CN102816852A - 一种早期预判不同品种烟草成熟期叶片生物碱相对含量的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种早期预判不同品种烟草成熟期叶片生物碱相对含量的方法，包括：(1)收集至少两个烟草品种的处于旺长期植株的叶片，分别提取各叶片的总RNA，并逆转录合成cDNA；(2)针对烟草中任一与生物碱合成相关的基因设计特异性引物，利用该特异性引物，以cDNA为模板，进行实时荧光定量PCR扩增，计算得到各烟草品种所述与生物碱合成相关的基因的相对表达量；(3)预判各烟草品种成熟期叶片的生物碱相对含量；本发明方法克服了现有检测方法只能在烟叶采收后才能对其定量分析的缺陷，避免了现有方法检测的条件限制，为及早判定烟叶生物碱含量开辟新的途径。
Description
技术领域
本发明涉及一种烟草生物碱含量的检测方法，尤其涉及一种早期预判不同品种烟草成熟期叶片生物碱相对含量的方法。
背景技术
生物碱是广泛存在于植物体内的一类由小分子含氮化合物组成的次生代谢产物，目前世界上已有超过12000种的生物碱类物质被分离鉴定。生物碱在烟草及其制品中有特殊的地位，它不仅是烟草重要的品质要素，而且规定了烟草作为一种商品的特质。研究发现，烟草中含有多种生物碱，在栽培烟草中主要有四种，分别是烟碱、降烟碱、假木贼碱和新烟碱，其中尤以烟碱含量最高，一般占到总生物碱的90～95％。
研究表明，不同类型烟草，其生物碱组分与含量差异显著，同样，不同品种之间生物碱的组分与含量也不尽相同。此外，栽培条件(如种植地点、天气、光照和水分等)的不同也对生物碱有较大影响。由于消费者的偏好，我国种植的烟草类型多为烤烟，占到总栽培面积的95％以上。另一方面，在栽培品种的烟株群体中，由于基因突变，会出现烟碱转化现象，即烟碱在去甲基化酶的作用下大量转化为降烟碱。而降烟碱含量的升高会直接影响烟叶的香吃味品质，导致烤烟调制后出现“樱红”现象且香味不佳。
近年来，我国烟叶生产中一直存在烟碱等生物碱含量过高的问题，烟碱含量过高会导致烟叶品质变差，可用性明显下降，而目前检测烟叶生物碱的方法主要是气相色谱法(GC)，虽然该方法稳定性、可操作性都比较好，但该方法仅能分析采收后的成熟烟叶或烘烤后的烟叶，无法在早期了解不同品种烟叶及同一品种的不同群体内生物碱含量的差异，进而无法在早期将不良烟株及时淘汰。
公开号为“CN102401816A”的中国发明专利申请公开了一种烟草中生物碱的检测方法，包括如下步骤：步骤一，取烟草样品，加入碱溶液，超声处理，之后加入含有喹啉的有机溶剂，震荡萃取，将有机层浓缩，得进样溶液；步骤二，利用气相色谱-质谱联用仪器检测进样溶液，对烟草生物碱进行定性和定量测定。
公开号为“CN102004132A”的中国发明专利申请公开了一种烟草制品中生物碱的测定方法，它利用氢氧化钠溶液将烟草或烟草制品中的生物碱游离出来，采用三乙胺/三氯甲烷溶液萃取试样中的生物碱，通过气相色谱-质谱(GC-MS)定量分析检测其中5种生物碱的含量。
上述专利公开的检测方法均是通过萃取获得烟叶样品中的生物碱，然后利用气相色谱进行检测，但所使用的样品均是成熟烟叶或烟叶制品，无法在烟叶早期对生物碱含量进行预测判断。
发明内容
本发明公开了一种早期预判不同品种烟草成熟期叶片生物碱相对含量的方法，解决了传统方法只能对成熟期叶生物碱含量片进行定量检测，缺乏早期预判能力，不能及时剔除不良烟株的问题。
一种早期预判不同品种烟草成熟期叶片生物碱相对含量的方法，包括：
(1)收集至少两个烟草品种的处于旺长期植株的叶片，分别提取各叶片的总RNA，并逆转录合成cDNA；
(2)针对烟草中任一与生物碱合成相关的基因设计特异性引物，利用该特异性引物，以cDNA为模板，进行实时荧光定量PCR扩增，计算得到各烟草品种所述与生物碱合成相关的基因的相对表达量；
(3)预判各烟草品种成熟期叶片的生物碱相对含量；
所述烟草中与生物碱合成相关的基因为：鸟氨酸脱羧酶基因(GenBank：AF321138.1)、腐胺N-甲基转移酶基因(GenBank：D28506.1)、甲基腐胺氧化酶基因(GenBank：AB289456.1)或喹啉酸磷酸核糖转移酶基因(GenBank：AB038494.1)。
经多次试验发现，鸟氨酸脱羧酶基因(ODC)、腐胺N-甲基转移酶基因(PMT)、甲基腐胺氧化酶基因(MPO)和喹啉酸磷酸核糖转移酶基因(QPT)早期的表达水平与烟草成熟期叶片生物含量存在正相关关系。根据如下公式可以计算出多种烟草品种某基因的相对表达量t：
t＝2-ΔΔCt
其中，ΔΔCt＝ΔCt1-ΔCt2，ΔCt＝目标基因的Ct值-内参基因的Ct值，其中ΔCt1，ΔCt2表示两种进行比较的烟草品种叶片中基因表达水平Ct差值，ΔCt2作为对照值。
步骤(1)中叶片取自植株的中部，中部叶片能较好地反映烟株的各项指标。
所述旺长期为烟株经过漂浮育苗后，移栽至大田中55-65天时。
取到的鲜叶样品，应立即放入装有液氮的冰盒中短暂保存并提取总RNA，若不立即提取总RNA应将样品保存在-80℃超低温冰箱中待用。提取总RNA后应立即反转录为cDNA，保存在-20℃条件下，若不立即反转录为cDNA应将总RNA样品保存在-80℃超低温冰箱中待用。
鲜叶样品在-80℃条件下保存期为1年，总RNA样品在-80℃条件下和cDNA样品在-20℃条件下保存期为6个月。
步骤(1)中，总RNA提取采用植物RNA试剂盒(如Qiagen公司的RNeasy Plant Mini kit等)法或Trizol法进行；mRNA反转录为cDNA采用AMV反转录酶或MMLV反转录酶；在步骤(2)中，实时荧光定量PCR方法为SYBR Green I荧光嵌合法。
qRT-PCR反应体系：采用SYBR Green I荧光嵌合法进行qRT-PCR，PCR反应液总体积为20μl，包含Takara 2×SYBR Premix EX Taq 10μl，正向引物(10μM)0.5μl，反向引物(10μM)0.5μl，cDNA模板2μl，灭菌蒸馏水7μl。
反应条件为：95℃预变性5min；95℃变性10s，55℃退火10s，72℃延伸10s，共60个循环；72℃延伸5min；55-95℃缓慢升温，产生溶解曲线。
内参基因一般选用生物体或细胞内稳定表达的基因，本发明选用内参基因为26S-RNA(GenBank：X68710.1)。针对内参基因的特异性引物如下：
正向引物：GAAGAAGGTCCCAAGGGTTC
反向引物：TCTCCCTTTAACACCAACGG。
实时定量PCR的目的是为了检测某基因的相对表达量，因为在扩增时不需全序列扩增，但选用引物应具有较好的特异性，本发明针对鸟氨酸脱羧酶基因(ODC)、腐胺N-甲基转移酶基因(PMT)、甲基腐胺氧化酶基因(MPO)和喹啉酸磷酸核糖转移酶基因(QPT)的特异性引物以及扩增的序列长度如下表1所示：
表1特异性引物及扩增序列长度表
本发明方法以烤烟旺长期烟叶为材料，采用实时荧光定量PCR技术对其生物碱生物合成基因的表达水平进行检测，根据基因表达差异判定成熟期烟叶的生物碱水平。
本发明方法取样量少，相比现有方法不会对取样烟株造成明显伤害，且操作简便、结果精确、重复性好。
本发明方法克服了现有检测方法只能在烟叶采收后才能对其定量分析的缺陷，避免了现有方法检测的条件限制，为研究人员与种植户及早判定烟叶生物碱含量，及时剔除不良烟株开辟了一条新的有效途径。
具体实施方式
实施例1分析ODC基因的表达水平
(1)烟叶的选择与取样：
以红花大金元、K326和中烟100三个品种为材料，分别选取其旺长期中部叶片0.5g，取好的鲜叶样品用锡箔纸包好并标记，之后迅速放入装有液氮的冰盒中保存，快速送往实验室进行下一步工作。
(2)提取RNA及反转录为cDNA
取锡箔纸中的烟叶样品各100mg，采用Qiagen公司的RNeasy PlantMini kit提取其总RNA，具体步骤如下：
将烟叶加液氮磨细，液氮挥发前转入Eppendorf管并加450μl RLT，振荡后56℃温育3min；将提取液转入紫色管，10,000g离心2min，滤液转入新的Eppendorf管，加225μl无水乙醇混匀；滤液再转入粉红色小管，离心(8,000g)15秒，弃滤液；加700μl RW1于粉红色小管，离心(8,000g)15秒，弃滤液；加500μl RPE于粉红色小管，离心(8,000g)15秒，弃滤液，重复一次，空管离心2min；将粉红色小管插到无菌的Eppendorf管，加30μl无RNase水，离心(10,000g)1min，提取好的RNA置-80℃保存。
然后采用Takara公司的AMV反转录酶，将样品总RNA中的mRNA反转录为cDNA，稀释10倍后备用，具体步骤如下：
每个总RNA样品取2μl，50pmol/μl的Oligo(dT)18primer 1μl，10mM dNTP Mixture 2.5μl，RNase Inhibitor 20U，AMV反转录酶10U，5×AMV Buffer 4μl，DEPC H2O定容至20μl，室温下放置10min后移入42℃恒温槽中，42℃保温1.5h，之后在冰水中冷却2min即可。将得到的cDNA稀释10倍后用于下一步试验。
(3)特异性引物设计
选择26S-RNA基因作为内参基因，烟草生物碱生物合成相关基因ODC及内参基因的特异性引物序列如下表2：
表2烟草生物碱合成基因ODC和内参基因引物序列
(4)实时荧光定量PCR(qRT-PCR)扩增
qRT-PCR反应体系：采用SYBR Green I荧光嵌合法进行qRT-PCR，PCR反应液总体积为20μl，包含Takara 2×SYBR Premix EX Taq 10μl，正向引物(10μM)0.5μl，反向引物(10μM)0.5μl，cDNA模板2μl，灭菌蒸馏水7μl；
将加样后的PCR管放入荧光定量PCR仪中进行扩增，反应条件为：95℃预变性5min；95℃变性10s，55℃退火10s，72℃延伸10s，共60个循环；72℃延伸5min；55-95℃缓慢升温，产生溶解曲线；
(5)计算ODC基因表达水平并判定成熟期烟叶生物碱水平
红花大金元、K326和中烟100旺长期烟叶的cDNA样品分别以上述引物进行qRT-PCR反应，得到其检测样品的qRT-PCR扩增循环数(Ct)，结果见表3；分别以内参基因和各个生物合成基因的Ct值进行计算，得到各生物合成基因的相对表达量，计算公式如下：
基因相对表达量＝2-ΔΔCt
ΔΔCt＝[目标基因Ct值(未知样品)-内参基因Ct值(未知样品)]-[目标基因Ct值(对照样品)-内参基因Ct值(对照样品)]
表3不同品种烤烟旺长期烟叶ODC基因Ct值
以红花大金元为对照，根据公式计算得到不同烤烟品种旺长期烟叶的ODC基因的表达情况，结果见表4。
表4不同品种烤烟旺长期烟叶ODC基因相对表达量
由上表可以看出不同烤烟品种的旺长期叶片的ODC基因表达水平差异明显，K326表达量最高，其次是中烟100，红花大金元最低，据此我们判定这三个品种取样地点所种植的群体其成熟期烟叶的生物碱含量从高到低依次为K326、中烟100和红花大金元。
为了验证本发明方法的准确性，发明者对取样地点的烟叶进行后续跟踪调查，在烟叶上中下部叶片成熟后对其进行取样，测定其生物碱含量，分析方法参照烟草行业标准YC/T383-2010，烟草及烟草制品烟碱、降烟碱、新烟碱、麦斯明和假木贼碱的测定-气相色谱-质谱联用法。不同品种成熟期烟叶生物碱含量见表5。不同叶位的成熟期叶片其单个生物碱及总生物碱含量从高到低依次为K326、中烟100和红花大金元，与旺长期ODC基因表达趋势一致。由此可见，本发明所提供的方法具有高度的准确性，与实际情况完全吻合。
表5烤烟不同品种成熟期烟叶生物碱组分与含量
实施例2分析PMT基因的表达水平
(1)烟叶的选择与取样
以红花大金元、K326和中烟100三个品种为材料，分别选取其旺长期中部叶片0.5g，取好的鲜叶样品用锡箔纸包好并标记，之后迅速放入装有液氮的冰盒中保存，快速送往实验室进行下一步工作。
(2)提取RNA及反转录为cDNA
取锡箔纸中的烟叶样品各100mg，采用Qiagen公司的RNeasy PlantMini kit提取其总RNA，具体步骤如下：
将烟叶加液氮磨细，液氮挥发前转入Eppendorf管并加450μl RLT，振荡后56℃温育3min；将提取液转入紫色管，10,000g离心2min，滤液转入新的Eppendorf管，加225μl无水乙醇混匀；滤液再转入粉红色小管，离心(8,000g)15秒，弃滤液；加700μl RW1于粉红色小管，离心(8,000g)15秒，弃滤液；加500μl RPE于粉红色小管，离心(8,000g)15秒，弃滤液，重复一次，空管离心2min；将粉红色小管插到无菌的Eppendorf管，加30μl无RNase水，离心(10,000g)1min，提取好的RNA置-80℃保存。
然后采用Takara公司的AMV反转录酶，将样品总RNA中的mRNA反转录为cDNA，稀释10倍后备用，具体步骤如下：
每个总RNA样品取2μl，50pmol/μl的Oligo(dT)18primer 1μl，10mM dNTP Mixture 2.5μl，RNase Inhibitor 20U，AMV反转录酶10U，5×AMV Buffer 4μl，DEPC H2O定容至20μl，室温下放置10min后移入42℃恒温槽中，42℃保温1.5h，之后在冰水中冷却2min即可。将得到的cDNA稀释10倍后用于下一步试验。
(3)特异性引物设计
选择26S-RNA基因作为内参基因，烟草生物碱生物合成相关基因PMT及内参基因的特异性引物序列如下表：
表6烟草生物碱合成基因PMT和内参基因引物序列
(4)实时荧光定量PCR(qRT-PCR)扩增：
qRT-PCR反应体系：采用SYBR Green I荧光嵌合法进行qRT-PCR，PCR反应液总体积为20μl，包含Takara 2×SYBR Premix EX Taq 10μl，正向引物(10μM)0.5μl，反向引物(10μM)0.5μl，cDNA模板2μl，灭菌蒸馏水7μl；
将加样后的PCR管放入荧光定量PCR仪中进行扩增，反应条件为：95℃预变性5min；95℃变性10s，55℃退火10s，72℃延伸10s，共60个循环；72℃延伸5min；55-95℃缓慢升温，产生溶解曲线；
(5)计算PMT基因表达水平并判定成熟期烟叶生物碱水平：
红花大金元、K326和中烟100旺长期烟叶的cDNA样品分别以上述引物进行qRT-PCR反应，得到其检测样品的qRT-PCR扩增循环数(Ct)，结果见表7；分别以内参基因和各个生物合成基因的Ct值进行计算，得到各生物合成基因的相对表达量，计算公式如下：
基因相对表达量＝2-ΔΔCt
ΔΔCt＝[目标基因Ct值(未知样品)-内参基因Ct值(未知样品)]-[目标基因Ct值(对照样品)-内参基因Ct值(对照样品)]
表7不同品种烤烟旺长期烟叶PMT基因Ct值
以红花大金元为对照，根据公式计算得到不同烤烟品种旺长期烟叶的PMT基因的表达情况，结果见表8。
表8不同品种烤烟旺长期烟叶PMT基因相对表达量
由上表可以看出不同烤烟品种的旺长期叶片的PMT基因表达水平差异明显，K326表达量最高，其次是中烟100，红花大金元最低，据此我们判定这三个品种取样地点所种植的群体其成熟期烟叶的生物碱含量从高到低依次为K326、中烟100和红花大金元。
同样，为了验证本发明方法的准确性，采用了同实施例1的方法进行结果验证，不同品种成熟期烟叶生物碱含量见表5。结果表明，不同叶位的成熟期叶片其单个生物碱及总生物碱含量从高到低依次为K326、中烟100和红花大金元，与旺长期PMT基因表达趋势一致。由此可见，本发明所提供的方法具有高度的准确性，与实际情况完全吻合。
实施例3分析MPO基因的表达水平
(1)烟叶的选择与取样
以红花大金元、K326和中烟100三个品种为材料，分别选取其旺长期中部叶片0.5g，取好的鲜叶样品用锡箔纸包好并标记，之后迅速放入装有液氮的冰盒中保存，快速送往实验室进行下一步工作。
(2)提取RNA及反转录为cDNA
取锡箔纸中的烟叶样品各100mg，采用Qiagen公司的RNeasy PlantMini kit提取其总RNA，具体步骤如下：
将烟叶加液氮磨细，液氮挥发前转入Eppendorf管并加450μl RLT，振荡后56℃温育3min；将提取液转入紫色管，10,000g离心2min，滤液转入新的Eppendorf管，加225μl无水乙醇混匀；滤液再转入粉红色小管，离心(8,000g)15秒，弃滤液；加700μl RW1于粉红色小管，离心(8,000g)15秒，弃滤液；加500μl RPE于粉红色小管，离心(8,000g)15秒，弃滤液，重复一次，空管离心2min；将粉红色小管插到无菌的Eppendorf管，加30μl无RNase水，离心(10,000g)1min，提取好的RNA置-80℃保存。
然后采用Takara公司的AMV反转录酶，将样品总RNA中的mRNA反转录为cDNA，稀释10倍后备用，具体步骤如下：
每个总RNA样品取2μl，50pmol/μl的Oligo(dT)18primer 1μl，10mM dNTP Mixture 2.5μl，RNase Inhibitor 20U，AMV反转录酶10U，5×AMV Buffer 4μl，DEPC H2O定容至20μl，室温下放置10min后移入42℃恒温槽中，42℃保温1.5h，之后在冰水中冷却2min即可。将得到的cDNA稀释10倍后用于下一步试验。
(3)特异性引物设计
选择26S-RNA基因作为内参基因，烟草生物碱生物合成相关基因MPO及内参基因的特异性引物序列如下表：
表9烟草生物碱合成基因MPO和内参基因引物序列
(4)实时荧光定量PCR(qRT-PCR)扩增
qRT-PCR反应体系：采用SYBR Green I荧光嵌合法进行qRT-PCR，PCR反应液总体积为20μl，包含Takara 2×SYBR Premix EX Taq 10μl，正向引物(10μM)0.5μl，反向引物(10μM)0.5μl，cDNA模板2μl，灭菌蒸馏水7μl；
将加样后的PCR管放入荧光定量PCR仪中进行扩增，反应条件为：95℃预变性5min；95℃变性10s，55℃退火10s，72℃延伸10s，共60个循环；72℃延伸5min；55-95℃缓慢升温，产生溶解曲线；
(5)计算MPO基因表达水平并判定成熟期烟叶生物碱水平
红花大金元、K326和中烟100旺长期烟叶的cDNA样品分别以上述引物进行qRT-PCR反应，得到其检测样品的qRT-PCR扩增循环数(Ct)，结果见表10；分别以内参基因和各个生物合成基因的Ct值进行计算，得到各生物合成基因的相对表达量，计算公式如下：
基因相对表达量＝2-ΔΔCt
ΔΔCt＝[目标基因Ct值(未知样品)-内参基因Ct值(未知样品)]-[目标基因Ct值(对照样品)-内参基因Ct值(对照样品)]
表10不同品种烤烟旺长期烟叶MPO基因Ct值
以红花大金元为对照，根据公式计算得到不同烤烟品种旺长期烟叶的MPO基因的表达情况，结果见表11。
表11不同品种烤烟旺长期烟叶MPO基因相对表达量
由上表可以看出不同烤烟品种的旺长期叶片的MPO基因表达水平差异明显，K326表达量最高，其次是中烟100，红花大金元最低，据此我们判定这三个品种取样地点所种植的群体其成熟期烟叶的生物碱含量从高到低依次为K326、中烟100和红花大金元。
同样，为了验证本发明方法的准确性，采用了同实施例1的方法进行结果验证，不同品种成熟期烟叶生物碱含量见表5。结果表明，不同叶位的成熟期叶片其单个生物碱及总生物碱含量从高到低依次为K326、中烟100和红花大金元，与旺长期MPO基因表达趋势一致。由此可见，本发明所提供的方法具有高度的准确性，与实际情况完全吻合。
实施例4分析QPT基因的表达水平
(1)烟叶的选择与取样：
以红花大金元、K326和中烟100三个品种为材料，分别选取其旺长期中部叶片0.5g，取好的鲜叶样品用锡箔纸包好并标记，之后迅速放入装有液氮的冰盒中保存，快速送往实验室进行下一步工作；
(2)提取RNA及反转录为cDNA：
取锡箔纸中的烟叶样品各100mg，采用Qiagen公司的RNeasy PlantMini kit提取其总RNA，具体步骤如下：
将烟叶加液氮磨细，液氮挥发前转入Eppendorf管并加450μl RLT，振荡后56℃温育3min；将提取液转入紫色管，10,000g离心2min，滤液转入新的Eppendorf管，加225μl无水乙醇混匀；滤液再转入粉红色小管，离心(8,000g)15秒，弃滤液；加700μl RW1于粉红色小管，离心(8,000g)15秒，弃滤液；加500μl RPE于粉红色小管，离心(8,000g)15秒，弃滤液，重复一次，空管离心2min；将粉红色小管插到无菌的Eppendorf管，加30μl无RNase水，离心(10,000g)1min，提取好的RNA置-80℃保存。
然后采用Takara公司的AMV反转录酶，将样品总RNA中的mRNA反转录为cDNA，稀释10倍后备用，具体步骤如下：
每个总RNA样品取2μl，50pmol/μl的Oligo(dT)18primer 1μl，10mM dNTP Mixture 2.5μl，RNase Inhibitor 20U，AMV反转录酶10U，5×AMV Buffer 4μl，DEPC H2O定容至20μl，室温下放置10min后移入42℃恒温槽中，42℃保温1.5h，之后在冰水中冷却2min即可。将得到的cDNA稀释10倍后用于下一步试验。
(3)特异性引物设计：
选择26S-RNA基因作为内参基因，烟草生物碱生物合成相关基因QPT及内参基因的特异性引物序列如下表：
表12烟草生物碱合成基因QPT和内参基因引物序列
(4)实时荧光定量PCR(qRT-PCR)扩增：
qRT-PCR反应体系：采用SYBR Green I荧光嵌合法进行qRT-PCR，PCR反应液总体积为20μl，包含Takara 2×SYBR Premix EX Taq 10μl，正向引物(10μM)0.5μl，反向引物(10μM)0.5μl，cDNA模板2μl，灭菌蒸馏水7μl；
将加样后的PCR管放入荧光定量PCR仪中进行扩增，反应条件为：95℃预变性5min；95℃变性10s，55℃退火10s，72℃延伸10s，共60个循环；72℃延伸5min；55-95℃缓慢升温，产生溶解曲线；
(5)计算QPT基因表达水平并判定成熟期烟叶生物碱水平：
红花大金元、K326和中烟100旺长期烟叶的cDNA样品分别以上述引物进行qRT-PCR反应，得到其检测样品的qRT-PCR扩增循环数(Ct)，结果见表13；分别以内参基因和各个生物合成基因的Ct值进行计算，得到各生物合成基因的相对表达量，计算公式如下：
基因相对表达量＝2-ΔΔCt
ΔΔCt＝[目标基因Ct值(未知样品)-内参基因Ct值(未知样品)]-[目标基因Ct值(对照样品)-内参基因Ct值(对照样品)]
表13不同品种烤烟旺长期烟叶QPT基因Ct值
以红花大金元为对照，根据公式计算得到不同烤烟品种旺长期烟叶的QPT基因的表达情况，结果见表14。
表14不同品种烤烟旺长期烟叶QPT基因相对表达量
由上表可以看出不同烤烟品种的旺长期叶片的QPT基因表达水平差异明显，K326表达量最高，其次是中烟100，红花大金元最低，据此我们判定这三个品种取样地点所种植的群体其成熟期烟叶的生物碱含量从高到低依次为K326、中烟100和红花大金元。
同样，为了验证本发明方法的准确性，采用了同实施例1的方法进行结果验证，不同品种成熟期烟叶生物碱含量见表5。结果表明，不同叶位的成熟期叶片其单个生物碱及总生物碱含量从高到低依次为K326、中烟100和红花大金元，与旺长期QPT基因表达趋势一致。由此可见，本发明所提供的方法具有高度的准确性，与实际情况完全吻合。
Claims (6)
1.一种早期预判不同品种烟草成熟期叶片生物碱相对含量的方法，包括：
(1)收集至少两个烟草品种的处于旺长期植株的叶片，分别提取各叶片的总RNA，并逆转录合成cDNA；
(2)针对烟草中任一与生物碱合成相关的基因设计特异性引物，利用该特异性引物，以cDNA为模板，进行实时荧光定量PCR扩增，计算得到各烟草品种所述与生物碱合成相关的基因的相对表达量；
(3)预判各烟草品种成熟期叶片的生物碱相对含量；
所述烟草中与生物碱合成相关的基因为：鸟氨酸脱羧酶基因、腐胺N-甲基转移酶基因、甲基腐胺氧化酶基因或喹啉酸磷酸核糖转移酶基因。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述实时荧光定量PCR选用的内参基因为26S-RNA。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，针对内参基因的特异性引物为：
正向引物：5’-GAAGAAGGTCCCAAGGGTTC-3’
反向引物：5’-TCTCCCTTTAACACCAACGG-3’。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，针对鸟氨酸脱羧酶基因、腐胺N-甲基转移酶基因、甲基腐胺氧化酶基因和喹啉酸磷酸核糖转移酶基因的特异性引物如下表所示：
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中叶片取自植株的中部。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，叶片重量为0.1～1g。
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| KR100899993B1 (ko) * | 2007-03-07 | 2009-05-28 | 한국생명공학연구원 | 저니코틴 형질전환 담배식물체 및 이의 제조방법 |
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