TWI258340B

TWI258340B - Modifying nicotine and nitrosamine levels in tobacco

Info

Publication number: TWI258340B
Application number: TW091112317A
Authority: TW
Inventors: Mark A Conking
Original assignee: Vector Tobacco Ltd
Priority date: 2001-06-08
Filing date: 2002-06-07
Publication date: 2006-07-21
Also published as: CA2449920A1; JP2006304800A; EP1406518A2; AR040059A1; IL159213A; US20050161056A1; JP2004530430A; NZ530238A; WO2002100199A2; US6907887B2; UY27326A1; US20060060211A1; SG132542A1; EP1406518A4; PL367438A1; CN1638655A; ZA200400084B; WO2002100199A3; MXPA03011385A; EA200400013A1

Description

1258340 09541 pifi 九、發明說明：【發明所屬之技術領域】有關於含減量尼古丁與菸草亞硝酸胺之七草及其製造方法。特別是許多製造含減量 ^ 丁與TSNA之於草的方法在此被揭露。實施例包含該 ^卓的收成、錢處理，和用域理過祕草生產於草製品以及製造這些合成物的方法。【先前技術】於草的吸收對健康的後果是眾所皆知的，但是許多人侧續使用於草製品’對於草製品的成瘾則都歸咎於尼古丁的存在除了成為眾所皆知的一種成瘾物質之外，尼古丁亦成為絕大多數存在於草及人體中致癌物質的先驅。最近該生產含減量有害、致癌或會致成瘾之物質例如焦油、亞硝酸胺以及尼古丁的方法引起人們高度的興趣，即使研九人員研發了數種降低於草製品中所含或所輸出尼古丁量的方法，許多技術製造出來的產品其口味、氣味或口感都顯不良。有些製程為透過微生物酵素分解、化學處理以及高壓萃取來減低菸草中尼古丁的含量，例如在採收後。（詳見美國專利 4,557,280; 4,561，452; 4,848,373;4，183,364 以及 4,215,706)。有鑑於此，儘管在引證案中有各種不同的例證以生產含減量尼古丁與TSNAs 之菸草及其製造方法，但對於其需求仍顯不足。【發明内容】一種含減量尼古丁與（或）菸草亞硝酸胺（TSNA)之 1258340 09541 pif 1 (亞硝替甲氨基）一4 —(3一氮笨基）-1-丁醇（異NNAL) 以及（或）4~亞硝替甲氨基—4〜（3一丁丽从）。舉_言，本發明讀實不含i 少一種的TSNA，而該至少一種的TSNA為選自以4-亞於草及其製造方法，其中並含減量的亞硝替去甲菸鹼 (丽幻力’雙卩比咬^“四氮化一卜亞硝基 (NAT)、亞硝替新烟驗（NAB)、4一（亞硝替甲氨基）— 1— (3 —氮苯基）一1〜丁酮（NNk)、4一（亞硝替甲氨基）—4一（3—氮苯基）一卜丁盤（丽A)、4—(亞硝替曱氨基）-1- (3 -氮苯基）叫—丁醇（NNAL)、4 — 碩替去甲於 ^ 甘丫虱基）一 1一（3—氮笨基） 1 —丁酮、NAT以及亞硝替新烟鹼所組成的。該菸草製包含有抽煙之物品（如香煙、雪⑨以及煙斗用之煙絲）、，鼻煙、口嚼料、尼古τ橡皮糖以及尼古丁鍵，上述之於草製品為例證之說明’但非限於此。其中之—實施例包含-以基因改造處理過的料，祕草包含—減量尼古丁以及-集合體’崎#讀包含有ννν、νατ、讎以 )ΝΝΚ ’其含量約為小於〇、〇々§々或。卩祕料祕草是由基因改造的㈣所製成者。古丁的雜為騎核絲餅祕草中之尼阻礙❸含量。此研發論點如遺傳工程阻礙忒於麵物合絲古了之能力 =丁的終草。由於在該基因改造之於草植物=尸Ϊ 古丁，所以，存在於料及其㈣料植物為原料之製品 1258340 09541 ριΠ 中的TSNA墨也會相對地減少。此一較佳的方法為，於草上广2改&的目的在於產生一種或多種減量的亞石肖酸胺， =減量的TSNA包含亞硝替去甲菸鹼（NNN)、4—(亞硝曰曱氨基）—(3一氮苯基）一1 —丁酮（NNK)、（NAT) 以^ 口(或）亞硝替新烟驗(NAB)等，但非僅限於此。其於草衣ασ包含有抽煙之物品（如香煙、雪茄及煙斗用之煙絲）、，鼻煙、口嚼料、尼古了橡皮糖以及尼古丁疑等（上 ί之Ϊ草製品為例證之說明，但非限於此)，皆以該基因改、:上芳、草為原料’並以傳統技術製造而成。較好的方式為，於草製品的傳統製程中，使用採收後經過切割、乾燥’、、、 =制甚至發酵程序等所處理過的於葉或於梗。儘管如此，石肖酸月;3=:程中，改良的技術亦可進而達到降低亞的之實施财，製造該完全不含尼古丁及TSNA dnA 擇至少—個的料細胞暴露於—外生的因，而該啟動基因可摔;到3,定向的啟動基〇ΝΔ ^ 本作於一個植物細胞以及DNA，且該列。素編入尼古丁合成路徑的DNA序哕社該啟動基因締合，且該於草細胞被 Μ至少造^ 尼rx 及⑷ tsn二== 可顯示，dna結構包含-部份 ' '匕丁 σ成路徑的DNA序列，其DNA可能 pif 1 83〇i° 具有完整的酵素編排序列或該序列之補體。鲜素為丁-㈣—轉甲基酶、N—轉曱丁二胺氧化酶、 :=脫麵、S腺奸硫氨酸合細、脑醯胺腺^ :亥甘酸硫酸（NADH)脫氫酶、磷酸核糖磷酸氨基笨； =異構酶或對苯二㈣键核糖轉細（QpTase)。而在 ^的實施例中所使用之酵素為QpTase。於尼古丁合成路 =編入酵素的DNA序列片段可為反定位或定位。於部 :的實施例中顯示，製作該不含尼古丁以及（或）伽八 ^份的於草所使用的於草種類來自Budey(伯利）（如： =ley 21 號）、〇riental(東方)或 Flue cured，此論點無需八迷然絕大錄種類的料皆可藉此技術改良成不敦尼古丁以及（或）^财成份。舉例來說，Burley 21的兔草的植物細胞可被用來作為基因工程中的受體，其目的 ;達到使基因改造後的植物含減量的尼古丁以及（或 1SNA。本發明的一大特性亦包含一獨立的DNA分子，該獨立的DNA分子包含序列碼：丨，編入酵素的dna序列碼：2，將此DNA序列雜化後，以雜化的Dna編入一對苯二紛鹽磷酸核糖轉移酶酵素，或一部份的此種酵素，其所得之 DNA序列會因為遺傳密碼的退化而與雜化前的dna序列有所差異。以該雜化的DNA編入太（Peptide)則為本發明的另一特性。本叙明的另一項特性為有關一 dna結構，該dna結 1258340 09541 pif 1 構包含一種可作用於植物細胞之啟動基因，以及一將對笨二酚鹽磷酸核糖轉移酶酵素排入於該啟動基因下游位置的 DNA片段，並使該酵素與該啟動基因作用於該DNA結構中。另外，本發明的其他特性亦揭露一方法，該方法為利用一般已知的植物細胞種類呈現對苯二酚鹽磷酸核糖轉移酶，來製造基因改造的植物細胞，而使該植物細胞呈現減量的對苯二酚鹽磷酸核糖轉移酶（QPTase);以包含一啟動基因之外生# DNA結構來轉化該植物細胞，且該dna 包含一部份排人對苯二盼觸酸核糖轉移酶信使核糖核酸 (mRNA)的序列。其較佳的實施例顯示，擁有部份序列編入對苯二酚鹽磷酸核糖轉移酶酵素酵素序列完整或部份敎。更佳的實_為使包含-種與對笨二Μ俩核糖轉鋪（QpTase)基因對應之序列的改良基因’或於該片段的長度中至少含十三獅核脊酸。本發明的另-補性為—Mf ，該基因改造植物具減量對苯二盼趟沐 ^ (QPTase)的表現，與—非轉化對糖轉移酶 ΜΜλλ α ㈣化㈣植物相關連。該基因文k植物咖料含-DNA結構，該 ^嶋酸核糖轉移酶酵素完整或部份編該方法為藉由衍生一 I達到減低對苯二酚本發明的其他特性亦揭露一方法，轉化的植物細胞以具有外生的Dna， 1258340 09541 pif 1 鹽磷酸核糖轉移酶基因在植物細胞中的表現，而該衍生轉化植物細胞處有一外生DNA的轉錄股與該細胞内生的對笨二酚鹽碟酸核糖轉移酶信使核糖核酸為互補。該互補股的轉錄作用即減低了内生的對苯二酚鹽磷酸核糖基因的表現。另外，本發明的其他特性尚揭露一方法，該方法為藉由包含一外生DNA序列的細胞來繁殖一菸草植物，使該植物的葉子裡含有減量的尼古丁，而該外生DNA序列所拆入一核糖核酸與該細胞中一部份的外生之對笨二酚鹽磷酸核糖轉移酶信使核糖核酸為互補。夂本發明的另一特性有關於一生產含減量尼古丁與（或） TSNA之煙草植物的方法，該方法包含了取自具有外生 DNA序列的細胞來繁殖菸草植物，其中，一轉錄股與該細胞的内生對笨一盼鹽鱗酸核糖轉移酶信使核糖核酸區為互補。其相關的實施例包含了自該含減量尼古丁與（或） TSNA的於草植物製造菸草製品的數種方法，而該菸草製品包^有香煙、雪％、煙斗用之煙絲、口嚼於草，以及^ 他型恶’如·私葉、碎於草或切割於草等，但非僅限於此。本發明的另—特性有關於料突變義製造、分離以及特性化，該突變體顯示了包含尼古丁化合之基因的突變，而該突㈣結果即使得料植物含減量尼古丁與或fNA。舉例來說，在數個實施例中可見，該與尼化二相關並存在於至少—個基因的突變體包含了丁二胺一轉甲基酶、N-轉曱丁二胺氧化酶、鳥胺酸脫羧酶、 1258340 A 09541 pifl S腺脊甲硫氨酸合成酶、於驗酿胺腺嘌呤二核苷酸硫酸 (NADH)脫氫酶、磷酸核糖磷酸氨基苯甲酸異構酶或對苯二紛鹽磷酸核糖轉移酶（QPTase)，但非僅限於此。以適用於繁殖植物的技術，可選擇於上述基因的自然突變體來達到減低尼古丁與（或）TSNA的含量。在數個實施例中可見，上述的菸草突變體其菸草的種類為取自Burley菸 f (如：Burley Μ > 〇riental 或 Flue_cured，此論點無需贅述，然而，尼古丁合成中的基因突變體可選自絕大多數種類的菸草。而該些菸草植物亦可被用來生產含減量尼古丁與（或）TSNA的菸草製品。其他的實施例中亦包含了經過仔細混合以使其具有所需尼古丁與（或）TSNA含量的菸草製品。舉例而;^，如上述之製程之含減量尼古丁與（或）TSNA菸草，可與傳統的私草混合以在實質上達到任何尼古丁與（或）的含1。另外，可將兩種或兩種以上含減量尼古丁與（或） TSNA祕草混合，以使其所含之尼古丁與（或）丁概達到所需的含量。針對這一點，其種類與口味的變化，與其尼，y與（或）TSNA的含量一樣可作斟酌調整。該混合之菸草製品可被合併使用於戒煙包以及專為降低或去除尼古丁瘾及致癌機率的療程。而該戒煙包及療程亦屬於本發明的貫施例。、更多本發明的實闕揭露了降低料製品致癌機率的方法’該於草製品包含香煙、雪痛、口嚼於草、嗅鼻煙、以及含尼古丁的橡皮糖和餅干等。舉例而言，其中的數個 !25834〇 09541 pifi 方法包含了製備含減量尼古丁與（或）TSNA菸草以及生產含該菸草的製品。根據以上所述，該轉化基因的菸草植物為採收後經熏製並做成菸草製品，而該菸草製品即因其原料為含減量的尼古丁與（或）TSNA於草而具有降低致癌機率的特性。一本發明的另一特性有關於減低亞硝酸胺的含量，較理相者為減少NNN、NNK，以及因為抽煙、仙或以其它方g 吸收於草而在人翻所產生的新陳代謝產物。所使用的方法，提供該人齡減量的亞雜_料製品，藉此降低轉草製品於人體_致癌機率。其中的方法之―，例如 ^於間接或直接贿者人體_致癌機率會因為所處的煙：環境巾使職製並_高溫分解的料製品而降低，品後確實使得該間接或直接吸於的環 ^減1的TSNA。因此’該熏製過含減量舰一可以被用來製備於草製品，藉接間接或直接贿環⑽的致癌機率。U低人體在接觸【實施方式】目前已研發出數種生產含減量的尼古丁與（或）UNA 於卓及其^㈣法，於此性因改造之含減量尼二吏二中自該轉殖基因之罐物的於草來$;:=二酶：該其中-種基因改造之於草植物包;—種=:。： 12 I258340ipifi DNA結才冓mNA與至少一部份的對笨二酚鹽磷酸核糖轉移酶（QPTase)基因互補。該職互補股的轉錄作用即減低了内生的對笨二_雜核糖基因的表現，而此表現的減低為依序減少尼古了於該料植物中的含量，並且TSNA在該菸草植物的含量亦會隨之減少。因此，一發明的概;t為：以基因遺傳1程來降低尼古丁祕草植物中的含量亦可降低亞硝酸胺在該菸草植物的含量。'以下將提供更多關於亞硝酸胺以及T s NA的詳細說明。

亞硝酸胺以及TSNA ，該亞猶胺之名稱-般來說可參考任何有機化合物白( 等級，而該有機化合物具有一般的化_〇或倾丽〇程

式（R表示含胺的基）。在許多種類的食物中都含有亞硝酉委胺，在實驗室的動物體中發現該亞硝酸胺所為致癌物質。這些化合物是由胺的亞硝化作用所形成的，例如··胺基酸以及含亞硝酸鹽和（或）氧化亞氮的生物鹼。這些亞硝酸胺本身不會致癌，但是在哺乳動物體中經過酶催活性的分解而成烷基化的代謝物，該代謝物會與生物分二致腫瘤的發生。因此，減少亞硝酸胺的攝取量可有效降低人體致癌的機率。 - 亞硝酸胺已被鑑定出存在於菸草、菸草製品以及菸草吸食，该鑑定的技術例如氣體熱色層法交互分析 (GC-TEA)。而有些種類的亞硝酸胺已被鑑定為tsna。 TSNA的形成基本上是以兩種最富含量的生物鹼、尼古丁以及去曱菸鹼與氧化亞氮（N0x)來作反應，相對的，該 13 1258340 09541 pifi 製品她食中的繼最高的。 :香射所發現的子集大部份^ —丁納甲亞磺氨基—卜（3—氮苯基）、 ^ N''亞硝酸胺一酮）或NNK。在實驗室的動斗1 ^射^高劑量的亞確酸胺，其NNK會致癌中 ==的亞顧胺含量是最低的，這顯示了 = ' 、7成可此是發生在製程階段，如··菸草的重f^ 燥、發酵、燃燒以及貯藏。皁I衣、乾

會jSNA的形成可歸於在菸草的製程中，特別是在菸草的二^發酵以及陳放的過程中經化學程序製成、酶催化以及細菌影響㈣成的。去曱碰、Anatabine以及新烟鹼的亞硝化作用提供了對應的亞硝酸胺，例如：亞硝替去甲菸鹼（NNN)、NAT以及亞硝替新烟鹼（NAB )。於水溶液中之尼古丁的亞硝化作用可製成4一亞硝替曱氨基—(3 一氮苯基）~1一丁酮（NNK)、亞硝替去甲菸鹼（nnn) 以及4~亞硝替曱氨基一 4- (3—氮苯基）一；[一丁醛 (NNA)的混合液。較不常見的亞硝酸胺包含有4一（亞硝替甲氨基）—1— (3-氮苯基）—卜丁醇（NNal)、4 —(亞硝替曱氨基）一4一（3 一氮苯基）一丁醇（異 NNAL)以及（或）4一亞硝替曱氨基_4_ (3—氮苯基） -丁酸（異NNAC)。可參考於US-6，135，121中所揭露者以對照本發明。存在於口嚼菸草和嗅鼻煙中的T s NA含量特別高，部份於發酵過程中所發生的無氧程序會造成自菸草生物鹼 14 1258340 09541 pifl 中’藉由促進亞硝>酸鹽含量的增當會因為_鹽含量以及== 應而使得嗅鼻煙中的TSN =谓催化反降低亞石肖酸鹽於嗔4煙中的含旦^士近年來已研發達成製品帽含之細菌=:=二其方法為藉由對祕草既然於草中硝酸鹽含量對於香菸中重要’藉由使用低硝酸鹽含量的菸：二、/ 1 指標性地降低香煙中亞_鹽的^及到法有可能會對抽煙的〜祕“二=如此，這些方 f時該亞物的含量可經由使用乙;二 __在料、___毅甚巧而降低 (::Λ 處理的菸草如細菸草以及火烤深色的菸草 u 的TSNA含量可能比报明顯的原因是以加、細於卓及深色的於草，成TSNA Ltr 處理可以殺死使生物鹼轉化華早他氣處理的於草其葉子中（尤其是的於草含更豐富的硝酸鹽（Ν_Ν〇3)，而含量亦較後者為高。在處理的過中程，Ϊ -·伟IS生:轉低為亞確酸鹽(Ν〇2)，而該Ν〇2可進 ^ X或直接與生物鹼反應而形成TSNA。，付冰心的疋，加上上述的技術，於 =。、在較^的條件下做域處稱草的實驗顯示在 /成的Ν㈣胺含量較於16〇c時高，而該亞硝胺與在於 15 1258340 09541 pif 1 的亞侧鹽含量締合’亦可能與微生物的酶催化二Ϊ良的熏製方法包含在較大空間裡快速乾燥或疋如同、、、田於卓（Burley)用來降低TSNA含量的方法，即使用更秦散的結構進行熏製。在熏製的過程中，氣候的條件於形成N_亞硝胺時具極大的影響力，而在空氣處理時的㈣濕度亦是重要。經空氣處理的莖幹所含的tsna量比主葉南。、經日照處理的〇riental#草所含的丁s·量比熏製和空氣處理的深色料來得低。未加工過祕苴之快速處理（如··使於葉均勻的處理）限制了細菌進行亞石肖化反應的能力。儘管如此，上述許多降低TSNAs的方法用於 Burley私草上可能導致該菸草的口感不良。於熏衣的過程中’ TSNA亦形成於熏製時該於草暴露於燃燒氣體的過程；於熏製的過程中，幾乎所有的TSNA(例如· Virgmia Flue)都是因為包含Ν〇χ以及尼古丁的反應而引起。其主要NQX的來源為直接火烤（direeMke)的榖倉中其燃燒氣體所產生的混合物，最近，熏製於草大部份於大型的商務榖倉内進行。由於美國在⑽吟代的能源壓力丄具有熱父換熏製設備的農用舊式榖倉已逐漸被更具能的大型滅倉取代，該大型榖倉使用直接火烤的液態、元氣（LPG)燃燒。而這些使用液態丙烧氣（Lp⑴直火，燃燒的設備可耗盡燃燒氣體，並且在與處理於草有穀倉中直接燃燒其副產品。研究發現，LPG燃燒副產口口 ^與自^^成的於草生物驗反應而形成TSNA。相對於直接火烤熏製，熱交換燃燒器有構造完整的排煙 16 1258340 09541 pif 1 2排出魏喊私副產^至 Γ:該熱交換製程使於草不致暴露於』= 中，猎此去除用形成TSNA沾π h J凡的田這口口製程並不會降低於葉的等級亦之來源’而該用熱交換器可降低約90%的,TSN: ϋ煙：°:貝降低。使 ^成間接使用熱交換器加熱來達到降低 s里仁疋绝種方法的成本十分昂貴。即使於此部份所述的許多方法有重大的缺失，但是可以理解的是，這些技術中任何-個或所有的技術都可與本發明所說明之技術併用以製造含減量TSNA的菸草或菸草製品。尼古丁尼古丁最主要於菸草植物的根部形成，然後輸送至葉子並儲存於其中（Tso，Physiol〇gy and Biochemistry, ρρ·233_34,

Dowden，Hutchinson & R〇ss，Stroudsburg，Pa· ( 1972))。此型的作物種植技術已可生產含減量尼古丁的菸草，包括^ 降低8%尼古丁的野生型於草。於本發明所述的許多種方法實際上可以適用於任何種類的菸草，但較理想的菸草種類為 Burley，Oriental 以及 Flue (例如·· VirginiaFlue)。尼古丁是由菸鹼酸以及4一曱胺基丁醛的凝結而產生於菸草中。該於產生尼古丁時的生物合成路徑請參考圖 1。兩個調節點（Nicl以及Nic2)的作用為產生尼古丁的共同主導之調節器。自單一和兩個的Nic突變種的根部組織作酵素分析顯示了兩種酵素的活性，對笨二盼鹽碟酸核糖轉化_ (QPTase)以及腐甲基轉化酶（PMTase)，該兩 17 1258340 09541 pifl 種酵素直接地與尼古丁生物合成的含量對稱。在尼古丁生物合成中一個必要的階段為自吡啶二曱酸—〔2,3〕形成菸鹼酸，該階段為以QPTase催化。QpTase的作用為該路徑中的比率限制酵素，提供在菸草的尼古丁合成中所需之菸鹼酸（可參考例證如：Feth，pianta et此，丨仰，卯4〇1〇7 (1986) and Wagner et al.9 Physiol.Plant.5685pp. 667-72 (1982))。菸草組織(根部及表皮硬化部份）的酵素活性與尼古丁合成之不同效能的比較顯示了 QpTase活化與尼古丁 δ i具有絕對的相互作用（Wagner and w叫na，

Plantal65.532( 1985))。事實上，Saunders 以及 Bush(Plant

PhyS1〇l 64:236 ( 1979))揭露了含低量尼古丁的突變體根口P所含的QPTase量與於葉中尼古丁的含量是相對稱的。以腐曱基轉化酶（PMTase)反調節改善在菸草植物中的尼古丁含量的表現，可以參考曾經在美國專利5,369,〇23 以及 5,260,205 中被 Nakatani 以及 Malik 提出，和 Wahad

以及Malik的PCT申請書W094/28142，其中說明了 DNA 編入PMT以及PMT和反PMT結構的作用。其它以降低響尼古丁含量的基因改造提案可參考Timk〇的pCT申請書 W0 00/67558 以及 David 和 Marcum 的 W0 93/5646。即使於此#又落所述的卉多方法中有重大缺失，但是可以理解的是，這些技術中任何一個或所有的技術都可以與本發明所說明之技術併用以製造含減量尼古丁的菸草或菸草製品。減低尼古丁以及菸草特有亞硝胺酸（TSNAs)的含量 18 J258340 09541 pifl 誠如上述’ TSNAs以及尼古了會致錢且讓使用或於草製品者上瘸，因此使於草或於草製品含減量的尼古 =TSNAS即非常具有其㈣的意義。在不被任何特情況下’可期待的是創造出含減量尼古丁和的於草植物、於草以及於草製品。意即及於草製品中去除尼古丁並自TSNAs ^織中料去除祕酸作用物。研究發現，降低养草中二：Ϊί是ί接關係到含量的減少。出乎意料的草’，連ί著:降低成瘾機率的於菸草當戶理過或基因改造的於草植物、於草以及物、菸草以狀轉σ 改造的於草植的量確實比同種ί ==的尼古丁以及（或）二;生型的於草會被使用；使用本發明所述之方法而降低。(或）tsnas含量是否有因〆 TSNAs (其種類如：nnn、nat \r δ d 以及尼古丁於野生_中的含量黯）及生長、採收以及重紫的方化二曰口為该於卓的種類以一片熏製的BU一種! 有極大的變化。舉例來說， (P，)的尼古丁二1=:約百萬分之30，_份

心萬刀之8,000份（ppb )的TSNA 19 1258340 09541 pif ι (其種類如：NNN、NAT、NAB以及NNK); —片熏製的 Flue终葉含大約百萬分之2〇,〇〇〇份（ppm)的尼古丁以及億萬分之300份（ppb)的TSNA (其種類如：NNN、NAT、 NAB以及NNK);以及一片Oriental種熏製的於葉含大約百萬分之10,00〇份（ppm)的尼古丁以及億萬分之1〇〇份 (PPb)的 TSNA(其種類如：NNN、NAT、NAB 以及 NNK)〇

含減量尼古丁以及（或）TSNA的菸草可以不含可測出的尼古丁以及（或）TSNA (種類如NNN、NAT、NAB以及 NNK)，或含部份其含量足以被測出的一種或多種tsnAs =及（或）尼古丁，只要該尼古丁以及（或）TSNA的含夏少於相同種類的菸草中之含量，在類似的條件下種植，以及以相同的方式進行熏製和（或）其製程。意即於此所述之Burley菸草所含尼古丁的含量可以減到介於〇到 3〇，_個ppm，以及TSNA的含量可以減到介於〇到8,〇〇〇個ppb，理想的是尼古丁的含量可以減到介於㈣綱⑻ 個ppm，以及TSNA的含量可以減到介於Q到6〇〇〇個卯b，較理想的是尼古丁的含量可以減到介於〇到削⑻ 個PPm，以及TSNA的含量可以減到介於㈣5〇⑻個 ppb，更理想的是尼古丁的含量可以減到介於 ppm，以及TSNA的含量可以減到介於η χ τ ，UUU 1U 極理想的是尼古丁的含量可以減到介於

ppm，以及TSNA的含量可以減到介 j ，DUU1U 县饰相认3 p丄卞α人曰 ’丨於0到2,〇〇〇個ppb，取H尼古T的含1可以減到介 ppm，以及TSNA的含量可以減到介 &丨_個 J "於0 到 1，000 個 ppb。 20 1258340 09541 pif 1 以本發明的方法製備該經熏製過的Burley於葉的實施例顯示，其尼古丁的含量玎以減到介於0到1，⑻〇個ppm，以及TSNA的含量可以減到介於0到500個PPb，〇到500 個ppm的尼古丁，以及〇到250個PPb的TSNA，〇到250 個ppm的尼古丁，以及〇到1〇〇個ppb的TSNA，〇到1〇〇個ppm的尼古丁，以及0到50個ppb的丁SNA，〇到50 個ppm的尼古丁，以及0到5個ppb的TSNA，並且尚有其他實施例顯示該經熏製過的Burley於葉確實不含可測出的尼古丁或TSNA。於上述之數個實施例中所提到的含量請參考NNN、NAT、NAB以及NNK的組群内容而本發明中經熏製的Flue菸草的實施例相同地亦含有減ϊ的尼古丁，且該尼古丁含量可減至為介於〇到2〇,〇〇〇個PPm’以及TSNA的含量可以減到介於0到300個ppb，理想的是尼古丁的含量可以減到介於㈣i5，嶋個卯. =TSNA的含量可以減到介於q到㈣個_，較理想含量可以減到介於G到1擊個PPm，以及尼古二到2°°個卩沖，更理想的是的含量可以朗介於G ;丨於_ 5，_個ppm，以及TSNA 的含量可介於915G個_，極理想的是尼古丁量可以減到介於0到，500個卯m，以及TSNA的含量可以減到介於〇到/0個Ppb ’最理想的是尼古丁的含以減到介於0到5〇個’〇〇0個PPm，以及TSNA的含量可草的實施例，其尼古固PPb。於此所述之經熏製的Flue菸丁的含量亦可以減到介於0到500個 21 1258340 09541 pifi ppm，以及TSNA的含量可以減到介於〇到25個ppb，〇到200個ppm的尼古丁，以及0到1〇個ppb的TSNA，〇到100個ppm的尼古丁 ’以及〇到5個ppb的TSNA，並且尚有其他實施例顯示該經熏製的Flue菸草確實不含可測出的尼古丁或TSNA。於上述之數個實施例中所提到的 TSNA含量請參考NNN、NAT、NAB以及NNK的組群内容。另外，經熏製過含減量尼古丁的〇riental菸草的實施例顯示，該尼古丁含量可減至為介於〇到1〇,〇〇〇個ppm，以及TSNA的含量可以減到介於〇到1〇〇個ppb，理想的是尼古丁的含量可以減到介於〇到7,〇〇〇個ppm，以及TSNa 的含量可以減到介於0到7 5個ppb，較理想的是尼古丁的含量可以減到介於0到5,000個Ppm，以及TSNA的 f量可以減到介於〇到50個ppb，更理想的是尼古丁的含 1可以減到介於0到3,〇〇〇個ppm，以及TSNA的含量可以減到介於0到25個ppb，極理想的是尼古丁的含量可以減到介於0到1，500個ppm，以及TSNA的含量可以減到介於0到10個ppb，最理想的是尼古丁的含量可以減到介於〇到500個ppm，以及TSNA可以減到沒有可測出之 έ里。經熏製過含減量尼古丁的〇riental菸草的實施例顯示，其尼古丁的含量亦可以減到介於0到250個ppm，以及TSNA的含量可以減到沒有可測出之含量，並且尚有其他實施例顯示該經熏製的於草確實不含可測出的尼古丁或 TSNA。於上述之收個實施例中所提到的TSNA含量請參 22 1258340 09541 pif 1 考NNN、NAT、NAB以及NNK的組群内容。數個實施例包含具減量尼古丁之熏製菸草（種類如： Burley、Flue或0riental)與對照組的比較，該尼古丁的含量大約為少於2mg/g，lmg/g，〇 75mg/g，理想為少於約〇.lmg/g 約 0.08mg/g，0.07mg/g，〇〇6mg/g，〇〇5吨/§，〇.〇4mg/g ’ 0.03mg/g，0.02mg/g ’ 〇〇lmg/g。而以含減量尼古丁及T SNA料製成之於草製品亦為本發明的實施例。在本發明中所述之“於草製品，，一詞包含有抽煙之材料（例如：香煙、雪茄以及煙斗用煙絲）、嗅鼻煙、口嚼菸草、以及含尼古T的橡皮糖和餅干等，但非僅限所述之項目。在，些詞句中所指稱“減量的尼古丁以及（或） TSNAs的含意為比較本發明所描述之菸草植物、經重製之於草以及料Μ，就訂从⑷TSNAs (義如NNN、NAT、NAB以及NNK)的含量以其重量而言比 ^相同方式生長、製造以及熏製姻種祕草低。舉例來 1’野生型經熏製的於草可含大約1 %到4%乾重的尼古丁以及大約0.2%到0.8%乾重的TSNA，視其生長、採收以及熏製的方式而定。一支典型香煙含介於2到11Mg的尼古丁和大約0.5/zg的丁SNAs。因此，以乾重而言，本發明中的私草植物、菸草以及菸草製品可含例如··少於0.01%， 0.015% ’ 〇·02%，0.025%，0.03%，0.035%，0.04%，0.045%， 0.05% · 〇·055°/〇，〇·〇6%，0.065%，0.07% · 0.075%，0.08%， 0.085%，〇·〇9%，0.095%，0.1%，〇·ΐ5%，0.175%，0.2%， 23 1258340 09541 pif 1 0.225%，0.25%，0.275%，0.3%，0.325%，0.35%，0.375%， 0.4%，0.425%，0.45%，0.475%，0.5%，0.55%，0·6%， 0.65%，0.7%，0.75%，0.8%，0.85%，0·9%，0.95%以及 1.0%的尼古丁以及少於〇·〇1%，〇·〇15%，0.02%，0.025%， 0.03%，0.035%，0.04%，0.045% ’ 0.05% · 0.055% ’ 0·06% ’ 0.065%，0.07% · 0.075%，0.08%的 TSNA (種類如 ΝΝΝ、 NAT、ΝΑΒ 以及 ΝΝΚ)。另外，本發明中的一支香煙可含例如：少於0·lmg， 0.15mg，0.2mg，0.25mg，0.3mg，0.35mg，0.4mg，0.45mg， 0.5mg，0.55mg，0.6mg，0.65mg，0.7mg，0.75mg，0.8mg， 0.85mg，0.9mg，0.95mg，l.Omg，l.lmg，1.15mg，1.2mg， 1.25mg，1.3mg，1.35mg，1.4mg，1.45mg，1.5mg，1.55mg， 1.6mg，1.65mg，1.7mg，1.75mg，1.8mg，1.85mg，1.9mg， 1.95mg，2.0mg，2.1mg，2.15mg，2.2mg，2.25mg，2.3mg， 2.35mg，2.4mg，2.45mg，2.5mg，2.55mg，2.6mg，2.65mg， 2.7mg，2.75mg，2.8mg，2.85mg，2.9mg，2.95mg，3.0mg， 3.1mg，3.15m g，3.2mg，3.25mg，3.3mg，3.35mg，3.4mg， 3.45mg，3.5mg，3.55mg，3.6mg，3.65mg，3.7mg，3.75mg， 3.8mg，3.85mg，3.9mg，3.95mg，4.0mg，4.1mg，4.15m g，4.2mg，4.25mg，4.3mg，4.35mg，4.4mg，4.45mg， 4.5mg，4.55mg，4.6mg，4.65mg，4.7mg，4.75mg，4.8mg， 4.85mg，4.9mg，4.95mg，5.0mg，5.5mg，5.7mg，6.0mg， 6.5mg，6.7mg，7.0mg，7.5mg , 7.7mg，8.0mgm g，9.5mg， 9.7mg，lO.Omg，10.5mg，10.7mg，ll.Omg 尼古丁，和少 24 1258340 09541 pif 1 於 0.001 // g，0.002 V g，0·003 // g，0·004 // g，0.005 // g， 0.006 // g，0.007 " g，0.008 // g，0.009 " g，0.01 // g，0·01 // g，0.02 " g，0·03 // g，0·04 // g，0.05 // g，0·06 // g，0·07 //g，0.08//g，0.09//g，0·1 //g，〇.15//g，0.2//g，0·25 // g，0.3 // g，0.336 // g，0.339 // g，0.345 // g，0·35 // g// g，0.375 // g，0.4 // g，0.414 // g，0.45 // g，0.5 // g，0.515 β g 5 0.55 β g 5 0.555 β g 5 0.56 β g 5 0.578 // g 5 0.58 // g ?

0.6 # g，0.611 // g，0.624// g，0.65 // g，0.7// g，0.75 // g， 0.8//g，0.85//g，0.9//g，0.95//g，1.0//g，1.1 //g，1.114 ，1.115//g，1.2/zg，1.25//g，1.3/zg，1.35/zg，1.4 // g，1.45 // g，1.5 // g，1.55 // g，1.6 // g，1.65 // g，1.7 // g，1.75//g，1.8//g，1.85^g/z g，1.9//g，2.0//g，2.1 //g，2.15//g，2.2//g 的 TSNA(種類如 NNN、NAT、NAB 以及NNK)。很出乎意料地，於本發明中發現許多降低植物中内生尼古丁含量的方法適用於生產完全不含亞硝酸胺（尤其是 TSNAs)的菸草。任何可降低其他生物鹼包含去曱菸鹼的方法也同樣適用於製造完全不含亞硝酸胺（尤其是 TSNAs)的於草。如上述之說明，本發明包含一種降低於草製品之致癌機率的方法，該方法包含提供一種如上述的熏製菸草以及使用該熏製菸草製備一種菸草製品，藉此方法來降低该知草製品的致癌機率。本發明的數個苴例包含以使射《製料來製備含降低致癌辭的於草製品與對照組相較，該對肋具有（或具有）降低的tsna， 25 1258340 09541 pif 1 或使用菸草後於人體中所產生的TSNA代謝物。 u在本發明的某些實施例中說明，舉例來說，該抽煙的產品降低了間接或直接吸煙帶給人體的致癌機率。提供如上述之基因改造的熏製菸草於一經過熱分解的產品中，例如，由該產品所產生的間接以及（或）直接吸食含有減量的TSNAs以及（或）尼古丁。因此，該熏製菸草可用來製備一種抽煙產品，而該抽煙產品於間接以及（或）直接吸食的情形下包含一種減量的TSNA。舉例來說’部份的實施例顯示直接吸食或非直接吸食一菸草製品（包含經基因改造的菸草）中的nnn、nat、 NAB以及NNK的族群含量約介於〇到5 〇//g/g，〇到4 〇 // g/g ’ 0 到 3.0// g/g，〇到 2 〇 a g/g，〇到 J 5 # g/g，〇到 1.0 /z g/g ’ 0 到〇·75 // g/g，〇到〇·5 # g/g，〇到〇·25 " g/g， 0 到 0.15//g/g ’ 〇到 o iag/g，〇到〇〇5#g/g，〇到〇〇2 //g/g，0 到 0.015//g/g，〇到〇〇2#g/g，〇到〇〇15//g/g， Ο 到 0.01 // g/g，Ο 到〇·〇〇5 # g/g，〇到〇〇〇2 # g/g 或〇到 0.001//g/g。某些實施例以基因改造的Buriey菸草而言，直接與非直接抽煙所產生的NNN、NAT、NAB以及NNK 群組含量為介於約〇到5 〇//g/g，〇到4 〇//g/g，〇到3·〇 // g/g，0 到 2.0// g/g，0 到 15 # g/g，〇到 j g/g，〇到 0·75 // g/g，0 到〇·5 // g/g，〇到〇 25 # g/g , 〇到〇15 # g/g， 0 到 0· 1 // g/g ’ 0 到〇·〇5 “ g/g，〇到〇〇2 # g/g，〇到〇〇 15

Vg/g，〇到〇.〇2//g/g，〇到〇〇15//g/g，〇到〇〇1 "g/g，〇到 0.005 // g/g ’ 0 到 0.002 β g/g 或〇到〇〇〇1 # g/g。 26 1258340 09541 pif 1 其它關於基因改造的F1Ue之實施例中顯示，直接與非直接吸煙所產生的NNN、NAT、NAB以及NNK群組含量為介於約 0 到 5.0"g/g，〇到 4.0//g/g，〇到 3.0//g/g，〇到 2.0 " g/g，0 到 1·5 〆 g/g，〇到 1·0 " g/g，0 到 0·75 // g/g，〇到 0.5 // g/g，0 到 0·25 // g/g，0 到〇·15 // g/g，0 到 0·1 " g/g，0 到 0.05 " g/g，〇到〇·〇2 " g/g，0 到〇·〇ΐ5 " g/g，〇到 0.02// g/g，0 到 0.015 // g/g，0 到〇·〇1 // g/g，〇到 0.005 "g/g，0 到 0.002 // g/g 或 0 到 0·001 // g/g。更多關於基因改造的Oriental於草之實施例中顯示，直接與非直接吸煙所產生的NNN、NAT、NAB以及NNK群組含量為介於約5.0//g/g，〇到tO^g/g，〇到3 〇//g/g，〇到 2.0//叭，0到 L5//g/g，（^ 到〇75#g/g， 0 到 0.5/Zg/g，〇到〇.25/zg/g，〇到〇.l5/zg/g，〇到〇 i v ?二到 0.05'g/g’〇到〇.㈣ .〇^抑’0到0.015//心，0到001//姓，〇到〇 g g，〇到 0·002 // g/g 或 0 到 o.ooi # g/g。了 —較佳減低菸草中尼古丁及TSNAs含量 ^因改造工程，以該基因改造工程直接降轉/包含或）TSNAs或其它生物驗的含量。任何勺a尼古，二路挺的酵素可適用為降低於草中尼古丁 =於尼古丁及基因改造工程的目標。適用於減低；草：包含去勺八或）亞確酸胺（特別是TSNAs)含量的其中尼古丁 ::/但不限於此）丁二胺N—轉甲基酶；因改造工程贱酶、鳥胺酸脫_、S腺:g：f硫=甲丁二。成_、菸給 27 1258340 09541 pif 1 醯胺腺嘌呤二核苷酸硫酸（nadh)脫氫酶、磷酸核糖磷酸氨基苯甲酸異構酶或對苯二酚鹽磷酸核糖轉移酶 (QPTase)。另外，控製母質循環至尼古丁合成路徑的酵素適合作為減低於草中尼古丁及（或）亞硝酸胺（特別是 TSNAs)含量之基因改造工程的目標，在此領域中已知的基因改造工程之適用方法，例如使用抑制及反抑制技術以降低酵素的產生’如同使用隨機或有目標的突變來分裂基因機能，例如：使用插入t-DNA或致突變之EMS。舉例來說，含減量尼古丁及TSNAs的菸草是由一種菸草植物所生產，該菸草植物的形成是用所選定的菸草種類 (較佳者為B u d e y菸草）以至少一個菸草細胞暴露於一個外生的DNA結構，該DNA結構有一介於5 ^到3 >定向的啟動基因’而該啟動基因可操作於—個植物細胞以及 DNA，且該DNA為包含一部份可將酵素編入尼古丁合路徑的DNA序列’該DNA可操作與該啟動基因締人:且 ^草細胞被該DNA結構所轉化。以負選或正選^ 出该轉化細胞並以該轉化細胞來再造至少_種的始物。而該再造的料植物較理想者為被檢析出不具# 以及（或）TSNA的含量，而這些數據可與含尼 ===的整株或部卿植物相較； DNA結構包含一部份可將酵素排入尼職序列，其DNA可具有完整的酵 ==的之補體。-部份將酵素編人尼打合成路亥= 28 1258340 09541 pif 1 或其補體可能有至少25,或較佳、 150，或 250，或 500，或 750，或！ _ :或 75，或 1〇〇，或或2,500 ’或5,〇〇〇，或整個酵素編或丨’5〇〇 ’或2,0〇〇，這些DNA結構有能力藉由反向或^列或其補體。因此，尼古丁合成路徑中的内生酵素之同抑制機制來擾亂於向或共同抑制結構有效降低了笪姑L值得注意的是該反亞硝酸胺的含量。；皁植物中尼古丁以及（或）一較佳的實施例顯示包含在尼古人 _ 可為例如··丁二胺N-轉f基酶、N—轉^路徑中的酵素鳥胺酸脫膽、s腺U：甲硫氨酸胺氧化酶、二核苷酸硫酸（NADH)脫氫酶、萨=胺腺嘌呤酸異構酶或對苯L恤核糖轉基本甲 QPTase。朗排料Μ打合^ :該序酵正取向。於-特別理想的實施: —於一方法中應用一新的cDNA序列（序列碼：丄）編 )一序列碼：2之植物的對苯二紛鹽鱗酸核糖轉移酶 (QPTase)。當QPTase活性強烈與尼古丁含量相互關連，其根部含減量QPTase的基因改造菸草植物結構中其菸葉中亦含減量尼古丁（與野生型的含量比較）。本發明的實施例提供數種方法以及生產該基因改造植物的核酸構造，除此之外，還包含以該植物本身生產基因改造植物。該方法包含了反N tQPTl RNA的表現，而該表現減低了菸草根部QPTase的含量。 29 1258340 09541 pifl 本無明的特性亦關於作用與反作用的編人QpTase或 QPTase反RNA分子的DNA分子重組體，且媒介者包含。亥DNA刀子重組體，此外，用該DNA分子重組體和媒介者，行植物細胞以及植物的基因改造。於此所述之基因改這於草細胞以及植物的等性為相較於對照和對照組，該基因改造菸草細胞以及植物含減量的尼古丁以及（或） TSNA。於此所述之菸草植物適合傳統的種植和採收技術（例如·矣枝或不剪枝、將花套袋或不套袋，以及栽培於充份施肥或不施肥的土壤），且該收成的葉子和梗適合用於任何傳統的菸草製品，包含（但不以此為限）：煙絲、雪茄以及香煙，以及任何型態的口嚼菸草包含菸葉、碎菸草或、或切割菸草。亦可預期的是該含低量尼古丁以及（或）TSNA 的菸草可以用傳統的菸草製造及混合以生產出具不同尼古丁以及（或）TSNA含量之大範圍的於草製品。該混合的菸草可被用於戒菸計劃的菸草製品中，讓消費者慢慢地由尼古丁以及TSNA含量的製品轉移到低尼古丁以及TSNA 含量的製品。本發明中的數個實施例使用戒菸包包含一種菸草，且包含兩種或多種具有不同尼古丁以及（或）亞硝酸胺含量的於草製品。例如：戒於計劃的初始，一抽煙者可抽含5mg的尼古丁和0.3//g的亞硝酸胺的混合香煙，逐漸地改成抽含3mg的尼古丁和〇·2//g的亞硝酸胺的香煙，其次改為抽含2mg的尼古丁和〇.l//g的亞硝酸胺的香煙，再改為抽含lmg的尼古丁和〇·〇5 // g的亞石肖酸胺的 30 1258340 09541 pifi 香煙’接著再改為抽含〇·〇_的尼古丁和不含可測劍量之亞硝酸胺的香煙直到該吸煙者決定只抽完全不含尼古丁和亞硝酸胺的香煙或完全戒煙為止。因此，本發明^混合香於提供了-個以階段式方法降低於人體内致雜率的方法之原則。該使用上述戒煙器材的菸草可包含其它菸草製品，例如（但非限於此）··抽煙的用品（例如··香煙、、雪二 ~ 以及煙絲）、嗅鼻煙、口嚼於草、尼古丁橡皮糖以及尼古丁鍵。本發明之發明者揭露該TobRD2基因（詳見c〇nkHng， ·_ 植物學93,1203 (1990))編入一 N.T.QPTase，以及提供該

NtQPTl (之前稱之為TGbRD2) ^DNA序列以及該排入酵素的氨基酸序列。本發明的技術特性亦曾於 PCT/US98/11893中揭露。比較該NtQPT1胺基酸序列與該基因銀行（GenBank )的數據顯示有限之序列與編入的細菌蛋白相同（詳見圖3 )。在原核生物以及真核生物中的從新尼古丁腺嘌呤二核甘酸（NAD)生物合成中需要QPTase。所測出於菸草根部鲁· 所含的QPTase量較高而非葉子。本發明之發明者曾利用 · 大腸桿菌細菌病變（TH265 )來去除編入QpTase的 NtQPTl，而該細菌病變為QPTase所缺乏的突變體 (nadC)。該突變體無法在缺乏菸鹼酸的極小媒介上生長。僅管如此，存在於該細菌病變的NtQPTl蛋白之表現提供了 NadC %性表現型（詳見圖4)，以確認了該NtQpT1 排入 QPTase 〇 31 1258340 09541 pifi ★該〜旧以及Nic2突變體於菸草中的作用，以及剪枝菸草植物的作用為NtQPTl穩定mRNA及尼古丁的含量已被去除。（在開花初期剪枝以去除頂點顯性為已知的技術，以達到減低菸草中尼古丁的生物合成以及輸送量。）若 NtQPTl貫際上包含於尼古丁的生物合成中，可期的結果為（1) NtQPTl mRNA含量會降低於Nicl/Nic2的雙突變體（2)NtQPTl mRNA含量會於剪枝後增加。而於Nici/Nic2 的雙突變體中的NtQPT1 mRNA含量大約為野生型的25% (°羊見圖5 )。另外’在剪枝的六個小時之内該NtQPTl mRNA於私草植物中的含量增加約八倍。因此，NtQpTi 已被去除而成為於尼古丁的生物合成路徑中的主要控制基因。下一個部份將會說明基因改造菸草植物細胞以及基因改造於草植物的創造。基因改造植物細胞以及基因改造植物於植物細胞基因組中基因表現的調節可藉由異構dna 的統合在於受體中機能化的一啟動基因之轉錄控制完成，且其中該異構DNA的轉錄股為DNA股的補體用以轉錄内生基因之調節。該引植的DNA於此為反DNA，提供自然生成（内生的）mRNA之補體一 RNA序列，且以該補體抑制内生DNA的表現。即使反作用機制並未能被完全理解，但已知的是反作用結構可以用來調節基因的表現。於本發明中的數個方法顯示，該反作用的產物可作為自然生成目標RNA的編排或非編排（或兩者皆是）部份補體。該反作縣構可被以任何適#的方法引植人該^勿 32 1258340 09541 pifl :胞’並且可整合入基因組以誘導或組成反作用序列的轉 =職的的外生或異構_ __人

可ίΖίΓ胞（或該細胞之袓先）中。如異構㈣A 或對照_草植物或二取一外生的QPT反轉錄單位轉化，該單位於一反 :向中包含-部份的QPTcDNA序列、—全長的㈣職 =、-部份的QPT染色體序列，或—全長的QpT染色 =序=，而該反取向為與適#作用連接調節的序列反作 1。適當調節的序列包含-已被轉錄可作用於該植物的轉錄起始序m所謂之“啟動者”），以及_聚腺苷酸化作用 /轉錄終止序列。標準的技術例如限制作用作圖、南方污點雜化作用（Southern blot hybridization)以及核蛋白序列分析，而這些技術被使用來辨識於反取向的無性系製造之 QPTase序列，且可操作地連接調節序列。然後於草植物即以用傳統技術成功轉化的細胞再造。最佳的是’利用該反序列為内生序列的補體，僅管如此，於外生以及内生序列中較小的變體是可被接受的。較佳的是，該反DNA序列應為相似於可連結細胞中内生序列之足夠序列以利於在嚴格的條件下作調節，該嚴格條件如以下說明。反作用技術已被運用於許多實驗室以特種酵素將基因 33 1258340 09541 pifl 改造的植物特徵化。例如，含較低量苯基苯乙烯酮類的合成酉母，該合成酶為一種花色素生物合成路徑的酵素，而該酵素已藉由安插一苯基苯乙烯酮類反作用基因進入該菸草及制π八花的基因體中製造出來。這些基因改造的於草以及喇叭花植物可開出較正常色澤淡的花（Van der Kr〇l et al.， "An Anti-Sense Chalcone Synthase Gene in Transgenic

Plants Inhibits Flo wer Pigmentation，，，Nature, 3 3 3， ρρ·866-69(1988))。反RNA技術亦已被成功地應用於抑制於基因改造蕃茄之表現中的酵素多聚半乳糖醛酸酶（Smith et al·，“Antisense RNA Inhibition of P〇lygalact腦nase Gene Expression in Transgenic Tomatoes，，，Nature, 334, ρρ·724-26(1988)) ’以及應用於該酵素核酮糖二碟酸鹽羧基滅解@母於蕃加中的小次單位（R〇(jermel et ai.. Nuclear-Organelle Interactions: Nuclear Antisense Genebits Ribulose Bisphosphate Carboxylase Enzyme Levels in

Transformed Tobacco Plants，，，Cell, 55, pp.673_81(1988))。另外，以比正常量所需的酵素較大的量來特徵化該基因改造植物，可藉由轉化該植物來製造而得到位於該正（即正常）取向之所需的酵素。於本發明中該基因改造菸草植物中的尼古丁含量可被標準尼古丁分析儀測出。含減量 QPTase的基因改造植物與未實施基因改造的對照組植物比較，該尼古丁含量會相同地比對照組植物來得低；而含增量QPTase的基因改造植物與未實施基因改造的對照組植物比較，該尼古丁含量會相同地比對照組植物來得高。 34 1258340 09541 pifj 製造 H用^敕本 ^明的反作用方法之異構序列可被選作為物;^序%份砂、mRNA序列互補的之職: 意即可與内生的壬何自:然的mRNA的鄰近序列互補，蓋區下方介於覆罢「^近端互補S Υ末端或覆蓋區，於覆編碼區的全部或部份編非與編碼區的所有<mU非編碼區與編碼區可從=:=;固未，6區，互補。適用的反作用序列 _ 個、16到21個、20個、30個、50 酸:另可1:個娜 ϋ ;上述的3’或5’末端延伸或縮短。田d的反相及反序列的長度可視所需之抑制作、〇反序列的穩定性或其它因素而改變。熟知此技蔹的人將使用已存在於此技藝中之技術以及知識以針對 QPTase反序列作適當的選擇，參考本發明之圖2a以及序列碼.卜當轉化為-植物細胞受體時，本發明之寡核脊酸於反取向中可用任何足以達成所要成果的長度來作一 QPTase cDNA片段的延續。本發明亦可被用於尼古丁生成之正共抑制的方法中。當表現於一植物細胞，正DNAs被用於完成本發明的作法: 以一足夠的長度抑制該植物之QpTase蛋白的天然表現。這種正DNAs可為本質上排入該QPTase酵素或上述之片段的一完整基因組或互補的DNA，於該片段之長度中典型至少有十五個核苷酸。可達到抑制於細胞中一天然基因的 35 1258340 09541 pif 1 表現以破定正DNA長度的方法已為熟悉本技藝之人

.aPn 〇 I 的核酸代酶分裂區在初始時可被藉由掃瞄該目標分子來認定（例如：GUA、GUU或GUC序列）。一旦被認定，15、 20、30的短RNA序列或更多核糖核苷酸與目標基因對應，而該包含分裂區的目標基因的預測結構性特徵是可被評估的。數個後選目標的適合性亦可藉由測試該可被接受的能力來與互補的寡核苷酸雜種培殖，該測試可利用如本技藝中已為人所熟知的核糖核替酸保護分析物。DNA序列排入本發明的另一實施例為該於草植物細胞被—職社構轉化，言亥DNA結構包含一排入酵素的舰分子（_ 代酉母）之DNA片段，該RNA分子直接對著（分裂）該 DNA排入植物QPTase白勺mRNA轉錄。核酸代酶包含μ 該目標mRNA之可到達區的酵解物結合區域和催化齡裂RNA的區域’並且魏解及蛋自產生。該結合區域可包與目標mRNA㈣互觸含反序％ ;其催化的要素可為一鎚頭要素或其它如髮夾要素。位於一 rna目標之中酶RNA分子可根據已知技術製造。參考文獻例如發明者 T· Cech，美國專利 4,987,071 ; Keene，美國專利 5,559,021 ;

Donson，美國專利 5,589,367 ; Torrence，美國專利 5,583,032 ; Joyce，美國專利 3,380,967 ; Gold，美國專利 5,595,877 ; Wanger，美國專利5,591，601以及美國專利 5,622,854。 ’ 於一植物細胞中酶RNA分子的產生和QPTase蛋白製造 36 1258340 °9541 pif j 的分裂減低了於植物細胞中的QpTase活性作用，以本質相同的方法如製造一反RNA分子：意即分裂於該細胞中生產酵素之mRNA的轉譯。而“核酸代酶，，一詞被用於此來4田述包含RN A的核：g：酸，該核脊酸可如一酵素（如：内生核糖核酸酶）般作用，並且可被與‘酶KNA分子，父替使用◦本發明更包含DNA編入核酸代酶該DNA編入核酸代_被插入一表現載體的，於載體細胞中有含該種載體’以及使用核酸代酶減少於植物中QPTase的產生之方法亦包含於本發明中。核苷酸序列利用於成就本發明者包含相似於序列碼：工的DNA序列，排入一具有QpTase活性作用的蛋白。而這些定義的主旨在於包含於QPTase蛋白中的自然等位變化。因此，與DNA序列碼·· 1雜化的DNA序列以及QPTase 表現，的編"馬特別是植物QPTase酶可被用來完成本發明。複形式的^草QPTase g每是可存在的。—種酶的複形式是 ‘因於單基因產物的後轉譯的修正，或NtQPTl基因的複形式。谷彳"匕具有QPTase活性作用的蛋白編碼的 DNA序

列與DNA序_ 1或其它以所需蛋白的DNA序列如：序列碍：2的DNA序列雜化，條件可被以一常規性的方法限定。例如：這些序觸於駄所需蛋㈣的職序列碼.2之雜化作用可在於此所述之標準s i t u雜化 :::二器中，以減壓的條件或甚至嚴格的條下完成（例 ° 甚至7〇°C以-0·3^1 NaC1的沖洗嚴格度，0.03M 37 1258340 09541 pif 1 才丁才豕=鈉’ 〇」％DSS的條件）。參考j. ，分子的 ^氨殖，—貫驗室手冊（（2d Ed· 1989) (Cold Spring Harbor Laboratory))。—般而言，這些序列會有至65%、 =/〇 8〇/〇、85%、90%，甚至95%或更高比率與該所需之序列如序列碼：1，或編入所需蛋白的的DNA序列碼：2 相，（序列相似程度的確定為將該二序列排成成一列以達到，大的勿合，於該二序列間被相合之間隙於最大的吻合中疋可以接叉的。間隙長度為l0或小於a者較佳，間隙長度為5或小於5者更佳，以及間隙長度為2或小於2者最佳。已知的差式雜化作用程序可容許cDNA無性系的隔離，而該無性系的mRNA的含量為約0.05%的聚（A) NA 參考]\4 · Conklinget al.，Plant Physiology 93，1203 - (1990)間而έ之，以從植物組織（例如：根部以及 (或）葉子）中反轉錄mRNA的單股cDNA探測器來篩選 cDNA貧料庫。為執行差式篩選，將浸泡於5xSSC的確基纖維素或尼龍薄膜放置於一 96井吸入管；15〇#L的穩定隔夜培養物被由主盤轉化至每一個井並且真空塗敷每—個井直到所有液體通過該過濾薄膜。用複式吸量管放大約 15〇//L的變性溶液（0.5M的氫氧化鈉，1.5M的氧化鈉）於每一個井中並靜置約3分鐘。如上述進行抽吸且該薄膜去除並中和於α5Μ的Tris —HC1 (pH值8·0)與15M的Naa，然後真空烘烤2小時並且以相關探測器培育。以尼龍薄膜過濾器並且將主盤 38 1258340 09541 ριη ，存於零下7°c的7%D_之中，過劇可被複式吸量 b篩選數次ϋ且適$的無性系會在數年的保存之後回收。如同本發明所述=“基因，，—詞參考—DNA序列包含 (1)上游（5 )调節訊號，而該訊號包含啟動基因 -編碼區，該編碼區指定其基因的蛋白或RNA產物⑶ 下游區’該下游區包含轉錄終止及聚·酸化作用訊號，以及（4)連結序列，該序烟以得到有效及特定的表現。於本發明找DNA相可必要地財發明所提供的序列組成（序列碼.1) ’或相等的核脊酸序列代理該基因之對偶基因或多形變體，或上述的編碼區。“大約序列相似點”—詞於本說明及專利申請範圍中意為DNA、RNA 或胺基酸賴，該職、職或胺級序财於此揭露及主張自實際序列輕微及非因而發生的序列變化，而該序列被=定為與本發明之序列相同。_ “輕微及非因而發生意為“相似的’，序列（即已於本發明中揭露與主張含有大約與該DNA、RNA或蛋⑽同的賴），會機能上與本發明揭露與主張的序州目同。機能上相同序列會作用於大致上^同的喊以製造於本發明巾揭露與主張同的核脊酸組合。本發明中的DNA序列可被轉化為一載體細胞性，適合載體細胞的多樣性有所需的生長以及處理的性質已為人所熟知。“分離”或“大約無性”於本發二及張為- dna、rna、多太（p〇lypeptides)或蛋白的修正，意為該DNA、RNA、多太（p〇iypeptldes)或已 39 !25834〇〇954lpifl 由其細胞環境内人工分離。 ‘於本發明中“天然；DNA序列”或“自然咖八序列 ‘‘意為一 DNA序列可被分離自非基因改造細胞或組織。天然DNA序列為非經改造的，例如藉由指定區的突變。 —旦天然DNA序列被認定’ DNA分子擁有天然〇 n a序列可藉由已知的重組D N A程序化學性地合成或生產。如本發明所述，一天然菸草DNA序列可被分離自非基因改造菸草細胞或組織。本發明的DNA結構或“轉錄匣”包含於該轉錄方向的5到3 ，一啟動基因，一 DNA序列如上述與該啟動基因操縱地締合，另外，一終止序列包含RNA聚合酶的停止訊號及一聚腺脊酸化作用訊號。所有的調節訊號應為可操縱於該組織細胞以被轉化。任何適合的終止訊號可被利用於完成本發明，可參考本發明之例証，但不以此為，，該胭脂鹼合成酶（nos)終止者，章魚鹼合成酶（〇cs) 、冬止者，C a MV終止者或天然終訊號，誘導自基因相同於轉錄初始區或一不同基因。參考Rezian ( 1988) supra; 及 Rodermel ( 1988) supra。本發明中“操縱地締合”一詞，參考於單DNA分子上之DNA序列，該序列的締合以影響其它序列之功用。因此，一啟動基因為可操縱地與一 DNA締合，當該DNA的轉錄被其影響時（即該DNA為在該啟動基因轉錄的控制之下）。該啟動基因為轉錄後DNA序列的“上游”，而轉錄後的DNA序列為下游。 40 1258340 09541 pif 1 該轉錄匣可被以一 dna結構提供，而DNA結構有至少一個的複製體系。為求方便，有一複製體系作用於大腸桿菌’如：CoIEl，PSC101，PACYC184或其它相同種類疋很平¥的。於此形態，在每一次操縱之後的每一階段其之後的結構可被無性系化、序列化以及終止操的正當化。另外，或於大腸桿菌複製體體系中，可利用一大範圍的載體複製體系，如該p 一 1不相合的複製體系的質粒，例如： PRK290。而該複製體系會規律地出現標記，而該標記可對一個或更多的載體有用，或不同的標記於載體個體。意即當另一標記被用於選擇一真核生物載體時，一標記可被用於述擇原核生物載體，特別是於植物載體中。該標記可對抗生物殺蟲劑（例如：抗生素、毒素、重金屬或其它），藉由傳授原質營養生物給營養缺陷的載體提供互補作用，以及（或）經由該植物中新的化合物提供一可見的表現型。該異變的片段包含異變的結構、轉錄匣、標記以及其匕被連貝引入以一個適當複製體系的酵素分離限制，以及該特定的結構或片段的插入至可用的區。在束缚結合與無性系化之後，該DNA結構可被分離以進行下一步操縱。這些技術被擴大驗証於文獻中，如j. Sambr〇〇k et al.， Molecular Cloning, a Laboratory Manual (2d Ed. 1989)( Cold Spring Harbor Laboratory ) ° 可被用來以本發明的核苷酸結構轉化植物組織者，包含土壤桿菌、媒介者彈性載體和適合DNA 一調節轉化的載體。啟動基因”參考一 DNA序列的區域，該 41 1258340 09541 pif 1 區域包括編排序列之有效率表現的必要訊號。這可包含一與RNA聚合酶結合的序列，但非僅限於該種序列，而該載體可包含其它調節蛋白所結合的區域，並與其它區域包含於蛋白轉譯控制中。這些載體亦可包含編碼序列。本發明之啟動基因可為組織作用啟動基因，而數個組織作用啟動基因可操作於植物者是存在的。較佳的例子為花椰菜鑲嵌病毒（CaMV) 35S啟動基因，該啟動基因組織地表現於大部的植物組織。另外，該啟動基因可為根部特定啟動基因或根部表皮特定啟動基因，詳細說明如後揭露。反序列曾表現於基因改造菸草植物中，利用花椰菜鑲甘欠病毋（C aMV)3 5 S啟動基因。參考Cornelisen et al·， Both RNA Level and Translation Efficiency are Reduced by Anti-Sense RNA in Transgenic Tobacco:，Nucleic Acids Res. 17，PP.833-43 (81989)，Rezaian et al·，“Anti-Sense RNAs of Cucumber Mosaic Virus in Transgenic Plants Assessed for Control of the Virus”，Plant Molecular Biology 11，pp· 146-71 (1988); Rodermel et al·，“Nuclear Antisense Gene Inhibits Ribulose Bisphosphate Carbooxylase Enzyme Levels in Transformed Tobacco Plants^, Cell 555 pp.673-81(1988); smith et al·，“Antisense RNA Inhibition of Polygalacturonase Gene Expression in Transgenic Tomatoes”，Nature 334, pp.724-26(1988); Van der Krol et al·，“An Anti-sense Chalcone Synthase Gene in Transgenic Plants Inhibits Flower Pigmentation，，，Nature 333, pp.886-69(1988)。 42 1258340 09541 pifi

CaMV 35S啟動基因的作用於QPTase在轉化的菸草細胞及植物中的表現在本發明中為較佳的。CaMV 35S啟動基因的作用於其它重組的基因在菸草根部表現已詳細記載於（Lam et al.，“Site-Specific Mutations Alter in Vitro Factor Binking and Change Promoter Expression Pattern in Transgenic Plants”，Proc· Nat· Acad Sci· USA 86, pp.7890-94(1989); Poulsenet al. "Dissection of 55 Upstream Sequenses for Selective Expression of the Nicotiana Plumbaginifolia rbcS-8B Gene”，Mol. Gen. Genet. 214, PP.16-23(1988))。其它啟動基因僅在根部組織内作用（根部特定基因）亦特別適合於本發明的方法中，參考美國專利5,459,252，發明者 Conkling; yamamoto et al·，The Plant Cell， 3:371(1991)。該TobRD2根部表皮特定啟動基因亦可被利用。美國專利申請書SN 08/508/786，現已核準，發明者 Conkling; PCTW〇97〇526卜以上所有的專利皆可作結合參考。於本發明中該QPTase重組DNA分子和載體被使用於生產轉化菸草細胞及植物，並可進而包含一操縱可選擇的標圮基因。適用於菸草中的操縱可選擇之標記除此之外，包含抗生素的抗藥性。基因編入新黴素磷酸轉移酶 (ΝΡΤΠ )以及澄黴素磷酸轉移酶（Ηρτ)。抑其它適合用於菸草知名的可選擇的標記包含二氫葉酸還原環i兄犬、交基因，該基因編入抗氨曱葉酸二氫葉酸還原 43 1258340 酶。dmA載體包含適用的抗抗生素基因，以及對應的抗生素己存在於商業用途中。轉化的菸草細胞被從非基因改造細胞的周圍細胞中選出，其選出的方法為將綜合細胞放入一培養皿中，該培養皿包含一適當抗生素濃度（或其它化合物，通常為對菸草細胞有毒的），對被選出的操縱可選的標記基因產物給予抵制。因此，只有這些已被轉化的菸草會存活下來並且分化。另外，Jefferson所揭露正面的選擇技術（例如：w〇 00055333; W0 09913085 ;美國專利·· 5599670; 5432081;以及5268463)皆為可行的。 ’ 本發明中製造重組植物的方法，一般而言，包含首先有再生能力的植物細胞（該植物細胞典型存在於一有再生月匕力的組織中）。然後該植物細胞被以DNA結構轉化，該結構包含-本發明中所述之轉錄£，以及—重組植物，該重組植物為轉化的植物細胞所再生而來的。如後所述者，以本技藝巾所A知的技術完成該轉化步驟但不限於使用有轉錄ϋ的微粒子撞擊雜物細胞，以—根癌該細胞，崎桿g具有帶轉_的鈦質粒，其它適用^ 產基因改造植物的技術亦可使用於此。數個土壤桿菌載體系統對本發明有用為已知的如·美國專利4,459,355揭露一葉）的方法，該植物扎冬右#新、鈇/1 β用马已知的。例轉化善感植物（包含雙子

44 1258340 09541 pifi -兩等份的土壤桿g賴（意為—均粒的Vir區但沒T區的質粒，以及包含τ區作=貝第二個質粒）在本發明中為有用的。 m的微粒子適合於-植物細胞的彈性的轉化作用，發明中的DNA結構者也有用於製造該轉化雜物。將节微粒推進-植物細胞以製造適合_性細胞轉化方法/ f織以運用於本發日种。例如，組織及程序被揭露於美國專利4,945,050發明者San#D w〇lf，以及5 〇15，則，發明者Christou。當使用彈性轉化作用程序，該轉駭可包含於-質粒’該質粒可複f或整合於待轉化的細胞中。適用於這種系統的微粒子的例証包含丨到5//m單位之鍍金球。该DNA結構可利用任何適合的技術沈積於微粒子之上，如：沈澱。於本發明中植物種可被以DNA結構轉化，藉由植物細胞原生質體的媒介DNA而轉化。植物可於後被以含微脂粒的DNA再生自轉化的原生質體，或於本技藝中已知透過 ELECTR0P0LATI0N 的 DNA 結構（Shillito et al·， “Direct Gene Transfer to Protoplasts of Dicotyledonous and

Moncotyledonous Plants by a Number Of Methods, Including Electroporation”， Methods in Enzymology 153, ρρ·313-36(1987)) 〇如同用於本發明中，參照於細胞中引入外生DNA的轉化作用，而以該外生DNA製造穩定轉化的基因改造細胞。透過於本技藝中已知的菸草細胞及組織培養技術再生完整 45 1258340 09541 pifi 的菸草植物包含轉化的細胞的運用。植物再生的方法己被選用來相容於該轉化作用的方法。而於基因改造的菸草植物中QPTase穩定的存在與其取向可被以QPTase序列的孟德爾遺傳確認，如DNA分析標準方法所顯示使用於自已控制的混合種所產生的子代。在基因改造菸草植物由轉化細胞再生後，該引入的DNA序列很容易透過傳統的植物繁殖技能且無過度實驗地被轉化入其它菸草種類。例如，分析該轉殖基因的分離，再生的轉化植物（R〇) 可生長至成熟，然後測試其尼古丁以及（或）TSNA含量，並生長出心株。帶有轉殖基因的Ri株的比率為該轉殖基因的同種接合子，確認同種接合子Ri株及轉殖基因心株己生長至成沾並自殖，同種接合的株會生產子代而每一子代株為帶該轉殖基因者；同種接合Ri株的子代會分離至3 : 1。 ^ 任何可Ik後發生無性生殖系繁殖植物組織，不論以器官形成或胚胎形成皆可以一於本發明中所述之載體轉化。於此所之器官形成” 一詞意為枝條及根部自分生組織中心持續發育的轉；而“胚胎形成”意為枝條與根部一同於共同形式中發育（但非持續地），不論自體細胞或配偶子:該，定組織的選擇會根據所存在的無性生殖繁系統而改變，，適合者為該特定的轉化種類。例如組織目標包含葉盤、把知、芽、子葉、胚轴、癒傷組織、存在的分生组織的組織（tlSSUe)(例如：頂端分生組織、腋生花爸以及根部7刀生組織）以及包含分生組織（例如：子葉分生組織 46 1258340 09541 pif 1 以及胚軸分生叙織）。本發明中之該 ^ 夕轉化細胞的嵌/ ·物^有多種形式。該植物可為轉化或非所有的細胞轉“包；轉錄：為無性系的轉化物(例如：化組織的嫁接（例士一:匚），該植物可包含轉化與未轉轉化接穗）。該轉根石占木嫁接至柑橘種的未繁殖或典型繁料術。舉__!種方法繁殖，如以無性系

可自生以授予同種接合的第::弟―代⑹轉化植物 2株藉由典型的繁育技術 '(或Τ2 )轉化植物以及T Π )可與該轉錄_合以協助繁育—操縱可選標記（如npt 提供-種方法以生產含有；溫=此，本發明 τ==化的相似作物相比含= =:Γ以下例”明確說明本發，^ 例言正1 分離及序列測定 T〇bRD2 cDNA ( ConkHng et. al., Plant Phy, 93, 1203(1990))已被序列測定，於此為序列碼：】，該推绩的胺基酸序列為序列碼：2。該推縯的胺基酸序列被預測為一細胞溶質的蛋白。僅管尚未有文獻報告說明植物的QpTase 基因，NtQPTl胺基酸序列與GenBank資料庫（圖3)的比較顯示有限的序列與一定細菌及其它蛋白的相似點；對 47 1258340 09541 pif 1 苯二酚鹽磷酸核糖轉移酶（QPTase)活性作用已被証明於傷寒沙門氏菌、大勝桿菌以及菸草基因。該編入NtQPTase 的QPTase有與該推縯的太（peptide)片段有相似點而該 pep·片段以一 Arabidopsis Est (表現序列標籤）序列 (GenBank 作品編號 F20096 )編號，該 Arabidopsis Est 序列可代理部份的Arabidopsis QPTase基因。例証2 同區雜化作用為終止TobRD2 mRNA轉錄於根部各種組織的空間分佈區域，同區雜化作用即表現於轉化的植物中。於根部組織TobRD2對TobRD2 mRNA的反轉股之同區雜化作用已被以說明於 Meyerowitz，Plant Mol. Biol. Rep. 5:242(1987)以及 Smith et al·，Plant Mol· Biol. Rep. 5:237(1987)中的技術完成。由種子生長七天大的菸草 (Nicotania Tabacum L.)根部被固定於一磷酸鹽緩衝的戊二搭，包埋於 Paraplease Plus(M〇n〇ject Inc , st L〇uis, M〇) 以及切8被米厚度之薄片得其橫向及縱向。反τ減轉錄被用來作探·ϋΑΤρ的型式合成於咖。。以驗使 =標記的RNA水解以利於使用前產生丨⑻到基本 5〇%^ Ψ 16^ 5 二有大約5X105 _標記的雜化作用 ^ 、翻片顯影並可見於明暗視野的顯微鏡 48 1258340 09541 pif 1 該雜化作用訊號僅限於根部細胞的皮質層。與根皮質的薄壁細胞比較該相同限定段落的TobRD2轉錄的明暗視野顯影。於該表皮及中柱裡見不到雜化作用的訊號。例言正3 於Nicl以及Nic2菸草突變的T〇bRD2 mRNA量及與尼古丁含置的相互關連TobRD2恆態mRNA量被測試於Nici 以及Nic2突變菸草植物中。Nicl以及Nic2為已知調節苯 —3分鹽構酸核糖轉移酶（QPTase)活性作用以及丁二胺曱基轉移酶活性作用，並可為尼古丁生成的共操縱調節者。而該成果顯示於圖5A及5B且亦顯示以Nicl以及Nic2調節TobRD2的表現。 RNA被分離自野生型Burley 21菸草植物的根部 (Nicl/Nicl Nic2/Nic2 ) ^ Nicl-Burley 21 ( nicl/nicl

Nic2/Nic2)的根部，Nic2-Burley21(Nicl/Niclnic2/nic2)的根部以及 Nicl-/Nic2-Burley 21(nicl/nicl nic2/nic2)的根部。四種Burley 21菸草品種以種子生長於土壤中一個月後轉植於溫室中以溶液培養室於通風的培養液中一個月。這些品種為同基因者，除了該兩種低尼古丁位點，並有 Nicl/Nicl Nic2/Nic25 nicl/nicl Nic2/Nic2? Nicl/Nicl nic2/nic2? nicl/nicl nic2/nic2的基因型。從約廿株採收其根部以得每一種基因型並且將相同基因者放在一起以作RNA分離。總合透過含1.1M曱醛的1%瓊脂電泳所有自每一基因的 RNA ( 1//g)，並根據 Sambrook et al.(1989)轉化移至一尼龍薄膜。以IP的TobRD2 cDNA片段標記該薄膜，以密度 49 1258340 09541 pif 1 什測量TobRD2轉錄的相關強度。圖5 (實心柱）顯示四種基因型的各別相關的轉錄量（與Nid/Nid Nic2/Nic2比較）。該四種基因型的相關尼古丁含量（相較於Nicl/Nicl Nic2/Nic2)以斜線柱表示。圖5 (貫心柱）以圖示以在野生型Burjey 21 (Nicl/Nicl

Nic2/Nic2 )中所發現的含量來比較相關的怪態T〇bRE)2 mRNA 量。於 nicl/nicl nic2/nic2 雙突變體中的 TobRD2 mRNA量約為野生型菸草的25%。圖5 B更進一步比較該尼古丁的相關含量與本例証中所研究的菸草的相近同基因者比較（圖中所示實心柱為T〇bRD2之轉錄量；斜紋柱為尼古丁的含量）。於尼古丁含量與TobRD2轉錄量之間有一接近的相互關係。例言正4 缺少DNA序列碼：1的QPTase之細菌突變體的互補作用大腸桿菌菌株TH265為一缺乏對苯二酚鹽填酸核糖轉移酶（nad C-)的突變體，且因此不能於缺乏菸鹼酸的媒介上生長。TH265細胞被以一含有DNA序列碼：1的表現載體（PWS161)轉化，或僅以該現載體（ρΚΚ233 )轉化。將轉化細菌的生長與TH265 (pKK233 )轉化體以及未轉化的TH265 nad C-突變體的生長作比較。而比較該生長於 ME最小的媒介（缺少於驗酸）以及增加於驗酸的me最小媒介之上。該含有QPTase突變作用（nad C)之大腸桿菌為Dr. κ Τ· Hughes 所提供（Hughes et al·，J Bact· 175:479 (1993)。今玄 50 1258340 09541 pif 1 細胞被保持於L B媒介，且依照Sambrook et al (1989)戶斤述準備適用的細胞◦一表現質粒在Tac啟動基因的控制下於 pkk2233 (Brosius，1984)中與該 TobRD2cDNA 無性系組成結構。其組成結構後的質粒pWS161被轉化為TH265細胞。隨後可用或不用菸鹼酸（0.0002%)作補充將該轉化細胞置於表小媒介（Vogel以及Bonner，1956)i复脂計數板。將ΊΉ265細胞單獨以及與pkk2233轉化的TH265放置在，類似的盤上以作對照組。 _，如圖4所示之結果，只有與ONA序列碼：1轉化的 TH265在缺乏於鹼酸的媒體中生長。這些成果顯示序列碼：1的DNA表現於TH265菌細胞將該Nad C+表現塑授予這些細胞，並確認該序列編入QPTase。該T〇bRD2〆詞因此變岛NtQPTl。例証5 菸草植物的轉化作用序列碼：1的DNA於反取向中與一植物啟動基因 (CaMV 35S或TobRD2根部表皮特有啟動基因）可操作籲連結以製造兩種不同的DNA匣：CaMV35S啟動基因/反序列碼：1以及TobRD2啟動基因/反序列碼：i。一野生型菸草品種以及一低尼古丁菸草種被選作轉化，例如：野生型Burley 21菸草（Nid+/Nic2+)以及同種接合子的Nid-/N1C2- Burley 21。用每一個dNa &轉化每一品種的大量於草植物細胞。以土壤桿菌載體執行轉化作用，例如··一土壤桿菌雙載體帶Trborder序列以及該 51 1258340 〇954lplfl 素且被nos啟動基因（npt]j )控 nPtn基因（確定抗康黴制）。作衫者為基因改造邮草植物細胞的二G 長至成株並測其尼古丁含量；該基因改造對照==子集的尼古丁含量顯著呈現了較非基因改造 ◦株隨後被自殖並於下一代分析該改造基因的分離是二\子代。該Ri子代長到成株並自殖；於心子代間其改造基因的分離顯示Rl株為該改造基因之同種接合子。例証6 含減量尼古丁的菸草

Burley 21 LA的變種菸草被與雙體土壤桿菌載體 PYTY32轉化以製造一低尼古丁含量的菸草變種，是為

Vector 21-41。該雙載體 ΡΥΤΥ32 帶有 2.0 KBNtQPTl 根部表皮特有啟動基因趨動NtQPTl cDNA的反表現以及自根癌土壤桿菌T-DNA膽脂驗合成酶（nos) 3’的終止序列。此結構之可選標記為選自大腸桿菌Tn5可抵抗康徽素的新磷酸轉移酶（nptn );而該根癌土壤桿菌T-DNA中的nos 啟動基因指引該nptn的表現。以生長於含3⑻vg/ml康黴素Murashige-Skoog(MS)媒介的能力來選擇轉化的基因、組織及幼苗。Burley 21 LA為Burley 21的一種變體，以該變體與Burley 21比較確實具有減量的尼古丁（該Burley 21 LA的尼古含量是Burley 21的8 %詳見Legg et al·，Can J Genet Cytol， 13:287-91(1971); Legg et al.5 Jhered, 52 1258340 09541 pif 1 60:213-17(1969)) 〇以一百棵如以211^(丁()）轉化株之獨立{)竹¥32轉 ^株來自殖。自殖株（Tl)的子代含有康黴素的媒介上發芽並可分裂出抗康黴素的子代。自單點轉化作用分裂為3: ^ 的子代T!亦列入進一步之分析。以一微測技術對分裂3:1的凡子代之尼古丁含量做定性分析，收集約200 mg的新鮮菸葉並在} ml萃取溶液中研磨（该卒取溶液為1 ml乙酸加1〇〇 mi的水），再同種接合子以14,000 xg離心五分鐘並將懸浮物移至乾淨的試管中’在試管中再加入試劑·· 100//L的NH4OAC (5g/100ml 的 H2O + 50//L 的 Brij 35) ; 400//L 的苯胺（0·3 ml 緩衝的苯胺於100 ml的NH4OAC + 5〇vL的Brij 35)。於萃取溶液中10 mg/ml的尼古丁喬性砧溶液製備完成並稀釋以製作一標準系列以查看其刻度。所吸收的刻度為460 nm，且樣品中之尼古丁含量即可藉由該標準的刻度曲線來確定。 Τι子代的尼古丁含量比Burley 21 LA母代少10%，可用來自殖以生產出T2子代。以在含康黴素的媒介上發芽的丁2子代種子來確認其同種接合子，並從其中選100%抗康黴素者作無性系繁殖之用（即4:0分裂；異合子的子代為 3:1分裂）。以微測定性分析於同種接合子及異合子Τ2子代中的尼古丁含量，再次呈現出其尼古丁含量為少於Burley 21 LA母代的的10%將同種接合子T2子代的葉子送至

Southern Research and Testing Laboratory in Wilson，NC 以 53 i25834〇9 09541 pif 1 ίί-ί (GC/FID) 最少的尼古丁含量（^#41的同種接合子T2子代提供了

Vector 2K41 姓丄 PPm)，並稱為 “Vector 21-4r，。

A'' B 了乂叉自殖，以生產屮T工yJU 子代成長心定性及定量測其尼古丁 l T3子代。使A 叉自殖生產t;处 3里丁3子代亦可交尼古丁含量。以整批的14子代種子來種植並其 21 Vector 2,'41 Λ Buriey 如-古丁及去甲於驗？:該的4:==7, 總植物鹼辨識該vector 21_41 ’：=及去甲於鹼和 n.，ViW Λ 1 4丨及 π亥母代 Burley 21 LA。如下以曰ect〇r21-41的總植物驗濃度、尼古丁以及去甲於鹼的含量，母代Burley 21 LA都低得多。而該⑽沉2二的含糖量亦比Burley 21 LA明顯地降低。

Vector 21-41子代的田間測試可參考於Cemral Cr〇ps ResearchStation (Clayton，NC)的研究並與其母代 Budey 21 LA作比較。該試驗為三種處理（Vector 21-41，一僅含 NtQPTl啟動基因〔控制啟動基因〕的Burley 21 LA轉化種，以及未轉化的Burley 21 LA〔野生型〕），十五次重覆試驗，每次十株。測量並比較以下的耕種特性：自轉植至花期的曰數；花期該植株的高度；花期的葉片數量；收成；含尼古丁比率；含去曱菸驗比率；含總氮比率以及含糖量減低比率。

54 1258340 09541 pif 1 低尼古丁和亞硝酸胺的混合菸草以下例子說明數以混合來創造含特定量尼古丁和（或） TSNAs菸草製品的方法。數種混合的方法以自含極低量尼古丁以及TSNAs的種類來製備於草。使用一含低量尼古丁以及TSNAs種（測不到其尼古丁以及（或）TSNAs含量）的於草與傳統於草（例如·· Burley，該尼古丁含量為3〇,〇〇〇 ppm，TSNA 含量為 8,000 ppb ; Flue-Cured，該尼古丁含量為 20,000 ppm，TSNA 含量為 3,000 ppb 以及〇rienta卜該尼古丁含量為10,000 ppm，TSNA含量為l〇0ppbhi合製備於草’可製造出含有任何一種所需之尼古丁以及（或） TSNAs的於卓製品。具有不同尼古丁或TSNAs含量的於草製品可被利用於戒煙包，以及幫助抽煙者減少或甚至去除對尼古丁的依賴，並降低致癌率。例如：步驟1，菸草製品包含2 5 %具減量尼古丁 / T s N a 的菸草及75%傳統菸草；步驟2，菸草製品包含5〇%具減量尼古丁/TSNA的菸草及50%傳統菸草；步驟3，於草製品包含25%具減量尼古丁/TSNA的菸草及75%傳統於草，步驟4 ’於草製品包含100%具減量尼古丁/TSNa的於草及0%傳統菸草。一戒煙包含一種上述之混合於草製品以滿足消費者一個月之療程。意即若為每日一包煙的消費者，例如：一個月的戒煙包可提供每一階段七包，總共廿八包香煙。每一個戒煙包包含一說明書，該說明書特別以逐步程序引導消費者。當然，菸草製品含有特定量的尼古丁以及（或）TSNAs可做成傳統上所使用的形式（例如： 55 1258340 09541 pif 1 盒裝雪茄、包裝香煙、鼻嗅煙盒以及袋裝或扭曲的口嚼菸）以利習慣不同的消費者，選用自己所需要的尼古丁以及 (或）TSNAs含量。於此，許多其它含各種少量尼古丁/ TSNAs菸草的混合方法，如後述者僅做為指導熟悉此技藝者之可能方法。使用步驟1的含25%減量尼古丁/TSNAs菸草的混合菸草製品’以大約〇 ppm的尼古丁 / TSNAs與傳統 Burley、Flue-cured 以及〇rientai 混合製備一 25%/75%比例的菸草’以得一含22,5〇〇 ppm尼古丁、600 ppb TSNAs的 Burley，和一含 15,〇〇〇 ppm 尼古丁、225 ppb TSNAs 的 Flue-cured 以及一含 7,500 ppm 尼古丁、75 ppb TSNAs 的 Oriental混合菸草製品。類似步驟1的方法，使用步驟2 的含50%減量尼古丁/TSNAs菸草的混合菸草製品，以大約 0 ppm 的尼古丁/TSNAs 與傳統 Burley、Flue-cured 以及Oriental混合製備一 50%/50%比例的菸草，以得一含 15.000 ppm 尼古丁、4,000 ppb TSNAs 的 Burley，和一含 10.000 ppm 尼古丁、150 ppb TSNAs 的 Flue-cured 以及一含 5,000 ppm 尼古丁、50 ppb TSNAs 的 Oriental 混合於草製品。另外，使用步驟3的混合菸草製品，以大約0 ppm 的尼古丁/TSNAs 與傳統 Burley、Flue-cured 以及 Oriental 混合製備一 75%/25%比例的菸草，以得一含7,500 ppm尼古丁、2,000 ppb TSNAs 的 Burley，和一含 5,000 ppm 尼古丁、75 ppb TSNAs 的 Flue-cured 以及一含 2,500 ppm 尼古丁、25 ppb TSNAs的Oriental混合菸草製品。 56 !25834〇 09541 pifl 於草製品通常以數種不同菸草混合製成，而該數種不同於草又以不同的生長條件生長於全球各地，這點是值得肯定的優點。如成果所示該尼古丁及TSNAs的含量因作物的不同而有所差異。儘管如此，藉使用傳統的技術可輕易地決定一平均的尼古丁及TSna於作物中的含量使用來製造 —所需的混合製品。藉由調整每一種使用於技藝中的菸草量可以平衡其尼古丁以及（或）TSNAs含量，且同時考慮到口味及口感。在這方面…具有不同的尼古丁以及亞硝酸胺含㈣鱗種類的變種，亦可創的變化。个1 雖然本發明以數個較佳的實施例及例 μ限定本發明’任可熟習此技藝者，在不脫離本= 用神和範圍内，可作π 離本發明之精告心⑼、+、* 彡正。因此’本發明之保護範圍田視如後所奴申請專娜_界定者為準。軌圍【圖式簡單說明】圖1為形絲古T的生物合搞徑胸及Nlc2所控制者為QpTase 二：：酵素活性由移酶）以及PMTase( 丁二胺N—轉甲基酶^峨酸核糖轉圖2A顯示核酸序列（序列編碼' 有以大寫字母標示之編入序列的NtQpTl ^酸序列為具圖2B顯示以NtQPT1以及_Α編。鹽磷酸核糖轉移酶所推演出的胺基酸（，卓對笨二酚圖3將去除的NtQPTi胺基酸序 ^碼2)。相關的深紅紅螺菌、 57 1258340 09541 ριη 分枝桿菌、鼠傷寒沙門氏菌、大腸桿菌、人類以及糖單孢菌的序列排成一列。圖4顯示一大腸桿菌突變體將QPTase (TH265 )與 NtQpT 1以及cdNA連結的互補結果。細胞被一含NtQPT 1 的表現載體轉化；轉化的TH265細胞的生成表現了於極小媒介上的NtQPTl與菸鹼酸連結，而此連結即呈現NtQPTl 編入 QPTase。圖5比較了尼古丁含量與於Nicl以及Nic2菸草突變種、野生型 Burley 21 (Nicl/NiclNic2/Nic2)、Nicl-Burley 21 (nicl/nicl Nic2/Nic2)、Nic2-Burley 21 (Nicl/Nicl nic2 /nic2)以及 Nicl/Nic2- Burley 21 (nicl/nicl nic2/nic2) 中相關的恆態NtQPTl mRNA含量。實心柱顯示了 mRNA 轉錄量；斜線柱顯示尼古丁含量。 58

Claims

1258340 09541 pif 1 爲第91丨丨23丨7號中文專利範園無劃線修正本十、申請專利範圍： 1. 一種含減量尼古丁的熏製菸草，包括一種基因的改造以及一種包含亞硝替去曱菸鹼(NNN)、NAT、亞硝替新烟鹼(NAB)以及4-(亞硝替曱氨基）-1-(3-氮苯基）-1-丁酮 (NNK)的集體内含物，且該集體内含物的含量約少於 0.5//g/g，其中該基因的改造包括引入可抑制尼古丁之合成的一基因物質，該基因物質包括與一尼古丁生合成基因或其片段對應的序列，且該尼古丁生合成基因是選自丁二胺 N-轉曱基酶基因、N-轉曱丁二胺氧化酶基因、鳥胺酸脫羧酶基因、S腺苷曱硫氨酸合成酶基因、菸鹼醯胺腺嘌呤二核苷酸硫酸(NADH)脫氫酶基因、磷酸核糖磷酸氨基苯曱酸異構酶基因以及對苯二酚鹽磷酸核糖轉移酶(QPTase)基因所組成的族群。 2. 如申請專利範圍第1項所述之含減量尼古丁的熏製菸草，其中，該NNN 〇ΝΑΤ、NAB以及NNK的集體内含物的含量約少於〇.4/;i/g。 3. 如申請專利範圍第1項所述之含減量尼古丁的熏製菸草，其中，該NNN、NAT、NAB以及NNK的集體内含物的含量約少於〇.2//g/g。 4. 如申請專利範圍第1項所述之含減量尼古丁的熏製菸草，其中，該熏製菸草選自以Burley (伯利），Flue (煙管) 和Oriental (東方）種類之菸草所組成的族群。 5. 如申請專利範圍第4項所述之含減量尼古丁的熏製於草，其中，該熏製菸草為Burley (伯利）種。 59 1258340, Plfl 一 4 6.如申請專利範圍第4項所述之含減量尼古丁的熏製私草’其中，該熏製菸草為Flue (煙管)種。 ^ ^ 7·如申請專利範圍第4項所述之含減量尼古丁的熏製菸草，其中該熏製菸草為〇riental (東方)種。 ’、、' 衣 _—8·如申請專利範圍第1項所述之含減量尼古丁的熏製菸草，其中該尼古丁生合成基因之該片段的長度至少為: 三個核苷酸。， 1 —9，如申請專職圍第1項所述之含減量尼古丁的黨製於草’其中，該尼古丁生合成基因為對苯二雜鱗酸核ς 轉移酶(QPTase)基因。 ι〇·如申請專利範圍帛項中任—項所述之含減量尼古丁的熏製私草，其中尼古丁含量約少於Q 11·如申請專利範圍第U3項中任—項所述之含減量尼古丁的熏製菸草’其中尼古丁含量約少於0.5 mg/g。 12. 如申請專利範圍第丨至3項中任一項所述之尼古丁的熏製^草，其中尼古丁含量約少於〇lmg/g4里 13. —種於草製品，包括如申請專利範圍第1至I〕中任一項所述之含減量尼古丁的熏製菸草。、 14. -種混合於草製品，包括如申請專利範圍第1至 12項中任一項所述之含減量尼古丁的熏製菸草。 15. -種戒煙包’包括如申請專利範圍第彳至任一項所述之含減量尼古丁的熏製菸草。、 16. 如申，專利範㈣13項所述之於草製品，其自香煙、雪说、煙斗用之煙絲、嗅鼻煙、口嚼於草、尼古 60 12583^, ριπ 丁橡皮糖以及尼古丁錠所組成之族群。 17.如申請專利範圍第丨4項所述之混合於草製品，直中是選自香煙、雪祐、煙斗用之煙絲、嗅鼻煙、广、尼古丁橡皮糖以及尼古丁錠所組成之族群。、丨8·使用如申請專利範㈣1 1丨2項中任-項所述之含減量尼古丁的熏製菸草來製備菸草製、 …1曰9·使用如申請專利範圍第】S 12項中任—項所述之 3減=尼古丁的熏製菸草來製備可以降低使用菸草的人體

中的菸草亞硝酸胺或菸草亞硝酸胺代謝物含量的一菸草g 品。、、 20.使用如申請專利範圍第！至12項中任—項所述之含減量尼古丁的熏製菸草來製備吸煙用的一菸草製品，其所產生的間接吸入煙(sidestream sm〇ke)含減量的菸酸胺。、

21· —種包含Burley(伯利）菸草的改良菸草製品，其 =’该改良於草製品包括一 Burley種於草，該切種於草中NNN、NAT、NAB與NNK之總含量約少於〇.2//g/g，且該改良菸草製品中尼古丁之含量約少於〇 75 。 22·如申請專利範圍第丨5項所述之戒煙包，其包括由申請專利範圍第1至12項中任一項所述之含減量尼古;的熏製私草所製成的香煙，其中每根香煙中含（)·6ηιε左右的尼古丁。 23·如申請專利範圍第15項所述之戒煙包，其包括由申凊專利範圍第1至12項中任一項所述之含減量尼古丁的 61 12583^, ptfi '熏^草所製成的香煙’其中每根香煙尼古丁。 24·如申明專利|巳圍第ls項所述之戒煙包，其包括由申請^範圍第】至12項中任—項所述之含減量尼古丁的熏製於早所製成的香煙，其中每根香煙中尼古丁的含量不超過 0.05mg。 25.如申請專利範圍第21項所述之包含Buriey種菸草的改良於草製品，其中尼古丁的含量低於G.5mg/g。 26·如申凊專利範圍第21項所述之包含Burley種菸草 _ 的改良於草製品，其中尼古丁的含量低於〇 ln輪。 27 申請專利範圍第2丨項所述之包含BuHey種菸草的改良於草製品，其係為一種香煙，其中每根香煙的尼古丁含量低於0.6mg。 28. 如申請專利範圍第2丨項所述之包含Bur|ey種菸草的改良私草製品，其係為一種香煙，其中每根香煙的尼古丁含量低於0.3mg。 29. 如申請專利範圍第2]項所述之包含BLlr丨ey種菸草的改良私草製品，其係為一種香煙，其中每根香煙的尼古丁含量低於0.1 mg。 30· —種含減量尼古丁的熏製菸草，包括一基因改造，以及包含亞硝替去曱菸鹼(NNN)、ΝΑΤ、亞硝替新烟鹼 (ΝΑβ)與4-(亞硝替曱氨基)-苯基)小丁酮(ΝΝΚ)的一集體内含物，該集體内含物在由該熏製菸草所產生的直接吸入煙(mainstream smoke)中的含量為0〜5.0//g/g左右， 62 I25834pipir 該基因的改造包括弓丨人可抑制尼古丁之合成的—基因物質，該基因物質包括與—尼古了生合成基因或其片段對應的序列’且該尼古丁生合成基因是選自丁二胺N—轉甲基酶基因、Ν-轉曱丁二胺氧化酶基因、鳥胺酸脫賴基因、s 腺苦曱硫聽合絲基H舰麟$吟二料酸硫酸 (NADH)脫氫酶基因、_酸核㈣酸氨基笨曱酸異構ς基因以及對苯二s分鹽磷酸核糖轉移酶(QPTase)基因所組成二族群。

— 如申請專利範圍第3〇項所述之含減量尼古丁的熏製菸草，其中該集體内含物在該直接吸入煙中的含量為 0〜4_〇Ag/g 左右。。— 如申請專利範圍第30項所述之含減量尼古丁的熏 i於草，其中该集體内含物在該直接吸入煙中的含量為 0〜3.0//g/g 左右。。如巾請專利範圍第3G項所述之含減量尼古丁的熏、製菸草，其中該集體内含物在該直接吸入煙中的含量為 0〜2.0/zg/g 左右。

,/·如申請專利範圍第30項所述之含減量尼古丁的熏製於草，其中§玄集體内含物在該直接吸入煙中的含量為 0〜1.0//g/g 左右。 35. 如申請專利範圍第30項所述之含減量尼古丁的熏製私草，其中邊集體内含物在該直接吸入煙中的含量為 0〜0.5//g/g 左右。 36. 如申請專利範圍第30項所述之含減量尼古丁的熏 63 12583傲 41 pif ! 泌t草，其中泫集體内含物在該直接吸入煙旦 0〜〇々/g/g左右。馮制^如^請專纖，3G項所述之含減量尼古丁的熏取於早，其中該集體内含物在該直接吸入旦 0〜〇.〇i//g/g左右。 m里為 =如巾料纖_ 3Q項賴之麵4尼^ 丁的熏衣於草，其中該於草選自於Burley (伯利），Flue (煙管 Oriental (東方）種菸草所組成的族群。 39.如申請專利範圍第38項所述之含減量尼古丁的重製於草，其中該菸草為Burley (伯利)種。 …、 "40·如申請專利範圍第38項所述之含減量尼古丁的重製菸草，其中該熏製菸草為Flue (煙管)種。 …、 ,41·如申請專利範圍第30項所述之含減量尼古丁的重製於草，其巾該尼古T生合成基因之該片段為十三個核苷酸。又王乂马 ,42·如巾請專利範圍帛30項所述之含減量尼古 =於草’其巾献古丁生合成基因是對笨Lll酸核糖轉移酶(QPTase)基因。 43.如申請專利範圍第30項所述之含減量尼古 ^草，其中該尼古了生合絲因是丁q$N_轉甲基酶基因0 44·一種菸草製品，包括如申請專利範圍第％至c項中任一項所述之含減量尼古丁的熏製菸草。、 45.-種混合於草製品，包括如申請專利範圍第3()至 64 9541 pifl 1258340 43項令任一項所述之含減量尼古丁的熏製菸草。 46·—種戒煙包，包括如申請專利範圍第刈至43項中任一項所述之含減量尼古丁的熏製菸草。、 47·如申請專利範圍第44項所述之菸,草製品，其自香煙、雪说、煙斗用之煙絲、嗅鼻煙、口嚼终草、丁橡皮糖以及尼古丁錠所組成之族群。 β、e48·如申請專利範圍第45項所述之混合菸草製品，其疋遙自香煙、雪&、煙斗用之煙絲、嗅鼻煙、口嘱於草、、尼古丁橡皮糖以及尼古丁錠所組成之族群。 49·一種使於草製品的菸草亞硝酸胺減量的方法，包括使用如申請專利範圍第3Q至43項中任—項所述之尼古丁的熏製菸草來製備該菸草製品。使用如申請專利範圍第30至43項中任一項所述之含減量尼古丁的熏製菸草來製備一菸草製品。、一 5丨·一種使於草製品對使用菸草的人體造成較少的菸早亞頌酸胺或料亞顧胺代職含量的方法，包括使用如申請專利範圍第3Q至43項中任—項所述之含減量尼古丁的熏製菸草來製備該菸草製品。〇 UU 八、、=·使用如申請專利範圍第30至43項中任一項所述之各ί ΐ尼古丁的熏製菸草來製備可降低使用菸草的人體中，於草亞硝酸胺或菸草亞硝酸胺代謝物含量的一菸草製 4 一53·一種使於草製品的直接吸入煙與間接吸入煙中的於草亞_胺減量的方法，包括❹如t請專纖圍第3〇 65 12583氣 r 至43項中任一項所述之含減量尼古丁的熏製菸草來製備該菸草製品，該菸草製品經高溫分解所產生的直接吸入煙與間接吸入煙中皆含減量的菸草亞硝酸胺。 54.使用如申請專利範圍第30至43項中任一項所述之含減量尼古丁的熏製菸草來製備吸煙用的一菸草製品，其所產生的間接吸入煙中含減量的菸草亞硝酸胺。 5 5. —種戒煙包，包括：含尼古丁的一第一菸草製品；以及含尼古丁的一第二菸草製品，該第二菸草製品的尼古丁含量低於該第一菸草製品的尼古丁含量。 56. 如申請專利範圍第55項所述之戒煙包，其中該第一菸草製品與該第二菸草製品中有一者含有經過基因改造的菸草，該基因的改造包括引入可抑制尼古丁之合成的一基因物質，該基因物質包括與一尼古丁生合成基因或其片段對應的序列，且該尼古丁生合成基因是選自丁二胺N-轉曱基酶基因、N-轉曱丁二胺氧化酶基因、鳥胺酸脫羧酶基因、S腺苷曱硫氨酸合成酶基因、菸鹼醯胺腺嘌呤二核苷酸硫酸(NADH)脫氫酶基因、磷酸核糖磷酸氨基笨曱酸異構酶基因以及對苯二酚鹽磷酸核糖轉移酶(QPTase)基因所組成的族群。 57. 如申請專利範圍第55項所述之戒煙包，其包括一包香煙。 58. 如申請專利範圍第55項所述之戒煙包，其包括數包香煙。 66 I25834Q 如申請專利範圍第55項所述之戒煙包，其中該第草製品與該第二於草製品中有—者含有如申請專利範圍f到43項中任一項所述之含減量尼古丁的熏製菸草。 6〇·如申請專利範圍第56項所述之戒煙包其中該尼古丁生合餘因之該>5段的長度至少為 13個核發酸。士丁專利範㈣56項所述之戒煙包，其中該尼因。口；土因是對笨二酚鹽磷酸核糖轉移酶(QPTasc)基

古：

67 1258340 09541 pif 1 七、指定代表圖： (一）本案指定代表圖為：圖（5 )。 (二) 本代表圖之元件符號簡單說明·· 八、本案若有化學式時，請揭示最能顯示發明特徵的化學式： 4