CN1638655A

CN1638655A - 修饰烟草中烟碱和亚硝胺的水平

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Publication number: CN1638655A
Application number: CNA028151739A
Authority: CN
Inventors: M·A·康克林
Original assignee: Vector Tobacco Ltd
Current assignee: Vector Tobacco Ltd
Priority date: 2001-06-08
Filing date: 2002-06-06
Publication date: 2005-07-13
Also published as: MXPA03011385A; PL367438A1; US20060060211A1; KR20040019301A; US20060191549A1; EP1406518A4; US20050161056A1; TWI258340B; HUP0400161A2; EA200400013A1; IL159213A0; US20060191547A1; JP2006304800A; US20040144397A1; SG132542A1; ZA200400084B; WO2002100199A3; WO2002100199A2; UY27326A1; IL159213A

Abstract

本发明一般涉及烟碱和/或烟草特异的亚硝胺(TSNA)含量降低的烟草和烟草产品。更具体的，本发明公开了几种制备烟碱和TSNA水平降低的烟草植物的方法。本发明的实施方案包括从该烟草植物收获的烟草、源自该烟草植物的加工烟草、用该加工烟草制造的烟草产品和制造这些组合物的方法。

Description

修饰烟草中烟碱和亚硝胺的水平

发明领域

本发明一般涉及烟碱和/或烟草特异的亚硝胺(TSNA)含量降低的烟草和烟草产品。更具体的，公开了几种制备烟碱和TSNA水平降低的烟草植物的方法。实施方案包括从该烟草植物收获的烟草、源自该烟草植物的加工烟草(cured tobacco)、用该加工烟草制造的烟草产品和制造这些组合物的方法。

发明背景

尽管烟草消费的健康后果是公知的，但有许多人继续使用烟草产品。烟草产品的成瘾性在很大程度上归因于烟碱的存在。除作为一种公知的最成瘾的物质外，烟碱还是烟草和体内出现的大量致癌化合物的前体。

当前在有害、致癌，或上瘾性物质包括焦油、亚硝胺，和烟碱水平降低的烟草生产方法上有极大的兴趣。尽管研究者已开发了几种降低烟草产品烟碱含量或去除烟碱的方法，但多数技术导致产品的味道、香气，或吸烟性质(smoking properties)差。例如，一些方法，在烟草收获后通过微生物酶降解、化学处理，或高压提取降低其烟碱含量。(参见美国专利号4,557,280；4,561,452；4,848,373；4,183,364；和4,215,706，此处特别地全部引用作为参考)。由上述看来，尽管现有技术举例说明了多种努力，但仍然需要烟碱和TSNA降低的烟草和生产这种烟草的方法。

发明概述

本发明的实施方案涉及制备烟碱和/或烟草特异的亚硝胺(TSNAs)含量降低的烟草和烟草产品。除烟碱水平降低外，本发明的一些烟草和烟草产品的N′-亚硝基去甲烟碱(NNN)、N′-亚硝基新烟草碱(NAT)、N′-亚硝基新烟碱(N′-nitrosoanabasine)(NAB)、4-(N-亚硝基甲氨基)-1-(3-吡啶基)-1-丁酮(NNK)、4-(N-亚硝基甲氨基)-4-(3-吡啶基)-1-丁醛(NNA)、4-(N-亚硝基甲氨基)-1-(3-吡啶基)-1-丁醇(NNAL)、4-(N-亚硝基甲氨基)-4-(3-吡啶基)-1-丁醇(异-NNAL)和/或4-(N-亚硝基甲氨基)-4-(3-吡啶基)-1-丁酸(异-NNAC)的含量也降低。例如，一些实施方案，基本上缺少至少一种TSNA，其选自N′-亚硝基去甲烟碱、4-(N-亚硝基甲氨基)-1-(3-吡啶基)-1-丁酮、N′-亚硝基新烟草碱，和N′-亚硝基新烟碱。术语“烟草产品”包括，但不限于，吸烟材料(例如，卷烟、雪茄、烟斗烟草(pipe tobacco))、鼻烟(snuff)、嚼用烟草(chewing tobacco)、口香糖(gum)，和糖锭(lozenge)。例如，一个实施方案，包括遗传修饰的加工烟草，其中的烟碱含量降低及NNN、NAT、NAB，和NNK的总含量低于约0.5μg/g、0.4μg/g或0.2μg/g。即，该加工烟草由遗传修饰的烟草植物制造。

本发明的另一方面涉及从烟草中基本上除去或降低烟碱和/或TSNA含量的方法。经由一种方法，通过使用基国工程阻断植物合成烟碱的能力而获得基本上缺少烟碱的烟草植物。由于这些遗传修饰的植物中去除了烟碱，因此由这些植物制造的烟草和烟草产品的TSNA的含量也降低。在优选的方法中，创造的转基因烟草有一或多种TSNA减少，包括但不限于，N′-亚硝基去甲烟碱(NNN)、4-(N-亚硝基甲氨基)-1-(3-吡啶基)-1-丁酮(NNK)、N′-亚硝基新烟草碱(NAT)，和/或N′-亚硝基新烟碱(NAB)。然后用常规技术由该转基因烟草植物制备烟草产品，其包括但不限于，吸烟材料(例如，卷烟、雪茄、烟斗烟草)、鼻烟、嚼用烟草、口香糖和糖锭。优选地，这些烟草产品由已经根据烟草制备中的常规技术切割、干燥、加工，和/或发酵的收获的烟叶和梗制造。然而，还可应用烟草加工和处理中的改进技术进一步降低TSNA的水平。

在本发明的一些实施方案中，通过将至少一种所选品种的烟草细胞暴露于外源DNA构建体而获得基本上不含烟碱和TSNA的烟草，所述构建体，以5′到3′的方向，具有植物细胞中有效的启动子和包含编码烟碱合成途径中酶的DNA序列片段的DNA。DNA与该启动子有效结合，用DNA构建体转化烟草细胞，选择转化细胞并从转化细胞中再生至少一种转基因烟草植物。当与同品种的对照烟草植物对比时，转基因烟草植物的烟碱和/或TSNA的含量降低。在优选的实施方案中，具有编码烟碱合成途径中酶的DNA序列片段的DNA构建体，可具有该酶的全部编码序列，或其任何片段。

在一些实施方案中，烟碱合成途径涉及的酶是腐胺(putrescine)N-甲基转移酶、N-甲基腐胺氧化酶、鸟氨酸脱羧酶、S-腺苷甲硫氨酸合成酶、NADH脱氢酶、磷酸核糖邻氨基苯甲酸异构酶或喹啉磷酸核糖基转移酶(quinolate phosphoribosyl transferase)(QPTase)。在优选的实施方案中，该酶是QPTase。编码烟碱合成途径中酶的DNA序列片段可是反义或有义方向。在一些实施方案中，从许多种Burley烟草(例如，Burley 21)、Oriental烟草或Flue-cured烟草中制备基本上不含烟碱和/或TSNA的烟草。然而，应当理解，用此处描述的实施方案可将大多数烟草品种制造成无烟碱和/或TSNA。例如，品种Burley 21的植物细胞被用作产生烟碱和/或TSNA减少的基因工程宿主，以便生成的转基因植物是烟碱和/或TSNA含量降低的Burley 21品种。

本发明一方面还包括分离的DNA分子，包括SEQ ID NO：1的DNA序列(其编码SEQ ID NO：2的酶)、与这种DNA杂交和编码喹啉磷酸核糖基转移酶或这种酶一部分的DNA序列，和由于遗传密码简并而与以上DNA不同的DNA序列。由这样的DNA编码的肽是本发明的另一方面。

本发明另一方面涉及DNA构建体，其包括植物细胞中有效的启动子和位于启动子下游并与其有效连接的的编码喹啉磷酸核糖基转移酶的DNA片段。编码该酶的DNA可是反义或有义方向。

本发明另一方面涉及获得喹啉磷酸核糖基转移酶(QPTase)表达减少的转基因植物细胞的方法，通过提供已知表达喹啉磷酸核糖基转移酶类型的植物细胞；用外源DNA构建体转化植物细胞，该构建体包括启动子和包含编码喹啉磷酸核糖基转移酶mRNA序列片段的DNA。在优选的实施方案中，具有编码喹啉磷酸核糖基转移酶的DNA序列片段的DNA构建体，可具有该酶的全部编码序列，或其任何片段。更优选的是，遗传修饰的烟草包含对应于喹啉磷酸核糖基转移酶(QPTase)基因的序列或其至少13个核苷酸长度的片段。

本发明另一方面涉及烟草(Nicotiana)品种的转基因植物，相对未转化的对照植物其喹啉磷酸核糖基转移酶(QPTase)的表达减少。这种植物的细胞包含DNA构建体，其包括编码植物喹啉磷酸核糖基转移酶mRNA的DNA序列或其片段。

本发明另一方面涉及通过培养转化为包含外源DNA的植物细胞而减少喹啉磷酸核糖基转移酶基因表达的方法，其中外源DNA的转录链与细胞中内源喹啉磷酸核糖基转移酶mRNA互补。互补链的转录减少了内源喹啉磷酸核糖基基因的表达。

本发明另一方面包括通过从包含外源DNA序列的细胞中再生烟草植物而生产烟草植物叶中烟碱水平降低的烟草植物的方法，其中外源DNA序列编码与细胞中内源喹啉磷酸核糖基转移酶信使RNA区域互补的RNA。

本发明另一方面涉及制备烟碱和/或TSNA减少的烟草植物的方法，其涉及从包含外源DNA序列的细胞中再生烟草植物，其中外源DNA序列的转录链与细胞中内源喹啉磷酸核糖基转移酶信使RNA区域互补。相关的实施方案包括从烟碱和/或TSNA含量降低的所述烟草植物中生产烟草产品的方法，该烟草产品包括，但不限于，卷烟、雪茄、烟斗烟草、嚼用烟草，并可以是烟叶、碎烟草，或切割烟草的形式。

本发明另一方面涉及烟草突变体的制造、分离、和/或鉴定，所述烟草突变体显示导致烟草植物烟碱和/或TSNA含量降低的烟碱生物合成涉及的基因突变。例如，一些实施方案，有至少一种烟碱生物合成涉及的基因突变，包括但不限于，腐胺N-甲基转移酶、N-甲基腐胺氧化酶、鸟氨酸脱羧酶、S-腺苷甲硫氨酸合成酶、NADH脱氢酶、磷酸核糖邻氨基苯甲酸异构酶或喹啉磷酸核糖基转移酶(QPTase)。为降低烟碱和/或TSNA的水平可用植物育种的普通技术筛选上述基因的自然突变。在一些实施方案中，从许多种Burley烟草(例如，Burley21)、Oriental烟草，或Flue-cured烟草中制备上述烟草突变体。然而，应当理解，可从大多数烟草品种中筛选烟碱生物合成基因突变体。这些烟草植物也可用于制备烟碱和/或TSNA水平降低的烟草产品。

另外的实施方案包括小心混合以便获得期望的烟碱和/或TSNA水平的烟草产品。例如，如上所述制备的烟碱和/或TSNA水平降低的烟草，可与常规烟草混合以获得基本上任何含量的烟碱和/或TSNA。另外，可混合两种或多种烟碱和/或TSNA水平降低的烟草以达到期望的烟碱和/或TSNA含量。在这种情况下，可大幅调节品种、香味，及烟碱和/或TSNA含量的差异。这些混合的烟草产品可组成烟草使用停止试剂盒及为降低烟碱依赖和致癌潜能而设计的程序。这样的试剂盒和程序也是本发明的实施方案。

本发明更多的实施方案涉及降低烟草产品致癌潜能的方法，其中烟草产品包括卷烟、雪茄、嚼用烟草、鼻烟和含烟草的口香糖和糖锭。例如，一些方法包括制备烟碱和/或TSNA含量降低的烟草及制造含该烟草的烟草产品。因此，上述的转基因烟草植物被收获、加工，和处理成烟草产品。由于这些烟草产品从烟碱和/或TSNA含量降低的烟草中制备，因此其致癌潜能降低。

本发明的再一方面涉及在吸烟、消费(consume)或摄取烟草的人中降低TSNA及其代谢产物的含量，其中TSNA优选NNN和NNK。通过向所述人提供TSNA含量降低的烟草产品，从而降低这种产品在所述人中的致癌潜能而实施这种方法。例如，用一种方法，通过在进行热分解的产品中提供如上所述的加工烟草，而在暴露于侧流或主流烟草烟气的人中降低该侧流或主流烟草烟气的致癌潜能，其中该产品的热分解导致侧流或主流烟草烟气中TSNA含量降低。因此，如上所述的加工烟草可用于制备烟草的吸烟产品，其在侧流和/或主流烟气中产生的TSNA含量降低并因此降低在与烟草烟气接触的人中致癌物的含量。

附图简述

图1显示烟碱的生物合成途径。已知QPTase(喹啉磷酸核糖基转移酶)和PMTase(putrescence甲基转移酶)的酶活性被Nicl和Nic2调节。

图2A提供NtQPT1 cDNA的核酸序列(SEQ ID NO：1)，其中编码序列以大写字母显示(SEQ ID NO：3)。

图2B提供NtQPT1 cDNA编码的烟草QPTase的推论氨基酸序列(SEQ ID NO：2)。

图3比对了NtQPT1的推论氨基酸序列和深红螺菌(Rhodospirillum rubrum)、麻疯分枝杆菌(Mycobacterium leper)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)、大肠杆菌(Escherichiacoli)、人，和啤酒糖酵母(Saccharomyces cerevisiae)的相关序列。

图4显示缺少喹啉磷酸核糖基转移酶的大肠杆菌突变体(TH265)与NtQPT1 cDNA的互补结果。用携带NtQPT1的表达载体转化细胞；表达NtQPT1的转化TH265细胞在缺少烟酸的基本培养基上的生长证明NtQPT1编码QPTase。

图5比较Nic1和Nic2烟草突变体中烟碱水平和相对稳定状态的NtQPT1 mRNA水平；野生型Burley 21(Nicl/Nicl Nic2/Nic2)；Nic1-Burley 21(nicl/nicl Nic2/Nic2)；Nic2-Burley 21(Nicl/Nicl nic2/nic2)；和Nicl-Nic2-Burley 21(nicl/nicl nic2/Nnc2)。实体柱(solid bars)指示mRNA转录水平；阴影柱(hatched bars)指示烟碱水平。

发明详述

公开了几种产生烟碱和/或TSNA含量降低的烟草和烟草产品的方法。此处描述的技术方面也在PCT/US98/11893中被描述，此处特别地全部引用作为参考。通过一种方法，生产烟碱和TSNA水平降低的转基因烟草植物并从该转基因烟草植物中收获烟草用于制备多种烟草产品。一种这样的转基因烟草植物包含DNA构建体，其编码至少与一部分喹啉磷酸核糖基转移酶(QPTase)的基因互补的反义RNA。RNA互补链的转录降低了内源喹啉磷酸核糖基基因的表达，其依次地降低在烟草植物中的烟碱含量，并同时降低TSNA的含量。因此，一个创造性的概念是利用可降低烟草植物中TSNA含量的基因工程降低该植物中烟碱的含量。以下部分详述亚硝胺和烟草特异的亚硝胺。

亚硝胺和烟草特异的亚硝胺

术语亚硝胺通常指通式为R₂NNO或RNHNO(其中R为含胺的基团)的一类有机化合物中任一种。亚硝胺存在于很多中食物中，并在实验动物中发现是致癌的。这些化合物通过胺(例如氨基酸和生物碱)与亚硝酸盐和/或氧化亚氮的亚硝化作用形成。亚硝胺本身不是致癌性物质，但在动物体内亚硝胺通过酶反应进行分解形成的烷基化代谢产物与生物多聚物发生反应而启动它们的致癌作用。因此，通过降低亚硝胺的摄入量，已经有效降低了人体中的致癌潜能。

通过使用例如气相色谱热交换分析(gas chromatography-thermalexchange analysis)(GC-TEA)技术，已经在烟草、烟草产品，和烟草烟气中鉴定出亚硝胺。其中一些亚硝胺已被鉴定为烟草特异的亚硝胺(TSNA)。TSNA基本上通过两种最丰富的生物碱，烟碱和去甲烟碱，与氧化亚氮(NOx)之间的反应产生，它们相称地占烟草产品和主流烟气中最高浓度的亚硝胺。在已鉴定的TSNA，和已发现存在于烟草烟气的亚类中，最典型的是N-亚硝胺、4-(甲基亚硝氨基)-1-(3-吡啶基)-1-丁酮(N-亚硝胺-甲酮)，或NNK。当以相对高的剂量注射时，NNK在啮齿类中是致癌的。在绿色烟草中发现TSNA的含量极微，表明TSNA的产生可能发生在处理步骤中，例如烟草的加工、干燥、发酵、烘烤或贮存。

TSNA的产生归因于烟草处理中化学、酶和细菌的影响，尤其在加工、发酵和陈化(aging)中。去甲烟碱、新烟草碱(anatabine)，和新烟碱的亚硝基化产生对应的亚硝胺：N′-亚硝基去甲烟碱(NNN)、N′-亚硝基新烟草碱(NAT)和N′-亚硝基新烟碱(NAB)。烟碱在水溶液中的亚硝基化产生4-(N-亚硝基甲氨基)-1-(3-吡啶基)-1-丁酮(NNK)、NNN，和4-(N-亚硝基甲氨基)-4-(3-吡啶基)-1-丁醛(NNA)的混合物。不常见的TSNA包括NNAL(4-N-亚硝基甲氨基)-1-(3-吡啶基)-1-丁醇)、异-NNAL(4-N-亚硝基甲氨基)-4-(3-吡啶基)-1-丁醇，11)和异-NNAC(4-(N-亚硝基甲氨基)-4-(3-吡啶基)-1-丁酸，12)。参见，美国专利号6,135,121，其公开的全部内容此处特别地全部引用作为参考。

TSNA水平在嚼用烟草和鼻烟中尤其高。发酵中发生的部分厌氧过程通过促进亚硝酸盐水平的升高而促进由烟草生物碱生成TSNA；特别地，过发酵(over-fermentation)可通过其对硝酸盐水平和微生物酶活性的作用提高鼻烟中的TSNA水平。近年已通过在这些产品中保持对细菌含量的更好控制达到鼻烟中亚硝胺水平的降低。

由于烟草的硝酸盐水平对卷烟烟气中的亚硝胺产生是重要的，所以可通过低硝酸盐的叶和梗的混和物达到烟气中的亚硝胺显著降低，然而，这些方法可负面影响烟草的吸烟性能(smokability)或味道。主流烟气中的亚硝胺含量可通过醋酸纤维素过滤器减少多达80％，并可通过滤器通气进一步减少。

空气处理(Air-cured)的烟草例如burley和dark-fired比某些类型的烟熏(flue-cured)bright、burley，或深色烟草具有更高水平的TSNA，主要由于烟熏(flue-curing)相关的高温可杀死将生物碱转化成TSNA的微生物。在空气处理的类型中，叶中(尤其在叶和梗中)的硝酸盐(N-NO₃)比烟熏烟草更丰富，并且生物碱含量也更高。这种N-NO₃通过加工中的微生物被还原成亚硝酸盐(NO₂ ^-)，该NO₂ ^-可被进一步还原成NO_X或与生物碱直接反应形成TSNA。

除上述技术外，还涉及可通过限制向亚硝基化因素或条件暴露而降低烟草中(尤其在叶子中)的硝酸盐水平。更高温度的空气处理实验显示，32℃比16℃的处理温度有更高水平的N-亚硝胺形成，其与烟草中的亚硝酸盐水平升高有关，还可能与微生物酶活性的升高有关。改进的处理包括从更宽的间距或更开放的加工结构中更快的干燥，其已被证明可在burley烟草中降低TSNA的水平。处理中主要的气候条件对N-亚硝胺的形成产生主要影响，空气处理中的相对湿度是重要的。茎的加工比预处理叶子(primed-leaf)的加工在烟气中产生更高水平的TSNA。日光处理(sun-cured)的Oriental烟草比Flue和空气处理的深色烟草的TSNA水平更低。粗烟草的加速处理，例如经过匀化叶子处理可限制细菌进行亚硝基化反应的能力。然而，上述多种在Burley烟草中降低TSNA的方法会对烟草味道有不良影响。

烟熏烟草中TSNA的形成还起因于加工中烟草暴露于燃烧气体，其中烟熏(例如，弗吉尼亚Flue)中几乎所有的TSNA起因于NO_X和烟碱的反应。NO_X的主要来源是直接燃烧仓(direct-fired barns)中燃烧气体的混合物。目前，烟熏烟草主要在商品化的整体仓(bulkbarns)中加工。作为1960年代美国能源压力的产物，农民建造的带热交换烟道系统的“自保仓”(stick barns)已逐渐被使用直接燃烧液态丙烷气(LPG)燃烧器的能量效率更高的整体仓代替。这些LPG直接燃烧器系统将燃烧气体和燃烧副产物直接排到仓中并在这里与加工烟草产生接触。研究表明LPG燃烧副产物与自然产生的烟草生物碱反应形成TSNA。

与直接燃烧加工相反，热交换燃烧器结构将燃烧气体和燃烧副产物直接排到外部空气中，而不是仓中。该热交换过程排除了烟草向LPG燃烧副产物的暴露，因此在不降低烟叶质量或吸烟质量的情况下，消除了TSNA形成的亚硝基化因素的一个重要来源。使用热交换器减少约90％的TSNA水平。正在进行的在美国烟草中降低TSNA水平的步骤通过使用热交换器将仓改建为间接热，但这些方法很昂贵。尽管这部分描述的许多方法有显著缺点，但应当理解，如此处所描述，任何或所有这些技术可与其他技术一起使用，以使烟草和烟草产品的亚硝胺降低。下部分详述烟碱和在烟草中降低烟碱的方法。

烟碱

烟碱首先在烟草植物的根中形成然后输送到叶子，贮存在那里(Tso，Physiology and Biochemistry of Tobacco Plants，PP.233-34，Dowden，Hutchinson & Ross，Stroudsburg，Pa.(1972))。传统的农作物育种技术已经产生了更低水平烟碱的烟草，包括烟碱含量降至野生型烟草8％的品种。此处描述的许多技术基本上可用于任何烟草品种，但是优选用于burley、Oriental或Flue(例如弗吉尼亚Flue)品种。

通过烟酸和4-甲氨基丁醛的缩合作用在烟草植物中生成烟碱。图1中说明了导致烟碱生成的生物合成途径。两个调节基因座(Nic1和Nic₂)充当烟碱生成的共显性调节子。Nic单和双突变体根组织的酶分析显示，喹啉磷酸核糖基转移酶(″QPTase″)和putrescence甲基转移酶(PMTase)两种酶的活性，与烟碱生物合成的水平直接成比例。烟碱生物合成的必须步骤是从喹啉酸形成烟酸，该步骤由QPTase催化。QPTase看来是烟草中为烟碱合成提供烟酸途径中的限速酶。(参见，例如，Feth等人，Planta，168，pp.402-07(1986)和Wagner等人，Physiol.Plant.，68，pp.662-72(1986)，此处特别地全部引用作为参考)。在烟碱合成能力不同的烟草组织中(根和愈伤组织)酶活性的比较显示QPTase的活性与烟碱含量严格相关(Wagner和Wagner，Planta165：532(1985)，此处特别地全部引用作为参考)。实际上，Saunders和Bush(Plant Physiol 64：236(1979)，此处特别地全部引用作为参考)，证明低烟碱突变体根中的QPTase水平与叶中的烟碱水平是成比例的。

已经由Nakatani和Malik在美国专利5,369,023和5,260,205及Wahad和Malik在PCT申请WO 94/28142中提出，通过反义调节putrescence甲基转移酶(PMTase)的表达改变烟草植物中的烟碱水平，其描述了编码PMT的DNA和有义和反义PMT构建体的用途，此处特别地全部引用其中每一个的全部内容作为参考。其他提出的降低烟碱水平的基因修饰在Timko的PCT申请WO 00/67558及Davis和Marcum的WO 93/05646中有描述；此处特别地全部引用每一个的全部内容作为参考。尽管这部分描述的许多方法有显著缺点，但应当理解，如此处所描述，任何或所有这些技术可与其他技术一起使用，以使烟草和烟草产品的烟碱降低。下部分说明在烟草和烟草产品中降低烟碱和TSNA水平的新方法。

降低烟碱和烟草特异的亚硝胺(TSNA)的含量

如上所述，主要是TSNA和烟碱导致烟草和烟草产品的致癌潜能和成瘾性。因此，TSNA和烟碱含量降低的烟草和烟草产品有巨大的实用性。不希望被任何特殊的理论束缚，期望创造的烟碱含量降低的烟草植物、烟草和烟草产品，还会有TSNA含量的降低。即，通过从烟草植物、烟草和烟草产品中去除烟碱，有效地去除了TSNA生成的生物碱底物。发现烟草中烟碱的减少与TSNA的减少直接相关。出乎意料地，此处描述的方法不仅产生成瘾潜能降低的烟草，而且同时产生致癌潜能降低的烟草。

应当强调的是短语“含量降低”意指处理或转基因的烟草植物、烟草或烟草产品中的烟碱和/或TSNA含量低于在那些没有为了减少烟碱和/或TSNA而被处理或转基因的、以同样方式加工的、同品种烟草的烟草植物、烟草或烟草产品中应当发现的含量。因此，在某些情况下，已经以同样方式加工的同品种野生型烟草被用作对照以检测是否通过此处描述的发明方法减少了烟碱和/或TSNA。

由于品种和生长、收获及加工的方式不同，野生型烟草中的TSNA(例如，NNN、NAT、NAB，和NNK的总含量)和烟碱的含量差异显著。例如，加工的Burley烟叶可含有约百万分之30,000(ppm)的烟碱和十亿分之8,000(ppb)的TSNA(例如，NNN、NAT、NAB，和NNK的总含量)；FlHe-Cured叶可含有约20,000ppm的烟碱和300ppb的TSNA(例如NNN、NAT、NAB和NNK的总含量)；Oriental加工叶中可含有约10,000ppm烟碱和100ppb的TSNA(例如NNN、NAT、NAB和NNK的总含量)。只要烟碱和/或TSNA含量低于相同品种、相似生长条件及以同样方式处理和/或加工的烟草中发现的含量，烟碱和/或TSNA含量降低的烟草，可含有检测不到的烟碱和/或TSNA(例如，NNN、NAT、NAB，和NNK的总含量)，或含有一些可检测含量的一或多种TSNAs和/或烟碱。即，加工的Burley烟草，如此处所描述，其含有降低的烟碱含量为0到30,000ppm烟碱和0到8,000ppb TSNA，希望为0到20,000ppm烟碱和0到6,000ppb TSNA，更希望为0到10,000ppm烟碱和0到5,000ppb TSNA，优选为0到5,000ppm烟碱和0到4,000ppb TSNA，更优选为0到2,500ppm烟碱和0到2,000ppb TSNA及最优选为0到1,000ppm烟碱和0到1,000ppb TSNA。用此处描述的方法制备加工Burley烟叶的实施方案还可含有0到1,000ppm烟碱和0到500ppb TSNA、0到500ppm烟碱和0到250ppb TSNA、0到250ppm烟碱和0到100ppb TSNA、0到100ppm烟碱和0到50ppb TSNA、0到50ppm烟碱和0到5ppbTSNA，并在此处描述的加工Burley烟叶的一些实施方案中含有基本上检测不到含量的烟碱或TSNA。在以上一些实施方案中，TSNA含量指NNN、NAT、NAB，和NNK的总含量。

类似地，本发明烟碱含量降低的加工Flue烟草的实施方案可含有0到20,000ppm烟碱和0到300ppb TSNA，希望为0到15,000ppm烟碱和0到250ppb TSNA，更希望为0到10,000ppm烟碱和0到200ppb TSNA，优选为0到5,000ppm烟碱和0到150ppb TSNA，更优选为0到2,500ppm烟碱和0到100ppb TSNA，及最优选为0到1,000ppm烟碱和0到50ppb TSNA。加工Flue烟草的实施方案，如此处所描述，还可含有0到500ppm烟碱和0到25ppb TSNA、0到200ppm烟碱和0到10ppb TSNA、0到100ppm烟碱和0到5ppb TSNA及一些加工Flue烟草的实施方案含有基本上检测不到含量的烟碱或TSNA。在以上一些实施方案中，TSNA含量指NNN、NAT、NAB，和NNK的总含量。

另外，烟碱含量降低的加工Oriental烟草的实施方案可含有0到10,000ppm烟碱和0到100ppb TSNA，希望为0到7,000ppm烟碱和0到75ppb TSNA，更希望为0到5,000ppm烟碱和0到50ppbTSNA，优选为0到3,000ppm烟碱和0到25ppb TSNA，更优选为0到1,500ppm烟碱和0到10ppb TSNA及最优选为0到500ppm烟碱和检测不到的TSNA。加工Oriental烟草的实施方案还可含有0到250ppm烟碱和检测不到的TSNA及一些加工Oriental烟草的实施方案含有基本上检测不到含量的烟碱或TSNA。在以上一些实施方案中，TSNA含量指NNN、NAT、NAB，和NNK的总含量。

一些实施方案包括与对照品种相比烟碱含量降低的加工烟草(例如，Burley、Flue，或Oriental)，其中烟碱含量低于约2mg/g、1mg/g、0.75mg/g、0.5mg/g或希望低于约0.1mg/g，并优选低于0.08mg/g、0.07mg/g、0.06mg/g、0.05mg/g、0.04mg/g、0.03mg/g、0.02mg/g、0.01mg/g。由这些烟碱和TSNA减少的烟草制造的烟草产品也是实施方案。术语“烟草产品”包括，但不限于，吸烟材料(例如，卷烟、雪茄、烟斗烟草)、鼻烟、嚼用烟草、口香糖，和糖锭。

在某些情况下，短语“烟碱和/或TSNA含量降低”指烟草植物、加工烟草，和烟草产品，如此处所描述，其比以同样方式生长、加工，和处理的同品种烟草含有更低重量的烟碱和/或TSNA(例如，NNN、NAT、NAB，和NNK的总含量)。例如，根据生长、收获和加工的方式，野生型加工烟草可含有约1-4％干重的烟碱和约0.2-0.8％干重的TSNA。典型的卷烟含有2-11mg的烟碱和约5.0μg TSNA。因此，本发明的烟草植物、烟草和烟草产品可含有，以干重为例，低于0.01％、0.015％、0.02％、0.025％、0.03％、0.035％、0.04％、0.045％、0.05％、0.055％、0.06％、0.065％、0.07％、0.075％、0.08％、0.085％、0.09％、0.095％、0.1％、0.15％、0.175％、0.2％、0.225％、0.25％、0.275％、0.3％、0.325％、0.35％、0.375％、0.4％、0.425％、0.45％、0.475％、0.5％、0.55％、0.6％、0.65％、0.7％、0.75％、0.8％、0.85％、0.9％、0.95％，和1.0％的烟碱及低于0.01％、0.015％、0.02％、0.025％、0.03％、0.035％、0.04％、0.045％、0.05％、0.055％、0.06％、0.065％、0.07％、0.075％，和0.08％的TSNA(例如，NNN、NAT、NAB，和NNK的总含量)。

另外，本发明的卷烟可含有，例如，低于0.1mg、0.15mg、0.2mg、0.25mg、0.3mg、0.35mg、0.4mg、0.45mg、0.5mg、0.55mg、0.6mg、0.65mg、0.7mg、0.75mg、0.8mg、0.85mg、0.9mg、0.95mg、1.0mg、1.1mg、1.15mg、1.2mg、1.25mg、1.3mg、1.35mg、1.4mg、1.45mg、1.5mg、1.55mg、1.6mg、1.65mg、1.7mg、1.75mg、1.8mg、1.85mg、1.9mg、1.95mg、2.0mg、2.1mg、2.15mg、2.2mg、2.25mg、2.3mg、2.35mg、2.4mg、2.45mg、2.5mg、2.55mg、2.6mg、2.65mg、2.7mg、2.75mg、2.8mg、2.85mg、2.9mg、2.95mg、3.0mg、3.1mg、3.15mg、3.2mg、3.25mg、3.3mg、3.35mg、3.4mg、3.45mg、3.5mg、3.55mg、3.6mg、3.65mg、3.7mg、3.75mg、3.8mg、3.85mg、3.9mg、3.95mg、4.0mg、4.1mg、4.15mg、4.2mg、4.25mg、4.3mg、4.35mg、4.4mg、4.45mg、4.4mg、4.45mg、4.5mg、4.55mg、4.6mg、4.65mg、4.7mg、4.75mg、4.8mg、4.85mg、4.9mg、4.95mg、5.0mg、5.5mg、5.7mg、6.0mg、6.5mg、6.7mg、7.0mg、7.5mg、7.7mg、8.0mg、8.5mg、8.7mg、9.0mg、9.5mg、9.7mg、10.0mg、10.5mg、10.7mg，和11.0mg的烟碱及低于0.001μg、0.002μg、0.003μg、0.004μg、0.005μg、0.006μg、0.007μg、0.008μg、0.009μg、0.01μg、0.02μg、0.03μg、0.04μg、0.05μg、0.06μg、0.07μg、0.08μg、0.09μg、0.1μg、0.15μg、0.2μg、0.25μg、0.3μg、0.336μg、0.339μg、0.345μg、0.35μg、0.375μg、0.4μg、0.414μg、0.45μg、0.5μg、0.515μg、0.55μg、0.555μg、0.56μg、0.578μg、0.58μg、0.6μg、0.611μg、0.624μg、0.65μg、0.7μg、0.75μg、0.8μg、0.85μg、0.9μg、0.95μg、1.0μg、1.1μg、1.114μg、1.15μg、1.2μg、1.25μg、1.3μg、1.35μg、1.4μg、1.45μg、1.5μg、1.55μg、1.6μg、1.65μg、1.7μg、1.75μg、1.8μg、1.85μg、1.9μg、1.95μg、2.0μg、2.1μg、2.15μg、2.2μg的TSNA(例如，NNN、NAT、NAB，和NNK的总含量)。

出乎意料地，发现在植物中降低内源性烟碱水平的几种方法适合生产基本上不含亚硝胺，尤其是TSNA的烟草。降低其他生物碱包括去甲烟碱(norniticotine)水平的任何方法，会同样适合生产基本上不含亚硝胺、尤其是TSNA的烟草。如上所述本发明包括降低烟草产品致癌潜能的方法，其中包括提供如此处所描述的加工烟草和从该加工烟草中制备烟草产品，从而降低该烟草产品的致癌潜能。本发明的其他实施方案包括此处描述的加工烟草在制备与对照品种相比致癌物含量降低的烟草产品和/或降低使用烟草的人体中TSNA或TSNA代谢物(metobolite)含量的烟草产品中的用途。

在一些实施方案中，例如，此处描述的烟草吸烟产品降低暴露于侧流或主流烟草烟气的人中该侧流或主流烟草烟气的致癌潜能。例如，通过在进行热分解的产品中提供此处描述的遗传修饰的加工烟草，由该产品产生的侧流和/或主流烟气中TSNA和/或烟碱的含量降低。因此，此处描述的加工烟草可用于制备在侧流和/或主流烟气中TSNA含量降低的烟草吸烟产品。

在一些实施方案中，例如，在来自包含此处描述的遗传修饰烟草的烟草产品的主流或侧流烟气中NNN、NAT、NAB和NNK的总含量为约0-5.0μg/g、0-4.0μg/g、0-3.0μg/g、0-2.0μg/g、0-1.5μg/g、0-1.0μg/g、0-0.75μg/g、0-0.5μg/g、0-0.25μg/g、0-0.15μg/g、0-0.1μg/g、0-0.05μg/g、0-0.02μg/g、0-0.015μg/g、0-0.01μg/g、0-0.005μg/g、0-0.002μg/g，或0-0.001μg/g。即，一些实施方案是遗传修饰的Burley烟草，其中从包含该Burley烟草的烟草产品产生的侧流或主流烟气在该主流或侧流烟气中包含的NNN、NAT、NAB和NNK的总含量为约0-5.0μg/g、0-4.0μg/g、0-3.0μg/g、0-2.0μg/g、0-1.5μg/g、0-1.0μg/g、0-0.75μg/g、0-0.5μg/g、0-0.25μg/g、0-0.15μg/g、0-0.1μg/g、0-0.05μg/g、0-0.02μg/g、0-0.015μg/g、0-0.01μg/g、0-0.005μg/g、0-0.002μg/g，或0-0.001μg/g。

其他实施方案涉及遗传修饰的Flue烟草，其中从包含该Flue烟草的烟草产品产生的侧流或主流烟气在该主流或侧流烟气中包含的NNN、NAT、NAB和NNK的总含量为约0-5.0μg/g、0-4.0μg/g、0-3.0μg/g、0-2.0μg/g、0-1.5μg/g、0-1.0μg/g、0-0.75μg/g、0-0.5μg/g、0-0.25μg/g、0-0.15μg/g、0-0.1μg/g、0-0.05μg/g、0-0.02μg/g、0-0.015μg/g、0-0.01μg/g、0-0.005μg/g、0-0.002μg/g或0-0.001μg/g。

更多的实施方案涉及遗传修饰的Oriental烟草，其中从包含该Oriental烟草的烟草产品产生的侧流或主流烟气在该主流或侧流烟气中包含的NNN、NAT、NAB和NNK的总含量为约0-5.0μg/g、0-4.0μg/g、0-3.0μg/g、0-2.0μg/g、0-1.5μg/g、0-1.0μg/g、0-0.75μg/g、0-0.5μg/g、0-0.25μg/g、0-0.15μg/g、0-0.1μg/g、0-0.05μg/g、0-0.02μg/g、0-0.015μg/g、0-0.01μg/g、0-0.005μg/g、0-0.002μg/g，或0-0.001μg/g。

生产烟碱和TSNA含量降低的烟草的优选方法涉及定向降低烟碱和/或去甲烟碱或其他生物碱水平的遗传工程。烟碱合成途径涉及的任何酶可是降低烟碱水平和任选的其他生物碱(包括去甲烟碱)水平的遗传工程的合适靶标。产生烟碱和/或亚硝胺(尤其是TSNA)含量降低烟草的遗传工程的合适靶标包括但不限于腐胺N-甲基转移酶、N-甲基腐胺氧化酶、鸟氨酸脱羧酶、S-腺苷甲硫氨酸合成酶、NADH脱氢酶、磷酸核糖邻氨基苯甲酸异构酶或喹啉磷酸核糖基转移酶(QPTase)。另外，调节前体流入烟碱合成途径的酶是产生烟碱和亚硝胺(尤其是TSNA)含量降低烟草的遗传工程的合适靶标。遗传工程的合适方法为本领域所公知并包括，例如减少酶生成的反义和有义抑制技术的应用，及破坏基因功能的随机或定位突变的应用，例如，使用T-DNA插入或EMS突变。

举例来说，烟碱和TSNA含量降低的烟草从烟草植物中产生，该烟草植物是通过将至少一种所选烟草品种(优选Burley 21)的烟草细胞暴露于外源DNA构建体而创造，该构建体，以5′到3′的方向，具有植物细胞中有效的启动子和包含编码烟碱合成途径中酶的DNA序列片段或其互补序列(complement)的DNA。DNA与该启动子有效结合，并用DNA构建体转化烟草细胞。用阴性选择或阳性选择技术选择转化细胞并从转化细胞中再生至少一种烟草植物。优选分析再生烟草植物或其部分以确定存在的烟碱和/或TSNA的含量，这些数值可与优选同品种的对照烟草植物或部分中存在的烟碱和/或TSNA的含量比较。

具有编码烟碱合成途径中酶的DNA序列片段的DNA构建体可具有该酶的全部编码序列、该序列的互补序列，或其任何片段。编码烟碱合成途径中酶的DNA序列片段或其互补序列可有至少25，或优选50，或75、或100、或150、或250、或500、或750、或1000、或1500、或2000、或2500、或5000，或该酶的全部编码序列或其互补序列。因此，通过反义或共抑制机制，这些DNA构建体具有干扰烟碱生物合成途径中内源性酶生成的能力。预料反义和共抑制构建体在降低烟草植物中烟碱和/或亚硝胺水平上都有效。

在优选的实施方案中，烟碱合成途径中涉及的酶可是，例如，腐胺N-甲基转移酶、N-甲基腐胺氧化酶、鸟氨酸脱羧酶、S-腺苷甲硫氨酸合成酶、NADH脱氢酶、磷酸核糖邻氨基苯甲酸异构酶，或喹啉磷酸核糖基转移酶(QPTase)。在优选的实施方案中，该酶是QPTase。编码烟碱合成途径中酶的DNA序列片段可是反义或有义方向。在特别优选的实施方案中，该酶是QPTase。

在一个方法中，使用编码SEQ ID NO：2的植物喹啉磷酸核糖基转移酶(QPTase)的新cDNA序列(SEQ ID NO：1)。由于QPTase活性与烟碱含量严格相关，因此构建植物根中QPTase水平降低的(与野生型植物中的水平相比)转基因烟草植物产生叶中烟碱水平降低的植物。本发明的实施方案提供产生这种转基因植物的方法和核酸构建体以及转基因植物本身。这样的方法包括反义NtQPT1 RNA的表达，其降低烟草根中的QPTase含量。

本发明的内容还涉及编码QPTase或QPTase反义RNA分子的有义和反义重组DNA分子，和包括这些重组DNA分子的载体，及用这些DNA分子和载体转化的转基因植物细胞和植物。此处描述的转基因烟草细胞和植物特征在于，与未修饰的或对照烟草细胞和植物相比，它们的烟碱和/或TSNA的含量降低。

此处描述的烟草植物适合常规的生长和收获技术(例如截梢(topping)或不截梢、花装袋(bagging)或不装袋、在富含肥料或不含肥料的土壤中栽培)，并且收获的叶和茎适合用于任何传统烟草产品，包括但不限于，烟斗、雪茄和卷烟烟草及任何形式的嚼用烟草，包括叶烟、碎烟草或切割烟草。还期望此处描述的低烟碱和/或TSNA的烟草可与常规烟草一起加工和混合，以产生烟碱和/或亚硝胺含量不同的宽范围的烟草产品。这些混合的烟草产品可用于烟草产品停止程序，以缓慢地把消费者从高烟碱和TSNA产品移到低烟碱和TSNA的产品。本发明的一些实施方案包括烟草使用停止试剂盒，其中包括两或多种烟碱和/或亚硝胺水平不同的烟草产品。例如，吸烟者可通过吸食5mg烟碱和0.3μg亚硝胺的混合香烟开始该程序，逐渐地转移到吸食3mg烟碱和0.2μg亚硝胺的香烟，接着是含2mg烟碱和0.1μg亚硝胺的香烟，接着是含1.0mg烟碱和0.05μg亚硝胺的香烟，接着是含0.05mg烟碱和检测不到的TSNA的香烟，直到消费者决定仅吸基本上不含烟碱和亚硝胺的香烟或完全地放弃吸烟。因此，此处描述的混合香烟提供了以逐步的方式在人体中降低致癌潜能方法的基础。此处描述的烟草使用停止试剂盒的成分可包括其他烟草产品，包括但不限于，吸烟材料(例如，卷烟、雪茄、烟斗烟草)、鼻烟、嚼用烟草、口香糖，和糖锭。

本发明人已发现TobRD2基因(参见Conkling等人，Plant Phys.93，1203(1990))编码烟草(Nicotiana tabacum)QPTase，并在此处提供了NtQPT1(以前称为TobRD2)的cDNA序列和编码酶的氨基酸序列。此处描述的技术内容在PCT/US98/11893中也有描述，其在此处特别地全部引用作为参考。NtQPT1的氨基酸序列同GenBank数据库的比较显示，其与编码喹啉磷酸核糖基转移酶(QPTase)的细菌蛋白质具有有限的序列相似性(图3)。

喹啉磷酸核糖基转移酶为原核生物和真核生物中烟碱腺嘌呤二核苷酸(NAD)的从新生物合成所必需。在烟草中，在根中检测到高水平的QPTase，而在叶中没有。为确定NtQPT1编码的QPTase，本发明人使用大肠杆菌菌株(TH265)，一种缺少喹啉磷酸核糖基转移酶的突变体(nadC)。这种突变体不能在缺少烟酸的基本培养基上生长。然而，NtQPT1蛋白质在该菌株中的表达赋予了NadC+表型(图4)，证实NtQPT1编码QPTase。

测定了烟草中Nicl和Nic2突变体及烟草植物截梢在NtQPT1稳态mRNA水平和烟碱水平上的作用。(众所周知，在刚开花时截梢去除顶端优势会导致烟草中烟碱生物合成和转运水平的升高，并且是烟草生产中的标准操作。)如果NtQPT1确实参与了烟碱的生物合成，可以预期(1)nicl/nic2双突变体中的NtQPT1 mRNA水平将降低和(2)截梢后NtQPT1 mRNA水平将升高。已发现nicl/nic2双突变体中的NtQPT1 mRNA水平约为野生型的25％(图5)。另外，在截梢六小时内，烟草植物中NtQPT1 mRNA水平升高了约8倍。因此，NtQPT1被确定为烟碱生物合成途径中的关键调节基因。下一节描述转基因烟草植物细胞和转基因烟草植物的产生。

转基因植物细胞和植物

通过在宿主中有效的转录控制启动子下整合异源DNA，可调节植物细胞基因组中的基因表达，其中异源DNA的转录链与被调节的内源基因转录出的DNA链互补。引入的DNA，指的是作为反义DNA，其提供与自然生成的(内源)mRNA互补的RNA序列，并抑制内源mRNA的表达。尽管反义的机制不完全清楚，但已知反义构建体可用于调节基因表达。

在本发明的一些方法中，反义产物可与自然发生的靶RNA编码或非编码区(或二者)互补。该反义构建体可以任何适合的方式引入植物细胞，并可整合到植物基因组以诱导或组成性转录反义序列。

此处使用的外源或异源DNA(或RNA)指的是通过人为努力已引入细胞(或细胞祖先)的DNA(或RNA)。这种异源DNA可是被转化细胞中自然形成序列的拷贝，或其片段。为产生与未转化的或对照烟草植物或其片段相比QPTase水平下降、及烟碱和TSNA含量降低的烟草植物，可用外源QPT反义转录单位转化烟草细胞，其中包括部分QPT cDNA序列、全长QPT cDNA序列、部分QPT染色体序列，或全长QPT染色体序列，以反义方向与调节序列适当有效连接。适当的调节序列包括转化植物中有效的转录起始序列(“启动子”)，和多腺苷酸化/转录终止序列。然后用标准技术，例如限制性内切酶谱、Southern印迹杂交，和核酸序列分析鉴定克隆，其携带反义方向、与调节序列有效连接的QPTase序列。

然后从使用常规技术成功转化的细胞中再生烟草植物。最优选的是使用与内源序列互补的反义序列，然而，可容忍内源和外源序列中较小的变异。优选的是反义DNA序列有足够的序列相似性，以达到在下述严紧条件下能结合被调节细胞中内源序列的程度。

反义技术已在几个实验室中使用以产生转基因植物，其特征为特定酶低于正常含量。例如，已经通过在烟草和矮牵牛基因组中插入查耳酮合酶反义基因，产生查耳酮合酶水平降低的植物，查耳酮合酶是花色素生物合成途径中的一种酶。这些转基因烟草和矮牵牛植物产生比正常着色更浅的花(Van der Krol等人，″An Anti-Sense ChalconeSynthase Gene in Transgenic Plants Inhibits Flower Pigmentation″，Nature，333，pp.866-69(1988))。反义RNA技术还被成功应用于抑制番茄中多聚半乳糖醛酸酶的产生(Smith等人，″Antisense RNAInhibition of Polygalacturonase Gene Expression in TransgenicTomatoes″，Nature，334，pp.724-26(1988)；Sheehy等人，″Reductionof Polygalacturonase Activity in Tomato Fruit by Antisense RNA″，Proc.NM.Acad SU USA，85，pp.8805-09(1988))，和抑制烟草中二磷酸核酮糖羧化酶小亚基的产生(Rodermel等人，″Nuclear-OrganelleInteraction：Nuclear Antisense Gene Inhibits Ribulose BisphosphateCarboxylase Enzyme Levels in Transformed Tobacco Plants″，Cell，55，pp.673-81(1988))。

另外，可通过用有义(即，正常)方向的该酶的基因转化植物产生以给定酶高于正常含量为特征的转基因植物。本发明转基因烟草植物中的烟碱水平可用标准烟碱测定法检测。与未转化的对照植物相比QPTase水平降低的转化植物，与对照相比会相应的降低烟碱水平；与未转化的对照植物相比QPTase水平升高的转化植物，与对照相比会相应的升高烟碱水平。

可选择本发明反义方法中使用的异源序列，以产生与整个QPTasemRNA序列或其片段互补的RNA产物。该序列可与任何天然信使RNA的邻近序列互补，即，其可与邻近5′-末端或加帽位点、加帽位点下游、加帽位点和起始密码子之间并可涵盖全部或仅部分非编码区、跨越非编码和编码区的内源mRNA序列互补，可与全部或部分编码区互补，与编码区C-末端互补，或与mRNA 3′-非翻译区互补。适合的反义序列可为至少约13到约15个核苷酸、至少约16到约21个核苷酸、至少约20个核苷酸、至少约30个核苷酸、至少约50个核苷酸、至少约75个核苷酸、至少约100个核苷酸、至少约125个核苷酸、至少约150个核苷酸、至少约200个核苷酸，或更多。另外，该序列可在其3′或5′末端延长或缩短。

特定的反义序列和反义序列的长度将根据需要抑制的程度、反义序列的稳定性等改变。使用本领域可提供的技术和此处提供的信息，将引导本领域的技术人员选择适当的QPTase反义序列。参见此处的图2A和SEQ ID NO：1，本发明的寡核苷酸可是反义方向QPTasecDNA序列的连续片段，其具有在转化入受体植物细胞时足以达到期望效果的任何长度。

本发明还可用于烟碱产生的有义共抑制方法。当在植物细胞中表达时，进行本发明使用的有义DNA的长度，足以抑制该植物细胞中如此处所描述的植物QPTase蛋白质的自然表达。这种有义DNA可基本上是整个基因组或编码QPTase酶的互补DNA，或其片段，其中这种片段一般至少长为15个核苷酸。本领域的技术人员可使用确定导致细胞中天然基因表达抑制的有义DNA长度的方法。

在本发明另外的实施方案中，用含有编码酶促RNA分子(即“核酶”)DNA片段的DNA构建体转化烟草植物细胞，其中酶促RNA分子针对(即，切割)如此处所描述的编码植物QPTase DNA的mRNA转录本。核酶包括与靶mRNA易接近区结合的底物结合结构域，和催化RNA切割的结构域，阻止翻译和蛋白质产生。结合结构域可包括与靶mRNA序列互补的反义序列；催化基序可是锤头状基序或其他基序，例如发夹状基序。最初可通过扫描靶分子的核酶切割位点(例如，GUA、GUU或GUC序列)鉴定RNA靶标中的核酶切割位点。一旦鉴定对应于包含切割位点的靶基因区的15、20、30或更多核苷酸的短RNA序列，可评估其预计的结构特点。使用本领域公知的核糖核酸酶保护测定法，通过测试它们与互补寡核苷酸杂交的可及性可评估候选靶标的适合性。根据公知技术可产生编码酶促RNA分子的DNA序列。例如，参见，T.Cech等人，美国专利号4,987,071；Keene等人，美国专利号5,559,021；Donson等人，美国专利号5,589,367；Torrence等人，美国专利号5,583,032；Joyce，美国专利号5,580,967；Gold等人，美国专利号5,595,887；Wagner等人，美国专利号5,591,601；和美国专利号5,622,854(其内容此处全部引用作为参考)。

在植物细胞中这种酶促RNA分子的产生，以及QPTase蛋白质产生的破坏降低植物细胞中QPTase活性，与反义RNA分子产生的方式基本相同：即，通过破坏产生酶的细胞中的mRNA的翻译。此处使用的术语‘核酶’描述发挥酶作用(例如核糖核酸内切酶)的含RNA的核酸，并可与‘酶促RNA分子’交换使用。本发明还包括编码核酶的DNA、已插入表达载体的编码核酶的DNA、包含这种载体的宿主细胞和使用核酶降低植物中QPTase产生的方法。

进行本发明使用的核酸序列包括那些与SEQ ID NO：1具有序列相似性，并编码有喹啉磷酸核糖基转移酶活性的蛋白质的序列。该定义包括QPTase蛋白质中的自然等位基因变异。因此，与SEQ ID NO：1的DNA杂交并编码QPTase，尤其是植物QPTase酶表达的DNA序列，也可用于进行本发明。可存在多种形式的烟草QPT酶。一种酶的多种形式可归因于单基因产物的翻译后修饰，或NtQPT1基因的多种形式。

可用常规方法确定，允许编码有QPTase活性的蛋白质表达的其他DNA序列与SEQ ID NO：1的DNA或编码SEQ ID NO：2给出蛋白质的其他DNA序列杂交的条件。例如，可在此处原位杂交试验标准中的低严紧性条件或甚至严紧条件下(例如，0.3M NaCl、0.03M柠檬酸钠、0.1％SDS在60℃或甚至70℃的洗涤严紧性代表的条件)，进行这种序列与SEQ ID NO：2给出蛋白质的编码DNA杂交。参见J.Sambrook等人，Molecular Cloning，A Laboratory Manual(2d Ed.1989)(Cold Spring Harbor Laboratory)。一般而言，这样的序列至少65％相似、75％相似、80％相似、85％相似、90％相似，或甚至95％相似或更高的相似于此处SEQ ID NO：1给出的序列或编码SEQ IDNO：2的蛋白质的DNA序列。(用两条序列的最大匹配的比对确定序列相似性；在求极大匹配中允许两条配对序列中任一条的缺口。优选缺口长度为10或更小，更优选缺口长度为5或更小，还更优选缺口长度为2或更小。)

可用不同的杂交过程，其允许分离mRNA水平低至约0.05％poly(A)RNA的cDNA克隆。参见M.Conkling等人，Plant Physiol.93，1203-1211(1990)。简言之，用从植物组织(例如，根和/或叶)反转录mRNA的单链cDNA探针筛选cDNA文库。对于不同的筛选，硝酸纤维素或尼龙膜在5×SSC中浸湿并置于96孔抽吸复合管(suctionmanifold)中；从原平皿转移150μL静止过夜培养物到每一孔并通过真空直到所有的液体通过滤膜。近似地，用多道移液器在每一孔中放置150μL变性液(0.5M NaOH，1.5M NaCl)并让其停留约3分钟。如上使用抽吸，撤出滤膜，并在0.5M Tris-HCl(pH 8.0)，1.5M NaCl中中和。然后其在真空中烤2小时并与相关探针温育。通过使用尼龙滤膜并保持原平皿贮存在-70℃、7％DMSO中，滤膜可用多种探针筛选多次并在几年的贮存后发现适当的克隆。

如此处所使用，术语‘基因’指的是DNA序列，其组合(1)包括启动子的上游(5′)调节信号，(2)基因的产物、蛋白质或RNA的特异编码区，(3)包括转录终止和多腺苷酸化信号的下游区和(4)有效和特异表达需要的相关序列。本发明的DNA序列可基本上由此处提供的序列(SEQ ID NO：1)，或代表这些基因的等位基因或多态变异体的等效核苷酸序列，或其编码区组成。在本说明书和权利要求书中，短语“基本序列相似性”的使用意指，与此处公开和要求的实际序列相比具有轻微和不重要的(non-onsequential)序列变异的DNA、RNA或氨基酸序列被认为与本发明的序列等同。在这方面，“轻微和不重要的序列变异”意指将与本发明公开和要求的序列功能等同的“相似”序列(即，与此处公开和要求的DNA、RNA或蛋白质有基本序列相似性的序列)。功能等同序列将基本上以相同的方式发挥功能以基本上产生同此处公开和要求的核苷酸和氨基酸组合物相同的组合物。

此处提供的DNA序列可转化进多种宿主细胞。在本领域容易得到具有需要的生长和操作性质的许多适合的宿主细胞。在本说明书和权利要求书中作为DNA、RNA、多肽或蛋白质的修饰语使用的短语“分离”或“基本纯”意指已通过人类的努力从它们的体内细胞环境中分离出所指的DNA、RNA、多肽或蛋白质。

如此处所使用，“天然DNA序列”或“自然DNA序列”意指可从非转基因细胞或组织中分离的DNA序列。天然DNA序列是那些未被人工改变的序列，例如通过定向诱变。一旦天然DNA序列被鉴定，可利用化学合成或如本领域公知的重组DNA操作产生有天然DNA序列的DNA分子。如此处所使用，天然植物DNA序列是可从非转基因植物细胞或组织分离的序列。此处的天然烟草DNA序列是可从非转基因烟草细胞或组织中分离的序列。

本发明的DNA构建体，或“转录盒”，5′到3′的转录方向，包括，如此处所述的启动子、如此处所论述的与启动子有效结合的DNA序列和任选的包括RNA聚合酶停止信号和多腺苷酸化信号的终止序列。所有这些调节区应能在转化组织细胞中有效的。任何适合的终止信号都可在进行本发明中使用，其实例包括，但不限于，胭脂碱合酶(nos)终止子、章鱼碱(octapine)合酶(ocs)终止子、CaMV终止子或天然终止信号，其衍生自转录起始区的同一基因或衍生自不同基因。参见，例如，Rezian等人(1988)，见上文，和Rodermel等人(1988)，见上文。

如此处所使用的术语“有效连接”，指的是单个DNA分子上的DNA序列，其被连接以便一个序列被另一个影响。因此，当启动子能影响DNA的转录时(即，DNA在启动子的转录控制之下)，其与该DNA的连接是有效的。启动子被称为转录DNA序列的“上游”，反过来转录DNA序列被称为启动子的“下游”。

转录盒可在至少有一个复制系统的DNA构建体中提供。为了方便，其通常有在大肠杆菌中有效的复制系统，例如ColE1、pSC101、pACYC184等。因此在每次操作后的每一步，可克隆、测序获得的构建体，并确定操作的正确性。另外，或替换大肠杆菌复制系统，可使用宽范围的宿主复制系统，例如P-1不相容质粒复制系统，例如，pRK290。除复制系统外，经常应当有至少一个标记存在，其可在一种或多种宿主中使用，或单独的宿主不同的标记。即，一个标记可用于原核宿主中的筛选，而另一个标记可用于真核宿主中的筛选，尤其是植物细胞。标记可以抗杀生物剂(例如抗生素、毒素、重金属等)，可通过向营养缺陷型宿主传递原养型提供互补作用和/或通过在植物中产生新化合物提供可见的表型。

通过限制性内切酶切割适当的复制系统及特定构建体或片段插入有效位点，可连续地引入多种片段，包括构建体、转录盒、标记等。在连接和克隆后，可为进一步操作分离DNA构建体。所有这些技术在文献中被广泛地举例说明，如J.Sambrook等人，Molecular Cloning，A Laboratory Manual(2d Ed.1989)(Cold Spring HarborLaboratory)。

可与本发明的核苷酸构建体一起用于转化植物组织的载体包括农杆菌(Agrobacterium)载体和冲击(ballistic)载体，及适合DNA介导转化的载体。术语‘启动子’指的是组合了编码序列有效表达必需信号的DNA序列区。这可包括RNA聚合酶结合序列，但不限于这样的序列，并可包括其他调节蛋白质结合的区域及蛋白质翻译控制涉及的区域。它们还可包括编码序列。

进行本发明使用的启动子可是组成型活动启动子。可使用很多植物中有效的组成型活动启动子。优选的实例是花椰菜花叶病毒(CaMV)35S启动子，其在大多数植物组织中组成性的表达。另外，启动子可是根特异的启动子或根皮层特异的启动子，如以下详细解释的那样。

已经利用花椰菜花叶病毒(CaMV)35S启动子在转基因烟草植物中表达反义序列。参见，例如，Cornelissen等人，″Both RNA Level andTranslation Efficiency are Reduced by Anti-Sense RNA in TransgenicTobacco″，Nucleic Acids Res.17，pp.833-43(1989)；Rezaian等人，″Anti-Sense RNAs of Cucumber Mosaic Virus in Transgenic PlantsAssessed for Control of the Virus″，Plant Molecular Biology 11，pp.463-71(1988)；Rodermel等人，″Nuclear-Organelle Interactions：Nuclear Antisense Gene Inhibits Ribulose Bisphosphate CarboxylaseEnzyme Levels in Transformed Tobacco Plants″，Cell 55，pp.673-81(1988)；Smith等人，″Antisense RNA Inhibition of PolygalacturonaseGene Expression in Transgenic Tomatoes″，Nature 334，pp.724-26(1988)；Van der Krol等人，″An Anti-Sense Chalcone Synthase Gene inTransgenic Plants Inhibits Flower Pigmentation″，Nature 333，pp.866-69(1988)。

在本发明的转化烟草细胞和植物中，优选使用CaMV 35S启动子表达QPTase。在烟草根中使用CaMV启动子表达其他重组基因已有详细描述(Lam等人，″Site-Specific Mutations Alter In Vitro FactorBinding and Change Promoter Expression Pattern in TransgenicPlants″，Proc.Nat.Acad Sci.USA 86，pp.7890-94(1989)；Poulsen等人，″Dissection of 5′Upstream Sequences for Selective Expression ofthe Nicotiana plumbaginifolia rbcS-8B Gene″，Mol.Gen.Genet.214，pp.16-23(1988))。

其他仅在根组织中有效的启动子(根特异性启动子)也特别适合本发明的方法。参见，例如，Conkling等人的美国专利5,459,252；Yamamoto等人，The Plant Cell，3：371(1991)。还可使用TobRD2根皮层特异启动子。参见，例如，目前已同意授权Conkling等人的美国专利申请SN 08/508,786；PCT WO 9705261。此处引用的所有专利全部作为参考。

用于产生本发明转化烟草细胞和植物的QPTase重组DNA分子和载体还可包括显性选择标记基因。适合在烟草中使用的显性选择标记包括，特别编码新霉素磷酸转移酶(NPTII)和潮霉素磷酸转移酶(HPT)的抗生素抗性基因。其他众所周知的适合在烟草中使用的选择标记包括，编码氨甲喋呤抗性二氢叶酸还原酶的二氢叶酸还原酶基因突变体。商业上可提供携带适当抗生素抗性基因的DNA载体和相应的抗生素。

通过将混合细胞群置于含适当浓度抗生素(或其他一般对烟草细胞有毒的化合物)的培养基中，从未转化的周围细胞群中选出转化烟草细胞，其中选用的显性选择标记基因产物赋予针对抗生素的抗性。因此，只有那些转化烟草细胞会存活和增殖。另外，可使用Jefferson描述的阳性选择技术(例如，WO 00055333；WO 09913085；美国专利5599670；5432081；和5268463，此处特别地全部引用作为参考)。

制备本发明重组植物的方法，一般而言，包括先提供能再生的植物细胞(该植物细胞一般位于能再生的组织中)。然后用包含本发明转录盒的DNA构建体转化植物细胞(如此处所描述)，并从转化植物细胞中再生重组植物。如下所述，用本领域公知的技术进行转化步骤，包括但不限于，用携带转录盒的微粒冲击植物细胞，用包含携带转录盒的Ti质粒的根癌农杆菌感染细胞，或适合产生转基因植物的任何其他技术。

许多可用于进行本发明的农杆菌载体系统是公知的。例如，美国专利4,459,355公开了转化易感植物的方法，包括用含Ti质粒的农杆菌株dicots。美国专利4,795,855中公开了用农杆菌载体转化木本植物。另外，Schilperoot等人的美国专利4,940,838公开了可用于进行本发明的二元农杆菌载体(即，其中一个农杆菌包含一个有Ti质粒vir区但无T区的质粒，第二个质粒有T区但无vir区)。

携带本发明DNA构建体、适合植物细胞冲击转化的微粒还用于制备此处描述的转化植物。微粒被推进到植物细胞以产生转化植物细胞，并从转化植物细胞中再生植物。任何适合的冲击细胞转化方法学和仪器可用于实施本发明。典型仪器和方法公开在Sanford和Wolf的美国专利4,945,050和Christou等人的美国专利5,015,580中。当使用冲击转化方法时，转录盒可与能在转化细胞中复制或与转化细胞整合的质粒结合。适合这种系统使用的微粒的实例包括1到5μm的金粒。可通过任何适当的技术(例如沉淀)在微粒上沉积DNA构建体。

可通过DNA介导的植物细胞原生质体的转化，用本发明的DNA构建体转化植物品种。然后可根据本领域众所周知的方法从转化原生质体中再生植物。烟草原生质体通过电穿孔与包含DNA的脂质体或DNA构建体的融合在本领域是公知的。(Shillito等人，″Direct GeneTransfer to Protoplasts of Dicotyledonous and MonocotyledonousPlants by a Number of Methods，Including Electroporation″，Methodsin Enzymology 153，pp.313-36(1987))。

如此处所使用，转化指的是导入外源DNA到细胞中以产生外源DNA稳定转化的转基因细胞。通过应用本领域众所周知的烟草细胞和组织培养技术，诱导转化细胞再生完整烟草植物。选择植物再生的方法以与转化方法一致。如应用于控制杂交(controlled crosses)产生后代的标准DNA分析方法所显示，可通过QPTase序列的孟德尔(Mendelian)遗传验证QPTase序列在转基因烟草植物中的稳定存在和定向。从转化细胞再生转基因烟草植物后，不用过多的实验，通过常规植物育种技术可容易地将导入DNA序列转移到其他烟草品种中。

例如，为分析转基因的分离，再生转化植物(RO)可生长到成熟期，检测烟碱和/或TSNA水平，并自交产生R₁植物。部分携带转基因的R₁植物是转基因纯合子。为鉴定纯合R₁植物，转基因R₁植物生长到成熟期并自交。纯合R₁植物将产生每一个后代植物都携带转基因的R₂后代；杂合R₁后代，植物将分离成3∶1。

通过器官发生或胚胎发生，能后续无性繁殖的任何植物组织，可用本发明的载体转化。术语“器官发生”，如此处所使用，意指从分生组织中心依序地发育茎干(shoot)和根的过程；术语“胚胎发生”，如此处所使用，意指从体细胞或配子，以协同方式一起(非依序地)发育茎干和根的过程。将根据可用的，和最适合转化特定品种的无性繁殖系统选择特定组织。典型靶组织包括叶片、花粉、胚胎、子叶、下胚轴、愈伤组织、现存的分生组织(例如，顶端分生组织、腋芽，和根分生组织)和诱导的分生组织(例如，子叶分生组织和下胚轴分生组织)。

本发明的植物可有多种形式。植物可是转化细胞和非转化细胞的嵌合体；植物可是纯系细胞转化体(例如，所有的转化细胞都包含转录盒)；植物可包括转化和非转化组织的嫁接物；(例如，在柑桔品种未转化接穗中嫁接转化根状茎)。转化植物可通过多种方法繁殖，例如克隆繁殖或传统育种技术。例如，第一代(或T₁)转化植物可自交产生纯合第二代(或T₂)转化植物，T₂植物继续通过传统育种技术繁殖。显性选择标记(例如nptII)可与转录盒结合以辅助育种。

如此处所使用，一批(a crop)包括本发明同一种属的多种植物，在农田中放置在一起。“农田”的含意是普通小块土壤或温室。因此，本发明提供产生一批植物的方法，其与类似的一批同种类非转化植物相比，其QPTase活性降低并因此降低烟碱和/或TSNA水平。接着的实施例用于说明本发明，并不得解释为限制本发明。

实施例1

分离和测序

TobRD2 cDNA(Conkling等人，Plant Phys.93，1203(1990))被测序并在此处作为SEQ ID NO：1提供，推论的氨基酸序列作为SEQID NO：2。预测推论的氨基酸序列是胞质蛋白质。尽管植物QPTase基因还未被报道，但NtPT1氨基酸序列与GenBank数据库相比(图3)，显示了与某些细菌和其他蛋白质有限的序列相似性；已证明了鼠伤寒沙门氏菌、大肠杆菌和烟草基因的喹啉磷酸核糖基转移酶(QPTase)活性。NtQPT1编码的QPTase，与可能代表部分Arabidopsis基因的Arabidopsis EST(表达序列标签)序列(GenBank登录号F20096)编码的推论肽段有相似性。

实施例2

原位杂交

在未转化植物中进行原位杂交，以确定TobRD2 mRNA转录本在根的不同组织中的空间分布。使用如Meyerowitz，Plant Mol.Biol.Rep.5：242(1987)和Smith等人，Plant Mol.Biol.Rep.5：237(1987)中所描述的技术，在根组织中进行TobRD2反义链与TobRD2 mRNA的原位杂交。七日龄的烟草(Nicotania tabacum L.)幼苗根在磷酸盐缓冲戊二醛中固定，在Paraplast Plus(Monoject Inc，St.Louis，MO)中包埋并以8微米厚度切割以获得横向及纵向的切片。³⁵S-ATP存在下体外合成的反义TobRD2转录本，用作探针。使用前用碱处理标记RNA以产生平均长度100到200碱基的物质。

杂交在50％甲酰胺中于42℃进行16小时，其中每毫升杂交液约5×10⁶每分钟计数(cpm)标记RNA。曝光后，在明暗视野显微镜下观察形成的载玻片。

杂交信号集中在根细胞皮层。比较同一切片明暗两种视野图象，TobRD2转录本集中在根皮层薄壁组织细胞。表皮和中柱中无可见杂交信号。

实施例3

Nicl和Nic2烟草突变体中TobRD2 mRNA水平和与烟碱水平的相关性

检测了Nicl和Nic2突变烟草植株中TobRD2稳态mRNA水平。已知Nicl和Nic2调节喹啉磷酸核糖基转移酶(QPTase)活性和putrescence甲基转移酶活性，并是烟碱生成的共显性调节基因。此结果如图5A和5B中所示，并显示TobRD2的表达被Nicl和Nic2调节。

从野生型Burley 21烟草植物(Nicl/Nicl Nic2/Nic2)根中、Nicl-Burley 21(nicl/nicl Nic2/Nic2)根中、Nic2-Burley 21(Nicl/Niclnic2/nic2)根中和Nicl-/Nic2-Burley 21(nicl/nicl nic2/nic2)根中分离RNA。

四个Burley 21烟草品系在土壤中从种子生长一个月并转移到温室通气的营养溶液的水培室中一个月。除两个低烟碱基因座外，这些品系是等基因的，并具有基因型Nicl/Nicl Nic2/Nic2；nicl/niclNic2/Nic2；Nicl/Nicl nic2/nic2；nicl/nicl nic2/nic2。从每个基因型约20个植株中收获根并混合用于RNA分离。根据Sambrook等人(1989)，来自每一基因型的总RNA(1μg)通过含1.1M甲醛的1％琼脂糖凝胶电泳并转移到尼龙膜。用IP标记的TobRD2 cDNA片段杂交该膜。用光密度法检测TobRD2转录本的相对强度。图5(实体柱)显示四种基因型中每一个的相对转录水平(与Nicl/Nicl Nic2/Nic2相比)。通过阴影柱显示四种基因型的相对烟碱含量(与Nicl/Nicl Nic2/Nic2相比)。

使用野生型Burley 21(Nicl/Nicl Nic2/Nic2)中发现的水平作为参照量，图5图解比较了稳态TobRD2 mRNA的相对水平。nicl/niclnic2/nic2双突变体中TobRD2 mRNA的水平约为野生型烟草的25％。图5B进一步比较了本实施例研究的近等因品系中烟碱的相对水平(实体柱代表TobRD2转录水平；阴影柱代表烟碱水平)。烟碱水平和TobRD2转录本水平之间紧密相关。

实施例4

SEQ ID NO：1 DNA对缺失QPTase细菌突变体的互补作用

大肠杆菌菌株TH265是缺失喹啉磷酸核糖基转移酶(nadC-)的突变体，并因此不能在缺少烟酸的培养基上生长。用含SEQ ID NO：1 DNA的表达载体(pWS161)转化TH265细胞，或仅用表达载体(pKK233)转化。转化细菌的生长与TH265(pKK233)转化子的生长，以及未转化TH265 nadC-突变体的生长对比。在ME基本培养基(缺少烟酸)和添加烟酸的ME基本培养基上比较生长。

QPTase突变(nadC)大肠杆菌菌株TH265由K.T.Hughes博士惠供(Hughes等人，J Bact.175：479(1993))。如Sambrook等人(1989)中所描述，细胞在LB培养基中培养并制备感受态细胞。表达质粒在pKK2233中构建(Brosius，1984)，其中TobRD2 cDNA克隆在Tac启动子控制之下。获得的质粒pWS161转化到TH265细胞中。然后转化细胞铺板在含或不含补充烟酸(0.0002％)的基本培养基(Vogel和Bonner，1956)琼脂平板上。单独的TH265细胞和用pKK2233转化的TH265铺板在类似的平板上用作对照。

结果显示在图4中。只有用SEQ ID NO：1的DNA转化的TH265在缺少烟酸的培养基上生长。这些结果显示SEQ ID NO：1的DNA在TH265细菌细胞中的表达赋予这些细胞NadC+表型，验证了该序列编码QPTase。因此TobRD2的命名变为NtQPT1。

实施例5

烟草植物的转化

将SEQ ID NO：1的DNA，以反义方向，与植物启动子(CaMV35S或TobRD2根皮层特异启动子)有效连接以产生两种不同的DNA盒：CaMV 35S启动子/反义SEQ ID NO：1和TobRD2启动子/反义SEQ ID NO：1。

选择转化一个野生型烟草品系和一个低烟碱烟草品系，例如，野生型Burley 21烟草(Nic1+/Nic2+)和纯合Nic1-/Nic2-Burley 21。用每一种DNA盒转化来自每一品系的大量烟草植物细胞。用农杆菌载体实施转化，例如，携带Ti边界序列和nptII基因的农杆菌二元载体(赋予卡那霉素抗性并在nos启动子(nptII)的控制下)。

选择转化细胞再生成称为R₀的转基因烟草植物。R₀植物生长到成熟期并检测烟碱水平；与未转化对照植物相比，转化烟草植物亚群显示显著降低的烟碱水平。

然后R₀植物自交并在下一代中(即R₁后代)分析转基因的分离。R₁后代生长到成熟期并自交；R₂后代中转基因的分离表明哪一个R₁植物是转基因的纯合子。

实施例6

烟碱水平降低的烟草

用二元农杆菌载体pYTY32转化烟草品种Burley 21 LA以产生低烟碱烟草品种，载体21-41。二元载体pYTY 32携带2.0kb NtQPT1根皮层特异启动子，其驱动NtQPT1 cDNA和源自根癌农杆菌T-DNA的胭脂碱合酶(nos)3’终止序列的反义表达。该构建体的选择标记是源自大肠杆菌Tn5的新霉素磷酸转移酶(nptII)，其赋予卡那霉素抗性；通过源自根癌农杆菌T-DNA的nos启动子指导nptII的表达。通过在含300μg/ml卡那霉素的Murashige-Skoog(MS)培养基上的生长能力，选择转化细胞、组织，和幼苗。与Burley 21相比，Burley 21 LA是烟碱水平基本上降低的Burley 21品种(即，Burley 21 LA的烟碱水平是Burley 21的8％，参见Legg等人，Can J Genet Cytol，13：287-91(1971)；Legg等人，J Hered，60：213-17(1969))。

使一百个独立的Burley 21 LA的pYTY32转化子(T₀)自交。在含卡那霉素的培养基上发育自交植物的后代(T₁)并计数卡那霉素抗性的分离。进一步分析由单基因座转化产生的3∶1分离的T₁后代。

用微量测定技术定性检测3∶1分离的T₁后代的烟碱水平。收集约200mg新鲜烟叶并在1ml提取液中研磨(提取液：1ml醋酸于100ml水中)。14,000×g离心匀浆5分钟并将上清转移至一干净试管中，并在其中加入下述试剂：100μL NH₄OAC(5g/100ml H₂O+50μL Brij35)；500μL溴化氰(Sigma C-6388，0.5g/100ml H₂O+50μL Brij 35)；400μL苯胺(0.3ml缓冲的苯胺在100ml NH₄OAC+50μL Brij 35中)。制备在提取液中的10mg/ml的烟碱标准贮存液并稀释以产生用于校正的标准系列。读取460nm的吸收，并用标准校正曲线确定检测样品的烟碱含量。

使烟碱水平低于Burley 21 LA亲本10％的T₁后代自交产生T₂后代。通过在含卡那霉素的培养基上发育种子并选择100％的后代都是卡那霉素抗性的克隆(即，4∶0分离；杂合后代会3∶1分离)鉴定纯合T₂后代。用微量测定法定性确定纯合和杂合T₂后代的烟碱水平，并再次显示水平低于Burley 21 LA亲本的10％。纯合T₂后代的叶子样品被送到Wilson，NC的Southern Research and Testing实验室，用GasChromatography/Flame Ionization Detection(GC/FID)定量分析烟碱水平。转化子#41的纯合T₂后代显示最低的烟碱水平(～70ppm)，该转化子被命名为“载体21-41”。

使载体21-41植物自杂交，产生T₃后代。栽培T₃后代并定性和定量分析烟碱水平。使T₃后代自杂交，产生T₄后代。栽培T₄后代的大量种子样本并检测烟碱水平。

一般而言，除生物碱含量和总还原糖外(例如，烟碱和去甲烟碱)，在评价的所有性质中载体21-41与Burley 21 LA相似。通过其显著降低的烟碱、去甲烟碱和总生物碱含量，可从Burley 21 LA亲本区别载体21-41。如下所示，大致相对于Burley 21 LA亲本中的水平，载体21-41中的总生物碱浓度显著降低，并且当与Burley 21 LA对比时，载体21-41中的烟碱和去甲烟碱浓度显示显著降低。当与Burley 21 LA对比时，载体21-41还有显著高水平的还原糖。

在Central Crops Research Station(Clayton，NC)进行载体21-41T₄后代的田间试验，并与Burley 21 LA亲本比较。设计是三种处理(载体21-41、仅携带NtQPT1启动子的Burley 21 LA转化品系[启动子对照]，和未转化的Burley 21 LA[野生型])，15个重复，每个重复10个植株。检测和对比下列农学性状；从移植到开花的天数；开花时的高度；开花时的叶数；产量；烟碱百分比；去甲烟碱百分比；总氮百分比；和还原糖百分比。

实施例7

低烟碱和亚硝胺混合烟草

下述实施例描述了几种通过混合产生特异烟碱和/或TSNA含量烟草产品的方法。一些混合方法从极低含量烟碱和/或TSNA品种制备的烟草开始。通过源自低烟碱/TSNA品种(例如不可检出水平的烟碱和/或TSNAs)的制备烟草与常规烟草混合(例如，Burley，其含有百万分之30,000(ppm)的烟碱和十亿分之8,000(ppb)的TSNA；Flue-Cured，其含有20,000ppm烟碱和300ppb TSNA；和Oriental，其含有10,000ppm烟碱和100ppb TSNA)，可制造基本上具有任何需要量的烟碱和/或TSNA的烟草产品。烟碱和/或TSNAs含量不同的烟草产品可组成烟草使用停止试剂盒和程序，以帮助烟草使用者降低或消除他们对烟碱的依赖和降低致癌潜能。

例如，步骤1的烟草产品可由约25％低烟碱/TSNA烟草和75％常规烟草组成；步骤2的烟草产品可由约50％低烟碱/TSNA烟草和50％常规烟草组成；步骤3的烟草产品可由约75％低烟碱/TSNA烟草和25％常规烟草组成；步骤4的烟草产品可由约100％低烟碱/TSNA烟草和0％常规烟草组成。烟草使用停止试剂盒可包括源自上述每一种混合物的大量烟草产品以满足消费者的单月程序。即，如果消费者是一天一包的吸烟者，例如，单月试剂盒每个步骤会提供7包，共28包香烟。每个烟草使用停止试剂盒将包括一套说明书，其特异地指导消费者一步一步地通过程序。当然，烟碱和/或TSNAs特异含量的烟草产品，将以方便制造的量提供(例如，成盒的雪茄、成包的香烟、成听的鼻烟，和成袋(pouch)或成搓(twist)的嚼烟)以便消费者能选择他们个别需要的烟碱和/或TSNAs的量。使用此处描述的教导有多种方法获得多种低烟碱/低TSNA的烟草混合物，下面仅意在指导本领域的技术人员一种可能的方法。

为获得步骤1的烟草产品，其是25％低烟碱/TSNA混合物，源自约0ppm烟碱/TSNA烟草的制备烟草可与常规Burley、Flue-Cured，或Oriental分别以25％/75％的比例混合，以获得含22,500ppm烟碱和6,000ppb TSNA的Burly烟草产品、含15,000ppm烟碱和225ppbTSNA的Flue-Cured产品，和含7,500ppm烟碱和75ppb TSNA的Oriental产品。类似地，为获得步骤2的产品，其是50％低烟碱/TSNA混合物，源自约0ppm烟碱/TSNA烟草的制备烟草，可与常规Burley、Flue-Cured，或Oriental分别以50％/50％的比例混合，以获得含15,000ppm烟碱和4,000ppb TSNA的Burly烟草产品、含10,000ppm烟碱和150ppb TSNA的Flue-Cured产品，和含5,000ppm烟碱和50ppbTSNA的Oriental产品。另外，步骤3的产品，其是75％/25％低烟碱/TSNA混合物，源自约0ppm烟碱/TSNA烟草的制备烟草，可与常规Burley、Flue-Cured，或Oriental分别以75％/25％的比例混合，以获得含7,500ppm烟碱和2,000ppb TSNA的Burly烟草产品、含5,000ppm烟碱和75ppb TSNA的Flue-Cured产品，和含2,500ppm烟碱和25ppb TSNA的Oriental产品。

应当理解，烟草产品经常是多种不同类型烟草的混合物，起在世界许多不同的地方和多种生长条件下生长。因此，批与批之间的烟碱和TSNA的含量会不同。尽管如此，通过使用常规技术，技术人员容易确定用于产生所需混合物的每一批的烟碱和TSNA的平均含量。通过调整组成混合物的每种类型烟草的量，技术人员可平衡烟碱和/或TSNA含量与其他因素，例如外观和香味，及吸烟性能。由此可产生多种烟碱和/或亚硝胺水平及多种外观和香味和吸烟性能的多种类型的烟草产品。

尽管参考实施方案和实施例描述本发明，但应当理解，可进行多种改变而不偏离本发明的精神。因此，本发明仅被下面的权利要求书限制。此处引用的所有参考文献因此特别地引用作为参考。

序列表

(1)一般信息：

(i) 申请人：Conkling，Mark A.

(ii) 发明名称：修饰烟草中烟碱和亚硝胺的水平

(iii) 序列数：4

(iv) 联系地址：

(A)地址：Eric Furman，Knobbe，Martens，Olson & Bear

(B)街道：620 NewportCenterDrive，16th Floor

(C)城市：Newport Beach

(D)州：California

(E)国家：美国

(F)ZIP：92660

(v) 计算机可读形式：无

(viii) 律师/代理人信息

(A)名称：Furman，Eric S.

(B)注册号：45664

(C)索引/备忘(DOCKET)号：VTOB.033PR

(ix)电信信息：

(A)电话：(619)687-8673

(B)传真：(619)235-0176

(2)SEQ ID NO：1的信息：

(i)序列特征：

(A)长度：1399碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑学：线性

(ii)分子类型：cDNA

(ix)特征：

(A)名称/key：CDS

(B)位置：52...1104

(xi)序列描述：SEQ ID NO：1

CAAAAACTAT TTTCCACAAA ATTCATTTCA CAACCCCCCC AAAAAAAAAC C ATG TTT 57

Met Phe

1

AGA GCT ATT CCT TTC ACT GCT ACA GTG CAT CCT TAT GCA ATT ACA GCT 105

Arg Ala Ile Pro Phe Thr Ala Thr Val His Pro Tyr Ala Ile Thr Ala

5 10 15

CCA AGG TTG GTG GTG AAA ATG TCA GCA ATA GCC ACC AAG AAT ACA AGA 153

Pro Arg Leu Val Val Lys Met Ser Ala Ile Ala Thr Lys Asn Thr Arg

20 25 30

GTG GAG TCA TTA GAG GTG AAA CCA CCA GCA CAC CCA ACT TAT GAT TTA 201

Val Glu Ser Leu Glu Val Lys Pro Pro Ala His Pro Thr Tyr Asp Leu

35 40 45 50

AAG GAA GTT ATG AAA CTT GCA CTC TCT GAA GAT GCT GGG AAT TTA GGA 249

Lys Glu Val Met Lys Leu Ala Leu Ser Glu Asp Ala Gly Asn Leu Gly

55 60 65

GAT GTG ACT TGT AAG GCG ACA ATT CCT CTT GAT ATG GAA TCC GAT GCT 297

Asp Val Thr Cys Lys Ala Thr Ile Pro Leu Asp Met Glu Ser Asp Ala

70 75 80

CAT TTT CTA GCA AAG GAA GAC GGG ATC ATA GCA GGA ATT GCA CTT GCT 345

His Phe Leu Ala Lys Glu Asp Gly Ile Ile Ala Gly Ile Ala Leu Ala

85 90 95

GAG ATG ATA TTC GCG GAA GTT GAT CCT TCA TTA AAG GTG GAG TGG TAT 393

Glu Met Ile Phe Ala Glu Val Asp Pro Ser Leu Lys Val Glu Trp Tyr

100 105 110

GTA AAT GAT GGC GAT AAA GTT CAT AAA GGC TTG AAA TTT GGC AAA GTA 441

Val Asn Asp Gly Asp Lys Val His Lys Gly Leu Lys Phe Gly Lys Val

115 120 125 130

CAA GGA AAC GCT TAC AAC ATT GTT ATA GCT GAG AGG GTT GTT CTC AAT 489

Gln Gly Asn Ala Tyr Asn Ile Val Ile Ala Glu Arg Val Val Leu Asn

135 140 145

TTT ATG CAA AGA ATG AGT GGA ATA GCT ACA CTA ACT AAG GAA ATG GCA 537

Phe Met Gln Arg Met Ser Gly Ile Ala Thr Leu Thr Lys Glu Met Ala

150 155 160

GAT GCT GCA CAC CCT GCT TAC ATC TTG GAG ACT AGG AAA ACT GCT CCT 585

Asp Ala Ala His Pro Ala Tyr Ile Leu Glu Thr Arg Lys Thr Ala Pro

165 170 175

GGA TTA CGT TTG GTG GAT AAA TGG GCG GTA TTG ATC GGT GGG GGG AAG 633

Gly Leu Arg Leu Val Asp Lys Trp Ala Val Leu Ile Gly Gly Gly Lys

180 185 190

AAT CAC AGA ATG GGC TTA TTT GAT ATG GTA ATG ATA AAA GAC AAT CAC 681

Asn His Arg Met Gly Leu Phe Asp Met Val Met Ile Lys Asp Asn His

195 200 205 210

ATA TCT GCT GCT GGA GGT GTC GGC AAA GCT CTA AAA TCT GTG GAT CAG 729

Ile Ser Ala Ala Gly Gly Val Gly Lys Ala Leu Lys Ser Val Asp Gln

215 220 225

TAT TTG GAG CAA AAT AAA CTT CAA ATA GGG GTT GAG GTT GAA ACC AGG 777

Tyr Leu Glu Gln Asn Lys Leu Gln Ile Gly Val Glu Val Glu Thr Arg

230 235 240

ACA ATT GAA GAA GTA CGT GAG GTT CTA GAC TAT GCA TCT CAA ACA AAG 825

Thr Ile Glu Glu Val Arg Glu Val Leu Asp Tyr Ala Ser Gln Thr Lys

245 250 255

ACT TCG TTG ACT AGG ATA ATG CTG GAC AAT ATG GTT GTT CCA TTA TCT 873

Thr Ser Leu Thr Arg Ile Met Leu Asp Asn Met Val Val Pro Leu Ser

260 265 270

AAC GGA GAT ATT GAT GTA TCC ATG CTT AAG GAG GCT GTA GAA TTG ATC 921

Asn Gly Asp Ile Asp Val Ser Met Leu Lys Glu Ala Val Glu Leu Ile

275 280 285 290

AAT GGG AGG TTT GAT ACG GAG GCT TCA GGA AAT GTT ACC CTT GAA ACA 969

Asn Gly Arg Phe Asp Thr Glu Ala Ser Gly Asn Val Thr Leu Glu Thr

295 300 305

GTA CAC AAG ATT GGA CAA ACT GGT GTT ACC TAC ATT TCT AGT GGT GCC 1017

Val His Lys Ile Gly Gln Thr Gly Val Thr Tyr Ile Ser Ser Gly Ala

310 315 320

CTG ACG CAT TCC GTG AAA GCA CTT GAC ATT TCC CTG AAG ATC GAT ACA 1065

Leu Thr His Ser Val Lys Ala Leu Asp Ile Ser Leu Lys Ile Asp Thr

325 330 335

GAG CTC GCC CTT GAA GTT GGA AGG CGT ACA AAA CGA GCA TGAGCGCCAT 1114

Glu Leu Ala Leu Glu Val Gly Arg Arg Thr Lys Arg Ala

340 345 350

TACTTCTGCT ATAGGGTTGG AGTAAAAGCA GCTGAATAGC TGAAAGGTGC AAATAAGAAT 1174

CATTTTACTA GTTGTCAAAC AAAAGATCCT TCACTGTGTA ATCAAACAAA AAGATGTAAA 1234

TTGCTGGAAT ATCTCAGATG GCTCTTTTCC AACCTTATTG CTTGAGTTGG TAATTTCATT 1294

ATAGCTTTGT TTTCATGTTT CATGGAATTT GTTACAATGA AAATACTTGA TTTATAAGTT 1354

TGGTGTATGT AAAATTCTGT GTTACTTCAA ATATTTTGAG ATGTT 1399

(2)SEQ ID NO：2的信息：

(i)序列特征：

(A)长度：351氨基酸

(B)类型：氨基酸

(C)

(D)拓扑学：线性

(ii)分子类型：蛋白质

(xi)序列描述：SEQ ID NO：2

Met Phe Arg Ala Ile Pro Phe Thr Ala Thr Val His Pro Tyr Ala Ile

1 5 10 15

Thr Ala Pro Arg Leu Val Val Lys Met Ser Ala Ile Ala Thr Lys Asn

20 25 30

Thr Arg Val Glu Ser Leu Glu Val Lys Pro Pro Ala His Pro Thr Tyr

35 40 45

Asp Leu Lys Glu Val Met Lys Leu Ala Leu Ser Glu Asp Ala Gly Asn

50 55 60

Leu Gly Asp Val Thr Cys Lys Ala Thr Ile Pro Leu Asp Met Glu Ser

65 70 75 80

Asp Ala His Phe Leu Ala Lys Glu Asp Gly Ile Ile Ala Gly Ile Ala

85 90 95

Leu Ala Glu Met Ile Phe Ala Glu Val Asp Pro Ser Leu Lys Val Glu

100 105 110

Trp Tyr Val Asn Asp Gly Asp Lys Val His Lys Gly Leu Lys Phe Gly

115 120 125

Lys Val Gln Gly Asn Ala Tyr Asn Ile Val Ile Ala Glu Arg Val Val

130 135 140

Leu Asn Phe Met Gln Arg Met Ser Gly Ile Ala Thr Leu Thr Lys Glu

145 150 155 160

Met Ala Asp Ala Ala His Pro Ala Tyr Ile Leu Glu Thr Arg Lys Thr

165 170 175

Ala Pro Gly Leu Arg Leu Val Asp Lys Trp Ala Val Leu Ile Gly Gly

180 185 190

Gly Lys Asn His Arg Met Gly Leu Phe Asp Met Val Met Ile Lys Asp

195 200 205

Asn His Ile Ser Ala Ala Gly Gly Val Gly Lys Ala Leu Lys Ser Val

210 215 220

Asp Gln Tyr Leu Glu Gln Asn Lys Leu Gln Ile Gly Val Glu Val Glu

225 230 235 240

Thr Arg Thr Ile Glu Glu Val Arg Glu Val Leu Asp Tyr Ala Ser Gln

245 250 255

Thr Lys Thr Ser Leu Thr Arg Ile Met Leu Asp Asn Met Val Val Pro

260 265 270

Leu Ser Asn Gly Asp Ile Asp Val Ser Met Leu Lys Glu Ala Val Glu

275 280 285

Leu Ile Asn Gly Arg Phe Asp Thr Glu Ala Ser Gly Asn Val Thr Leu

290 295 300

Glu Thr Val His Lys Ile Gly Gln Thr Gly Val Thr Tyr Ile Ser Ser

305 310 315 320

Gly Ala Leu Thr His Ser Val Lys Ala Leu Asp Ile Ser Leu Lys Ile

325 330 335

Asp Thr Glu Leu Ala Leu Glu Yal Gly Arg Arg Thr Lys Arg Ala

340 345 350

(2)SEQ ID NO：3的信息：

(i)序列特征：

(A)长度：1053碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑学：线性

(ii)分子类型：cDNA

(xi)序列描述：SEQ ID NO：3

ATGTTTAGAG CTATTCCTTT CACTGCTACA GTGCATCCTT ATGCAATTAC AGCTCCAAGG 60

TTGGTGGTGA AAATGTCAGC AATAGCCACC AAGAATACAA GAGTGGAGTC ATTAGAGGTG 120

AAACCACCAG CACACCCAAC TTATGATTTA AAGGAAGTTA TGAAACTTGC ACTCTCTGAA 180

GATGCTGGGA ATTTAGGAGA TGTGACTTGT AAGGCGACAA TTCCTCTTGA TATGGAATCC 240

GATGCTCATT TTCTAGCAAA GGAAGACGGG ATCATAGCAG GAATTGCACT TGCTGAGATG 300

ATATTCGCGG AAGTTGATCC TTCATTAAAG GTGGAGTGGT ATGTAAATGA TGGCGATAAA 360

GTTCATAAAG GCTTGAAATT TGGCAAAGTA CAAGGAAACG CTTACAACAT TGTTATAGCT 420

GAGAGGGTTG TTCTCAATTT TATGCAAAGA ATGAGTGGAA TAGCTACACT AACTAAGGAA 480

ATGGCAGATG CTGCACACCC TGCTTACATC TTGGAGACTA GGAAAACTGC TCCTGGATTA 540

CGTTTGGTGG ATAAATGGGC GGTATTGATC GGTGGGGGGA AGAATCACAG AATGGGCTTA 600

TTTGATATGG TAATGATAAA AGACAATCAC ATATCTGCTG CTGGAGGTGT CGGCAAAGCT 660

CTAAAATCTG TGGATCAGTA TTTGGAGCAA AATAAACTTC AAATAGGGGT TGAGGTTGAA 720

ACCAGGACAA TTGAAGAAGT ACGTGAGGTT CTAGACTATG CATCTCAAAC AAAGACTTCG 780

TTGACTAGGA TAATGCTGGA CAATATGGTT GTTCCATTAT CTAACGGAGA TATTGATGTA 840

TCCATGCTTA AGGAGGCTGT AGAATTGATC AATGGGAGGT TTGATACGGA GGCTTCAGGA 900

AATGTTACCC TTGAAACAGT ACACAAGATT GGACAAACTG GTGTTACCTA CATTTCTAGT 960

GGTGCCCTGA CGCATTCCGT GAAAGCACTT GACATTTCCC TGAAGATCGA TACAGAGCTC 1020

GCCCTTGAAG TTGGAAGGCG TACAAAACGA GCA 1053

Claims

1.加工烟草，其包括遗传修饰，烟碱含量降低，以及N′-亚硝基去甲烟碱(NNN)、N′-亚硝基新烟草碱(NAT)、N′-亚硝基新烟碱(NAB)、4-(N-亚硝基甲氨基)-1-(3-吡啶基)-1-丁酮(NNK)的总含量低于约0.5μg/g。

2.权利要求1的加工烟草，其中NNN、NAT、NAB和NNK总含量低于约0.4μg/g。

3.权利要求1的加工烟草，其中NNN、NAT、NAB和NNK总含量低于约0.2μg/g。

4.权利要求1的加工烟草，其中该加工烟草选自Burley、Flue，或Oriental。

5.权利要求4的加工烟草，其中该加工烟草是Burley。

6.权利要求4的加工烟草，其中该加工烟草是Flue。

7.权利要求1的加工烟草，其中所述遗传修饰包括相应于喹啉磷酸核糖基转移酶(QPTase)基因或其至少13个核苷酸长度片段的序列。

8.权利要求1-3的加工烟草，其中烟碱含量低于约0.5mg/g。

9.权利要求1-3的加工烟草，其中烟碱含量低于约0.1mg/g。

10.包括权利要求1-9任一项的加工烟草的烟草产品。

11.包括权利要求1-9任一项的加工烟草的混合烟草产品。

12.包括权利要求1-9任一项的加工烟草的烟草使用停止试剂盒。

13.权利要求10或11的烟草产品，其中该烟草产品选自卷烟、雪茄、烟斗烟草、鼻烟、嚼用烟草、口香糖，和糖锭。

14.降低烟草产品致癌潜能的方法，包括提供根据权利要求1-8的任一项的加工烟草，并从该加工烟草制备烟草产品，从而降低该烟草产品的致癌潜能。

15.权利要求1-9任一权利要求的加工烟草在制备致癌物减少的烟草产品中的用途。

16.在使用烟草的人中降低TSNA或TSNA代谢产物含量的方法，包括提供该人包含权利要求1-9任一项中的加工烟草的烟草产品。

17.权利要求1-9任一项的加工烟草在制备在使用烟草的人中降低TSNA或TSNA代谢产物含量的烟草产品中的用途。

18.在暴露于侧流或主流烟草烟气的人中降低该侧流或主流烟草烟气致癌潜能的方法，包括在进行热分解的产品中提供权利要求1-9任一项的加工烟草，其中该产品的热分解导致侧流或主流烟气中包含含量降低的TSNA。

19.权利要求1-9任一项的加工烟草在制备烟草吸烟产品中的用途，在该烟草吸烟产品的所述侧流烟气中包含含量降低的TSNA。

20.包含Burley烟草的改进烟草产品，其中所述改进包括NNN、NAT、NAB和NNK的总含量低于约0.2μg/g和烟碱含量低于约0.5mg/g。