CN113272434A - 用于修饰植物的生物碱含量的方法和手段 - Google Patents

Abstract

本发明提供了用于调节（例如降低）植物（例如烟草植物）的生物碱含量的方法，所述方法包括通过调节（例如降低）至少一种犰狳重复蛋白的表达来修饰所述植物。本发明还提供了犰狳重复蛋白用于调节植物的生物碱含量的用途，以及可根据本发明获得的烟草细胞、植物、植物繁殖材料、收获的叶片、加工烟草或烟草产品。

Description

用于修饰植物的生物碱含量的方法和手段

技术领域

本发明涉及调节植物或其部分的生物碱含量，例如尼古丁含量的方法。本发明还扩展到调节由基因编码的多肽表达的方法，所述多肽调节植物内的生物碱含量。另一方面，本发明提供了调节基因表达的方法，所述基因编码调节植物内的生物碱含量的多肽。本发明还扩展到可以用于调节多肽的构建体，用这种构建体转化的植物细胞以及转基因植物本身。本发明还涉及从这种转基因植物收获的叶片的用途，所述转基因植物已由用于调节生物碱含量的遗传构建体进行转化，以及包含这种叶片的吸烟制品（例如可燃吸烟制品）。

背景技术

生物碱是一组天然存在的化合物，其主要含有碱性氮原子，并且由大量各种生物包括细菌、真菌、植物和动物产生。

生物碱可以根据碳骨架例如吲哚、异喹啉和吡啶样的相似性进行分类。吡啶衍生物是一类单体生物碱；这个类别包括简单的吡啶衍生物、多环缩合和非缩合吡啶衍生物以及倍半萜吡啶衍生物。实例是尼古丁、降烟碱、新烟碱、米喔斯明和新烟草碱。

生物碱的大多数已知的生物学功能都与保护相关。神经活性分子如咖啡因、柯卡因、吗啡和尼古丁，充当针对侵入的捕食者的防御化合物。这些生物碱的累积是监控基因表达、酶活性和生物碱浓度的信号转导级联的结果。植物中的生物碱含量的精细调节涉及负反馈环和降解途径。

尼古丁天然存在于几个植制品种中，但在烟草植物中以最高水平发现。栽培烟草产生总干重2-4%的生物碱。尼古丁在野生和栽培烟草属（Nicotiana）物种中产生，并且它在针对食草动物和昆虫的植物防御中起重要作用（Voelckel等人2001，引入本文作为参考），占总生物碱含量的~90%。剩余10%的生物碱库主要由结构上有关的化合物降烟碱、新烟草碱、新烟碱和假氧化尼古丁（pseudoxynicotine）（PON）构成。

烟草中生物碱含量的调节是复杂的。几种因素包括基因型、环境、施肥和农学实践（例如打顶）影响烟草植物中的生物碱水平。尼古丁生物合成的一些关键调节物是充分表征的，例如在这个途径中起关键作用的腐胺N-甲基转移酶（PMT）被乙烯应答因子（ERF）超家族- 烟草基因组中最大的转录因子家族 - 的成员激活（引入本文作为参考的Rushton等人，2008）。诱导生物碱生物合成的其它转录因子属于MYC2-样碱性螺旋-环-螺旋（bHLH）家族。MYC2-样bHLHs通过Gbox-介导的生物碱结构基因的结合和激活直接调节生物碱水平，并且通过ERFs的激活间接调节生物碱水平。

修饰植物（例如烟草）中的生物碱含量可以具有几个商业优点。例如，降低植物中的总生物碱含量可以增加所述植物作为生物量资源的价值。例如，修饰生物碱含量可以包括减少烟草植物中的生物碱含量，例如尼古丁含量。鉴于 “尼古丁最高限度（nicotineceiling）”，即烟草产品中的平均尼古丁上限的潜在调节，具有减少的尼古丁的烟草植物和产品可能是期望的。另一方面，增加植物例如烟草植物中的生物碱含量，可以帮助保护植物以抗昆虫和食草动物。仍然需要植物及其制备方法，所述植物在具有改善的商业上期望的性状的情况下具有调节的生物碱含量，例如具有调节的尼古丁含量。

在收获后的叶片调制（curing）过程中，吡啶生物碱与亚硝化种类之间的反应导致烟草特有亚硝胺（TSNAs）的形成。降烟碱和PON分别是TSNAs NNN和NNK的前体。减少降烟碱和PON的产生和累积具有重要意义。尼古丁脱甲基酶基因的CYP82E家族是尼古丁向降烟碱转化的主要调节物，并且改变其活性或累积导致NNN水平降低。然而，迄今为止，尚未鉴定出负责产生PON的酶或基因。

如实施例中所述的，发明人设法研究负责生物碱合成的基因，目的是调节植物中的生物碱含量，例如降低烟草植物中的尼古丁含量。

发明内容

已令人惊讶地发现，如本文教导的通过调节犰狳重复蛋白（armadillo repeatprotein）的表达或通过修饰编码犰狳重复蛋白的至少一种基因的核酸序列，可以调节植物的生物碱含量和/或TSNA含量或TSNA前体含量。如本文教导的编码犰狳重复蛋白的基因充当尼古丁生物合成的正调节物。Nitab4.5_0002810g0020.2在本文中被教导为栽培烟草中尼古丁、降烟碱和PON的正调节物。Nitab4.5_0002810g0020.2编码犰狳（Arm）重复蛋白。这些蛋白质含有大约40个氨基酸的简并蛋白质序列基序的串联拷贝，其形成保守的三维结构。这些蛋白质的功能通常由Arm结构域外的特征性序列决定。

根据本发明，可以生产具有调节的生物碱含量以及由烟草产品的消费者所追求的商业上期望性状的烟草产品。在一些情况下，消费者可能期望具有低水平的生物碱含量，例如低水平的尼古丁含量的产品。

本发明可能在植物分子农业领域中特别有用，其中植物（例如烟草和其它烟草属物种）用于生产蛋白质、肽和代谢物，例如用于生产治疗剂和药物如抗生素、病毒样颗粒、或营养药（neutraceuticals）或小分子。在EU提供资金的名为PharmPlant的项目中，烟草已用于开发HIV-中和抗体，并且加拿大的Medicago Inc.已参与基于烟草的平台，用于生产用于流感疫苗制造的病毒样颗粒。

因此，根据本发明的植物可以用于分子农业，以减少或消除尼古丁、降烟碱、PON和/或其它尼古丁生物碱的存在。低尼古丁植物或根状茎（rootsock）的使用在分子农业中是有益的，并且将减少与纯化有关的下游加工成本。

在其它情况下，可能期望生产具有高生物碱水平如高水平的尼古丁含量的植物，从而使得可以从烟草植物中纯化尼古丁，以生产纯尼古丁产品例如用于利用含有尼古丁的液体的设备（例如电子烟（e-cigarettes））或烟草加热设备内。例如，具有含有高水平的尼古丁的叶片的植物的生产可以减少用于生产用于电子烟的电子烟液（e-liquids）的尼古丁提取成本。

本发明人已令人惊讶地确定了通过调节编码犰狳重复蛋白的基因（其充当烟草中尼古丁的正调节物）的表达或核酸序列或通过修饰编码犰狳重复蛋白的至少一种基因（其充当烟草中尼古丁的正调节物）的核酸序列，用于调节植物（例如烟草植物）的生物碱含量，例如尼古丁含量的方法。植物（例如烟草植物）的生物碱含量（例如尼古丁含量）可以通过降低编码犰狳重复蛋白的基因的表达或通过修饰编码犰狳重复蛋白的至少一种基因的核酸序列（例如通过破坏犰狳重复结构域）得到降低，或者可以通过增加编码犰狳重复蛋白的基因的表达或通过修饰编码犰狳重复蛋白的至少一种基因的核酸序列（例如通过增加犰狳重复结构域的结合亲和力）得到增加。在本发明之前，尚不知道如本文所述的编码犰狳重复蛋白的基因表达的调节或编码犰狳重复蛋白的至少一种基因的核酸序列的修饰可以用于调节生物碱含量。

在一个方面，提供了调节（例如降低）植物或其部分或细胞培养物的生物碱含量的方法，所述方法包括通过调节编码犰狳重复蛋白的至少一种基因的表达或通过修饰编码犰狳重复蛋白的至少一种基因的核酸序列，来修饰所述植物或细胞培养物。

在另一个方面，提供了调节（例如降低）烟草植物或其植物部分中的烟草特有亚硝胺（TSNA）或TSNA前体含量的方法，所述方法包括通过调节编码犰狳重复蛋白的至少一种基因的表达或通过修饰编码犰狳重复蛋白的至少一种基因的核酸序列，来修饰所述植物或细胞培养物。

在进一步的方面，提供了编码犰狳重复蛋白的至少一种基因用于调节细胞或植物或其部分或细胞培养物的生物碱含量的用途。

在又另一个方面，提供了用于生产具有调节的（例如降低的）生物碱含量的植物或其部分、细胞培养物、植物繁殖材料、叶片、切割的收获的叶片、加工叶片或切割且加工的叶片的方法，所述方法包括：修饰所述植物或细胞培养物，以调节编码犰狳重复蛋白的至少一种基因的表达；或修饰编码犰狳重复蛋白的至少一种基因的核酸序列。

在一个方面，本发明提供了调节（例如降低）植物或其部分或细胞培养物的生物碱含量的方法，所述方法包括通过以下修饰所述植物或细胞培养物：调节（例如降低）至少一种犰狳重复蛋白的表达，所述至少一种犰狳重复蛋白：

a）包含如以下中所示的氨基酸序列：SEQ ID No. 1或者其功能变体或功能片段或直向同源物，或者与SEQ ID No. 1具有至少80%同一性的序列；或

b）由以下编码：如SEQ ID No. 2或3中所示的核苷酸序列；或者SEQ ID No. 2或3的功能变体或功能片段或直向同源物；或者与SEQ ID No. 2或3具有至少80%同一性的核酸序列。

在进一步的方面，本发明提供了调节（例如降低）烟草植物或其植物部分中的烟草特有亚硝胺（TSNA）或TSNA前体含量的方法，所述方法包括通过以下修饰所述植物或细胞培养物：调节（例如降低）至少一种犰狳重复蛋白的表达，所述至少一种犰狳重复蛋白：

a）包含如以下中所示的氨基酸序列：SEQ ID No. 1或者其功能变体或功能片段或直向同源物，或者与SEQ ID No. 1具有至少80%同一性的序列；或

b）由以下编码：如SEQ ID No. 2或3中所示的核苷酸序列；或者SEQ ID No. 2或3的功能变体或功能片段或直向同源物；或者与SEQ ID No. 2或3具有至少80%同一性的核酸序列。

在另一个方面，本发明提供了编码犰狳重复蛋白的至少一种基因用于调节细胞或植物或其部分或细胞培养物的生物碱含量的用途；其中所述犰狳重复蛋白：

a）包含如以下中所示的氨基酸序列：SEQ ID No. 1或者其功能变体或功能片段或直向同源物，或者与SEQ ID No. 1具有至少80%同一性的序列；或

b）由以下编码：如SEQ ID No. 2或3中所示的核苷酸序列；或者SEQ ID No. 2或3的功能变体或功能片段或直向同源物；或者与SEQ ID No. 2或3具有至少80%同一性的核酸序列。

本发明还提供了用于生产具有调节的（例如降低的）生物碱含量的植物或其部分、细胞培养物、植物繁殖材料、叶片、切割的收获的叶片、加工叶片或切割且加工的叶片的方法，所述方法包括修饰所述植物或细胞培养物，以：调节（例如降低）至少一种犰狳重复蛋白的表达，所述至少一种犰狳重复蛋白：

a）包含如以下中所示的氨基酸序列：SEQ ID No. 1或者其功能变体或功能片段或直向同源物，或者与SEQ ID No. 1具有至少80%同一性的序列；或

b）由以下编码：如SEQ ID No. 2或3中所示的核苷酸序列；或者SEQ ID No. 2或3的功能变体或功能片段或直向同源物；或者与SEQ ID No. 2或3具有至少80%同一性的核酸序列。

适当地，编码犰狳重复蛋白的至少一种基因可以编码如以下中所示的氨基酸序列：SEQ ID No. 1或者其功能变体或功能片段或直向同源物，或者与SEQ ID No. 1具有至少80%同一性的序列；或者其中编码犰狳重复蛋白的至少一种基因包含如SEQ ID No. 2或3中所示的核酸序列；或者SEQ ID No. 2或3的功能变体或功能片段或直向同源物；或者与SEQ ID No. 2或3具有至少80%同一性的核酸序列。

适当地，与尚未进行修饰以：调节至少一种犰狳重复蛋白的表达；或修饰编码犰狳重复蛋白的至少一种基因的核酸序列的植物或细胞培养物相比，生物碱含量可以是调节的（例如降低的）。

在进一步的方面，本发明提供了植物或其部分或细胞培养物，其已进行修饰，以实现与未修饰的植物或未修饰的细胞培养物相比，在生物碱含量中的调节（例如降低），其中所述修饰是至少一种犰狳重复蛋白的表达的调节，所述至少一种犰狳重复蛋白：

a）包含如以下中所示的氨基酸序列：SEQ ID No. 1或者其功能变体或功能片段或直向同源物，或者与SEQ ID No. 1具有至少80%同一性的序列；或

b）由以下编码：如SEQ ID No. 2或3中所示的核苷酸序列；或者SEQ ID No. 2或3的功能变体或功能片段或直向同源物；或者与SEQ ID No. 2或3具有至少80%同一性的核酸序列。

在一个方面，提供了植物或其部分或细胞培养物，其已进行修饰，以实现与未修饰的植物或未修饰的细胞培养物相比，在生物碱含量中的调节（例如降低），其中所述修饰是编码犰狳重复蛋白的至少一种基因的表达的调节、编码犰狳重复蛋白的至少一种基因、或编码犰狳重复蛋白的至少一种基因的核酸序列的修饰；其中所述犰狳重复蛋白包含如以下中所示的氨基酸序列：SEQ ID No. 1或者其功能变体或功能片段或直向同源物，或者与SEQID No. 1具有至少80%同一性的序列；或者其中编码犰狳重复蛋白的至少一种基因包含如SEQ ID No. 2或3中所示的核酸序列；或者SEQ ID No. 2或3的功能变体或功能片段或直向同源物；或者与SEQ ID No. 2或3具有至少80%同一性的核酸序列。

在进一步的方面，提供了从根据本发明的植物或者从通过根据本发明的方法生产的植物或细胞培养物可获得（例如获得）的植物繁殖材料。

在进一步的方面，提供了根据本发明的方法或用途、或根据本发明的植物或其部分或细胞培养物、或根据本发明的植物繁殖材料，其中与尚未进行修饰以调节编码犰狳重复蛋白的至少一种基因的表达或修饰编码犰狳重复蛋白的至少一种基因的核酸序列的植物或细胞培养物相比，所述植物的生物碱含量是降低的。

适当地，与尚未进行修饰以调节编码犰狳重复蛋白的至少一种基因的表达的植物或其部分或细胞或细胞培养物相比，编码犰狳重复蛋白的至少一种基因的表达可以是降低的。

适当地，与尚未进行修饰以调节至少一种犰狳重复蛋白的表达或修饰编码犰狳重复蛋白的至少一种基因的核酸序列的植物相比，植物或其部分或细胞或细胞培养物的生物碱含量可以是增加的。

适当地，植物可以进行修饰，以增加编码犰狳重复蛋白的至少一种基因的表达或修饰至少一种犰狳重复蛋白的核酸序列；并且与尚未进行修饰以调节至少一种犰狳重复蛋白的表达的植物或细胞培养物相比，所述植物或细胞培养物显示出增加的生物碱含量。

适当地，植物或细胞培养物的总生物碱含量可以是调节的。适当地，选自尼古丁、降烟碱、PON、新烟碱、米喔斯明和新烟草碱的一种或多种生物碱的含量可以是调节的（例如降低的），优选地，尼古丁、降烟碱和/或PON的含量是调节的（例如降低的）。

在一个方面，植物或植物细胞来自茄科（Solanaceae）。

适当地，植物或植物细胞可以来自茄属（Solanum）。

适当地，植物或植物细胞可以来自烟草属（Nicotiana）。

适当地，尼古丁含量可以是调节的。适当地，尼古丁含量可以是降低的。

在一个方面，提供了根据本发明的方法或用途、根据本发明的植物或其部分或细胞培养物、或根据本发明的植物繁殖材料，其中编码犰狳重复蛋白的至少一种基因包含如以下中所示的氨基酸序列：SEQ ID No. 1或者其功能变体或功能片段或直向同源物，或者与SEQ ID No. 1具有至少80%同一性的序列；或者其中编码犰狳重复蛋白的至少一种基因包含如SEQ ID No. 2或3中所示的核酸序列；或者SEQ ID No. 2或3的功能变体或功能片段或直向同源物；或者与SEQ ID No. 2或3具有至少80%同一性的核酸序列。

在进一步的方面，提供了根据本发明的方法或用途、根据本发明的植物或其部分或细胞培养物、或根据本发明的植物繁殖材料，其中编码犰狳重复蛋白的额外的基因是调节的，其中所述额外的基因包含如SEQ ID No. 2或3中所示的核苷酸序列；或者SEQ ID No.2或3的功能变体或功能片段或直向同源物；或者与SEQ ID No. 2或3具有至少80%同一性的核酸序列。

在进一步的方面，本发明提供了编码犰狳重复蛋白的核苷酸序列来选择具有调节的（例如降低的）生物碱含量和/或调节的（例如降低的）烟草特有亚硝胺（TSNA）或TSNA前体含量的植物的用途，所述犰狳重复蛋白：

a）包含如以下中所示的氨基酸序列：SEQ ID No. 1或者其功能变体或功能片段或直向同源物，或者与SEQ ID No. 1具有至少80%同一性的序列；或

b）由以下编码：如SEQ ID No. 2或3中所示的核苷酸序列；或者SEQ ID No. 2或3的功能变体或功能片段或直向同源物；或者与SEQ ID No. 2或3具有至少80%同一性的核酸序列。

在一个方面，提供了根据本发明的植物或其部分或细胞培养物、或者通过本发明的方法生产的植物培育植物的用途。

在另一个方面，提供了根据本发明的植物或其部分或细胞培养物、或者通过本发明的方法生产的植物用于生产产品的用途。

在又另一个方面，提供了根据本发明的植物或其部分、或者通过根据本发明的方法生产的植物种植作物的用途。

在另一个方面，提供了根据本发明的植物或其部分、或者根据本发明生产的植物生产叶片的用途。

在另一个方面，提供了收获的叶片，其是根据本发明的植物的、或者可得自（例如得自）（或得自）从根据本发明的繁殖材料繁殖的植物、或者可得自（例如得自）（或得自）通过根据本发明的用途获得的植物、或者可得自（例如得自）（或得自）通过根据本发明的方法生产的植物。

在一个方面，植物的收获的叶片是切割的收获的叶片。

在另一个方面，提供了加工叶片，优选加工烟草叶片，优选不能存活的加工烟草叶片，其：

可得自（例如得自）（或得自）从根据本发明的用途可获得（例如获得）的植物；

通过加工根据本发明的植物可获得（例如获得）（或获得）；

可得自（例如得自）（或得自）从根据本发明的植物繁殖材料繁殖的植物；或

通过加工根据本发明的植物的收获的叶片可获得（例如获得）（或获得）；或

可得自（例如得自）（或得自）通过根据本发明的方法生产的植物。

在一个方面，叶片通过调制、发酵、巴氏灭菌或其组合进行加工。

适当地，加工叶片可以是切割的加工叶片。

在另一个方面，提供了由根据本发明的植物或其部分或其提取物制成的调制后的烟草材料。

在进一步的方面，提供了烟草掺合物，其包含根据本发明的所述调制后的烟草材料。

在另一个方面，提供了烟草工业产品，其由以下进行制备：

根据本发明的烟草植物或其部分，或者根据本发明的烟草细胞培养物；

从根据本发明的烟草植物繁殖材料繁殖的烟草植物或其部分；

根据本发明植物的收获的叶片，其中所述植物是烟草；

根据本发明的加工叶片，其中所述植物是烟草；

或

通过根据本发明的方法生产的植物。

在一个方面，烟草产品是可燃吸烟制品。

在另一个方面，烟草产品是无烟烟草产品。

适当地，烟草产品可以是非可燃气雾剂供应系统，例如烟草加热设备或气雾剂生成设备。

在一个方面，提供了根据本发明的烟草细胞用于调节细胞培养物中的生物碱含量的用途。

在一个方面，提供了可燃吸烟制品、非可燃气雾剂供应系统、无烟烟草产品或烟草加热设备，其包括根据本发明的植物或其部分或其提取物（例如烟草提取物）、或根据本发明的烟草细胞培养物；或根据本发明的调制后的烟草材料；或根据本发明的烟草掺合物。

在进一步的方面，提供了编码犰狳重复蛋白的至少一种基因的核苷酸序列来选择具有调节的（例如降低的）生物碱含量和/或调节的（例如降低的）烟草特有亚硝胺（TSNA）或TSNA前体含量的植物的用途，优选地，其中所述犰狳重复蛋白的序列选自：SEQ ID No. 1或者其功能变体或功能片段或直向同源物，或者与SEQ ID No. 1具有至少80%同一性的序列；或者其中编码犰狳重复蛋白的至少一种基因包含如SEQ ID No. 2或3中所示的核酸序列；或者SEQ ID No. 2或3的功能变体或功能片段或直向同源物；或者与SEQ ID No. 2或3具有至少80%同一性的核酸序列。

在另一个方面，本发明提供了在核苷酸序列中携带可遗传突变的植物的突变体，所述核苷酸序列：

a）包含如以下中所示的氨基酸序列：SEQ ID No. 1或者其功能变体或功能片段或直向同源物，或者与SEQ ID No. 1具有至少80%同一性的序列；或

b）由以下编码：如SEQ ID No. 2或3中所示的核苷酸序列；或者SEQ ID No. 2或3的功能变体或功能片段或直向同源物；或者与SEQ ID No. 2或3具有至少80%同一性的核酸序列，

其中所述可遗传突变调节（例如降低）犰狳重复蛋白的表达，并且其中相对于并不携带所述遗传突变的可比较植物，所述突变植物具有调节的（例如降低的）生物碱含量和/或调节的烟草特有亚硝胺（TSNA）或TSNA前体含量。

在一个方面，提供了在编码犰狳重复蛋白的至少一种基因的核苷酸序列中携带可遗传突变的植物的突变体，优选地，其中所述基因选自：SEQ ID No. 2或3；或者其功能变体或功能片段或直向同源物；或者与SEQ ID No. 2或3具有至少80%同一性的核酸序列；其中所述可遗传突变调节（例如降低）编码犰狳重复蛋白的至少一种基因的表达或修饰编码犰狳重复蛋白的至少一种基因的核酸序列；并且其中相对于并不携带所述遗传突变的可比较植物，所述突变植物具有调节的（例如降低的）生物碱含量和/或调节的烟草特有亚硝胺（TSNA）或TSNA前体含量。

在进一步的方面，提供了根据本发明携带可遗传突变的突变植物的后代或种子。

在进一步的方面，本发明提供了由植物产生的收获的叶片、加工叶片或调制后的烟草材料，所述植物包含在核苷酸序列中的修饰，所述核苷酸序列：

a）包含如以下中所示的氨基酸序列：SEQ ID No. 1或者其功能变体或功能片段或直向同源物，或者与SEQ ID No. 1具有至少80%同一性的序列；或

b）由以下编码：如SEQ ID No. 2或3中所示的核苷酸序列；或者SEQ ID No. 2或3的功能变体或功能片段或直向同源物；或者与SEQ ID No. 2或3具有至少80%同一性的核酸序列；

其中所述修饰调节（例如降低）编码犰狳重复蛋白的至少一种基因的表达，并且其中相对于在编码犰狳重复蛋白的至少一种基因中并不携带所述修饰的可比较植物，所述植物具有调节的（例如降低的）生物碱含量和/或调节的烟草特有亚硝胺（TSNA）或TSNA前体含量。

在一个方面，提供了由植物产生的收获的叶片、加工叶片或调制后的烟草材料，所述植物包含在编码犰狳重复蛋白的至少一种基因的核苷酸序列中的修饰，其中所述至少一种基因选自：SEQ ID No. 2或3；或者其功能变体或功能片段或直向同源物；或者与SEQ IDNo. 2或3具有至少80%同一性的核酸序列；其中所述修饰调节（例如降低）编码犰狳重复蛋白的至少一种基因的表达或修饰编码犰狳重复蛋白的至少一种基因的核酸序列；并且其中相对于在编码犰狳重复蛋白的至少一种基因中并不携带所述修饰的可比较植物，所述植物具有调节的（例如降低的）生物碱含量和/或调节的烟草特有亚硝胺（TSNA）或TSNA前体含量。

在进一步的方面，提供了如本文参考说明书和附图所述的方法、叶片、植物、植物繁殖材料、收获的叶片、加工烟草、烟草产品、用途或其组合。

附图说明

现在将参考附图仅仅举例来说描述本发明的实施方案，其中：

图1显示了表达Nitab4.5_0002810g0020.2（SEQ ID No. 3）的5周龄TN90叶片的尼古丁、降烟碱和PON含量。尼古丁、降烟碱和PON含量相对于对照表示，并且包含通过t-检验分析的三个生物学重复实验。值显示为平均值±SEM。星号指示P值≤0.001的统计显著性。

图2显示了表达构建体的5周龄TN90叶片的尼古丁、降烟碱和PON含量，所述构建体通过病毒诱导性基因沉默来沉默Nitab4.5_0002810g0020.2（SEQ ID No. 3）。尼古丁、降烟碱和PON含量相对于对照表示，并且包含通过t-检验分析的三个生物学重复实验。值显示为平均值± SEM。星号指示P值≤ 0.001的统计显著性。

图3显示了表达下述构建体的5周龄TN90叶片的生物碱含量：OE = 超表达Nitab4.5_0002810g0020.2；DeltaArm = 表达Nitab4.5_0002810g0020.2序列，所述序列已进行修饰以缺失犰狳重复结构域（Arm）。生物碱含量相对于对照表示，并且包含通过单因素ANOVA和Tukey氏多重比较事后检验（Tukey’s multiple-comparison post-test）分析的三个生物学重复实验。值显示为平均值± SEM。星号指示P值≤ 0.001的统计显著性。

图4显示了表达下述构建体的5周龄TN90叶片的生物碱含量：OE = 超表达Nitab4.5_0002810g0020.2；As = Nitab4.5_0002810g0020.2反义。生物碱含量相对于对照表示，并且包含通过单因素ANOVA和Tukey氏多重比较事后检验分析的三个生物学重复实验。值显示为平均值± SEM。星号指示P值≤ 0.001的统计显著性。

图5显示了表达下述构建体的5周龄TN90叶片的生物碱含量：OE = 超表达Nitab4.5_0002810g0020.2；amiRNA = SEQ ID No. 6中所示的amiRNA序列。生物碱含量相对于对照表示，并且包含通过单因素ANOVA和Tukey氏多重比较事后检验分析的三个生物学重复实验。值显示为平均值± SEM。星号指示P值≤ 0.001的统计显著性。

图6显示了在稳定T1品系中超表达Nitab4.5_0002810g0020.2，处于12叶片期的温室生长的TN90植物的生物碱含量。每个点代表从底部到顶部叶片采样的24个测量的平均值。

图7显示了对于Nitab4.5_0002810g0020.2沉默的，温室生长的成年TN90植物的生物碱含量。生物碱含量相对于对照表示，并且包含通过单因素ANOVA和Tukey氏多重比较事后检验分析的20株植物/基因型的三个测量值。值显示为平均值± SEM。星号指示P值≤0.001的统计显著性。

图8显示了根据本发明来自烟草（Nicotiana tabacum）的Nitab4.5_0002810g0020.2的氨基酸序列 - SEQ ID No. 1 - 犰狳重复蛋白。

图9显示了根据本发明编码来自烟草的犰狳重复蛋白的Nitab4.5_0002810g0020.2的基因组序列 - SEQ ID No. 2。

图10显示了根据本发明编码来自烟草的犰狳重复蛋白的Nitab4.5_0002810g0020.2的转录物序列 - SEQ ID No. 3。

图11显示了图5中使用的miRNA序列。

序列表

提供了在主题说明书自始至终使用的序列标识符的概括和相应的序列表，其中：

SEQ ID No. 1对应于Nitab4.5_0002810g0020.2的氨基酸序列。

SEQ ID No. 2对应于Nitab4.5_0002810g0020.2的基因组序列。

SEQ ID No. 3对应于Nitab4.5_0002810g0020.2的转录物序列。

SEQ ID No. 4是实施例2中使用的序列TRV1。

SEQ ID No. 5是实施例2中使用的序列TRV2。

SEQ ID No. 6是图5中使用的amiRNA序列。

本文公开的一些序列在核苷酸序列中含有“X”或“N”。“X”或“N”可以是任何核苷酸或者一个或多个核苷酸的缺失或插入。例如，在一些情况下，显示了一串“X”或“N”。“X”或“N”的数目不一定与所述位置处的实际核苷酸数目有关。可能存在比序列中显示为“X”或“N”的更多或更少的核苷酸。

具体实施方式

本发明人首次已显示通过调节植物（例如烟草植物）中编码犰狳重复蛋白的至少一种基因的表达或通过修饰编码犰狳重复蛋白的至少一种基因的核酸序列，可以调节植物的生物碱和/或TSNA含量。

本发明提供了调节（例如降低）植物或其部分的生物碱含量的方法，所述方法包括通过调节（例如增加）编码犰狳重复蛋白的至少一种基因的表达或通过修饰编码犰狳重复蛋白的至少一种基因的核酸序列来修饰所述植物。

还提供了调节（例如降低）烟草植物或其植物部分中的烟草特有亚硝胺（TSNA）或TSNA前体含量的方法，所述方法包括通过调节（例如增加）编码犰狳重复蛋白的至少一种基因的表达或通过修饰编码犰狳重复蛋白的至少一种基因的核酸序列来修饰所述植物。

编码犰狳重复蛋白的至少一种基因可以选自编码犰狳重复蛋白的至少一种基因，所述犰狳重复蛋白包含如SEQ ID No. 1中所示的氨基酸序列或者其功能变体或功能片段或直向同源物，或者与SEQ ID No. 1具有至少80%同一性的序列；或者其中编码犰狳重复蛋白的至少一种基因包含如SEQ ID No. 2或3中所示的核苷酸序列，或者SEQ ID No. 2或3的功能变体或功能片段或直向同源物，或者与SEQ ID No. 2或3具有至少80%同一性的核酸序列。适当地，犰狳重复蛋白可以包含犰狳重复结构域。

在一个方面，至少一种犰狳重复蛋白基因编码这样的多肽，其包含如以下中所示的氨基酸序列：SEQ ID No. 1或者其功能变体或功能片段或直向同源物，或者与SEQ IDNo. 1具有至少80%同一性的序列；或者其中编码犰狳重复蛋白的至少一种基因包含如SEQID No. 2或3中所示的核苷酸序列；或者SEQ ID No. 2或3的功能变体或功能片段或直向同源物；或者与SEQ ID No. 2或3具有至少80%同一性的核酸序列。适当地，犰狳重复蛋白可以包含犰狳重复结构域。

编码犰狳重复蛋白的基因的“表达”可以指转录、翻译即蛋白质表达水平。

基因产物的水平或量的测量可以通过任何合适的方法来进行，例如包括修饰植物以及尚未根据本发明进行修饰的可比较植物之间的mRNA转录物水平、蛋白质或肽水平和/或植物表型的比较。

如本文定义的术语“可比较产物”将是衍生自植物（例如烟草植物）的产物，所述植物尚未根据本发明进行修饰，但其中所有其它有关特征是相同的（例如植物物种、生长条件、加工植物如烟草的方法等）。根据本发明的可比较产物可以意指可得自（例如得自）或得自尚未根据本发明进行修饰，例如，以调节编码犰狳重复蛋白的基因的表达或修饰编码犰狳重复蛋白的至少一种基因的核酸序列的植物的植物（例如烟草植物）或其部分，例如叶片（例如烟草叶片）、收获的叶片（例如收获的烟草叶片）、切割的收获的叶片（例如切割的收获的烟草叶片）、加工叶片（例如加工烟草叶片）、或植物繁殖材料（例如烟草植物繁殖材料）、或包含所述植物或其部分的产物，例如烟草产物或其组合。在一个实施方案中，可比较产物是不包含其表达已进行调节的编码犰狳重复蛋白的基因的产物。在一个实施方案中，可比较产物是不包含编码至少一种基因的修饰的核酸序列的产物，所述至少一种基因编码犰狳重复蛋白。

如本文使用的术语“修饰”或“修饰的”意指已改变或变化的植物（例如烟草植物）或核酸序列。本发明包含使用用于植物的遗传修饰或植物的非遗传修饰的技术的植物修饰。这种方法是本领域众所周知的，并且遗传修饰技术的实例包括转化、转基因、同源转基因（cisgenics）和基因编辑方法。非遗传修饰技术的实例包括快中子诱变、化学诱变例如甲基磺酸乙酯（EMS）诱变和现代种群分析方法。

如本文定义的术语“未修饰的植物”将是这样的植物（例如烟草植物），其尚未根据本发明进行修饰，例如以调节犰狳重复蛋白的表达或修饰编码犰狳重复蛋白的至少一种基因的核酸序列；并且其中所有其它有关特征是相同的（例如植物物种、生长条件、加工烟草的方法等）。在一个实施方案中，未修饰的植物是不包含其表达已进行调节的编码犰狳重复蛋白的基因的植物。在一个实施方案中，未修饰的植物是不包含编码至少一种基因的修饰的核酸序列的植物，所述至少一种基因编码犰狳重复蛋白。

犰狳重复蛋白

如本文使用的“犰狳重复蛋白”具有其在本领域中的通常含义，并且指包含犰狳重复序列的蛋白质，所述犰狳重复序列是长度大约40个残基的重复氨基序列。串联犰狳重复序列通常折叠在一起，以形成犰狳（ARM）结构域。

犰狳重复蛋白包含犰狳重复结构域。在一个实施方案中，犰狳重复结构域是与SEQID No. 1比对（例如缺口比对）时，对应于SEQ ID No. 1的氨基酸118至162的序列。

犰狳重复蛋白通过其串联犰狳重复结构域与一系列不同结合配偶体的相互作用来发挥功能。犰狳重复蛋白通过生成且转导影响基因表达的信号，具有作为细胞接触和细胞骨架相关蛋白和信号传导功能的作用。

犰狳重复序列的三维折叠根据β-联蛋白的晶体结构已知。所述蛋白质的圆柱形结构包含带阳电的沟（grove），其被认为与β-联蛋白的相互作用配偶体的酸性表面相互作用（Huber等人， Cell. 1997年9月5日；90（5）:871-82）。

如本文使用的“编码犰狳重复蛋白的基因”指编码犰狳重复蛋白的基因。

在一个实施方案中，犰狳重复蛋白包含如SEQ ID No. 1所示的氨基酸序列，或与SEQ ID No. 1具有至少80%（例如至少85%、至少90%、至少93%、至少94%、至少95%、至少97%、至少98%、至少99%）同一性的序列，或其同源物。适当地，犰狳重复蛋白可以包含犰狳重复结构域，例如与SEQ ID No. 1比对（例如缺口比对）时，对应于SEQ ID No. 1的氨基酸118至162的结构域。

在一个实施方案中，根据本发明的犰狳重复蛋白包含SEQ ID No. 1中所示的氨基酸序列或由SEQ ID No. 1中所示的氨基酸序列组成。

适当地，蛋白质可以来自烟草。

在一个实施方案中，犰狳蛋白由多核苷酸序列编码，其中基因（在突变之前）包含如SEQ ID No. 2或3所示的序列；或与其具有至少80%序列同一性的序列。适当地，犰狳重复蛋白可以包含犰狳重复结构域，例如与SEQ ID No. 1比对（例如缺口比对）时，对应于SEQID No. 1的氨基酸118至162的结构域。

适当地，用于根据本发明使用的犰狳蛋白可以由多核苷酸序列编码，其中基因（在突变之前）包含如SEQ ID No. 2所示的序列，或与其具有至少80%序列同一性（优选与其具有至少85%，优选至少90%，优选至少93%，优选至少94%，优选至少95%、至少97%或至少99%同一性）的序列。适当地，犰狳重复蛋白可以包含犰狳重复结构域，例如与SEQ ID No. 1比对（例如缺口比对）时，对应于SEQ ID No. 1的氨基酸118至162的结构域。

适当地，用于根据本发明使用的犰狳蛋白可以由多核苷酸序列编码，其中基因（在突变之前）包含如SEQ ID No. 3所示的序列，或与其具有至少80%序列同一性（优选与其具有至少85%，优选至少90%，优选至少93%，优选至少94%，优选至少95%、至少97%或至少99%同一性）的序列。适当地，犰狳重复蛋白可以包含犰狳重复结构域，例如与SEQ ID No. 1比对（例如缺口比对）时，对应于SEQ ID No. 1的氨基酸118至162的结构域。

在一个实施方案中，犰狳蛋白由多核苷酸序列编码，其中基因（在突变之前）选自：SEQ ID No. 2或3。

适当地，用于根据本发明使用的野生型蛋白可以由来自烟草的多核苷酸序列编码。

在一个方面，本发明提供了降低植物或其部分或细胞（例如植物细胞）的生物碱含量的方法，所述方法包括通过降低或抑制如本文定义的至少一种犰狳重复蛋白的表达，来修饰所述植物。

在一个方面，本发明提供了降低植物或其部分或细胞（例如植物细胞）的生物碱含量的方法，所述方法包括通过降低或抑制如本文定义的编码犰狳重复蛋白的至少一种基因的表达，来修饰所述植物。

在一个方面，本发明提供了降低植物或其部分或植物细胞的生物碱含量的方法，所述方法包括通过降低或抑制至少一种犰狳重复蛋白的表达，来修饰所述植物，所述至少一种犰狳重复蛋白包含：如SEQ ID No. 1所示的氨基酸序列，或者与其具有至少80%同一性的序列，或者SEQ ID No. 1的功能变体或功能片段或直向同源物；或者由以下编码：如SEQID No. 2或3中所示的核苷酸序列，或者SEQ ID No. 2或3的功能变体或功能片段或直向同源物，或者与SEQ ID No. 2或3具有至少80%同一性的核酸序列。适当地，犰狳重复蛋白可以包含犰狳重复结构域。

在一个方面，本发明提供了降低植物或其部分（例如叶片）的烟草特有亚硝胺（TSNA）或TSNA前体含量的方法，所述方法包括通过降低或抑制如本文定义的至少一种犰狳重复蛋白的表达，来修饰所述植物。

在一个方面，本发明提供了降低植物或其部分（例如叶片）的烟草特有亚硝胺（TSNA）或TSNA前体含量的方法，所述方法包括通过降低或抑制如本文定义的编码犰狳重复蛋白的至少一种基因的表达，来修饰所述植物。

在一个方面，本发明提供了降低植物或其部分（例如叶片）的烟草特有亚硝胺（TSNA）或TSNA前体含量的方法，所述方法包括通过降低或抑制至少一种犰狳重复蛋白的表达，来修饰所述植物，所述至少一种犰狳重复蛋白：

a）包含如以下中所示的氨基酸序列：SEQ ID No. 1或者其功能变体或功能片段或直向同源物，或者与SEQ ID No. 1具有至少80%同一性的序列；或

b）由以下编码：如SEQ ID No. 2或3中所示的核苷酸序列；或者SEQ ID No. 2或3的功能变体或功能片段或直向同源物；或者与SEQ ID No. 2或3具有至少80%同一性的核酸序列。

如本文使用的术语“抑制”（例如抑制编码犰狳重复蛋白的基因的表达）意指与基因在可比较产物中的基因表达相比，编码犰狳重复蛋白的基因的表达较少或降低。

编码犰狳重复蛋白的特异性基因的表达可以通过测量基因的转录和/或翻译进行测量。用于测量转录的方法是本领域众所周知的，并且尤其包括RNA印迹、RNA-Seq、原位杂交、DNA微阵列和RT-PCR。另一方面，可以通过测量基因产物例如由所述基因编码的蛋白质的水平，来间接测量基因的表达。

在一些实施方案中，当与尚未根据本发明进行修饰的植物（例如烟草植物）中编码犰狳重复蛋白的基因的表达相比较时，编码犰狳重复蛋白的基因的表达可以被调节（即增加或降低）至少约10%、20%、30%或40%，适当地至少约50%、60%、70%，更适当地至少约80%、90%、95%或100%。

适当地，犰狳重复蛋白基因的表达可以被减少、部分失活、抑制、消除、敲除或丧失，从而使得犰狳重复蛋白基因的蛋白表达或功能是不可检测的。

在一个方面，至少一种犰狳重复蛋白基因被敲除。换言之，犰狳重复蛋白基因已被致使完全无效。

本领域中已知的用于减少或阻止蛋白质的表达的任何方法都可以用于根据本发明的方法中。

例如，本方法可以包括：

● 在编码蛋白质的核酸序列中提供突变，所述蛋白质包含如SEQ ID No. 1所示的氨基酸序列、或与其具有至少80%（例如至少85%、至少90%、至少93%、至少94%、至少95%、至少97%、至少98%、至少99%）序列同一性的氨基酸序列；

● 在调节区（例如启动子或增强子）中提供有助于控制蛋白质的表达的突变，所述蛋白质包含如SEQ ID No. 1所示的氨基酸序列、或与其具有至少80%（例如至少85%、至少90%、至少93%、至少94%、至少95%、至少97%、至少98%、至少99%）序列同一性的氨基酸序列；

● 提供反义RNA、siRNA或miRNA，其减少编码蛋白质的核酸序列的水平，所述蛋白质包含如SEQ ID No. 1所示的氨基酸序列、或与其具有至少80%（例如至少85%、至少90%、至少93%、至少94%、至少95%、至少97%、至少98%、至少99%）序列同一性的氨基酸序列。

上述方法各自导致以下的表达的减少或阻止：包含如SEQ ID No. 1所示的氨基酸序列；或与其具有至少80%（例如至少85%、至少90%、至少93%、至少94%、至少95%、至少97%、至少98%、至少99%）序列同一性的氨基酸序列的蛋白质，或者其包含如SEQ ID No. 2或3中所示的核苷酸序列，或者SEQ ID No. 2或3的功能变体或功能片段或直向同源物，或者与SEQID No. 2或3具有至少80%（例如至少85%、至少90%、至少93%、至少94%、至少95%、至少97%、至少98%、至少99%）同一性的核酸序列。

在一个方面，犰狳重复蛋白的调节序列可以是修饰的。调节序列可以是例如启动子、增强子或其它调节信号。适当地，调节序列的修饰可以导致犰狳重复蛋白的降低的表达。例如，启动子的修饰如突变或缺失可能降低犰狳重复蛋白的表达。

如本文使用的，术语“突变”包括天然遗传变体或人工改造变体。特别地，术语“突变”指与如SEQ ID No. 1所示的序列，或者与其具有至少80%（优选至少85%、优选至少90%、优选至少93%、优选至少95%、优选至少98%、优选至少99%）序列同一性的氨基酸序列相比，编码氨基酸序列的核苷酸序列或氨基酸序列中的变异。

在一个实施方案中，突变降低植物的生物碱含量。在另一个实施方案中，突变降低烟草中的至少一种TSNA或TSNA前体的含量。

在一个实施方案中，根据本发明的方法可以包括向植物或其部分或植物细胞提供核酸序列，其中所述核酸导致编码犰狳重复蛋白的至少一种基因的表达的降低或消除。

在一个实施方案中，根据本发明的方法可以包括向植物或其部分或植物细胞提供核酸序列，其中所述核酸导致编码犰狳重复蛋白的至少一种基因的核酸序列的修饰。

适当地，可以将所述核酸序列引入植物或其部分或细胞。适当地，可以修饰植物或其部分或细胞中的内源核酸序列，以编码根据本发明的多肽（例如，通过基因编辑）。例如，可以修饰内源核苷酸序列，以降低编码犰狳重复蛋白的至少一种基因的表达。

在优选的实施方案中，存在于植物中的核酸序列的每个拷贝是修饰的，例如如本文定义的突变的（例如，植物中编码所述蛋白质的基因的每个基因组拷贝是突变的），所述核酸序列编码蛋白质，所述蛋白质包含如SEQ ID No. 1所示的序列，或与其具有至少80%（例如至少85%、至少90%、至少93%、至少94%、至少95%、至少97%、至少98%、至少99%）序列同一性的序列，或者其中编码犰狳重复蛋白的至少一种基因包含如SEQ ID No. 2或3中所示的核苷酸序列，或者SEQ ID No. 2或3的功能变体或功能片段或直向同源物，或者与SEQ IDNo. 2或3具有至少80%（例如至少85%、至少90%、至少93%、至少94%、至少95%、至少97%、至少98%、至少99%）同一性的核酸序列。例如，烟草的异源四倍体基因组中基因的每个拷贝可以是突变的。

在优选的实施方案中，根据本发明的植物或植物细胞是纯合的。适当地，植物或植物细胞对于修饰例如抑制或突变可以是纯合的。

在一个实施方案中，根据本发明的植物或植物细胞仅表达编码犰狳重复蛋白的修饰的例如突变的核酸。换言之，在一些实施方案中，在根据本发明的植物中不存在内源性（或内源性和功能性蛋白）。换言之，如果存在任何内源性蛋白质，则它优选为无活性形式。

在一个实施方案中，本方法可以包括在以下中提供突变：如SEQ ID No. 2或3所示的核酸序列，或者与其具有至少80%（例如至少85%、至少90%、至少93%、至少94%、至少95%、至少97%、至少98%、至少99%）同一性的核酸序列。

突变可以改变植物基因组，从而使得编码蛋白质的核酸序列被完全或部分缺失或者以其它方式进行修饰，以阻止犰狳重复蛋白形成蛋白质:蛋白质相互作用，所述蛋白质包含如SEQ ID No. 1所示的氨基酸序列、或与其具有至少80%（例如至少85%、至少90%、至少93%、至少94%、至少95%、至少97%、至少98%、至少99%）序列同一性的氨基酸序列。

突变可以中断编码蛋白质的核酸序列，所述蛋白质包含如SEQ ID No. 1所示的氨基酸序列、或与其具有至少80%（例如至少85%、至少90%、至少93%、至少94%、至少95%、至少97%、至少98%、至少99%）序列同一性的氨基酸序列。

中断可以导致核酸序列不被转录和/或翻译。

可以例如通过缺失或以其它方式修饰核酸序列的ATG起始密码子来中断核酸序列，从而使得蛋白质的翻译被减少或阻止。

核酸序列可以包含减少或阻止蛋白质表达或者影响蛋白质运输的一种或多种核苷酸变化。例如，可以通过在可读框中引入一个或多个提前终止密码子、移码、剪接突变体或非耐受的氨基酸取代，来减少或阻止蛋白质的表达。

提前终止密码子指这样的突变，其将终止密码子引入可读框内，并且阻止整个氨基酸序列的翻译。提前终止密码子可以是TAG（“琥珀”）、TAA（“赭石”）或TGA（“乳白”或“棕土”）密码子。

移码突变（也称为读框错误（framing error）或读框移位）是由核酸序列中不能被三除尽的多个核苷酸的插入/缺失（插入或缺失）引起的突变。由于通过密码子的基因表达的三联体特性，插入或缺失可以改变读框，从而导致与原始完全不同的翻译。移码突变将经常引起突变后的密码子读取，以编码不同的氨基酸。移码突变将通常导致提前终止密码子的引入。

剪接突变体在特异性位点处插入、缺失或改变许多核苷酸，在前体信使RNA加工为成熟信使RNA的过程中，在所述特异性位点处发生剪接。剪接位点的缺失导致一个或多个内含子保留在成熟mRNA中，并且可能导致异常蛋白质的产生。

非耐受的氨基酸取代指引起蛋白质中的非同义氨基酸取代的突变，其导致蛋白质的降低或除去的功能。

本领域已知的用于提供核酸序列中的突变的任何方法都可以用于根据本发明的方法中。例如，可以使用同源重组，其中产生其中一种或多种有关的核酸序列突变的载体，并且用于转化植物或植物细胞。然后可以选择表达突变的序列的重组植物或植物细胞。

在一个实施方案中，突变在蛋白质中引入非耐受的氨基酸取代，所述蛋白质包含如SEQ ID No. 1所示的氨基酸序列、或与其具有至少80%（例如至少85%、至少90%、至少93%、至少94%、至少95%、至少97%、至少98%、至少99%）序列同一性的序列。

在一个实施方案中，与如SEQ ID No. 1所示的蛋白质、或与其具有至少80%（例如至少85%、至少90%、至少93%、至少94%、至少95%、至少97%、至少98%、至少99%）序列同一性的序列相比，突变减少、抑制或消除犰狳重复蛋白形成蛋白质-蛋白质相互作用的能力。

在一个实施方案中，与如SEQ ID No. 1所示的蛋白质、或与其具有至少80%（例如至少85%、至少90%、至少93%、至少94%、至少95%、至少97%、至少98%、至少99%）序列同一性的序列相比，突变不改变蛋白质的水平或表达，但减少、抑制或消除犰狳重复蛋白形成蛋白质-蛋白质相互作用的能力。适当地，突变可以在犰狳重复蛋白的犰狳重复结构域中。适当地，突变可以在犰狳重复蛋白的蛋白质-蛋白质相互作用结构域中。

可以通过使用对于犰狳重复蛋白特异性的抗体，例如对于犰狳重复序列特异性的抗体，通过蛋白质印迹测量蛋白质的存在，来确定蛋白质的表达。调节或突变的犰狳重复蛋白形成蛋白质-蛋白质相互作用的能力可以例如通过使用调节或突变的犰狳重复蛋白和相应的未修饰或未突变的犰狳重复蛋白，执行共免疫沉淀实验来确定。如果犰狳重复蛋白中的调节或突变减少、抑制或消除犰狳重复蛋白形成蛋白质-蛋白质相互作用的能力，则共免疫沉淀将显示调节或突变的犰狳重复蛋白将具有较少的蛋白质:蛋白质相互作用。

在一个实施方案中，犰狳重复蛋白包含犰狳重复结构域。

如本文使用的术语“犰狳重复结构域”指约40-45个氨基酸的结构上保守的蛋白质结构域，其与蛋白质-蛋白质相互作用有关。

犰狳重复结构域可以通过与已知蛋白质结构的氨基酸序列比较进行注释或预测。例如，犰狳重复蛋白和犰狳重复蛋白结构域可以通过针对SEQ ID No. 1的序列比对进行鉴定，其中对应于SEQ ID No. 1的约氨基酸118至约162的那些的氨基酸残基的存在指示犰狳重复结构域。

在一个实施方案中，犰狳重复结构域是与SEQ ID No. 1的约氨基酸118至162相对应的蛋白质区域。

在一个实施方案中，犰狳重复结构域是与SEQ ID No. 1比对（例如缺口比对）时，对应于SEQ ID No. 1的氨基酸118至162的序列。

在一个实施方案中，犰狳重复结构域可以含有突变，其调节编码犰狳重复蛋白的至少一种基因的表达。在一个实施方案中，犰狳重复结构域可以含有突变，其增加编码犰狳重复蛋白的至少一种基因的表达。在一个实施方案中，犰狳重复蛋白结构域可以含有突变，其降低编码犰狳重复蛋白的至少一种基因的表达。

突变可以是缺失、剪接突变体或编码非耐受的氨基酸取代的密码子。

在一个实施方案中，犰狳重复结构域可以是突变的，从而修饰犰狳重复蛋白形成蛋白质:蛋白质相互作用的能力。换言之，犰狳重复结构域可能是突变的，从而导致犰狳重复蛋白的结合亲和力的修饰。在一个实施方案中，突变可以包含在对应于SEQ ID No. 1的约氨基酸118-162的区域中。在一个实施方案中，突变可以包含在对应于SEQ ID No. 1的氨基酸118-162的区域中。适当地，氨基酸编号对应于与SEQ ID No. 1的比对，例如缺口比对。

在一个实施方案中，编码犰狳重复蛋白的核酸序列可以被完全或部分缺失。缺失可以是连续的，或者可以包含序列的多个段。缺失优选去除足够量的核苷酸序列，从而使得核酸序列不再编码功能性犰狳重复蛋白。当与可比较的未修饰植物的对应基因组相比较时，缺失可以是全部的，在所述情况下核酸序列的编码部分的100%不存在。缺失可以例如去除核酸序列的编码部分的至少50、60、70、80或90%。适当地，蛋白质的至少一部分可以是缺失的。缺失可以例如去除蛋白质的编码部分的至少10、20、30、40、50、60、70、80或90%。

缺失可以去除犰狳重复结构域的至少一部分。

缺失可以例如去除犰狳重复蛋白结构域的至少10、20、30、40、50、60、70、80或90%。

适当地，缺失可以从犰狳重复蛋白结构域去除至少5个氨基酸、至少10个氨基酸、至少15个、至少20个、至少25个、至少30个氨基酸。适当地，缺失可以从犰狳重复蛋白结构域去除至少5个氨基酸、至少10个氨基酸、至少15个、至少20个、至少25个、至少30个氨基酸，其中所述结构域对应于SEQ ID No. 1的约氨基酸残基118至约氨基酸残基162。

在一个实施方案中，缺失可以从犰狳重复蛋白的C-末端去除至少100个氨基酸、至少150个、至少200个、至少250个、至少300个、至少350个、至少400个、至少450个、至少500个、至少550个氨基酸。

适当地，突变的蛋白质可以是截短的蛋白质，其缺乏对应于来自SEQ ID No. 1的C-末端的氨基酸的至少约100个氨基酸、至少约150个、至少约200个、至少约250个、至少约300个、至少约350个、至少约400个、至少约450个、至少约500个、至少约550个氨基酸，或者与截短的蛋白质具有至少80%（优选至少85%、至少、至少90%、至少95%、至少98%）序列同一性的序列，所述截短的蛋白质缺乏对应于来自SEQ ID No. 1的C-末端的氨基酸的至少约100个氨基酸、至少约150个、至少约200个、至少约250个、至少约300个、至少约350个、至少约400个、至少约450个、至少约500个、至少约550个氨基酸。

适当地，突变的蛋白质可以是截短的蛋白质，其缺乏对应于来自SEQ ID No. 1的C-末端的氨基酸的至少100个氨基酸、至少150个、至少200个、至少250个、至少300个、至少350个、至少约400个、至少约450个、至少约500个、至少约550个氨基酸，或者与截短的蛋白质具有至少80%（优选至少85%、至少、至少90%、至少95%、至少98%）序列同一性的序列，所述截短的蛋白质缺乏对应于来自SEQ ID No. 1的C-末端的氨基酸的至少100个氨基酸、至少150个、至少200个、至少250个、至少300个、至少350个、至少约400个、至少约450个、至少约500个、至少约550个氨基酸。

用于缺失植物中的核酸序列的方法是本领域已知的。例如，可以使用同源重组，其中产生其中一种或多种有关的核酸序列失去的载体，并且用于转化植物或植物细胞。然后可以选择表达新序列部分的重组植物或植物细胞。

根据众所周知的组织培养方法，例如通过在供应有必需生长因子如氨基酸、植物激素、维生素等的合适培养基中培养细胞，可以生长且维持用如本文所述的载体转化的植物细胞。

可以使用定向诱变方法（也称为定向核苷酸交换（targeted nucleotideexchange）（TNE）或寡核苷酸定向诱变（oligo-directed mutagenesis）（ODM））来执行核酸序列的修饰。定向诱变方法包括但不限于那些采用锌指核酸酶、TALENs（参见WO2011/072246和WO2010/079430）、Cas9-样、Cas9/crRNA/tracrRNA、Cas9/gRNA或其它CRISPR系统（参见WO 2014/071006和WO2014/093622）、大范围核酸酶（参见WO2007/047859和WO2009/059195）的方法，或采用诱变寡核苷酸的定向诱变方法，可能含有进入植物原生质体内的与基因具有序列互补性的用于增强诱变的化学修饰的核苷酸（例如KeyBase®或TALENs）。

另一方面，诱变系统例如TILLING（定向诱导基因组局部突变（Targeting InducedLocal Lesions IN Genomics）；McCallum等人，2000，Nat Biotech 18:455，以及McCallum等人2000，Plant Physiol. 123，439-442，两者均引入本文作为参考），可以用于生成包含具有突变的编码蛋白质的基因的植物系。TILLING使用传统的化学诱变（例如产生随机突变的甲基磺酸乙酯（EMS）诱变），继之以突变的高流量筛选。因此，可以获得包含具有所期望的突变的基因的植物、种子、细胞和组织。

方法可以包括以下步骤：诱变植物种子（例如EMS诱变），植物个体或DNA的合并，感兴趣的区域的PCR扩增，异源双链体形成和高流量检测，突变植物的鉴定，突变PCR产物的测序。应理解，其它诱变和选择方法可以同等地用于生成这种修饰的植物。种子可以例如进行辐射或化学处理，并且可以就修饰的表型筛选植物。

快中子缺失诱变可以在反求遗传学意义上（即，利用PCR）使用以鉴定在内源基因中携带缺失的植物系。参见例如Ohshima等人（1998）Virology 213:472-481；Okubara等人（1994）Genetics 137:867-874；以及Quesada等人（2000）Genetics 154:421-4315，其引入本文作为参考。

在另一种方法中，由于基因倒位和重复基因座位的重组，显性突变体可以用于触发RNA沉默。参见例如Kusaba等人（2003）Plant Cell 15:1455-1467（引入本文作为参考）。

通过分子方法，例如DNA中存在的一种或多种突变，并且通过修饰的表型特征，可以将修饰的植物与未修饰的植物，即野生型植物区分开。修饰的植物对于修饰可以是纯合的或杂合的。优选地，修饰的植物对于修饰是纯合的。

在一个实施方案中，减少或阻止蛋白质表达的方法不包括用化学药品（例如农用化学品）处理植物，所述蛋白质包含如SEQ ID No. 1所示的氨基酸序列、或与其具有至少80%（例如至少85%、至少90%、至少93%、至少94%、至少95%、至少97%、至少98%、至少99%）序列同一性的氨基酸序列。

减少或阻止表达的其它方式对于本领域技术人员将是显而易见的，并且包括病毒诱导性基因沉默（VIGs）、微小RNA沉默、RNAi、反义、tDNA插入、或显性失活构建体（或反效等位基因突变（antimorphic mutation））的使用。

在一个实施方案中，蛋白质的表达可以通过病毒诱导性基因沉默得到减少或消除，所述蛋白质包含如SEQ ID No. 1所示的氨基酸序列、或与其具有至少80%（例如至少85%、至少90%、至少93%、至少94%、至少95%、至少97%、至少98%、至少99%）序列同一性的氨基酸序列。

在一个实施方案中，蛋白质的表达可以通过微小RNAs得到减少或消除，所述蛋白质包含如SEQ ID No. 1所示的氨基酸序列、SEQ ID No. 1、或与其具有至少80%（例如至少85%、至少90%、至少93%、至少94%、至少95%、至少97%、至少98%、至少99%）序列同一性的氨基酸序列。

在一个实施方案中，蛋白质的表达可以通过RNAi得到减少或消除，所述蛋白质包含如SEQ ID No. 1所示的氨基酸序列、SEQ ID No. 1、或与其具有至少80%（例如至少85%、至少90%、至少93%、至少94%、至少95%、至少97%、至少98%、至少99%）序列同一性的氨基酸序列。

在一个实施方案中，蛋白质的表达可以通过反义抑制得到减少或消除，所述蛋白质包含如SEQ ID No. 1所示的氨基酸序列、SEQ ID No. 1、或与其具有至少80%（例如至少85%、至少90%、至少93%、至少94%、至少95%、至少97%、至少98%、至少99%）序列同一性的氨基酸序列。

在一个实施方案中，蛋白质的表达可以通过有义抑制得到减少或消除，所述蛋白质包含如SEQ ID No. 1所示的氨基酸序列、SEQ ID No. 1、或与其具有至少80%（例如至少85%、至少90%、至少93%、至少94%、至少95%、至少97%、至少98%、至少99%）序列同一性的氨基酸序列。

在一个实施方案中，蛋白质的表达可以通过tDNA插入得到减少或消除，所述蛋白质包含如SEQ ID No. 1所示的氨基酸序列、SEQ ID No. 1、或与其具有至少80%（例如至少85%、至少90%、至少93%、至少94%、至少95%、至少97%、至少98%、至少99%）序列同一性的氨基酸序列。

在一个实施方案中，蛋白质的表达可以通过显性失活构建体（或反效等位基因突变）得到减少或消除，所述蛋白质包含如SEQ ID No. 1所示的氨基酸序列、SEQ ID No. 1、或与其具有至少80%（例如至少85%、至少90%、至少93%、至少94%、至少95%、至少97%、至少98%、至少99%）序列同一性的氨基酸序列。

在一个实施方案中，蛋白质的表达可以通过基于定向诱变的系统得到减少或消除，所述蛋白质包含如SEQ ID No. 1所示的氨基酸序列、SEQ ID No. 1、或与其具有至少80%（例如至少85%、至少90%、至少93%、至少94%、至少95%、至少97%、至少98%、至少99%）序列同一性的氨基酸序列。

在一个实施方案中，蛋白质的表达可以通过基于CRISPR的系统得到减少或消除，所述蛋白质包含如SEQ ID No. 1所示的氨基酸序列、SEQ ID No. 1、或与其具有至少80%（例如至少85%、至少90%、至少93%、至少94%、至少95%、至少97%、至少98%、至少99%）序列同一性的氨基酸序列。

在一个实施方案中，蛋白质的表达可以通过锌指核酸酶、TALENs、大范围核酸酶、诱变寡核苷酸或TILLING得到减少或消除，所述蛋白质包含如SEQ ID No. 1所示的氨基酸序列、或与其具有至少80%（例如至少85%、至少90%、至少93%、至少94%、至少95%、至少97%、至少98%、至少99%）序列同一性的氨基酸序列。

在一个方面，本发明提供了增加植物或其部分或植物细胞的生物碱含量的方法，所述方法包括通过增加编码犰狳重复蛋白的至少一种基因的表达来修饰所述植物。

在一个方面，本发明提供了增加植物或其部分或植物细胞的生物碱含量的方法，所述方法包括通过增加编码犰狳重复蛋白的至少一种基因的表达来修饰所述植物，所述犰狳重复蛋白包含如SEQ ID No. 1所示的氨基酸序列，或者具有至少80%（例如至少85%、至少90%、至少93%、至少94%、至少95%、至少97%、至少98%、至少99%）的氨基酸序列，或者如SEQ IDNo. 1中所示的氨基酸序列的功能变体或功能片段或直向同源物，或者其中编码犰狳重复蛋白的至少一种基因包含如SEQ ID No. 2或3中所示的核苷酸序列，或者SEQ ID No. 2或3的功能变体或功能片段或直向同源物，或者与SEQ ID No. 2或3具有至少80%（例如至少85%、至少90%、至少93%、至少94%、至少95%、至少97%、至少98%、至少99%）同一性的核酸序列。

在一个方面，本发明提供了降低植物或其部分（例如叶片）中的烟草特有亚硝胺（TSNA）或TSNA前体含量的方法，所述方法包括通过降低至少一种犰狳重复蛋白的表达来修饰所述植物。

在一个方面，本发明提供了降低植物或其部分（例如叶片）中的烟草特有亚硝胺（TSNA）或TSNA前体含量的方法，所述方法包括通过降低编码犰狳重复蛋白的至少一种基因的表达来修饰所述植物，所述犰狳重复蛋白包含如SEQ ID No. 1所示的序列，或者与如SEQID No. 1中所示的氨基酸序列具有至少80%同一性的序列，或者SEQ ID No. 1的功能变体或功能片段或直向同源物，或者其中编码犰狳重复蛋白的至少一种基因包含如SEQ ID No.2或3中所示的核苷酸序列，或者SEQ ID No. 2或3的功能变体或功能片段或直向同源物，或者与SEQ ID No. 2或3具有至少80%同一性的核酸序列。

如本文使用的术语“增加”（例如增加编码犰狳重复蛋白的基因的表达）意指与可比较产物中未修饰的基因的基因表达相比，犰狳重复蛋白基因的表达更高。

在一些实施方案中，增加至少一种犰狳重复蛋白基因的表达，且从而增加生物碱含量和/或TSNA含量（或其前体）的修饰选自：

增加、促进或增大至少一种犰狳重复蛋白的转录、翻译或表达；

增加由至少一种犰狳重复蛋白编码的多肽的合成；或其从细胞内贮藏所（intracellular store）的释放；或

降低由至少一种犰狳重复蛋白基因编码的多肽的降解率。

适当地，方法可以包括用遗传构建体转化植物（例如烟草植物）的细胞，所述遗传构建体编码至少一种犰狳重复蛋白，其包含如SEQ ID No. 1中所示的氨基酸序列、或者其功能变体或功能片段或直向同源物、或者与SEQ ID No. 1具有至少80%同一性的序列；或者包含如SEQ ID No. 2或3中所示的核苷酸序列、或者SEQ ID No. 2或3的功能变体或功能片段或直向同源物、或者与SEQ ID No. 2或3具有至少80%同一性的核酸序列；或者包含编码能够促进或增大至少一种内源性犰狳重复蛋白基因的蛋白质的核苷酸序列。

将理解的是，这些选项各自将导致由至少一种犰狳重复蛋白基因编码的多肽的增加的活性和表达。方法可以包括从转化的细胞再生植物。提供了遗传构建体用于增加用所述构建体转化的植物或其部分或细胞中的生物碱含量（例如尼古丁含量）和或TSNA含量（或其前体）的用途，所述遗传构建体能够增加由至少一种犰狳重复蛋白基因编码的多肽的表达。

遗传构建体可以编码包含以下的多肽：氨基酸SEQ ID No. 1、或者其功能变体或功能片段或直向同源物、或者与SEQ ID No. 1具有至少80%同一性的序列；或者其包含如SEQ ID No. 2或3中所示的核苷酸序列、或者SEQ ID No. 2或3的功能变体或功能片段或直向同源物、或者与SEQ ID No. 2或3具有至少80%同一性的核酸序列。

在另一个实施方案中，本发明涉及增加植物或其部分的生物碱含量和/或植物或其植物部分中的TSNA含量（或其前体）的方法，其包括通过增加编码犰狳重复蛋白的至少一种基因的活性，来修饰所述植物。

在一个实施方案中，可以通过对编码犰狳重复蛋白的至少一种基因引入（或提供）突变，来增加编码犰狳重复蛋白的至少一种基因的活性。

适当地，编码犰狳重复蛋白的至少一种基因的表达可以通过对以下引入突变得到增加：

a）编码犰狳重复蛋白的至少一种基因，所述犰狳重复蛋白包含如SEQ ID No. 1中所示的氨基酸序列；或者其功能变体或功能片段或直向同源物，或者与SEQ ID No. 1具有至少80%同一性的序列；或

b）如SEQ ID No. 2或3中所示的核苷酸序列，或者SEQ ID No. 2或3的功能变体或功能片段或直向同源物，或者与SEQ ID No. 2或3具有至少80%同一性的核酸序列。

在一个实施方案中，与未修饰的犰狳重复蛋白相比，用于根据本发明使用的犰狳重复蛋白显示出增加的活性。与未修饰的犰狳重复蛋白相比，用于根据本发明使用的犰狳重复蛋白可以显示出至少约1%、至少约3%、至少约5%、至少约10%、至少约20%、至少约30%、至少约40%、至少约50%、至少约60%、至少约70%、至少约80%或至少约90%增加的结合。

生物碱含量

在一个实施方案中，本发明提供了调节植物（例如烟草植物）或其部分的生物碱含量的方法，所述方法包括通过调节至少一种犰狳重复蛋白的表达来修饰所述植物。

在一个实施方案中，本发明提供了调节植物（例如烟草植物）或其部分的生物碱含量的方法，所述方法包括修饰编码犰狳重复蛋白的至少一种基因的核酸序列。

术语“调节”在本文中用于意指增加或降低。

术语“增加生物碱含量”在本文中用于意指，与尚未根据本发明进行修饰的可比较产物相比，在本发明的产物（例如植物、其部分（例如叶片）、加工叶片或由植物制备的产物（例如烟草产物））中的浓度和/或总生物碱含量更高。

术语“降低生物碱含量”在本文中用于意指，与尚未根据本发明进行修饰的可比较产物相比，在本发明的产物（例如植物、其部分（例如叶片）、加工叶片或由植物制备的产物（例如烟草产物））中的浓度和/或总生物碱含量更低。

在一些实施方案中，生物碱含量的调节指生物碱含量中的增加，其中至少一种犰狳重复蛋白基因的表达是降低的（或抑制的）。

在一些实施方案中，生物碱含量的调节指生物碱含量中的增加，其中编码犰狳重复蛋白的至少一种基因的核酸序列已进行修饰。

在一些实施方案中，生物碱含量的调节指生物碱含量中的降低，其中至少一种犰狳重复蛋白的表达是降低或抑制或消除的。在一些实施方案中，生物碱含量的调节指生物碱含量中的降低，其中编码犰狳重复蛋白的至少一种基因的表达是降低或抑制或消除的。

在一些实施方案中，生物碱含量的调节指生物碱含量中的降低，其中编码犰狳重复蛋白的至少一种基因的核酸序列已进行修饰。

在进一步的方面，从叶片测量生物碱的含量。在一个方面，从绿色叶片测量生物碱含量。在进一步的方面，从调制后的叶片，例如晾制（air-cured）、火管烘烤（flue-cured）、明火烘烤（fire-cured）或晒制（sun-cured）叶片测量生物碱含量。在进一步的方面，从火管烘烤的叶片测量生物碱含量。在进一步的方面，从晾制叶片测量生物碱含量。

术语“生物碱含量”在本文中用于意指分类为生物碱的整组化合物的浓度和/或总量。烟草中一般存在的生物碱包括尼古丁、降烟碱、PON、新烟草碱、新烟碱和米喔斯明。在一个实施方案中，选自尼古丁、降烟碱、PON、新烟草碱、新烟碱和米喔斯明的一种或多种生物碱的含量是调节的。在一个实施方案中，选自尼古丁、降烟碱、PON、新烟草碱、新烟碱和米喔斯明的一种或多种生物碱的含量是减少的。在一个实施方案中，选自尼古丁、降烟碱、PON、新烟草碱、新烟碱和米喔斯明的一种或多种生物碱的含量是增加的。适当地，尼古丁含量可以是调节的。在一个实施方案中，尼古丁含量是减少的。在另一个实施方案中，尼古丁含量是增加的。

可以使用本领域已知的用于确定生物碱的浓度和/或总含量的任何方法。用于分析生物碱含量的一种优选方法涉及通过气相层析-火焰电离检测方法（GC-FID）的分析。

在一个实施方案中，提供了用于生产以下的方法：通过本发明的植物可获得（例如获得）或获得的植物（例如烟草植物）或其部分、植物繁殖材料（例如烟草植物繁殖材料）、细胞（例如烟草细胞）、叶片（例如烟草叶片）、收获的叶片（例如收获的烟草叶片）、切割的收获的叶片（例如切割的收获的烟草叶片）、加工叶片（例如加工烟草叶片）、切割且加工的叶片（例如切割且加工的烟草叶片）、包含所述植物或其部分的产物（例如烟草产物）或其组合，所述本发明的植物具有调节的生物碱含量，所述方法包括：修饰所述植物以调节编码犰狳重复蛋白的基因的表达；或修饰编码犰狳重复蛋白的至少一种基因的核酸序列。调节的生物碱含量可以通过将以下中的生物碱含量与可比较产物进行比较来确定：植物（例如烟草植物）或其部分、植物繁殖材料（例如烟草植物繁殖材料）、细胞（例如烟草细胞）、叶片（例如烟草叶片）、收获的叶片（例如收获的烟草叶片）、切割的收获的叶片（例如切割的收获的烟草叶片）、加工叶片（例如加工烟草叶片）、切割且加工的叶片（例如切割且加工的烟草叶片）、包含本发明的植物或其部分的产物例如烟草产物或其组合。

适当地，生物碱含量可以在植物，例如烟草植物，例如修饰的烟草植物中进行调节。适当地，生物碱含量可以在叶片（例如烟草叶片，例如来自修饰的烟草植物的烟草叶片）中进行调节。适当地，生物碱含量可以在收获的叶片（例如来自修饰的烟草植物的收获的烟草叶片）中进行调节。适当地，生物碱含量可以在切割的收获的叶片（例如来自修饰的烟草植物的切割的收获的烟草叶片）中进行调节。适当地，生物碱含量可以在加工叶片（例如加工烟草叶片，例如来自修饰的烟草植物的加工烟草叶片）中进行调节。适当地，生物碱含量可以在切割且加工的叶片（例如切割且加工的烟草叶片，例如来自修饰的烟草植物的切割且加工的烟草叶片）中进行调节。适当地，生物碱含量可以在调制后的叶片（例如来自修饰的烟草植物的调制后的烟草叶片）中进行调节。适当地，生物碱含量可以在绿色叶片（例如来自修饰的烟草植物的绿色烟草叶片）的提取物中进行调节。适当地，生物碱含量可以在包含本发明植物或其部分的产物（例如烟草产物，例如由修饰的烟草植物或其部分生产的烟草产物）中进行调节。适当地，生物碱含量可以在任何一种上述产物或其组合中进行调节。适当地，上述生物碱含量的调节可以是生物碱含量中的增加。适当地，上述生物碱含量的调节可以是生物碱含量中的降低（例如尼古丁含量中的降低）。

在一个实施方案中，选自尼古丁、降烟碱、PON、新烟草碱、新烟碱和米喔斯明的一种或多种生物碱的含量是降低的。

适当地，上述生物碱含量的调节可以是尼古丁含量中的降低。适当地，上述生物碱含量的调节可以是尼古丁含量中的增加。

在一个实施方案中，修饰的植物（例如烟草植物）、植物繁殖材料（例如烟草植物繁殖材料）、叶片（例如烟草叶片）、收获的叶片（例如收获的烟草叶片）、切割的收获的叶片（例如切割的收获的烟草叶片）、加工叶片（例如加工烟草叶片）、切割且加工的叶片（例如切割且加工的烟草叶片）、或来自修饰的烟草植物的烟草产物的尼古丁含量是降低的。

在一个实施方案中，当分别与已在相似的生长条件下生长，尚未进行修饰以：调节编码犰狳重复蛋白的至少一种基因的表达；或修饰编码犰狳重复蛋白的至少一种基因的核酸序列的植物（例如烟草植物）或其部分的生物碱含量相比较时，植物（例如烟草植物）或其部分的生物碱含量可以被调节到至少2、3、4、5、6、7、8、9或10倍。适当地，生物碱含量可以被调节到约2倍至约10倍，优选约3倍至约10倍，适当地约3倍至约5倍。适当地，修饰可以是生物碱含量中的增加或降低。适当地，调节可以是选自尼古丁、降烟碱、PON、新烟草碱、新烟碱和米喔斯明的一种或多种生物碱的调节。适当地，尼古丁含量是调节的。

在本发明的一个实施方案中，与尚未根据本发明进行修饰的植物（例如烟草植物）或其部分相比，植物（例如烟草植物）或其部分的生物碱含量可以被调节1%、2%、5%、8%、10%、12%、15%、20%、25%、30%、40%、50%、60%、70%、80%或90%。当与未修饰的植物（例如烟草植物）或其部分相比较时，调节可以是生物碱含量中的增加或降低。适当地，调节可以是总生物碱含量的调节。适当地，调节可以是选自尼古丁、降烟碱、PON、新烟草碱、新烟碱和米喔斯明的一种或多种生物碱的调节。适当地，调节是尼古丁含量的调节，例如尼古丁含量中的降低。适当地，调节是降烟碱含量的调节，例如降烟碱含量中的降低。适当地，调节是PON含量的调节，例如PON含量中的降低。

烟草特有亚硝胺（TSNA）含量

在一个实施方案中，本发明提供了调节（即增加或减少）植物（例如烟草植物）或其部分中的烟草特有亚硝胺（TSNA）或TSNA前体含量的方法。适当地，所述方法可以包括通过调节至少一种犰狳重复蛋白的表达，来修饰所述植物。适当地，所述方法可以包括通过修饰编码犰狳重复蛋白的至少一种基因的核酸序列，来修饰所述植物。适当地，TSNA或TSNA前体含量可以是减少的。

TSNA可以在加工烟草例如调制后的烟草或再造烟草中进行测量。在一个实施方案中，TSNA含量在调制后的烟草植物或其部分（例如调制后的烟草叶片）中进行测量和/或修饰（例如减少）。

如本文使用的术语“烟草特有亚硝胺”或“TSNA”具有其在本领域中的通常含义，即仅在烟草产物或其它含尼古丁的产物中发现的亚硝胺。适当地，至少一种烟草特有亚硝胺可以是4-(甲基亚硝胺基)-1-(3-吡啶基)-1-丁酮（NNK）、N'-亚硝基降烟碱（NNN）、N'-亚硝基新烟草碱（NAT）或N'-亚硝基新烟碱（NAB）。

当关于至少一种烟草特有亚硝胺使用时，术语“其前体”指烟草植物的一种或多种化学药品或化合物，其引起烟草特有亚硝胺的形成或与导致烟草特有亚硝胺产生的亚硝化反应有关。适当地，术语“其前体”可以指硝酸盐、亚硝酸盐或氧化氮。

术语“调节”在本文中用于意指增加或降低。

在一个实施方案中，TSNA是N'亚硝基降烟碱（NNN）和/或前体是降烟碱。

在一个实施方案中，TSNA可以是选自以下的组的一种或多种：N'-亚硝基降烟碱（NNN）、N'亚硝基新草烟碱（NAT）、N'-亚硝基新烟碱（NAB）和4-(甲基亚硝胺基)-1-(3-吡啶基)-1-丁酮（NNK）。适当地，至少一种烟草特有亚硝胺可以是NNK或NNN。在一个实施方案中，烟草特有亚硝胺是NNN。

在一个实施方案中，TSNA的前体是选自降烟碱、新烟碱、新烟草碱和尼古丁的氧化衍生物如假氧化尼古丁（PON）的组的一种或多种。

在优选的实施方案中，TSNA的前体是降烟碱。

在一个实施方案中，TSNA的前体可以是PON。TSNA（例如NNN、NNK、NAB和/或NAT）的前体可以在绿色烟草叶片中，例如在加工之前，例如在调制之前进行测量。在一个实施方案中，TSNA（例如NNN、NNK、NAB和/或NAT）的前体在绿色烟草叶片中，例如在加工之前，例如在调制之前进行测量和/或修饰（例如减少）。

在一个实施方案中，当与尚未根据本发明进行修饰的烟草植物（或其部分）相比较时，实施本发明的方法和或用途导致修饰的烟草植物（或其部分）中的至少一种TSNA或其前体的减少。

术语“减少至少一种TSNA或其前体”或“至少一种TSNA或其前体的减少”在本文中用于意指，相对于可比较的产物、方法或用途，本发明的产物、方法或用途中的至少一种TSNA或其前体的浓度和/或总含量较低。例如，可比较的烟草工业产品将衍生自这样的烟草植物，其尚未根据本发明进行修饰，但其中所有其它有关特征都是相同的（例如植物物种、生长条件、加工烟草的方法等）。

可以使用本领域已知的用于确定至少一种TSNA或其前体的浓度和/或水平的任何方法。特别地，可以使用这种方法，其可以包括添加氘标记的内标、水提取和过滤，继之以使用具有串联质谱分析法的反相高效液相层析（LC-MS/MS）的分析。用于确定烟草特有亚硝胺前体的浓度和/或水平的其它实例包括方法，例如CORESTA推荐的方法CRM-72：通过LC-MS/MS确定烟草和烟草产物中的烟草特有亚硝胺（CORESTA recommended method CRM-72:Determination of Tobacco Specific Nitrosamines in Tobacco and TobaccoProducts by LC-MS/MS）；正被开发为ISO/DIS 21766的CRM或Wagner等人AnalyticalChemistry（2005），77（4），1001-1006中详述的方法，其全部引入本文作为参考。

适当地，可以通过实施本发明的方法和/或用途来减少至少一种烟草特有亚硝胺或其前体的浓度和/或总含量。适当地，当与尚未根据本发明进行修饰的烟草植物中的至少一种烟草特有亚硝胺或其前体的浓度和/或水平相比较时，至少一种烟草特有亚硝胺或其前体的浓度和/或水平在本发明（例如，通过本发明的方法和/或用途可获得（例如获得）或获得）的烟草植物中可以是减少的。

当与可得自（例如得自）或得自尚未根据本发明进行修饰的烟草植物（或烟草植物的部分或烟草细胞培养物）的烟草叶片、收获的叶片、加工烟草叶片、烟草工业产品或其组合相比较时，至少一种烟草特有亚硝胺或其前体的浓度和/或总含量在可得自（例如得自）或得自本发明的烟草植物（或烟草植物的部分或烟草细胞培养物）的烟草叶片、收获的叶片、加工烟草叶片、烟草工业产品或其组合中可以是减少的。

适当地，至少一种烟草特有亚硝胺或其前体的浓度和/或总含量在加工烟草叶片中可以是减少的。

适当地，至少一种烟草特有亚硝胺或其前体的浓度和/或水平在烟草工业产品中可以是减少的。

在一个实施方案中，至少一种烟草特有亚硝胺或其前体可以减少至少约1%、至少约3%、至少约5%、至少约10%、至少约20%、至少约30%、至少约40%、至少约50%、至少约60%、至少约70%、至少约80%或至少约90%。在一些实施方案中，至少一种烟草特有亚硝胺或其前体可以减少约5%至约95%、约10%至约90%、20%至约80%、30%至约70%或约40%至60%。

关于加工（例如调制后的）烟草叶片（例如调制后的或再造的），至少一种烟草特有亚硝胺或其前体可以减少约5000 ng/g至约50 ng/g、约4000 ng/g至约100 ng/g、约3000ng/g至500 ng/g、或2000 ng/g至1000 ng/g。在一些实施方案中，至少一种烟草特有亚硝胺或其前体可以减少至少约5000 ng/g、至少约4000 ng/g、至少约3000 ng/g、至少约2000ng/g、至少约1000 ng/g、至少约500 ng/g、至少约100 ng/g或至少约50 ng/g。

生物量产生

在一个方面，本发明提供了产生生物量的方法，其包括：

使细胞在产生生物量的条件下生长，所述细胞已进行人工改造，以调节（例如增加）如本文定义的编码犰狳重复蛋白的基因的表达。

在另一个方面，本发明提供了产生生物量的方法，其包括：

使细胞在产生生物量的条件下生长，所述细胞已进行人工改造，以修饰如本文定义的编码犰狳重复蛋白的基因的核酸序列。

在一个实施方案中，本发明提供了产生具有修饰的（例如增加的）尼古丁浓度和/或总含量的生物量的方法，其包括使细胞生长，所述细胞已进行人工改造以：

增加至少犰狳重复蛋白的表达，所述犰狳重复蛋白包含如SEQ ID No. 1中所示的氨基酸序列、或者其功能变体或功能片段或直向同源物、或者与SEQ ID No. 1具有至少80%同一性的序列；或

增加以下的表达：如SEQ ID No. 2或3中所示的核苷酸序列、或者SEQ ID No. 2或3的功能变体或功能片段或直向同源物、或者与SEQ ID No. 2或3具有至少80%同一性的核酸序列。

在一个实施方案中，本发明提供了产生具有修饰的（例如增加的）尼古丁浓度和/或总含量的生物量的方法，其包括使细胞生长，所述细胞已进行人工改造，以修饰：

编码犰狳重复蛋白的至少一种基因的核酸序列，所述犰狳重复蛋白包含如SEQ IDNo. 1中所示的氨基酸序列、或者其功能变体或功能片段或直向同源物、或者与SEQ ID No.1具有至少80%同一性的序列；或

如SEQ ID No. 2或3中所示的核苷酸序列、或者SEQ ID No. 2或3的功能变体或功能片段或直向同源物、或者与SEQ ID No. 2或3具有至少80%同一性的核酸序列。

适当地，犰狳重复蛋白包含犰狳重复结构域。

适当地，核酸序列可以包含在犰狳重复结构域中的修饰（例如突变或缺失）。

细胞可以通过本领域已知的任何方法进行人工改造，以增加编码犰狳重复蛋白的至少一种基因的表达。适当地，细胞可以进行人工改造，以表达编码犰狳重复蛋白的外源基因。适当地，细胞可以进行人工改造，以超表达编码犰狳重复蛋白的基因。

适当地，与由尚未根据本发明进行修饰的可比较细胞产生的生物量相比，生物量可以含有更高的尼古丁浓度和/或总含量。

适当地，供生物量产生之用的细胞可以是植物细胞，例如烟草细胞。

适当地，供生物量产生之用的细胞可以是酵母细胞。

在一个实施方案中，细胞（例如酵母细胞）可以进一步进行修饰，以包含增加尼古丁生物碱生物合成的一种或多种序列。适当地，这些一种或多种序列可以并入适合于细胞（例如酵母细胞）转化的核酸构建体内。一种或多种序列可以在细胞（例如酵母细胞）中超表达。序列可以选自下述基因中的一种或多种：MPO（或甲基腐胺氧化酶或MPO1或MPO2）；A622（或异黄酮还原酶样蛋白或异黄酮还原酶同源物（homolog）或异黄酮还原酶样蛋白）；BBL（或小檗碱桥酶或小檗碱桥酶样或BBE或NBB1）；PMT（或腐胺N-甲基转移酶或腐胺甲基转移酶或S-腺苷-L-甲硫氨酸:腐胺N-甲基转移酶或PMT或PMT1或PMT2或PMT3或PMT4）和QPT（或喹啉酸磷酸核糖基转移酶）。在一个实施方案中，序列可以选自下述基因中的一种或多种：BBL、A622、PMT和MPO（MPO1或MPO2）。适合于以这种方式修饰的基因可以在例如引入本文作为参考的US2016032299中得到教导。

商业上期望的性状

在一个实施方案中，本发明的植物具有修饰的（即增加的或降低的）总生物碱含量，和/或修饰的（即增加的或降低的）选自尼古丁、降烟碱、新烟碱、米喔斯明和新烟草碱的一种或多种生物碱含量和/或减少的尼古丁，而香味特征和/或其它商业上期望的性状至少得到维持。在一个实施方案中，本发明的植物产生与尚未根据本发明进行修饰的植物相似等级和/或质量的叶片。

在一个实施方案中，本发明的植物具有在没有植物的香味特征中的显著变化的情况下减少的尼古丁含量（例如，与尚未根据本发明进行修饰的相同植物相比）。

在一个实施方案中，本发明的植物具有在没有植物的其它商业上期望的性状中的显著变化（例如降低）的情况下修饰的（即增加的或降低的）生物碱和/或TSNA含量（例如，与尚未根据本发明进行修饰的相同植物相比）。特别地，与尚未根据本发明进行修饰的相同植物相比，修饰的植物的产量优选没有减少。

因此，在一个实施方案中，本发明的方法和用途涉及修饰（即增加或降低）总生物碱含量，和/或修饰（即增加或降低）选自尼古丁、降烟碱、新烟碱和新烟草碱的一种或多种生物碱，和/或修饰（即增加或降低）尼古丁含量和/或TSNA含量，同时维持香味特征和/或其它商业上期望的性状（例如产量）。

如本文使用的术语“商业上期望的性状”将包括性状如产量、成熟植株高度、可收获的叶片数、平均节长度、腰叶（cutter leaf）长度、腰叶宽度、质量（例如，叶片质量，适当地调制后的叶片质量）、非生物（例如干旱）胁迫耐受性、除草剂耐受性和/或生物（例如昆虫、细菌或真菌）胁迫耐受性。

例如根据美国农业部（United States Department of Agriculture）（USDA）等级和标准，可以基于调制后的叶片的颜色、质地和香气来测量叶片质量。

烟草等级基于包括但不限于以下的因素进行评价：叶柄位置、叶片大小、叶片颜色、叶片均匀性和完整性、成熟度、质地、弹性、光泽（与叶片的着色强度和深度以及光亮有关）、吸湿性（烟草叶片吸收且保留环境水分的能力）和绿色细微差别（green nuance）或特质（cast）。

可以使用本领域已知的标准方法，例如，使用由美国农业部农产品营销服务局（Agricultural Marketing Service of the US Department of Agriculture）公布的官方标准等级（Official Standard Grades）（7 U.S.C. §511），来确定叶片等级。参见，例如，于1990年11月5日生效的白肋烟（Burley Tobacco）（美国31型和外国93型）的官方标准等级（55 F.R. 40645）；于1989年3月27日生效的烤烟（美国11、12、13、14型和外国92型）的官方标准等级（54 F.R. 7925）；于1965年1月8日生效的宾夕法尼亚阔叶烟（PennsylvaniaSeedleafTobacco）（美国41型）的官方标准等级（29 F.R. 16854）；于1963年12月8日生效的俄亥俄州雪茄叶烟（Ohio Cigar-Leaf Tobacco）（美国42、43和44型）的官方标准等级（28F.R. 11719和28 F.R. 11926）；于1969年11月20日生效的威斯康星州雪茄内包皮烟（Wisconsin Cigar-Binder Tobacco）（美国54和55型）的官方标准等级（34 F.R. 17061）；于1969年11月20日生效的威斯康星州雪茄内包皮烟（美国54和55型）的官方标准等级（34F.R. 17061）；于1971年4月生效的乔治亚州和佛罗里达州遮阴栽培雪茄外包皮烟（ShadeGrown Cigar-Wrapper Tobacco）（美国62型）的官方标准等级。USDA等级指数值可以根据产业公认的等级指数来确定。参见，例如，Bowman等人，Tobacco Science，32:39-40（1988）；烟草遗产文献图书馆（Legacy Tobacco Document Library）（Bates Document #523267826-523267833，1988年7月1日，拟议白肋烟等级指数备忘录（Memorandum on theProposed Burley Tobacco Grade Index））；和Miller等人，1990，Tobacco Intern.，192:55-57（所有前述参考文献都整体引入本文）。

在一个方面，USDA等级指数是接收的联邦等级的0-100数值表示，并且是所有柄位置的加权平均值。较高的等级指数指示较高的质量。另一方面，可以经由超光谱成像（hyper-spectral imaging）来确定叶片等级。参见，例如，WO 2011/027315（其引入本文作为参考）。

在一个实施方案中，本发明的烟草植物提供了商业上可接受等级的烟草。

适当地，本发明的烟草植物提供了商业上可接受等级的调制后的烟草。

在一个实施方案中，当在相似的生长条件下生长时，本发明的烟草植物能够产生具有可比较植物叶片的USDA等级指数值的至少约70%的USDA等级指数值的叶片。适当地，当在相似的生长条件下生长时，本文公开的烟草植物可能能够产生具有对照植物的USDA等级指数值的至少约65%、至少约70%、至少约75%、至少约80%、至少约85%、至少约90%、至少约95%或至少约98%的USDA等级指数值的叶片。适当地，本文公开的烟草植物可能能够产生具有可比较植物的USDA等级指数值的65%至130%、70%至130%、75%至130%、80%至130%、85%至130%、90%至130%、95%至130%、100%至130%、105%至130%、110%至130%、115%至130%或120%至130%的USDA等级指数值的叶片。

在一个方面，本发明的烟草植物能够产生具有至少50的USDA等级指数值的叶片。适当地，本文公开的烟草植物可能能够产生具有55或更高、60或更高、65或更高、70或更高、75或更高、80或更高、85或更高、90或更高以及95或更高的USDA等级指数值的叶片。

除非另有说明，否则本文使用的烟草产量指调制后的叶片产量，其遵循标准农学和调制实践，在标准的田间条件下，基于每英亩的调制后的烟草叶片重量进行计算。

在一个方面，当在相似的田间条件下生长时，本发明的植物（例如烟草植物）具有的产量为可比较植物的产量的50%至150%、55%至145%、60%至140%、65%至135%、70%至130%、75%至125%、80%至120%、85%至115%、90%至110%、95%至105%、50%至100%、55%至100%、60%至100%、65%至100%、70%至100%、75%至100%、80%至100%、85%至100%、90%至100%、95%至100%、100%至150%、105%至150%、110%至150%、115%至150%、120%至150%、125%至150%、130%至150%、135%至150%、140%至150%或145%至150%。

在另一个方面，当在相似的田间条件下生长时，本发明的植物（例如烟草植物）的产量是可比较植物的产量的大约1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9或3.0倍。

在另一个方面，当在相似的田间条件下生长时，本发明的烟草植物的产量与火管烘烤的可比较植物的产量是可比较的。

在一个方面，本发明的烟草植物提供了选自以下的产量：约1200至3500、1300至3400、1400至3300、1500至3200、1600至3100、1700至3000、1800至2900、1900至2800、2000至2700、2100至2600、2200至2500以及2300至2400磅/英亩。

在另一个方面，本发明的烟草植物提供了选自以下的产量：约1200至3500、1300至3500、1400至3500、1500至3500、1600至3500、1700至3500、1800至3500、1900至3500、2000至3500、2100至3500、2200至3500、2300至3500、2400至3500、2500至3500、2600至3500、2700至3500、2800至3500、2900至3500、3000至3500以及3100至3500磅/英亩。

在进一步的方面，本发明的烟草植物提供了选自以下的产量：约1200至3500、1200至3400、1200至3300、1200至3200、1200至3100、1200至3000、1200至2900、1200至2800、1200至2700、1200至2600、1200至2500、1200至2400、1200至2300、1200至2200、1200至2100、1200至2000、1200至1900、1200至1800、1200至1700、1200至1600、1200至1500以及1200至1400磅/英亩。

植物育种

在一个实施方案中，本发明提供了产生具有修饰的生物碱含量和/或修饰的烟草特有亚硝胺（TSNA）或TSNA前体含量的植物的方法，其包括：

a. 使供体植物与受体烟草植物杂交，所述供体植物具有修饰的尼古丁含量和/或修饰的烟草特有亚硝胺（TSNA）或TSNA前体含量，并且其中编码犰狳重复蛋白的至少一种基因的表达已根据本发明在供体植物中进行调节，所述受体烟草植物不具有修饰的尼古丁含量或修饰的烟草特有亚硝胺（TSNA）或TSNA前体含量，并且具有商业上期望的性状；

b. 从与所述受体植物杂交的所述供体植物的后代中分离遗传物质；和

c. 用分子标记物执行分子标记物辅助的选择，其包括：

i. 鉴定在编码a中定义的蛋白质的多核苷酸序列中包含突变的渐渗的区域。

在另一个实施方案中，本发明提供了产生具有修饰的生物碱含量和/或修饰的烟草特有亚硝胺（TSNA）或TSNA前体含量的植物的方法，其包括：

ii. 使供体植物与受体烟草植物杂交，所述供体植物具有修饰的尼古丁含量和/或修饰的烟草特有亚硝胺（TSNA）或TSNA前体含量；其中编码犰狳重复蛋白的至少一种基因的核酸序列已根据本发明在供体植物中进行修饰，所述受体烟草植物不具有修饰的尼古丁含量或修饰的烟草特有亚硝胺（TSNA）或TSNA前体含量，并且具有商业上期望的性状；

iii. 从与所述受体植物杂交的所述供体植物的后代中分离遗传物质；和

iv. 用分子标记物执行分子标记物辅助的选择，其包括：

v. 鉴定在编码a中定义的蛋白质的多核苷酸序列中包含突变的渐渗的区域。

vi.

当与可比较植物相比较时，犰狳重复蛋白的表达在供体植物中被调节，所述犰狳重复蛋白：

a）包含如以下中所示的氨基酸序列：SEQ ID No. 1或者其功能变体或功能片段或直向同源物，或者与SEQ ID No. 1具有至少80%同一性的序列；或

b）由以下编码：如SEQ ID No. 2或3中所示的核苷酸序列；或者SEQ ID No. 2或3的功能变体或功能片段或直向同源物；或者与SEQ ID No. 2或3具有至少80%同一性的核酸序列。适当地，犰狳重复蛋白包含犰狳重复结构域。

分子标记物辅助的选择可以包括执行PCR，以鉴定包含突变的渐渗的核酸序列，所述突变调节蛋白质的表达，所述蛋白质包含如SEQ ID No. 1所示的氨基酸序列或与其具有至少80%序列同一性的氨基酸序列。

植物

根据本发明的合适植物包括茄科植物，其包括例如曼陀罗草、茄子、曼德拉草、致命性茄属植物（颠茄）、辣椒属（红辣椒、辣椒）、土豆和烟草。

在一个实施方案中，茄科的合适属是茄属，例如番茄（Solanum lycopersicum）。

在一个实施方案中，茄科的合适属是烟草属（Nicotiana），例如烟草或黄花烟草（Nicotiana rustica）。

烟草属的合适物种可以是烟草。烟草属的物种在本文中可以被称为烟草植物，或简单地烟草。

烟草植物

本发明提供了针对植物（例如烟草植物）的方法、用途以及细胞（例如烟草细胞）、植物（例如烟草植物）和植物繁殖材料。

如本文使用的术语“烟草植物”指在烟草产品的生产中使用的烟草属中的植物。合适的“烟草”植物的非限制性实例包括烟草和黄花烟草（例如，烟草（N. tabacum L.）、LAB21、LN KY171、Tl 1406、Basma、Galpao、Perique、Beinhart 1000-1和Petico）。

烟草材料可以衍生自或得自烟草类型的变种，通常称为白肋烟变种、烤烟（flue）或亮色（bright）变种和深色（dark）变种。在一些实施方案中，烟草材料衍生自白肋烟、弗吉尼亚（Virginia）或深色烟草植物。烟草植物可以选自白肋烟草、稀有烟草、特产烟草（speciality tobacco）、膨胀烟草等等。

本文还预期了烟草栽培种和原种（elite）烟草栽培种的使用。因此，用于本文的烟草植物可以是烟草变种或原种烟草栽培种。特别有用的烟草变种包括烤烟弗吉尼亚型、白肋烟型和东方型（Oriental type）。

在一些实施方案中，烟草植物可以例如选自下述变种中的一个或多个：L. 栽培种T.I. 1068、AA 37-1、B 13P、Xanthi（Mitchell-Mor）、KT D#3杂种（Hybrid）107、Bel-W3、79-615、Samsun Holmes NN、来自杂交BU21 x Hoja Parado的F4、品系97、KTRDC#2杂种49、KTRDC#4杂种1 10、Burley 21、PM016、KTRDC#5 KY 160 SI、KTRDC#7 FCA、KTRDC#6 TN 86SI、PM021、K 149、K 326、K 346、K 358、K 394、K 399、K 730、KY 10、KY 14、KY 160、KY 17、KY 8959、KY 9、KY 907、MD 609、McNair 373、NC 2000、PG 01、PG 04、P01、P02、P03、RG 11、RG 17、RG 8、Speight G-28、TN 86、TN 90、VA 509、AS44、Banket A1、Basma Drama B84/31、Basma I Zichna ZP4/B、Basma Xanthi BX 2A、Batek、Besuki Jember、C104、Coker 319、Coker 347、Criollo Misionero、PM092、Delcrest、Djebel 81、DVH 405、Galpao Comum、HB04P、Hicks Broadleaf、Kabakulak Elassona、PM102、Kutsage E1 、KY 14 x L8、KY 171、LA BU 21、McNair 944、NC 2326、NC 71、NC 297、NC 3、PVH 03、PVH 09、PVH 19、PVH 21 10、Red Russian、Samsun、Saplak、Simmaba、Talgar 28、PM132、Wislica、Yayaldag、NC 4、TRMadole、Prilep HC-72、Prilep P23、Prilep PB 156/1、Prilep P12-2/1、Yaka JK-48、YakaJB 125/3、TI-1068、KDH-960、TI-1070、TW136、PM204、PM205、Basma、TKF 4028、L8、 TKF2002、TN 90、GR141 、Basma xanthi、GR149、GR153和Petit Havana。

变种或栽培种的非限制性实例是：BD 64、CC 101 、CC 200、CC 27、CC 301 、CC400、CC 500、CC 600、CC 700、CC 800、CC 900、Coker 176、Coker 319、Coker 371 Gold、Coker 48、CD 263、DF91 1 、DT 538 LC、Galpao烟草、GL 26H、GL 350、GL 600、GL 737、GL939、GL 973、HB 04P、HB 04P LC、HB3307PLC、杂种403LC、杂种404LC、杂种501 LC、K 149、K326、K 346、K 358、K394、K 399、K 730、KDH 959、KT 200、KT204LC、KY10、KY14、KY 160、KY17、KY 171 、KY 907、KY907LC、KTY14xL8 LC、Little Crittenden、McNair 373、McNair944、msKY 14xL8、Narrow Leaf Madole、Narrow Leaf Madole LC、NBH 98、N-126、N-777LC、N-7371 LC、NC 100、NC 102、NC 2000、NC 291、NC 297、NC 299、NC 3、NC 4、NC 5、NC 6、NC7、NC 606、NC 71、NC 72、NC 810、NC BH 129、NC 2002、Neal Smith Madole、OXFORD 207、PD7302 LC、PD 7309 LC、PD 7312 LC 'Periq'e'烟草、PVH03、PVH09、PVH19、PVH50、PVH51、R610、R 630、R 7-1 1 、R 7-12、RG 17、RG 81、RG H51、RGH 4、RGH 51、RS 1410、Speight168、Speight 172、Speight 179、Speight 210、Speight 220、Speight 225、Speight 227、Speight 234、Speight G-28、Speight G-70、Speight H-6、Speight H20、Speight NF3、Tl1406、Tl 1269、TN 86、TN86LC、TN 90、TN 97、TN97LC、TN D94、TN D950、TR（Tom Rosson）Madole、VA 309、VA359、AA 37-1、B 13P、Xanthi（Mitchell-Mor）、Bel-W3、79-615、SamsunHolmes NN、KTRDC 2号杂种49、Burley 21、KY 8959、KY 9、MD 609、PG 01、PG 04、P01、P02、P03、RG 1 1、RG 8、VA 509、AS44、Banket A1、Basma Drama B84/31、Basma I Zichna ZP4/B、Basma Xanthi BX 2A、Batek、Besuki Jember、C104、Coker 347、Criollo Misionero、Delcrest、Djebel 81、DVH 405、Galpao Comum、HB04P、Hicks Broadleaf、KabakulakElassona、Kutsage E1、LA BU 21、NC 2326、NC 297、PVH 21 10、Red Russian、Samsun、Saplak、Simmaba、Talgar 28、Wislica、Yayaldag、Prilep HC-72、Prilep P23、Prilep PB156/1、Prilep P12-2/1、Yaka JK-48、Yaka JB 125/3、TI-1068、KDH-960、Tl-1070、TW136、Basma、TKF 4028、L8、TKF 2002、GR141、Basma xanthi、GR149、GR153、Petit Havana。即使本文并未具体确定，还是预期了上述的低转化子亚变种（Low converter subvarieties）。

烟草植物可以是白肋烟、烤烟弗吉尼亚或东方。

在一个实施方案中，植物繁殖材料可以是从本发明的植物（例如烟草植物）可获得的（例如获得的）。

如本文使用的“植物繁殖材料”指取自植物的任何植物物质，可以由其产生进一步的植物。适当地，植物繁殖材料可以选自种子、植物愈伤组织和植物块。适当地，植物繁殖材料可以是种子。适当地，植物繁殖材料可以是植物愈伤组织。适当地，植物繁殖材料可以是植物块。

在一个实施方案中，细胞（例如烟草细胞）、烟草植物和/或植物繁殖材料可以是通过根据本发明的方法可获得的（例如获得的）（例如获得的）。

适当地，当与未修饰的烟草植物相比较时，根据本发明的烟草植物可以具有调节的（例如降低的）尼古丁含量，其中所述烟草植物已进行修饰，以调节（例如增加）至少一种犰狳重复蛋白的表达，所述至少一种犰狳重复蛋白：

a）包含如以下中所示的氨基酸序列：SEQ ID No. 1或者其功能变体或功能片段或直向同源物，或者与SEQ ID No. 1具有至少80%同一性的序列；或

b）由以下编码：如SEQ ID No. 2或3中所示的核苷酸序列；或者SEQ ID No. 2或3的功能变体或功能片段或直向同源物；或者与SEQ ID No. 2或3具有至少80%同一性的核酸序列。

适当地，当与未修饰的烟草植物相比较时，根据本发明的烟草植物可以具有调节的（例如减少的）烟草特有亚硝胺（TSNA）或TSNA前体含量，其中所述烟草植物已进行修饰，以调节（例如增加）至少一种犰狳重复蛋白的表达，所述至少一种犰狳重复蛋白：

a）包含如以下中所示的氨基酸序列：SEQ ID No. 1或者其功能变体或功能片段或直向同源物，或者与SEQ ID No. 1具有至少80%同一性的序列；或

b）由以下编码：如SEQ ID No. 2或3中所示的核苷酸序列；或者SEQ ID No. 2或3的功能变体或功能片段或直向同源物；或者与SEQ ID No. 2或3具有至少80%同一性的核酸序列。

在一个实施方案中，根据本发明的烟草植物包含本发明的烟草细胞。

在另一个实施方案中，植物繁殖材料可以是从本发明的烟草植物可获得的（例如获得的）（例如获得的）。

在一个实施方案中，提供了如本文所述的烟草植物育种烟草植物的用途。

在另一个实施方案中，本发明还提供了前述实施方案的烟草植物用于生产烟草工业产品的用途。

在另一个实施方案中，提供了本发明的烟草植物种植作物的用途。

在一个实施方案中，提供了如在前述实施方案中提供的细胞用于生产烟草工业产品的用途。

在一个实施方案中，本发明提供了细胞培养物（例如体外培养物）。

烟草细胞培养物可以是细胞悬浮培养物。可以将这些体外培养的细胞并入烟草工业产品内，例如作为常规烟草颗粒、烟丝（shreds）、细切或长切烟草薄片的取代物，作为添加物成分，或者既作为取代物又作为添加物。适当地，细胞培养物可以产生尼古丁。

在一个实施方案中，提供了细胞培养物，例如根据本发明的收获的和/或加工的细胞培养物用于生产烟草工业产品的用途。

从体外培养物中收获的烟草细胞可以进行干燥，例如冷冻干燥，例如以产生粉末。

在一个实施方案中，细胞培养物是烟草细胞培养物。技术人员将知道用于确立烟草细胞的体外培养物的已知方法。仅举例来说，可以使用下述方法：收集来自感兴趣的烟草植物的种子，并且对其外部进行灭菌以消除不希望有的生物，种植所述种子以生长感兴趣的烟草植物，从烟草植物中（例如，从烟草茎中）取出组织供用作外植体，从烟草外植体确立愈伤组织培养物，从愈伤组织培养物确立细胞悬浮培养物，并且收获培养材料（例如包括烟草细胞）以产生烟草细胞培养物。

烟草细胞可以通过各种方法进行收获，所述方法包括过滤，例如真空过滤。可以通过添加水在滤器中洗涤样品，并且用过滤例如真空过滤去除剩余的液体。

收获的烟草细胞培养物可以进一步进行加工，例如干燥，例如风干和/或冷冻干燥。可以将收获的烟草细胞培养物或干燥的收获的烟草细胞培养物或其提取物并入根据本发明的烟草工业产品内。

在一个实施方案中，本发明提供了供分子农业之用的植物（例如烟草植物）或其部分。适当地，根据本发明修饰的植物或其部分可以用于制造蛋白质，例如治疗剂，如抗生素、病毒样颗粒、营养药或小分子。

在一个实施方案中，本发明提供了用于生产蛋白质（例如治疗用蛋白质）的方法；所述方法包括通过调节犰狳重复蛋白的表达来修饰能够产生所述蛋白质（例如治疗用蛋白质）的植物或其部分，所述犰狳重复蛋白：

a）包含如以下中所示的氨基酸序列：SEQ ID No. 1或者其功能变体或功能片段或直向同源物，或者与SEQ ID No. 1具有至少80%同一性的序列；或

b）由以下编码：如SEQ ID No. 2或3中所示的核苷酸序列；或者SEQ ID No. 2或3的功能变体或功能片段或直向同源物；或者与SEQ ID No. 2或3具有至少80%同一性的核酸序列；

并且在足以允许产生所述蛋白质（例如治疗用蛋白质）的条件下培养所述植物。适当地，犰狳重复蛋白包含犰狳重复结构域。

产物

本发明还提供了从根据本发明的植物可获得（例如获得）或获得的产物。提供了从其中编码犰狳重复蛋白的基因的表达已进行调节的植物可获得（例如获得）或获得的产物。提供了从其中至少一种犰狳重复蛋白的核酸序列已进行修饰的植物可获得（例如获得）或获得的产物。适当地，编码犰狳重复结构域的核酸序列已进行修饰。

在一个实施方案中，产物可以包含本发明的构建体，其调节如本文所定义的编码犰狳重复蛋白的至少一种基因的表达。在一个实施方案中，产物可以包含本发明的构建体，其修饰如本文所定义的编码犰狳重复蛋白的至少一种基因的核酸序列。

本发明还提供了可得自（例如得自）或得自根据本发明的烟草的产物。

在一个实施方案中，提供了本发明的烟草植物生产烟草叶片的用途。

适当地，烟草叶片可以经受下游应用，例如加工。

因此，在一个实施方案中，前述实施方案的使用可以提供加工烟草叶片。适当地，烟草叶片可以经受调制、发酵、巴氏灭菌或其组合。在另一个实施方案中，烟草叶片可以被切割。在一些实施方案中，烟草叶片可以在经受调制、发酵、巴氏灭菌或其组合之前或之后被切割。

在一个实施方案中，本发明提供了本发明的烟草植物的收获的叶片。

在进一步的实施方案中，收获的叶片可以是从由本发明的繁殖材料繁殖的烟草植物可获得的（例如获得的）（例如获得的）。

在另一个实施方案中，提供了可得自（例如得自）本发明的方法或用途的收获的叶片。

适当地，收获的叶片可以是切割的收获的叶片。

在一些实施方案中，收获的叶片可以包含活的烟草细胞。在其它实施方案中，收获的叶片可以经受进一步加工。

还提供了加工烟草叶片。

加工烟草叶片可以是从本发明的烟草植物可获得的（例如获得的）。适当地，加工烟草叶片可以是从根据本发明的任何方法和/或用途获得的烟草植物可获得的（例如获得的）。

在另一个实施方案中，加工烟草叶片可以是从由根据本发明的烟草植物繁殖材料繁殖的烟草植物可获得的（例如获得的）。

本发明的加工烟草叶片可以是通过加工本发明的收获的叶片可获得的（例如获得的）。

如本文使用的术语“加工烟草叶片”指已经历了本领域中烟草经受的一个或多个加工步骤的烟草叶片。“加工烟草叶片”不包含或基本上不包含活细胞。

术语“活细胞”指能够生长和/或具有代谢活性的细胞。因此，如果细胞被说成不是活的，也被称为“不能存活的”，则细胞不展示活细胞的特征。

术语“基本上无活细胞”意指全部细胞的小于约5%是活的。全部细胞的优选地，小于约3%，更优选小于约1%，甚至更优选小于约0.1%是活的。

在一个实施方案中，加工烟草叶片可以通过以下中的一种或多种进行加工：调制、发酵和/或巴氏灭菌。

适当地，加工烟草叶片可以通过调制进行加工。

烟草叶片可以通过本领域已知的任何方法进行调制。在一个实施方案中，烟草叶片可以通过选自以下的一种或多种调制方法进行调制：晾制、明火烘烤、火管烘烤和晒制。

适当地，烟草叶片可以被晾制。

一般，晾制通过将烟草叶片悬挂在通风良好的烤房中并允许干燥来实现。这通常在四至八周的时间段期间进行。晾制尤其适合于白肋烟。

适当地，烟草叶片可以被明火烘烤。明火烘烤一般通过将烟草叶片悬挂在大型烤房中来实现，在所述大型烤房中，让硬木火一直连续或间歇低闷烧着，并且取决于工艺和烟草，通常需要三天至十周。

在另一个实施方案中，烟草叶片可以被火管烘烤。火管烘烤可以包括将烟草叶片串到烟草杆上，并且将它们挂在调制烤房中的挂烟杆（tier-poles）上。烤房通常具有以外部供应的火箱运行的焰道。一般，这导致在不暴露于烟的情况下已进行热调制的烟草。通常，温度在调制的过程期间缓慢升高，而整个过程需要大约1周。

适当地，烟草叶片可以被晒制。这种方法一般包括将无覆盖物的烟草暴露于太阳。

适当地，加工烟草叶片可以通过发酵进行加工。

发酵可以以本领域已知的任何方式进行。一般，在发酵过程中，将烟草叶片堆成覆盖在例如麻袋中的调制后的烟草垛（堆）以保留水分。叶片内部的剩余水与烟草重量的组合生成了使烟草成熟的天然热量。每天监控堆中心的温度。在一些方法中，每周将整个堆打开。然后取出叶片以摇动且润湿，并且将堆旋转，从而使得内部叶片到外面且底部叶片置于堆的顶部。这确保了整个堆的均匀发酵。叶片上的额外水分加上叶片本身的实际旋转生成热量，从而释放烟草的天然氨并减少尼古丁，同时也加深了颜色并改善了烟草的香气。一般，发酵过程延续最多到6个月，这取决于烟草的变种、叶片上的柄位置、叶片的厚度和预期用途。

适当地，加工烟草叶片可以通过巴氏灭菌进行加工。当烟草叶片将用于制备无烟烟草工业产品最优选口含烟（snus）时，巴氏灭菌可以是特别优选的。

烟草叶片巴氏灭菌法可以通过本领域已知的任何方法来进行。例如，巴氏灭菌法可以如J Foulds，L Ramstrom，M Burke，K Fagerstrom. Effect of smokeless tobacco（snus）on smoking and public health in Sweden. Tobacco Control（2003）12: 349–359中详述的进行，所述参考文献的教导引入本文作为参考。

在口含烟生产过程中，巴氏杀菌法一般通过其中用蒸气将烟草热处理24-36小时（达到大约100℃的温度）的工艺来进行。这导致几乎无菌的产物，并且不希望受理论的束缚，这样的后果之一被认为是限制进一步的TSNA形成。

在一个实施方案中，巴氏灭菌法可以是蒸气巴氏灭菌法。

在一些实施方案中，加工烟草叶片可以被切割。加工烟草叶片可以在加工之前或之后被切割。适当地，加工烟草叶片可以在加工之后被切割。

在一个实施方案中，前述实施方案的使用可以提供再造的烟草。

在一个实施方案中，提供了再造的烟草。

如本文使用的“再造的”也可以被称为重构（recon）、再循环或均质的薄片烟草，并且指由加工后的烟草叶片残余物生成的烟草材料。再造的烟草允许生产一致、高质量的掺合物，并且允许调整各种组分的比率。

再造的烟草可以是纳米纤维（nano fibre）重构（纳米纤维可以以固体或液体形式提取），造纸重构（其使用茎、碎屑和中脉（midrib）等作为原材料），或浆液型重构（其使用磨成粉末，与水和植物黏合剂混合的细粉材料和烟草茎的混合物。通过提取水使可溶性残余物形成薄片。）

本领域中已知的任何方法都可以用于制备再造的烟草，例如，参见CORESTACongress，Sapporo，2012，Smoke Science/Product Technology Groups，SSPT 12（引入本文作为参考）。

在一些实施方案中，烟草植物、烟草植物的收获的叶片和/或加工烟草叶片可以用于提取尼古丁。尼古丁的提取可以使用本领域已知的任何方法来实现。例如，用于从烟草中提取尼古丁的方法在引入本文作为参考的US 2,162,738中得到教导。

在一个方面，本发明提供了由根据本发明的烟草植物或其部分制成的调制后的烟草材料。

在另一个方面，本发明提供了烟草掺合物，其包含由根据本发明的烟草植物或其部分、或者根据本发明的烟草细胞培养物制成的烟草材料。在一个方面，本发明提供了烟草掺合物，其包含根据本发明的调制后的烟草材料。

适当地，根据本发明的烟草掺合物可以包含来自根据本发明的烟草植物或其部分或者来自根据本发明的烟草细胞培养物的大约10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%或90%的烟草。适当地，烟草掺合物可以包含来自根据本发明的烟草植物或其部分或者来自根据本发明的烟草细胞培养物的大约10%的烟草。适当地，烟草掺合物可以包含来自根据本发明的烟草植物或其部分或者来自根据本发明的烟草细胞培养物的大约20%的烟草。适当地，烟草掺合物可以包含来自根据本发明的烟草植物或其部分或者来自根据本发明的烟草细胞培养物的大约30%的烟草。适当地，烟草掺合物可以包含来自根据本发明的烟草植物或其部分或者来自根据本发明的烟草细胞培养物的大约40%的烟草。适当地，烟草掺合物可以包含来自根据本发明的烟草植物或其部分或者来自根据本发明的烟草细胞培养物的大约50%的烟草。适当地，烟草掺合物可以包含来自根据本发明的烟草植物或其部分或者来自根据本发明的烟草细胞培养物的大约60%的烟草。适当地，烟草掺合物可以包含来自根据本发明的烟草植物或其部分或者来自根据本发明的烟草细胞培养物的大约70%的烟草。适当地，烟草掺合物可以包含来自根据本发明的烟草植物或其部分或者来自根据本发明的烟草细胞培养物的大约80%的烟草。适当地，烟草掺合物可以包含来自根据本发明的烟草植物或其部分或者来自根据本发明的烟草细胞培养物的大约90%的烟草。

在一个方面，本发明的烟草掺合物产物包含按干重计至少约5、10、20、30、40、50、60、70、80、90或95百分比的烟草，所述烟草由根据本发明的烟草植物或其部分或者根据本发明的烟草细胞培养物调制。

适当地，调制后的烟草材料可以被晾制。适当地，调制后的烟草材料可以被火管烘烤。适当地，调制后的烟草材料可以被晒制。适当地，调制后的烟草材料可以被明火烘烤。

根据本发明的烟草工业产品或吸烟制品可以包含根据本发明的烟草材料（例如，调制后的烟草材料或再造的烟草材料）。

在另一个方面，本发明提供了烟草工业产品。

在一个实施方案中，根据本发明的烟草工业产品可以是掺合的烟草工业产品。适当地，烟草掺合物可以包含根据本发明的调制后的烟草材料。

在一个实施方案中，烟草工业产品可以由本发明的烟草植物或其部分制备。

适当地，烟草植物或其部分可以由根据本发明的烟草植物繁殖材料繁殖。

如本文在烟草植物的上下文中使用的术语“其部分”指烟草植物的一部分。适当地，“其部分”可以是烟草植物的叶、根或茎或花。适当地，“其部分”可以是烟草植物的叶、根或茎。

烟草工业产品

如本文使用的，术语“烟草工业产品”意图包括可燃吸烟制品，例如香烟，小雪茄，雪茄烟，用于烟斗或手卷烟的烟草（无论是基于烟草、烟草衍生物、膨胀烟草、再造的烟草、烟草取代物还是其它可抽吸材料），非可燃气雾剂供应系统，例如无需燃烧而从基质材料释放化合物的加热产品，例如电子香烟，烟草加热产品，以及从基质材料的组合生成气雾剂的混杂系统，例如含有液体或凝胶或固体基质的混杂系统，以及在这些气雾剂供应系统内使用的可气雾化基质材料；以及无气雾剂的递送制品，例如锭剂，口香糖，贴剂，包含可以吸入的粉末的制品，以及无烟烟草工业产品例如口含烟和鼻烟，所述无气雾剂的递送制品可以递送或可以不递送尼古丁。

在一个实施方案中，烟草工业产品可以由本发明的烟草植物或其部分制备（例如可以包含本发明的烟草植物或其部分）。

适当地，烟草植物或其部分可以由根据本发明的烟草植物繁殖材料繁殖。

如本文在烟草植物的上下文中使用的，术语“其部分”指烟草植物的一部分。优选地，“其部分”是烟草植物的叶片。

在另一个实施方案中，烟草工业产品可以由本发明的收获的叶片制备。

在进一步的实施方案中，烟草工业产品可以由本发明的加工烟草叶片制备。

适当地，烟草工业产品可以由通过以下中的一种或多种进行加工的烟草叶片制备：调制、发酵和/或巴氏灭菌。

适当地，烟草工业产品可以包含切割的烟草叶片，任选地按照前述实施方案进行加工。

在另一个实施方案中，烟草工业产品可以由根据本发明的烟草细胞培养物制备。

在另一个实施方案中，烟草工业产品可以由根据本发明的调制后的烟草材料制备（例如可以包含根据本发明的调制后的烟草材料）。

在另一个实施方案中，烟草工业产品可以由根据本发明的烟草掺合物制备（例如可以包含根据本发明的烟草掺合物）。

在一个实施方案中，烟草工业产品可以是吸烟制品。

如本文使用的，术语“吸烟制品”可以包括可抽吸产品，例如卷烟、香烟、雪茄和小雪茄，无论是基于烟草、烟草衍生物、膨胀烟草、再造的烟草还是烟草取代物。

在另一个实施方案中，烟草工业产品可以是无烟烟草工业产品。

如本文使用的术语“无烟烟草工业产品”指并不意图抽吸和/或经受燃烧的烟草工业产品。

无烟烟草工业产品（包括加热不燃烧（heat-not-burn）的材料）可以含有沉积在其它成分上、在其它成分中混合、由其它成分包围、或与其它成分组合的任何形式（包括干燥颗粒、烟丝、颗粒、粉末或浆液）的烟草，所述其它成分采取任何形式，例如薄片、薄膜、接片（tabs）、泡沫或珠。

在一个实施方案中，无烟烟草工业产品可以包括口含烟、鼻烟、嚼烟等等。

在一个实施方案中，烟草工业产品是选自香烟、小雪茄和雪茄的可燃吸烟制品。

在一个实施方案中，烟草工业产品包含可燃吸烟制品的一种或多种部件，例如过滤嘴，过滤嘴条（filter rod），过滤嘴条段（filter rod segment），烟草，烟草条，烟草条段，塞子（spill）、添加物释放部件例如胶囊，线，珠，纸例如成型纸（plug wrap），接装纸或卷烟纸。

在一个实施方案中，烟草工业产品是非可燃气雾剂供应系统。

在一个实施方案中，烟草工业产品包含非可燃气雾剂供应系统的一种或多种部件，例如加热器和可气雾化基质。

在一个实施方案中，气雾剂供应系统是电子香烟，也称为蒸汽烟设备（vapingdevice）。

在一个实施方案中，电子香烟包括加热器、能够向加热器供电的电源、可气雾化基质例如液体或凝胶、壳以及任选的接口。

在一个实施方案中，可气雾化基质被容纳在基质容器中。在一个实施方案中，基质容器与加热器结合或包括加热器。

在一个实施方案中，烟草工业产品是加热产品，其通过加热而不是燃烧基质材料而释放一种或多种化合物。基质材料是可气雾化材料，其可以是例如烟草或其它非烟草产物，其可以含有或可以不含有尼古丁。在一个实施方案中，加热产品是烟草加热产品。

在一个实施方案中，加热产品是电子设备。

在一个实施方案中，烟草加热产品包括加热器、能够向加热器供电的电源、可气雾化基质例如固体或凝胶材料。

在一个实施方案中，加热产品是非电子制品。

在一个实施方案中，加热产品包括可气雾化基质例如固体或凝胶材料和热源，所述热源能够在没有任何电子工具的情况下向可气雾化基质供应热能，例如通过燃烧诸如炭的燃烧材料。

在一个实施方案中，加热产品还包括能够过滤通过加热可气雾化基质而生成的气雾剂的过滤器。

在一些实施方案中，可气雾化基质材料可以包含蒸气或气雾剂生成剂或湿润剂，例如甘油、丙二醇、乙酸甘油酯或二甘醇。

在一个实施方案中，烟草工业产品是混杂系统，以通过加热而不燃烧基质材料的组合来生成气雾剂。基质材料可以包括例如固体、液体或凝胶，其可以含有或可以不含有尼古丁。在一个实施方案中，混杂系统包括液体或凝胶基质和固体基质。固体基质可以是例如烟草或其它非烟草产物，其可以含有或可以不含有尼古丁。在一个实施方案中，混杂系统包括液体或凝胶基质和烟草。

在进一步的实施方案中，烟草工业产品可以是烟草加热设备或混杂设备或电子烟等等。

一般在烟草加热设备或混杂设备中，通过将热量从热源传递到物理上分开的气雾剂形成基质或材料来生成气雾剂，所述气雾剂形成基质或材料可以位于热源内、周围或下游。在吸烟期间，挥发性化合物通过来自热源的热传递而从气雾剂形成基质释放，并且夹带在通过吸烟制品吸进的空气中。随着释放的化合物冷却，它们凝聚以形成被使用者吸入的气雾剂。

用于消费或抽吸烟草加热设备的气雾剂生成制品和设备是本领域已知的。它们可以包括例如电加热的气雾剂生成设备，其中通过将热量从气雾剂生成设备的一个或多个电加热元件传递到烟草加热设备的气雾剂形成基质来生成气雾剂。

适当地，烟草加热设备可以是气雾剂生成设备。

优选地，烟草加热设备可以是加热不燃烧设备。加热不燃烧设备是本领域已知的，并且通过加热而不是燃烧烟草来释放化合物。

合适的、加热不燃烧设备的实例可以是引入本文作为参考的WO2013/034459或GB2515502中教导的设备。

在一个实施方案中，烟草加热设备的气雾剂形成基质可以是根据本发明的烟草工业产品。

在一个实施方案中，烟草加热设备可以是混杂设备。

多核苷酸/多肽/构建体

在本发明的某些实施方案中，适当地在启动子的指导下，可以将调节至少一种犰狳重复蛋白的表达或核酸序列的构建体转化到植物细胞内。

在本发明的某些实施方案中，在启动子的指导下，可以将降低（即抑制）至少一种犰狳重复蛋白的表达或修饰其核酸序列的构建体转化到植物细胞内。例如，遗传构建体可以是基因编辑构建体或可以包含RNAi分子，所述RNAi分子可以包含小干扰RNA（siRNA）分子或短发夹环（shRNA）分子。

在本发明的某些实施方案中，适当地在启动子的指导下，可以将增加犰狳重复蛋白的表达的构建体转化到植物细胞内，例如编码基因的构建体，所述基因编码犰狳重复蛋白如内源性犰狳重复蛋白。

可以借助于合适的载体例如植物转化载体，将构建体引入根据本发明的植物内。植物转化载体可以包含表达盒，其在转录方向5'-3'上包含启动子序列、靶向编码犰狳重复蛋白的基因的构建体序列和任选地3'非翻译的终止子序列，包括用于RNA聚合酶的终止信号和用于多腺苷酸化酶（polyadenylase）的多腺苷酸化信号。启动子序列可以以一个或多个拷贝存在，并且这种拷贝可以是相同的或是如上所述的启动子序列的变体。终止子序列可以得自植物、细菌或病毒基因。合适的终止子序列是例如豌豆rbcS E9终止子序列，衍生自根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）的胭脂氨酸合成酶基因的nos终止子序列，以及来自花椰菜花叶病毒的35S终止子序列。本领域技术人员将容易地知道其它合适的终止子序列。

本发明的构建体还可以包含基因表达增强机制，以增加启动子的强度。这种增强子元件的实例是衍生自豌豆质体蓝素基因的启动子的一部分的增强子元件，并且是引入本文作为参考的国际专利申请No. WO 97/20056的主题。合适的增强子元件可以是例如衍生自根癌农杆菌的胭脂氨酸合成酶基因的nos增强子元件，以及来自花椰菜花叶病毒的35S增强子元件。

这些调节区可以衍生自与启动子DNA序列相同的基因，或者可以衍生自来自烟草或其它生物，例如来自茄科植物或来自亚科亚香树亚科（Cestroideae）的不同基因。所有调节区都应该能够在待转化组织的细胞中起作用。

启动子DNA序列可以衍生自与感兴趣的基因相同的基因，例如启动子将要指导的基因，例如根据本发明编码犰狳重复蛋白的基因，本发明中使用的编码序列，或者可以衍生自来自烟草或另一种生物，例如来自茄科植物或来自亚科亚香树亚科的不同基因。

可以将表达盒并入基础植物转化载体，例如pBIN 19 Plus、pBI 101、pKYLX71:35S2、pCAMBIA2300或本领域已知的其它合适的植物转化载体内。除表达盒之外，植物转化载体将含有如对于转化过程必需的这种序列。这些可以包括农杆菌属（Agrobacterium）vir基因，一个或多个T-DNA边界序列（border sequences），以及选择性标记物或鉴定转基因植物细胞的其它手段。

术语“表达载体或植物转化载体”意指能够在体内或体外表达的构建体。优选地，将表达载体并入生物的基因组中。在一个实施方案中，本发明的载体表达蛋白质，例如如本文所述的犰狳重复蛋白。术语“并入”优选包括稳定并入基因组内。

用于转化植物的技术是本领域众所周知的，并且包括例如农杆菌属介导的转化。基因修饰植物的构建中的基本原理是在植物基因组中插入遗传信息，以便获得所插入的遗传物质的稳定维持。一般技术的综述可以在通过Potrykus（Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol [1991] 42:205-225）和Christon（AgroFood-Industry Hi-Tech 1994年3月/4月 17-27）的论文中找到，所述参考文献引入本文作为参考。

一般，在农杆菌属介导的转化中，通过农杆菌属与来自靶植物的外植体的共培养，将携带感兴趣的外源DNA的双元载体（binary vector），即根据本发明的构建体，从适当的农杆菌属菌株转移到靶植物。然后在选择培养基上再生转化的植物组织，所述选择培养基包含选择性标记物和植物生长激素。备择方法是浸花法（Clough & Bent，1998 Plant J.1998年12月；16（6）:735-43，其引入本文作为参考），由此使完整植物的花芽与含有嵌合基因的农杆菌属菌株的悬浮液接触，并且在结实之后，通过在选择培养基上的生长，使转化的个体萌发并进行鉴定。通过农杆菌属直接感染植物组织是简单技术，其已得到广泛采用，并且在Butcher D. N.等人，（1980），Tissue Culture Methods for Plant Pathologists，编辑: D. S. Ingrams和J.P. Helgeson，203-208中进行描述，所述参考文献引入本文作为参考。

进一步的合适转化方法包括例如使用聚乙二醇或电穿孔技术、粒子轰击、显微注射以及碳化硅纤维的使用，将基因直接转移到原生质体内。使用冲击转化（ballistictransformation）包括碳化硅须晶技术来转化植物在Frame B R，Drayton P R，Bagnaall SV，Lewnau C J，Bullock W P，Wilson H M，Dunwell J M，Thompson J A & Wang K（1994）中得到教导，所述参考文献引入本文作为参考。通过碳化硅须晶介导的转化生产能育的转基因玉蜀黍植物在The Plant Journal 6: 941-948中得到教导，所述参考文献引入本文作为参考），并且病毒转化技术在例如Meyer P，Heidmmm I & Niedenhof I（1992）中得到教导，所述参考文献引入本文作为参考。木薯花叶病毒作为用于植物的载体系统的用途在Gene110: 213-217中得到教导，所述参考文献引入本文作为参考。关于植物转化的进一步教导可以在引入本文作为参考的EP-A-0449375中找到。

在进一步的方面，本发明涉及载体系统，其携带构建体，并且将其引入生物例如植物，适当地烟草植物的基因组内。载体系统可以包含一种载体，但它可以包含两种载体。在两种载体的情况下，载体系统通常被称为双元载体系统。双元载体系统在GynheungAnetal，（1980），Binary Vectors，Plant Molecular Biology Manual A3，1-19中得到进一步详细描述，所述参考文献引入本文作为参考。

用于转化植物细胞的一种广泛采用的系统使用来自根癌农杆菌的Ti质粒或来自发根农杆菌（Agrobacterium rhizogenes）的Ri质粒，其通过An等人，（1986），Plant Physiol. 81，301-305和Butcher D. N.等人，（1980），Tissue Culture Methods for Plant Pathologists，编辑: D. S. Ingrams和J.P. Helgeson，203-208进行描述，所述参考文献引入本文作为参考。在植物中根据本发明的所期望的外源基因的每种引入方法后，进一步的DNA序列的存在和/或插入可能是必需的。T-DNA用于植物细胞转化的用途已得到充分研究，并且在EP-A-120516；Hoekema，in: The Binary Plant Vector System Offset-drukkerij Kanters B. B.，Amsterdam，1985，第V章；Fraley等人，Crit. Rev. Plant Sci.，4:1-46；以及Anetal.，EMBO J（1985）4:277-284中进行描述，所述参考文献引入本文作为参考。

根据众所周知的组织培养方法，例如通过在供应有必需生长因子如氨基酸、植物激素、维生素等的合适培养基中培养细胞，可以生长且维持用一种或多种构建体转化的植物细胞，所述一种或多种构建体调节编码犰狳重复蛋白的至少一种基因的表达或修饰其核酸序列。

与本发明有关的术语“转基因植物”包括包含构建体的任何植物，所述构建体调节根据本发明的编码犰狳重复蛋白的至少一种基因的表达或修饰其核酸序列。相应地，转基因植物是已用根据本发明的构建体进行转化的植物。优选地，根据本发明，转基因植物显示出调节的生物碱含量和/或调节的TSNA含量（或其前体）。术语“转基因植物”不包括当处于其天然启动子（所述天然启动子也处于其自然环境中）的控制下时处于其自然环境中的天然核苷酸编码序列。

在一个方面，根据本发明的编码犰狳重复蛋白的基因、构建体、植物转化载体或植物细胞处于分离的形式。术语“分离的”意指序列至少基本上不含所述序列与之在自然界中天然结合且如自然界中发现的至少一种其它组分。

在一个方面，根据本发明的编码犰狳重复蛋白的基因、构建体、植物转化载体或植物细胞处于纯化的形式。术语“纯化的”意指处于相对纯的状态，例如至少约90%纯、或至少约95%纯或至少约98%纯。

如本文使用的术语“核苷酸序列”指寡核苷酸序列或多核苷酸序列，以及其变体、同源物、片段和衍生物（例如其部分）。核苷酸序列可以具有基因组或合成或重组起源，其可以是双链或单链的，无论代表有义链还是反义链。

与本发明有关的术语“核苷酸序列”包括基因组DNA、cDNA、合成DNA和RNA。优选地，它意指编码本发明的DNA，更优选cDNA序列。

在优选的实施方案中，当与本发明本身的范围有关并且当被本发明的范围本身包括时，核苷酸序列即编码犰狳重复蛋白的基因包括当处于其自然环境中时并且当它连接到也处于其自然环境中的一种或多种其天然相关序列时的天然核苷酸序列。为了便于参考，我们应该将这个优选实施方案称为“天然核苷酸序列”。在这方面，术语“天然核苷酸序列”意指整个核苷酸序列，其处于其自然环境中，并且当可操作地连接至它与之天然结合的整个启动子时，所述启动子也处于其自然环境中。

供本发明之用的核苷酸序列可以存在于载体中，其中所述核苷酸序列可操作地连接至调节序列，所述调节序列能够保证核苷酸序列由合适的宿主生物的表达。供本发明之用的构建体可以转化到如本文所述的合适的宿主细胞内，以保证本发明的多肽的表达。载体例如质粒、黏粒或噬菌体载体的选择将经常取决于它待引入其内的宿主细胞。载体可以在体外例如用于RNA的生产，或者用于转染、转化、转导或感染宿主细胞。

在一些应用中，供本发明之用的核苷酸序列可操作地连接至调节序列，所述调节序列能够保证核苷酸序列例如通过所选宿主细胞的表达。例如，本发明包括包含与这种调节序列可操作连接的如本文所述的编码犰狳重复蛋白的基因的核苷酸序列的载体，即载体是表达载体。

术语“可操作地连接的”指其中所述组分处于允许其以其预期方式起作用的关系中的并列。与编码序列“可操作地连接”的调节序列以这样的方式连接，从而使得在与控制序列相容的条件下实现编码序列的表达。

术语“调节序列”包括启动子和增强子以及其它表达调节信号。术语“启动子”以本领域的通常含义使用，例如RNA聚合酶结合位点。编码基因的构建体内的核苷酸序列可以与至少一个启动子可操作地连接，所述基因编码犰狳重复蛋白。

与术语例如“盒”或“载体”同义的术语“构建体”包括直接或间接附着至启动子的用于根据本发明使用的核苷酸序列。

间接附着的实例是在启动子和本发明的核苷酸序列的中间，提供合适的间隔基团，例如内含子序列，例如Sh1-内含子或ADH内含子。对于与本发明有关的术语“融合的”同样如此，其包括直接或间接附着。在一些情况下，所述术语并不包括通常与野生型基因启动子结合，以及当它们均处于其自然环境中时的编码蛋白质的核苷酸序列的天然组合。构建体甚至可以含有或表达标记物，其允许遗传构建体的选择。

在一些实施方案中，启动子可以与构建体或载体中的核苷酸序列可操作地连接，所述核苷酸序列用于调节细胞或细胞培养物或烟草植物或其部分中的尼古丁浓度和/或总含量。

在一些实施方案中，启动子可以选自：组成型启动子、组织特异性启动子、发育调节的启动子和诱导型启动子。

在一个实施方案中，启动子可以是组成型启动子。

组成型启动子指导基因在植物发育期间连续地遍及植物各个部分的表达，尽管基因可能不在所有细胞类型中以相同水平表达。已知的组成型启动子的实例包括与以下相关的那些：花椰菜花叶病毒35S转录物（Odell JT，Nagy F，Chua NH.（1985）. Identificationof DNA sequences required for activity of the cauliflower mosaic virus 35Spromoter. Nature. 313 810-2）、水稻肌动蛋白1基因（Zhang W，McElroy D，Wu R.（1991）.Analysis of rice Act1 5' region activity in transgenic rice plants. PlantCell 3 1155-65）以及玉蜀黍泛素1基因（Cornejo MJ，Luth D，Blankenship KM，AndersonOD，Blechl AE.（1993）. Activity of a maize ubiquitin promoter in transgenicrice. Plant Molec. Biol. 23 567-81）。组成型启动子，例如香石竹蚀环病毒（CERV）启动子（Hull R，Sadler J，LongstaffM（1986）（CaMV/35S），玄参花叶病毒（figwort mosaicvirus） 35S启动子. The sequence of carnation etched ring virus DNA: comparisonwith cauliflower mosaic virus and retroviruses. EMBO Journal，5（2）:3083-3090）。

组成型启动子可以选自：香石竹蚀环病毒（CERV）启动子、花椰菜花叶病毒（CaMV35S启动子）、来自水稻肌动蛋白1基因或玉蜀黍泛素1基因的启动子。

启动子可以是组织特异性启动子。组织特异性启动子是指导基因在植物的一个（或几个）部分中的表达的启动子，通常贯穿那些植物部分的生存期。组织特异性启动子的类别通常还包括其特异性不绝对的启动子，即它们还可以指导在除优选组织外的组织中以较低水平的表达。组织特异性启动子包括菜豆蛋白启动子、豆球蛋白b4-启动子、usp-启动子、sbp-启动子、ST-LS1启动子、B33（patatin I类启动子）。

在另一个实施方案中，启动子可以是发育调节的启动子。

发育调节的启动子指导基因在植物发育期间的特定时间，在植物的一个或多个部分中的表达中的变化。基因可以在其它时间以不同（通常较低）的水平在所述植物部分中表达，并且也可以在其它植物部分中表达。

在一个实施方案中，启动子可以是诱导型启动子。

诱导型启动子能够响应诱导物指导基因的表达。在不存在诱导物的情况下，基因将不表达。诱导物可以直接作用于启动子序列，或者可以通过抵消阻遏物分子的效应而起作用。诱导物可以是化学试剂例如代谢物，蛋白质，生长调节剂（例如激活OCS启动子的生长素和水杨酸）或有毒元素，生理应激例如热，光（例如大豆 SSU启动子），损伤（例如nos、胭脂氨酸合成酶启动子），或渗透压，或者病原体或害虫作用的间接后果。发育调节的启动子可以被描述为特定类型的诱导型启动子，其响应由植物产生的内源性诱导物或在植物的生活史中的特定时刻的环境刺激。已知的诱导型启动子的实例包括与例如由Warner SA，ScottR，Draper J.（（1993）Plant J. 3 191-201）描述的伤口应答、如由Benfey & Chua（1989）（Benfey，P.N.,和Chua，N-H.（（1989）Science 244 174-181）公开的温度应答以及如由Gatz（（1995）Methods in Cell Biol. 50 411-424）描述的化学诱导的有关的那些启动子。

可以从产生所述蛋白质的任何细胞或生物中鉴定和/或分离和/或纯化核苷酸序列，所述核苷酸序列编码具有作为如本文定义的编码犰狳重复蛋白的基因的特定性质的蛋白质或者适合于修饰的蛋白质。用于核苷酸序列的鉴定和/或分离和/或纯化的各种方法是本领域内众所周知的。例如，一旦合适的序列已鉴定和/或分离和/或纯化，就可以使用PCR扩增技术来制备更多的序列。

在再进一步的备择方法中，编码犰狳重复蛋白的核苷酸序列可以通过确立的标准方法进行合成制备，所述标准方法例如通过Beucage S.L.等人，（1981）TetrahedronLetters 22，第1859-1869页（其引入本文作为参考）描述的亚磷酰胺法，或者通过Matthes等人，（1984）EMBO J. 3，第801-805页（其引入本文作为参考）描述的方法。在亚磷酰胺法中，寡核苷酸例如在自动DNA合成仪中合成、纯化、退火、连接且在适当的载体中克隆。

如本文使用的，术语“氨基酸序列”与术语“多肽”和/或术语“蛋白质”同义。在一些情况下，术语“氨基酸序列”与术语“肽”同义。在一些情况下，术语“氨基酸序列”与术语“酶”同义。

本发明还包括序列的使用，所述序列与具有本文定义的特定性质的多肽的一种或多种氨基酸序列、或任何核苷酸序列即编码这种多肽的犰狳重复蛋白基因具有一定程度的序列同一性或序列同源性（在下文中被称为“一种或多种同源序列”）。此处，术语“同源物”意指与主题氨基酸序列和主题核苷酸序列具有一定同源性的实体。此处，术语“同源性”可以与“同一性”相等。

同源氨基酸序列和/或核苷酸序列和/或片段应该提供和/或编码多肽，其保留犰狳重复蛋白基因的功能活性和/或增强犰狳重复蛋白基因的活性。一般，同源序列将包含例如与主题氨基酸序列相同的活性位点等，或者将编码相同的活性位点。尽管同源性也可以按照相似性加以考虑（即具有相似化学性质/功能的氨基酸残基），但在本发明的背景下，它优选表示按照序列同一性的同源性。同源序列一般保留功能性结构域或基序。适当地，犰狳重复蛋白的同源物可以含有犰狳重复蛋白结构域和包含保守赖氨酸残基的活性位点。

在一个实施方案中，采用同源序列以包括氨基酸序列或核苷酸序列，所述氨基酸序列或核苷酸序列与主题序列相比具有一个、两个或几个添加、缺失和/或取代。

序列同一性

序列同一性比较可以通过眼力进行，或更通常地，借助于可容易获得的序列比较程序进行。这些商购可得的计算机程序可以计算两个或更多个序列之间的%同源性。%同源性或%同一性可以在邻接序列上进行计算，即一个序列与另一序列进行比对，并且一个序列中的每个氨基酸与另一序列中的相应氨基酸直接进行比较，一次比较一个残基。这称为“无缺口”比对。一般，仅在相对短数目的残基上执行这种无缺口比对。

尽管这是非常简单且一致的方法，但它未能考虑到，例如，在其它方面等同的序列对中，一个插入或缺失将导致后面的氨基酸残基不能比对，因此潜在地导致当执行总体比对时，%同源性的大大降低。因而，大多数序列比较方法被进行设计以产生最佳比对，其在不过度惩罚总同源性得分的情况下考虑到可能的插入和缺失。这通过在序列比对中插入“缺口”以尝试使局部同源性达到最大来实现。

然而，这些更复杂的方法将“缺口罚分（gap penalties）”分配给比对中出现的每个缺口，从而使得对于相同数目的相同氨基酸，具有尽可能少的缺口的序列比对 - 反映了两个比较的序列之间的更高相关性 – 将获得比具有许多缺口的比对更高的得分。一般使用“仿射缺口成本（Affine gap cost）”，其对于缺口的存在负担相对高的成本，而对缺口中的每个之后的残基负担较小的罚分。这是最常用的缺口评分系统。高缺口罚分将当然产生具有较少缺口的最优化比对。大多数比对程序允许修改缺口罚分。然而，当使用这种软件用于序列比较时，优选使用缺省值。

因此，最大%同源性的计算首先需要产生考虑到缺口罚分的最佳比对。用于进行这种比对的合适计算机程序是Vector NTI（Invitrogen Corp.）。可以执行序列比较的软件实例包括，但不限于，例如BLAST程序包（参见Ausubel等人1999 Short Protocols inMolecular Biology，第4版 - 第18章）、BLAST 2（参见FEMS Microbiol Lett 1999 174（2）: 247-50；FEMS Microbiol Lett 1999 177（1）: 187-8和tatiana@ ncbi.nlm.nih.gov）、FASTA（Altschul等人1990 J. Mol. Biol. 403-410）和AlignX。至少BLAST、BLAST 2和FASTA可用于离线和在线检索（参见Ausubel等人1999，第7-58至7-60页）。

尽管最终的%同源性可以按照同一性进行测量，但比对过程本身一般不基于全或无成对比较。相反，通常使用改变比例的相似性得分矩阵，其基于化学相似性或进化距离对每个配对比较分配得分。通常使用的这种矩阵的实例是BLOSUM62矩阵 - BLAST程序套件的缺省矩阵。Vector NTI程序通常使用公开的缺省值或惯例符号比较表（如果提供的话）（关于进一步细节，参见用户手册）。对于一些应用，优选使用Vector NTI程序包的缺省值。

另一方面，可以基于类似于CLUSTAL（Higgins DG & Sharp PM（1988），Gene 73（1），237-244）的算法，使用Vector NTI（Invitrogen Corp.）中的多重比对特征计算来百分比同源性。一旦软件已产生最佳比对，就可能计算%同源性，优选%序列同一性。软件一般将其作为序列比较的一部分来执行，并且生成数值结果。

如果当确定序列同一性时应该使用缺口罚分，则优选地下述参数用于配对比对：

对于BLAST
		缺口打开（GAP OPEN）	0
缺口延伸（GAP EXTENSION）	0

对于CLUSTAL	DNA	蛋白质
				字长	2	1	K三联体
缺口罚分	15	10
				缺口延伸	6.66	0.1

在一个实施方案中，CLUSTAL可以与如上定义的缺口罚分和缺口延伸集合一起使用。在一些实施方案中，用于BLAST或CLUSTAL比对的缺口罚分可以不同于上文详述的那些。技术人员将理解，用于执行BLAST和CLUSTAL比对的标准参数可能定期改变，并且将能够基于当时对于BLAST或CLUSTAL比对算法详述的标准参数来选择适当的参数。

适当地，在至少50个邻接核苷酸上，优选在至少60个邻接核苷酸上，优选在至少70个邻接核苷酸上，优选在至少80个邻接核苷酸上，优选在至少90个邻接核苷酸上，优选在至少100个邻接核苷酸上，优选在至少150个邻接核苷酸上，优选在至少200个邻接核苷酸上，优选在至少250个邻接核苷酸上，优选在至少300个邻接核苷酸上，优选在至少350个邻接核苷酸上，优选在至少400个邻接核苷酸上，优选在至少450个邻接核苷酸上，优选在至少500个邻接核苷酸上，优选在至少550个邻接核苷酸上，优选在至少600个邻接核苷酸上，优选在至少650个邻接核苷酸上，或优选在至少700个邻接核苷酸上，确定关于核苷酸序列的同一性程度。

适当地，可以在整个序列上确定关于核苷酸、cDNA、cds或氨基酸序列的同一性程度。

序列还可以具有氨基酸残基的缺失、插入或取代，其产生沉默变化并导致功能上等价的物质。可以基于残基的极性、电荷、溶解度、疏水性、亲水性和/或两亲特性中的相似性，来进行有意的氨基酸取代，只要物质的次级结合活性得到保留。例如，带阴电的氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸；带阳电的氨基酸包括赖氨酸和精氨酸；且具有相似的亲水性值的具有不带电的极性首基的氨基酸包括亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、甘氨酸、丙氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、苯丙氨酸和酪氨酸。

可以例如根据下表进行保守取代。第二列中相同组中的氨基酸，且优选第三列中的同一行中的氨基酸可以彼此取代：

本发明还包括可能出现的同源取代（取代和置换两者在本文中均用于意指现有氨基酸残基与备择残基的互换），即同类（like-for-like）取代，例如碱性取代碱性、酸性取代酸性、极性取代极性等。非同源取代也可以出现，即从一类残基到另一类残基，或者另一方面涉及非天然氨基酸的包括，所述非天然氨基酸例如鸟氨酸（下文称为Z）、二氨基丁酸鸟氨酸（下文称为B）、正亮氨酸鸟氨酸（下文称为O）、吡啶基丙氨酸、噻吩丙氨酸、萘基丙氨酸和苯甘氨酸。

置换也可以由非天然氨基酸进行，所述非天然氨基酸包括；α*和α-双取代的*氨基酸，N-烷基氨基酸*，乳酸*，天然氨基酸的卤化物衍生物例如三氟酪氨酸*，对- Cl -苯丙氨酸*，对-Br-苯丙氨酸*，对-I-苯丙氨酸*，L-烯丙基-甘氨酸*，β-丙氨酸*，L-α-氨基丁酸*，L-γ-氨基丁酸*，L-α-氨基异丁酸*，L-ε-氨基己酸^#，7-氨基庚酸*，L-甲硫氨酸砜^#*，L-正亮氨酸*，L-正缬氨酸*，对硝基-L-苯丙氨酸*，L-羟脯氨酸^#，L-硫代脯氨酸（thioproline）*，苯丙氨酸（Phe）的甲基衍生物例如4-甲基-Phe*，五甲基-Phe*，L-Phe（4-氨基）^#，L-Tyr（甲基）*，L-Phe（4-异丙基）*，L-Tic（1,2,3,4-四氢异喹啉-3-羧酸）*，L-二氨基丙酸^#和L-Phe（4-苄基）*。记号*已用于上文讨论的目的（与同源取代或非同源取代有关），以指示衍生物的疏水特性，而#已用于指示衍生物的亲水特性，#*指示两亲特征。

除氨基酸间隔基例如甘氨酸或β-丙氨酸残基之外，变体氨基酸序列可以包括合适的间隔基，其可以插入序列的任何两个氨基酸残基之间，包括烷基例如甲基、乙基或丙基。进一步的变异形式涉及拟肽形式的一个或多个氨基酸残基的存在，其将是本领域技术人员充分理解的。为了避免疑问，“拟肽形式”用于指变体氨基酸残基，其中α-碳取代基位于残基的氮原子而不是α-碳上。用于制备拟肽形式的肽的方法是本领域已知的，例如Simon RJ等人，PNAS（1992）89（20），9367-9371以及Horwell DC，Trends Biotechnol.（1995）13（4），132-134。

供本发明之用的核苷酸序列可以在其内包括合成或修饰的核苷酸。许多不同类型的对寡核苷酸的修饰是本领域已知的。这些包括甲基膦酸酯和硫代磷酸酯主链和/或在分子的3'和/或5'端处的吖啶或聚赖氨酸链添加。对本发明来说，应理解本文描述的核苷酸序列可以通过本领域中可获得的任何方法进行修饰。可以进行这种修饰，以增强本发明的核苷酸序列的体内活性或寿命。

本发明还包括与本发明的核酸序列互补的序列，或能够与本发明的序列或与和其互补的序列杂交的序列。如本文使用的术语“杂交”应该包括“通过其核酸链经由碱基配对与互补链结合的过程”，以及如在聚合酶链反应（PCR）技术中进行的扩增过程。

本发明还涉及可以与本发明的核苷酸序列（包括本文呈现的那些的互补序列）杂交的核苷酸序列。优选地，在严格性条件（例如50℃和0.2xSSC {1xSSC = 0.15 M NaCl、0.015 M柠檬酸Na₃，pH 7.0}）下测定杂交。更优选地，在高严格性条件（例如65℃和0.1xSSC{1xSSC = 0.15 M NaCl、0.015 M柠檬酸Na₃，pH 7.0}）下测定杂交。

用于转化植物的一般技术的综述可以在通过Potrykus（Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol [1991] 42:205-225）和Christou（Agro-Food-Industry Hi-Tech 1994年3月/4月 17-27）的论文中找到，所述参考文献引入本文作为参考。关于植物转化的进一步教导可以在引入本文作为参考的EP-A-0449375中找到。

除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语都具有与本公开内容所属领域中的普通技术人员通常理解的相同的含义。Singleton等人，DICTIONARY OFMICROBIOLOGY AND MOLECULAR BIOLOGY，20 ED.，John Wiley and Sons，New York（1994）以及Hale & Marham，THE HARPER COLLINS DICTIONARY OF BIOLOGY，Harper Perennial，NY（1991）为技术人员提供了本公开内容中使用的众多术语的一般字典。

本公开内容并不受本文公开的示例性方法和材料的限制，并且与本文描述的那些方法和材料相似或等价的任何方法和材料都可以用于本公开内容的实施方案的实践或测试中。数值范围包括限定范围的数值在内。除非另外指出，否则分别地，任何核酸序列均以5'至3'的取向从左到右书写；氨基酸序列以氨基至羧基的取向从左到右书写。

本文提供的标题不是对本公开内容的各个方面或实施方案的限制，其可以通过整个地参考说明书来获得。相应地，紧在下文定义的术语通过整个地参考说明书更全面地定义。

氨基酸在本文中使用氨基酸的名称、三字母缩写或单字母缩写来提及。如本文使用的，术语“蛋白质”包括蛋白质、多肽和肽。如本文使用的，术语“氨基酸序列”与术语“多肽”和/或术语“蛋白质”同义。在一些情况下，术语“氨基酸序列”与术语“肽”同义。在一些情况下，术语“氨基酸序列”与术语“酶”同义。

在本公开内容和权利要求中，可以使用氨基酸残基的常规单字母和三字母代码。氨基酸的3-字母代码如依照IUPACIUB生物化学命名联合委员会（IUPACIUB JointCommission on Biochemical Nomenclature）（JCBN）定义的。还应理解，由于遗传密码的简并性，多肽可以由不止一种核苷酸序列编码。

术语的其它定义可能在整个说明书中出现。在更详细地描述示例性实施方案之前，应理解，本公开内容并不限于所述的特定实施方案，因为这些当然可以变化。还应理解，本文使用的术语学仅为了描述特定实施方案起见，且不预期是限制性的，这是因为本公开内容的范围将仅受所附权利要求的限制。

在提供值范围的场合，应理解，除非上下文另有明确指示，否则在所述范围的上限和下限之间的每个以下限单位的十分之一为基准的中间值也被具体公开。在规定范围内的任何规定值或中间值与所述规定范围内的任何其它规定值或中间值之间的每个较小范围都包括在本公开内容内。根据规定范围中任何具体排除的限值，这些较小范围的上限和下限可以独立地包括在所述范围内或从所述范围中排除，并且其中在较小范围内包括任一限值、不包括限值或包括两个限值的每个范围也包括在本公开内容中。在规定范围包括一个或两个限值的场合，排除那些包括的限值中的任一或两者的范围也包括在本公开内容中。

必须指出的是，如本文和所附权利要求中使用的，单数形式“一个（a）”、“一种（an）”和“该/所述（the）”包括复数对象，除非上下文另有明确指示。因此，例如，提及“酶”或“硝酸还原酶”包括本领域技术人员已知的多种这种候选试剂及其等价物，等等。

优点

已令人惊讶地发现，通过调节如本文教导的至少一种犰狳重复蛋白的表达，可以调节（例如降低）植物的生物碱含量（例如尼古丁和/或降烟碱和/或PON含量）和/或TSNA含量，所述至少一种犰狳重复蛋白充当烟草中尼古丁的正调节物。由此，可以生产具有调节的生物碱（例如尼古丁和/或降烟碱和/或PON含量）和/或TSNA含量以及由烟草产品的消费者所追求的商业上期望性状的烟草产品。

本发明人已令人惊讶地确定了通过调节（例如降低）犰狳重复蛋白的表达，用于调节（例如降低）植物（例如烟草植物）的生物碱含量（例如尼古丁和/或降烟碱和/或PON含量）和/或TSNA含量的方法。植物（例如烟草植物）的生物碱（例如尼古丁含量）或TSNA含量可以通过降低或抑制编码犰狳重复蛋白的基因的表达得到降低。植物（例如烟草植物）的生物碱（例如尼古丁含量）或TSNA含量可以通过增加编码犰狳重复蛋白的基因的表达得到增加。在本发明之前，尚不知道如本文所述的犰狳重复蛋白的表达的调节可以用于调节植物（例如烟草植物）的生物碱（例如尼古丁和/或降烟碱和/或PON含量）和/或TSNA含量。

本发明人已确定抑制编码犰狳重复蛋白的基因的表达可以将修饰的植物的生物碱含量（例如尼古丁含量）减少到令人惊讶地低水平。

本文讨论的出版物仅由于其公开内容在本申请的申请日之前而提供。本文中的任何内容都不应解释为承认这种出版物构成本文所附权利要求的现有技术。

实施例

实施例1 - 犰狳重复蛋白的瞬时超表达增加叶片中的生物碱含量

方法和材料

克隆

犰狳重复蛋白表达载体

使用位于侧接基因序列的限制位点外部的引物，从Gateway™相容的cDNA文库中扩增基因序列（SEQ ID No. 3）。然后将基因序列转移至表达载体。

所得到的质粒进行测序，并且通过热休克转化到根癌农杆菌GV3101pMP90内且在TN90叶中瞬时表达。

瞬时基因表达

携带感兴趣的构建体的根癌农杆菌GV3101菌株在补加有适当抗生素的Luria-Bertani（LB）培养基中生长过夜。将培养物快速离心（spin down），并且在含有10 mMMgCl2、10 mM MES pH 5.6和100 µM乙酰丁香酮的缓冲液中，重悬浮至OD600=0.6，并且于室温温育1小时。用无针注射器执行进入TN90叶片内的渗入。渗入后5天获得样品。

测试以三个生物学重复实验执行。

生物碱测量

通过具有串联质谱分析法的反相高效液相层析（LC-MS/MS）来确定吡啶生物碱的相对含量。层析分离使用Gemini-NX层析柱（100 mm × 3.0 mm，粒度3 μm，Phenomenex）以及使用6.5 mM乙酸铵缓冲液（aq）（pH10）和甲醇的梯度层析分离来实现。

质谱仪使用预定的MRM数据采集以电喷射（ESI）正模式运行。对于每种分析物监控两次MRM跃迁，并且对于同位素标记的内标监控一次。

统计分析

用Prism 5.01软件（GraphPad Software）执行基于单因素ANOVA分析的统计显著性。

结果

表达Nitab4.5_0002810g0020.2构建体的5周龄TN90叶片的生物碱含量显示于图1中。尼古丁、降烟碱和PON含量相对于对照表示，并且包含通过单因素ANOVA和Tukey氏多重比较事后检验分析的三个生物学重复实验。值显示为平均值± SEM。星号指示P值≤ 0.001的统计显著性。

Nitab4.5_0002810g0020.2的超表达导致叶片中的尼古丁、降烟碱和PON含量中的显著增加。

结论

Nitab4.5_0002810g0020.2是叶片中的生物碱含量，特别是尼古丁、降烟碱和PON含量的正调节物，并且是烟草中的吡啶生物碱的调节物。

实施例2 - 犰狳重复蛋白的病毒诱导性基因沉默（VIGS）降低叶片中的生物碱含 量

病毒诱导性基因沉默（VIGS）

对于病毒诱导性基因沉默，合成300-核苷酸的cDNA片段，并且使用下述引物Nitab4.5_0002810g0020.2_InFusion 5’ TGAGTAAGGTTACCGAATTC（SEQ ID No. 4）；以及Nitab4.5_0002810g0020.2_InFusion 3’ CTCGAGGCCCGGGCATGTCC（SEQ ID No. 5），用In-Fusion克隆试剂盒克隆到pTV00内（在EcoRI和XhoI位点之间），以形成TRV2- Nitab4.5_0002810g0020.2。然后将所述质粒转化到根癌农杆菌GV3101内。

包含含有靶向的核苷酸序列的（TRV RNA1）和（TRV RNA2）两者的TRV载体在根癌农杆菌中分开进行繁殖。将这些培养物混合（1:1），并且用注射器渗入2-周龄的TN90植物内。通过评估靶基因的表达水平来评估病毒感染后五周的沉默效应。

沉默

VIGS测定如先前所述（Ratcliff等人，2001）Ratcliff，F.等人，（2001），The PlantJournal，25: 237-245（引入本文作为参考）执行。简言之，携带TRV2和TRV1质粒的根瘤农杆菌GV3101的独立培养物在补加有适当抗生素的LB培养基中繁殖过夜。将培养物在VIGS缓冲液（10 mM吗啉乙磺酸pH 5.6、10 mM MgCL₂和100 µM乙酰丁香酮）中重悬浮，将光密度调整至OD₆₀₀=1，并且于室温在黑暗中温育过夜。将这些培养物混合（1:1），并且用注射器渗入2-周龄的TN90植物内。通过评估靶基因的表达水平来评估病毒感染后两周的沉默效应。将TRV-萤光素酶用作阴性对照，并且将TRV-PDS（沉默的叶片的降低的叶绿素含量）用作表型沉默对照。

结果

表达使Nitab4.5_0002810g0020.2沉默的构建体的5周龄TN90叶片的尼古丁、降烟碱和PON含量显示于图2中。含量相对于对照表示，并且包含通过t-检验分析的三个生物学重复实验。值显示为平均值± SEM。星号指示P值≤ 0.001的统计显著性。

使Nitab4.5_0002810g0020.2沉默导致叶片中的尼古丁、降烟碱和PON含量中的降低。

结论

Nitab4.5_0002810g0020.2是叶片中的生物碱含量，特别是尼古丁、降烟碱和PON含量的正调节物，并且是烟草中的吡啶生物碱的调节物。

实施例3 - Nitab4.5_0002810g0020.2-介导的生物碱含量的调节需要Arm结构域

为了确定Arm结构域是否是生物碱含量的调节所需要的，制备其中Nitab4.5_0002810g0020.2的Arm结构域被缺失的构建体（Delta-Arm）。

用于表达所述构建体的方法如实施例1中所述。

结果

表达Nitab4.5_0002810g0020.2和Nitab4.5_0002810g0020.2 Delta-Arm的5周龄TN90叶片的生物碱含量显示于图3中。生物碱含量相对于对照表示，并且包含通过单因素ANOVA和Tukey氏多重比较事后检验分析的三个生物学重复实验。值显示为平均值± SEM。星号指示P值≤ 0.001的统计显著性。

与表达Nitab4.5_0002810g0020.2构建体的叶片相比，表达Nitab4.5_0002810g0020.2-DeltaArm构建体的叶片含有更少的尼古丁、降烟碱和PON。

结论

Nitab4.5_0002810g0020.2-介导的生物碱含量的调节需要Arm结构域。

实施例4 - Nitab4.5_0002810g0020.2反义的瞬时超表达导致尼古丁、降烟碱和 PON中的显著减少

表达Nitab4.5_0002810g0020.2和针对Nitab4.5_0002810g0020.2的反义的5周龄TN90叶片的生物碱含量显示于图4中。生物碱含量相对于对照表示，并且包含通过单因素ANOVA和Tukey氏多重比较事后检验分析的三个生物学重复实验。值显示为平均值± SEM。星号指示P值≤ 0.001的统计显著性。

与表达Nitab4.5_0002810g0020.2构建体的叶片相比，包含Nitab4.5_0002810g0020.2反义的叶片含有更少的尼古丁、降烟碱和PON。

结论

Nitab4.5_0002810g0020.2反义的瞬时超表达导致尼古丁、降烟碱和PON中的显著减少。

实施例5 - 靶向Nitab4.5_0002810g0020.2的人工miRNA的瞬时表达导致尼古丁、 降烟碱和PON中的显著减少

表达Nitab4.5_0002810g0020.2和靶向Nitab4.5_0002810g0020.2的人工miRNA（SEQ ID No. 6）的5周龄TN90叶片的生物碱含量显示于图5中。生物碱含量相对于对照表示，并且包含通过单因素ANOVA和Tukey氏多重比较事后检验分析的三个生物学重复实验。值显示为平均值± SEM。星号指示P值≤ 0.001的统计显著性。

结论

靶向Nitab4.5_0002810g0020.2的人工miRNA的瞬时表达导致尼古丁、降烟碱和PON中的显著减少。

实施例6 - 超表达Nitab4.5_0002810g0020.2的稳定T1选定品系具有增加的生物 碱含量

超表达Nitab4.5_0002810g0020.2，处于12叶片期的温室生长的TN90植物的尼古丁、降烟碱和PON含量显示于图6中。

每个点代表从底部到顶部叶片采样的24个测量的平均值。

图6显示了超表达犰狳重复蛋白的稳定T1品系具有增加的生物碱含量，特别是增加的尼古丁、降烟碱和PON含量。

实施例7 –对于Nitab4.5_0002810g0020.2沉默的成年植物具有降低的生物碱含 量

对于Nitab4.5_0002810g0020.2沉默的温室生长的TN90植物的生物碱含量显示于图7中。

生物碱含量相对于对照表示，并且包含通过单因素ANOVA和Tukey氏多重比较事后检验分析的20株植物/基因型的三个测量值。值显示为平均值± SEM。星号指示P值≤0.001的统计显著性。

图7显示了对于犰狳重复蛋白沉默的成年植物具有降低的生物碱含量，特别是降低的尼古丁、降烟碱和PON含量。

序列表

<110> British American Tobacco (Investments) Limited

<120> 用于修饰植物的生物碱含量的方法和手段

<130> P115515PCT

<150> GB1818715.3

<151> 2018-11-16

<160> 6

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 436

<212> PRT

<213> 烟草（Nicotiana tabacum）

<400> 1

Met Pro Asn Thr Ser Thr Thr Ser Asn Trp Tyr Leu Thr Tyr Ile Lys

1 5 10 15

Leu Arg Phe Phe Thr Lys Val Arg Arg Phe Leu Gln Leu Lys Ala Ala

20 25 30

Ser Lys Lys Pro Leu Lys Pro Ser Asp Gln Pro Arg Glu Lys Ser Asp

35 40 45

Thr Leu Ile Val Ile Glu Glu Gly Glu Lys Gly Glu Lys Gly Ile Met

50 55 60

Gly Lys Glu Ser Asp Ile Lys Asp Asn Gly Trp Met Val Leu Gln Lys

65 70 75 80

Ser Val Lys Lys Leu His Phe Gly Ser Ser Glu Glu Lys Glu Val Ala

85 90 95

Ala Lys Glu Ile Lys Lys Leu Ala Lys Glu Asp Leu Lys Arg Arg Lys

100 105 110

Leu Met Ala Glu Leu Gly Val Ile Pro Pro Leu Val Ala Met Ile Gly

115 120 125

Gly Ser Glu Val Val Leu Arg Arg Gln Arg Leu Ala Val Gln Ala Leu

130 135 140

Val Glu Leu Ala Asn Gly Ser Phe Thr Asn Lys Ala Leu Met Val Glu

145 150 155 160

Ala Gly Ile Leu Ser Arg Leu Pro Gln Lys Pro Asp Asn Leu Asp Gly

165 170 175

Asn Thr Arg Gln Glu Phe Ala Glu Leu Ile Leu Ser Ile Ser Ser Leu

180 185 190

Ala Asn Thr Gln Phe Ser Met Asp Ser Ser Arg Ile Ile Pro Phe Val

195 200 205

Val Ser Ile Leu Asp Ser Ser Asn Ser Ser Val Glu Thr Lys Ser Thr

210 215 220

Cys Leu Gly Thr Leu Tyr Asn Leu Ser Ser Val Leu Glu Asn Ala Ala

225 230 235 240

Ile Leu Ala Thr Asn Gly Thr Met Thr Thr Leu Phe Arg Leu Ser Ser

245 250 255

Leu Lys Glu Val Ser Glu Lys Ala Leu Ala Thr Leu Gly Asn Leu Val

260 265 270

Val Thr Leu Met Gly Lys Lys Ala Met Glu Glu Asn Pro Met Val Pro

275 280 285

Glu Ser Leu Ile Glu Ile Met Thr Trp Glu Glu Lys Pro Lys Cys Gln

290 295 300

Glu Leu Ser Val Tyr Ile Leu Met Ile Leu Ala His Gln Ser Ser Ile

305 310 315 320

Gln Arg Glu Lys Met Ala Lys Ala Gly Ile Val Pro Val Leu Leu Glu

325 330 335

Val Ala Leu Leu Ser Ser Pro Leu Ala Gln Lys Arg Ala Leu Lys Leu

340 345 350

Leu Gln Trp Phe Lys Asp Glu Arg Gln Ser Lys Met Gly Pro His Ser

355 360 365

Gly Pro Gln Ala Gly Arg Ile Ala Ile Asp Ser Pro Pro Val Ser Pro

370 375 380

Arg Ala Val Asp Glu Ser Lys Lys Leu Met Lys Lys Ile Val Lys Gln

385 390 395 400

Ser Leu His Lys Asn Met Glu Thr Ile Thr Ser Arg Ala Asn Gly Gly

405 410 415

Ser Asp Cys Ser Arg Leu Lys Ser Leu Val Val Ser Ser Ser Ser Lys

420 425 430

Ser Leu Pro Tyr

435

<210> 2

<211> 4253

<212> DNA

<213> 烟草（Nicotiana tabacum）

<400> 2

ccgatgtaac tgacatatcg tgaatctgca tgtgctttct gctcttcttg ttttgttgcc 60

ctcaaagtct tcttctctct ttgtctgctt cttttccaac taattctttc tttcaccaaa 120

agtcagatat aaacacactt aatttaaaac cttttagaat ttcaattaaa ccacccctac 180

ccctacccct acccccacca cggcccctac aaaaccgttc ttcttcatat atgtcctctt 240

cacgagtagt atatatcgaa acatgcctaa tacttcaaca actagtaatt ggtatttgac 300

ctacataaag cttaggtttt tcacaaaagt ccgtcggttc cttcagctca aggcagcatc 360

taaaaagcca ttgaaaccgt ctgatcagcc gagagaaaaa tcagatactt tgatcgtgat 420

tgaagaaggt gaaaagggag aaaagggtat aatgggaaaa gagagtgata ttaaagataa 480

tggatggatg gttttgcaaa aatctgtgaa gaaacttcac tttgggagtt cggaagaaaa 540

agaggtggca gccaaagaga taaaaaagtt ggctaaagaa gacttaaaga ggaggaaact 600

gatggcggag ctgggcgtaa ttccgccgct tgtggccatg attggtggtt ctgaggtggt 660

gctgcggcgg cagagattgg ctgttcaagc attagttgag cttgccaatg gctctttcac 720

gtaagttcat ttacttataa ttttataaat cataaatatt aatcactcgt ttaagtaaaa 780

tcctttttta ttttatttta tcaattaatc cactttcttc ttcatgcttg gttttctcct 840

cggctaatag ttacgatcaa gtttaagtgc taagtttgac gctgcactaa tatatgtgtt 900

tatcgtaaaa acgataagaa caagaatcat gaatttataa caatttgtaa ttttataata 960

atgtgagatt ttttcatcac attaagtaag aaatttgtaa aggtgaagtt caaattttat 1020

cccatattcg tgaactggag aactgatttt aaaatttaat taaatcgcat tatccatttt 1080

ggaaaagcaa atggcatgtt aattttctgt ttcgtgattt ctttcagtaa agaacatcta 1140

ttattgccaa aatagaagaa tgaatttata gtttttatta atatcctata aacgttagat 1200

gtcaaggtga ttggcttaat ggtttaaaaa ctgaagtgat aatcttgcat attaaggtta 1260

gaaactaata aaggtaacta aaggtgaatt atatttggta atctagtcaa gatgcatgca 1320

aaaaactcga caattaccgt cctagaaaaa tttagctaac atgtagaata taatatgatt 1380

ttttattgag ctgagatttt gatagtgatc ttattttaat agcaatataa tacaaggggt 1440

tccgtagtac aaatttcatc ctattaagct agtgggtttt agtgcggtgg tatgacgtgg 1500

cgactgatta ttagatgtgt aactaactac ataaagggaa atgtacgaat acgtggagcc 1560

cactgaccac tttcagtggc caatatttga ctttaacaca ctgtatggca cgtgaggtct 1620

ggtttagaga ataatacccc gtctcttggc tcttaaagtg cccaagaagt tcatgacttt 1680

gtacctccca tcatagatag ccataaaaat aaaatatccc tagtgatttt tatcccaata 1740

aaattcaaat atgttccaat tacatctttg tttttcgagg atgtgtatga ccaaaataaa 1800

aaatattact ctctatttca atttagatga tgtagtttga ctcgacacgg agtttaagag 1860

aaaataggac ttttaaaact tgtggtctta aaaacttaaa gagtaaaagc tttgtaggct 1920

aatgtcattt gtgtggctat aaaaacttct cattaatgat aaaagaatta aaatgaagag 1980

tttaaagtta aattatttcc aaacttaaaa atgcgtcatc tattttggaa caaactaaaa 2040

agaaaagtac ttcgtcaccc tgaattctat actatttaaa cgtccaattt taataacgga 2100

ataaaaaact gcagctatgc aaaaagaaaa actctaatat tctattgcat ctactagttt 2160

attctttaat ttcctcgtac ttttctcttt gtactttttg gttaagcgat tggtaagaac 2220

ttttttacat agacttttgt tgtggtctgt ttttaaccat atgatatttc gaaaatagtc 2280

ttaaatctct tcttcatttg aaagccttta aataatgact aagaaagcaa gtagcaaatg 2340

gattttatca acttgacttt cttgccatag cattttcgaa gccttaaaat ggcaaatata 2400

ggttagttga gtcaacttga ccttctagcc cataacattt tatccgaaaa ggacttaggc 2460

ctttttctaa gcctcgattg gtcctacaat acaagtatgt ggtatgacca cattgttttg 2520

gtaattatga agagggttga atcgactcta tgatgatagc gtacagcttt cacctgatct 2580

tttaacattt cagtttcgat aaatatctct tgaaggacaa aataattgat acgtttcacc 2640

caatctttta ttttagtcct atttttatct atgtatttgg attaatttca tgaaaaaaga 2700

cgtcattttt ctcttatgag agtaaaaaaa atataatgat atagaaatta ttgttattgt 2760

agttaaaatt gttgccataa aatgcgttca ctgtctagta caaccatggt ggaataacta 2820

gcgggttgtt cattttacat gttattctta cttgtcttta ttaatatttg tggccgaagt 2880

gatcaaagtg gagtggttca cgtattaatt atatgaaaac aattaagaaa tatggtaaaa 2940

tcgactttgt tgaccttcag ttcttgcact gatctggttt gcagaatctt attgacttct 3000

cactgtcaat aatgttttta atttctattg ttatttattt ggggacccct acttgattgg 3060

gcaatccccc aacttcctac ccatttttct atatcatttt ccaagttgct gaccaataaa 3120

tataactaat gaaagtcata aaattgggtc cctaatgctt ggttattcta atattctttt 3180

tggccatatc attggagtaa ttcatttgtt taacattgtt cttttttctt ggttcccatt 3240

ttcaggaaca aggctctgat ggtagaagca ggaatcttat caagattacc ccaaaaacca 3300

gacaatttag atggaaacac aaggcaagaa tttgcagaat tgatcttgtc tatatcatcc 3360

ctagccaaca cccaattcag tatggattcc tcaagaatta ttccatttgt agtcagcatt 3420

cttgattcat ccaactcaag tgttgaaaca aaaagtacat gtctaggaac attgtacaat 3480

ttatcctcag tgctggaaaa tgctgccatt ttggcaacta atggaacaat gactactctc 3540

tttagattgt cttcattgaa ggaagtatca gagaaagcat tagccacatt gggaaatcta 3600

gtagttacct taatggggaa gaaggcaatg gaagaaaatc ctatggtgcc cgagagctta 3660

atcgaaataa tgacatggga agagaagcca aaatgtcaag aattatcggt ctatattttg 3720

atgattttgg ctcaccagag ttctattcaa agggagaaaa tggctaaggc tggtattgtt 3780

ccagttctac ttgaagtggc attgttgagt agtcctttgg ctcaaaaaag agcattgaaa 3840

ttattacaat ggtttaagga tgaaaggcag agcaaaatgg gacctcactc tgggccacaa 3900

gcaggaagga tagcaattga ttcaccacca gtgagtccaa gagccgttga tgaaagcaag 3960

aaactgatga agaaaattgt gaaacaaagc cttcataaaa atatggaaac aattactagt 4020

agagccaatg gtggtagtga ttgttcaagg cttaagtccc tagttgttag ctcaagttct 4080

aagagtttgc cttactaaga atgatctttt aagcatttta ttaagtctca ccttgcacta 4140

cttgtgcaat gttctgcaag aatttttgta tcatatgaaa atatttgtcc ttcaaacaaa 4200

aaaggagtga tcttaaccaa ataacaataa tctattgatt cgttccattt gtg 4253

<210> 3

<211> 1311

<212> DNA

<213> 烟草（Nicotiana tabacum）

<400> 3

atgcctaata cttcaacaac tagtaattgg tatttgacct acataaagct taggtttttc 60

acaaaagtcc gtcggttcct tcagctcaag gcagcatcta aaaagccatt gaaaccgtct 120

gatcagccga gagaaaaatc agatactttg atcgtgattg aagaaggtga aaagggagaa 180

aagggtataa tgggaaaaga gagtgatatt aaagataatg gatggatggt tttgcaaaaa 240

tctgtgaaga aacttcactt tgggagttcg gaagaaaaag aggtggcagc caaagagata 300

aaaaagttgg ctaaagaaga cttaaagagg aggaaactga tggcggagct gggcgtaatt 360

ccgccgcttg tggccatgat tggtggttct gaggtggtgc tgcggcggca gagattggct 420

gttcaagcat tagttgagct tgccaatggc tctttcacga acaaggctct gatggtagaa 480

gcaggaatct tatcaagatt accccaaaaa ccagacaatt tagatggaaa cacaaggcaa 540

gaatttgcag aattgatctt gtctatatca tccctagcca acacccaatt cagtatggat 600

tcctcaagaa ttattccatt tgtagtcagc attcttgatt catccaactc aagtgttgaa 660

acaaaaagta catgtctagg aacattgtac aatttatcct cagtgctgga aaatgctgcc 720

attttggcaa ctaatggaac aatgactact ctctttagat tgtcttcatt gaaggaagta 780

tcagagaaag cattagccac attgggaaat ctagtagtta ccttaatggg gaagaaggca 840

atggaagaaa atcctatggt gcccgagagc ttaatcgaaa taatgacatg ggaagagaag 900

ccaaaatgtc aagaattatc ggtctatatt ttgatgattt tggctcacca gagttctatt 960

caaagggaga aaatggctaa ggctggtatt gttccagttc tacttgaagt ggcattgttg 1020

agtagtcctt tggctcaaaa aagagcattg aaattattac aatggtttaa ggatgaaagg 1080

cagagcaaaa tgggacctca ctctgggcca caagcaggaa ggatagcaat tgattcacca 1140

ccagtgagtc caagagccgt tgatgaaagc aagaaactga tgaagaaaat tgtgaaacaa 1200

agccttcata aaaatatgga aacaattact agtagagcca atggtggtag tgattgttca 1260

aggcttaagt ccctagttgt tagctcaagt tctaagagtt tgccttacta a 1311

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 4

tgagtaaggt taccgaattc 20

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 5

ctcgaggccc gggcatgtcc 20

<210> 6

<211> 410

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> amiRNA序列

<400> 6

acaaacacac gctcggacgc atattacaca tgttcataca cttaatactc gctgttttga 60

attgatgttt taggaatata tatgtagata cgcccagctc cgccatcact tcacaggtcg 120

tgatatgatt caattagctt ccgactcatt catccaaata ccgagtcgcc aaaattcaaa 180

ctagactcgt taaatgaatg aatgatgcgg tagacaaatt ggatcattga ttctctttga 240

tgatggcggc gctgggcgta cactctctct tttgtattcc aattttcttg attaatcttt 300

cctgcacaaa aacatgcttg atccactaag tgacatatat gctgccttcg tatatatagt 360

tctggtaaaa ttaacatttt gggtttatct ttatttaagg catcgccatg 410

Claims (33)

1.调节（例如降低）植物或其部分或细胞培养物的生物碱含量的方法，所述方法包括通过以下修饰所述植物或细胞培养物：调节（例如降低）至少一种犰狳重复蛋白的表达，所述至少一种犰狳重复蛋白：

a）包含如以下中所示的氨基酸序列：SEQ ID No. 1或者其功能变体或功能片段或直向同源物，或者与SEQ ID No. 1具有至少80%同一性的序列；或

b）由以下编码：如SEQ ID No. 2或3中所示的核苷酸序列；或者SEQ ID No. 2或3的功能变体或功能片段或直向同源物；或者与SEQ ID No. 2或3具有至少80%同一性的核酸序列。

2.调节（例如降低）烟草植物或其植物部分中的烟草特有亚硝胺（TSNA）或TSNA前体含量的方法，所述方法包括通过以下修饰所述植物或细胞培养物：调节（例如降低）至少一种犰狳重复蛋白的表达，所述至少一种犰狳重复蛋白：

a）包含如以下中所示的氨基酸序列：SEQ ID No. 1或者其功能变体或功能片段或直向同源物，或者与SEQ ID No. 1具有至少80%同一性的序列；或

b）由以下编码：如SEQ ID No. 2或3中所示的核苷酸序列；或者SEQ ID No. 2或3的功能变体或功能片段或直向同源物；或者与SEQ ID No. 2或3具有至少80%同一性的核酸序列。

3.编码犰狳重复蛋白的至少一种基因用于调节细胞或植物或其部分或细胞培养物的生物碱含量的用途；其中所述犰狳重复蛋白：

a）包含如以下中所示的氨基酸序列：SEQ ID No. 1或者其功能变体或功能片段或直向同源物，或者与SEQ ID No. 1具有至少80%同一性的序列；或

b）由以下编码：如SEQ ID No. 2或3中所示的核苷酸序列；或者SEQ ID No. 2或3的功能变体或功能片段或直向同源物；或者与SEQ ID No. 2或3具有至少80%同一性的核酸序列。

4.用于生产具有调节的（例如降低的）生物碱含量的植物或其部分、细胞培养物、植物繁殖材料、叶片、切割的收获的叶片、加工叶片或切割且加工的叶片的方法，所述方法包括修饰所述植物或细胞培养物，以：调节（例如降低）至少一种犰狳重复蛋白的表达，所述至少一种犰狳重复蛋白：

a）包含如以下中所示的氨基酸序列：SEQ ID No. 1或者其功能变体或功能片段或直向同源物，或者与SEQ ID No. 1具有至少80%同一性的序列；或

b）由以下编码：如SEQ ID No. 2或3中所示的核苷酸序列；或者SEQ ID No. 2或3的功能变体或功能片段或直向同源物；或者与SEQ ID No. 2或3具有至少80%同一性的核酸序列。

5.根据前述权利要求中任一项的方法或用途，其中所述编码犰狳重复蛋白的至少一种基因的核酸序列中的修饰在犰狳重复结构域中。

6.根据前述权利要求中任一项的方法或用途，其中与尚未进行修饰以：调节至少一种犰狳重复蛋白的表达；或修饰编码犰狳重复蛋白的至少一种基因的核酸序列的植物或细胞培养物相比，所述生物碱含量是调节的（例如降低的）。

7.植物或其部分或细胞培养物，其已进行修饰，以实现与未修饰的植物或未修饰的细胞培养物相比，在生物碱含量中的调节（例如降低），其中所述修饰是至少一种犰狳重复蛋白的表达的调节，所述至少一种犰狳重复蛋白：

a）包含如以下中所示的氨基酸序列：SEQ ID No. 1或者其功能变体或功能片段或直向同源物，或者与SEQ ID No. 1具有至少80%同一性的序列；或

b）由以下编码：如SEQ ID No. 2或3中所示的核苷酸序列；或者SEQ ID No. 2或3的功能变体或功能片段或直向同源物；或者与SEQ ID No. 2或3具有至少80%同一性的核酸序列。

8.植物繁殖材料，其从根据权利要求7的植物、或者通过权利要求1至6中任一项的方法生产的植物或细胞培养物可获得（例如获得）。

9.根据权利要求1至6中任一项的方法或用途、或根据权利要求7的植物或其部分或细胞培养物、或根据权利要求8的植物繁殖材料，其中与尚未进行修饰以调节（例如降低）所述至少一种犰狳重复蛋白的表达、或修饰编码所述犰狳重复蛋白的至少一种基因的核酸序列的植物或细胞培养物相比，所述植物的生物碱含量是降低的。

10.根据权利要求9的方法或用途、根据权利要求7的植物或其部分或细胞培养物、或根据权利要求7的植物繁殖材料，其中与尚未进行修饰以调节编码犰狳重复蛋白的至少一种基因的表达、或修饰编码所述犰狳重复蛋白的至少一种基因的核酸序列的植物或细胞培养物相比，所述至少一种犰狳重复蛋白的表达是降低的。

11.根据权利要求1至6或9至10中任一项的方法或用途、根据权利要求7或9至10的植物或其部分或细胞培养物、或根据权利要求8至10的植物繁殖材料，其中所述植物或细胞培养物的总生物碱含量是调节的（例如降低的）。

12.根据权利要求1至6或9至11中任一项的方法或用途、根据权利要求7或9至11的植物或其部分或细胞培养物、或根据权利要求8至11的植物繁殖材料，其中选自尼古丁、降烟碱、PON、新烟碱、米喔斯明和新烟草碱的一种或多种生物碱的含量是调节的（例如降低的），优选地，尼古丁、降烟碱和/或PON的含量是调节的（例如降低的）。

13.根据权利要求1至6或9至12中任一项的方法或用途、根据权利要求7或9至12的植物或其部分或细胞培养物、或根据权利要求8至12的植物繁殖材料，其中所述植物或植物细胞来自烟草属。

14.根据权利要求13的方法或用途、根据权利要求13的植物或其部分或细胞培养物、或根据权利要求13的植物繁殖材料，其中所述植物是烟草植物，并且尼古丁含量是调节的。

15.根据权利要求14的方法或用途、根据权利要求14的烟草植物或其部分或烟草细胞培养物、或根据权利要求14的植物繁殖材料，其中所述尼古丁含量是降低的。

16.根据权利要求7或9至15任一项的植物或其部分或细胞培养物、或者通过权利要求1至6或9至15中任一项的方法生产的植物培育植物的用途。

17.根据权利要求7或9至15任一项的植物或其部分或细胞培养物、或者通过权利要求1至6或9至15中任一项的方法生产的植物用于生产产品的用途。

18.根据权利要求7或9至15中任一项的植物或其部分、或者通过权利要求1至6或9至15中任一项的方法生产的植物种植作物的用途。

19.根据权利要求7或9至15中任一项的植物或其部分、或者通过权利要求1至6或9至15中任一项的方法生产的植物生产叶片的用途。

20.收获的叶片，其是根据权利要求7或9至15任一项的植物的、或者可得自（例如得自）从根据权利要求8至15任一项的繁殖材料繁殖的植物、或者可得自（例如得自）通过根据权利要求3或5至7或9至19中任一项的用途获得的植物、或者可得自（例如得自）通过权利要求1至6或9至15中任一项的方法生产的植物。

21.根据权利要求20的植物的收获的叶片，其中所述植物的收获的叶片是切割的收获的叶片。

22.加工叶片，优选加工烟草叶片，优选不能存活的加工烟草叶片，其：

可得自（例如得自）从根据权利要求3或5至6或9至19中任一项的用途可获得（例如获得）的植物；

通过加工根据权利要求7或9至15中任一项的植物可获得（例如获得）；

可得自（例如得自）从根据权利要求8至15中任一项的植物繁殖材料繁殖的植物；或

通过加工根据权利要求20或21的植物的收获的叶片可获得（例如获得）；或

可得自（例如得自）通过权利要求1至6或9至15中任一项的方法生产的植物。

23.根据权利要求22的加工叶片，其中所述叶片通过调制、发酵、巴氏灭菌或其组合进行加工。

24.根据权利要求22或23的加工叶片，其中所述加工叶片是切割的加工叶片。

25.调制后的烟草材料，其由根据权利要求14或15的植物或其部分或其提取物制成。

26.烟草掺合物，其包含权利要求25的所述调制后的烟草材料。

27.烟草工业产品，其由以下进行制备：

根据权利要求14至15任一项的烟草植物或其部分，或者根据权利要求14至15任一项的烟草细胞培养物；

从根据权利要求8至15任一项的烟草植物繁殖材料繁殖的烟草植物或其部分；

根据权利要求14至15中任一项的植物的收获的叶片；

根据权利要求20或21的收获的叶片；

根据权利要求22至24中任一项的加工叶片，其中所述植物是烟草；

或

通过权利要求14或15的方法生产的植物。

28.根据权利要求27的烟草工业产品，其中所述烟草产品是：

a）可燃吸烟制品；

b）无烟烟草产品；或

c）非可燃气雾剂供应系统，例如烟草加热设备或气雾剂生成设备。

29.可燃吸烟制品、非可燃气雾剂供应系统、无烟烟草产品或烟草加热设备，其包括根据权利要求7或9至15中任一项的植物或其部分或其提取物（例如烟草提取物）、或根据权利要求7或9至15中任一项的烟草细胞培养物；或根据权利要求25的调制后的烟草材料；或根据权利要求26的烟草掺合物。

30.编码犰狳重复蛋白的核苷酸序列来选择具有调节的（例如降低的）生物碱含量和/或调节的（例如降低的）烟草特有亚硝胺（TSNA）或TSNA前体含量的植物的用途，所述犰狳重复蛋白：

a）包含如以下中所示的氨基酸序列：SEQ ID No. 1或者其功能变体或功能片段或直向同源物，或者与SEQ ID No. 1具有至少80%同一性的序列；或

b）由以下编码：如SEQ ID No. 2或3中所示的核苷酸序列；或者SEQ ID No. 2或3的功能变体或功能片段或直向同源物；或者与SEQ ID No. 2或3具有至少80%同一性的核酸序列。

31.在核苷酸序列中携带可遗传突变的植物的突变体，所述核苷酸序列：

a）包含如以下中所示的氨基酸序列：SEQ ID No. 1或者其功能变体或功能片段或直向同源物，或者与SEQ ID No. 1具有至少80%同一性的序列；或

b）由以下编码：如SEQ ID No. 2或3中所示的核苷酸序列；或者SEQ ID No. 2或3的功能变体或功能片段或直向同源物；或者与SEQ ID No. 2或3具有至少80%同一性的核酸序列，

其中所述可遗传突变调节（例如降低）犰狳重复蛋白的表达，并且其中相对于并不携带所述遗传突变的可比较植物，所述突变植物具有调节的（例如降低的）生物碱含量和/或调节的烟草特有亚硝胺（TSNA）或TSNA前体含量。

32.根据权利要求32的携带可遗传突变的突变植物的后代或种子。

33.由植物产生的收获的叶片、加工叶片或调制后的烟草材料，所述植物包含在核苷酸序列中的修饰，所述核苷酸序列：

a）包含如以下中所示的氨基酸序列：SEQ ID No. 1或者其功能变体或功能片段或直向同源物，或者与SEQ ID No. 1具有至少80%同一性的序列；或

b）由以下编码：如SEQ ID No. 2或3中所示的核苷酸序列；或者SEQ ID No. 2或3的功能变体或功能片段或直向同源物；或者与SEQ ID No. 2或3具有至少80%同一性的核酸序列；

其中所述修饰调节（例如降低）编码犰狳重复蛋白的至少一种基因的表达，并且其中相对于在编码犰狳重复蛋白的至少一种基因中并不携带所述修饰的可比较植物，所述植物具有调节的（例如降低的）生物碱含量和/或调节的烟草特有亚硝胺（TSNA）或TSNA前体含量。

Images