CN107613762A - 减少烟草中的烟草特异性亚硝胺nnk的方法和组合物 - Google Patents

Abstract

本发明提供包含一种或多种异源性核酸分子的烟草植物、植物部分和/或植物细胞，所述核酸分子包含编码假氧尼古丁降解酶的核苷酸序列。本文还提供用于生产具有减少的假氧尼古丁(PON)和/或4‑(甲基亚硝基氨基)‑1‑(3‑吡啶基)‑1‑丁酮(NNK)含量的烟草植物和烟草产品的方法和组合物。

Description

减少烟草中的烟草特异性亚硝胺NNK的方法和组合物

优先权声明

本申请依据35 U.S,C,§119 (e)，要求2015年5月5日提交的美国临时申请号62/156,981的权益，其全部内容通过引用结合到本文中。

关于序列表的电子提交的声明

依据37 C.F.R.§1.821提交的ASCII文本格式的序列表(题名为5051-880WOST25.txt,大小30,014字节，2016年5月3日生成并经由EFS-Web提交)，被提供以代替纸副本。该序列表通过引用，以其公开内容结合到本说明书中。

发明领域

本发明涉及假氧尼古丁降解酶和它们在烟草及其产品中减少烟草特异性亚硝胺的用途。

发明背景

烟草特异性亚硝胺(TSNA)是通过烟草生物碱的亚硝化作用产生的一类化合物。TSNA的水平在新鲜收获的烟草植物中是非常低的，然而在随后的叶的熟化和处理期间显著地增加(Bush et al. Rec. Adv. Tob. Sci. 27:23-46 (2001))。在熟烟草叶中发现的4种主要的TSNA是N’-亚硝基降烟碱(NNN)、N’-亚硝基新烟草碱(NAT)、N’-亚硝基假木贼碱(NAB)和4-(甲基亚硝基氨基)-1-(3-吡啶基)-1-丁酮(NNK)。TSNA的重要性源于它们涉及烟草-相关的癌症。特别地，NNK和NNN被认为是在烟草产品中发现的最强的致癌物(Hecht, S.S. Chem. Res. Toxicol. 11:559-603 (1998); Hecht, S.S. Nat. Rev. Cancer 3:733-744(2003); Hecht, S.S. Langenbecks Arch. Surg. 391: 603-613 (2006); Hoffmann etal., J. Toxicol. Environ. Health 41:1-52 (1994))并已由国际癌症研究机构(International Agency for Research on Cancer) (IARC, 2007)分类为1类致癌物(最强的类别)。相比之下，NAT和NAB似乎是弱致癌的或者良性的。虽然已表明NNN是动物系统中的强烈致癌物，与食管及口腔和鼻腔的癌症高度相关，但NNK可论证地是最成问题的TSNA。在动物系统中的许多致癌性研究，与吸烟者的流行病学数据和组织和体液的生物化学评估结合，导致研究者得出结论，NNK是烟草-相关的肺癌的主要的决定因素(Hecht, S.S.Chem. Res. Toxicol. 11:559-603 (1998); Hecht, S.S. Nat. Rev. Cancer 3:733-744(2003); Hecht, S.S. Langenbecks Arch. Surg. 391: 603-613 (2006))。在每一种测试的动物物种中，已显示NNK引起肺瘤，而不管其给予途径。NNK也可能涉及吸烟者和类似的无烟产品的用户的口腔和鼻腔的癌症，以及肝、胰和子宫颈的癌症。

当氧化氮种类(如NO、NO₂、N₂O₃和N₂O₄)与烟草生物碱反应时形成TSNA (图1)。NAT和NAB分别经由二级生物碱新烟草碱和假木贼碱的亚硝化作用形成。虽然早期研究认为NNN源自尼古丁和降烟碱二者(Hecht et al. J. Natl. Cancer Inst. 60:819-824 (1978))，更加晚近的报告已证实，在熟烟草叶中NNN的出现与降烟碱含量确实相关，而不是与尼古丁相关(Bush et al., Rec. Adv. Tob. Sci. 27:23-46 (2001); Lewis et al. Plant Biotech. J. 6:346-354 (2008))。NNK形成的前体/产物关系是不甚清除的。优势文献简单地叙述了NNK是尼古丁的亚硝化产物(如，Hoffmann et al., J. Toxicol. Environ. Health 41:1-52 (1994); Hecht, S.S. Chem. Res. Toxicol. 11:559-603 (1998))。这个结论主要基于尼古丁在低pH的水性环境中的亚硝化特性的体外观察(Caldwell et al.,Chem. Res. Toxicol. 4:513-516 (1991))。作为在其吡咯烷环上具有保护性甲基的叔生物碱，然而，尼古丁对亚硝化作用比二级生物碱降烟碱、新烟草碱和假木贼碱(在它们的非-吡啶环上缺乏类似的保护性基团)更不易受影响(图1)。由于尼古丁亚硝化的缓慢的反应速率，很可能是尼古丁的氧化衍生物，而不是尼古丁本身作为NNK的直接前体起作用(Caldwell et al., Ann. N.Y. Acad. Sci. 686:213-228 (1993))。

由于广泛可接受的假设，即TSNA明显地对烟草-相关的癌症负有责任，减少它们在烟草产品中的流行率的方法已进行深入调查。理论上，在烟草产品中发现的任何TSNA水平可通过其生物碱前体的有针对性的减少，或者通过减少对涉及的亚硝化试剂的暴露来降低。在更引人注目的成就中，落入后一类的包括：(1)，具有热交换器的烤房的改良，以在叶烤干期间减少导致TSNA形成的氧化亚氮气体(Hamm, L.A. Rec. Adv. Tob. Sci. 27:13-15 (2001); Peele et al. Rec. Adv. Tob. Sci. 27:3-12 (2001))；和(2)，采用巴氏灭菌方法以杀灭烟草叶上的产亚硝酸盐的微生物，所述烟草叶用于生产称为“snus”的低-TSNA无烟产品。通过有针对性的减少生物碱前体来减少TNSA的最佳实例涉及旨在降低熟烟草叶中NNN含量的最近的努力。通过敲除负责合成生物碱降烟碱的基因功能，证实在风干的白肋(burley)烟草中的降烟碱和NNN水平与使用现有的商业品种和生产实践而获得的水平比较可减少约80% (Lewis et al. Plant Biotech. J. 6:346-354 (2008); Lewis etal. Phytochemistry 71:1988-1998 (2010))。虽然在过去二十年中，在降低熟烟草叶内形成和积累的TNSA的量方面取得显著的进展，事实是在大多数商业烟草产品中发现的NNK和NNN的量，比其它消费品，例如腊肉、啤酒和其它食物中发现的致癌物亚硝胺的水平仍高数百至数千倍(Bartsch和Spiegelhalder, Eur. J. Can. Prevent. 5, 11-18 (1996);Hecht et al., Tob. Control 20, 443 (2011); Hotchkiss, J.H. Cancer Surv. 8:295-321(1989))。因此，对设计可进一步减少烟草植物和从烟草植物生产的产品中的TNSA，特别是NNK水平的方法，仍存在大量需求。

发明概述

在一个方面，本发明提供包含一种或多种异源性核酸分子的烟草植物、植物部分和/或植物细胞，所述核酸分子包含编码假氧尼古丁(PON)降解酶的核苷酸序列。在某些方面，编码PON降解酶的核苷酸序列可在烟草中优化表达。在另外的方面，PON降解酶可融合(即，可操作地连接)于液泡靶向序列或内质网靶向信号序列。在特别的方面，PON降解酶是假氧尼古丁胺氧化酶(PAO)。

在进一步的方面，本发明提供减少烟草植物的PON和/或NNK的方法，其包括：将一种或多种含有编码PON降解酶的核苷酸序列的异源性核酸分子引入烟草植物、植物部分和/或植物细胞中。

在更进一步的方面，提供生产具有减少的PON和/或NNK含量的植物、植物部分或植物细胞的方法，该方法包括：将一种或多种含有编码PON降解酶的核苷酸序列的异源性核酸分子引入烟草植物、植物部分和/或植物细胞中，从而生产具有减少的PON和/或NNK含量的烟草植物、植物部分和/或植物细胞。

在另外的方面，本发明提供生产具有减少的NNK含量的烟草产品的方法，该方法包括：将一种或多种含有编码PON降解酶的核苷酸序列的异源性核酸分子引入烟草植物、植物部分和/或植物细胞，从而生产具有减少的PON和/或NNK含量的转基因烟草植物、植物部分和/或植物细胞和从所述转基因烟草植物、植物部分和/或植物细胞生产烟草产品，其中烟草产品具有减少的PON和/或NNK含量。

在进一步的方面，本发明提供生产具有减少的NNK含量的烟草产品的方法，该方法包括：从本发明的烟草植物、植物部分和/或植物细胞生产烟草产品，所述烟草植物、植物部分和/或植物细胞包含含有编码PON降解酶的核苷酸序列的一种或多种异源性核酸分子，其中烟草产品具有减少的PON和/或NNK含量。

本发明的另外的方面提供包含核酸构建体的组合物，所述核酸构建体包含编码假氧尼古丁(PON)降解酶的核苷酸序列，用于转化烟草植物、植物部分和/或植物细胞。本文还提供转化的烟草植物细胞、植物和/或植物部分以及后代植物，从所述转化的植物细胞、植物、植物部分和/或后代植物生产的收获和加工产品。

在本发明以下的描述中更详细地阐述本发明的这些和其它方面。

附图简述

图1显示烟草生物碱和TSNA之间的前体/产物关系。

图2A-2G显示与本研究相关的核苷酸和预测的氨基酸序列。图2A显示如在假单胞菌(Pseudomonas)菌株HZN6中发现的假氧尼古丁胺氧化酶(PAO)基因的核苷酸序列(GenBank检索号JN391188) (SEQ ID NO:1)。加下划线的是起始和终止密码子。图2B显示用来转化烟草品种K326 SRC和TN90 SRC的PAO基因的核苷酸序列(SEQ ID NO:2)。经优化用于在烟草中表达的假单胞菌HZN6 PAO序列以黑体显示；从烟草CYP82E10基因获得的5’和3’UTR序列以粗体显示；经基因改造以创建限切位点而促进克隆的核苷酸以小写字母显示。加下划线的是起始和终止密码子。图2C显示预测的PAO的氨基酸序列(SEQ ID NO:3)。图2D显示烟草BBLa基因的核苷酸序列(GenBank检索号AB604219) (SEQ ID NO:4)。加下划线的是起始和终止密码子。图2E显示预测的BBLa的氨基酸序列(SEQ ID NO:5)。图2F显示BBL_vac-PAO融合构建体的核苷酸序列(SEQ ID NO:6)。黑色斜体的序列对应于BBLa 5’侧翼序列和含有液泡定位信号的首50个密码子；黑色、标准字体序列代表优化的假单胞菌HZN6 PAO序列；从烟草CYP82E10基因获得的3’ UTR序列以黑体显示；经基因改造以创建限切位点而促进克隆的核苷酸以小写字母显示。加下划线的是起始和终止密码子。图2G显示预测的BBL_vac-PAO融合蛋白的氨基酸序列(SEQ ID NO:7)。从BBLa获得的氨基酸以红色斜体显示；以黑体显示的残基对应于PAO；粗体、加下划线的丙氨酸残基由于创建融合构建体的结果而生成。

图3显示在对照植物(E4:GUS)和含有PAO构建体的植物的熟叶中的尼古丁、NNK、NNN和NAT浓度。所示值代表6-10株T₀植物对于每种基因型的均值±标准误差。含有PAO构建体的基因型(其均值与E4:GUS对照没有显著差异(P<0.05))用“a”指示；与对照基因型有显著差异的均值用“b”显示。

图4显示在TN90 SRC和在相同背景下表达PAO转基因的3个T₂转基因系的空气熟化叶子中作为NNK存在的总TSNA的分数。条代表对于每个基因型的30株植物的均值。对于转基因株系均值和非-转基因TN90 SRC对照的均值之间差异的T-检验的P值是：35S:PAO#11, P= 0.0084；35S:PAO#3, P = 0.0550；35S:BBLvac-PAO#3, P = 0.0537。

发明详述

本说明书不打算为一个其中本发明可以实施的所有不同的方式，或可加入到本发明中的所有特征的详细的目录。例如，关于一个实施方案说明的特征可结合到其它实施方案，和关于一个特定实施方案说明的特征可从该实施方案删除。因此，本发明构思，在本发明的一些实施方案中，在此提出的任何特征或特征的组合可被排除在外或省略。此外，本领域技术人员根据本公开内容将明白本文提出的对各个实施方案的许多变化和添加，这些变化和添加并不背离本发明。因此，以下描述打算说明本发明的一些特定的实施方案，而并未穷尽地指定其所有的排列、组合和变化。

除非另外限定，本文所用的全部技术和科学术语具有本发明所属领域普通技术人员通常理解的相同意义。用于本发明的说明书的术语在此仅仅是为了描述特定实施方案的目的并不打算限制本发明。

本文引用的所有出版物、专利申请、专利和其它参考文献通过引用以其全文中参考的有关句子和/或段落的讲述结合到本文中。提及本文所用的技术意欲指本领域通常理解的技术，包括对本领域技术人员而言将是显而易见的有关那些技术的变化或等同技术的替代。

除非本文另外表示，可特别打算将在此描述的本发明的各个特征以任何组合使用。此外，本发明还认为，在本发明的一些实施方案中，在此提出的任何特征或特征的组合可被排除在外或省略。为举例说明，如果本说明书陈述：一种复合物包含组分A、B和C，它具体地是指A、B或C的任何一个，或其组合，可被省略和单独或以任何组合的方式放弃。

如本发明的说明书和所附权利要求书所用的，单数形式“一”、“一个”和“该”意欲还包括复数形式，除非文中另外清楚地指明。

如本文所用的，“和/或”指并且涵盖一种或多种有关的所列项目的任何和所有可能的组合，以及当以可供选择的方式(“或”)解释时则缺乏组合。

如本文所用的术语“约”，当涉及到一个可测量的值如量或时间段等时，则涵盖特定量的± 20%、± 10%、± 5%、± 1%、± 0.5%，或甚至± 0.1%的变化。

如本文所用的，短语例如" X和Y"之间和"约X和Y之间"应被解释为包括X和Y。如本文所用的，短语例如"约X和Y之间"意指"约X和约Y之间"和短语例如"从约X至Y"意指"从约X至约Y"。

如本文所用的术语“包含”、“含有”和“包括”，特指所述特征、整数、步骤、操作、要素，和/或成分的存在，但不排除其一种或多种其它特征, 整数, 步骤, 操作, 要素, 成分，和/或基团的存在或添加。

如本文所用的，连接词“基本上由...组成”意指要求保护的范围是被解释为包括在权利要求书中叙述的特定材料或步骤，以及对本发明要求保护的基本和新颖的特征没有重大影响的那些材料或步骤。因此，术语“基本上由...组成”当用于本发明的权利要求书时，并不打算解释为是等同于“包含”。

本发明涉及烟草中TSNA的减少，更特别地涉及NNK的减少。鉴于尼古丁的化学稳定性，非常可能的是，尼古丁的一种或多种氧化衍生物是NNK的直接生物碱前体，与尼古丁本身相反。几种已知的氧化的尼古丁衍生物中，化合物PON是最有可能用作NNK的前体之一，其具有与NNK相同的结构，但在其仲氮上缺乏氧化氮基团(在亚硝化时加入的单位) (图1)。虽然很少有人会怀疑PON可在物理上用作NNK的前体，早期的调查质疑其在NNK体内形成的相关性，因为PON不能明确地显示以可测量的量存在于烟草提取物中(例如，见在tobaccodocuments.org/ahf/2023321204-1214.html中的烟草遗留文档)。本领域的关键的进步始于PON与以下3个其它分子种类平衡存在的发现：2’-羟基尼古丁、N’-甲基麦司明(methylmyosmine)和尼古丁1’, 2’-亚胺离子(Wei, 关于烟草种类中吡啶生物碱的生物合成和代谢物的研究(Studies on the biosynthesis and metabolites of pyridine alkaloids in Nicotiana species). Ph.D. Thesis. Univ. of Kentucky (2000))。PON对快速互换分子种类的能力，与在提取期间其对氧化的高度敏感性结合，使得特别难以从烟草组织精确纯化和定量。然而，已确定尼古丁1’, 2’-亚胺离子可使用氰化钾捕获以产生2’-氰基尼古丁(Neurath et al. Med. Sci. Res. 20:853-858 (1992))，并且由此产生一个方案，从而PON水平可使用气相色谱法/质谱，通过2’-氰基尼古丁的间接定量，从烟草叶材料精确定量(Wei, 吡啶生物碱在烟草种类的生物合成和代谢物的研究(Studies on the biosynthesis and metabolites of pyridine alkaloids in Nicotiana species).Ph.D. Thesis. Univ. of Kentucky (2000))。使用这种方法，不仅证实PON确实存在于绿色的和熟化的两种烟草中，而且它以充分的量存在以用作NNK的生物碱前体。

因此，在一个方面，本发明提供包含一种或多种异源性核酸分子的烟草植物、植物部分和/或植物细胞，所述核酸分子包含编码假氧尼古丁(PON)降解酶的核苷酸序列、基本上由，或由编码假氧尼古丁(PON)降解酶的核苷酸序列组成。

本发明的另一个方面提供减少烟草植物和/或植物部分中的PON和/或NNK含量的方法，其包括：将一种或多种异源性核酸分子引入烟草植物、植物部分和/或植物细胞中，所述核酸分子包含编码PON降解酶的核苷酸序列，基本上由，或由编码PON降解酶的核苷酸序列组成，从而与不用所述一种或多种异源性核酸分子转化的烟草植物、植物部分和/或植物细胞比较，减少转基因烟草植物和/或植物部分中的PON和/或NNK含量。在一些实施方案中，与对照(例如，野生型、不包含一种编码PON降解酶的核苷酸序列的烟草植物)比较，PON含量可减少约10%-约100%。因此，例如，本发明的烟草植物和/或植物部分中的PON含量可减少约10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100%，或与对照品比较的任何范围或其中的值。在代表性实施方案中，PON含量可减少如与对照品比较的约10%-约50%、约20%-约50%、约20%-约60%、约20%-约80%、约20%-约90%、约30%-约60%、约30%-约80% 约30%-约95%等。在本发明的另外的实施方案中，与对照(例如，野生型、不包含一种编码PON降解酶的核苷酸序列的烟草植物)比较，本发明的烟草植物和/或植物部分中的NNK含量可减少约10%-约100%。因此，在一些实施方案中，NNK含量可减少约10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100%，或与对照品比较的任何范围或其中的值。在代表性实施方案中，NNK含量可减少如与对照品比较的约10%-约50%、约20%-约50%、约20%-约60%、约20%-约80%、约20%-约90%、约30%-约60%、约30%-约80% 约30%-约95%等。

本发明的进一步方面提供生产具有减少的PON和/或NNK含量的植物、植物部分，或植物细胞的方法，其包括：将一种或多种异源性核酸分子引入烟草植物、植物部分和/或植物细胞，所述核酸分子包含编码PON降解酶的核苷酸序列，基本上由，或由编码PON降解酶的核苷酸序列组成，从而与不用所述一种或多种异源性核酸分子转化的烟草植物、植物部分和/或植物细胞比较，生产具有减少的PON和/或NNK含量的烟草植物、植物部分和/或植物细胞。

在另外的方面，本发明提供生产具有减少的PON和/或NNK含量的烟草产品的方法，该方法包括：从本发明的烟草植物、植物部分和/或植物细胞生产烟草产品，所述烟草植物、植物部分和/或植物细胞包含一种或多种异源性核酸分子，后者包含一种编码PON降解酶的核苷酸序列，其中烟草产品具有减少PON和/或NNK含量。

在更进一步的方面，本发明提供生产具有减少的PON和/或NNK含量的烟草产品的方法，该方法包括：将一种或多种异源性核酸分子引入烟草植物、植物部分和/或植物细胞，所述核酸分子包含编码PON降解酶的核苷酸序列，基本上由，或由编码PON降解酶的核苷酸序列组成，从而与不用所述一种或多种异源性核酸分子转化的烟草植物、植物部分和/或植物细胞比较，生产具有减少的PON和/或NNK含量的转基因烟草植物、植物部分和/或植物细胞；和从所述转基因烟草植物、植物部分和/或植物细胞生产烟草产品，其中与从不用所述一种或多种异源性核酸分子转化的植物、植物部分和/或植物细胞生产的烟草产品比较，所述烟草产品具有减少PON和/或NNK含量。

在一些实施方案中，与对照(例如，野生型、不包含一种编码PON降解酶的核苷酸序列的烟草植物)比较，从本发明的烟草植物和/或植物部分生产的产品中PON含量可减少约10%-约100%。因此，例如，PON含量可减少约10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100%，或与对照品比较的任何范围或其中的值。在代表性实施方案中，PON含量可减少如与对照品比较的约10%-约50%、约20%-约50%、约20%-约60%、约20%-约80%、约20%-约90%、约30%-约60%、约30%-约80% 约30%-约95%等。在本发明的另外的实施方案中，与对照(例如，野生型、不包含一种编码PON降解酶的核苷酸序列的烟草植物)比较，从本发明的烟草植物和/或植物部分生产的产品中的NNK含量可减少约10%-约100%。因此，在一些实施方案中，NNK含量可减少约10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100%，或与对照品比较的任何范围或其中的值。在代表性实施方案中，NNK含量可减少如与对照品比较的约10%-约50%、约20%-约50%、约20%-约60%、约20%-约80%、约20%-约90%、约30%-约60%、约30%-约80% 约30%-约95%等。

在一些方面，PON降解酶可以是从例如已知降解尼古丁的细菌或真菌获得的微生物酶。在特别的方面，真菌属可以是曲霉属(Aspergillis)。在其它方面，细菌属可以是节杆菌属(Arthrobacter)、土壤杆菌属(Agrobacterium)或假单胞菌属(Pseudomonas)。如本领域充分理解的，植物可用超过一种编码PON降解的异源性核酸转化和表达超过一种编码PON降解酶的异源性核酸，其中PON降解酶可以是来自生物体(例如，细菌、真菌、曲霉属、节杆菌属、土壤杆菌属、假单胞菌属等)的相同或任何组合。

在本发明的一些方面，PON降解酶可以是假氧尼古丁胺氧化酶(PAO)。在代表性实施方案中，PAO可以是来自细菌。在一些实施方案中，细菌可以是假单胞菌。

因此，例如，在2012年，Qiu等报道从假单胞菌菌株(HZN6)鉴定两个新的基因，所述菌株能够代谢尼古丁(Appl. Environ. Microbiol. 78:2154-2160)。这些基因之一显示可编码假氧尼古丁胺氧化酶(PAO)，其将PON转化为3-琥珀酰半醛(succinoylsemialdehyde)-吡啶和甲基胺。本发明人惊奇地发现，PAO在烟草植物中的表达导致PON的代谢，伴有这种重要的NNK前体的水平的总体减少。在一些实施方案中，编码来自假单胞菌菌株HZN6的PAO的核苷酸序列包含SEQ ID NO:1的核苷酸序列，基本上由，或由SEQ ID NO:1的核苷酸序列组成。在还有的其它实施方案中，编码来自假单胞菌菌株HZN6的PAO的核苷酸序列编码一种多肽，其包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列，基本上由，或由SEQ ID NO:3的氨基酸序列组成。在进一步实例中，PON降解酶可以是来自另一个尼古丁降解菌株，恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida) S16。恶臭假单胞菌(P. putida) S16的整个基因组已被测序(Hongzhi, et al.,2011. J. Bacteriol. 193:5541-5542)，并且候选PAO已被鉴定与来自假单胞菌菌株HZN6的PAO (例如，SEQ ID NO:9的核苷酸序列；SEQ ID NO:10的氨基酸序列)具有至少79%同一性。因此，在一些实施方案中，一种或多种编码PON降解酶的异源性核酸可包含SEQ ID NO:1或9的核苷酸序列，基本上由，或由SEQ ID NO:1或9的核苷酸序列组成或可包含编码SEQ IDNO:3或10的氨基酸序列的核苷酸序列，基本上由，或由编码SEQ ID NO:3或10的氨基酸序列的核苷酸序列组成。

在一些方面，编码PON降解酶的核苷酸序列可以是优化用于在烟草中表达的密码子。

这样的核苷酸序列修饰的非-限制性实例包括改变G/C含量以更接近通常在感兴趣的种类(即，烟草)中发现的含量，并除去在例如，烟草中非典型地发现的密码子。

因此，如本文所用的短语"密码子优化"，指适宜的DNA核苷酸在结构基因或其片段内使用的选择，其接近在烟草内的密码子使用。因此，优化的基因或核酸序列指原生或天然存在的基因的核苷酸序列，其已被修饰以在感兴趣的种类内利用统计学上-优选的或统计学上-有利的密码子。核苷酸序列通常以DNA水平，并在使用任何合适的程序确定的所述种类中表达的优化编码区内检查，例如如在Sardana et al. (1996, 植物细胞报告(PlantCell Reports) 15:677-681) (也见，美国专利号8,513,488和WO/1993/007278)中所述。在这种方法中，密码子使用的标准差，一种密码子使用偏差的量度，可通过首先发现原生基因的每个密码子使用相对于高度表达的植物基因的平方比例偏差(squared proportionaldeviation)，接着计算平均方差来计算。所用的公式是：1 SDCU=n=1N[(Xn-Yn)/Yn]2/N，在这里Xn指密码子n在高度表达的植物基因中的使用频率，在这里Yn指密码子n在感兴趣的基因中的使用频率和N指密码子在感兴趣的基因中的总数(美国专利号8,513,488)。来自双子叶植物的高度表达的基因的密码子使用可以在Murray et al. (1989, Nuc Acids Res.17:477-498)中发现。

对于特定植物细胞类型，另一个优化根据优选的密码子使用的核酸序列的方法是基于直接使用密码子优化图表例如在密码子使用数据库(Codon Usage Database)，通过日本的NIAS (国立农业科学研究所(National Institute of Agrobiological Sciences))DNA数据库(http://www.kazusa.or.jp/codon/)在线提供的那些，而不进行任何额外的统计学计算。

因此，在特定实施方案中，PON降解酶可以是优化用于在烟草中表达的PAO，其中编码PAO的优化的核苷酸序列包含SEQ ID NO:2的核苷酸序列。

本发明人已进一步发现，烟草细胞中的PON降解的效率可通过将PON降解酶导向液泡来增加。因此，在本发明的某些方面，编码PON降解酶的核苷酸序列(如，来自已知降解尼古丁的真菌或细菌属的PON降解酶；假氧尼古丁胺氧化酶(PAO)；和/或来自假单胞菌菌株HZN6或恶臭假单胞菌S16的PAO)可融合至液泡靶向序列。液泡靶向或分选序列(VSS)是本领域熟知的并可包含3个不同的类型，位于N-末端、C-末端，或所述蛋白内部的那些(见，例如，Neuhaus和Rogers, Plant Mol Biol. 38:127-144 (1998); Misaki et al. J. Biosci Bioengin 112 (5): 476-484 (2011); Vitale和Raikhel Trends in Plant Sci 4(4):149-155 (1999))。因此，任何已知的或后来发现的液泡靶向序列可被用来使本发明的PON降解酶靶向烟草植物的细胞的液泡。在本发明的一些实施方案中，液泡靶向序列可来自烟草。在其它实施方案中，液泡靶向序列是来自并非烟草的植物。

一些示例性液泡靶向序列包括来自以下的液泡靶向序列：小檗碱桥-样酶(berberine bridge-like enzyme)；甘薯prosporamine；大麦proaleurain；大麦血凝素；烟草壳多糖酶；烟草葡聚糖酶；烟草渗透蛋白；巴西坚果和豌豆2S白蛋白贮藏蛋白；蓖麻毒豆蛋白(castor bean ricin)；和/或普通菜豆素(common bean phaseolin)。

在代表性实施方案中，PON降解酶可使用来自烟草小檗碱桥-样酶的液泡靶向或分选序列靶向液泡。烟草小檗碱桥-样酶, 包括，但不限于，BBLa、BBLb、BBLc和BBLd(Kajikawa et al. Plant Physiol. 155:2010-2022 (2011))。在一些实施方案中，编码BBLa的小檗碱桥-样酶的核苷酸序列可以是SEQ ID NO:4的核苷酸序列。在其它实施方案中，编码BBLa的小檗碱桥-样酶的核苷酸序列可以是编码具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的多肽的核苷酸序列。在更进一步的实施方案中，来自小檗碱桥-样酶的液泡靶向序列包含SEQ ID NO:8的核苷酸序列。

在一些实施方案中，编码融合至液泡靶向序列的PON降解酶的核苷酸序列包含SEQID NO:6的核苷酸序列，基本上由，或由SEQ ID NO:6的核苷酸序列组成，其中PON降解酶是来自假单胞菌菌株HZN6的PAO。在进一步的实施方案中，编码融合至液泡靶向序列的PON降解酶的核苷酸序列编码具有SEQ ID NO:7的氨基酸序列的多肽，其中PON降解酶是来自假单胞菌菌株HZN6的PAO，而液泡靶向序列是来自烟草小檗碱桥-样酶(例如，BBLa)。

另外地，为减少细胞外PON和NNK的库的水平，将待转运的编码PON降解酶的核苷酸序列导向质外体可能是有利的。因此，在一些实施方案中，编码PON降解酶的核苷酸序列(如，来自已知降解尼古丁的真菌或细菌菌属/种类的PON降解酶；假氧尼古丁胺氧化酶(PAO)；和/或来自假单胞菌菌株HZN6或恶臭假单胞菌S16的PAO)可以被导向质外体。将蛋白靶向质外体可通过在蛋白的N-末端(例如，在PON降解酶的N-末端)放置可裂解的信号序列以引导其通过内质网(ER)来启动，因而将所述蛋白引入分泌途径。在促进使液泡定位或者保留在ER或高尔基氏体(Golgi)内的另外的信号不存在下，通过分泌途径引导的蛋白通常经“默认途径(default pathway)”被转运到质外体(Hood et al., In A. Altman和P.M.Hasegawa, eds. 植物生物技术和农业(Plant Biotechnology and Agriculture). 第3章. Academic Press, pp. 35-54 (2012))。因此，在一些实施方案中，ER保留信号不存在。

因此，在一些实施方案中，要导向质外体的PON降解酶可融合至ER靶向信号序列。ER靶向信号序列是本领域熟知的(见，例如，Hood et al., In A. Altman和P.M.Hasegawa, eds. 植物生物技术和农业(Plant Biotechnology and Agriculture). 第3章. Academic Press, pp. 35-54 (2012))，而任何已知的或后来发现的ER靶向信号序列可被用来将本发明的PON降解酶导向烟草植物细胞的质外体。在本发明的一些实施方案中，ER靶向信号序列可以是来自烟草。在其它实施方案中，ER靶向信号序列可以是来自并非烟草的植物。

示例性ER靶向信号序列包括，但不限于，来自伸展蛋白、渗透蛋白、渗透蛋白-样蛋白、PR-S、PR1a、大麦α淀粉酶、天蚕抗菌肽(cecropin)、壳多糖酶A、E1内切葡聚糖酶，和/或甘薯sporamin的ER靶向信号序列。

在一些实施方案中，包含至少两种含有编码PON降解酶的核苷酸序列的异源性核酸分子的烟草植物、植物部分和/或植物细胞被提供，其中至少两种异源性核酸分子中的至少一种包含融合至液泡靶向序列的编码PON降解酶的核苷酸序列和至少两种异源性核酸分子中的至少一种包含融合至ER靶向信号序列的编码PON降解酶的核苷酸序列。

包含编码PON降解酶的多核苷酸的本发明核酸分子或表达盒还可包含一种或多种调节序列。因此，在一些实施方案中，本发明提供包含在在5'至3'方向的核酸构建体，一种在从所述启动子下游定位和可操作地与此相关的、本发明的植物细胞和核酸分子中的可操作启动子。在其它实施方案中，调节序列可以是启动子、5’非翻译区(UTR)、3’ UTR、终止序列，或其任何组合。

本发明的另外的实施方案提供从本发明的转基因植物、植物部分或植物细胞产生的后代植物，其中所述后代植物包含一种或多种含有编码假氧尼古丁(PON)降解酶的核苷酸序列，基本上由，或由编码假氧尼古丁(PON)降解酶的核苷酸序列组成的异源性核酸分子。还有的其它实施方案提供来自本发明的转基因植物或后代植物的种子，其中所述种子在其基因组中包含一种或多种含有编码假氧尼古丁(PON)降解酶的核苷酸序列的异源性核酸分子。进一步的实施方案提供从本发明的种子产生的植物。

本发明还提供包含在农田中种植在一起的本发明的多种转基因烟草植物的植物作物。

在另外的实施方案中，本发明提供从转基因烟草植物、植物部分、植物细胞，其后代植物和/或其作物生产的烟草产品，其中产品具有减少量的PON和/或NNK。烟草产品可以是使用本发明的烟草植物，植物部分或植物细胞制得的任何产品。因此烟草产品可以是烟叶、烟丝、生切烟丝、研磨烟丝、粉末烟草、烟草提取物、尼古丁提取物(例如，从本发明的烟草提取的尼古丁，用于，例如，电子香烟(e-cigarettes)或尼古丁替代治疗产品(例如，口香糖、糖锭片、贴片等))、无烟烟草、潮湿或干燥鼻烟、丁香烟、烟斗烟草、雪茄烟草、小雪茄烟烟草、卷烟用烟叶、嚼用烟草、比迪烟(bidis)、bits和含烟草口香糖、糖锭片，或其任何组合。在其它实施方案中，烟草产品可以是小雪茄烟、非透气休闲过滤香烟、透气休闲过滤香烟、雪茄、鼻烟、嚼用烟草，或其任何组合。在一些实施方案中，从本发明的转基因烟草植物，植物部分或植物细胞制得的烟草提取物可用于电子香烟。

如本文描述的，本发明涉及用于减少烟草植物、部分和/或细胞和从中产生的产品中的PON的方法和组合物，从而减少所述烟草植物、部分和/或细胞和从中获得的烟草产品中的PON和/或NNK的量。如本文所用的术语“烟草”意指烟草属(genus Nicotiana)的任何植物。因此，术语“烟草”可包括，但不限于，茄科烟草(Nicotiana L.)、普通烟草(N. Tabacum)、本塞姆氏烟草(N. Benthamiana)、黄花烟草(N. rustica)、具翼烟草(N. alata)、毛叶烟草(N. sylvestris)、渐尖叶烟草(N. acuminata)、南美洲野生烟草(N. bigelovii)、假柴龙树烟草(N. obtusifolia)、夸德瑞伍氏烟草(N. quadrivalvis)、三角叶烟草(N. trigonophylla)、慈竹烟草(N. affinis)、渐狭叶烟草(N. attenuata)、克利夫兰氏烟草(N. clevelandii)、高烟草(N. excelsior)、福尔吉特氏烟草(N. forgetiana)、粉蓝烟草(N. glauca)、心叶烟草(N. glutinosa)、蓝格斯多夫烟草(N. langsdorffii)、长花烟草(N. longiflora)、假柴龙树烟草(N. obtusifolia)、三角叶烟草(N. trigonophylla)、N. palmeri、圆锥烟草(N. paniculata)、蓝茉莉叶烟草(N.plumbaginifolia)、夸德瑞伍氏烟草(N. quadrivalvis)、残波烟草(N. repanda)、香甜烟草(N. suaveolens)、毛叶烟草(N. sylvestris)、绒毛烟草(N. tomentosa)、绒毛花叶烟草(N. Velutina)等。此外，希望TSNA减少，特别是NNK减少的任何种类的烟草可用于本发明。

如本文所用的烟草“植物部分”，包括但不限于生殖组织(例如，花瓣、萼片、雄蕊、雌蕊、花托、花粉囊、花粉、花、果、花蕾、胚珠、种子、胚芽、蒴果)；植物组织(例如，叶柄、茎、根、根毛、根尖、木髓、木、胚根鞘、柄、芽、树枝、树皮、顶端分生组织、腋芽、子叶、胚轴、根、根尖、毛状体、叶)；导管组织(例如，韧皮部和木质部)；特化细胞例如表皮细胞、薄壁组织细胞、chollenchyma细胞、schlerenchyma细胞、叶孔、保卫细胞、表皮、叶肉细胞；愈伤组织；和接枝(cuttings)。术语“植物部分”也包括植物细胞，包括在植物和/或植物部分、植物原生质体(protoplasts)、植物组织、植物器官、植物细胞组织培养物、植物愈伤组织、植物丛等中的完整植物细胞。如本文所用的，“出芽”指包括叶和茎的地上部分。如本文所用的，术语“组织培养物”涵盖组织、细胞、原生质体和愈伤组织的培养物。

如本文所用的，“植物细胞”指烟草植物的结构和生理单元，其通常包含细胞壁，但是也包含原生质体。本发明的烟草植物细胞可以呈现为分离的单个细胞的形式或可以是培养的细胞或可以是高度-有组织的单元部分例如，植物组织(包含愈伤组织)或植物器官。“原生质体”是无细胞壁或仅有部分细胞壁的分离的植物细胞。因此，在本发明的一些实施方案中，包含本发明的核酸分子和/或核苷酸序列的转基因细胞是任何植物或植物部分的细胞，包括，但不限于，根细胞、叶细胞、组织培养细胞、种子细胞、花细胞、果实细胞、花粉细胞等。

“植物细胞培养物”意指植物单元例如，在植物组织、花粉、花粉管、胚珠、胚囊、接合孢子和在各个发育阶段的胚胎中的原生质体、细胞培养物细胞。在本发明的一些实施方案中，转基因组织培养物或转基因植物细胞培养物被提供，其中转基因组织或细胞培养物包含本发明的核酸分子/核苷酸序列。

如本文所用的，“植物器官”是植物的截然不同的和明显的结构和分化部分，例如根、茎、叶、花蕾，或胚胎。

如本文所用的“植物组织”意指组织成一个结构和功能单位的一群植物细胞。植物原位(in planta)或体外培养的任何组织被包括在内。这种术语包括，但不限于，整个植物、植物器官、植物种子、组织培养物和组织成结构和/或功能单位的任何植物细胞群。这个术语与如上所列的或由这个定义另外包含的任何特定类型的植物组织组合使用，或在任何特定类型的植物组织不存在时，不打算排除任何其它类型的植物组织。

如本文所用的，术语“表达(express)”、“表达(expresses)”、“表达的(expressed)”或“表达作用(expression)”等，涉及核酸分子和/或核苷酸序列(例如，RNA或DNA)时，表示核酸分子和/或核苷酸序列被转录并且任选地被翻译。因此，核酸分子和/或核苷酸序列可表达感兴趣的多肽或功能性非翻译RNA。“功能” RNA包括任何非翻译的RNA，其具有细胞的生物学功能，例如，基因表达的调节。这样的功能性RNAs包括但不限于RNAi (例如，siRNA、shRNA、反义RNA)、miRNA、核糖酶、RNA适配子等。

如本文所用的，术语“减少(reduce)”、“减少的(reduced)”、“减少(reducing)”、“减小(reduction)”、“缩小(diminish)”、“抑制(suppress)”和“降低(decrease)” (及其语法变化)，描述例如在其基因组中包含异源性核酸分子的烟草植物、植物部分，或植物细胞中PON和/或NNK含量的减少，所述核酸分子包含编码PON降解酶的核苷酸序列(与在其基因组中不包含含有编码PON降解酶的核苷酸序列的所述异源性核酸分子的对照植物、植物部分，或植物细胞比较)。因此，如本文所用的，术语“减少(reduce)”、“减少(reduces)”、“减少的(reduced)”、“减少(reduction)”、“缩小(diminish)”、“抑制(suppress)”和“降低(decrease)”和类似的术语意指与在其基因组中不包含含有一种编码PON降解酶的核苷酸序列)的所述异源性核酸分子的对照物(如，植物、植物部分，或植物细胞比较，降低至少约1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%,85%、90%、95%、100%等，或更多，或其中的任何范围。

“分离的”核酸分子、“分离的”核苷酸序列或“分离的”多肽是通过人手工，使其离开其原生环境存在和因此不是自然的产物的核酸分子、核苷酸序列或多肽。分离的核酸分子、核苷酸序列或多肽可以纯化的形式存在，其至少部分地从天然存在的生物体或病毒的至少一些其它成分，例如，细胞或病毒的结构成分或通常发现的与多核苷酸相关的其它多肽或核酸分离。在代表性实施方案中，分离的核酸分子，分离的核苷酸序列和/或分离的多肽是至少约1%、5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%，或更高的纯度。

在其它实施方案中，分离的核酸分子、核苷酸序列或多肽可在非-原生环境，例如，重组宿主细胞中存在。因此，例如，关于核苷酸序列，术语“分离的”意指其从染色体和/或细胞(其中它天然存在)分离。多核苷酸也是分离的，如果它是从染色体和/或细胞(其中它天然存在)分离的话，然后插入其中它不是天然存在(如，与在自然界发现的不同的宿主细胞，不同的调节序列，和/或基因组中的不同的位置)的遗传背景、染色体和/或细胞中。因此，重组核酸分子、核苷酸序列及其编码的多肽是“分离的”，其中通过人手工，使它们远离它们的原生环境存在，因此不是自然的产物，然而，在一些实施方案中，它们可以被引入并存在于重组宿主细胞中。

“异源性”核苷酸序列、核酸或多肽是与它引入的宿主细胞并非天然相关的核苷酸序列，包括天然存在的核苷酸序列的非-天然存在的多个拷贝或引入非-天然的基因组邻近序列(例如，不同的染色体、在相同染色体上的不同的位置和/或具有不同的调节要素)的天然存在的核苷酸序列。

“原生”或“野生型”核酸、核苷酸序列、多肽或氨基酸序列指天然存在的或内源性核酸、核苷酸序列、多肽或氨基酸序列。因此，例如，“野生型mRNA”是天然存在于生物体中或内生于生物体中的mRNA。“同源性”核酸序列是与其引入宿主细胞天然相关的核苷酸序列。

也如本文所用的，术语“核酸”、“核酸分子”、“核苷酸序列”和“多核苷酸”可以互换使用并涵盖RNA和DNA二者，包括cDNA、基因组DNA、mRNA、合成的(例如，化学合成的) DNA或RNA和RNA和DNA的嵌合体。术语多核苷酸、核苷酸序列，或核酸指不涉及链长的核苷酸链。核酸可以是双链或单链的。当为单链时，核酸可以是有义链或反义链。核酸可使用寡核苷酸类似物或衍生物(例如，肌苷或硫代磷酸核苷酸)合成。这样的寡核苷酸可用来，例如，制备已改变碱基配对的能力或增加对核酸酶的抵抗的核酸。本发明还提供是本发明的核酸、核苷酸序列，或多核苷酸的补足物(其可以是或者完全的补体或者部分的补体物)的核酸。本文提供的核酸分子和/或核苷酸序列按5’至3’方向(从左到右)存在并使用在美国序列规则，37 CFR §§1.821 - 1.825和世界知识产权组织(World Intellectual PropertyOrganization) (WIPO)标准ST.25中提出的代表核苷酸字符的标准代码表示。

具有同源性的不同的核酸或蛋白在本文被称为“同系物”。术语同系物包括来自相同和其它种类的同源性序列和来自相同和其它种类的直向同源序列。“同源性”指两种或更多种核酸和/或氨基酸序列之间在位置同一性的百分比方面的相似性水平(即，序列相似性或同一性)。同源性也指不同的核酸或蛋白中类似的功能特性的概念。因此，本发明的组合物和方法还包括本发明的核苷酸序列和多肽序列的同系物。如本文所用的“直向同源”，指在物种形成期间源自共同祖先基因的不同种类的同源性核苷酸序列和/或氨基酸序列。本发明的同系物与本发明的核苷酸序列具有显著的序列同一性(例如，70%、75%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%，和/或100%)。

如本文所用的“序列同一性”指两个最优比对的多核苷酸或肽序列在例如核苷酸或氨基酸的整个比对窗口中是不变的程度。“同一性”可以容易地通过已知的方法包括，但不限于在以下文献中描述的那些计算：计算分子生物学(Computational Molecular Biology) (Lesk, A. M., ed.) Oxford University Press, New York (1988)；生物计算：信息学和基因组计划(Biocomputing: Informatics and Genome Projects) (Smith,D. W., ed.) Academic Press, New York (1993)；序列数据的计算机分析，部分I(Computer Analysis of Sequence Data, Part I) (Griffin, A. M.，和Griffin, H.G., eds.) Humana Press, New Jersey (1994)；分子生物学的序列分析(Sequence Analysis in Molecular Biology) (von Heinje, G., ed.) Academic Press (1987)；和序列分析引物(Sequence Analysis Primer) (Gribskov, M.和Devereux, J., eds.)Stockton Press, New York (1991)。

如本文所用的，术语“百分比序列同一性”或“百分比同一性”指当两个序列被最优比对时，参考(“查询(query)”)多核苷酸分子(或其互补链)的线性多核苷酸序列与试验(“主体”)多核苷酸分子(或其互补链)比较时相同的核苷酸的百分比。在一些实施方案中，“百分比同一性”可指氨基酸序列中相同的氨基酸的百分比。

如本文所用的，短语“基本相同的”，在两个核酸分子、核苷酸序列或蛋白序列的邻近序列中，指当与最大的一致比较和比对时，具有至少约70%、至少约75%、至少约80%、至少约81%、至少约82%、至少约83%、至少约84%、至少约85%、至少约86%、至少约87%、至少约88%、至少约89%、至少约90%、至少约95%、至少约96%、至少约97%、至少约98%，或至少约99%的核苷酸或氨基酸残基同一性的两种或更多种序列或子序列，如采用以下序列比较算法或者通过目视检查法之一测定的。在本发明的一些实施方案中，基本同一性存在于为至少约50个残基至约150个残基长度的序列区。因此，在本发明的一些实施方案中，基本同一性存在于为至少约50、约60、约70、约80、约90、约100、约110、约120、约130、约140、约150，或更多个残基长度的序列区。在一些特定实施方案中，所述序列在至少约150个残基上是基本相同的。在进一步的实施方案中，所述序列在全长编码区中是基本相同的。此外，在代表性实施方案中，基本上相同的核苷酸或蛋白序列执行基本相同的功能(如，降解PON或减少PON含量)。

为了序列比较，通常将一个序列用作与试验序列比较的参考序列。当使用序列比较算法时，将试验和参考序列输入计算机，如果必要，指定子序列坐标，并且指定序列算法程序参数。然后基于指定的程序参数，用序列比较算法计算试验序列相对于参考序列的百分比序列同一性。

用于比对比较窗口的序列的最优比对是本领域技术人员熟知的并可通过例如Smith和Waterman的局部同源性算法、Needleman和Wunsch的同源性比对算法、Pearson和Lipman的搜寻相似性方法的工具，并任选地通过这些算法例如作为GCG® WisconsinPackage®的部分(Accelrys Inc., San Diego, CA)可获得的GAP、BESTFIT、FASTA，和TFASTA的计算机实施来进行。用于比对试验序列和参考序列的片段的“同一性分数”是由两个比对序列共享的相同成分的数量除以参考序列片段，即整个参考序列或参考序列的较小限定部分的成分总数得到的数值。百分比序列同一性表示为同一性分数乘以100。一种或多种多核苷酸序列可以对全长多核苷酸序列或其部分，或对更长的多核苷酸序列进行比较。为了本发明的目的，“百分比同一性”也可使用用于翻译的核苷酸序列的BLASTX版本2.0和用于多核苷酸序列的BLASTN版本2.0测定。

用于进行BLAST分析的软件是通过美国国立生物技术信息中心(National Centerfor Biotechnology Information)而可为公众获得的。这种算法涉及通过识别在查询序列中的长度W的短词(当与数据库序列中的相同长度的词比对时，其或者匹配或满足一些正值的阈值评分T)，首先鉴定高得分序列对(HSPs)。T被称为邻近词(neighborhood word)分数阈值(Altschul et al., 1990)。这些初始的邻近词击中率(hits)用作用于初始搜寻以发现含有它们的更长的HSPs的种子。然后词点击沿着每个序列的两个方向扩展，直到累积比对得分可以增加。累积得分对于核苷酸序列使用参数M (用于一对匹配残基的奖励分数；总是> 0)和N (用于错配残基的惩罚分数；总是< 0)计算。对于氨基酸序列，评分矩阵被用来计算累积分数。当累积比对分数从其最大的获得值下降数量X时，词击中在每个方向的扩展停止，由于一种或多种负分残基比对的累积，累积分数趋于零或是低的，或达到任一序列的末端。BLAST算法参数W、T，和X确定敏感性和比对的速度。BLASTN程序(用于核苷酸序列)使用作为11的词长度(W)的默认值，10的期望值(E)，100的截止值，M=5，N=-4，和两条链的比较。对于氨基酸序列，BLASTP程序使用作为3的词长度(W)的默认值，10的期望值(E)，和BLOSUM62评分矩阵(见Henikoff & Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 10915(1989))。

除了计算百分比序列同一性外，BLAST算法也执行两个序列之间的相似性的统计学分析(见，例如，Karlin & Altschul, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 90: 5873-5787(1993))。由BLAST算法提供的相似性的一个量度是最小的概率之和(P(N))，其提供两个核苷酸或氨基酸序列之间的匹配偶然会发生的概率的指示。例如，如果试验核苷酸序列与参考核苷酸序列的比较的最小概率之和少于约0.1-少于约0.001，则试验核酸序列被认为类似于参考序列。因此，在本发明的一些实施方案中，试验核苷酸序列与参考核苷酸序列的比较的最小概率之和少于约0.001。

当两个序列在严格的条件下彼此杂交时，两个核苷酸序列可被认为是基本互补的。在一些代表性实施方案中，认为是基本互补的两个核苷酸序列在非常严格的条件下彼此杂交。

在核酸杂交实验例如DNA杂交和RNA杂交(Northern hybridizations)背景下的“严格的杂交条件”和“严格的杂交清洗条件”是序列依赖性的，且在不同的环境参数下是不同的。对核酸杂交的一个广泛的指导被发现于Tijssen的使用核酸探针的生物化学和分子生物学-杂交实验室技术(Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization with Nucleic Acid Probes)部分I第2章“杂交原理和核酸探针测定策略的一般观察(Overview of principles of hybridization and the strategyof nucleic acid probe assays)” Elsevier, New York (1993)中。一般来说，选非常严格的杂交和清洗条件被择为比对于在限定的离子强度和pH下的特定序列的热熔点(T_m)低约5℃。

T_m是50%的靶序列杂交于优选匹配的探针的温度(在限定的离子强度和pH下)。非常严格的条件被选择为等于对一个特定探针的T_m。在DNA印迹和RNA印迹中，对于在滤器上具有超过100个互补残基的互补核苷酸序列的杂交的严格杂交条件的例子是于42℃下的含1 mg肝素的50%甲酰胺，且杂交进行过夜。非常严格的清洗条件的一个实例是于72℃下的0.1 5M NaCl约15分钟。严格的清洗条件的一个实例是于65℃进行0.2x SSC清洗15分钟(见, Sambrook, infra, 对SSC缓冲液的描述)。通常，非常严格的清洗先用低严格清洗进行以除去背景探针信号。对于例如，超过100个核苷酸的双链的中等严格清洗一个实例是于45℃下的1x SSC经15分钟。对于例如，超过100个核苷酸的双链的低严格清洗的一个实例是于40℃下的4-6x SSC经15分钟。对于短探针(例如，约10-50个核苷酸)，严格的条件通常包括于pH 7.0-8.3的少于约1.0 M Na离子，通常约0.01-1.0 M Na离子浓度(或其它盐)的盐浓度，且温度通常至少约30℃。严格的条件也可用添加去稳定剂例如甲酰胺获得。一般来说，在特定杂交测定中，2x (或更高)的信噪比(相比对无关的探针观察到的信噪比)指示特定杂交的检测。在严格的条件下彼此不杂交的核苷酸序列，如果它们编码的蛋白是基本上相同的，则仍然是基本相同的。这可发生在例如当核苷酸序列的拷贝使用由遗传代码允许的最大密码子简并度创建时。

以下是可以用来克隆与本发明的参考核苷酸序列是基本相同的同源性核苷酸序列的几组杂交/清洗条件的实例。在一个实施方案中，参考核苷酸序列于50℃在7%十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5 M NaPO₄、1 mM EDTA中(伴有于50℃在2X SSC, 0.1% SDS中的清洗)，杂交于“试验”核苷酸序列。在另一个实施方案中，参考核苷酸序列于50℃在7%十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5 M NaPO₄、1 mM EDTA中(伴有于50℃在1X SSC、0.1% SDS中的清洗)或于50℃在7%十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5 M NaPO₄, 1 mM EDTA中(伴有于50℃在0.5X SSC、0.1%SDS中的清洗)，杂交于“试验”核苷酸序列。在更进一步的实施方案中，参考核苷酸序列于50℃在7%十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5 M NaPO₄、1 mM EDTA中(伴有于50℃在0.1X SSC、0.1%SDS中的清洗)，或于50℃在7%十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5 M NaPO₄、1 mM EDTA中(伴有于65℃在0.1X SSC、0.1% SDS中的清洗)，杂交于“试验”核苷酸序列。

在本发明的一些实施方案中，提供与本发明的核苷酸序列(例如，编码PON降解酶)具有显著的序列同一性的核苷酸序列。“显著的序列同一性”或“显著的序列相似性”意指与另一个核苷酸序列至少约70%、75%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%，和/或100%同一性或相似性。因此，在另外的实施方案中，“显著的序列同一性”或“显著的序列相似性”意指与另一个核苷酸序列约70%-约100%、约75%-约100%、约80%-约100%、约81%-约100%、约82%-约100%、约83%-约100%、约84%-约100%、约85%-约100%、约86%-约100%、约87%-约100%、约88%-约100%、约89%-约100%、约90%-约100%、约91%-约100%、约92%-约100%、约93%-约100%、约94%-约100%、约95%-约100%、约96%-约100%、约97%-约100%、约98%-约100%，和/或约99%-约100%的同一性或相似性的范围。因此，在一些实施方案中，本发明的核苷酸序列是与SEQ ID NO:1和/或SEQ ID NO:2的任何核苷酸序列具有显著的序列同一性的核苷酸序列。在特定实施方案中，本发明的核苷酸序列是与例如SEQ ID NO:1和/或SEQ ID NO:2的任何核苷酸序列具有至少75%序列同一性的核苷酸序列，且其中所述核苷酸序列编码一种包含PON降解活性的多肽。

在一些实施方案中，本发明的多肽包含氨基酸序列，基本上由，或由氨基酸序列组成，所述氨基酸序列是与例如，SEQ ID NO:3的氨基酸序列至少70%相同的，例如，至少70%、75%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%，和/或100%相同的，且其包含PON降解活性。

在一些实施方案中，本发明的多肽或核苷酸序列可以是保守地修饰的变体。如本文所用的，"保守地修饰的变体"指含有个别取代、缺失或添加的多肽和核苷酸序列，其改变、添加或缺失序列中的单个氨基酸或核苷酸或小百分比的氨基酸或核苷酸，其中改变导致用化学类似的氨基酸取代氨基酸。提供功能类似的氨基酸的保守的取代图表是本领域熟知的。

如本文所用的，多肽的保守地修饰的变体是生物学活性的并因此具有如本文描述的参考多肽的所需的活性(例如，PON降解活性；减少植物中的PON和/或NNK含量)。所述变体可从例如，遗传多态性或人类操纵而产生。参考多肽的生物学活性变体可具有与用于参考多肽的氨基酸序列至少约40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%，或更多的序列同一性或相似性(例如，约40%-约99%或更多的序列同一性或相似性及其中的任何范围)，如通过本文别处描述的序列比对程序和参数所测定的。活性的变体可不同于参考多肽序列，差异为少至1-15个氨基酸残基、少至1-10，例如6-10、少至5、少至4、3、2，或甚至是1个氨基酸残基。

天然存在的变体可存在于群体中。这样的变体可采用熟知的分子生物学技术，例如聚合酶链反应(PCR)，和如下所述的杂交鉴定。合成衍生的核苷酸序列，例如，由定点突变或PCR-介导的突变生成的序列(其仍编码本发明的多肽)也作为变体包括在内。一种或多种核苷酸或氨基酸取代、添加，或缺失可被引入在此公开的核苷酸或氨基酸序列，以致取代、添加，或缺失被引入编码的蛋白。添加(插入)或缺失(截短)可以在原生蛋白的N-末端或C-末端，或在原生蛋白的一种或多种位点进行。类似地，一种或多种核苷酸或氨基酸的取代可以在原生蛋白的一种或多种位点进行。

例如，保守的氨基酸取代可以在一种或多种预定的，优选非必需氨基酸残基上进行。"非必需的"氨基酸残基是可从野生型序列的蛋白改变，但不改变生物学活性的残基，而"必需"氨基酸对于生物活性是需要的。"保守的氨基酸取代"是其中氨基酸残基用具有类似侧链的氨基酸残基替代的氨基酸取代。具有类似的侧链的氨基酸残基的家族是本领域已知的。这些家族包括具有碱性侧链(例如，赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(例如，天冬氨酸、谷氨酸)、无电荷的极性侧链(例如，甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、非极性侧链(例如，丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、β-分枝侧链(例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳族侧链(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)的氨基酸。这样的取代将不对保守的氨基酸残基，或对保持在保守的基序内的氨基酸残基进行，在这里这样的残基对蛋白活性是必要的。

例如，参考多肽的氨基酸序列变体可通过使编码酶的核苷酸序列突变来制备。生成的突变体可以在植物中重组表达，并通过使用如本文描述的标准测定技术测定增加或减少的尼古丁含量，对保留生物学活性的那些突变体进行筛选。用于突变和核苷酸序列改造的方法是本领域已知的。见，例如，Kunkel (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:488-492; Kunkel et al. (1987) Methods in Enzymol. 154:367-382；和分子生物学技术(Techniques in Molecular Biology) (Walker & Gaastra eds., MacMillanPublishing Co. 1983)和在此引用的参考文献；以及美国专利号4,873,192。很明显，在DNA编码变体中的进行的突变必须不得破坏阅读框，并且优选地将不创建可产生第二mRNA结构的互补区。见，欧洲专利申请公布号75,444。至于不影响感兴趣蛋白的生物学活性的适宜氨基酸取代的指导可以在Dayhoff et al. (1978) Atlas of Protein Sequence and Structure (美国国家生物医学研究基金会(National Biomedical ResearchFoundation), Washington, D.C.)的模型中发现，通过引用结合到本文中。

预期在此描述的多肽中的缺失、插入和取代不会对多肽的特性(例如，多肽的活性)产生根本的改变。然而，当难以预测在这样做之前取代、缺失或插入的确切的影响时，本领域技术人员将意识到所述影响可通过可筛选感兴趣的特定多肽活性(例如，减少PON含量)的常规筛选测定来评价。

在一些实施方案中，本发明的组合物可包含多肽的活性片段。如本文所用的，"片段"意指保留赋予植物的增加或减少的尼古丁含量的多肽活性的参考多肽部分。片段也意指编码参考多肽的核酸分子部分。多肽的活性片段可例如通过分离表达的多肽-编码核酸分子部分，以产生多肽的编码片段(例如，通过体外重组表达)，并评价片段的活性来制备。编码这样的片段的核酸分子可以是至少约150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、800、900、1,000、1,100、1,200、1,300、1,400、1,500个连续的核苷酸，或至多为存在于全长多肽-编码核酸分子中的核苷酸数量。同样地，多肽片段可以是至少约50、60、70、80、90、100、125、150、175、200、225、250、275、300、325、350、375、400、425、450、475、500个连续的氨基酸残基，或至多为存在于全长多肽中的氨基酸残基的总数。

因此，在一些实施方案中，本发明的多肽的变体或功能片段或与本发明的多肽序列(例如，SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:7)具有基本同一性的变体或功能片段当在转基因植物中产生时，减少生产所述多肽的转基因植物的PON含量，从而减少从所述转基因植物生产的烟草产品中的PON和/或NNK的量。

在一些实施方案中，本发明的核苷酸序列和/或核酸分子可以是可操作地/有效地连接于多种用于在宿主细胞(例如，植物细胞)中表达的启动子。因此，在一些实施方案中，本发明提供转化的宿主细胞和包含转化的宿主细胞的转化的生物体，其中宿主细胞和生物体用一种或多种本发明的核酸分子/核苷酸序列转化。如本文所用的，“可操作地连接于”当提及可操作地连接于第二核酸序列的第一核酸序列时，意指第一核酸序列处于与第二核酸序列的功能关系中的情况。例如，如果启动子进行编码序列的转录或表达，则启动子与编码序列可操作地连接。

在多肽的情况下，“可操作地连接于”，在提及可操作地连接于第二多肽序列的第一多肽序列时，意指第一多肽序列处于与第二多肽序列的功能关系中的情况。例如，如果靶向序列在细胞或生物体中进行感兴趣的多肽序列的寻靶/定位，感兴趣的多肽(如，PON降解酶)可以可操作地连接于靶向肽(例如，液泡靶向序列或ER靶向信号序列)。

可用于启动植物细胞中的转录的任何启动子可用于本发明的表达盒。“启动子”，如本文所用的，是控制或调节可操作地与启动子连接的核苷酸序列(即，编码序列)的转录的核苷酸序列。通常，“启动子”指含有对RNA聚合酶II的结合位点并引导转录的启动的核苷酸序列。一般来说，启动子被发现在相对于对应的编码序列的编码区的起点的5'，或上游。启动子区域可包含用作基因表达的调节剂的其它要素。这些包括TATA盒共有序列，且往往包括CAAT盒共有序列(Breathnach和Chambon, (1981) Annu. Rev. Biochem. 50:349)。在植物中，CAAT盒可以被AGGA盒取代(Messing et al., (1983)在植物的遗传工程改造(Genetic Engineering of Plants)，T. Kosuge, C. Meredith和A. Hollaender (eds.),Plenum Press, pp. 211-227)。

启动子可包括，例如，组成型、诱导型, 暂时调节的、发育调节的, 化学调节的、组织-优选的和组织-特异性启动子，其用于制备重组核酸分子，即嵌合基因。

启动子的选择将取决于对表达的时间和空间的需求，并且还取决于待转化的宿主细胞而变化。因此，例如，当需要在特定组织或器官中表达时，组织-特异性或组织优选的启动子可被使用(如，根或叶特异性/优选的启动子)。相反，当需要对刺激的响应表达时，由刺激物或化学物诱导的启动子可以使用。当需要以相对恒定的水平在生物体的整个细胞或组织中连续表达时，组成型启动子可被选择。

因此，本发明的有用的启动子包括，但不限于，驱动核苷酸序列组成型表达的那些，当诱导时驱动表达的那些，和以组织-或发育-特定方式驱动表达的那些。这些各种类型的启动子是本领域已知的。而且，启动子可以在待转化的植物中鉴定和从待转化的植物分离，然后插入要用于所述植物或另一种植物的转化的表达盒中。

组成型启动子的实例包括，但不限于，夜香树属(cestrum)病毒启动子(cmp) (美国专利号7,166,770)、大米肌动蛋白1启动子(Wang et al. (1992) Mol. Cell. Biol.12: 3399-3406; 及美国专利号5,641,876)、CaMV 35S启动子(Odell et al. (1985)Nature 313: 810-812)、CaMV 19S启动子(Lawton et al. (1987) Plant Mol. Biol. 9:315-324), nos启动子(Ebert et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci USA 84:5745-5749)、Adh启动子(Walker et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:6624-6629)、蔗糖合酶启动子(Yang & Russell (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:4144-4148)，和遍在蛋白启动子。从遍在蛋白获得的组成型启动子在许多类型的细胞中积聚。遍在蛋白启动子已从用于转基因植物的几种植物种类克隆，例如葵花(Binet et al.,1991. 植物科学(Plant Science) 79: 87-94)、玉米(Christensen et al., 1989. Plant Molec. Biol. 12: 619-632)，以及拟南芥属(arabidopsis) (Norris et al. 1993.Plant Molec. Biol. 21: 895-906)。在代表性实施方案中，本发明的核苷酸序列(例如，编码PON降解酶的核苷酸序列)可以可操作地连接于如本文描述的组成型启动子。

在一些实施方案中，可使用组织特异性/组织优选的启动子。组织特异性或优选的表达模式包括，但不限于，绿色组织特异性或优选的、根特异性或优选的、茎特异性或优选的，和花特异性或优选的。适合于在绿色组织中表达的启动子包括调节参与光合成的基因的多数，并且这些中的许多已从单子叶植物和双子叶植物二者中克隆。在一个实施方案中，本发明的有用的启动子是来自磷酸烯醇羧酸酶基因的玉米PEPC启动子(Hudspeth &Grula, Plant Molec. Biol. 12:579-589 (1989))。组织-特异性启动子的非-限制性实例包括与编码种子贮藏蛋白的基因相关的那些(例如β-伴大豆球蛋白、甘蓝型油菜籽蛋白(cruciferin)、油菜种子储藏蛋白(napin)和云扁豆蛋白(phaseolin))、玉米蛋白或油体蛋白(例如油质蛋白(oleosin))，或参与脂肪酸生物合成的蛋白(包含酰基载体蛋白、硬脂酰-ACP去饱和酶和脂肪酸去饱和酶(fad 2-1))，和在胚胎发育期间的其它核酸表达(例如Bce4, 见，例如，Kridl et al. (1991) Seed Sci. Res. 1:209-219; 以及EP Patent No.255378)。可用于本发明的核苷酸序列在植物中的表达的组织-特异性或组织-优先启动子包括，但不限于，在根、木髓、叶或花粉中直接表达的那些。这样的启动子公开于例如WO 93/07278中，其与这种文句和/或章节有关的讲述的整体通过引用结合到本文中。本发明有用的组织特异性或组织优选的启动子的其它非-限制性实例，棉二磷酸羧化酶加氧酶(cottonrubisco)启动子公开于美国专利6,040,504中；大米蔗糖合酶启动子公开于美国专利5,604,121中；根特定启动子由de Framond (FEBS 290:103-106 (1991); 授权于Ciba-Geigy 的EP 0 452 269)描述；茎特定启动子描述于美国专利5,625,136 (授权于Ciba-Geigy)且其驱动玉米trpA基因的表达；和洋丁香黄曲叶病毒(cestrum yellow leafcurling virus)启动子公开于WO 01/73087中，全部通过引用以与这种文句和/或章节有关的讲述的整体结合到本文中。

组织-特异性/组织优选的启动子的另外的实例包括，但不限于，根-特异性启动子RCc3 (Jeong et al. Plant Physiol. 153: 185-197 (2010))和RB7 (美国专利号5459252)、血凝素启动子(Lindstrom et al. (1990) Der. Genet. 11:160-167；和Vodkin(1983) Prog. Clin. Biol. Res. 138:87-98)、玉米乙醇脱氢酶1启动子(Dennis et al.(1984) Nucleic Acids Res. 12:3983-4000)、S-腺苷酰-L-甲硫氨酸合成酶(SAMS)(Vander Mijnsbrugge et al. (1996) 植物和细胞生理学(Plant and Cell Physiology), 37(8): 1108-1115)、玉米捕光复合体启动子(Bansal et al. (1992)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 3654-3658)、玉米热休克蛋白启动子(O'Dell et al.(1985) EMBO J. 5: 451-458；和Rochester et al. (1986) EMBO J. 5:451-458)、豌豆小亚基RuBP羧酸酶启动子(Cashmore, “核酮糖-l,5-二磷酸羧化酶的核基因编码小亚基(Nuclear genes encoding the small subunit of ribulose-l,5-bisphosphatecarboxylase)” pp. 29-39 在：植物的遗传工程改造(Genetic Engineering of Plants)(Hollaender ed., Plenum Press 1983；和Poulsen et al. (1986) Mol. Gen. Genet.205: 193-200)、Ti质粒甘露氨酸(mannopine)合酶启动子(Langridge et al. (1989)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 3219-3223)、Ti质粒胭脂碱合酶启动子(Langridge et al. (1989), supra)、矮牵牛花查耳酮异构酶启动子(van Tunen et al. (1988) EMBO J.7: 1257-1263)、豆富含甘氨酸的蛋白1启动子(Keller et al. (1989) Genes Dev. 3:1639-1646)、截短的CaMV 35S启动子(O'Dell et al. (1985) Nature 313: 810-812)、马铃薯糖蛋白(potato patatin)启动子(Wenzler et al. (1989) Plant Mol. Biol. 13:347-354)、根细胞启动子(Yamamoto et al. (1990) Nucleic Acids Res. 18:7449)、玉米的玉米蛋白启动子(Kriz et al. (1987) Mol. Gen. Genet. 207:90-98; Langridge et al. (1983) Cell 34: 1015-1022; Reina et al. (1990) Nucleic Acids Res. 18:6425; Reina et al. (1990) Nucleic Acids Res. 18:7449；和Wandelt et al. (1989)Nucleic Acids Res. 17:2354)、球蛋白-1启动子(Belanger et al. (1991) Genetics129: 863-872)、α-微管蛋白cab启动子(Sullivan et al. (1989) Mol. Gen. Genet.215:431-440)、PEPCase启动子(Hudspeth & Grula (1989) PlantMol. Biol. 12:579-589)、R基因复合体-相关启动子(Chandler et al. (1989) Plant Cell 1:1175-1183)，和查耳酮合酶启动子(Franken et al. (1991) EMBO J. 10: 2605-2612)。在一些特定实施方案中，本发明的核苷酸序列可操作地与根-优选的启动子连接。

对于种子-特异性表达特别有用的是豌豆的豌豆球蛋白启动子(Czako et al.(1992) Mol. Gen. Genet. 235:33-40；以及公开于美国专利号5,625,136中的种子-特异性启动子。

用于在成熟的叶子中表达的有用的启动子是那些在衰老发生时开启的启动子，例如来自拟南芥属(Arabidopsis)的SAG启动子(Gan et al. (1995) Science 270: 1986-1988)。在代表性实施方案中，衰老诱导型启动子可以可操作地连接于编码PON降解酶的核苷酸序列。衰老-诱导型启动子的另外的实例是来自CYP82E4基因的启动子(Chakrabartiet al. Plant Mol. Biol. 66: 415-427 (2008)。CYP82E4基因的启动子不仅在自然衰老期间激活，而且在风干期间也是非常活泼的，这是一种控制衰老的形式。由于TSNA形成在熟化期间大大增强，使本发明的核苷酸序列(例如，编码PON降解酶的核苷酸序列)在这时表达可能是有利的。

此外，在质体中发挥功能的启动子可被利用。这样的启动子的非-限制性实例包括噬菌体T3基因9 5' UTR和在美国专利号7,579,516中公开的其它启动子。本发明的有用的其它启动子包括但不限于S-E9小亚基RuBP羧酸酶启动子和 Kunitz胰蛋白酶抑制剂基因启动子(Kti3)。

在本发明的一些实施方案中，可使用诱导型启动子。因此，例如，化学-调节的启动子可被用来通过外源性化学调节剂的应用来调节在植物中的基因表达。本发明的核苷酸序列表达的调节，经由化学调节的启动子，能够使本发明的多肽仅当用诱导性化学物处理作物植物时被合成。取决于目的，启动子可以是化学-诱导型启动子，其中化学物的应用诱导基因表达，或化学-可抑制的启动子，其中化学物的应用抑制基因表达。

化学诱导型启动子是本领域已知的并包括，但不限于，玉米In2-2启动子(其由苯磺酰胺除草剂安全剂激活)、玉米GST启动子(其通过用作出土前施用的(pre-emergent)除草剂的疏水性亲电化合物激活)，和烟草PR-1启动子(其由水杨酸(例如，PR1a系统) 激活)、类固醇类固醇-反应性启动子(见，例如，在Schena et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 10421-10425和McNellis et al. (1998) Plant J. 14, 247-257)中的糖皮质激素-诱导型启动子，以及四环-诱导型和四环-可抑制的启动子(见，例如，Gatz etal. (1991) Mol. Gen. Genet. 227, 229-237，和美国专利号5,814,618和5,789,156，Lac抑制剂系统启动子、铜-诱导型系统启动子、水杨酸-诱导型系统启动子(例如，PR1a系统)、糖皮质激素-诱导型启动子(Aoyama et al. (1997) Plant J. 11:605-612)，和蜕皮激素(ecdysone)-诱导型系统启动子。

诱导型启动子的其它非-限制性实例包括ABA-和膨压(turgor)-诱导型启动子、植物生长素-结合蛋白基因启动子(Schwob et al. (1993) Plant J. 4:423-432)、UDP葡萄糖类黄酮糖基转移酶启动子(Ralston et al. (1988) Genetics 119:185-197)，MPI蛋白酶抑制剂启动子(Cordero et al. (1994) Plant J. 6:141-150)，和甘油醛-3-磷酸脱氢酶启动子(Kohler et al. (1995) Plant Mol. Biol. 29:1293-1298; Martinez et al.(1989) J. Mol. Biol. 208:551-565；和Quigley et al. (1989) J. Mol. Evol. 29:412-421)。苯磺酰胺-诱导型(美国专利号5,364,780)和醇-诱导型(国际专利申请公布号WO97/06269和WO 97/06268)系统和谷胱甘肽S-转移酶启动子也包括在内。同样，人们可使用在Gatz (1996) Current Opinion Biotechnol. 7:168-172和Gatz (1997) Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 48:89-108中描述的任何诱导型启动子。可用于引导本发明的核苷酸序列在植物中表达的其它化学诱导型启动子被公开于美国专利5,614,395，其通过引用以其整体结合到本文中。基因表达的化学诱导也被详细描述于发表的申请EP 0 332 104 (授权于Ciba- Geigy)和美国专利5,614,395中。在一些实施方案中，用于化学诱导的启动子可以是烟草PR-1a启动子。

如本文所用的，“表达盒”意指包含一种感兴趣的核苷酸序列(如，编码PON降解酶的核苷酸序列)的核酸分子，其中所述核苷酸序列可操作地与至少一个对照序列(如，启动子)连接。因此，本发明的一些实施方案提供被设计以表达本发明的核苷酸序列的表达盒。采用这种方式，例如，可操作地与一种或多种编码PON降解酶的核苷酸序列(例如，SEQ IDNO:1, SEQ ID NO:2，和/或SEQ ID NO:6，和/或编码一种或多种具有SEQ ID NO:3或SEQ IDNO:7的氨基酸序列的多肽的核苷酸序列)连接的一种或多种植物启动子被提供在表达盒中，用于在生物体或其细胞(如，植物、植物部分和/或植物细胞)中的表达。

包含一种感兴趣的核苷酸序列的表达盒可以是嵌合的，意指其成分的至少一种对于其其它成分的至少一种是异源性的。表达盒也可以是天然存在的表达盒，但以可用于异源性表达的重组形式获得。然而，通常表达盒是对于宿主异源性的，即表达盒的特定核酸序列并不天然存在于宿主细胞中，而必须通过转化事件引入宿主细胞或原始宿主细胞。

除了启动子可操作地连接于本发明的核苷酸序列外，本发明的表达盒还可包括其它调节序列。如本文所用的，“调节序列”意指位于编码序列的上游(5'非-编码序列)、编码序列内或编码序列的下游(3'非-编码序列)的核苷酸序列，且其影响相关的编码序列的转录、RNA加工或稳定性，或翻译。调节序列包括，但不限于，启动子、增强子、内含子、5’和3’非翻译区、翻译前导序列、终止信号，和多腺苷酸化信号序列。

为了本发明的目的，调节序列或区可以是原生的/类似于植物、植物部分和/或植物细胞，和/或调节序列可以是原生/类似于其它调节序列。或者，调节序列可以是与植物(和/或植物部分和/或植物细胞)不同的和/或彼此(即，调节序列)不同的。因此，例如，启动子可以是异源性的，当它可操作地连接于来自与从中获得多核苷酸的种类不同的种类的多核苷酸。或者，如果启动子是来自从中获得多核苷酸的相同/类似的种类，则启动子也可以是与选择的核苷酸序列不同的，但一或二者(即，启动子和/或多核苷酸)被基本从它们的原始形式和/或基因位点进行修饰，和/或启动子不是可操作地连接的多核苷酸的原生启动子。

从病毒获得的许多非-翻译前导序列已知增强基因表达。特别地，来自烟草花叶病毒(Tobacco Mosaic Virus) (TMV，“ω-序列”)、玉米萎黄病斑点病毒(Maize ChloroticMottle Virus) (MCMV)和苜蓿花叶病毒(Alfalfa Mosaic Virus) (AMV)的前导序列已显示有效地提高表达(Gallie et al. (1987) Nucleic Acids Res. 15:8693-8711；和Skuzeski et al. (1990) Plant Mol. Biol. 15:65-79)。本领域已知的其它前导序列包括，但不限于，小核糖核酸病毒前导序列例如脑心肌炎病毒(EMCV) 5'非编码区前导序列(Elroy-Stein et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:6126-6130)；马铃薯Y病毒属(potyvirus)前导序列例如烟草蚀纹病毒(Tobacco Etch Virus) (TEV)前导序列(Allison et al. (1986) Virology 154:9-20)；玉米矮花叶病毒(Maize Dwarf MosaicVirus) (MDMV)前导序列(Allison et al. (1986), supra)；人免疫球蛋白重链结合蛋白(BiP)前导序列(Macejak & Samow (1991) Nature 353:90-94)；来自AMV的外壳蛋白mRNA的非翻译前导序列(AMV RNA 4; Jobling & Gehrke (1987) Nature 325:622-625)；烟草花叶TMV前导序列(Gallie et al. (1989) RNA的分子生物学(Molecular Biology of RNA)237-256)；和MCMV前导序列(Lommel et al. (1991) Virology 81:382-385)。也见，Della-Cioppa et al. (1987) Plant Physiol. 84:965-968。

表达盒也可任选地包括在植物中发挥功能的转录和/或翻译终止区(即，终止区)。各种转录终止子可被获得用于表达盒并负责感兴趣的异源性核苷酸序列之外的转录的终止和改正mRNA多腺苷酸化。终止区可天然来自转录起始区，可天然来自可操作地连接的感兴趣的核苷酸序列，可天然来自植物宿主，或可从另一个来源(即，异质的或异源性启动子、感兴趣的核苷酸序列，植物宿主，或其任何组合)获得。适宜的转录终止子包括，但不限于，CAMV 35S终止子、tml终止子、胭脂碱合酶终止子和/或豌豆rbcs E9终止子。

本发明的表达盒也可包括用于可选标记的核苷酸序列，其可被用来选择转化的植物、植物部分和/或植物细胞。如本文所用的，“可选标记”意指当表达时赋予表达标记的植物、植物部分和/或植物细胞不同的表型并因此允许这样转化的植物，植物部分和/或植物细胞与没有所述标记的那些区别开来的核苷酸序列。这样一种核苷酸序列可编码或者可选择的或者可筛选的标记，这取决于标记是否授予可通过化学方法，例如通过使用选择剂(例如，抗生素、除草剂等)选择的特征，或取决于标记是否只是一个可通过观察或试验，例如通过筛选(例如，R-基因座特征(R-locus trait))鉴定的特征。当然，合适的可选标记的许多实例是本领域已知的并可用于本文描述的表达盒。

可选标记的实例包括，但不限于，核苷酸序列编码neo或nptII (其赋予对卡那霉素的抗性)、G418等(Potrykus et al. (1985) Mol. Gen. Genet. 199:183-188)；编码bar的核苷酸序列(其赋予对草胺膦(phosphinothricin)的抗性)；编码改变的5-莽草酸-3-磷酸(enolpyruvylshikimate-3-phosphate) (EPSP)合酶核苷酸序列的(其赋予对草甘磷(glyphosate)的抗性) (Hinchee et al. (1988) Biotech. 6:915-922)；编码腈水解酶(nitrilase)例如来自臭鼻克雷白氏杆菌(Klebsiella ozaenae)的bxn的核苷酸序列(其赋予对溴草腈(bromoxynil)的抗性) (Stalker et al. (1988) Science 242:419-423)；编码改变的乙酰乳酸合酶(ALS)的核苷酸序列(其赋予对咪唑啉酮、磺酰脲或其它ALS-抑制化学物的抗性) (欧洲专利申请号154204)；编码甲氨蝶呤-抗性二氢叶酸还原酶(DHFR)的核苷酸序列(Thillet et al. (1988) J. Biol. Chem. 263:12500-12508)；编码茅草枯脱卤酶的核苷酸序列(dalapon dehalogenase) (其赋予对茅草枯的抗性)；编码甘露糖-6-磷酸异构酶(mannose-6-phosphate isomerase) (也称为磷酸甘露糖异构酶(PMI))的核苷酸序列(其赋予代谢甘露糖的能力) (美国专利号5,767,378和5,994,629)；编码改变的邻氨基苯甲酸合酶的核苷酸序列(其赋予对5-甲基色氨酸的抗性)；和/或编码hph的核苷酸序列(其赋予对潮霉素的抗性)。本领域技术人员能够选择用于本发明的表达盒的合适的可选标记。

另外的可选标记包括，但不限于，编码β-葡糖醛酸酶或uidA (GUS)的核苷酸序列(其编码对各种产色底物是已知的酶)；R-位点核苷酸序列(其编码一种调节植物组织中花色苷色素(anthocyanin pigments) (红色)产生的产物) (Dellaporta et al., “用Ac转座子标记玉米R-nj等位基因的分子克隆(Molecular cloning of the maize R-nj alleleby transposon-tagging with Ac)”, pp. 263-282在：染色体结构和功能：新概念的冲击(Chromosome Structure and Function: Impact of New Concepts), 第18届遗传学研讨会(18th Stadler Genetics Symposium) (Gustafson & Appels eds., Plenum Press1988))；编码β-内酰胺酶(一种各种产色底物已知的酶(例如，PADAC、产色头孢菌素(chromogenic cephalosporin)))的核苷酸序列(Sutcliffe (1978) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75:3737-3741)；编码xylE的核苷酸序列，其编码一种儿茶酚双加氧酶(Zukowskyet al. (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:1101-1105)；编码酪氨酸酶(一种能将酪氨酸氧化为DOPA和多巴醌(dopaquinone)的酶，后者依次缩聚形成黑色素(melanin))的核苷酸序列(Katz et al. (1983) J. Gen. Microbiol. 129:2703-2714)；编码β-半乳糖苷酶(一种有产色底物的酶)的核苷酸序列；编码荧光素酶(lux)的核苷酸序列，其允许用于生物荧光检测(bioluminescence detection) (Ow et al. (1986) Science 234:856-859)；编码水母发光蛋白(aequorin)的核苷酸序列，其可用于钙-敏生物荧光检测(Prasheret al. (1985) Biochem. Biophys. Res. Comm. 126:1259-1268)；或编码绿色荧光蛋白的核苷酸序列(Niedz et al. (1995) Plant Cell Reports 14:403-406)。本领域技术人员能够选择用于本发明的表达盒的合适的可选标记。

本发明的表达盒也可包括编码其它所需的特征的核苷酸序列。这样的所需的特征可以是赋予各个农业上需要的特征例如疾病和/或昆虫抵抗、耐除草剂、耐非生物胁迫或抗性等的其它核苷酸序列。这样的核苷酸序列可以用任何组合的核苷酸序列堆积，以创建具有所需表型的植物、植物部分或植物细胞。堆积组合可通过任何方法创建，包括，但不限于，通过任何常规方法，或者通过遗传转化来杂交育种植物。如果通过遗传转化植物为既抗虫又耐受除草剂的，则编码另外的所需特征的核苷酸序列可以在任何时间和以任何次序合并。例如，包含一种或多种所需的特征的转基因植物可用作通过随后的转化导入进一步的特征的靶标。另外的核苷酸序列可以共同-转化方案，用由表达盒的任何组合提供的核苷酸序列、核酸分子、核酸构建体，和/或本发明的组合物同时引入。例如，如果两个核苷酸序列被引入，它们可以结合到分开的盒中(反式)或可以结合到同一个盒中(顺式)。核苷酸序列的表达可通过相同启动子或者通过不同的启动子驱动。进一步认识到核苷酸序列可在所需的基因组位置，使用位点-特异性重组系统堆积。见，例如，国际专利申请号WO 99/25821；WO99/25854；WO 99/25840；WO 99/25855和WO 99/25853。

除了表达盒外，本文描述的核酸分子和核苷酸序列可以用于与载体连接。术语“载体”指用于转移、传递或引入一个核酸(或多个核酸)至细胞中的组合物。载体包含含有待转移、传递或引入的核苷酸序列的核酸分子。用于植物和其它生物体的转化的载体是本领域熟知的。通用类型的载体的非-限制性实例包括，但不限于，病毒载体、质粒载体、噬菌体载体、噬菌粒(phagemid)载体、粘粒、fosmid、噬菌体，或人工染色体。载体的选择将取决于优选的转化技术和用于转化的目标种类。因此，在进一步的实施方案中，本发明的重组核酸分子可被包含在重组载体内。载体的大小可根据载体是否包含一种或多种表达盒(例如，用于分子堆积)而有很大的变化。因此，载体大小可在从约3 kb至约30 kb的范围内。因此，在一些实施方案中，载体的大小是约3 kb、4kb、5 kb、6 kb、7 kb、8 kb、9 kb、10 kb、11 kb、12kb、13 kb、14kb、15 kb、16 kb、17 kb、18 kb、19 kb、20 kb、21 kb、22 kb、23 kb、24kb、25kb、26 kb、27 kb、28 kb、29 kb、30 kb、40 kb、50 kb、60 kb等或其中的任何范围。在一些特定实施方案中，载体的大小可以是约3 kb-约15 kb。

本发明部分涉及这样的发现，即与不包含所述分离的核酸分子或核酸构建体的植物比较，在植物中表达至少一种本发明的分离的核酸分子或核酸构建体(包含一种编码PON降解酶的核苷酸序列)可使得植物具有减少的PON和/或NNK含量。因此，在本发明的一些实施方案中，生产转基因植物细胞的方法被提供，所述方法包括将本发明的分离的核酸分子/构建体引入植物细胞，从而生产可再生具有降低的PON和/或NNK含量的转基因植物的转基因植物细胞(与从不包含所述核酸分子/构建体的植物细胞再生的植物比较)。在一些实施方案中，转基因植物细胞包含超过一种(例如，2、3、4、5、6、7、8、9、10等)本发明的核酸分子/核苷酸序列。因此，在本发明的一些方面，转基因植物，或其部分，包含和表达一种或多种分离的本发明的核酸分子/构建体，从而产生导致所述植物细胞和再生的转基因植物的PON和/或NNK含量减少的一种或多种本发明的多肽，其中从所述再生的转基因烟草植物获得的烟草产品具有减少的PON和/或减少的NNK含量。

在感兴趣的核苷酸序列(例如，本发明的核酸分子/构建体/表达盒)的邻近序列中，“引入”意指以核苷酸序列获准进入细胞内部这样一种方式，使感兴趣的核苷酸序列提呈至植物、植物部分和/或植物细胞。当超过一种核苷酸序列要引入时，这些核苷酸序列可作为单一多核苷酸或核酸构建体部分，或作为分开的多核苷酸或核酸构建体组装，且可位于相同或不同的转化载体上。因此，这些多核苷酸可以单一转化事件，以分开的转化事件，或例如作为育种方案的部分引入植物细胞。因此，如本文所用的术语“转化”指将异源性核酸引入细胞。细胞的转化可以是稳定的或瞬时的。因此，在一些实施方案中，本发明的植物、植物部分或植物细胞用本发明的核酸分子稳定地转化。在其它实施方案中，本发明的植物、植物部分或植物细胞用本发明的核酸分子瞬时转化。

在多核苷酸的邻近序列中的“瞬时转化”意指多核苷酸被引入细胞而不整合进细胞的基因组中。

在引入细胞的多核苷酸的邻近序列中，所谓“稳定引入”或“稳定地引入”意欲使引入的多核苷酸稳定地结合到细胞的基因组中，因此所述细胞用多核苷酸稳定地转化。

如本文所用的“稳定的转化”或“稳定地转化的”意指核酸被引入细胞并整合进细胞的基因组中。同样，整合的核酸能够被其后代，更特别地，被多个连续的后代遗传。如本文所用的“基因组”也包括核和质体基因组，并因此包括将核酸整合进例如叶绿体基因组中。如本文所用的稳定的转化也可指在染色体外(extrachromasomally)，例如，作为微染色体维持的转基因。

瞬时转化可通过例如酶联免疫吸附试验(ELISA)或蛋白质印迹检测，其可检测由一种或多种引入生物体的转基因编码的肽或多肽的存在。细胞的稳定的转化可通过例如细胞的基因组DNA的DNA印迹杂交测定来检测，所述细胞具有与引入生物体(如，植物)的转基因的核苷酸序列特异性杂交的核酸序列。细胞的稳定的转化可通过例如细胞RNA的RNA印迹杂交测定来检测，所述细胞具有与引入植物或其它生物体的转基因的核苷酸序列特异性杂交的核酸序列。细胞的稳定的转化也可通过例如聚合酶链反应(PCR)或为本领域熟知的其它扩增反应，使用与导致转基因序列扩增的转基因的靶向序列杂交的特定引物序列检测，其可根据标准方法检测。转化也可通过直接测序和/或本领域熟知的杂交方案检测。

本发明的核酸分子(例如，包含SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:6的一种或多种核苷酸序列或编码一种或多种具有SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:7的任何一个氨基酸序列的多肽的核苷酸序列)可通过本领域技术人员已知的任何方法引入细胞。

在本发明的一些实施方案中，细胞的转化包括核转化。在其它实施方案中，细胞的转化包括质体转化(例如，叶绿体转化)。

用于转化植物的程序是本领域熟知的和常规的并被描述于通篇文献中。用于转化植物的方法的非-限制性实例包括经由细菌-介导的核酸传递(如，经由农杆菌(Agrobacteria))、病毒-介导的核酸传递、碳化硅或核酸须状物(whisker)-介导的核酸传递、脂质体介导的核酸传递的转化、微量注射、微观粒子轰击、磷酸钙-介导的转化、环糊精-介导的转化、电穿孔、纳米粒子-介导的转化、超声处理、浸润、PEG-介导的核酸摄取，以及导致核酸引入植物细胞的任何其它电学、化学、物理学(机械学)和/或生物学机理，包括其任何组合的转化。本领域已知的各种植物转化方法的一般指南包括Miki et al. (“用于异质DNA引入植物的程序(Procedures for Introducing Foreign DNA into Plants)”在植物分子生物学和生物技术的方法(Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology)中, Glick, B. R.和Thompson, J. E., Eds. (CRC Press, Inc., BocaRaton, 1993), 67-88页)和Rakowoczy-Trojanowska (Cell. Mol. Biol. Lett. 7:849-858 (2002))。

土壤杆菌属(Agrobacterium)-介导的转化通常采用转化植物，特别是，双子叶植物的方法，由于其高效率的转化和由于其许多不同的种类的广泛用途。土壤杆菌属-介导的转化通常包括将携带感兴趣的异质DNA的二元载体转移至适宜的土壤杆菌属菌株，其可依赖于由宿主土壤杆菌属菌株或者在共同定居(co-resident)的Ti质粒或者染色体上携带的vir基因的补体(Uknes et al. (1993) Plant Cell 5: 159-169)。重组二元载体向土壤杆菌属的转移可通过三亲株交配程序，使用携带重组二元载体的大肠杆菌(Escherichia coli)、携带能够使重组二元载体移动至目标土壤杆菌属菌株的质粒的辅助大肠杆菌(helper E. coli)菌株实现。或者，重组二元载体可通过核酸转化被转移至土壤杆菌属(Höfgen & Willmitzer (1988) Nucleic Acids Res. 16:9877)。

通过重组土壤杆菌属的植物转化通常包括土壤杆菌属与来自植物的外植体的共同培养并按照本领域熟知的方法。转化的组织在携带二元质粒T-DNA边缘区之间的耐抗生素或除草剂标记的选择培养基上再生。

转化植物，植物部分和/或植物细胞的另一个方法包括推动惰性或生物学活性微粒至植物组织和细胞。见例如，美国专利号4,945,050；5,036,006和5,100,792。一般来说，这种方法包括在植物细胞在有效穿透细胞外表面并提供在其内部的结合的条件下，推动惰性或生物学活性的微粒至植物细胞。当使用惰性微粒时，载体可通过用含有感兴趣的核酸载体涂布微粒引入细胞。或者，一种或多种细胞可以被载体围绕，以致载体通过颗粒的激发被载入细胞。生物学活性的微粒(例如，干燥的酵母细胞、干燥的细菌或噬菌体，各自含有试图引入的一种或多种核酸)也可被推动进入植物组织。

因此，在本发明的特定实施方案中，植物细胞可通过本领域已知的和如在此描述的任何方法转化且完整的植物可使用任何各种已知的技术，从这些转化的细胞再生。从植物细胞、植物组织培养物和/或培养的原生质体再生植物例如在Evans et al. (植物细胞培养物手册(Handbook of Plant Cell Cultures), Vol. 1, MacMilan Publishing Co.New York (1983))；和Vasil I. R. (ed.) (植物的细胞培养物和体细胞遗传(Cell Culture and Somatic Cell Genetics of Plants), Acad. Press, Orlando, Vol. I(1984)，和Vol. II (1986))中描述。选择转化的转基因植物、植物细胞和/或植物组织培养物的方法在本领域是常规的并可用于在此提供的本发明的方法中。

同样地，以上描述的基因改造进入本发明的转基因种子、植物、植物部分和/或植物细胞的遗传特性可通过有性生殖和营养生长来传递，因此可以在后代植物中维持和繁殖。一般来说，维持和繁殖利用经开发以适合特定目的例如收获、播种或耕作的已知的农业方法。

因此核苷酸序列可以任意数量的本领域熟知的方法引入烟草植物、植物部分和/或植物细胞。本发明的方法不依赖于将一种或多种核苷酸序列引入植物的一个特定方法，只要它们进入植物的至少一种细胞的内部。当超过一种核苷酸序列被引入时，它们可被组装为单一核酸构建体的部分，或组装为分开的核酸构建体，且可以位于相同或不同的核酸构建体。因此，核苷酸序列可在单一转化事件，在分开的转化事件中，或例如，在植物中，作为育种方案的部分引入感兴趣的细胞。

因此，在另外的实施方案中，本发明提供生产具有减少的PON含量和/或减少的NNK含量的烟草植物、植物部分和/或植物细胞的方法，该方法包括将本发明的一种或多种核酸分子引入所述烟草植物、植物部分和/或植物细胞，以产生转基因烟草植物、植物部分和/或植物细胞，其中转基因烟草植物烟草植物、植物部分和/或植物细胞在其基因组中包含本发明的所述核酸构建体，从而生产具有减少的PON含量和/或减少NNK含量的烟草植物、植物部分和/或植物细胞(与不包含所述核酸构建体的对照烟草植物、植物部分和/或植物细胞比较)。

在一些实施方案中，本发明提供生产具有减少的PON含量和/或减少NNK含量的烟草植物、植物部分和/或植物细胞的方法，该方法包括将本发明的核酸分子引入烟草植物细胞，以产生转基因烟草植物细胞，其中转基因烟草植物细胞在其基因组中包含本发明的所述核酸构建体；并将所述转基因烟草植物细胞再生到烟草植物和/或植物部分中，以产生包含所述核酸构建体的转基因烟草植物和/或植物部分，从而生产具有减少的PON含量和/或减少的NNK含量的烟草植物和/或植物部分(与不包含所述核酸构建体的对照烟草植物和/或植物部分比较)。

在一些实施方案中，本发明提供在烟草植物、植物部分和/或植物细胞中减少PON和/或NNK含量的方法，其包括将本发明的一种或多种核酸构建体引入烟草植物、植物部分和/或植物细胞，以产生包含所述核酸构建体的转基因烟草植物、植物部分和/或植物细胞，从而减少所述转基因烟草植物、植物部分和/或植物细胞中的PON和/或NNK含量(与不用所述核酸构建体转化的对照烟草植物、植物部分和/或植物细胞比较)。

在一个另外的实施方案中，减少烟草植物、植物部分和/或植物细胞中的PON和/或NNK含量的方法被提供，其包括将本发明的核酸构建体引入烟草植物细胞，以产生包含所述核酸构建体的转基因烟草植物细胞；并再生所述转基因烟草植物细胞，以产生包含所述核酸构建体的转基因烟草植物，从而减少所述转基因烟草植物中的PON和/或NNK含量(与不用所述核酸构建体转化的对照烟草植物比较)。

在更进一步方面，本发明提供生产具有减少的PON和/或NNK含量的烟草产品的方法，该方法包括：将一种或多种含有编码PON降解酶的核苷酸序列的异源性核酸分子引入烟草植物、植物部分和/或植物细胞，从而生产具有减少的PON和/或NNK含量的转基因烟草植物、植物部分和/或植物细胞(与不用所述一种或多种异源性核酸分子转化的烟草植物、植物部分和/或植物细胞比较)；并从所述转基因烟草植物、植物部分和/或植物细胞生产烟草产品，其中与从不用所述一种或多种异源性核酸分子转化的植物、植物部分和/或植物细胞生产的烟草产品比较，烟草产品具有减少的PON和/或NNK含量。

用于测定PON含量和NNK含量的程序是本领域熟知和常规的并被描述于通篇文献中。测量PON含量的方法的非-限制性实例包括这样的方法，如在Wei (烟草种类中吡啶生物碱的生物合成和代谢物的研究(Studies on the biosynthesis and metabolites of pyridine alkaloids in Nicotiana species). Ph.D. Thesis. Univ. of Kentucky(2000))中提供的那些。其它方法被描述于legacy.library.ucsf.edu/tid/zcx53d00/pdf的“遗留文档(legacy documents)”中。Hecht et al.提供分析PON (称为氨基酮)的进一步的方法(Proc. Natl. Acad. Sci. 97(23):12493-12497 (2000))。

测定TSNA含量(包含NNK)的方法是本领域熟知的并包括基于例如气相色谱法-质谱法的测定和基于液相色谱法-质谱法的其它测定法(见，例如，Lewis et al. (Plant Biotech. J. 6:346-354 (2008))。

本发明的进一步方面提供转化的非-人宿主细胞和包含转化的非-人细胞的转化的非-人生物体，其中转化的细胞和转化的生物体包含核酸分子，其包含一种或多种本发明的异源性核酸分子和/或核苷酸序列(例如，编码PON降解酶)。在一些实施方案中，转化的非-人宿主细胞包括但不限于转化的细菌细胞，和/或转化的植物细胞。因此，在一些实施方案中，包含转化的非-人宿主细胞的转化的非-人生物体包括，但不限于，转化的细菌，和/或转化的植物。

在一些特定实施方案中，本发明提供转基因植物细胞，其包含本发明的核酸分子和/或从所述转基因植物细胞再生的转基因植物。因此，在本发明的一些实施方案中，具有减少的PON和/或NNK含量的转基因植物被提供，所述转基因植物从包含至少一种本发明的分离的核酸分子/核酸构建体的转基因植物细胞再生。

本发明的另外的方面包括从本发明的转基因植物和/或其部分生产的收获产品，以及从所述收获产品生产的加工产品(例如，烟草产品)。收获的产品可以是整个植物或任何植物部分，其中所述收获的产品包含本发明的重组核酸分子/构建体。因此，在一些实施方案中，收获的产品的非-限制性实例包括种子、果实、花或其部分(例如，花粉囊、柱头等)、叶、茎，来自所述植物和/或植物部分的提取物等。

“烟草产品”指包含由烟草植物生产的材料的产品。在一些实施方案中，烟草产品包括，但不限于，从本发明的烟草植物(如，包含一种编码PON降解酶的核苷酸序列的烟草植物)生产的干燥烟草叶。不同类型的干燥叶的非-限制性实例包括熏干的、风干的、烤干的和晒干的。在其它实施方案中，烟草产品可以是发酵的烟草产品。发酵的烟草产品包括，但不限于用于无烟产品的那些(例如，糖锭片、贴片、口香糖、电子香烟等)。

烟草产品的另外的非-限制性实例包括用于戒烟的尼古丁口香糖和贴片，包含扩展(膨化)和重组烟草的香烟烟草、雪茄烟草、烟斗烟草、香烟、雪茄，和所有形式的无烟烟草例如嚼用烟草、鼻烟、湿鼻烟和糖锭片。“香烟”包括电子香烟和“加热但不燃烧(heat notburn)”产品，其是加热烟草而不燃烧烟草的香烟-样装置。

因此，在另外的实施方案中，本发明提供从转基因烟草植物、植物部分、植物细胞，和/或其后代植物生产的烟草产品，其中产品具有减少量的PON和/或NNK。烟草产品可以是使用本发明的烟草植物、植物部分或植物细胞制得的任何产品。因此烟草产品可以是烟叶、烟丝、生切烟丝、研磨烟丝、粉末烟草、烟草提取物、无烟烟草、潮湿或干燥鼻烟、丁香烟、烟斗烟草、雪茄烟草、小雪茄烟烟草、卷烟用烟叶、嚼用烟草、比迪烟、bits，和含烟草口香糖、糖锭片，或其任何组合。在其它实施方案中，烟草产品可以是香烟(包含电子香烟)、小雪茄烟、非透气休闲过滤香烟、透气休闲过滤香烟、雪茄、鼻烟、嚼用烟草，或其任何组合。在一些实施方案中，从本发明的转基因烟草植物，植物部分或植物细胞制得的烟草提取物，包括从这样的提取物提纯的尼古丁，可以用于电子香烟。

本发明现在将参考以下实施例进行描述。应该意识到这些实施例不打算将权利要求书的范围限制于本发明，而是宁愿意欲使某些实施方案为示例性的。对技术人员发生的示例性方法的任何变化打算落入本发明的范围内。

实施例

实施例1. PAO构建体的生成

假单胞菌(Pseudomonas) HZN6 PAO核苷酸序列以优化用于在烟草中表达的方式定制合成(GenScript, Piscataway, NJ)。例如，贯穿整个基因进行核苷酸取代以优化烟草中的优选的密码子，消除隐蔽的剪接位点和早熟的polyA位点，优化整个GC含量并消除RNA不稳定性基序。此外，鉴于在5’和3’非翻译区(UTRs)发现的调节性和/或mRNA稳定性基序在原核生物和真核生物之间有很大的不同，PAO序列也被基因改造为含有来自烟草CYP82E10基因的5’和3’ UTR序列(Lewis et al., Phytochemistry 71:1988-1998 (2010))，以进一步提高转录稳定性和功能。优化的PAO核苷酸序列通过用优化的PAO核苷酸序列取代这种载体内的GUS报道基因而克隆到植物表达载体pBI121中，从而将其置于花椰菜花叶病毒(CaMV)的强组成型35S启动子的转录控制下，伴有由源自根癌农杆菌(Agrobacterium tumefacien)的胭脂碱合酶基因的nos终止基序介导的转录终止和多腺苷酸化(Chen et al. Mol. Breed. 11:287-293 (2003))。称为35S:PAO的该构建体的设计，被期望促进细胞的细胞质内PAO酶的合成。

虽然PON的细胞内定位是未知的，主要烟草生物碱，尼古丁主要贮存在中央大液泡内。如果PON主要被隔离在液泡中，则使PAO靶向这种细胞器可能优于酶的细胞质定位。为了介导PAO易位至液泡，制备了另外的构建体，其中编码BBLa的首50个氨基酸的序列在PAO的5’末端融合。BBLa是位于参与烟草生物碱生物合成的最后阶段的小檗碱桥-样酶的液泡，但其催化特性尚未确定(Kajikawa et al. Plant Physiol. 155:2010-2022 (2011))。在Kajikawa等的这个相同报告中，BBLa的首50个氨基酸与GFP报道蛋白的连接被显示对转运GFP进入烟草细胞的液泡是充分的。编码BBLa N-末端/PAO融合蛋白的序列被克隆到pBI121中，且构建体被称为35S:BBL_vac-PAO。类似于35S:PAO，35S:BBL_vac-PAO构建体的3’-UTR序列源自CYP82E10；然而，5’-UTR对应于天然BBLa基因。最后，BBLa的全长cDNA也被克隆到pBI121中并称为35S:BBLa。用于这种研究的每个构建体的核苷酸和预测的蛋白序列在附录中显示。

实施例2. 转化

构建体35S:PAO、35S:BBL_vac-PAO，和35S:BBLa被转移到根癌农杆菌菌株GV3101中，其然后使用标准土壤杆菌属-介导的转化方案，被引入白肋烟草(TN90 SRC)和烤烟(K326 SRC)栽培品种二者中(Horsch et al., 1985)。作为载体对照，这些相同的烟草株系在相同pBI121载体主链(E4:GUS)内衰老-诱导型启动子的转录控制下，也用含有GUS报道基因的构建体转化。T₀代转基因植物在土壤中生长至7-10叶阶段(约5-6英寸高)，然后测定它们代谢PON的能力。

实施例3. PON分析

在实验室环境中生长的幼小的烟草植物比在商业栽培下大片原野-生长的植物产生少得多生物碱。因此，检测和定量这些材料中的内源性PON需要与为商业栽培的植物所用方法不同的方法。因此，当在烟草细胞的环境内表达时，分离的叶测定被用作测定任何引入的转基因是否可产生能够代谢PON的酶的备选方法。在分离的叶测定中，用稳定的同位素氘[4-(甲基-d3-氨基)-1-(3-吡啶基)-1-丁酮；Toronto Research Chemicals]标记的PON通过蒸腾流被引入叶内。用剃刀刀片从各个独立的T0转基因植物的叶柄基部切下各个叶片(范围从1-4 g鲜重)，并快速地转移至含有在10 mM磷酸盐缓冲液(pH 7.4)中的1 ml 0.4 mM的d₃-PON溶液的锥形容器中。分离的叶于室温、光照下培育，直至大部分溶液已被吸收(通常在1.5-2.5 hr之间)。此后，加入75 ml磷酸盐缓冲液，接着经另外的24 hr培育期。每片叶随后于65℃干燥过夜，磨成细粉并根据Wei的方案(烟草种类中吡啶生物碱的生物合成和代谢物的研究(Studies on the biosynthesis and metabolites of pyridine alkaloids in Nicotiana species). Ph.D. Thesis. Univ. of Kentucky (2000))对d₃-PON进行分析。

分离的叶测定的结果显示于下表1。假定d₃-PON的摄取是100%效率，每片叶将吸收100 µg d₃-PON。到实验结束时，来自含有对照E4:GUS构建体的植物叶子的d₃-PON含量范围从14.0至48.5 µg的d₃-PON，在K326 SRC背景下平均32.9 µg和在TN90 SRC中为20.2 µg。类似地，含有35S:BBLa构建体的叶子保留在17.9-45.0 µg之间的d₃-PON，在K326 SRC中平均28.5 µg和在TN90 SRC中为35.1 µg。具有35S:PAO转基因的叶子显示出特别广泛范围的d₃-PON水平，4种植物表现出的d₃-PON水平类似于载体对照物和35S:BBLa植物的d₃-PON水平(679/35S:PAO-#5、679/35S:PAO-#3、678/35S:PAO-#6和678/35S:PAO-#12)，而其它6种含有低于在具有最低量的d₃-PON的对照植物中观察到的d₃-PON水平。在所有的独立T₀个体中，含有35S:PAO构建体的植物在K326 SRC中平均为14.0 µg d₃-PON和在TN90 SRC中为10.6 µgd₃-PON。令人惊奇地，来自所有9种含有35S:BBL_vac-PAO构建体的T₀植物的叶子具有低于最低的对照品或35S:BBLa植物的d₃-PON水平，和9种叶子中的8种含有少于0.7 µg的d₃-PON。相反，在6种其叶子含有少于对照品的d₃-PON的35S:PAO植物中，这些中只有一种具有少于0.7µg的d₃-PON (679/35S:PAO-#16)。总之，来自K326 SRC转基因的叶子中d₃-PON的量平均为1.8 µg，而TN90 SRC中的平均量仅为0.2 µg。鉴于独立的T₀植物通常显示宽泛围的转基因转录表型，由于诸如基因组插入位点(位置效应)和转基因拷贝数等因素的变化，用35S:BBL_vac-PAO转基因烟草植物观察到的结果是尤其显著的。发明人的结果提示，35S:BBL_vac-PAO基因产品的活性是容易饱和的且为了是有效的，这个构建体的高水平表达不是需要的。

从这些实施例显而易见，在烟草的细胞环境内表达假单胞菌菌株HZN6的PAO基因可导致PON在这些植物中的降解。也显而易见的是，设计以促进PAO液泡定位的构建体的使用增加PAO-介导的PON代谢的效率。不希望受限于本发明的任何特殊理论，这种观察的两个合理的解释包括：(1)，液泡-定位的PAO放置所述酶在紧邻PON (一种推测贮存在这种细胞器中的化合物)处；和/或(2)，PAO酶自身的稳定性在液泡内(如不易受蛋白水解周转的影响)可能比当位于细胞质时更大。最后，鉴于PON可用作NNK形成的直接生物碱前体，这与绿色和熟化烟草叶具有解释在熟叶中发现的NNK的足量PON的观察一致(Wei, 吡啶生物碱在烟草种类的生物合成和代谢物的研究(Studies on the biosynthesis and metabolites of pyridine alkaloids in Nicotiana species). Ph.D. Thesis. Univ. of Kentucky(2000))，表达在此描述的PAO的转基因植物将证实与常规烟草植物比较，显著减少了熟叶中的NNK表型。

实施例4. T₀转基因植物的分析

K326 SRC背景中的另外的T₀个体被移植到野外，以确立编码PAO的构建体的表达可介导NNK在熟化烟草叶中形成的减少。除了在表1中所示的构建体(其转基因表达由35S CaMV启动子驱动)外，在CYP82E4 (E4)启动子的转录控制下，表达PAO和BBL_vac-PAO构建体的转基因植物也包括在这项研究中。在自然老化和熟化期间，E4启动子被强烈诱导，因此可具有介导更高水平的转基因表达的可能性，比使用35S启动子可能的更接近TSNA形成发生的时间(Chakrabarti et al, 2008 Plant Mol. Biol. 66: 415-427)。所有构建体由至少6个独立的T₀植物代表。用E4:GUS报道基因转化的植物代表对照品。野外生长的植物被受精并根据标准工业实践截去植物顶端。在成熟期，切下来自每种植物的上中段-茎位置的两片叶子并烤干约3天。由于在熟化过程期间，TSNA形成的不可预测性和可变性，在熟化期间，NOx气体被补充到熟化室中以促进TSNA生产。

得自现场研究的尼古丁和TSNA两个分析的结果显示于图3中。与对照基因型比较，每个具有PAO构建体的基因型组中NNK浓度显著地降低(P<0.05)。E4:GUS对照植物平均为0.115 µg/g NNK，而含有PAO基因的基因型平均在0.052-0.083 µg/g NNK之间，代表从对照植物中观察到的NNK减少55%-28%范围。相反，在E4:GUS对照基因型和任何含有PAO构建体的基因型组之间的尼古丁或NAT含量没有统计学上的显著性差异。NNN浓度在所有基因型中也是类似的，除了含有35S:BBL_vac-PAO构建体的植物之外。原因尚不清楚，NNN在这个组中出人意料地低。未提供NAB测量，因为它们只是在或低于这些样品中的检测水平。总之，图3中所示的结果提示PAO转基因能够介导熟叶中NNK形成的特定减少。

实施例5. 靶向细胞外基质-结合的PON库的烟草植物的生成

表1中所示的分离的叶测定结果提供了PAO在细胞质和/或液泡中的表达能够代谢通过蒸腾流外源性供应的d₃-PON的强有力证据。此外，来自现场研究的结果(图3)提示，PAO以这种方式的表达可导致烤干叶中NNK的减少。

表1. 供给1 ml 0.4 mM d3-PON溶液并培育24 hr的转基因叶子中d3-PON的定量

在Lang和Vuarnoz (J. Nat. Prod. 78(1):85-92 (2015))的最近的手稿中，报道了大比例的叶NNK及其生物碱前体(推测是PON)被发现与细胞壁紧密相关。Lang和Vuarnoz特别涉及作为这种“基质-结合的NNK”及其前体的位点的细胞壁的木质素部分。在测定的风干白肋烟草中，77%的叶NNK被发现结合于细胞外基质，并且在熏干的烟草中，该比率为53%(Lang和Vuarnoz, 2015)。在两种情况下，剩余的NNK是可溶性的，同样代表细胞内部分。

靶向细胞质或液泡的PAO酶将可能能够代谢可溶性的、细胞内的PON库，但预测不能接近或降解位于细胞外空间(也称为质外体)的PON库。重新定向对质外体的PAO活性应该能使酶接近基质-相关的PON部分，因此代表除了其可通过使PAO靶向细胞质和/或液泡实现外的另外的降低NNK合成的方法。使蛋白靶向质外体可通过所述蛋白N-末端的可裂解信号序列的安排来启动，以指引其通过内质网(ER)，因而将所述蛋白引入分泌途径。在缺乏促进定位于液泡或者保留在ER或高尔基氏体(Golgi)内的另外的信号时，通过分泌途径引导的蛋白通常通过“默认途径”转运到质外体(Hood et al., In A. Altman和P.M. Hasegawa,eds. 植物生物技术和农业(Plant Biotechnology and Agriculture). 第3章. AcademicPress, pp. 35-54 (2012))。N-末端信号序列通常为20-30个氨基酸长度并介导蛋白的共同翻译插入ER的内腔。许多信号序列已被鉴定并显示出促进植物细胞中的异质蛋白的细胞外转运。已被用来传递异质蛋白通过分泌系统并进入质外体的从烟草基因获得的信号序列的实例包括从伸展蛋白、PR-S和渗透蛋白获得的那些(Hood et al., 2012)。

在质外体中表达PAO酶的烟草植物可通过工程改造的构建体生成，其中ER-引导的信号序列被融合至PAO酶的N-末端。被分泌至质外体的蛋白将通常具有贯穿多孔细胞壁空间的自由通道，如果蛋白是相对小的和可溶性的。Tepfer和Taylor (Science 213: 761-763 (1981))估计植物细胞壁内的孔径是约4 nm，其在理论上应允许大至60 kDa的蛋白自由扩散。预测的PAO酶的分子质量是54 kDa，其在建议的60 kDa阈值以下。此外，之前的出版物已报道类似-大小的蛋白漆酶(55 kDa)和纤维二糖水解酶(52.5 kDa)靶向植物细胞壁(Hood et al., Plant Biotech. J. 1: 129-140 (2003); Hood et al. Plant Biotech. J. 5: 709-719 (2007))。因此，使用融合至PAO或任何其它PON降解酶的ER靶向多肽将导致会自由移动遍及细胞壁基质的PON酶，因此将接近和降解细胞壁-相关的PON。最后，最大的PON降解和NNK减少将通过生成含有质外体靶向的构建体的转基因植物，与引导PAO至细胞质或者液泡的构建体(如分别为35S:PAO和35S:BBL_vac-PAO)结合来完成。以这种方式生成的植物应能够减少细胞内可溶性的PON库, 以及存在于细胞外基质中的PON库，从而也减少不同的对应的NNK库的形成。

前述是本发明的示例性说明，且不视为对其的限制。本发明由随附的权利要求书定义，其中包括权利要求的等同方案。

实施例5. T₂转基因植物的分析

DNA印迹分析在从表1的显示高d3-PON代谢活性的T₀个体上进行。使用PAO基因作为杂交探针，发明人得出结论，即PAO转基因作为植物678/35S:PAO#3、678/35S:PAO#11，和678/35S:BBLvac-PAO#3中的单一拷贝存在。这些植物的每一种是在TN90 SRC白肋背景中。3个单一拷贝PAO T₀个体被自我-受精，以产生T₁代植物。来自每个株系的几个T₁植物生长至成熟且许多T₂后代被基因分型以确定对PAO转基因是纯合子的T₁个体。来自对3个原始T₀事件的每一个被选定的种子批次的总共30种T₂植物，以及TN90 SRC对照植物，依据对于白肋烟草的标准工业实践在野外生长。每种植物在成熟时是茎-收获的并风干10周。在熟化期结束时，来自顶部的第4片叶被干燥至完全，干燥至细粉，并分析生物碱和TSNA含量。在对照和转基因品种之间未观察到生物碱组成和含量的显著性差异。如在图4中所示，NNK代表在TN90SRC对照中的约4.7%的总TSNA库。相反，NNK代表在株系35S:PAO#11 (P = 0.0084)、35S:PAO#3 (P = 0.0550)，和35S:BBLvac-PAO#3(P = 0.0537)中的分别为仅2.0%、2.8%，和2.7%的总TSNA。这些结果提示PAO转基因，伴有或没有液泡定位信号，可减少作为在风干的白肋种类中总叶TSNA的百分比的NNK含量。

前述是本发明的示例性说明，且不视为对其的限制。本发明由随附的权利要求书定义，其中包括权利要求的等同方案。

附录

核苷酸序列和氨基酸序列

A.在假单胞菌菌株HZN6中发现的假氧尼古丁胺氧化酶(PAO)基因的核苷酸序列(GenBank检索号JN391188)。起始和终止密码子加下划线。

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SEQ ID NO:1

B. 用来转化烟草品种K326 SRC和TN90 SRC的PAO基因的核苷酸序列。优化用于在烟草中表达的假单胞菌HZN6 PAO序列以黑体显示；从烟草CYP82E10基因获得的5’和3’ UTR序列以粗体显示；经工程改造以创建促进克隆的限切位点的核苷酸以斜体显示。起始和终止密码子加下划线。

GGATCCAGGGAAGTTGGTGATAGTTTGATTCCCAAGTGCTTTTCTAAAAATCCATACC ATGGCTAATGATAAGGGAGATATAAGTAAAGATGGTGTGAGTAGGAGGAAGTTTCTCGGTGGTGCTGTGATAGGTGCTGCTGCTGCTGCAGGTGTTGGATCACAAATTTTAAGTCTCTCCGCTACTGCACAGGGTGCTGATAAGGAAAGAGTTGGACCACTTCAAAGTAATGTGGATTATGATGCAGTTGTGATTGGAGGTGGATTTGCTGGTGTGACTGCTGCAAGAGAATTATCTAGATCAGGTCTCAAAACACTTGTTTTGGAGGGAAGAAGTAGGTTGGGTGGAAGGACTTTCACATCCAAGTTGGATGGAGAAAAAGTTGAGTTAGGTGGAACTTGGGTGCATTGGACACAACCAAACGTTTGGACTGAAGTGATGCACTATGGTCTCGAGATTGAAGAGACAGTTGGACTTGCTTCTCCAGAGACTGTTATATGGGTGACAGATAATCAGGTTAAGAGGGCTCCAGCTGCAGAAGCATTTGAGATTTTCGGTGCTGCATGTACTGAATATTACAAAGAGGCTCATAACATCTATCCAAGGCCTTTCGATCCATTTTTCGCTAAGAAAGCATTACAAGAGATGGATGGACTCAGTGCTTCCGAGTACCTTAATAAGTTATCTCTCACTAGAGAACAGAAAGATATGATGGATTCTTGGCTTTCTGGTAATGGTCACAACTATCCAGAAACAATAGCATACTCTGAGATCATGAGATGGTTTGCTCTTTCAAATTTCAACATGCCTACTATGTTCGATTCAATCGCTAGGTATAAGATAAAAAGTGGTACAGTTTCCCTTTTGGAGGCTATGGTGGCAGAATCTGATATGGAGGTTCAACTTTCAACTCCAGTTTTGAAGGTGAAACAGGATTCTCATAGAGTTCTTATCACTACAGAAGAGGGTACTATTGCTGCATCAGCTGTTGTGATGGCAGTGCCATTGAATACAATGGGAGATGTTGAATACTCTCCTAGGTTATCAGATGCTAAGAGTGAGATTGCATCCCAAGGTCACGCTGGAAAGGGAGTTAAAGGATACATCAGAATTAAGCAGGATGTTGGAAATGTGATGACATACGCTCCAGCAAGGAACGATGTTACTCCTTTTACATCTGTTTTCACTGATCATGTGGGTGAAAATGGTACTCTTCTCATAGCTTTTAGTGCAGATCCTAAACTTGTGGATATCAACGATTCCAAGGCTGTTGAAAAAGCATTGCACCCACTTTTGCCTGGTGTTGAAGTGACTTCTTCATATGGATACGATTGGAATCTTGATCCATTTTCTAAGGGTACTTGGTGCACATATAGACCTGGACAAACTACAAGGTACCTTACAGAATTGCAGAAAAGAGAGGGTAGGCTTTTCTTTGCAGGAAGTGATATGGCTAACGGTTGGAGAGGTTTTATTGATGGTGCTATTGAATCCGGTAGGGAGGTTGGTTATCAGGTTGCTTCATATCTCAAGGGAAAGAATAGTAACGCATAAAATCTAAGATGTTTTATCTTGGTTGATCATTGTTTAATACTCCTAGATAGATGGGTATTCATCTATCTTTTTAAAATTAATTGTCAGTACGAGTGTTTCTGAGCTCAAGCTT

SEQ ID NO:2

C. 预测的PAO的氨基酸序列

MANDKGDISKDGVSRRKFLGGAVIGAAAAAGVGSQILSLSATAQGADKERVGPLQSNVDYDAVVIGGGFAGVTAARELSRSGLKTLVLEGRSRLGGRTFTSKLDGEKVELGGTWVHWTQPNVWTEVMHYGLEIEETVGLASPETVIWVTDNQVKRAPAAEAFEIFGAACTEYYKEAHNIYPRPFDPFFAKKALQEMDGLSASEYLNKLSLTREQKDMMDSWLSGNGHNYPETIAYSEIMRWFALSNFNMPTMFDSIARYKIKSGTVSLLEAMVAESDMEVQLSTPVLKVKQDSHRVLITTEEGTIAASAVVMAVPLNTMGDVEYSPRLSDAKSEIASQGHAGKGVKGYIRIKQDVGNVMTYAPARNDVTPFTSVFTDHVGENGTLLIAFSADPKLVDINDSKAVEKALHPLLPGVEVTSSYGYDWNLDPFSKGTWCTYRPGQTTRYLTELQKREGRLFFAGSDMANGWRGFIDGAIESGREVGYQVASYLKGKNSNA

SEQ ID NO:3

D.烟草BBLa基因的核苷酸序列(GenBank检索号AB604219)。起始和终止密码子加下划线。

gaagcagaaatacatacaacatgtttccgctcataattctgatcagcttttcacttgcttccttgtctgaaactgctactggagctgttacaaatctttcagcctgcttaatcaaccacaatgtccataacttctctatttaccccacaagtagaaattactttaacttgctccacttctcccttcaaaatcttcgctttgctgcacctttcatgccgaaaccaaccttcattatcctaccaagcagtaaggaggagctcgtgagcaccattttttgttgcagaaaagcatcttatgaaatcagagtaaggtgcggcggacacagttacgaaggaacttcttacgtttcctttgacgcttctccattcgtgatcgttgacttgatgaaattagacgacgtttcagtagatttggattctgaaacagcttgggctcagggcggcgcaacaattggccaaatttattatgccattgccaaggtaagtgacgttcatgcattttcagcaggttcgggaccaacagtaggatctggaggtcatatttcaggtggtggatttggacttttatctagaaaattcggacttgctgctgataatgtcgttgatgctcttcttattgatgctgatggacggttattagaccgaaaagccatgggcgaagacgtgttttgggcaatcagaggtggcggcggtggaaattggggcattgtttatgcctggaaaattcgattactcaaagtgcctaaaatcgtaacaacttgtatgatctataggcctggatccaaacaatacgtggctcaaatacttgagaaatggcaaatagttactccaaatttggtcgatgattttactctaggagtactgctgagacctgcagatctacccgcggatatgaaatatggtaatactactcctattgaaatatttccccaattcaatgcactttatttgggtccaaaaactgaagttctttccatatcgaatgagacatttccggagctaggcgttaagaatgatgagtgcaaggaaatgacttgggtagagtcagcacttttcttctccgaattagctgacgttaacgggaactcgactggtgatatctcccgtctgaaagaacgttacatggacggaaaaggttttttcaaaggcaaaacggactacgtgaagaagccagtttcaatggatgggatgctaacatttcttgtggaactcgagaaaaacccgaagggatatcttgtctttgatccttatggcggagccatggacaagattagtgatcaagctattgctttccctcatagaaaaggtaaccttttcgcgattcagtatctagcacagtggaatgaagaggacgattacatgagcgacgtttacatggagtggataagaggattttacaatacaatgacgccctttgtttcaagctcgccaaggggagcttatatcaactacttggatatggatcttggagtgaatatggtcgacgactacttattgcgaaatgctagtagcagtagtccttcttcctctgttgatgctgtggagagagctagagcgtggggtgagatgtatttcttgcataactatgataggttggttaaagctaagacacaaattgatccactaaatgtttttcgacatgaacagagtattcctcctatgcttggttcaacgcaagagcacaagtatagcagtgaatgagatttaaaatgtactaccttgagagagattccgttgttagttttcc SEQ ID NO:4

E. 预测的BBLa的氨基酸序列

MFPLIILISFSLASLSETATGAVTNLSACLINHNVHNFSIYPTSRNYFNLLHFSLQNLRFAAPFMPKPTFIILPSSKEELVSTIFCCRKASYEIRVRCGGHSYEGTSYVSFDASPFVIVDLMKLDDVSVDLDSETAWAQGGATIGQIYYAIAKVSDVHAFSAGSGPTVGSGGHISGGGFGLLSRKFGLAADNVVDALLIDADGRLLDRKAMGEDVFWAIRGGGGGNWGIVYAWKIRLLKVPKIVTTCMIYRPGSKQYVAQILEKWQIVTPNLVDDFTLGVLLRPADLPADMKYGNTTPIEIFPQFNALYLGPKTEVLSISNETFPELGVKNDECKEMTWVESALFFSELADVNGNSTGDISRLKERYMDGKGFFKGKTDYVKKPVSMDGMLTFLVELEKNPKGYLVFDPYGGAMDKISDQAIAFPHRKGNLFAIQYLAQWNEEDDYMSDVYMEWIRGFYNTMTPFVSSSPRGAYINYLDMDLGVNMVDDYLLRNASSSSPSSSVDAVERARAWGEMYFLHNYDRLVKAKTQIDPLNVFRHEQSIPPMLGSTQEHKYSSE

SEQ ID NO:5

F. BBL_vac-PAO融合构建体的核苷酸序列。黑色斜体的序列对应于BBLa 5’侧翼序列和含有液泡定位信号的首50个密码子；黑色、标准字体序列代表优化的假单胞菌HZN6 PAO序列；从烟草CYP82E10基因获得的3’ UTR序列以粗体显示；经工程改造以创建促进克隆的限切位点的核苷酸以小写字母显示。起始和终止密码子加下划线。

ggatccgaagcagaaatacatacaac atg tttccgctcataattctgatcagcttttcacttgcttccttgtctgaa actgctactggagctgttacaaatctttcagcctgcttaatcaaccacaatgtccataacttctctatttaccccac aagtagaaattactttaacttggccATGGCTAATGATAAGGGAGATATAAGTAAAGATGGTGTGAGTAGGAGGAAGTTTCTCGGTGGTGCTGTGATAGGTGCTGCTGCTGCTGCAGGTGTTGGATCACAAATTTTAAGTCTCTCCGCTACTGCACAGGGTGCTGATAAGGAAAGAGTTGGACCACTTCAAAGTAATGTGGATTATGATGCAGTTGTGATTGGAGGTGGATTTGCTGGTGTGACTGCTGCAAGAGAATTATCTAGATCAGGTCTCAAAACACTTGTTTTGGAGGGAAGAAGTAGGTTGGGTGGAAGGACTTTCACATCCAAGTTGGATGGAGAAAAAGTTGAGTTAGGTGGAACTTGGGTGCATTGGACACAACCAAACGTTTGGACTGAAGTGATGCACTATGGTCTCGAGATTGAAGAGACAGTTGGACTTGCTTCTCCAGAGACTGTTATATGGGTGACAGATAATCAGGTTAAGAGGGCTCCAGCTGCAGAAGCATTTGAGATTTTCGGTGCTGCATGTACTGAATATTACAAAGAGGCTCATAACATCTATCCAAGGCCTTTCGATCCATTTTTCGCTAAGAAAGCATTACAAGAGATGGATGGACTCAGTGCTTCCGAGTACCTTAATAAGTTATCTCTCACTAGAGAACAGAAAGATATGATGGATTCTTGGCTTTCTGGTAATGGTCACAACTATCCAGAAACAATAGCATACTCTGAGATCATGAGATGGTTTGCTCTTTCAAATTTCAACATGCCTACTATGTTCGATTCAATCGCTAGGTATAAGATAAAAAGTGGTACAGTTTCCCTTTTGGAGGCTATGGTGGCAGAATCTGATATGGAGGTTCAACTTTCAACTCCAGTTTTGAAGGTGAAACAGGATTCTCATAGAGTTCTTATCACTACAGAAGAGGGTACTATTGCTGCATCAGCTGTTGTGATGGCAGTGCCATTGAATACAATGGGAGATGTTGAATACTCTCCTAGGTTATCAGATGCTAAGAGTGAGATTGCATCCCAAGGTCACGCTGGAAAGGGAGTTAAAGGATACATCAGAATTAAGCAGGATGTTGGAAATGTGATGACATACGCTCCAGCAAGGAACGATGTTACTCCTTTTACATCTGTTTTCACTGATCATGTGGGTGAAAATGGTACTCTTCTCATAGCTTTTAGTGCAGATCCTAAACTTGTGGATATCAACGATTCCAAGGCTGTTGAAAAAGCATTGCACCCACTTTTGCCTGGTGTTGAAGTGACTTCTTCATATGGATACGATTGGAATCTTGATCCATTTTCTAAGGGTACTTGGTGCACATATAGACCTGGACAAACTACAAGGTACCTTACAGAATTGCAGAAAAGAGAGGGTAGGCTTTTCTTTGCAGGAAGTGATATGGCTAACGGTTGGAGAGGTTTTATTGATGGTGCTATTGAATCCGGTAGGGAGGTTGGTTATCAGGTTGCTTCATATCTCAAGGGAAAGAATAGTAACGCATAAAATCTAAGATGTTTTATCTTGGTTGATCATTGTTTAATACTCCTAGATAGATGGGTATTCATCTATCTTTTTAAAATTAATTGTCAGTACGAGTGTTTCTgagctcaagctt

SEQ ID NO:6

G. 预测的BBL_vac-PAO融合蛋白的氨基酸序列。从BBLa获得的氨基酸是以细体(lighterfont)显示的首50个氨基酸；以黑体显示的残基对应于PAO；粗体、下划线的丙氨酸残基由于创建融合构建体的结果而生成。

MFPLIILISFSLASLSETATGAVTNLSACLINHNVHNFSIYPTSRNYFNLAMANDKGDISKDGVSRRKFLGGAVIGAAAAAGVGSQILSLSATAQGADKERVGPLQSNVDYDAVVIGGGFAGVTAARELSRSGLKTLVLEGRSRLGGRTFTSKLDGEKVELGGTWVHWTQPNVWTEVMHYGLEIEETVGLASPETVIWVTDNQVKRAPAAEAFEIFGAACTEYYKEAHNIYPRPFDPFFAKKALQEMDGLSASEYLNKLSLTREQKDMMDSWLSGNGHNYPETIAYSEIMRWFALSNFNMPTMFDSIARYKIKSGTVSLLEAMVAESDMEVQLSTPVLKVKQDSHRVLITTEEGTIAASAVVMAVPLNTMGDVEYSPRLSDAKSEIASQGHAGKGVKGYIRIKQDVGNVMTYAPARNDVTPFTSVFTDHVGENGTLLIAFSADPKLVDINDSKAVEKALHPLLPGVEVTSSYGYDWNLDPFSKGTWCTYRPGQTTRYLTELQKREGRLFFAGSDMANGWRGFIDGAIESGREVGYQVASYLKGKNSNA

SEQ ID NO:7

H. BBLa的液泡靶向序列

gaagcagaaatacatacaacatgtttccgctcataattctgatcagcttttcacttgcttccttgtctgaaactgctactggagctgttacaaatctttcagcctgcttaatcaaccacaatgtccataacttctctatttaccccacaagtagaaattactttaacttg SEQ ID NO:8

I. 推定的来自恶臭假单胞菌S16的PAO基因的核苷酸序列.

ATGACAAAAGATGGTGATGAAGGCAGCAAAAGCGGAGTATCACGCCGAAAGTTCCTTGGTAGCGCCGCGGTCGGAGTGGCAACAGCGGGCATAGCCTCGCAGCTTCTGACTCTGTCGGCGCCCGCGGAAGCGGCGGTGAAGACCAATGTTGGTCCATCACGCGCAGGCGTGGGTTATGACGTTATTGTAATCGGTGGAGGCTTCGCGGGTGTTACTGCGGCGCGAGAAGCAAGCCGTTCTGGCTTGAAAACTCTAATTCTTGAAGGTAGAAGTCGGTTGGGCGGCCGAACTTTTACGTCTAAGCTTCAGAATCAAAAAGTTGAGTTGGGAGGTACCTGGGTACATTGGACCCAGCCGAATGTTTGGACTGAGATTATGCACTATGGCCTAGAGGTGGAGGAGACGGTCGGTCTTGCGAATCCAGAGACCGTCATTTGGGTAACAGAGGATAATGTCAAAAGAGCACCTGCAGCAGAGGCGTTTGAAATTTTTGGCTCTGCCTGTAACGAATACTACAAAGAAGCACGGAATATTTATCCGCGCCCGTTTGAACCATTTTTTGAGCGAAAGAAGCTGCAGCATGTTGATGGACTTTCCGCGGCAGATTATCTTGAAAAATTGCCTTTGACCAGGGAGCAAAAGGATATGATGGATTCCTGGCTCAGTGGAAATGGACATAATTATCCGGAAACTATTGCATATAGCGAGATTATGCGTTGGTTTGCACTCAGTAACTTTAATATGCCCACAATGTTCGATTCCATTGCGCGGTACAAAATTAAAACCGGTACGCATAGTCTTTTAGAGGCCATAATGGCGGATGGTAACTCGGAAGTTAAACTTTCGACGCCAGTGACTAAGGTTAATCAAGATAAAGATAAAGTAACAGTTACCACTGAAGACGGTGTCTTCACGGCATCAGCGGTAATTGTAGCCGTCCCTATCAACACTTTGCATGATATTGAGTACTCGCCGAAGTTGTCGGCAGCTAAAGTGGATATGGGATCGCAACGGCATGCTGGTGCTGGTGTAAAGGGCTATATTCGCGTAAAACAAAATGTCGGCAATGTAATGACATATGCTCCTGCCCGGAATAAGCTCACACCATTTACCTCAGTATTCACAGATCACGTGGACGAGAGCGGTACGTTACTCATTGCATTTTCAGCCGACCCTAAGTTGATTGATATCAATGATATCAAAGCCGTCGAAAAGGCTTTGCAACCACTTTTGCCAGGCGTCGAAGTAACTGCTAGTTATGGCTACGACTGGAACCTCGATCCCTTTTCTAAGGGCACTTGGTGCACTTACCGTCCTAACCAGACGACTCGATACTTGACTGAGCTGCAGAAGCGCGAAGGACGGCTATTTTTTGCAGGCTCGGACATGGCCAATGGTTGGCGTGGATTCATTGATGGAGCAATCGAGAACGGTAGAGAGGTAGGGCATCAAGTCGCTACGTATCTAAAAAGAGAAAATGACAATGCGTGA

SEQ ID NO:9

J.预测的来自恶臭假单胞菌S16的推定的PAO基因的蛋白序列

mtkdgdegsksgvsrrkflgsaavgvatagiasqlltlsapaeaavktnvgpsragvgydvivigggfagvtaareasrsglktlilegrsrlggrtftsklqnqkvelggtwvhwtqpnvwteimhygleveetvglanpetviwvtednvkrapaaeafeifgsacneyykearniyprpfepfferkklqhvdglsaadyleklpltreqkdmmdswlsgnghnypetiayseimrwfalsnfnmptmfdsiarykiktgthslleaimadgnsevklstpvtkvnqdkdkvtvttedgvftasavivavpintlhdieyspklsaakvdmgsqrhagagvkgyirvkqnvgnvmtyaparnkltpftsvftdhvdesgtlliafsadpklidindikavekalqpllpgvevtasygydwnldpfskgtwctyrpnqttryltelqkregrlffagsdmangwrgfidgaiengrevghqvatylkrendna

SEQ ID NO:10。

Claims (47)

1.包含一种或多种异源性核酸分子的烟草植物、植物部分和/或植物细胞，所述核酸分子包含编码假氧尼古丁(PON)降解酶的核苷酸序列。

2.权利要求1的烟草植物、植物部分和/或植物细胞，其中PON降解酶来自已知降解尼古丁的真菌或细菌属。

3.权利要求1或权利要求2的烟草植物、植物部分和/或植物细胞，其中PON降解酶是假氧尼古丁胺氧化酶(PAO)。

4. 权利要求3的烟草植物、植物部分和/或植物细胞，其中PAO来自假单胞菌(Pseudomonas)菌株HZN6或恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida) S16。

5. 权利要求3或权利要求4的烟草植物、植物部分和/或植物细胞，其中编码PAO的核苷酸序列包含SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的核苷酸序列。

6. 权利要求3-5的任一项的烟草植物、植物部分和/或植物细胞，其中编码PAO的核苷酸序列编码包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列的多肽。

7.权利要求1-6的任一项的烟草植物、植物部分和/或植物细胞，其中由所述核苷酸序列编码的PON降解酶融合至液泡靶向序列。

8.权利要求1-6的任一项的烟草植物、植物部分和/或植物细胞，其中由所述核苷酸序列编码的PON降解酶融合至内质网(ER)靶向信号序列。

9.权利要求1-6的任一项的烟草植物、植物部分和/或植物细胞，其包含至少两种含有编码PON降解酶的核苷酸序列的异源性核酸分子，其中所述至少两种异源性核酸分子中的至少一种包含编码融合至液泡靶向序列的PON降解酶的核苷酸序列，并且所述至少两种异源性核酸分子中的至少一种包含编码融合至ER靶向信号序列的PON降解酶的核苷酸序列。

10. 权利要求7或权利要求9的烟草植物、植物部分和/或植物细胞，其中液泡靶向序列由SEQ ID NO:8的核苷酸序列编码。

11. 权利要求7、9或10的任一项的烟草植物、植物部分和/或植物细胞，其中融合至液泡靶向序列的PON降解酶由SEQ ID NO:6的核苷酸序列编码。

12. 权利要求7、9或11的任一项的烟草植物、植物部分和/或植物细胞，其中融合至液泡靶向序列的PON降解酶包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列。

13.权利要求1-12的任一项的烟草植物、植物部分和/或植物细胞，其中核酸分子还包含一种或多种调节序列。

14.从权利要求1-13的任一项的烟草植物、植物部分或植物细胞产生的后代植物或种子，其中所述后代植物或种子包含所述一种或多种含有编码PON降解酶的核苷酸序列的异源性核酸分子。

15.来自权利要求14的后代植物的种子，其中所述种子包含所述一种或多种含有编码PON降解酶的核苷酸序列的异源性核酸分子。

16.由权利要求14或权利要求15的种子产生的烟草植物，其中所述植物包含所述一种或多种含有编码PON降解酶的核苷酸序列的异源性核酸分子。

17.包含在农田中种植在一起的权利要求1-14或16的任一项的多种烟草植物的植物作物。

18.从权利要求1-13的任一项的烟草植物、植物部分和/或植物细胞，从权利要求14的后代植物，从权利要求14或15的种子，从权利要求16的植物，和/或从权利要求17的作物生产的烟草产品。

19.权利要求18的烟草产品，其中烟草产品是烟叶、烟丝、生切烟丝、研磨烟丝、粉末烟草、烟草提取物、尼古丁提取物、无烟烟草、潮湿或干燥鼻烟、丁香烟、烟斗烟草、雪茄烟草、小雪茄烟烟草、卷烟用烟叶、嚼用烟草、比迪烟、bits和含烟草的口香糖、糖锭片、贴片、电子香烟，或其任何组合。

20.权利要求18的烟草产品，其中烟草产品是香烟、小雪茄烟、非透气休闲过滤香烟、透气休闲过滤香烟、雪茄、鼻烟、嚼用烟草或其任何组合。

21.权利要求18-20的任一项的烟草产品，其中产品具有减少量的PON和/或NNK。

22.一种在烟草植物、植物部分和/或植物细胞中减少假氧尼古丁(PON)和/或4-(甲基亚硝基氨基)-1-(3-吡啶基)-1-丁酮(NNK)的方法，其包括：将一种或多种含有编码PON降解酶的核苷酸序列的异源性核酸分子引入烟草植物、植物部分和/或植物细胞，从而减少转基因烟草植物和/或植物部分中的PON和/或NNK含量。

23.一种生产具有减少的假氧尼古丁(PON)和/或4-(甲基亚硝基氨基)-1-(3-吡啶基)-1-丁酮(NNK)含量的植物、植物部分和/或植物细胞的方法，其包括：将一种或多种含有编码PON降解酶的核苷酸序列的异源性核酸分子引入烟草植物、植物部分和/或植物细胞，从而生产具有减少的PON和/或NNK含量的烟草植物、植物部分和/或植物细胞。

24.一种生产具有减少的PON和/或NNK含量的烟草产品的方法，该方法包括：从权利要求1-14或16的任一项的烟草植物、植物部分和/或植物细胞，或权利要求17的作物生产烟草产品，其中烟草产品具有减少的PON和/或NNK含量。

25.一种生产具有减少的假氧尼古丁(PON)和/或4-(甲基亚硝基氨基)-1-(3-吡啶基)-1-丁酮(NNK)含量的烟草产品的方法，其包括：将一种或多种含有编码PON降解酶的核苷酸序列的异源性核酸分子引入烟草植物、植物部分和/或植物细胞，从而生产具有减少的PON和/或NNK含量的转基因烟草植物、植物部分和/或植物细胞；并从所述转基因烟草植物、植物部分和/或植物细胞生产烟草产品，其中烟草产品具有减少的PON和/或NNK含量。

26.权利要求22-25的任一项的方法，其中编码PON降解酶的核苷酸序列来自已知降解尼古丁的真菌和/或细菌属。

27.权利要求22-26的任一项的方法，其中PON降解酶是PAO。

28.权利要求27的方法，其中PAO来自假单胞菌菌株HZN6或恶臭假单胞菌S16。

29. 权利要求26或权利要求27的方法，其中编码PAO的核苷酸序列包含SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的核苷酸序列。

30. 权利要求27-29的任一项的方法，其中编码PAO的核苷酸序列编码包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列的多肽。

31.权利要求22-30的任一项的方法，其中由所述核苷酸序列编码的PON降解酶融合至液泡靶向序列。

32.权利要求22-30的任一项的方法，其中由所述核苷酸序列编码的PON降解酶融合至内质网靶向信号序列。

33.权利要求22-30的任一项的方法，其包括至少两种含有编码PON降解酶的核苷酸序列的异源性核酸分子，其中所述至少两种异源性核酸分子中的至少一种包含编码融合至液泡靶向序列的PON降解酶的核苷酸序列和所述至少两种异源性核酸分子中的至少一种包含编码融合至ER靶向信号序列的PON降解酶的核苷酸序列。

34. 权利要求31或权利要求33的方法，其中液泡靶向序列由SEQ ID NO:8的核苷酸序列编码。

35. 权利要求31、33或34的任一项的方法，其中融合至液泡靶向序列的PON降解酶由SEQ ID NO:6的核苷酸序列编码。

36. 权利要求31，或33-35的任一项的方法，其中融合至液泡靶向序列的PON降解酶包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列。

37.权利要求22-36的任一项的方法，其中核酸分子还包含一种或多种调节序列。

38.由权利要求22-37的任一项的方法生产的烟草植物、植物部分和/或植物细胞。

39.从权利要求38的烟草植物、植物部分或植物细胞生产的后代植物或种子，其中所述后代植物或种子包含所述一种或多种含有编码PON降解酶的核苷酸序列的异源性核酸分子。

40.来自权利要求39的后代植物的种子，其中所述种子包含所述一种或多种含有编码PON降解酶的核苷酸序列的异源性核酸分子。

41.来自权利要求39或权利要求40的种子的烟草植物，其中所述植物包含所述一种或多种含有编码PON降解酶的核苷酸序列的异源性核酸分子。

42.包含在农田中种植在一起的权利要求38、39或41的任一项的多种转基因烟草植物的植物作物。

43.从权利要求24的方法生产的烟草产品。

44.从权利要求38的烟草植物、植物部分和/或植物细胞，从权利要求39的后代植物，从权利要求39或40的种子，从权利要求40的烟草植物，和/或从权利要求41的作物生产的烟草产品。

45.权利要求43或权利要求44的烟草产品，其中烟草产品是烟叶、烟丝、生切烟丝、研磨烟丝、粉末烟草、烟草提取物、尼古丁提取物、无烟烟草、潮湿或干燥鼻烟、丁香烟、烟斗烟草、雪茄烟草、小雪茄烟烟草、卷烟用烟叶、嚼用烟草、比迪烟、bits和含烟草的口香糖、糖锭片、电子香烟，或其任何组合。

46.权利要求43或权利要求44的烟草产品，其中烟草产品是小雪茄烟、香烟、非透气休闲过滤香烟、透气休闲过滤香烟、雪茄、鼻烟、嚼用烟草或其任何组合。

47.权利要求43-46的任一项的烟草产品，其中所述产品具有减少量的PON和/或NNK。