BR112021009579A2

BR112021009579A2 - método de modulação, uso, método para produzir uma planta, planta, material de propagação, folha, material de tabaco, mistura de tabaco, produto , artigo de fumo, mutante de uma planta, progênie ou semente

Info

Publication number: BR112021009579A2
Application number: BR112021009579-9A
Authority: BR
Inventors: Sara Ben Khaled; Francisco Anastacio De Abreu E Lima
Original assignee: British American Tobacco (Investments) Limited
Priority date: 2018-11-16
Filing date: 2019-11-14
Publication date: 2021-08-17
Also published as: EP3880825A1; CN113272434A; GB201818715D0; US20220033837A1; WO2020099875A1; AR117078A1; US12037593B2

Abstract

MÉTODO DE MODULAÇÃO, USO, MÉTODO PARA PRODUZIR UMA PLANTA, PLANTA, MATERIAL DE PROPAGAÇÃO, FOLHA, MATERIAL DE TABACO, MISTURA DE TABACO, PRODUTO, ARTIGO DE FUMO, MUTANTE DE UMA PLANTA, PROGÊNIE OU SEMENTE. A presente invenção fornece um método de modulação (por exemplo, diminuição) do teor de alcaloides de uma planta (por exemplo, uma planta de tabaco), o método compreendendo a modificação da referida planta modulando (por exemplo, diminuindo) a expressão de pelo menos uma proteína de repetição Armadillo. A presente invenção também fornece o uso de uma proteína de repetição Armadillo para modular o teor de alcaloides de uma planta, bem como células de tabaco, plantas, materiais de propagação de plantas, folhas colhidas, tabacos processados ou produtos de tabaco obtidos de acordo com a invenção.

Description

MÉTODO DE MODULAÇÃO, USO, MÉTODO PARA PRODUZIR UMA PLANTA, PLANTA, MATERIAL DE PROPAGAÇÃO, FOLHA, MATERIAL DE TABACO, MISTURA DE TABACO, PRODUTO, ARTIGO DE FUMO, MUTANTE DE UMA PLANTA, PROGÊNIE OU SEMENTE CAMPO DE INVENÇÃO

[0001] A presente invenção refere-se a métodos de modulação de teor de alcaloides, por exemplo, teor de nicotina de uma planta ou parte da mesma. A invenção também se estende a métodos de modulação da expressão de polipeptídeos codificados por genes que modulam o teor de alcaloides nas plantas. Alternativamente, a invenção fornece métodos de modulação da expressão de genes que codificam polipeptídeos que modulam o teor de alcaloides nas plantas. A invenção também se estende a construções, que podem ser usadas para modular os polipeptídeos, células vegetais transformadas com tais construções e às próprias plantas transgênicas. A invenção também se refere ao uso de folhas colhidas de tais plantas transgênicas que foram transformadas com uma construção genética para modular o teor de alcaloides e artigos de fumo (por exemplo, artigos de fumo combustíveis) compreendendo tais folhas.

ESTADO DA TÉCNICA

[0002] Alcaloides são um grupo de compostos de ocorrência natural que contêm principalmente átomos de nitrogênio básico e são produzidos por uma grande variedade de organismos, incluindo bactérias, fungos, plantas e animais.

[0003] Alcaloides podem ser classificados de acordo com a similaridade do esqueleto de carbono, por exemplo, indol-, isoquinolina- e piridina-semelhante. Os derivados de piridina são uma classe de alcaloides monoméricos; esta classe inclui derivados simples de piridina, derivados de piridina policíclicos condensados e não condensados e derivados de sesquiterpeno-piridina. Exemplos são nicotina, nornicotina, anabasina, miosmina e anatabina.

[0004] A maioria das funções biológicas conhecidas dos alcaloides está relacionada à proteção. Moléculas neuroativas, como cafeína, cocaína, morfina e nicotina, agem como compostos de defesa contra predadores invasores. O acúmulo desses alcaloides é o resultado de cascatas de transdução de sinal que monitoram a expressão gênica, atividades enzimáticas e concentrações de alcaloides. O ajuste fino do teor de alcaloides na planta envolve circuitos de resposta negativa e vias de degradação.

[0005] A nicotina ocorre naturalmente em várias variedades de plantas, mas é encontrada em seu nível mais alto na planta do tabaco. O tabaco cultivado produz alcaloides de 2 a 4% em peso seco total. A nicotina é produzida em espécies de Nicotiana selvagens e cultivadas e desempenha um papel importante na defesa das plantas contra herbívoros e insetos (Voelckel et al. 2001, incorporado neste documento por referência), sendo responsável por ~90% do teor total de alcaloides. Os 10% restantes do aglomerado de alcaloides são principalmente constituídos pelos compostos estruturalmente relacionados nornicotina, anatabina, anabasina e pseudoxinicotina (PON).

[0006] A regulação do teor de alcaloides no tabaco é complexa. Vários fatores, incluindo genótipo, ambiente, fertilização e práticas agronômicas (por exemplo, cobertura) afetam os níveis de alcaloides nas plantas de tabaco. Alguns reguladores principais da biossíntese de nicotina são bem caracterizados, por exemplo, putrescina N-metiltransferase (PMT), que desempenha um papel fundamental nesta via, é ativada por membros da superfamília do fator responsivo ao etileno (ERF), a maior família de fatores de transcrição no genoma do tabaco (Rushton et al., 2008 incorporado aqui por referência). Outros fatores de transcrição que induzem a biossíntese de alcaloides pertencem à família da hélice-volta-hélice MYC2-semelhante básica (bHLH). As bHLHs MYC2-semelhante regulam os níveis de alcaloides diretamente, por meio da ligação e ativação mediada por Gbox de genes estruturais de alcaloides, e indiretamente, por meio da ativação de ERFs.

[0007] A modificação do teor de alcaloides em plantas (por exemplo, tabaco) pode ter várias vantagens comerciais. Por exemplo, diminuir o teor total de alcaloides nas plantas pode aumentar o valor da referida planta como uma fonte de biomassa. Por exemplo, a modificação do teor de alcaloides pode compreender a redução do teor de alcaloides, por exemplo, o teor de nicotina das plantas de tabaco. As plantas e produtos de tabaco com nicotina reduzida podem ser desejáveis, tendo em vista a regulamentação potencial dos “limites máximos de nicotina”, ou seja, limites superiores médios de nicotina nos produtos do tabaco. Alternativamente, o aumento do teor de alcaloides em plantas, por exemplo, plantas de tabaco, pode ajudar a proteger as plantas contra insetos e herbívoros. Ainda existe uma necessidade de plantas com teor de alcaloides modulado, por exemplo, com teor de nicotina modulado, com atributos melhorados comercialmente desejáveis e métodos para produzir os mesmos.

[0008] Durante a cura pós-colheita das folhas, as reações entre alcaloides piridínicos e espécies nitrosantes levam à formação de nitrosaminas tabaco específicas (TSNAs). Nornicotina e PON são os precursores de TSNAs NNN e NNK, respectivamente. Reduzir a produção e o acúmulo de nornicotina e PON é de grande importância. A família CYP82E de genes de nicotina desmetilase é o regulador primário da conversão de nicotina em nornicotina, e alterar sua atividade ou acúmulo resulta em uma diminuição nos níveis de NNN. No entanto, nenhuma enzima ou gene responsável pela produção de PON foi identificado até agora.

[0009] Conforme descrito nos Exemplos, os inventores procuraram investigar genes responsáveis, pela síntese de alcaloides, com o objetivo de modular o teor de alcaloides em plantas, por exemplo, diminuindo o teor de nicotina em plantas de tabaco.

RESUMO DA INVENÇÃO

[0010] Surpreendentemente, foi descoberto que ao modular a expressão de uma proteína de repetição Armadillo ou por modificação da sequência de ácido nucleico de pelo menos um gene que codifica uma proteína de repetição Armadillo como ensinado neste documento, o teor de alcaloide e/ou teor de TSNA ou precursor de teor de TSNA de plantas pode ser modulado. O gene que codifica uma proteína de repetição Armadillo, conforme ensinado aqui, atua como um regulador positivo da biossíntese de nicotina. Nitab4.5_0002810g0020.2 é ensinado aqui como regulador positivo de nicotina, nornicotina e PON em tabaco cultivado. Nitab4.5_0002810g0020.2 codifica uma proteína de repetição Armadillo (Arm). Essas proteínas contêm cópias em tandem de um motivo de sequência de proteína degenerada de aproximadamente 40 aminoácidos que forma uma estrutura tridimensional conservada. A função dessas proteínas é geralmente determinada por sequências características fora do domínio Arm.

[0011] De acordo com a presente invenção, os produtos de tabaco com teor de alcaloides modulado e comercialmente características desejáveis procurados pelos consumidores de produtos de tabaco pode ser produzido. Em alguns casos, os consumidores podem desejar um produto com baixos níveis de teor de alcaloides, por exemplo, baixos níveis de teor de nicotina.

[0012] A presente invenção pode ser particularmente útil no campo da agricultura molecular de plantas, onde as plantas (como tabaco e outras Nicotiana spp.) são usadas para a produção de proteínas, peptídeos e metabólitos, por exemplo, para a produção de produtos terapêuticos e farmacêuticos, como antibióticos, partículas semelhantes a vírus ou neutracêuticos ou moléculas pequenas. O tabaco tem sido usado para o desenvolvimento de um anticorpo neutralizante de HIV em um projeto financiado pela UE denominado PharmPlant and Medicago Inc., no Canadá, que trabalharam em uma plataforma baseada no tabaco para a produção de partículas semelhantes a vírus para a fabricação de vacinas contra a gripe.

[0013] Assim, uma planta de acordo com a presente invenção pode ser usada para cultivo molecular para reduzir ou eliminar a presença de nicotina, nornicotina, PON e/ou outros alcaloides nicotínicos. O uso de uma planta ou raiz com baixo teor de nicotina é benéfico na agricultura molecular e reduziria os custos de processamento a jusante associados à purificação.

[0014] Em outros casos, pode ser desejável produzir plantas com altos níveis de alcaloides, por exemplo, altos níveis de teor de nicotina, de modo que a nicotina possa ser purificada a partir da planta do tabaco para produzir um produto de nicotina pura, por exemplo, para uso em dispositivos que utilizam líquido contendo nicotina (por exemplo, cigarros eletrônicos) ou dentro de dispositivos de aquecimento de tabaco. Por exemplo, a produção de plantas com folhas contendo altos níveis de nicotina poderia reduzir os custos de extração de nicotina para a produção de líquidos para cigarros eletrônicos.

[0015] Os presentes inventores surpreendentemente determinaram um método para modulação do teor de alcaloides, por exemplo, o teor de nicotina, de uma planta (por exemplo, uma planta de tabaco) por modulação da expressão ou sequência de ácido nucleico do gene que codifica uma proteína de repetição Armadillo que atua como um positivo regulador de nicotina no tabaco ou pela modificação da sequência de ácido nucleico de pelo menos um gene que codifica uma proteína de repetição Armadillo que atua como um regulador positivo da nicotina no tabaco. O teor de alcaloide (por exemplo, teor de nicotina) de uma planta (por exemplo, planta de tabaco) pode ser reduzido diminuindo a expressão do gene que codifica uma proteína de repetição Armadillo ou modificando a sequência de ácido nucleico de pelo menos um gene que codifica uma proteína de repetição Armadillo (por exemplo, interrompendo o domínio de repetição Armadillo) ou pode ser aumentado por aumento da expressão do gene que codifica um proteína de repetição Armadillo ou por modificação da sequência de ácido nucleico de pelo menos um gene que codifica uma proteína de repetição Armadillo (por exemplo,

aumentando a afinidade de ligação de domínio de repetição Armadillo). Antes da presente invenção, não se sabia que a modulação da expressão do gene que codifica uma proteína de repetição Armadillo ou a modificação da sequência de ácido nucleico de pelo menos um gene que codifica uma proteína de repetição Armadillo como descrito aqui poderia ser usada para modular o teor de alcaloides.

[0016] Em um aspecto, é fornecido um método de modulação (por exemplo, diminuição) do teor de alcaloides de uma planta ou uma parte da mesma, ou uma cultura de células, o método compreendendo a modificação da referida planta ou de uma cultura de células modulando a expressão de pelo menos um gene codificando uma proteína de repetição Armadillo ou modificando a sequência de ácido nucleico de pelo menos um gene que codifica uma proteína de repetição Armadillo.

[0017] Em outro aspecto, é fornecido um método de modulação (por exemplo, diminuição) do teor de uma nitrosamina tabaco específica (TSNA) ou um precursor de uma TSNA em uma planta de tabaco ou parte da planta, o método compreendendo a modificação da referida planta ou uma cultura de células modulando a expressão de pelo menos um gene que codifica uma proteína de repetição Armadillo ou modificando a sequência de ácido nucleico de pelo menos um gene que codifica uma proteína de repetição Armadillo.

[0018] Em um aspecto adicional, é fornecido o uso de pelo menos um gene que codifica uma proteína de repetição Armadillo para modular o teor de alcaloide de uma célula ou planta ou parte da mesma ou uma cultura de células.

[0019] Ainda em outro aspecto, é fornecido um método para a produção de uma planta ou parte da mesma, uma cultura de células, um material de propagação de plantas, uma folha, uma folha colhida cortada, uma folha processada ou uma folha cortada e processada que modulou (por exemplo, diminuição) o teor de alcaloide, o método compreendendo: modificação da referida planta ou cultura de células para modular a expressão de pelo menos um gene que codifica uma proteína de repetição Armadillo; ou modificação da sequência de ácido nucleico de pelo menos um gene que codifica uma proteína de repetição Armadillo.

[0020] Em um aspecto, a presente invenção fornece um método de modulação (por exemplo, diminuição) do teor de alcaloides de uma planta ou uma parte da mesma, ou uma cultura de células, o método compreendendo a modificação da referida planta ou uma cultura de células: a modulação (por exemplo, diminuição) da expressão de pelo menos uma proteína de repetição Armadillo que: a) compreende uma sequência de aminoácidos conforme estabelecida em: SEQ ID No. 1 ou uma variante funcional ou fragmento funcional ou ortólogo da mesma, ou uma sequência que tem pelo menos 80% de identidade com SEQ ID No. 1; ou b) é codificada por uma sequência de nucleotídeos conforme estabelecida em SEQ ID No. 2 ou 3; ou uma variante funcional ou fragmento funcional ou ortólogo de SEQ ID No. 2 ou 3; ou uma sequência de ácido nucleico que tem pelo menos 80% de identidade com a SEQ ID No. 2 ou 3.

[0021] Em um outro aspecto, a presente invenção fornece um método de modulação (por exemplo, diminuição) do teor de uma nitrosamina tabaco específica (TSNA) ou um precursor de uma TSNA em uma planta de tabaco ou parte da planta, o método compreendendo a modificação da referida planta ou uma cultura de células: modulação (por exemplo, diminuição) da expressão de pelo menos uma proteína de repetição Armadillo que: a) compreende uma sequência de aminoácidos conforme estabelecida em: SEQ ID No. 1 ou uma variante funcional ou fragmento funcional ou ortólogo da mesma, ou uma sequência que tem pelo menos 80% de identidade com SEQ ID No. 1; ou b) é codificada por uma sequência de nucleotídeos conforme estabelecida em SEQ ID No. 2 ou 3; ou uma variante funcional ou fragmento funcional ou ortólogo de SEQ ID No. 2 ou 3; ou uma sequência de ácido nucleico que tem pelo menos 80% de identidade com a SEQ ID No. 2 ou 3.

[0022] Em outro aspecto, a presente invenção fornece o uso de pelo menos um gene que codifica uma proteína de repetição Armadillo para modular o teor de alcaloide de uma célula ou planta ou parte da mesma ou uma cultura de células; em que a proteína de repetição Armadillo: a) compreende uma sequência de aminoácidos conforme estabelecida em: SEQ ID No. 1 ou uma variante funcional ou fragmento funcional ou ortólogo da mesma, ou uma sequência que tem pelo menos 80% de identidade com SEQ ID No. 1; ou b) é codificada por uma sequência de nucleotídeos conforme estabelecida em SEQ ID No. 2 ou 3; ou uma variante funcional ou fragmento funcional ou ortólogo de SEQ ID No. 2 ou 3; ou uma sequência de ácido nucleico que tem pelo menos 80% de identidade com a SEQ ID No. 2 ou 3.

[0023] Também fornecido pela presente invenção é um método para produzir uma planta ou parte da mesma, uma cultura de células, um material de propagação de plantas, uma folha, uma folha colhida cortada, uma folha processada ou uma folha cortada e processada que modulou (por exemplo, diminuiu) o teor de alcaloide, o método compreendendo a modificação da referida planta ou cultura de células para: modular (por exemplo, diminuir) a expressão de pelo menos uma proteína de repetição Armadillo que: a) compreende uma sequência de aminoácidos conforme estabelecida em: SEQ ID No. 1 ou uma variante funcional ou fragmento funcional ou ortólogo da mesma, ou uma sequência que tem pelo menos 80% de identidade com SEQ ID No. 1; ou b) é codificada por uma sequência de nucleotídeos conforme estabelecida em SEQ ID No. 2 ou 3; ou uma variante funcional ou fragmento funcional ou ortólogo de SEQ ID No. 2 ou 3; ou uma sequência de ácido nucleico que tem pelo menos 80% de identidade com a SEQ ID No. 2 ou 3.

[0024] Adequadamente, pelo menos um gene que codifica uma proteína de repetição Armadillo pode codificar uma sequência de aminoácidos conforme estabelecido em: SEQ ID No. 1 ou uma variante funcional ou fragmento funcional ou ortólogo da mesma, ou uma sequência que tem pelo menos 80% de identidade com SEQ ID No. 1; ou em que pelo menos um gene que codifica uma proteína de repetição Armadillo compreende uma sequência de ácido nucleico conforme estabelecida em SEQ ID No. 2 ou 3; ou uma variante funcional ou fragmento funcional ou ortólogo de SEQ ID No. 2 ou 3 ou uma sequência de ácido nucleico que tem pelo menos 80% de identidade com SEQ ID No. 2 ou 3.

[0025] Adequadamente, o teor de alcaloides pode ser modulado (por exemplo, diminuído) em comparação com uma planta ou cultura de células que não foi modificada para: modular a expressão de pelo menos uma proteína de repetição Armadillo; ou modificar a sequência de ácido nucleico de pelo menos um gene que codifica uma proteína de repetição Armadillo.

[0026] Em um aspecto adicional, a presente invenção fornece uma planta ou parte da mesma ou uma cultura de células que foi modificada para atingir uma modulação (por exemplo, diminuição) no teor de alcaloides em comparação com uma planta não modificada ou cultura de células não modificada, em que a modificação é a modulação da expressão de pelo menos uma proteína de repetição Armadillo que: a) compreende uma sequência de aminoácidos conforme estabelecida em: SEQ ID No. 1 ou uma variante funcional ou fragmento funcional ou ortólogo da mesma, ou uma sequência que tem pelo menos 80% de identidade com SEQ ID No. 1; ou b) é codificada por uma sequência de nucleotídeos conforme estabelecida em SEQ ID No. 2 ou 3; ou uma variante funcional ou fragmento funcional ou ortólogo de SEQ ID No. 2 ou 3; ou uma sequência de ácido nucleico que tem pelo menos 80% de identidade com a SEQ ID No. 2 ou 3.

[0027] Em um aspecto, é fornecida uma planta ou parte da mesma ou uma cultura de células que foi modificada para atingir uma modulação (por exemplo, diminuição) no teor de alcaloides em comparação com uma planta não modificada ou cultura de células não modificadas, em que a modificação é a modulação da expressão de pelo menos um gene que codifica uma proteína de repetição

Armadillo - pelo menos um gene que codifica uma proteína de repetição Armadillo ou a modificação da sequência de ácido nucleico de pelo menos um gene que codifica uma proteína de repetição Armadillo; em que a proteína de repetição Armadillo compreende uma sequência de aminoácidos tal como estabelecida em: SEQ ID No. 1 ou uma variante funcional ou fragmento funcional ou ortólogo da mesma, ou uma sequência que tem pelo menos 80% de identidade com a SEQ ID No. 1; ou em que, pelo menos, um gene que codifica uma proteína de repetição Armadillo compreende uma sequência de ácido nucleico conforme estabelecida em SEQ ID No. SEQ ID No. 2 ou 3; ou uma variante funcional ou fragmento funcional ou ortólogo de SEQ ID No. 2 ou 3 ou uma sequência de ácido nucleico que tem pelo menos 80% de identidade com SEQ ID No. 2 ou 3.

[0028] Em um aspecto adicional, é fornecido um material de propagação de planta que pode ser obtenível (por exemplo, obtido) de uma planta de acordo com a presente invenção ou de uma planta ou cultura de células produzida pelo método de acordo com a presente invenção.

[0029] Em um aspecto adicional, é fornecido um método ou uso de acordo com a presente invenção, ou uma planta ou parte da mesma ou cultura de células de acordo com a presente invenção, ou um material de propagação de plantas de acordo com a presente invenção, em que o teor de alcaloides da planta é diminuído em comparação com uma planta ou cultura de células que não foi modificada para modular a expressão de pelo menos um gene que codifica uma proteína de repetição Armadillo ou para modificar a sequência de ácido nucleico de pelo menos um gene que codifica uma proteína de repetição Armadillo.

[0030] Adequadamente, a expressão de pelo menos um gene que codifica uma proteína de repetição Armadillo pode ser diminuída em comparação com uma planta ou parte da mesma ou célula ou cultura de células que não foi modificada para modular a expressão de pelo menos um gene que codifica uma proteína de repetição Armadillo.

[0031] Adequadamente, o teor de alcaloides da planta ou parte da mesma ou célula ou cultura de células pode ser aumentado em comparação com uma planta que não foi modificada para modular a expressão de pelo menos uma proteína de repetição Armadillo ou para modificar a sequência de ácido nucleico de pelo menos pelo menos um gene que codifica uma proteína de repetição Armadillo.

[0032] Adequadamente, a planta pode ser modificada para aumentar a expressão de pelo menos um gene que codifica uma proteína de repetição Armadillo ou para modificar a sequência de ácido nucleico de pelo menos uma proteína de repetição Armadillo; e a planta ou cultura de células exibe maior teor de alcaloides em comparação com uma planta ou cultura de células que não foi modificada para modular a expressão de pelo menos uma proteína de repetição Armadillo.

[0033] Adequadamente, o teor total de alcaloides da planta ou cultura de células pode ser modulado. Adequadamente, o teor de um ou mais alcaloides selecionados de nicotina, nornicotina, PON, anabasina, miosmina e anatabina pode ser modulado (por exemplo, diminuído), de preferência o teor de nicotina, nornicotina e/ou PON é modulado (por exemplo, diminuído).

[0034] Em um aspecto, a planta ou célula vegetal é da família Solanaceae.

[0035] Adequadamente, a planta ou célula vegetal pode ser do gênero Solanum.

[0036] Adequadamente, a planta ou célula vegetal pode ser do gênero Nicotiana.

[0037] Adequadamente, o teor de nicotina pode ser modulado. Adequadamente, o teor de nicotina pode ser diminuído.

[0038] Em um aspecto, é fornecido um método ou uso de acordo com a presente invenção, uma planta ou parte da mesma ou cultura de células de acordo com a presente invenção, ou um material de propagação de plantas de acordo com a presente invenção, em que pelo menos um gene que codifica uma proteína de repetição Armadillo compreende uma sequência de aminoácidos conforme estabelecido em: SEQ ID No. 1 ou uma variante funcional ou fragmento funcional ou ortólogo da mesma, ou uma sequência que tem pelo menos 80% de identidade com a SEQ ID No. 1; ou em que o pelo menos um gene que codifica uma proteína de repetição Armadillo compreende uma sequência de ácido nucleico conforme estabelecida em SEQ ID No. SEQ ID No. 2 ou 3; ou uma variante funcional ou fragmento funcional ou ortólogo de SEQ ID No. 2 ou 3 ou uma sequência de ácido nucleico que tem pelo menos 80% de identidade com SEQ ID No. 2 ou 3.

[0039] Em um aspecto adicional, é fornecido um método ou uso de acordo com a presente invenção, uma planta ou parte da mesma ou cultura de células de acordo com a presente invenção, ou um material de propagação de plantas de acordo com a presente invenção, em que um gene adicional que codifica uma proteína de repetição Armadillo é modulada em que o gene adicional compreende uma sequência de nucleotídeos conforme estabelecida em SEQ ID

No. 2 ou 3; ou uma variante funcional ou fragmento funcional ou ortólogo de SEQ ID No. 2 ou 3 ou uma sequência de ácido nucleico que tem pelo menos 80% de identidade com SEQ ID No. 2 ou 3.

[0040] Em um aspecto adicional, a presente invenção fornece o uso de uma sequência de nucleotídeos que codifica uma proteína de repetição Armadillo que: a) compreende uma sequência de aminoácidos conforme estabelecida em: SEQ ID No. 1 ou uma variante funcional ou fragmento funcional ou ortólogo da mesma, ou uma sequência que tem pelo menos 80% de identidade com SEQ ID No. 1; ou b) é codificada por uma sequência de nucleotídeos conforme estabelecida na SEQ ID No. 2 ou 3; ou uma variante funcional ou fragmento funcional ou ortólogo de SEQ ID No. 2 ou 3; ou uma sequência de ácido nucleico que tem pelo menos 80% de identidade com a SEQ ID No. 2 ou 3, para selecionar uma planta com teor de alcaloide modulado (por exemplo, reduzido) e/ou teor de nitrosamina tabaco específica (TSNA) modulado (por exemplo, reduzido) ou um precursor de uma TSNA.

[0041] Em um aspecto, é fornecido o uso de uma planta ou parte da mesma ou cultura de células de acordo com a presente invenção, ou de uma planta produzida pelo método da presente invenção para produzir uma planta.

[0042] Em outro aspecto, é fornecido o uso de uma planta ou parte da mesma ou uma cultura de células de acordo com a presente invenção, ou de uma planta produzida pelo método da presente invenção para a produção de um produto.

[0043] Em ainda outro aspecto, é fornecido o uso de uma planta ou parte da mesma de acordo com a presente invenção, ou de uma planta produzida pelo método de acordo com a presente invenção para cultivar uma cultura.

[0044] Em outro aspecto, é fornecido o uso de uma planta ou parte da mesma de acordo com a presente invenção, ou de uma planta produzida de acordo com a presente invenção para produzir uma folha.

[0045] Em outro aspecto, é fornecida uma folha colhida de uma planta de acordo com a presente invenção, ou obtenível (por exemplo, obtida) (ou obtida) de uma planta propagada de um material de propagação de acordo com a presente invenção, ou obtenível (por exemplo, obtida) (ou obtida) de uma planta obtida por um uso de acordo com a presente invenção, ou obtenível (por exemplo, obtida) (ou obtida) de uma planta produzida pelo método de acordo com a presente invenção.

[0046] Em um aspecto, a folha colhida de uma planta é uma folha colhida cortada.

[0047] Em outro aspecto, é fornecida uma folha processada, de preferência uma folha de tabaco processada, de preferência uma folha de tabaco processada não viável: obtenível (por exemplo, obtida) (ou obtida) de uma planta obtenível (por exemplo, obtida) a partir de um uso de acordo com a presente invenção; obtenível (por exemplo, obtida) (ou obtida) por processamento de uma planta de acordo com a presente invenção;

obtenível (por exemplo, obtida) (ou obtida) de uma planta propagada a partir de um material de propagação de planta de acordo com a presente invenção; ou obtenível (por exemplo, obtida) (ou obtida) por processamento de uma folha colhida de uma planta de acordo com a presente invenção; ou obtenível (por exemplo, obtida) (ou obtida) de uma planta produzida pelo método de acordo com a presente invenção.

[0048] Em um aspecto, a folha é processada por cura, fermentação, pasteurização ou uma combinação dos mesmos.

[0049] Adequadamente, a folha processada pode ser uma folha processada cortada.

[0050] Em outro aspecto, é fornecido material de tabaco curado feito de uma planta ou uma parte da mesma de acordo com a presente invenção ou um extrato da mesma.

[0051] Em um aspecto adicional, é fornecida uma mistura de tabaco que compreende o referido material de tabaco curado de acordo com a presente invenção.

[0052] Em outro aspecto, é fornecido um produto da indústria do tabaco preparado a partir de: uma planta de tabaco de acordo com a presente invenção, ou uma parte da mesma ou uma cultura de células de tabaco de acordo com a presente invenção; uma planta de tabaco ou parte da mesma propagada a partir de um material de propagação de uma planta de tabaco de acordo com a presente invenção;

uma folha colhida de uma planta de acordo com a presente invenção, em que a planta é tabaco; uma folha processada de acordo com a presente invenção, em que a planta é tabaco; ou uma planta produzida pelo método de acordo com a presente invenção.

[0053] Em um aspecto, o produto de tabaco é um artigo de fumo combustível.

[0054] Em outro aspecto, o produto de tabaco é um produto de tabaco sem fumaça.

Adequadamente, o produto de tabaco pode ser um sistema de provisão de aerossol não combustível, como um dispositivo de aquecimento de tabaco ou um dispositivo gerador de aerossol.

[0055] Em um aspecto, é fornecido o uso de uma célula de tabaco de acordo com a presente invenção, para modular o teor de alcaloides em culturas de células.

[0056] Em um aspecto, é fornecido um artigo de fumo combustível, sistema de provisão de aerossol não combustível, produto de tabaco sem fumaça ou dispositivo de aquecimento de tabaco que compreende uma planta ou uma parte da mesma de acordo com a presente invenção ou um extrato (por exemplo, um extrato de tabaco) ou uma cultura de células de tabaco de acordo com a presente invenção; ou um material de tabaco curado de acordo com a presente invenção; ou uma mistura de tabaco de acordo com a presente invenção.

[0057] Em um aspecto adicional, é fornecido o uso de uma sequência de nucleotídeos de pelo menos um gene que codifica uma proteína de repetição Armadillo de preferência onde a sequência da proteína de repetição Armadillo é selecionada de: SEQ ID No. 1 ou uma variante funcional ou fragmento funcional ou ortólogo da mesma, ou uma sequência que tem pelo menos 80% de identidade com a SEQ ID No. 1; ou em que o pelo menos um gene que codifica uma proteína de repetição Armadillo compreende uma sequência de ácido nucleico conforme estabelecida em SEQ ID No. SEQ ID No. 2 ou 3; ou uma variante funcional ou fragmento funcional ou ortólogo de SEQ ID No. 2 ou 3 ou uma sequência de ácido nucleico que tem pelo menos 80% de identidade com SEQ ID No. 2 ou 3, para selecionar uma planta com teor de alcaloides modulado (por exemplo, reduzido) e/ou teor de nitrosamina tabaco específica (TSNA) modulado (por exemplo, reduzido) ou um precursor de uma TSNA.

[0058] Em outro aspecto, a presente invenção fornece um mutante de uma planta que carrega uma mutação hereditária em uma sequência de nucleotídeos que: a) compreende uma sequência de aminoácidos conforme estabelecida em: SEQ ID No. 1 ou uma variante funcional ou fragmento funcional ou ortólogo da mesma, ou uma sequência que tem pelo menos 80% de identidade com SEQ ID No. 1; ou b) é codificada por uma sequência de nucleotídeos conforme estabelecida em SEQ ID No. 2 ou 3; ou uma variante funcional ou fragmento funcional ou ortólogo de SEQ ID No. 2 ou 3; ou uma sequência de ácido nucleico que tem pelo menos 80% de identidade com a SEQ ID No. 2 ou 3,

em que a referida mutação hereditária modula (por exemplo, diminui) a expressão da proteína de repetição Armadillo e em que a planta mutante modulou (por exemplo, diminuiu) o teor de alcaloides e/ou modulou o teor de uma nitrosamina tabaco específica (TSNA) ou um precursor de uma TSNA em relação a uma planta comparável que não carrega a referida mutação hereditária.

[0059] Em um aspecto, é fornecido um mutante de uma planta que carrega uma mutação hereditária em uma sequência de nucleotídeos de pelo menos um gene que codifica uma proteína de repetição Armadillo, preferencialmente em que o gene é selecionado a partir de: SEQ ID No. 2 ou 3; ou uma variante funcional ou fragmento funcional ou ortólogo da mesma; ou uma sequência de ácido nucleico que tem pelo menos 80% de identidade com a SEQ ID No. 2 ou 3; em que a referida mutação hereditária modula (por exemplo, diminui) a expressão de pelo menos um gene que codifica uma proteína de repetição Armadillo ou modifica a sequência de ácido nucleico de pelo menos um gene que codifica uma proteína de repetição Armadillo; e em que a planta mutante modulou (por exemplo, diminuiu) o teor de alcaloides e/ou modulou o teor de uma nitrosamina tabaco específica (TSNA) ou um precursor de uma TSNA em relação a uma planta comparável que não carrega a referida mutação hereditária.

[0060] Em um aspecto adicional, é fornecida progênie ou semente de uma planta mutante que carrega a mutação hereditária de acordo com a presente invenção.

[0061] Em um aspecto adicional, a presente invenção fornece uma folha colhida, uma folha processada ou material de tabaco curado produzido a partir de uma planta que compreende uma modificação em uma sequência de nucleotídeos que:

a) compreende uma sequência de aminoácidos conforme estabelecida em: SEQ ID No. 1 ou uma variante funcional ou fragmento funcional ou ortólogo da mesma, ou uma sequência que tem pelo menos 80% de identidade com SEQ ID No. 1; ou b) é codificada por uma sequência de nucleotídeos conforme estabelecida em SEQ ID No. 2 ou 3; ou uma variante funcional ou fragmento funcional ou ortólogo de SEQ ID No. 2 ou 3; ou uma sequência de ácido nucleico que tem pelo menos 80% de identidade com a SEQ ID No. 2 ou 3; em que a referida modificação modula (por exemplo, diminui) a expressão de pelo menos um gene que codifica uma proteína de repetição Armadillo e em que a referida planta modulou (por exemplo, diminuiu) o teor de alcaloides e/ou modulou o teor de uma nitrosamina tabaco específica (TSNA) ou um precursor de uma TSNA relativo a uma planta comparável que não carrega a referida modificação em pelo menos um gene que codifica uma proteína de repetição Armadillo.

[0062] Em um aspecto, é fornecida uma folha colhida, uma folha processada ou material de tabaco curado produzido a partir de uma planta que compreende uma modificação em uma sequência de nucleotídeos de pelo menos um gene que codifica uma proteína de repetição Armadillo, em que pelo menos um gene é selecionado de SEQ ID No. 2 ou 3 ; ou uma variante funcional ou fragmento funcional ou ortólogo da mesma; ou uma sequência de ácido nucleico que tem pelo menos 80% de identidade com a SEQ ID No. 2 ou 3; em que a referida modificação modula (por exemplo, diminui) a expressão de pelo menos um gene que codifica uma proteína de repetição Armadillo ou modifica a sequência de ácido nucleico de pelo menos um gene que codifica uma proteína de repetição Armadillo; e em que a referida planta modulou (por exemplo, diminuiu) o teor de alcaloides e/ou modulou o teor de uma nitrosamina tabaco específica (TSNA) ou um precursor de uma TSNA em relação a uma planta comparável que não carrega a referida modificação em pelo menos um gene que codifica uma proteína de repetição Armadillo.

[0063] Em um aspecto adicional, é fornecido um método, uma folha, uma planta, um material de propagação de planta, uma folha colhida, um tabaco processado, um produto de tabaco, um uso ou uma combinação dos mesmos, conforme descrito neste documento com referência à descrição e aos desenhos.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[0064] Concretizações da invenção serão descritas agora, por meio apenas de exemplo, com referência aos os desenhos que acompanham, nos quais:

[0065] Figura 1 mostra o teor de nicotina, nornicotina e PON de folhas de TN90 com 5 semanas de idade expressando Nitab4.5_ 0002810g0020.2 (SEQ ID No. 3). O teor de nicotina, nornicotina e PON é representado em relação ao controle e compreende três réplicas biológicas analisadas por teste t. Os valores são apresentados como médias ± SEM. Os asteriscos indicam signiﬁcância estatística de p-valor ≤ 0,001.

[0066] Figura 2 mostra o teor de nicotina, nornicotina e PON de folhas de TN90 com 5 semanas de idade expressando uma construção que silencia Nitab4.5_0002810g0020.2 (SEQ ID No. 3) por silenciamento de gene induzido por vírus. O teor de nicotina, nornicotina e PON é representado em relação ao controle e compreende três réplicas biológicas analisadas por teste t. Os valores são apresentados como médias ± SEM. Os asteriscos indicam signiﬁcância estatística de p-valor ≤ 0,001.

[0067] Figura 3 mostra o teor de alcaloides de folhas de TN90 com 5 semanas de idade expressando as seguintes construções: OE = superexpressão de Nitab4.5_0002810g0020.2; DeltaArm = expressando uma sequência Nitab4.5_0002810g0020.2 que foi modificada para deletar o domínio de repetição Armadillo (Arm). O teor alcaloide é representado em relação ao controle e compreende três repetições biológicas analisadas por ANOVA de uma via e pós-teste de Tukey de comparação múltipla. Os valores são apresentados como médias ± SEM. Os asteriscos indicam signiﬁcância estatística de p-valor ≤ 0,001.

[0068] Figura 4 mostra o teor de alcaloides de folhas de TN90 com 5 semanas de idade expressando as seguintes construções: OE = superexpressão de Nitab4.5_0002810g0020.2; As = Nitab4.5_0002810g0020.2 antissenso. O teor de alcaloides é representado em relação ao controle e compreende três réplicas biológicas analisadas por ANOVA unidirecional e pós-teste de Tukey de comparação múltipla. Os valores são apresentados como médias ± SEM. Os asteriscos indicam signiﬁcância estatística de p-valor ≤ 0,001.

[0069] Figura 5 mostra o teor de alcaloides de folhas de TN90 com 5 semanas de idade expressando as seguintes construções: OE = superexpressão de Nitab4.5_0002810g0020.2; amiRNA = a sequência de amiRNA apresentada na SEQ ID No. 6. O teor de alcaloides é representado em relação ao controle e compreende três réplicas biológicas analisadas por ANOVA unidirecional e pós-teste de Tukey de comparação múltipla. Os valores são apresentados como médias ± SEM. Os asteriscos indicam signiﬁcância estatística de p-valor≤ 0,001.

[0070] Figura 6 mostra o teor de alcaloides de plantas TN90 cultivadas em estufa no estágio de 12 folhas superexpressando Nitab4.5_0002810g0020.2 em linhas T1 estáveis. Cada ponto representa a média de 24 medições amostradas da folha inferior à folha superior.

[0071] Figura 7 mostra o teor de alcaloides de plantas adultas TN90 cultivadas em estufa silenciadas para Nitab4.5_0002810g0020.2. O teor alcaloides é representado em relação ao controle e compreende três medições de 20 plantas/genótipo analisadas por ANOVA unidirecional e pós-teste de comparação múltipla de Tukey. Os valores são apresentados como médias ± SEM. Os asteriscos indicam signiﬁcância estatística do p-valor ≤ 0,001.

[0072] Figura 8 mostra a sequência de aminoácidos de Nitab4.5_0002810g0020.2 - SEQ ID No. 1 - uma proteína de repetição Armadillo de Nicotiana tabacum de acordo com a presente invenção.

[0073] Figura 9 mostra a sequência genômica de Nitab4.5_0002810g0020.2 - SEQ ID No. 2 - que codifica uma proteína de repetição Armadillo de Nicotiana tabacum de acordo com a presente invenção.

[0074] Figura 10 mostra a sequência de transcrição de Nitab4.5_0002810g0020.2 - SEQ ID No. 3 - que codifica uma proteína de repetição Armadillo de Nicotiana tabacum de acordo com a presente invenção.

[0075] Figura 11 mostra a sequência de miRNA utilizada em Figura 5.

LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS

[0076] Um resumo dos identificadores de sequência usados ao longo da especificação em questão e a listagem de sequência correspondente é fornecido, em que:

[0077] SEQ ID No. 1 corresponde à sequência de aminoácidos de Nitab4.5_0002810g0020.2.

[0078] SEQ ID No. 2 corresponde à sequência genômica de Nitab4.5_0002810g0020.2.

[0079] SEQ ID No. 3 corresponde à sequência de transcrição de Nitab4.5_0002810g0020.2.

[0080] SEQ ID No. 4 é a sequência TRV1 usada no Exemplo 2.

[0081] SEQ ID No. 5 é a sequência TRV2 usada no Exemplo 2.

[0082] SEQ ID No. 6 é a sequência de miRNA usada na Figura 5.

Algumas sequências divulgadas aqui contêm "X" ou "N" em sequências de nucleotídeos. “X” ou “N” pode ser qualquer nucleotídeo ou uma deleção ou inserção de um ou mais nucleotídeos. Por exemplo, em alguns casos, uma sequência de “X”s ou “N”s é mostrada. O número de “X”s ou “N”s não se correlaciona necessariamente com o número real de nucleotídeos nessa posição. Pode haver mais ou menos nucleotídeos do que mostrado como na sequência " X " ou "N".

DESCRIÇÃO DETALHADA

[0083] Pela primeira vez, os presentes inventores demonstraram que pela modulação da expressão de pelo menos um gene que codifica uma proteína de repetição Armadillo ou por modificação da sequência de ácido nucleico de pelo menos um gene que codifica uma proteína de repetição Armadillo em uma planta (por exemplo, uma planta de tabaco), o teor de alcaloide e/ou TSNA da planta pode ser modulado.

[0084] A presente invenção fornece um método de modulação (por exemplo, diminuição) do teor de alcaloides de uma planta ou uma parte da mesma, o método compreendendo a modificação da referida planta modulando (por exemplo, aumentando) a expressão de pelo menos um gene que codifica uma proteína de repetição Armadillo ou modificando a sequência de ácido nucleico de pelo menos um gene que codifica uma proteína de repetição Armadillo.

[0085] Também é fornecido um método de modulação (por exemplo, diminuição) do teor de uma nitrosamina tabaco específica (TSNA) ou um precursor de uma TSNA em uma planta de tabaco ou parte da planta, o método compreendendo a modificação da referida planta modulando (por exemplo, aumentando) a expressão de pelo menos um gene que codifica uma proteína de repetição Armadillo ou modificando a sequência de ácido nucleico de pelo menos um gene que codifica uma proteína de repetição Armadillo.

[0086] Pelo menos um gene que codifica uma proteína de repetição Armadillo pode ser selecionado a partir de pelo menos um gene que codifica uma proteína de repetição Armadillo que compreende uma sequência de aminoácidos conforme estabelecido na SEQ ID No. 1 ou uma variante funcional ou fragmento funcional ou ortólogo da mesma, ou uma sequência que tem pelo menos 80% de identidade com a SEQ ID No. 1; ou em que pelo menos um gene que codifica uma proteína de repetição Armadillo compreende uma sequência de nucleotídeos conforme estabelecida na SEQ ID No. 2 ou 3 ou uma variante funcional ou fragmento funcional ou ortólogo de SEQ ID No. 2 ou 3 ou uma sequência de ácido nucleico que tem pelo menos 80% de identidade com a SEQ ID No. 2 ou 3. Adequadamente, a proteína de repetição Armadillo pode compreender um domínio de repetição Armadillo.

[0087] Em um aspecto, pelo menos um gene de proteína de repetição Armadillo codifica um polipeptídeo que compreende uma sequência de aminoácidos conforme estabelecida em: SEQ ID No. 1 ou uma variante funcional ou fragmento funcional ou ortólogo da mesma, ou uma sequência que tem pelo menos 80 % de identidade com a SEQ ID No. 1; ou em que pelo menos um gene que codifica uma proteína de repetição Armadillo compreende uma sequência de nucleotídeos conforme estabelecida em SEQ ID No. 2 ou 3 ou uma variante funcional ou fragmento funcional ou ortólogo de SEQ ID No. 2 ou 3; ou uma sequência de ácido nucleico que tem pelo menos 80% de identidade com a SEQ ID No. 2 ou 3. Adequadamente, a proteína de repetição Armadillo pode compreender um domínio de repetição Armadillo.

[0088] A “expressão” do gene que codifica uma proteína de repetição Armadillo pode se referir ao nível de transcrição, tradução, ou seja, expressão da proteína.

[0089] A medição do nível ou quantidade de um produto gênico pode ser realizada por qualquer método adequado, por exemplo, incluindo a comparação dos níveis de transcrição de mRNA, níveis de proteína ou peptídeo e/ou fenótipo de uma planta, entre uma planta modificada e uma planta comparável que não foi modificada de acordo com a presente invenção.

[0090] O termo "um produto comparável", conforme definido neste documento, seria um derivado de uma planta (por exemplo, uma planta de tabaco) que não tivesse sido modificada de acordo com a presente invenção, mas em que todas as outras características relevantes fossem as mesmas (por exemplo, espécies de plantas, crescimento condições, método de processamento da planta, por exemplo, tabaco, etc.). O produto comparável de acordo com a presente invenção pode significar uma planta (por exemplo, uma planta de tabaco) ou uma parte da mesma, como uma folha (por exemplo, uma folha de tabaco), uma folha colhida (por exemplo, uma folha de tabaco colhida), uma folha colhida cortada (por exemplo, uma folha de tabaco colhida cortada), uma folha processada (por exemplo, uma folha de tabaco processada) ou material de propagação de planta (por exemplo, material de propagação de planta de tabaco), ou um produto compreendendo a referida planta ou parte, por exemplo, um produto de tabaco ou combinações dos mesmos obteníveis (por exemplo obtido) ou obtido de uma planta que não foi modificada de acordo com a presente invenção, por exemplo, para modular a expressão do gene que codifica uma proteína de repetição Armadillo ou para modificar a sequência de ácido nucleico de pelo menos um gene que codifica uma proteína de repetição Armadillo.

Em uma concretização, um produto comparável é aquele que não compreende um gene que codifica uma proteína de repetição Armadillo cuja expressão foi modulada.

Em uma concretização, um produto comparável é aquele que não compreende uma sequência de ácido nucleico modificada que codifica pelo menos um gene que codifica uma proteína de repetição Armadillo.

[0091] O termo "modificando" ou "modificado", tal como utilizado aqui, significa uma planta (por exemplo, uma planta de tabaco) ou sequência de ácido nucleico que foi alterada ou modificada. A presente invenção compreende a modificação de plantas utilizando artes de modificação genética de plantas ou modificação não genética de plantas. Tais métodos são bem conhecidos na arte e exemplos de artes de modificação genética incluem métodos de transformação, transgênicos, cisgênicos e de edição de genes. Exemplos de artes de modificação não genética incluem mutagênese de nêutrons rápidos, mutagênese química, por exemplo, mutagênese de metanossulfonato de etila (EMS) e abordagens modernas de análise de população.

[0092] O termo “planta não modificada”, conforme definido neste documento, seria uma planta (por exemplo, uma planta de tabaco) que não foi modificada de acordo com a presente invenção, por exemplo, para modular a expressão de uma proteína de repetição Armadillo ou para modificar a sequência de ácido nucleico de pelo menos um gene que codifica uma proteína de repetição Armadillo; e em que todas as outras características relevantes eram as mesmas (por exemplo, espécies de plantas, condições de cultivo, método de processamento do tabaco, etc.). Em uma concretização, uma planta não modificada é aquela que não compreende um gene que codifica uma proteína de repetição Armadillo cuja expressão foi modulada. Em uma concretização, uma planta não modificada é aquela que não compreende uma sequência de ácido nucleico modificada que codifica pelo menos um gene que codifica uma proteína de repetição Armadillo.

PROTEÍNA DE REPETIÇÃO ARMADILLO

[0093] Uma “proteína de repetição Armadillo”, conforme utilizada aqui, tem seu significado usual na arte e se refere a uma proteína que compreende repetições Armadillo que são sequências de aminoácidos repetitivas de aproximadamente 40 resíduos de comprimento. Repetições tandem Armadillo geralmente se dobram para formar um domínio Armadillo (ARM).

[0094] A proteína de repetição Armadillo compreende um domínio de repetição Armadillo. Em uma concretização, um domínio de repetição Armadillo é uma sequência que corresponde aos aminoácidos 118 a 162 de SEQ ID No. 1 no alinhamento (por exemplo, alinhamento de GAP) com SEQ ID No. 1.

[0095] As proteínas de repetição Armadillo exercem funções por meio de interações de seu domínio de repetições tandem Armadillo com uma variedade de parceiros de ligação diversos. As proteínas de repetição Armadillo têm papéis como proteínas de contato celular e associadas ao citoesqueleto e funções de sinalização, gerando e transduzindo sinais que afetam a expressão gênica.

[0096] A dobra tridimensional de uma repetição Armadillo é conhecida pela estrutura cristalina da β-catenina. A estrutura cilíndrica da proteína compreende um sulco carregado positivamente que se pensa interagir com as superfícies ácidas dos parceiros de interação da β-catenina (Huber et al., Cell. 1997 Set 5; 90 (5): 871-82).

[0097] Um "gene que codifica uma proteína de repetição Armadillo", conforme usado neste documento, refere-se a um gene que codifica uma proteína de repetição Armadillo.

[0098] Em uma concretização, uma proteína de repetição Armadillo compreende uma sequência de aminoácidos mostrada como SEQ ID No. 1 ou uma sequência que tem pelo menos 80% (tal como, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 93%, pelo menos 94 %, pelo menos 95%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%) de identidade com a SEQ ID No. 1, ou uma homóloga da mesma. Adequadamente, a proteína de repetição Armadillo pode compreender um domínio de repetição Armadillo, tal como um domínio que corresponde aos aminoácidos de 118 a 162 de SEQ ID No. 1 no alinhamento (por exemplo, alinhamento de gap) com SEQ ID No. 1.

[0099] Em uma concretização, a proteína de repetição Armadillo de acordo com a presente invenção compreende ou consiste de uma sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID No. 1.

[0100] Adequadamente, a proteína pode ser de Nicotiana tabacum.

[0101] Em uma concretização, a proteína Armadillo é codificada por uma sequência de polinucleotídeos em que o gene (antes da mutação) compreende a sequência mostrada como SEQ ID No. 2 ou 3; ou uma sequência que tem pelo menos 80% de identidade de sequência com aquela. Adequadamente, a proteína de repetição Armadillo pode compreender um domínio de repetição Armadillo, tal como um domínio que corresponde aos aminoácidos de 118 a 162 de SEQ ID No. 1 no alinhamento (por exemplo, alinhamento de gap) com SEQ ID No. 1.

[0102] Adequadamente, a proteína Armadillo para uso de acordo com a presente invenção pode ser codificada por uma sequência de polinucleotídeos em que o gene (antes da mutação) compreende a sequência mostrada como SEQ ID No. 2, ou uma sequência que tem pelo menos 80% de identidade de sequência com a mesma (preferencialmente pelo menos 85%, preferencialmente pelo menos 90%, preferencialmente pelo menos 93%, preferencialmente pelo menos 94%, preferencialmente pelo menos 95%, pelo menos 97%, ou pelo menos 99% de identidade com a mesma). Adequadamente, a proteína de repetição Armadillo pode compreender um domínio de repetição Armadillo, tal como um domínio que corresponde aos aminoácidos de 118 a 162 de SEQ ID No. 1 no alinhamento (por exemplo, alinhamento de gap) com SEQ ID No. 1.

[0103] Adequadamente, a proteína Armadillo para uso de acordo com a presente invenção pode ser codificada por uma sequência de polinucleotídeos em que o gene (antes da mutação) compreende a sequência mostrada como SEQ ID No. 3, ou uma sequência que tem pelo menos 80% de identidade de sequência com a mesma. (preferencialmente pelo menos 85%, preferencialmente pelo menos 90%, preferencialmente pelo menos 93%, preferencialmente pelo menos 94%, preferencialmente pelo menos 95%, pelo menos 97%, ou pelo menos 99% de identidade com a mesma). Adequadamente, a proteína de repetição Armadillo pode compreender um domínio de repetição Armadillo, tal como um domínio que corresponde aos aminoácidos de 118 a 162 de SEQ ID No. 1 no alinhamento (por exemplo, alinhamento de gap) com SEQ ID No. 1.

[0104] Em uma concretização, a proteína Armadillo é codificada por uma sequência de polinucleotídeos em que o gene (antes da mutação) é selecionado a partir de: SEQ ID No. 2 ou 3.

[0105] Adequadamente, a proteína tipo selvagem para uso de acordo com a presente invenção pode ser codificada por uma sequência de polinucleotídeos de Nicotiana tabacum.

[0106] Em um aspecto, a presente invenção fornece um método de redução do teor de alcaloides de uma planta ou parte da mesma ou de células (por exemplo, célula de planta), o método compreendendo a modificação da referida planta por reduzir ou inibir a expressão de, pelo menos, uma proteína de repetição Armadillo conforme definido aqui.

[0107] Em um aspecto, a presente invenção fornece um método de redução do teor de alcaloides de uma planta ou parte da mesma ou célula (por exemplo, célula vegetal), o método compreendendo a modificação da referida planta diminuindo ou inibindo a expressão de pelo menos um gene que codifica uma proteína de repetição Armadillo conforme definido aqui.

[0108] Em um aspecto, a presente invenção fornece um método de redução do teor de alcaloides de uma planta ou parte da mesma ou célula da planta, o método compreendendo a modificação referida planta, diminuindo ou inibindo a expressão de, pelo menos, uma proteína de repetição Armadillo: comprende a sequência de aminoácido mostrada como SEQ ID No. 1, ou uma sequência que tem pelo menos 80% de identidade com a mesma ou uma variante funcional ou fragmento funcional ou ortólogo de SEQ ID No. 1; ou é codificado por uma sequência de nucleotídeos conforme estabelecida na SEQ ID No. 2 ou 3, ou uma variante funcional ou fragmento funcional ou ortólogo da SEQ ID No. 2 ou 3, ou uma sequência de ácido nucleico que tem pelo menos 80% de identidade com a SEQ ID No. 2 ou 3. Adequadamente, a proteína de repetição Armadillo pode compreender um domínio de repetição Armadillo.

[0109] Em um aspecto, a presente invenção fornece um método de redução do teor de uma nitrosamina tabaco específica (TSNA) ou um precursor de uma TSNA de uma planta ou parte da mesma (por exemplo, folha), o método compreendendo a modificação da referida planta diminuindo ou inibindo a expressão de pelo menos uma proteína de repetição Armadillo como definida aqui.

[0110] Em um aspecto, a presente invenção fornece um método de redução do teor de uma nitrosamina tabaco específica (TSNA) ou um precursor de uma TSNA uma planta ou parte da mesma (por exemplo, folha), o método compreendendo a modificação da referida planta diminuindo ou inibindo a expressão de pelo menos um gene que codifica uma proteína de repetição Armadillo como definido aqui.

[0111] Em um aspecto, a presente invenção fornece um método de redução do teor de uma nitrosamina tabaco específica (TSNA) ou um precursor de uma TSNA uma planta ou parte da mesma (por exemplo, folha), o método compreendendo a modificação da referida planta diminuindo ou inibindo a expressão de pelo menos uma proteína de repetição Armadillo que: a) compreende uma sequência de aminoácidos conforme estabelecido em: SEQ ID No. 1 ou uma variante funcional ou fragmento funcional ou ortólogo da mesma, ou uma sequência que tem pelo menos 80% de identidade com SEQ ID No. 1; ou b) é codificada por uma sequência de nucleotídeos conforme estabelecida em SEQ ID No. 2 ou 3; ou uma variante funcional ou fragmento funcional ou ortólogo de SEQ ID No. 2 ou 3; ou uma sequência de ácido nucleico que tem pelo menos 80% de identidade com a SEQ ID No. 2 ou 3.

[0112] O termo "inibir" (por exemplo, inibir a expressão do gene que codifica uma proteína de repetição Armadillo), tal como utilizado aqui, significa que a expressão do gene que codifica a proteína de repetição Armadillo é menor ou diminuída em comparação com a expressão do gene em um produto comparável.

[0113] A expressão de genes específicos que codificam as proteínas de repetição Armadillo pode ser medida por medição da transcrição e/ou tradução do gene. Os métodos de medição da transcrição são bem conhecidos na arte e incluem, entre outros, Northern blot, RNA-Seq, hibridização in situ, microarranjo de DNA e RT-PCR. Alternativamente, a expressão de um gene pode ser medida indiretamente medindo o nível do produto do gene, por exemplo, a proteína codificada pelo referido gene.

[0114] Em algumas concretizações, a expressão do gene que codifica uma proteína de repetição Armadillo pode ser modulada (ou seja, aumentada ou diminuída) em pelo menos cerca de 10% 20% 30%, ou 40%, adequadamente pelo menos cerca de 50%, 60%, 70%, mais adequadamente, pelo menos cerca de 80%, 90%, 95% ou 100% quando comparada com a expressão do gene que codifica uma proteína de repetição Armadillo em uma planta (por exemplo, uma planta de tabaco) que não foi modificada de acordo com a presente invenção.

[0115] Adequadamente, a expressão do gene da proteína de repetição Armadillo pode ser reduzida, parcialmente inativada, inibida, eliminada, nocauteada ou perdida de modo que a expressão da proteína ou função do gene da proteína de repetição Armadillo não seja detectável.

[0116] Em um aspecto, pelo menos um gene da proteína de repetição Armadillo é eliminado. Em outras palavras, o gene da proteína de repetição Armadillo ficou completamente inoperante.

[0117] Qualquer método conhecido na arte para reduzir ou prevenir a expressão de uma proteína pode ser usado nos métodos de acordo com a presente invenção.

[0118] A título de exemplo, o presente método pode compreender:  fornecimento de uma mutação em uma sequência de ácido nucleico que codifica uma proteína compreendendo a sequência de aminoácidos mostrada como SEQ ID No. 1, ou uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 80% (tal como, pelo menos 85%, pelo menos 90%, em pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%) de identidade de sequência com a mesma;  fornecimento de uma mutação em uma região reguladora (por exemplo, um promotor ou um intensificador) que contribui para controlar a expressão de uma proteína compreendendo a sequência de aminoácidos mostrada como SEQ ID No. 1, ou uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 80% (tal como, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%) de identidade de sequência com a mesma;  fornecimento de um RNA antissenso, siRNA ou miRNA que reduz o nível de sequência de ácido nucleico que codifica uma proteína compreendendo a sequência de aminoácidos mostrada como SEQ ID No. 1, ou uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 80% (tal como, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%) de identidade de sequência com a mesma.

[0119] Cada uma das abordagens acima resulta na redução ou prevenção da expressão de: uma proteína compreendendo a sequência de aminoácidos mostrada como SEQ ID No. 1; ou uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 80% (tal como, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%) de identidade de sequência com a mesma ou que compreende uma sequência de nucleotídeos conforme estabelecida em SEQ ID No. 2 ou 3 ou uma variante funcional ou fragmento funcional ou ortólogo de SEQ ID No. 2 ou 3 ou uma sequência de ácido nucleico que tem pelo menos 80% (tal como, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%) de identidade com SEQ ID No. 2 ou 3.

[0120] Em um aspecto, uma sequência regulatória da proteína de repetição Armadillo pode ser modificada. A sequência reguladora pode ser, por exemplo, um promotor, intensificador ou outro sinal regulador. Adequadamente, a modificação da sequência reguladora pode resultar na diminuição da expressão da proteína de repetição Armadillo. Por exemplo, modificações como mutação ou deleção de um promotor podem diminuir a expressão da proteína de repetição Armadillo.

[0121] Conforme usado neste documento, o termo "mutação" abrange uma variante genética natural ou uma variante projetada. Em particular, o termo "mutação" refere-se a uma variação na sequência de nucleotídeos que codifica a sequência de aminoácidos ou na sequência de aminoácidos em comparação com a sequência mostrada como SEQ ID No. 1, ou uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 80% (preferencialmente pelo menos 85%, preferencialmente pelo menos 90%, preferencialmente pelo menos 93%, preferencialmente pelo menos 95%, preferencialmente pelo menos 98%, preferencialmente pelo menos 99%) de identidade de sequência com a mesma.

[0122] Em uma concretização, a mutação diminui o teor de alcaloides de uma planta. Em outra concretização, a mutação diminui o teor de, pelo menos, uma TSNA ou um precursor de uma TSNA no tabaco.

[0123] Em uma concretização, um método de acordo com a presente invenção pode compreender o fornecimento de uma sequência de ácido nucleico a uma planta ou parte da mesma ou célula vegetal, quando o referido ácido nucleico resulta na redução ou eliminação da expressão de pelo menos um gene que codifica uma proteína de repetição Armadillo.

[0124] Em uma concretização, um método de acordo com a presente invenção pode compreender o fornecimento de uma sequência de ácido nucleico a uma planta ou parte da mesma ou célula vegetal, em que o referido ácido nucleico resulta na modificação da sequência de ácido nucleico de pelo menos um gene que codifica uma proteína de repetição Armadillo.

[0125] Adequadamente, a referida sequência de ácido nucleico pode ser introduzida na planta ou parte da mesma ou célula.

[0126] Adequadamente, uma sequência de ácido nucleico endógena na planta ou parte da mesma ou célula pode ser modificada para codificar o polipeptídeo de acordo com a presente invenção (por exemplo, por edição de gene). Por exemplo, uma sequência de nucleotídeos endógena pode ser modificada para diminuir a expressão de pelo menos um gene que codifica uma proteína de repetição Armadillo.

[0127] Em uma concretização preferida, cada cópia de uma sequência de ácido nucleico que codifica uma proteína compreendendo uma sequência mostrada como SEQ ID No. 1, ou uma sequência que tem pelo menos 80% (tal como, pelo menos 85%, pelo menos 90%, em pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%) de identidade de sequência ou em que pelo menos um gene que codifica uma proteína de repetição Armadillo compreende uma sequência de nucleotídeos como estabelecida na SEQ ID No. 2 ou 3, ou uma variante funcional ou fragmento funcional ou ortólogo da SEQ ID No. 2 ou 3 ou uma sequência de ácido nucleico que tem pelo menos 80% (tal como, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%) de identidade com a SEQ ID No. 2 ou 3 que está presente na planta é modificada, por exemplo, mutada conforme definido neste documento (por exemplo, cada cópia genômica de um gene que codifica a referida proteína em uma planta é mutada). Por exemplo, cada cópia do gene no genoma alotetraplóide de N. tabacum pode ser mutada.

[0128] Em uma concretização preferida, a planta ou célula vegetal de acordo com a presente invenção é homozigótica. Adequadamente, a planta ou célula vegetal pode ser homozigótica para a modificação, por exemplo, inibição ou mutação.

[0129] Em uma concretização, a planta ou célula vegetal de acordo com a presente invenção expressa apenas o ácido nucleico modificado, por exemplo, mutado que codifica a proteína de repetição Armadillo. Em outras palavras, em algumas concretizações, nenhuma proteína endógena (ou endógena e funcional) está presente na planta de acordo com a presente invenção. Em outras palavras, se qualquer proteína endógena está presente, ela está preferencialmente em uma forma inativa.

[0130] Em uma concretização, o presente método pode compreender o fornecimento de uma mutação na sequência de ácido nucleico mostrada como SEQ ID No. 2 ou 3, ou uma sequência de ácido nucleico que tem pelo menos 80% (tal como, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%) de identidade com a mesma.

[0131] A mutação pode alterar o genoma da planta de modo que uma sequência de ácido nucleico que codifica uma proteína compreendendo a sequência de aminoácidos mostrada como SEQ ID No. 1, ou uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 80% (tal como, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%) de identidade de sequência com a mesma é completamente ou parcialmente deletada ou modificada de outra forma para evitar a proteína de repetição Armadillo de formação de proteína: interações de proteínas.

[0132] A mutação pode interromper a sequência de ácido nucleico que codifica uma proteína compreendendo a sequência de aminoácidos mostrada como SEQ ID No. 1, ou uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 80% (tal como, pelo menos 85%, pelo menos 90%, em pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos

95%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%) de identidade de sequência com a mesma.

[0133] A interrupção pode fazer com que a sequência de ácido nucleico não seja transcrita e/ou traduzida.

[0134] A sequência de ácido nucleico pode ser interrompida, por exemplo, por deleção ou modificação de outra forma do códon de iniciação ATG da sequência de ácido nucleico de modo que a tradução da proteína seja reduzida ou evitada.

[0135] A sequência de ácido nucleico pode compreender uma ou mais mudança(s) de nucleotídeo que reduzem ou previnem a expressão da proteína ou afetam o tráfego de proteínas. Por exemplo, a expressão da proteína pode ser reduzida ou evitada pela introdução de um ou mais códons de parada prematuros, uma mudança de estrutura, um mutante de emenda ou uma substituição de aminoácido não tolerada no quadro de leitura aberta.

[0136] Um códon de parada prematuro refere-se a uma mutação que introduz um códon de parada no quadro de leitura aberta e evita a tradução de toda a sequência de aminoácidos. O códon de parada prematuro pode ser um códon TAG ("âmbar"), TAA ("ocre") ou TGA ("opala" ou "umber").

[0137] Uma mutação de alteração de quadro (também chamada de erro de enquadramento ou mudança de quadro de leitura) é uma mutação causada por indels (inserções ou deleções) de um número de nucleotídeos em uma sequência de ácido nucleico que não é divisível por três. Devido à natureza tripla da expressão do gene por códons, a inserção ou exclusão pode alterar o quadro de leitura, resultando em uma tradução completamente diferente da original. Uma mutação de alteração de quadro geralmente causa a leitura dos códons após a mutação para codificar diferentes aminoácidos. A mutação de alteração de quadro normalmente resultará na introdução de um códon de parada prematuro.

[0138] Um mutante de emenda insere, deleta ou altera um número de nucleotídeos no sítio específico em que a emenda ocorre durante o processamento do RNA mensageiro precursor em RNA mensageiro maduro. A deleção do sítio de emenda resulta na permanência de um ou mais íntrons no mRNA maduro e pode levar à produção de proteínas anormais.

[0139] Uma substituição de aminoácido não tolerada refere-se a uma mutação que causa uma substituição de aminoácido não sinônima na proteína que resulta em função reduzida ou ablacionada da proteína.

[0140] Qualquer método conhecido na arte para fornecer uma mutação em uma sequência de ácido nucleico pode ser usado no método de acordo com a presente invenção. Por exemplo, a recombinação homóloga pode ser usada, na qual um vetor é criado em que a(s) sequência(s) de ácido nucleico relevante(s) são mutadas e usadas para transformar plantas ou células vegetais. Plantas recombinantes ou células vegetais que expressam a sequência mutada podem então ser selecionadas.

[0141] Em uma concretização, a mutação introduz uma substituição de aminoácido não tolerada em uma proteína que compreende uma sequência de aminoácidos mostrada como SEQ ID No. 1, ou uma sequência que tem pelo menos 80% (tal como, pelo menos 85%, pelo menos 90 %, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%) de identidade de sequência com a mesma.

[0142] Em uma concretização, a mutação reduz, inibe ou elimina a capacidade da proteína de repetição Armadillo de formar interações proteína-proteína em comparação com uma proteína mostrada como SEQ ID No. 1, ou uma sequência que tem pelo menos 80% (como em pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%) de identidade de sequência com a mesma.

[0143] Em uma concretização, a mutação não altera o nível ou a expressão da proteína, mas reduz, inibe ou elimina a capacidade da proteína de repetição Armadillo de formar interações proteína-proteína em comparação com uma proteína mostrada como SEQ ID No. 1, ou uma sequência que tem pelo menos 80% (tal como, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%) de identidade de sequência com a mesma. Adequadamente, a mutação pode estar no domínio de repetição Armadillo da proteína de repetição Armadillo. Adequadamente, a mutação pode estar no domínio de interação proteína-proteína da proteína de repetição Armadillo.

[0144] A expressão de uma proteína pode ser determinada medindo a presença da proteína usando um anticorpo específico para a proteína de repetição Armadillo, por exemplo, anticorpos específicos para uma repetição Armadillo por Western blot. A capacidade de uma proteína de repetição Armadillo modulada ou mutada de formar interações proteína-proteína pode ser determinada, por exemplo, realizando experimentos de co- imunoprecipitação usando uma proteína de repetição Armadillo modulada ou mutada e uma proteína de repetição Armadillo não modificada ou mutada correspondente. Se a modulação ou mutação na proteína de repetição Armadillo reduz, inibe ou elimina a capacidade da proteína de repetição Armadillo de formar interações proteína-proteína, a co-imunoprecipitação mostrará que a proteína de repetição Armadillo modulada ou mutada terá menos interações proteína: proteína.

[0145] Em uma concretização, uma proteína de repetição Armadillo compreende um domínio de repetição Armadillo.

[0146] Tal como utilizado aqui, o termo "domínio de repetição Armadillo " refere-se a um domínio de proteína estruturalmente conservado de cerca de 40-45 aminoácidos que está envolvido em interações proteína-proteína.

[0147] Os domínios de repetição Armadillo podem ser anotados ou previstos por comparação da sequência de aminoácidos com estruturas de proteínas conhecidas. Por exemplo, proteínas de repetição Armadillo e domínios de proteína de repetição Armadillo podem ser identificados por alinhamento de sequência contra SEQ ID No. 1, em que a presença de resíduos de aminoácidos correspondentes àqueles de cerca do aminoácido 118 até cerca de 162 de SEQ ID No. 1 indica um domínio de repetição Armadillo.

[0148] Em uma concretização, um domínio de repetição Armadillo é uma região de uma proteína que corresponde a cerca dos aminoácidos 118 a 162 da SEQ ID No. 1.

[0149] Em uma concretização, um domínio de repetição Armadillo é uma sequência que corresponde aos aminoácidos 118 a 162 de SEQ ID No. 1 no alinhamento (por exemplo, alinhamento de gap) com SEQ ID No. 1.

[0150] Em uma concretização, o domínio de repetição Armadillo pode conter uma mutação que modula a expressão de pelo menos um gene que codifica uma proteína de repetição Armadillo. Em uma concretização, o domínio de repetição Armadillo pode conter uma mutação que aumenta a expressão de pelo menos um gene que codifica uma proteína de repetição Armadillo. Em uma concretização, o domínio da proteína de repetição Armadillo pode conter uma mutação que diminui a expressão de pelo menos um gene que codifica uma proteína de repetição Armadillo.

[0151] A mutação pode ser uma deleção, uma mutação de emenda ou códon que codifica uma substituição de aminoácido não tolerada.

[0152] Em uma concretização, o domínio de repetição Armadillo pode ser mutado, modificando assim a capacidade da proteína de repetição Armadillo de formar interações proteína:proteína. Em outras palavras, o domínio de repetição Armadillo pode sofrer mutação, resultando em uma modificação da afinidade de ligação da proteína de repetição Armadillo. Em uma concretização, a mutação pode ser compreendida em uma região que corresponde a cerca do aminoácido 118-162 de SEQ ID No. 1. Em uma concretização, a mutação pode estar compreendida em uma região que corresponde ao aminoácido 118-162 de SEQ ID No. 1. Adequadamente, a numeração de aminoácidos corresponde ao alinhamento com SEQ ID No. 1, por exemplo, alinhamento de gap.

[0153] Em uma concretização, a sequência de ácido nucleico que codifica a proteína de repetição Armadillo pode ser totalmente ou parcialmente deletada. A deleção pode ser contínua ou pode compreender uma pluralidade de seções de sequência. A deleção remove de preferência uma quantidade suficiente de sequência de nucleotídeos de modo que a sequência de ácido nucleico não codifique mais uma proteína de repetição Armadillo funcional. A deleção pode ser total, caso em que 100% da porção de codificação da sequência de ácido nucleico esteja ausente, quando comparada com o genoma correspondente de uma planta não modificada comparável. A deleção pode, por exemplo, remover pelo menos 50, 60, 70, 80 ou 90% da porção de codificação da sequência de ácido nucleico. Adequadamente, pelo menos parte da proteína pode ser deletada. A deleção pode, por exemplo, remover pelo menos 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80 ou 90% da porção codificadora da proteína.

[0154] A deleção pode remover pelo menos parte do domínio de repetição Armadillo.

[0155] A deleção pode, por exemplo, remover pelo menos 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80 ou 90% do domínio da proteína de repetição Armadillo.

[0156] Adequadamente, a deleção pode remover pelo menos 5 aminoácidos, pelo menos 10 aminoácidos, pelo menos 15, pelo menos 20, pelo menos 25, pelo menos 30 aminoácidos do domínio da proteína de repetição Armadillo. Adequadamente, a deleção pode remover pelo menos 5 aminoácidos, pelo menos 10 aminoácidos, pelo menos 15, pelo menos 20, pelo menos 25, pelo menos 30 aminoácidos do domínio da proteína de repetição Armadillo, em que o referido domínio corresponde a cerca de resíduo aminoácido 118 até cerca do resíduo aminoácido 162 de SEQ ID No. 1.

[0157] Em uma concretização, a deleção pode remover pelo menos 100 aminoácidos, pelo menos 150, pelo menos 200, pelo menos 250, pelo menos 300, pelo menos 350, pelo menos 400, pelo menos 450, pelo menos 500, pelo menos 550 aminoácidos do C-terminal da proteína de repetição Armadillo.

[0158] Adequadamente, a proteína mutada pode ser uma proteína truncada que carece de pelo menos cerca de 100 aminoácidos, pelo menos cerca de 150, pelo menos cerca de 200, pelo menos cerca de 250, pelo menos cerca de 300, pelo menos cerca de 350, pelo menos cerca de 400, pelo menos pelo menos cerca de 450, pelo menos cerca de 500, pelo menos cerca de 550 aminoácidos correspondentes aos aminoácidos do C-terminal de SEQ ID No. 1 ou uma sequência que tem pelo menos 80% (de preferência, pelo menos 85%, pelo menos, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98%) de identidade de sequência com uma proteína truncada que carece de pelo menos cerca de 100 aminoácidos, pelo menos cerca de 150, pelo menos cerca de 200, pelo menos cerca de 250, pelo menos cerca de 300, pelo menos cerca de 350, pelo menos cerca de 400, pelo menos cerca de 450, pelo menos cerca de 500, pelo menos cerca de 550 aminoácidos correspondentes aos aminoácidos do C- terminal de SEQ ID No. 1.

[0159] Adequadamente, a proteína mutada pode ser uma proteína truncada que carece de pelo menos 100 aminoácidos, pelo menos 150, pelo menos 200, pelo menos 250, pelo menos 300, pelo menos 350, pelo menos cerca de 400, pelo menos cerca de 450, pelo menos cerca de 500, pelo menos cerca de 550 aminoácidos correspondentes aos aminoácidos do C-terminal da SEQ ID No. 1 ou uma sequência que tem pelo menos 80% (de preferência pelo menos 85%, pelo menos, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98%) de identidade de sequência com uma proteína truncada que carece de pelo menos 100 aminoácidos, pelo menos 150, pelo menos 200, pelo menos 250, pelo menos 300, pelo menos 350, pelo menos cerca de 400, pelo menos cerca de 450, pelo menos cerca de 500, pelo menos cerca de 550 aminoácidos correspondentes aos aminoácidos do C- terminal da SEQ ID No. 1.

[0160] Os métodos para deleção de sequências de ácido nucleico em plantas são conhecidos na arte. Por exemplo, a recombinação homóloga pode ser usada, na qual um vetor é criado em que a(s) sequência(s) de ácido nucleico relevante(s) estão ausentes e é usada para transformar plantas ou células vegetais. Plantas recombinantes ou células vegetais que expressam a nova porção da sequência podem então ser selecionadas.

[0161] As células vegetais transformadas com um vetor, conforme descrito neste documento, podem ser cultivadas e mantidas de acordo com métodos de cultivo de tecidos bem conhecidos, como por meio do cultivo das células em um meio de cultivo adequado fornecido com os fatores de crescimento necessários, como aminoácidos, hormônios vegetais, vitaminas, etc.

[0162] A modificação da sequência de ácido nucleico pode ser realizada usando métodos de mutagênese direcionada (também referida como troca de nucleotídeos direcionada (TNE) ou mutagênese oligo-direcionada (ODM)). Os métodos de mutagênese direcionada incluem, sem limitação, aqueles que empregam nucleases de dedo de zinco, TALENs (ver WO2011/072246 e WO2010/079430), Cas9-semelhante, Cas9/crRNA/tracrRNA, Cas9/gRNA ou outros sistemas CRISPR (ver WO 2014/071006 e WO2014/093622), meganucleases (ver WO2007/047859 e WO2009/059195) ou métodos de mutagênese direcionada empregando oligonucleotídeos mutagênicos, possivelmente contendo nucleotídeos modificados quimicamente para aumentar a mutagênese com complementaridade de sequência ao gene, em protoplastos de plantas (por exemplo, KeyBase® ou TALENs).

[0163] Alternativamente, sistemas de mutagênese, tais como TILLING (Lesões Locais Induzidas em Genomas IN Genomics; McCallum et al., 2000, Nat Biotech 18: 455, e McCallum et al. 2000, Plant Physiol. 123, 439-442, ambos incorporados aqui por referência) pode ser usado para gerar linhagens de plantas que compreendem um gene que codifica uma proteína com uma mutação. TILLING usa mutagênese química tradicional (por exemplo, mutagênese de metanossulfonato de etila (EMS), que produz mutações aleatórias) seguida por varredura de alto rendimento para mutações. Assim, podem ser obtidas plantas, sementes, células e tecidos compreendendo um gene possuindo a mutação desejada.

[0164] O método pode compreender as etapas de mutagenização de sementes de plantas (por exemplo, mutagênese EMS), agrupamento de indivíduos de plantas ou DNA, amplificação por PCR de uma região de interesse, formação de heteroduplex e detecção de alto rendimento, identificação da planta mutante, sequenciamento dos produtos de PCR mutante. Entende-se que outros métodos de mutagênese e seleção podem igualmente ser usados para gerar tais plantas modificadas. As sementes podem, por exemplo, ser irradiadas ou tratadas quimicamente e as plantas podem ser rastreadas para um fenótipo modificado.

[0165] A mutagênese por deleção de nêutrons rápida pode ser usada no sentido da genética reversa (ou seja, com PCR) para identificar linhagens de plantas que carregam uma deleção no gene endógeno. Veja, por exemplo, Ohshima et al. (1998) Virology 213: 472-481; Okubara et al. (1994) Genetics 137: 867-874; e

Quesada et al. (2000) Genetics 154: 421-4315 que são incorporados aqui por referência.

[0166] Em outra abordagem, os mutantes dominantes podem ser usados para desencadear o silenciamento de RNA devido à inversão do gene e recombinação de um lócus de gene duplicado. Ver, por exemplo, Kusaba et al. (2003) Plant Cell 15: 1455-1467 (incorporado aqui por referência).

[0167] As plantas modificadas podem ser distinguidas de plantas não modificadas, ou seja, plantas de tipo selvagem, por métodos moleculares, como a(s) mutação/mutações presente(s) no DNA, e pelas características fenotípicas modificadas. As plantas modificadas podem ser homozigóticas ou heterozigóticas para a modificação. De preferência, as plantas modificadas são homozigóticas para a modificação.

[0168] Em uma concretização, o método de redução ou prevenção da expressão de uma proteína compreendendo a sequência de aminoácidos mostrada como SEQ ID No. 1, ou uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 80% (tal como, pelo menos 85%, pelo menos 90 %, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%) de identidade de sequência com a mesma não compreende o tratamento da planta com um produto químico (por exemplo, um agroquímico).

[0169] Outras maneiras de reduzir ou prevenir a expressão serão aparentes para um habilitado na arte e incluem o uso de silenciamento de gene induzido por vírus (VIGs), silenciamento de micro RNA, RNAi, antissenso, inserções de tDNA ou construções negativas dominantes (ou mutações antimórficas).

[0170] Em uma concretização, a expressão de uma proteína compreendendo a sequência de aminoácidos mostrada como SEQ ID No. 1, ou uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 80% (tal como, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%) de identidade de sequência com a mesma pode ser reduzida ou eliminada por silenciamento de gene induzido por vírus.

[0171] Em uma concretização, a expressão de uma proteína compreendendo a sequência de aminoácidos mostrada como SEQ ID No. 1, SEQ ID No. 1 ou uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 80% (tal como, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%) de identidade de sequência com a mesma pode ser reduzida ou eliminada por microRNAs.

[0172] Em uma concretização, a expressão de uma proteína compreendendo a sequência de aminoácidos mostrada como SEQ ID No. 1, SEQ ID No. 1 ou uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 80% (tal como, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%) de identidade de sequência com a mesma pode ser reduzida ou eliminada por RNAi.

[0173] Em uma concretização, a expressão de uma proteína compreendendo a sequência de aminoácidos mostrada como SEQ ID No. 1, SEQ ID No. 1 ou uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 80% (tal como, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%) de identidade de sequência com a mesma pode ser reduzida ou eliminada por supressão antissenso.

[0174] Em uma concretização, a expressão de uma proteína compreendendo a sequência de aminoácidos mostrada como SEQ ID No. 1, SEQ ID No. 1 ou uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 80% (tal como, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%) de identidade de sequência com a mesma pode ser reduzida ou eliminada por supressão senso.

[0175] Em uma concretização, a expressão de uma proteína compreendendo a sequência de aminoácidos mostrada como SEQ ID No. 1, SEQ ID No. 1 ou uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 80% (tal como, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%) de identidade de sequência com a mesma pode ser reduzida ou eliminada por inserções de tDNA.

[0176] Em uma concretização, a expressão de uma proteína compreendendo a sequência de aminoácidos mostrada como SEQ ID No. 1, SEQ ID No. 1 ou uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 80% (tal como, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%) de identidade de sequência com a mesma pode ser reduzida ou eliminada por construções negativas dominantes (ou mutações antimórficas).

[0177] Em uma concretização, a expressão de uma proteína compreendendo a sequência de aminoácidos mostrada como SEQ ID No. 1, SEQ ID No. 1 ou uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 80% (tal como, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%) de identidade de sequência com a mesma pode ser reduzida ou eliminada por um sistema baseado em mutagênese direcionada.

[0178] Em uma concretização, a expressão de uma proteína compreendendo a sequência de aminoácidos mostrada como SEQ ID No. 1, SEQ ID No. 1 ou uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 80% (tal como, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%) de identidade de sequência com a mesma pode ser reduzida ou eliminada pelo sistema baseado em CRISPR.

[0179] Em uma concretização, a expressão de uma proteína compreendendo a sequência de aminoácidos mostrada como SEQ ID No. 1, ou uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 80% (tal como, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%) de identidade de sequência com a mesma pode ser reduzida ou eliminada por nuclease de dedo de zinco, TALENs, meganucleases, oligonucleotídeos mutagênicos ou TILLING.

[0180] Em um aspecto, a presente invenção fornece um método para aumentar o teor de alcaloide de uma planta ou parte da mesma ou célula vegetal, o método compreendendo a modificação da referida planta aumentando a expressão de pelo menos um gene que codifica uma proteína de repetição Armadillo.

[0181] Em um aspecto, a presente invenção fornece um método de aumento do teor de alcaloides de uma planta ou parte da mesma ou célula da planta, o método compreendendo a modificação da referida planta, aumentando a expressão de pelo menos um gene que codifica um proteína de repetição Armadillo compreendendo a sequência de aminoácido mostrada como SEQ ID No. 1, ou uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 80% (tal como, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 97 %, pelo menos 98%, pelo menos 99%), ou uma variante funcional ou fragmento funcional ou ortólogo de uma sequência de aminoácidos conforme estabelecida na SEQ ID No. 1, ou em que pelo menos um gene que codifica uma proteína de repetição Armadillo compreende uma sequência de nucleotídeos conforme estabelecida na SEQ ID No. 2 ou 3, ou uma variante funcional ou fragmento funcional ou ortólogo da SEQ ID No. 2 ou 3, ou uma sequência de ácido nucleico que tem pelo menos 80% (tal como pelo menos 85 %, pelo menos 90%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%) de identidade com a SEQ ID No. 2 ou 3.

[0182] Em um aspecto, a presente invenção fornece um método para diminuir o teor de uma nitrosamina tabaco específica (TSNA) ou um precursor de uma TSNA de uma planta ou parte da mesma (por exemplo, folha), o método compreendendo a modificação da referida planta diminuindo a expressão de pelo menos uma proteína de repetição Armadillo.

[0183] Em um aspecto, a presente invenção fornece um método de diminuição do teor de uma nitrosamina tabaco específica (TSNA) ou um precursor de uma TSNA de uma planta ou parte da mesma (por exemplo, folha), o método compreendendo a modificação da referida planta reduzindo a expressão de pelo menos um gene que codifica uma proteína de repetição Armadillo.

[0184] Em um aspecto, a presente invenção fornece um método de diminuição do teor de uma nitrosamina tabaco específica (TSNA) ou um precursor de uma TSNA de uma planta ou parte da mesma (por exemplo, folha), o método compreendendo a modificação da referida planta pela redução da expressão de pelo menos um gene que codifica uma proteína de repetição Armadillo compreendendo a sequência mostrada como SEQ ID No. 1, ou uma sequência que tem pelo menos 80% de identidade com uma sequência de aminoácidos conforme estabelecida na SEQ ID No. 1, ou uma variante funcional ou fragmento funcional ou ortólogo de SEQ ID No. 1, ou em que pelo menos um gene que codifica uma proteína de repetição Armadillo compreende uma sequência de nucleotídeos conforme estabelecida em SEQ ID No. 2 ou 3, ou uma variante funcional ou fragmento funcional ou ortólogo de SEQ ID No. 2 ou 3, ou uma sequência de ácido nucleico que tem pelo menos 80% de identidade com a SEQ ID No. 2 ou 3.

[0185] O termo “aumentar” (por exemplo, aumentar a expressão de gene que codifica uma proteína de repetição Armadillo) como usado aqui significa que a expressão do gene da proteína de repetição Armadillo é maior em comparação com a expressão do gene não modificado em um produto comparável.

[0186] Em algumas concretizações, uma modificação que aumenta a expressão de pelo menos um gene de proteína de repetição Armadillo e, assim, o aumento do teor de alcaloides e/ou o teor de TSNA (ou precursor da mesma) é selecionado a partir do grupo que consiste de: melhoria, promoção ou aumento da transcrição, tradução ou expressão de pelo menos uma proteína de repetição Armadillo; aumento da síntese do polipeptídeo codificado por pelo menos uma proteína de repetição Armadillo; ou sua liberação de armazenamentos intracelulares; ou redução da taxa de degradação do polipeptídeo codificado por pelo menos um gene de proteína de repetição Armadillo.

[0187] Adequadamente, o método pode compreender a transformação de uma célula de uma planta (por exemplo, uma planta de tabaco) com uma construção genética que codifica pelo menos uma proteína de repetição Armadillo compreendendo uma sequência de aminoácidos conforme estabelecida na SEQ ID No. 1, ou uma variante funcional ou funcional fragmento ou ortólogo da mesma, ou uma sequência que tem pelo menos 80% de identidade com a SEQ ID No. 1; ou que compreende uma sequência de nucleotídeos conforme estabelecida na SEQ ID No. 2 ou 3 ou uma variante funcional ou fragmento funcional ou ortólogo da SEQ ID No. 2 ou 3, ou uma sequência de ácido nucleico que tem pelo menos 80% de identidade com a SEQ ID No. 2 ou 3; ou que compreende uma sequência de nucleotídeos que codifica uma proteína que é capaz de promover ou aumentar pelo menos um gene de proteína de repetição Armadillo endógena.

[0188] Será apreciado que cada uma dessas opções resultaria em um aumento da atividade e expressão do polipeptídeo codificado por pelo menos um gene de proteína de repetição Armadillo. O método pode compreender a regeneração da planta a partir da célula transformada. Neste ponto, é proporcionado o uso da construção genética que é capaz de aumentar a expressão de um polipeptídeo codificado por pelo menos um gene da proteína de repetição Armadillo para aumento do teor de alcaloides (por exemplo, teor de nicotina) e ou teor de TSNA (ou um precursor do mesmo) em uma planta ou parte da mesma ou célula transformada com a construção.

[0189] A construção genética pode codificar um polipeptídeo compreendendo o aminoácido de SEQ ID No. 1, ou uma variante funcional ou fragmento funcional ou ortólogo da mesma, ou uma sequência que tem pelo menos 80% de identidade com SEQ ID No. 1; ou que compreende uma sequência de nucleotídeos conforme estabelecida na SEQ ID No. 2 ou 3, ou uma variante funcional ou fragmento funcional ou ortólogo da SEQ ID No. 2 ou 3, ou uma sequência de ácido nucleico que tem pelo menos 80% de identidade com a SEQ ID No. 2 ou 3.

[0190] Em outra concretização, a invenção se refere a um método de aumento do teor de alcaloides de uma planta ou parte da mesma e/ou teor de TSNA (ou precursor da mesma) em uma planta ou parte da planta, compreendendo a modificação da referida planta aumentando a atividade de pelo menos um gene que codifica uma proteína de repetição Armadillo.

[0191] Em uma concretização, a atividade de pelo menos um gene que codifica uma proteína de repetição Armadillo pode ser aumentada pela introdução (ou fornecimento) de uma mutação em pelo menos um gene que codifica uma proteína de repetição Armadillo.

[0192] Adequadamente, a expressão de pelo menos um gene que codifica uma proteína de repetição Armadillo pode ser aumentada pela introdução de uma mutação para: a) pelo menos um gene que codifica uma proteína de repetição Armadillo que compreende uma sequência de aminoácidos conforme estabelecida na SEQ ID No. 1; ou uma variante funcional ou fragmento funcional ou ortólogo da mesma, ou uma sequência que tem pelo menos 80% de identidade com a SEQ ID No. 1; ou b) uma sequência de nucleotídeos conforme estabelecida na SEQ ID No. 2 ou 3, ou uma variante funcional ou fragmento funcional ou ortólogo da SEQ ID No. 2 ou 3, ou uma sequência de ácido nucleico que tem pelo menos 80% de identidade com a SEQ ID No. 2 ou 3.

[0193] Em uma concretização, a proteína de repetição Armadillo para uso de acordo com a presente invenção exibe atividade aumentada em comparação com uma proteína de repetição Armadillo não modificada. A proteína de repetição Armadillo para uso de acordo com a presente invenção pode exibir pelo menos cerca de 1%, pelo menos cerca de 3%, pelo menos cerca de 5%, pelo menos cerca de 10%, pelo menos cerca de 20%, pelo menos cerca de 30%, pelo menos cerca de 40%, pelo menos cerca de 50%, pelo menos cerca de 60%, pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 80% ou pelo menos cerca de 90% de ligação aumentada em comparação com uma proteína de repetição Armadillo não modificada.

TEOR DE ALCALOIDES

[0194] Em uma concretização, a presente invenção fornece um método de modulação do teor de alcaloides de uma planta (por exemplo, uma planta de tabaco) ou uma parte da mesma, o método compreendendo a modificação da referida planta por meio da modulação da expressão de pelo menos uma proteína de repetição Armadillo.

[0195] Em uma concretização, a presente invenção fornece um método de modulação do teor de alcaloides de uma planta (por exemplo, uma planta de tabaco) ou uma parte da mesma, o método compreendendo a modificação da sequência de ácido nucleico de pelo menos um gene que codifica uma proteína de repetição Armadillo.

[0196] O termo "modulação" é usado neste documento para significar aumento ou diminuição.

[0197] O termo “aumento de teor de alcaloides” é utilizado aqui para significar que a concentração e/ou teor de alcaloides total no produto da presente invenção (por exemplo, planta, parte da mesma (por exemplo, folha), folha processada ou um produto feito a partir da planta (por exemplo, um produto de tabaco) é superior em comparação com um produto semelhante que não tenha sido modificado de acordo com a presente invenção.

[0198] O termo "redução do teor de alcaloides" é usado neste documento para significar que a concentração e/ou teor de alcaloides total no produto da presente invenção (por exemplo, planta, parte da mesma (por exemplo, folha), folha processada ou um produto feito a partir da planta (por exemplo um produto de tabaco)) é inferior em comparação com um produto comparável que não foi modificado de acordo com a presente invenção.

[0199] Em algumas concretizações, a modulação do teor de alcaloides se refere a um aumento no teor de alcaloide, em que a expressão de pelo menos um gene de proteína de repetição Armadillo é diminuída (ou inibida).

[0200] Em algumas concretizações, a modulação do teor de alcaloide se refere a um aumento no teor de alcaloides em que a sequência de ácido nucleico de pelo menos um gene que codifica uma proteína de repetição Armadillo foi modificada.

[0201] Em algumas concretizações, a modulação do teor de alcaloides se refere a uma diminuição no teor de alcaloides, em que a expressão de pelo menos uma proteína de repetição Armadillo é diminuída, inibida ou eliminada. Em algumas concretizações, a modulação do teor de alcaloides se refere a uma diminuição no teor de alcaloides, em que a expressão de pelo menos um gene que codifica uma proteína de repetição Armadillo é diminuída, inibida ou eliminada.

[0202] Em algumas concretizações, a modulação do teor de alcaloides se refere a uma diminuição no teor de alcaloides em que a sequência de ácido nucleico de pelo menos um gene que codifica uma proteína de repetição Armadillo foi modificada.

[0203] Em um outro aspecto, o teor de alcaloide é medido a partir das folhas. Em um aspecto, o teor de alcaloides é medido a partir de folhas verdes. Em um aspecto adicional, o teor de alcaloides é medido a partir de folhas curadas, por exemplo, folhas curadas ao ar, curadas em fumeiro, curadas ao fogo ou curadas ao sol. Em um aspecto adicional, o teor de alcaloides é medido a partir de folhas curadas em fumeiro. Em um outro aspecto, o teor de alcaloide é medido a partir de folhas curadas ao ar.

[0204] O termo "teor de alcaloides" é usado neste documento para significar a concentração e/ou a quantidade total de todo o grupo de compostos classificados como alcaloides. Alcaloides tipicamente presentes no tabaco incluem nicotina, nornicotina, PON, anatabina, anabasina e miosmina. Em uma concretização, o teor de um ou mais alcaloides selecionados de nicotina, nornicotina, PON, anatabina, anabasina e miosmina é modulado. Em uma concretização, o teor de um ou mais alcaloides selecionados de nicotina, nornicotina, PON, anatabina, anabasina e miosmina é reduzido. Em uma concretização, o teor de um ou mais alcaloides selecionados de nicotina, nornicotina, PON, anatabina, anabasina e miosmina é aumentado. Adequadamente, o teor de nicotina pode ser modulado. Em uma concretização, o teor de nicotina é reduzido. Em outra concretização, o teor de nicotina é aumentado.

[0205] Qualquer método conhecido na arte para determinar a concentração e/ou o teor total de alcaloides pode ser usado. Um método preferido para analisar o teor de alcaloides envolve a análise por cromatografia gasosa-método de detecção por ionização de chama (GC-FID).

[0206] Em uma concretização, é fornecido um método para a produção de uma planta (por exemplo, uma planta de tabaco) ou parte da mesma, um material de propagação de planta (por exemplo, um material de propagação de planta de tabaco), uma célula (por exemplo, uma célula de tabaco), uma folha (por exemplo, uma folha de tabaco), uma folha colhida (por exemplo, uma folha de tabaco colhida), uma folha colhida cortada (por exemplo, uma folha de tabaco colhida cortada), uma folha processada (por exemplo, uma folha de tabaco processada), uma folha cortada e processada (por exemplo, uma folha de tabaco cortada e processada), um produto compreendendo a referida planta ou parte da mesma (por exemplo, um produto de tabaco) ou combinações das mesmas obteníveis (por exemplo, obtida) ou obtida por uma planta da invenção que tem teor de alcaloide modulado, o método compreendendo: modificação da referida planta para modular a expressão do gene que codifica uma proteína de repetição Armadillo; ou modificação da sequência de ácido nucleico de pelo menos um gene que codifica uma proteína de repetição Armadillo. O teor de alcaloides modulado pode ser determinado comparando o teor de alcaloides na planta (por exemplo, planta de tabaco) ou parte da mesma, material de propagação de planta (por exemplo, material de propagação de planta de tabaco), uma célula (por exemplo, uma célula de tabaco), folha (por exemplo, folha de tabaco), folha colhida (por exemplo, uma folha de tabaco colhida), folha colhida cortada (por exemplo, uma folha de tabaco colhida cortada), folha processada (por exemplo, folha de tabaco processada), folha cortada e processada (por exemplo, folha de tabaco cortada e processada), um produto que compreende uma planta ou parte da mesma da presente invenção, por exemplo, um produto de tabaco, ou combinações da mesma com um produto comparável.

[0207] Adequadamente, o teor de alcaloides pode ser modulado em uma planta, por exemplo, uma planta de tabaco, por exemplo, uma planta de tabaco modificada. Adequadamente, o teor de alcaloides pode ser modulado em uma folha (por exemplo, uma folha de tabaco, por exemplo, uma folha de tabaco de uma planta de tabaco modificada). Adequadamente, o teor de alcaloides pode ser modulado em uma folha colhida (por exemplo, uma folha de tabaco colhida de uma planta de tabaco modificada). Adequadamente, o teor de alcaloides pode ser modulado em uma folha colhida cortada (por exemplo, uma folha de tabaco colhida cortada de uma planta de tabaco modificada). Adequadamente, o teor de alcaloides pode ser modulado em uma folha processada (por exemplo, uma folha de tabaco processada, por exemplo, uma folha de tabaco processada de uma planta de tabaco modificada). Adequadamente, o teor de alcaloides pode ser modulado em uma folha cortada e processada (por exemplo, uma folha de tabaco cortada e processada, por exemplo, uma folha de tabaco cortada e processada de uma planta de tabaco modificada). Adequadamente, o teor de alcaloides pode ser modulado em uma folha curada (por exemplo, uma folha de tabaco curada de uma planta de tabaco modificada). Adequadamente,

o teor de alcaloides pode ser modulado em um extrato de uma folha verde (por exemplo, uma folha de tabaco verde de uma planta de tabaco modificada). Adequadamente, o teor de alcaloides pode ser modulado em um produto que compreende a planta da presente invenção ou parte da mesma (por exemplo, um produto de tabaco, por exemplo, um produto de tabaco produzido a partir de uma planta de tabaco modificada ou parte da mesma). Adequadamente, o teor de alcaloides pode ser modulado em qualquer um dos produtos acima ou combinações dos mesmos. Adequadamente, a modulação do teor de alcaloides descrita acima pode ser um aumento no teor de alcaloides. Adequadamente, a modulação do teor de alcaloides descrita acima pode ser uma diminuição no teor de alcaloides (por exemplo, uma diminuição no teor de nicotina).

[0208] Em uma concretização, o teor de um ou mais alcaloides selecionados de nicotina, nornicotina, PON, anatabina, anabasina e miosmina é diminuído.

[0209] Adequadamente, a modulação do teor de alcaloides descrita acima pode ser uma redução do teor de nicotina. Adequadamente, a modulação do teor de alcaloides descrita acima pode ser um aumento no teor de nicotina.

[0210] Em uma concretização, o teor de nicotina de uma planta modificada (por exemplo, planta de tabaco), material de propagação de planta (por exemplo, material de propagação de planta de tabaco), folha (por exemplo, folha de tabaco), folha colhida (por exemplo, folha de tabaco colhida), folha colhida cortada (por exemplo, folha de tabaco colhida cortada), folha processada (por exemplo, folha de tabaco processada), folha cortada e processada (por exemplo, folha de tabaco cortada e processada) ou produto de tabaco de uma planta de tabaco modificada é diminuída.

[0211] Em uma concretização, o teor de alcaloides de uma planta (por exemplo, planta de tabaco) ou parte da mesma pode ser modulado em pelo menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 vezes, quando comparado com o teor de alcaloides de um planta (por exemplo, planta de tabaco) ou parte da mesma, respectivamente, que não foi modificada para: modular a expressão de pelo menos um gene que codifica uma proteína de repetição Armadillo; ou para modificar a sequência de ácido nucleico de pelo menos um gene que codifica uma proteína de repetição Armadillo; que foi cultivado em condições de crescimento semelhantes. Adequadamente, o teor de alcaloides pode ser modulado em cerca de 2 vezes a cerca de 10 vezes, de preferência cerca de 3 vezes a cerca de 10 vezes, adequadamente cerca de 3 vezes a cerca de 5 vezes. Adequadamente, a modificação pode ser um aumento ou uma diminuição no teor de alcaloides. Adequadamente, a modulação pode ser de um ou mais alcaloides selecionados de nicotina, nornicotina, PON, anatabina, anabasina e miosmina. Adequadamente, o teor de nicotina é modulado.

[0212] Em uma concretização da invenção, o teor de alcaloides de uma planta (por exemplo, uma planta de tabaco) ou parte da mesma pode ser modulado em 1%, 2%, 5%, 8%, 10%, 12%, 15%, 20%, 25 %, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% ou 90% em comparação com uma planta (por exemplo, uma planta de tabaco) ou parte da mesma que não foi modificada de acordo com a presente invenção. A modulação pode ser um aumento ou uma diminuição no teor de alcaloides quando comparada a uma planta não modificada (por exemplo, uma planta de tabaco) ou parte da mesma. Adequadamente, a modulação pode ser de teor total de alcaloides. Adequadamente, a modulação pode ser de um ou mais alcaloides selecionados de nicotina, nornicotina, PON, anatabina, anabasina e miosmina. Adequadamente, a modulação é de teor de nicotina, tal como redução do teor de nicotina. Adequadamente, a modulação é de teor de nornicotina, tal como redução do teor de nornicotina. Adequadamente, a modulação é de teor de PON, tal como redução do teor de PON.

TEOR DE NITROSAMINA TABACO ESPECÍFICA (TSNA)

[0213] Em uma concretização, a presente invenção fornece um método de modulação (isto é, aumento ou redução) do teor de nitrosamina tabaco específica (TSNA) ou um precursor de uma TSNA em uma planta (por exemplo, uma planta de tabaco) ou uma parte da mesma. Adequadamente, o método pode compreender a modificação da referida planta modulando a expressão de pelo menos uma proteína de repetição Armadillo. Adequadamente, o método pode compreender a modificação da referida planta pela modificação da sequência de ácido nucleico de pelo menos um gene que codifica uma proteína de repetição Armadillo. Adequadamente, o teor de TSNA ou um precursor de uma TSNA pode ser reduzido.

[0214] A TSNA pode ser medida em um tabaco processado, por exemplo, tabaco curado ou tabaco reconstituído. Em uma concretização, o teor de TSNA é medido e/ou modificado (por exemplo, reduzido) em uma planta de tabaco curada ou parte da mesma (por exemplo, em folha de tabaco curada).

[0215] O termo "nitrosamina tabaco específica" ou "TSNA", conforme usado neste documento, tem seu significado usual na arte, nomeadamente uma nitrosamina que é encontrada apenas em produtos de tabaco ou outros produtos contendo nicotina.

Adequadamente, pelo menos uma nitrosamina tabaco específica pode ser 4-(metilnitrosamino)-1-(3-piridil)-1-butanona(NNK), N'- nitrosonornicotina (NNN), N'-nitrosoanatabina (NAT) ou N- nitrosoanabasina (NAB).

[0216] O termo "precursor da mesma", quando usado em relação a pelo menos uma nitrosamina tabaco específica, refere-se a um ou mais produtos químicos ou compostos de uma planta de tabaco que dão origem à formação de uma nitrosamina tabaco específica ou estão envolvidos na reação de nitrosação que conduz à produção de nitrosaminas específicas do tabaco. Adequadamente, o termo "precursor da mesma" pode referir-se a nitrato, nitrito ou óxido nítrico.

[0217] O termo "modulação" é usado neste documento para significar aumento ou redução.

[0218] Em uma concretização, a TSNA é N'nitrosonornicotina (NNN) e/ou o precursor é nornicotina.

[0219] Em uma concretização, a TSNA pode ser um ou mais dos grupos selecionados a partir de: N'-nitrosonornicotina (NNN), N'nitrosoanatabina (NAT), N'-nitrosoanabasina (NAB) e 4-(metil nitrosamina)-1-(3-piridil)-1-butanona (NNK). Adequadamente, pelo menos, uma nitrosamina tabaco específica pode ser NNK ou NNN. Em uma concretização, a nitrosamina tabaco específica é NNN.

[0220] Em uma concretização, o precursor de TSNA é um ou mais do grupo selecionado de nornicotina, anabasina, anatabina e um derivado oxidado de nicotina, tal como pseudooxinicotina (PON).

[0221] Em uma concretização preferida, o precursor de TSNA é a nornicotina.

[0222] Em uma concretização, o precursor de TSNA pode ser PON. O precursor de TSNA (por exemplo, NNN, NNK, NAB e/ou NAT) pode ser medido na folha de tabaco verde, por exemplo, antes do processamento, por exemplo, antes da cura. Em uma concretização, o precursor de TSNA (por exemplo, NNN, NNK, NAB e/ou NAT) é medido e/ou modificado (por exemplo, reduzido) em uma folha de tabaco verde, por exemplo, antes do processamento, por exemplo, antes da cura.

[0223] Em uma concretização, a realização de um método e/ou uso da invenção resulta em uma redução de pelo menos uma TSNA ou um precursor da mesma na planta de tabaco modificada (ou parte da mesma) em comparação com uma planta de tabaco (ou parte da mesma) que não foi modificada de acordo com a presente invenção.

[0224] Os termos "reduzindo de pelo menos uma TSNA ou precursor da mesma" ou "redução de pelo menos uma TSNA ou precursor da mesma" são usados neste documento para significar que a concentração e/ou o teor total de pelo menos uma TSNA ou precursor da mesma no produto, método ou uso da invenção é inferior em relação a um produto, método ou uso comparável. Por exemplo, um produto comparável da indústria do tabaco seria derivado de uma planta de tabaco que não foi modificada de acordo com a presente invenção, mas na qual todas as outras características relevantes eram as mesmas (por exemplo, espécies de plantas, condições de cultivo, método de processamento de tabaco, etc.).

[0225] Qualquer método conhecido na arte para determinar a concentração e/ou níveis de pelo menos uma TSNA ou precursor da mesma pode ser usado. Em particular, tal método pode compreender a adição de padrão interno marcado com deutério, uma extração aquosa e filtração, seguida por análise usando cromatografia líquida de alta eficiência de fase reversa com espectrometria de massa em tandem (LC-MS/MS) pode ser usada. Outros exemplos para determinar a concentração e/ou nível de um precursor de uma nitrosamina tabaco específica incluem um método como o detalhado no método recomendado pela CORESTA CRM-72: Determinação de Nitrosaminas Tabaco Específicas em Tabaco e Produtos de Tabaco por LC-MS/EM; CRM sendo desenvolvido em ISO/DIS 21766 ou Wagner et al. Analytical Chemistry (2005), 77 (4), 1001-1006, que são incorporados aqui por referência.

[0226] Adequadamente, a concentração e/ou teor total de pelo menos uma nitrosamina tabaco específica ou precursor da mesma pode ser reduzido realizando um método e/ou uso da presente invenção. Adequadamente, a concentração e/ou nível de pelo menos uma nitrosamina tabaco específica ou precursor da mesma pode ser reduzida em uma planta de tabaco da invenção (por exemplo, obtenível (por exemplo, obtida) ou obtida por um método e/ou uso da invenção) quando em comparação com a concentração e/ou nível de pelo menos uma nitrosamina tabaco específica ou precursor da mesma em uma planta de tabaco que não foi modificada de acordo com a presente invenção.

[0227] A concentração e/ou o teor total de pelo menos uma nitrosamina tabaco específica ou precursor da mesma pode ser reduzido em uma folha de tabaco, folha colhida, folha de tabaco processada, produto da indústria do tabaco ou combinações das mesmas obteníveis (por exemplo, obtidas) ou obtida a partir de uma planta de tabaco (ou parte de uma planta de tabaco ou uma cultura de células de tabaco) da invenção, quando comparada com uma folha de tabaco, folha colhida, folha de tabaco processada,

produto da indústria do tabaco ou combinações das mesmas obteníveis (por exemplo, obtidas) ou obtidas a partir de uma planta de tabaco (ou parte de uma planta de tabaco ou uma cultura de células de tabaco) que não foi modificada de acordo com a presente invenção.

[0228] Adequadamente, a concentração e/ou o teor total de, pelo menos, uma nitrosamina tabaco específica ou precursor da mesma pode ser reduzido em uma folha de tabaco processada.

[0229] Adequadamente, a concentração e/ou o nível de pelo menos uma nitrosamina tabaco específica ou precursor da mesma podem ser reduzidos em um produto da indústria do tabaco.

[0230] Em uma concretização, pelo menos uma nitrosamina tabaco específica ou precursor da mesma pode ser reduzida em pelo menos cerca de 1%, pelo menos cerca de 3%, pelo menos cerca de 5%, pelo menos cerca de 10%, pelo menos cerca de 20%, pelo menos cerca de 30%, pelo menos cerca de 40%, pelo menos cerca de 50%, pelo menos cerca de 60%, pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 80%, ou pelo menos cerca de 90%. Em algumas concretizações, pelo menos uma nitrosamina tabaco específica ou precursor da mesma pode ser reduzida entre cerca de 5% e cerca de 95%, entre cerca de 10% e cerca de 90%, entre 20% e cerca de 80%, entre 30% e cerca de 70%, ou entre cerca de 40% e 60%.

[0231] Em relação à folha de tabaco processada (por exemplo, curada) (por exemplo, curada ou reconstituída), pelo menos uma nitrosamina tabaco específica ou precursor da mesma pode ser reduzida entre cerca de 5000 ng/g e cerca de 50 ng/g, entre cerca de 4000 ng/g e cerca de 100 ng/g, entre cerca de 3000 ng/g e 500 ng/g ou entre 2000 ng/g e 1000 ng/g. Em algumas concretizações,

pelo menos uma nitrosamina tabaco específica ou precursor de mesma pode ser reduzida em pelo menos cerca de 5000 ng/g, pelo menos cerca de 4000 ng/g, pelo menos cerca de 3000 ng/g, pelo menos cerca de 2000 ng/g, pelo menos cerca de 1000 ng/g, pelo menos cerca de 500 ng/g, pelo menos cerca de 100 ng/g ou pelo menos cerca de 50 ng/g.

PRODUÇÃO DE BIOMASSA

[0232] Em um aspecto, a presente invenção fornece um método de produção de biomassa que compreende: cultivo de uma célula que foi projetada para modular (por exemplo, aumentar) a expressão de um gene que codifica uma proteína de repetição Armadillo, conforme definida neste documento, sob condições para produzir uma biomassa.

[0233] Em outro aspecto, a presente invenção fornece um método de produção de biomassa que compreende: o cultivo de uma célula que foi projetada para modificar a sequência de ácido nucleico de um gene que codifica uma proteína de repetição Armadillo, conforme definida neste documento, sob condições para produzir uma biomassa.

[0234] Em uma concretização, a presente invenção fornece um método de produção de uma biomassa com concentração modificada (por exemplo, aumentada) e/ou teor total de nicotina, compreendendo o cultivo de uma célula que foi projetada para: aumento da expressão de pelo menos a proteína de repetição Armadillo compreendendo uma sequência de aminoácidos conforme estabelecida na SEQ ID No. 1, ou uma variante funcional ou fragmento funcional ou ortólogo da mesma, ou uma sequência que tem pelo menos 80% de identidade com a SEQ ID No. 1; ou aumento da expressão de uma sequência de nucleotídeos conforme estabelecida na SEQ ID No. 2 ou 3, ou uma variante funcional ou fragmento funcional ou ortólogo da SEQ ID No. 2 ou 3 ou uma sequência de ácido nucleico que tem pelo menos 80% de identidade com a SEQ ID No. 2 ou 3.

[0235] Em uma concretização, a presente invenção fornece um método de produção de uma biomassa com concentração modificada (por exemplo, aumentada) e/ou teor total de nicotina, compreendendo o cultivo de uma célula que foi projetada para modificar: a sequência de ácido nucleico de pelo menos um gene que codifica uma proteína de repetição Armadillo compreendendo uma sequência de aminoácidos conforme estabelecido na SEQ ID No. 1 ou uma variante funcional ou fragmento funcional ou ortólogo da mesma, ou uma sequência que tem pelo menos 80% de identidade com SEQ ID No. 1; ou uma sequência de nucleotídeos conforme estabelecida na SEQ ID No. 2 ou 3, ou uma variante funcional ou fragmento funcional ou ortólogo da SEQ ID No. 2 ou 3 ou uma sequência de ácido nucleico que tem pelo menos 80% de identidade com a SEQ ID No. 2 ou 3.

[0236] Adequadamente, a proteína de repetição Armadillo compreende um domínio de repetição Armadillo.

[0237] Adequadamente, a sequência de ácido nucleico pode compreender uma modificação (tal como uma mutação ou deleção) no domínio de repetição Armadillo.

[0238] A célula pode ser projetada por qualquer método conhecido na arte para aumentar a expressão de pelo menos um gene que codifica uma proteína de repetição Armadillo.

[0239] Adequadamente, a célula pode ser projetada para expressar um gene exógeno que codifica uma proteína de repetição Armadillo. Adequadamente, a célula pode ser projetada para superexpressar um gene que codifica uma proteína de repetição Armadillo.

[0240] Adequadamente, a biomassa pode conter uma concentração e/ou teor total de nicotina maior em comparação com a biomassa produzida por uma célula comparável que não foi modificada de acordo com a presente invenção.

[0241] Adequadamente, a célula para uso na produção de biomassa pode ser uma célula vegetal, como uma célula de tabaco.

[0242] Adequadamente, a célula para uso na produção de biomassa pode ser uma célula de levedura.

[0243] Em uma concretização, a célula (por exemplo, célula de levedura) pode ser também modificada para compreender uma ou mais sequências que aumentam a biossíntese de alcaloides nicotínicos. Adequadamente, essas uma ou mais sequências podem ser incorporadas em uma construção de ácido nucleico que é adequada para a transformação de células (por exemplo, células de levedura). Uma ou mais sequências podem ser superexpressas na célula (por exemplo, célula de levedura). As sequências podem ser selecionadas de um ou mais dos seguintes genes: MPO (ou Metilputrescina Oxidase ou MPO1 ou MPO2); A622 (ou proteína semelhante a isoflavona redutase ou homóloga de isoflavona redutase ou proteína semelhante a isoflavona redutase); BBL (ou enzima ponte berberina ou semelhante à enzima ponte berberina ou BBE ou NBB1); PMT (ou Putrescina N-Metiltransferase ou Putrescina metiltransferase ou S-adenosil-L-metionina: Putrescina N-metiltransferase ou PMT ou PMT1 ou PMT2 ou PMT3 ou PMT4) e QPT (ou quinolinato de fosforibosiltransferase). Em uma concretização, as sequências podem ser selecionadas de um ou mais dos seguintes genes: BBL, A622, PMT e MPO (MPO1 ou MPO2). Genes adequados para modificação desta forma podem ser ensinados em US2016032299, por exemplo, que é incorporado aqui por referência.

CARACTERÍSTICAS COMERCIALMENTE DESEJÁVEIS

[0244] Em uma concretização, as plantas da presente invenção têm modificado (isto é, aumentado ou diminuído) o teor de alcaloides totais e/ou modificados (isto é, aumentado ou diminuído) do teor de um ou mais alcaloides selecionados de entre nicotina, nornicotina, anabasina, miosmina e anatabina e/ou nicotina reduzida, enquanto as características de sabor e/ou outras características comercialmente desejáveis são pelo menos mantidas. Em uma concretização, as plantas da presente invenção produzem folhas de um grau e/ou qualidade semelhante às plantas que não foram modificadas de acordo com a invenção.

[0245] Em uma concretização, as plantas da presente invenção têm teor de nicotina reduzido sem uma mudança significativa nas características de sabor da planta (por exemplo, em comparação com a mesma planta que não foi modificada de acordo com a presente invenção).

[0246] Em uma concretização, as plantas da presente invenção modificaram (ou seja, aumentaram ou diminuíram) o teor de alcaloide e/ou TSNA sem uma mudança significativa (por exemplo, diminuição) em outras características comercialmente desejáveis da planta (por exemplo, em comparação com a mesma planta que não foi modificada de acordo com a presente invenção). Em particular, o rendimento da planta modificada é de preferência não reduzido em comparação com a mesma planta que não tenha sido modificada de acordo com a presente invenção.

[0247] Portanto, em uma concretização, os métodos e usos da presente invenção referem-se à modificação (isto é, aumento ou redução) do teor de alcaloides total e/ou modificação (isto é, aumento ou redução) de um ou mais alcaloides selecionados de nicotina, nornicotina, anabasina e anabina e/ou modificação (ou seja, aumento ou redução) do teor de nicotina e/ou o teor de TSNA, enquanto mantém as características de sabor e/ou outras características comercialmente desejáveis (por exemplo, rendimento).

[0248] O termo "características comercialmente desejáveis", tal como utilizado aqui, incluirá características como rendimento, altura da planta madura, número de folhas colhidas, comprimento médio do nó, comprimento da folha do cortador, largura da folha do cortador, qualidade (por exemplo, qualidade da folha, qualidade da folha adequadamente curada), tolerância ao estresse abiótico (por exemplo, seca), tolerância a herbicida e/ou tolerância ao estresse biótico (por exemplo, inseto, bactéria ou fungo).

[0249] A qualidade da folha pode ser medida com base na cor, textura e aroma da folha curada, por exemplo, de acordo com as qualidades e padrões do Departamento de Agricultura dos Estados Unidos (USDA).

[0250] Os graus de tabaco são avaliados com base em fatores, incluindo, mas não se limitando a, posição do caule da folha, tamanho da folha, cor da folha, uniformidade e integridade da folha, maturação, textura, elasticidade, brilho (relacionado com a intensidade e a profundidade de coloração da folha assim como o brilho), higroscopicidade (a faculdade das folhas de tabaco de absorver e reter a umidade ambiente), e nuance ou matiz verde.

[0251] O grau de folha pode ser determinado usando métodos padrão conhecidos na arte, por exemplo, usando um Grau Padrão Oficial publicado pelo Serviço de Marketing de Agricultura do Departamento de Agricultura dos EUA (7 U.S.C §511). Ver, por exemplo, Graus Padrões Oficiais para Tabaco Burley (Tipo do EUA 31 e Tipo Estrangeiro 93), efetivo em 5 de novembro de 1990 (55 FR 40645); Graus Padrões Oficiais para tabaco curado em fumeiro (Tipos dos EUA 11, 12, 13, 14 e Tipo Estrangeiro 92), em vigor em 27 de março de 1989 (54 FR 7925); Graus Padrões Oficiais para Folha e Semente de Tabaco da Pennsilvania (Tipo dos EUA 41), em vigor em 8 de janeiro de 1965 (29 FR 16854); Graus Padrões Oficiais de Tabaco de Cigarro-folha para Ohio (Tipos dos EUA 42, 43 e 44), em vigor em 8 de dezembro de 1963 (28 FR 11719 e 28 FR 11926); Graus Padrões Oficiais de Tabaco de Cigarro-ligante para Wisconsin (Tipos de EUA 54 e 55), em vigor em 20 de novembro de 1969 (34 FR 17061); Graus Padrões Oficiais para Tabaco Cultivado em Sombra para Cigarro-Invólucro da Geórgia e Flórida (Tipo de EUA 62), em vigor em abril de 1971. Um valor de índice de classificação do USDA pode ser determinado de acordo com um índice de classificação aceito pela indústria. Ver, por exemplo, Bowman et al., Tobacco Science, 32: 39-40 (1988); Biblioteca de Documentos de Tabaco e Legado (Documento de Controle #523267826-

523267833, 1 de julho de 1988, Memorando sobre Índice de Grau de Tabaco Burley Proposto); e Miller et al., 1990, Tobacco Intern., 192: 55-57 (todas as referências anteriores são incorporadas aqui na sua totalidade).

[0252] Em um aspecto, um índice de classificação do USDA é uma representação numérica de 0-100 do grau federal recebido e é uma média ponderada de todas as posições de acompanhamento. Um índice de grau mais alto indica maior qualidade. Alternativamente, o grau da folha pode ser determinado por meio de imagem hiperespectral. Ver, por exemplo, WO 2011/027315 (que é incorporada aqui por referência).

[0253] Em uma concretização, uma planta de tabaco da presente invenção fornece tabaco de qualidade comercialmente aceitável.

[0254] Adequadamente, a planta de tabaco da presente invenção fornece tabaco curado de qualidade comercialmente aceitável.

[0255] Em uma concretização, uma planta de tabaco da presente invenção é capaz de produzir folhas com um valor de índice de grau USDA de pelo menos cerca de 70% do valor de índice de grau USDA de folhas de uma planta comparável quando cultivada em condições de crescimento semelhantes. Adequadamente, as plantas de tabaco divulgadas aqui podem ser capazes de produzir folhas com um valor de índice de grau USDA de pelo menos cerca de 65%, pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 75%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95% ou pelo menos cerca de 98% do valor do índice de grau USDA de uma planta de controle quando cultivada em condições de crescimento semelhantes. Adequadamente, as plantas de tabaco divulgadas aqui podem ser capazes de produzir folhas com um valor de índice de grau USDA entre 65% e 130%, entre 70% e 130%, entre 75% e 130%, entre 80% e 130%, entre 85% e 130%, entre 90% e 130%, entre 95% e 130%, entre 100% e 130%, entre 105% e 130%, entre 110% e 130%, entre 115% e 130%, ou entre 120% e 130% do valor do índice de grau USDA de uma planta comparável.

[0256] Em um aspecto, a planta de tabaco da presente invenção é capaz de produzir folhas com um valor de índice de grau USDA de pelo menos 50. Adequadamente, as plantas de tabaco divulgadas aqui podem ser capazes de produzir folhas com um valor de índice de grau USDA de 55 ou mais, 60 ou mais, 65 ou mais, 70 ou mais, 75 ou mais, 80 ou mais, 85 ou mais, 90 ou mais e 95 ou mais.

[0257] A menos que especificado de outra forma, usado aqui, o rendimento de tabaco se refere ao rendimento de folhas curadas que é calculado com base no peso das folhas de tabaco curadas por acre sob condições de campo padrão seguindo práticas agronômicas e de cura padrão.

[0258] Em um aspecto, uma planta (por exemplo, uma planta de tabaco) da presente invenção tem um rendimento entre 50% e 150%, entre 55% e 145%, entre 60% e 140%, entre 65% e 135%, entre 70% e 130%, entre 75% e 125%, entre 80% e 120%, entre 85% e 115%, entre 90% e 110%, entre 95% e 105%, entre 50% e 100%, entre 55% e 100%, entre 60% e 100%, entre 65% e 100%, entre 70% e 100%, entre 75% e 100%, entre 80% e 100%, entre 85% e 100%, entre 90% e 100%, entre 95% e 100%, entre 100% e 150%, entre 105% e 150%, entre 110% e 150%, entre 115% e 150%, entre 120% e 150%, entre 125% e 150%, entre 130% e 150%, entre 135% e 150%, entre 140% e 150%, ou entre 145% e 150% do rendimento de uma planta comparável quando cultivada em condições de campo semelhantes.

[0259] Em outro aspecto, o rendimento da planta (por exemplo, uma planta de tabaco) da presente invenção é de aproximadamente 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2,0, 2,1, 2,2, 2,3, 2,4, 2,5, 2,6, 2,7, 2,8, 2,9 ou 3,0 vezes o rendimento de uma planta comparável quando cultivada em condições de campo semelhantes.

[0260] Em outro aspecto, o rendimento de uma planta de tabaco da presente invenção é comparável ao rendimento da planta comparável curada com fumeiro quando cultivada em condições de campo semelhantes.

[0261] Em um aspecto, uma planta de tabaco da presente invenção fornece um rendimento selecionado do grupo que consiste de cerca de entre 1200 e 3500, entre 1300 e 3400, entre 1400 e 3300, entre 1500 e 3200, entre 1600 e 3100, entre 1700 e 3000, entre 1800 e 2900, entre 1900 e 2800, entre 2000 e 2700, entre 2100 e 2600, entre 2200 e 2500 e entre 2300 e 2400 libras/acre.

[0262] Em outro aspecto, uma planta de tabaco da presente invenção fornece um rendimento selecionado do grupo que consiste de cerca de entre 1200 e 3500, entre 1300 e 3500, entre 1400 e 3500, entre 1500 e 3500, entre 1600 e 3500, entre 1700 e 3500, entre 1800 e 3500, entre 1900 e 3500, entre 2000 e 3500, entre 2100 e 3500, entre 2200 e 3500, entre 2300 e 3500, entre 2400 e 3500, entre 2500 e 3500, entre 2600 e 3500, entre 2700 e 3500, entre 2800 e 3500, entre 2900 e 3500, entre 3000 e 3500 e entre 3100 e 3500 libras/acre.

[0263] Em um aspecto adicional, uma planta de tabaco da presente invenção fornece um rendimento selecionado a partir do grupo que consiste de cerca de entre 1200 e 3500, entre 1200 e 3400, entre 1200 e 3300, entre 1200 e 3200, entre 1200 e 3100,

entre 1200 e 3000, entre 1200 e 2900, entre 1200 e 2800, entre 1200 e 2700, entre 1200 e 2600, entre 1200 e 2500, entre 1200 e 2400, entre 1200 e 2300, entre 1200 e 2200, entre 1200 e 2100, entre 1200 e 2000, entre 1200 e 1900, entre 1200 e 1800, entre 1200 e 1700, entre 1200 e 1600, entre 1200 e 1500, e entre 1200 e 1400 libras/acre.

PRODUÇÃO DE PLANTAS

[0264] Em uma concretização, a presente invenção fornece um método de produção de uma planta com um teor de alcaloides modificado e/ou teor modificado de uma nitrosamina tabaco específica (TSNA) ou um precursor de uma TSNA, compreendendo: a. cruzamento de uma planta doadora com teor de nicotina modificado e/ou teor modificado de uma nitrosamina tabaco específica (TSNA) ou um precursor de uma TSNA e em que a expressão de pelo menos um gene que codifica uma proteína de repetição Armadillo foi modulada na planta de acordo doadora com a presente invenção com uma planta de tabaco receptora que não tem teor de nicotina modificado ou teor de uma nitrosamina tabaco específica (TSNA) ou um precursor de uma TSNA modificado e possui características comercialmente desejáveis; b. isolamento do material genético de uma progênie da referida planta doadora cruzada com a referida planta receptora; e c. realização de seleção assistida por marcador molecular com um marcador molecular compreendendo:

i. identificar uma região com íntrons compreendendo uma mutação em uma sequência de polinucleotídeos que codifica uma proteína definida em a.

[0265] Em outra concretização, a presente invenção fornece um método de produção de uma planta com um teor de alcaloide modificado e/ou teor de uma nitrosamina tabaco específica (TSNA) ou um precursor de uma TSNA modificado, compreendendo: ii. cruzamento de uma planta doadora com teor de nicotina modificado e/ou teor de uma nitrosamina tabaco específica (TSNA) ou um precursor de uma TSNA modificado; em que a sequência de ácido nucleico de pelo menos um gene que codifica uma proteína de repetição Armadillo foi modificada na planta doadora de acordo com a presente invenção com uma planta de tabaco receptora que não possui teor de nicotina modificado ou teor de uma nitrosamina tabaco específica (TSNA) ou um precursor de uma TSNA modificado e possui características comercialmente desejáveis; iii. isolamento do material genético de uma progênie da referida planta doadora cruzada com a referida planta receptora; e iv. realização de seleção assistida por marcador molecular com um marcador molecular compreendendo: v. identificação de uma região com íntrons compreendendo uma mutação em uma sequência de polinucleotídeos que codifica uma proteína definida em a.

vi.

[0266] A expressão de uma proteína de repetição Armadillo que: a) compreende uma sequência de aminoácidos conforme estabelecida em: SEQ ID No. 1 ou uma variante funcional ou fragmento funcional ou ortólogo da mesma, ou uma sequência que tem pelo menos 80% de identidade com SEQ ID No. 1; ou b) é codificada por uma sequência de nucleotídeos conforme estabelecida na SEQ ID No. 2 ou 3; ou uma variante funcional ou fragmento funcional ou ortólogo de SEQ ID No. 2 ou 3; ou uma sequência de ácido nucleico que tem pelo menos 80% de identidade com a SEQ ID No. 2 ou 3; é modulada na planta doadora quando comparado a uma planta comparável. Adequadamente, a proteína de repetição Armadillo compreende um domínio de repetição Armadillo.

[0267] A seleção assistida por marcador molecular pode compreender a realização de PCR para identificar uma sequência de ácido nucleico com íntrons compreendendo uma mutação que modula a expressão de uma proteína compreendendo a sequência de aminoácidos mostrada como SEQ ID No. 1 ou uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 80% de identidade com a mesma.

PLANTAS

[0268] Plantas adequadas de acordo com a invenção incluem a família Solanaceae de plantas que incluem, por exemplo, erva daninha jimson, berinjela, mandrágora, beladona mortal

(beladona), capsicum (páprica, pimenta malagueta), batata e tabaco.

[0269] Em uma concretização, um gênero adequado de Solanaceae é Solanum, por exemplo, Solanum lycopersicum.

[0270] Em uma concretização, um gênero adequado de Solanaceae é Nicotiana, por exemplo, Nicotiana tabacum ou Nicotiana rustica.

[0271] Uma espécie adequada de Nicotiana pode ser Nicotiana tabacum. Espécies de Nicotiana podem ser referidas aqui como uma planta de tabaco, ou simplesmente tabaco.

PLANTAS DE TABACO

[0272] A presente invenção fornece métodos, usos direcionados para as plantas (por exemplo, plantas do tabaco), bem como uma célula (por exemplo, uma célula de tabaco), uma planta (por exemplo, uma planta do tabaco) e um material de propagação da planta.

[0273] O termo "planta de tabaco", conforme usado neste documento, refere-se a uma planta do gênero Nicotiana que é usada na produção de produtos de tabaco. Exemplos não limitativos de plantas de "tabaco" adequadas incluem N. tabacum e N. rustica (por exemplo, N. tabacum L., LA B21, LN KY171, Tl 1406, Basma, Galpao, Perique, Beinhart 1000-1 e Petico).

[0274] O material de tabaco pode ser derivado ou obtido a partir de variedades de tipos de Nicotiana tabacum, vulgarmente conhecido como variedades Burley, variedades de fumeiro ou brilhantes e escuras. Em algumas concretizações, o material de tabaco é derivado de uma planta de Burley, Virginia ou de tabaco escuro. A planta do tabaco pode ser selecionada a partir de tabaco Burley, tabaco raro, tabaco especial, tabaco expandido ou semelhante.

[0275] O uso de cultivares de tabaco e cultivares elite de tabaco também é contemplado aqui. A planta de tabaco para uso pode aqui, portanto, ser uma variedade de tabaco ou cultivar de tabaco de elite. Variedades Nicotiana tabacum particularmente úteis incluem tipo Virgínia curado em fumeiro, tipo Burley e tipo Oriental.

[0276] Em algumas concretizações, a planta de tabaco pode ser, por exemplo, selecionada de uma ou mais das seguintes variedades: L. cultivar T.I. 1068, AA 37-1, B 13P, Xanthi (Mitchell-Mor), KT D # 3 Hybrid 107, Bel-W3, 79-615, Samsun Holmes NN, F4 do cruzamento BU21 x Hoja Parado, linha 97, KTRDC # 2 Hybrid 49, KTRDC # 4 Hybrid 1 10, Burley 21, PM016, KTRDC # 5 KY 160 SI, KTRDC # 7 FCA, KTRDC # 6 TN 86 SI, PM021, K 149, K 326, K 346, K 358, K 394, K 399, K 730, KY 10, KY 14, KY 160, KY 17, KY 8959, KY 9, KY 907, MD 609, McNair 373, NC 2000, PG 01, PG 04, P01, P02, P03, RG 11, RG 17, RG 8, Speight G-28, TN 86, TN 90, VA 509, AS44, Banket A1, Basma Drama B84/31, Basma I Zichna ZP4/B, Basma Xanthi BX 2A, Batek, Besuki Jember, C104, Coker 319, Coker 347, Criollo Misionero, PM092, Delcrest, Djebel 81, DVH 405, Galpao Comum, HB04P, Hicks Broadleaf, Kabakulak Elassona, PM102, Kutsage E1, KY 14 x L8, KY 171, LA BU 21, McNair 944, NC 2326, NC 71, NC 297, NC 3, PVH 03, PVH 09, PVH 19, PVH 21 10, Red Russian, Samsun, Saplak, Simmaba, Talgar 28, PM132, Wislica, Yayaldag, NC 4, TR Madole, Prilep HC-72, Prilep P23, Prilep PB 156/1, Prilep P12-2/1, Yaka JK-48, Yaka JB 125/3, ΤΊ -1068, KDH- 960, TI-1070, TW136, PM204, PM205, Basma, TKF 4028, L8, TKF 2002, TN 90, GR141, Basma xanthi, GR149, GR153 e Petit Havana.

[0277] Exemplos não limitativos de variedades ou cultivares são: BD 64, CC 101, CC 200, CC 27, CC 301, CC 400, CC 500, CC 600, CC 700, CC 800, CC 900, Coker 176, Coker 319, Coker 371 Gold, Coker 48, CD 263, DF91 1, DT 538 LC, tabaco Galpao, GL 26H, GL 350, GL 600, GL 737, GL 939, GL 973, HB 04P, HB 04P LC, HB3307PLC, Hybrid 403LC, Hybrid 404LC, Hybrid 501 LC, K 149, K 326, K 346, K 358, K394, K 399, K 730, KDH 959, KT 200, KT204LC, KY10, KY14, KY 160, KY 17, KY 171, KY 907, KY907LC, KTY14xL8 LC, Little Crittenden, McNair 373, McNair 944, msKY 14xL8, Narrow Leaf Madole, Narrow Leaf Madole LC, NBH 98, N-126, N-777LC, N- 7371 LC, NC 100, NC 102, NC 2000, NC 291, NC 297, NC 299, NC 3, NC 4, NC 5, NC 6, NC7, NC 606, NC 71, NC 72, NC 810, NC BH 129, NC 2002, Neal Smith Madole, OXFORD 207, PD 7302 LC, PD 7309 LC, tabaco PD 7312 LC 'Periq'e', PVH03, PVH09, PVH19, PVH50, PVH51, R 610, R 630, R 7-1 1, R 7-12, RG 17, RG 81, RG H51, RGH 4, RGH 51, RS 1410, Speight 168, Speight 172, Speight 179, Speight 210, Speight 220, Speight 225, Speight 227, Speight 234, Speight G- 28, Speight G-70, Speight H-6, Speight H20, Speight NF3, Tl 1406, Tl 1269, TN 86, TN86LC, TN 90, TN 97, TN97LC, TN D94, TN D950, TR (Tom Rosson) Madole, VA 309, VA359, AA 37-1, B 13P, Xanthi (Mitchell-Mor), Bel-W3, 79-615, Samsun Holmes NN, KTRDC número 2 Hybrid 49, Burley 21, KY 8959, KY 9, MD 609, PG 01, PG 04, P01, P02, P03, RG 1 1, RG 8, VA 509, AS44, Banket A1, Basma Drama B84/31, Basma I Zichna ZP4/B, Basma Xanthi BX 2A, Batek, Besuki Jember, C104, Coker 347, Criollo Misionero, Delcrest, Djebel 81, DVH 405, Galpao Comum, HB04P, Hicks Broadleaf, Kabakulak Elassona, Kutsage E1, LA BU 21, NC 2326, NC 297, PVH 21 10, Red Russian, Samsun, Saplak, Simmaba, Talgar 28, Wislica, Yayaldag, Prilep HC-72, Prilep P23, Prilep PB 156/1, Prilep P12-2/1, Yaka

JK-48, Yaka JB 125/3, TI-1068, KDH-960, Tl-1070, TW136, Basma, TKF 4028, L8, TKF 2002, GR141, Basma xanthi, GR149, GR153, Petit Havana. Subvariedades de baixo conversor do acima, mesmo se não especificamente identificadas aqui, também são contempladas.

[0278] A planta do tabaco pode ser Burley, Virginia curado em fumeiro ou Oriental.

[0279] Em uma concretização, o material de propagação da planta pode ser obtenível (por exemplo, obtido) a partir de uma planta (por exemplo, uma planta de tabaco) da invenção.

[0280] Um "material de propagação de planta", tal como usado aqui, refere-se a qualquer matéria vegetal retirada de uma planta a partir da qual outras plantas podem ser produzidas. Adequadamente, um material de propagação de planta pode ser selecionado a partir de uma semente, calos de planta e aglomerados de plantas. Adequadamente, o material de propagação da planta pode ser uma semente. Adequadamente, o material de propagação da planta pode ser calo de planta. Adequadamente, o material de propagação da planta pode ser aglomerados de plantas.

[0281] Em uma concretização, a célula (por exemplo, célula de tabaco), planta de tabaco e/ou material de propagação de planta pode ser obtenível (por exemplo, obtida) (por exemplo, obtido) por um método de acordo com a invenção.

[0282] Adequadamente, uma planta de tabaco de acordo com a presente invenção pode ter modulado (por exemplo, diminuído) o teor de nicotina em comparação com uma planta de tabaco não modificada, em que a planta de tabaco foi modificada para modular (por exemplo, aumentar) a expressão de pelo menos uma proteína de repetição Armadillo que:

a) compreende uma sequência de aminoácidos conforme estabelecida em: SEQ ID No. 1 ou uma variante funcional ou fragmento funcional ou ortólogo da mesma, ou uma sequência que tem pelo menos 80% de identidade com SEQ ID No. 1; ou b) é codificada por uma sequência de nucleotídeos conforme estabelecida em SEQ ID No. 2 ou 3; ou uma variante funcional ou fragmento funcional ou ortólogo de SEQ ID No. 2 ou 3; ou uma sequência de ácido nucleico que tem pelo menos 80% de identidade com a SEQ ID No. 2 ou 3.

[0283] Adequadamente, uma planta de tabaco de acordo com a presente invenção pode ter modulado (por exemplo, reduzido) o teor de uma nitrosamina tabaco específica (TSNA) ou um precursor de uma TSNA quando comparada a uma planta de tabaco não modificada, em que a planta de tabaco foi modificada para modular (por exemplo, aumentar) a expressão de pelo menos uma proteína de repetição Armadillo que: a) compreende uma sequência de aminoácidos conforme estabelecida em: SEQ ID No. 1 ou uma variante funcional ou fragmento funcional ou ortólogo da mesma, ou uma sequência que tem pelo menos 80% de identidade com SEQ ID No. 1; ou b) é codificada por uma sequência de nucleotídeos conforme estabelecida em SEQ ID No. 2 ou 3; ou uma variante funcional ou fragmento funcional ou ortólogo de SEQ ID No. 2 ou 3; ou uma sequência de ácido nucleico que tem pelo menos 80% de identidade com a SEQ ID No. 2 ou 3.

[0284] Em uma concretização, a planta de tabaco de acordo com a presente invenção compreende uma célula de tabaco da invenção.

[0285] Em outra concretização, o material de propagação da planta pode ser obtenível (por exemplo, obtido) (por exemplo, obtido) a partir de uma planta de tabaco da invenção.

[0286] Em uma concretização, é fornecido o uso de uma planta de tabaco, conforme descrito neste documento, para produzir uma planta de tabaco.

[0287] A presente invenção também fornece em outra concretização o uso de uma planta de tabaco das concretizações anteriores para a produção de um produto da indústria do tabaco.

[0288] Em outra concretização, é fornecido o uso de uma planta de tabaco da invenção para cultivar uma cultura.

[0289] Em uma concretização, é fornecido o uso de uma célula conforme previsto nas concretizações anteriores para a produção de um produto da indústria do tabaco.

[0290] Em uma concretização, a presente invenção fornece uma cultura de células (por exemplo, em cultivo in vitro).

[0291] O cultivo de células de tabaco pode ser uma cultura de células em suspensão. Estas células cultivadas in vitro podem ser incorporadas em um produto da indústria do tabaco, por exemplo, como um substituto para as partículas de tabaco convencionais, retalhos, cortes finos ou lâmina de tabaco de corte longo, como um ingrediente aditivo ou como um substituto e um aditivo. Adequadamente, a cultura de células pode produzir nicotina.

[0292] Em uma concretização, é fornecido o uso de uma cultura de células, por exemplo, uma cultura de células colhidas e/ou processadas de acordo com a presente invenção para a produção de um produto da indústria do tabaco.

[0293] As células de tabaco colhidas de uma cultura in vitro podem ser secas, por exemplo, liofilizadas, por exemplo para produzir um pó.

[0294] Em uma concretização, a cultura de células é uma cultura de células de tabaco. O especialista estará ciente dos métodos conhecidos para estabelecer culturas in vitro de células de tabaco. A título de exemplo, apenas o seguinte método pode ser usado: coleta de sementes de uma planta de tabaco de interesse e esterilização de seu exterior para eliminar organismos indesejados, plantio das referidas sementes para cultivar uma planta de tabaco de interesse, remoção do tecido da planta de tabaco (por exemplo, do caule do tabaco) para uso como explante, estabelecimento de uma cultura de calo do explante de tabaco, estabelecimento de uma cultura de suspensão de células da cultura de calo e colheita do material de cultura (por exemplo, incluindo células de tabaco) para produzir uma cultura de células de tabaco.

[0295] As células de tabaco podem ser colhidas por vários métodos, incluindo filtração, por exemplo, filtração a vácuo. A amostra pode ser lavada no filtro adicionando água e o líquido restante removido com a filtração, por exemplo, filtração a vácuo.

[0296] A cultura de células de tabaco colhida pode ser posteriormente processada, por exemplo, seca, tal como seca ao ar e/ou liofilizada. A cultura de células de tabaco colhidas ou a cultura de células de tabaco colhidas secas ou um extrato das mesmas podem ser incorporados em produtos da indústria do tabaco de acordo com a presente invenção.

[0297] Em uma concretização, a presente invenção fornece uma planta (por exemplo, planta de tabaco) ou parte da mesma para uso na agricultura molecular. Adequadamente, uma planta ou parte da mesma modificada de acordo com a presente invenção pode ser usada na fabricação de proteínas, tais como terapêuticas, por exemplo, antibióticos, partículas semelhantes a vírus, neutracêuticos ou moléculas pequenas.

[0298] Em uma concretização, a presente invenção fornece um método para a produção de proteínas (por exemplo, proteínas terapêuticas); o método compreendendo a modificação de uma planta ou parte da mesma capaz de produzir a referida proteína (por exemplo, proteína terapêutica) por meio da modulação da expressão de uma proteína de repetição Armadillo que: a) compreende uma sequência de aminoácidos conforme estabelecida em: SEQ ID No. 1 ou uma variante funcional ou fragmento funcional ou ortólogo da mesma, ou uma sequência que tem pelo menos 80% de identidade com SEQ ID No. 1; ou b) é codificada por uma sequência de nucleotídeos conforme estabelecida em SEQ ID No. 2 ou 3; ou uma variante funcional ou fragmento funcional ou ortólogo de SEQ ID No. 2 ou 3; ou uma sequência de ácido nucleico que tem pelo menos 80% de identidade com a SEQ ID No. 2 ou 3; e cultivo da planta em condições suficientes para permitir a produção da referida proteína (por exemplo, proteína terapêutica). Adequadamente, a proteína de repetição Armadillo compreende um domínio de repetição Armadillo.

PRODUTOS

[0299] A presente invenção também fornece produtos que podem ser obteníveis (por exemplo, obtidos) ou obtidos a partir de plantas de acordo com a presente invenção. Os produtos são fornecidos que são obteníveis (por exemplo, obtidos) ou obtidos de uma planta em que a expressão do gene que codifica para uma proteína de repetição Armadillo foi modulada. Produtos são fornecidos que podem ser obteníveis (por exemplo, obtidos) ou obtidos de uma planta na qual a sequência de ácido nucleico de pelo menos uma proteína de repetição Armadillo foi modificada. Adequadamente, a sequência de ácido nucleico que codifica um domínio de repetição Armadillo foi modificada.

[0300] Em uma concretização, o produto pode compreender uma construção da invenção que modula a expressão de pelo menos um gene que codifica uma proteína de repetição Armadillo conforme definida aqui. Em uma concretização, o produto pode compreender uma construção da invenção que modifica a sequência de ácido nucleico de pelo menos um gene que codifica uma proteína de repetição Armadillo conforme definida aqui.

[0301] A presente invenção também fornece produtos que podem ser obteníveis (por exemplo, obtidos) ou obtidos a partir do tabaco de acordo com a presente invenção.

[0302] Em uma concretização, é fornecido o uso de uma planta de tabaco da invenção para produzir uma folha de tabaco.

[0303] Adequadamente, a folha de tabaco pode ser submetida a aplicações a jusante, como processamento.

[0304] Assim, em uma concretização, o uso da concretização anterior pode fornecer uma folha de tabaco processada.

Adequadamente, a folha de tabaco pode ser submetida a cura, fermentação, pasteurização ou combinações das mesmas. Em outra concretização, a folha de tabaco pode ser cortada. Em algumas concretizações, a folha de tabaco pode ser cortada antes ou depois de ser submetida à cura, fermentação, pasteurização ou combinações das mesmas.

[0305] Em uma concretização, a presente invenção fornece uma folha colhida de uma planta de tabaco da invenção.

[0306] Em uma outra concretização, a folha colhida pode ser obtenível (por exemplo, obtida) (por exemplo, obtida) a partir de uma planta de tabaco propagada a partir de um material de propagação da presente invenção.

[0307] Em outra concretização, é fornecida uma folha de colheita que pode ser obtenível (por exemplo, obtida) a partir de um método ou uso da presente invenção.

[0308] Adequadamente, a folha colhida pode ser uma folha colhida cortada.

[0309] Em algumas concretizações, a folha colhida pode compreender células de tabaco viáveis. Em outras concretizações, a folha colhida pode ser submetida a processamento adicional.

[0310] Também é fornecida uma folha de tabaco processada.

[0311] A folha de tabaco processada pode ser obtenível (por exemplo, obtida) a partir de uma planta de tabaco da invenção. Adequadamente, a folha de tabaco processada pode ser obtenível (por exemplo, obtida) a partir de uma planta de tabaco obtida de acordo com qualquer um dos métodos e/ou usos da presente invenção.

[0312] Em outra concretização, a folha de tabaco processada pode ser obtenível (por exemplo, obtida) a partir de uma planta de tabaco propagada a partir de um material de propagação de planta de tabaco de acordo com a presente invenção.

[0313] A folha de tabaco processada da presente invenção pode ser obtenível (por exemplo, obtida) processando uma folha colhida da invenção.

[0314] O termo "folha de tabaco processada", tal como utilizada aqui, refere-se a uma folha de tabaco que foi submetida a uma ou mais etapas de processamento às quais o tabaco é submetido na arte. Uma "folha de tabaco processada" não compreende ou não contém células viáveis.

[0315] O termo "células viáveis" refere-se a células que são capazes de crescer e/ou são metabolicamente ativas. Portanto, se uma célula é considerada não viável, também referida como “não viável”, então uma célula não exibe as características de uma célula viável.

[0316] O termo "células substancialmente não viáveis" significa que menos de cerca de 5% do total de células são viáveis. Preferivelmente, menos do que cerca de 3%, mais preferivelmente menos do que cerca de 1%, ainda mais preferivelmente menos do que cerca de 0,1% do total de células são viáveis.

[0317] Em uma concretização, a folha de tabaco processada pode ser processada por um ou mais dentre: cura, fermentação e/ou pasteurização.

[0318] Adequadamente, a folha de tabaco processada pode ser processada por cura.

[0319] A folha de tabaco pode ser curada por qualquer método conhecido na arte. Em uma concretização, a folha de tabaco pode ser curada por um ou mais dos métodos de cura selecionados do grupo que consiste de: cura ao ar, cura ao fogo, cura em fumeiro e cura ao sol.

[0320] Adequadamente, a folha de tabaco pode ser curada ao ar.

[0321] Normalmente, a cura ao ar é obtida pendurando-se a folha de tabaco em celeiros bem ventilados e deixando-a secar. Isso geralmente é realizado durante um período de quatro a oito semanas. A cura ao ar é especialmente adequada para tabaco Burley.

[0322] Adequadamente, a folha de tabaco pode ser curada ao fogo. A cura ao fogo é normalmente obtida pendurando-se folha de tabaco em grandes celeiros onde as fogueiras de madeiras duras são mantidas em combustão lenta contínua ou intermitente e geralmente leva entre três dias e dez semanas, dependendo do processo e do tabaco.

[0323] Em outra concretização, a folha de tabaco pode ser curada em fumeiro. A cura em fumeiro pode compreender amarrar folhas de tabaco em palitos de tabaco e pendurá-las em postes em celeiros de cura. Os celeiros geralmente têm uma chaminé que sai de caixas de fogo alimentadas externamente. Normalmente, isso resulta em tabaco que foi curado por calor sem ser exposto à fumaça. Usualmente, a temperatura sobe lentamente ao longo da cura e todo o processo demora cerca de 1 semana.

[0324] Adequadamente, a folha de tabaco pode ser curada ao sol. Esse método geralmente envolve a exposição ao sol do tabaco descoberto.

[0325] Adequadamente, a folha de tabaco processada pode ser processada por fermentação.

[0326] A fermentação pode ser realizada de qualquer maneira conhecida na arte. Normalmente, durante a fermentação, as folhas de tabaco são empilhadas em pilhas (um volume) de tabaco curado coberto, por exemplo, com estopa para reter a umidade. A combinação da água remanescente no interior da folha e do peso do tabaco gera um calor natural que amadurece o tabaco. A temperatura no centro do volume é monitorada diariamente. Em alguns métodos, toda semana, todo o volume é aberto. As folhas são então removidas para serem sacudidas e umedecidas e o volume é girado de modo que as folhas de dentro saiam para fora e as folhas de baixo são colocadas no topo do volume. Isso garante uma fermentação uniforme em todo o volume. A umidade adicional nas folhas, somada à própria rotação das próprias folhas, gera calor, liberando a amônia natural do tabaco e reduzindo a nicotina, ao mesmo tempo em que aprofunda a cor e melhora o aroma do tabaco. Normalmente, o processo de fermentação continua por até 6 meses, dependendo da variedade do tabaco, posição do caule na folha, espessura e uso pretendido da folha.

[0327] Adequadamente, a folha de tabaco processada pode ser processada por pasteurização. A pasteurização pode ser particularmente preferida quando a folha de tabaco for usada para fazer um produto da indústria do tabaco sem fumaça, mais preferencialmente snus.

[0328] A pasteurização da folha de tabaco pode ser realizada por qualquer método conhecido na arte. Por exemplo, a pasteurização pode ser realizada conforme detalhado em J Foulds, L Ramstrom, M Burke, K Fagerstrom. Efeito do tabaco sem fumaça

(snus) no tabagismo e na saúde pública na Suécia. Tobacco Control (2003) 12: 349-359, cujo ensino é incorporado aqui por referência.

[0329] Durante a produção de snus, a pasteurização é normalmente realizada por um processo no qual o tabaco é tratado termicamente com vapor por 24–36 horas (atingindo temperaturas de aproximadamente 100 °C). Isso resulta em um produto quase estéril e sem querer ser limitado pela teoria, acredita-se que uma das consequências disso seja uma limitação da formação de TSNA.

[0330] Em uma concretização, a pasteurização pode ser pasteurização a vapor.

[0331] Em algumas concretizações, a folha de tabaco processada pode ser cortada. A folha de tabaco processada pode ser cortada antes ou depois do processamento. Adequadamente, a folha de tabaco processada pode ser cortada após o processamento.

[0332] Em uma concretização, o uso da concretização anterior pode fornecer tabaco reconstituído.

[0333] Em uma concretização, é fornecido tabaco reconstituído.

[0334] "Reconstituído", conforme usado neste documento, também pode ser referido como tabaco em folha reconstituído, reciclado ou homogeneizado e se refere ao material de tabaco gerado a partir de restos de folha de tabaco após o processamento. O tabaco reconstituído permite a produção de uma mistura consistente e de alta qualidade e permite o ajuste da proporção dos componentes individuais.

[0335] O tabaco reconstituído pode ser reconstituído por nanofibras (as nanofibras podem ser extraídas na forma sólida ou líquida), reconstituição para fabricação de papel (que usa caules, restos e nervuras intermediárias, etc. como matéria- prima) ou reconstituição do tipo lama (que usa uma mistura de finos e caules de tabaco, moídos para produzir, misturados com água e agente aglutinante vegetal. O resíduo solúvel é formado em folhas pela extração da água).

[0336] Qualquer método conhecido na arte pode ser usado para fazer tabaco reconstituído, por exemplo, ver CORESTA Congress, Sapporo, 2012, Smoke Science/Product Technology Groups, SSPT 12 (incorporado neste documento por referência).

[0337] Em algumas concretizações, a planta de tabaco, folha colhida de uma planta de tabaco e/ou folha de tabaco processada pode ser usada para extrair nicotina. A extração de nicotina pode ser alcançada usando qualquer método conhecido na arte. Por exemplo, um método para extrair nicotina do tabaco é ensinado em US 2.162.738 que é incorporado aqui por referência.

[0338] Em um aspecto, a presente invenção fornece material de tabaco curado feito de uma planta de tabaco ou parte da mesma, de acordo com a invenção.

[0339] Em outro aspecto, a presente invenção fornece uma mistura de tabaco que compreende material de tabaco feito de uma planta de tabaco ou parte da mesma de acordo com a presente invenção, ou de uma cultura de células de tabaco de acordo com a presente invenção. Em um aspecto, a presente invenção fornece uma mistura de tabaco que compreende material de tabaco curado de acordo com a presente invenção.

[0340] Adequadamente, a mistura de tabaco de acordo com a presente invenção pode compreender aproximadamente 10%, 20%, 30%,

40%, 50%, 60%, 70%, 80% ou 90% de tabaco de uma planta de tabaco ou parte da mesma de acordo com a presente invenção, ou de uma cultura de células de tabaco de acordo com a presente invenção.

Adequadamente, a mistura de tabaco pode compreender aproximadamente 10% de tabaco de uma planta de tabaco ou parte da mesma de acordo com a presente invenção, ou de uma cultura de células de tabaco de acordo com a presente invenção.

Adequadamente, a mistura de tabaco pode compreender aproximadamente 20% de tabaco de uma planta de tabaco ou parte da mesma de acordo com a presente invenção, ou de uma cultura de células de tabaco de acordo com a presente invenção.

Adequadamente, a mistura de tabaco pode compreender aproximadamente 30% de tabaco de uma planta de tabaco ou parte da mesma de acordo com a presente invenção, ou de uma cultura de células de tabaco de acordo com a presente invenção.

Adequadamente, a mistura de tabaco pode compreender aproximadamente 40% de tabaco de uma planta de tabaco ou parte da mesma de acordo com a presente invenção, ou de uma cultura de células de tabaco de acordo com a presente invenção.

Adequadamente, a mistura de tabaco pode compreender aproximadamente 50% de tabaco de uma planta de tabaco ou parte da mesma de acordo com a presente invenção, ou de uma cultura de células de tabaco de acordo com a presente invenção.

Adequadamente, a mistura de tabaco pode compreender aproximadamente 60% de tabaco de uma planta de tabaco ou parte da mesma de acordo com a presente invenção, ou de uma cultura de células de tabaco de acordo com a presente invenção.

Adequadamente, a mistura de tabaco pode compreender aproximadamente 70% de tabaco de uma planta de tabaco ou parte da mesma de acordo com a presente invenção, ou de uma cultura de células de tabaco de acordo com a presente invenção. Adequadamente, a mistura de tabaco pode compreender aproximadamente 80% de tabaco de uma planta de tabaco ou parte da mesma de acordo com a presente invenção, ou de uma cultura de células de tabaco de acordo com a presente invenção. Adequadamente, a mistura de tabaco pode compreender aproximadamente 90% de tabaco de uma planta de tabaco ou parte da mesma de acordo com a presente invenção, ou de uma cultura de células de tabaco de acordo com a presente invenção.

[0341] Em um aspecto, um produto de mistura de tabaco da presente invenção compreende pelo menos cerca de 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 ou 95 por cento em peso seco de tabaco curado de uma planta de tabaco ou parte da mesma de acordo com a presente invenção, ou uma cultura de células de tabaco de acordo com a presente invenção.

[0342] Adequadamente, o material de tabaco curado pode ser curado ao ar. Adequadamente, o material de tabaco curado pode ser curado em fumeiro. Adequadamente, o material de tabaco curado pode ser curado ao sol. Adequadamente, o material de tabaco curado pode ser curado ao fogo.

[0343] Um produto da indústria do tabaco ou artigo de fumo de acordo com a presente invenção pode compreender o material de tabaco (por exemplo, material de tabaco curado ou material de tabaco reconstituído) de acordo com a presente invenção.

[0344] Em outro aspecto, a presente invenção fornece um produto da indústria do tabaco.

[0345] Em uma concretização, o produto da indústria do tabaco de acordo com a presente invenção pode ser um produto da indústria do tabaco misturado. Adequadamente, a mistura de tabaco pode compreender material de tabaco curado de acordo com a presente invenção.

[0346] Em uma concretização, o produto da indústria do tabaco pode ser preparado a partir de uma planta de tabaco da invenção ou uma parte da mesma.

[0347] Adequadamente, a planta de tabaco ou parte da mesma pode ser propagada a partir de um material de propagação de planta de tabaco de acordo com a presente invenção.

[0348] O termo "parte da mesma", conforme usado neste documento no contexto de uma planta de tabaco, refere-se a uma parte da planta de tabaco. Adequadamente, a "parte da mesma" pode ser uma folha, raiz ou caule de uma planta de tabaco ou flores. Adequadamente, a "parte da mesma" pode ser uma folha, raiz ou caule de uma planta de tabaco.

PRODUTO DA INDÚSTRIA DE TABACO

[0349] Conforme usado neste documento, o termo "produto da indústria do tabaco" se destina a incluir artigos de fumo combustíveis, como cigarros, cigarrilhas, charutos, tabaco para cachimbos ou cigarros de enrolar, (seja à base de tabaco, derivados de tabaco, tabaco expandido, tabaco reconstituído, substitutos do tabaco ou outro material fumável), sistemas de provisão de aerossol não combustível, como produtos de aquecimento que liberam compostos de materiais de substrato sem queima, como cigarros eletrônicos, produtos de aquecimento de tabaco e sistemas híbridos para gerar aerossol de uma combinação de materiais de substrato, por exemplo, sistemas híbridos contendo um líquido ou gel ou substrato sólido, bem como materiais de substrato aerossolizáveis usados nestes sistemas de provisão de aerossol; e artigos de entrega sem aerossol, tais como pastilhas, gomas, adesivos, artigos compreendendo pós respiráveis e produtos da indústria do tabaco sem fumaça, como snus e rapé, cujos artigos de entrega sem aerossol podem ou não entregar nicotina.

[0350] Em uma concretização, o produto da indústria do tabaco pode ser preparado a partir de (por exemplo, pode compreender) uma planta de tabaco da invenção ou uma parte da mesma.

[0351] Adequadamente, a planta de tabaco ou parte da mesma pode ser propagada a partir de um material de propagação de planta de tabaco de acordo com a presente invenção.

[0352] O termo "parte da mesma", conforme usado neste documento no contexto de uma planta de tabaco, refere-se a uma parte da planta de tabaco. De preferência, a "parte da mesma" é uma folha de uma planta de tabaco.

[0353] Em outra concretização, o produto da indústria do tabaco pode ser preparado a partir de uma folha colhida da invenção.

[0354] Em outra concretização, o produto da indústria do tabaco pode ser preparado a partir de uma folha de tabaco processada da invenção.

[0355] Adequadamente, o produto da indústria do tabaco pode ser preparado a partir de uma folha de tabaco processada por um ou mais dentre: cura, fermentação e/ou pasteurização.

[0356] Adequadamente, o produto da indústria do tabaco pode compreender uma folha de tabaco cortada, opcionalmente processada de acordo com a concretização anterior.

[0357] Em outra concretização, o produto da indústria do tabaco pode ser preparado a partir de uma cultura de células de tabaco de acordo com a presente invenção.

[0358] Em outra concretização, o produto da indústria do tabaco pode ser preparado a partir de (por exemplo, pode compreender) um material de tabaco curado de acordo com a presente invenção.

[0359] Em outra concretização, o produto da indústria do tabaco pode ser preparado a partir de (por exemplo, pode compreender) uma mistura de tabaco de acordo com a presente invenção.

[0360] Em uma concretização, o produto da indústria do tabaco pode ser um artigo de fumo.

[0361] Conforme usado neste documento, o termo "artigo de fumo" pode incluir produtos para fumar, como tabaco de rolo, cigarros, charutos e cigarrilhas, quer seja à base de tabaco, derivados do tabaco, tabaco expandido, tabaco reconstituído ou substitutos de tabaco.

[0362] Em outra concretização, o produto da indústria do tabaco pode ser um produto da indústria do tabaco sem fumaça.

[0363] O termo "produto da indústria do tabaco sem fumaça", conforme usado neste documento, refere-se a um produto da indústria do tabaco que não se destina a ser fumado e/ou sujeito a combustão.

[0364] Os produtos da indústria do tabaco sem fumaça (incluindo materiais sem queima) podem conter tabaco em qualquer forma, incluindo partículas secas, fragmentos, grânulos, pós ou lama, depositados sobre, misturados com, envolvidos com ou combinados com outros ingredientes em qualquer formato, como flocos, filmes, abas, espumas ou grânulos.

[0365] Em uma concretização, um produto da indústria do tabaco sem fumaça pode incluir snus, rapé, tabaco de mascar ou semelhantes.

[0366] Em uma concretização, o produto da indústria do tabaco é um artigo de fumo combustível, selecionado do grupo que consiste de um cigarro, uma cigarrilha e um charuto.

[0367] Em uma concretização, o produto da indústria do tabaco compreende um ou mais componentes de um artigo de fumo combustível, como um filtro, uma haste de filtro, segmentos de haste de filtro, tabaco, uma haste de tabaco, um segmento de haste de tabaco, um derramamento, um componente de liberação aditivo como uma cápsula, um fio, pérolas, um papel como um envoltório de plugue, um papel de filtro ou um papel de cigarro.

[0368] Em uma concretização, o produto da indústria do tabaco é um sistema de provisão de aerossol não combustível.

[0369] Em uma concretização, o produto da indústria do tabaco compreende um ou mais componentes de um sistema de provisão de aerossol não combustível, como um aquecedor e um substrato aerossolizável.

[0370] Em uma concretização, o sistema de provisão de aerossol é um cigarro eletrônico também conhecido como dispositivo de vaporização.

[0371] Em uma concretização, o cigarro eletrônico compreende um aquecedor, uma fonte de energia capaz de fornecer energia ao aquecedor, um substrato aerossolizável, como um líquido ou gel, um invólucro e, opcionalmente, um bocal.

[0372] Em uma concretização, o substrato aerossolizável está contido em um recipiente de substrato. Em uma concretização, o recipiente de substrato é combinado com ou compreende o aquecedor.

[0373] Em uma concretização, o produto da indústria do tabaco é um produto de aquecimento que libera um ou mais compostos por aquecimento, mas sem queima, de um material de substrato. O material de substrato é um material aerossolizável que pode ser, por exemplo, tabaco ou outros produtos diferentes do tabaco, que podem ou não conter nicotina. Em uma concretização, o produto de aquecimento é um produto de aquecimento de tabaco.

[0374] Em uma concretização, o produto de aquecimento é um dispositivo eletrônico.

[0375] Em uma concretização, o produto de aquecimento de tabaco compreende um aquecedor, uma fonte de energia capaz de fornecer energia ao aquecedor, um substrato aerossolizável, como um material sólido ou em gel.

[0376] Em uma concretização, o produto de aquecimento é um artigo não eletrônico.

[0377] Em uma concretização, o produto de aquecimento compreende um substrato aerossolizável, como um material sólido ou em gel e uma fonte de energia que é capaz de fornecer energia térmica ao substrato aerossolizável sem qualquer meio eletrônico, tal como queimando um material de combustão, tal como carvão vegetal.

[0378] Em uma concretização, o produto de aquecimento também compreende um filtro capaz de filtrar o aerossol gerado pelo aquecimento do substrato aerossolizável.

[0379] Em algumas concretizações, o material de substrato aerossolizável pode compreender um vapor ou agente gerador de aerossol ou um umectante, tal como glicerol, propilenoglicol, triacetina ou dietilenoglicol. ]

[0380] Em uma concretização, o produto da indústria do tabaco é um sistema híbrido para gerar aerossol por aquecimento, mas sem queima, de uma combinação de materiais de substrato. Os materiais de substrato podem compreender, por exemplo, sólido, líquido ou gel que pode ou não conter nicotina. Em uma concretização, o sistema híbrido compreende um substrato líquido ou gel e um substrato sólido. O substrato sólido pode ser, por exemplo, tabaco ou outros produtos diferentes do tabaco, que podem ou não conter nicotina. Em uma concretização, o sistema híbrido compreende um substrato líquido ou gel e tabaco.

[0381] Em uma outra concretização, o produto da indústria do tabaco pode ser um dispositivo de aquecimento de tabaco ou dispositivo híbrido ou cigarro eletrônico ou semelhante.

[0382] Tipicamente, em dispositivos de aquecimento de tabaco ou dispositivos híbridos, um aerossol é gerado pela transferência de calor de uma fonte de calor para um substrato ou material de formação de aerossol fisicamente separado, que pode estar localizado dentro, ao redor ou a jusante da fonte de calor. Durante o fumo, os compostos voláteis são liberados do substrato formador de aerossol por transferência de calor da fonte de calor e arrastados no ar aspirado através do artigo de fumo. Conforme os compostos liberados esfriam, eles se condensam para formar um aerossol que é inalado pelo usuário.

[0383] Os artigos e dispositivos geradores de aerossol para consumo ou dispositivos de aquecimento de tabaco para fumo são conhecidos na arte. Eles podem incluir, por exemplo, dispositivos geradores de aerossol aquecidos eletricamente nos quais um aerossol é gerado pela transferência de calor de um ou mais elementos de aquecimento elétrico do dispositivo gerador de aerossol para o substrato de formação de aerossol de um dispositivo de aquecimento de tabaco.

[0384] Adequadamente, o dispositivo de aquecimento de tabaco pode ser um dispositivo gerador de aerossol.

[0385] De preferência, o dispositivo de aquecimento de tabaco pode ser um dispositivo de aquecimento, sem queima. Dispositivos de aquecimento sem queima são conhecidos na arte e liberam compostos aquecendo, mas não queimando, tabaco.

[0386] Um exemplo de um dispositivo de aquecimento sem queima adequado pode ser aquele ensinado em WO2013/034459 ou GB2515502 que são incorporados aqui por referência.

[0387] Em uma concretização, o substrato de formação de aerossol de um dispositivo de aquecimento de tabaco pode ser um produto da indústria do tabaco de acordo com a presente invenção.

[0388] Em uma concretização, o dispositivo de aquecimento de tabaco pode ser um dispositivo híbrido.

POLINUCLEOTÍDEOS/POLIPEPTÍDEOS/CONSTRUÇÕES

[0389] Em certas concretizações da presente invenção, as construções que modulam a expressão ou sequência de ácido nucleico de pelo menos uma proteína de repetição Armadillo podem ser transformadas em células vegetais, adequadamente sob a direção de um promotor.

[0390] Em certas concretizações da presente invenção, as construções que diminuem (isto é, inibem) a expressão ou que modificam a sequência de ácido nucleico de pelo menos uma proteína de repetição Armadillo podem ser transformadas em células vegetais sob a direção de um promotor. Por exemplo, a construção genética pode ser uma construção de edição de gene ou pode compreender uma molécula de RNAi, que pode compreender uma pequena molécula de RNA interferente (siRNA) ou uma molécula de alça em gancho curto (shRNA).

[0391] Em certas concretizações da presente invenção, as construções que aumentam a expressão de uma proteína de repetição Armadillo podem ser transformadas em células de plantas, adequadamente sob a direção de um promotor, por exemplo, construções que codificam um gene que codifica uma proteína de repetição Armadillo, tal como uma proteína de repetição endógena Armadillo.

[0392] As construções podem ser introduzidas em plantas de acordo com a presente invenção por meio de vetores adequados, por exemplo, vetores de transformação de plantas. Um vetor de transformação de planta pode compreender um cassete de expressão compreendendo 5'-3' na direção da transcrição, uma sequência promotora, uma construção de sequência de direcionamento do gene que codifica para uma proteína de repetição Armadillo e, opcionalmente, uma sequência 3' não traduzida, incluindo o terminador de um sinal de parada para RNA polimerase e um sinal de poliadenilação para poliadenilase. A sequência promotora pode estar presente em uma ou mais cópias, e tais cópias podem ser idênticas ou variantes de uma sequência promotora conforme descrito acima. A sequência terminadora pode ser obtida a partir de genes vegetais, bacterianos ou virais. Sequências de terminação adequados são a sequência terminadora rbcS E9 de ervilha, a sequência terminadora nsa derivada da nopalina sintase gene de Agrobacterium tumefaciens e a sequência terminadora 35S do vírus de mosaico de couve-flor, por exemplo. Um especialista na arte estará prontamente ciente de outras sequências terminadoras adequadas.

[0393] A construção da presente invenção também pode compreender um mecanismo de intensificação da expressão gênica para aumentar a força do promotor. Um exemplo de um tal elemento potenciador é um derivado de uma porção do promotor do gene da plastocianina da ervilha, e que é o objeto da Patente Internacional N° WO 97/20056 que é incorporada aqui, por referência. Elementos intensificadores adequados podem ser o elemento intensificador no derivado do gene nopalina sintase de Agrobacterium tumefaciens e o elemento intensificador 35S de vírus de mosaico da couve-flor, por exemplo.

[0394] Estas regiões reguladoras podem ser derivadas do mesmo gene que a sequência de DNA promotora ou podem ser derivadas de genes diferentes, de Nicotiana tabacum ou outros organismos, por exemplo, de uma planta da família Solanaceae ou da subfamília Cestroideae. Todas as regiões reguladoras devem ser capazes de operar nas células do tecido a ser transformado.

[0395] A sequência de DNA promotora pode ser derivada do mesmo gene que o gene de interesse, por exemplo, o gene que o promotor irá dirigir, por exemplo, um gene que codifica uma proteína de repetição Armadillo de acordo com a invenção, uma sequência de codificação usada na presente invenção ou pode ser derivada de um gene diferente, de Nicotiana tabacum, ou outro organismo, por exemplo, de uma planta da família Solanaceae ou da subfamília Cestroideae.

[0396] O cassete de expressão pode ser incorporado em um vetor de transformação de planta básico, tal como pBIN 19 Plus, pBI 101, pKYLX71:35S2, pCAMBIA2300 ou outros vetores de transformação de planta adequados conhecidos na arte. Além do cassete de expressão, o vetor de transformação da planta conterá as sequências necessárias para o processo de transformação. Estes podem incluir os genes de Agrobacterium vir, uma ou mais sequências de borda de T-DNA e como marcador elegível ou outros meios de identificação de células vegetais transgênicas.

[0397] O termo "vetor de expressão ou vetor de transformação de planta" significa uma construção capaz de expressar in vivo ou in vitro. De preferência, o vetor de expressão é incorporado no genoma do organismo. Em uma concretização, o vetor da presente invenção expressa uma proteína, por exemplo, uma proteína de repetição Armadillo como descrito aqui. O termo "incorporado" cobre de preferência a incorporação estável no genoma.

[0398] As técnicas para transformar plantas são bem conhecidas na arte e incluem a transformação mediada por Agrobacterium, por exemplo. O princípio básico na construção de plantas geneticamente modificadas é inserção de informações genéticas no genoma da planta de forma a obter uma manutenção estável do material genético inserido. Uma revisão das técnicas gerais pode ser encontrada em artigos de Potrykus (Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol [1991] 42: 205-225) e Christon (AgroFood-

Industry Hi-Tech março/abril 1994 17-27), que são incorporados aqui por referência.

[0399] Tipicamente, na transformação mediada por Agrobacterium, um vetor binário carregando um DNA estranho de interesse, isto é, uma construção de acordo com a presente invenção, é transferido de uma cepa de Agrobacterium apropriada para uma planta alvo pelo co-cultivo da Agrobacterium com explantes da planta alvo. O tecido vegetal transformado é então regenerado em meio de seleção, cujo meio de seleção compreende um marcador selecionável e hormônios de crescimento vegetal. Uma alternativa é o método de imersão floral (Clough & Bent, 1998 Plant J. 1998 Dec; 16 (6): 735-43, que é incorporado aqui por referência), pelo qual os botões florais de uma planta intacta são colocados em contato com uma suspensão da cepa de Agrobacterium contendo o gene quimérico, e após o conjunto de sementes, indivíduos transformados são germinados e identificados por crescimento em meio seletivo. A infecção direta de tecidos vegetais por Agrobacterium é uma técnica simples que tem sido amplamente empregada e que é descrita em Butcher D.N. et al., (1980), Tissue Culture Methods for Plant Pathologists, eds.: DS Ingrams e JP Helgeson, 203-208 que é incorporada aqui por referência.

[0400] Outros métodos de transformação adequados incluem transferência direta de genes em protoplastos usando polietilenoglicol ou técnicas de eletroporação, bombardeamento de partículas, microinjeção e o uso de fibras de carboneto de silício, por exemplo. Transformar plantas usando transformação balística, incluindo a técnica de whisker de carboneto de silício são ensinadas em Frame BR, Drayton PR, Bagnaall SV, Lewnau CJ,

Bullock W P, Wilson HM, Dunwell JM, Thompson JA & Wang K (1994) que são incorporadas aqui por referência. A produção de plantas de milho transgênicas férteis por transformação mediada por whisker de carboneto de silício é ensinada em The Plant Journal 6: 941-948, que é incorporada aqui por referência) e as técnicas de transformação viral são ensinadas, por exemplo, em Meyer P, Heidmann I e Niedenhof I (1992), que é incorporada aqui por referência. O uso do vírus de mosaico da mandioca como um sistema de vetor para plantas é ensinado em Gene 110: 213-217, que é incorporado aqui por referência. Outros ensinamentos sobre a transformação de plantas podem ser encontrados em EP-A-0449375, incorporado aqui por referência.

[0401] Em um aspecto adicional, a presente invenção se refere a um sistema de vetor que carrega uma construção e a introduz no genoma de um organismo, como uma planta, adequadamente uma planta de tabaco. O sistema de vetor pode compreender um vetor, mas pode compreender dois vetores. No caso de dois vetores, o sistema vetorial é normalmente referido como um sistema vetorial binário. Os sistemas de vetores binários são descritos em mais detalhes em Gynheung Anetal, (1980), Binary Vectors, Plant Molecular Biology Manual A3, 1-19, que é incorporado aqui por referência.

[0402] Um sistema amplamente utilizado para a transformação de células vegetais usa o plasmídeo Ti de Agrobacterium tumefaciens ou um plasmídeo Ri de Agrobacterium rhizogenes descrito por An et al., (1986), Plant Physiol. 81, 301-305 e Butcher D.N. et al., (1980), Tissue Culture Methods for Plant Pathologists, eds: DS Ingrams e JP Helgeson, 203-208 que são incorporados aqui por referência. Após cada método de introdução do gene exógeno desejado de acordo com a presente invenção nas plantas, a presença e/ou inserção de outras sequências de DNA pode ser necessária. O uso de T-DNA para a transformação de células vegetais foi intensamente estudado e está descrito em EP-A-120516; Hoekema, em: The Binary Plant Vector System Offset- drukkerij Kanters BB, Amsterdam, 1985, Capítulo V; Fraley, et al., Crit. Rev. Plant Sei., 4: 1-46; e Anetal., EMBO J (1985) 4: 277-284, incorporado aqui por referência.

[0403] As células vegetais transformadas com as construções que modulam a expressão de ou que modificam a sequência de ácido nucleico de pelo menos um gene que codifica uma proteína de repetição Armadillo podem ser cultivadas e mantidas de acordo com métodos de cultivo de tecidos bem conhecidos tais como através da cultivo das células em um meio de cultura adequado fornecido com os fatores de crescimento necessários, como aminoácidos, hormônios vegetais, vitaminas, etc.

[0404] O termo "planta transgênica" em relação ao presente invento inclui qualquer planta que compreende uma construção que modula a expressão de ou que modifica a sequência de ácido nucleico de pelo menos um gene que codifica uma proteína de repetição Armadillo de acordo com a invenção. Consequentemente, uma planta transgênica é uma planta que foi transformada com uma construção de acordo com a invenção. De preferência, a planta transgênica exibe teor de alcaloides modulado e/ou teor de TSNA modulado (ou precursor da mesma) de acordo com a presente invenção. O termo "planta transgênica" não cobre as sequências que codificam nucleotídeos nativos no seu ambiente natural quando está sob o controle do seu promotor nativo, que também está no seu ambiente natural.

[0405] Em um aspecto, o gene que codifica uma proteína de repetição Armadillo, uma construção, vetor de transformação de planta ou célula de planta de acordo com a presente invenção está em uma forma isolada. O termo "isolado" significa que a sequência é pelo menos substancialmente livre de pelo menos outro componente com o qual a sequência está naturalmente associada na natureza e como encontrada na natureza.

[0406] Em um aspecto, o gene que codifica uma proteína de repetição Armadillo, uma construção, vetor de transformação de planta ou célula de planta de acordo com a invenção está em uma forma purificada. O termo "purificado" significa em um estado relativamente puro, por exemplo, pelo menos cerca de 90% puro, ou, pelo menos, cerca de 95% puro, ou, pelo menos, cerca de 98% puro.

[0407] O termo "sequência de nucleotídeos", tal como utilizado aqui, refere-se a uma sequência de oligonucleotídeos ou sequência de polinucleotídeos e variantes, homólogos, fragmentos e derivados dos mesmos (como porções dos mesmos). A sequência de nucleotídeos pode ser de origem genômica ou sintética ou recombinante, que pode ser de fita dupla ou de fita simples, representando a fita senso ou antissenso.

[0408] O termo "sequência de nucleotídeos" em relação à presente invenção inclui DNA genômico, cDNA, DNA sintético e RNA. De preferência, significa DNA, mais preferencialmente a sequência de cDNA que codifica para a presente invenção.

[0409] Em uma concretização preferida, a sequência de nucleotídeos quando se relaciona com e quando englobadas pelo escopo em si da presente invenção, ou seja, o gene que codifica uma proteína de repetição Armadillo, inclui a sequência de nucleotídeos nativa quando no seu ambiente natural e quando é ligada às sequências naturalmente associadas que está/estão também em seu ambiente natural. Para facilidade de referência, nós chamaremos esta concretização preferida de "sequência de nucleotídeos nativa". A este respeito, o termo "sequência de nucleotídeos nativa" significa uma sequência de nucleotídeos inteira que está em seu ambiente nativo e quando operativamente ligada a um promotor completo com a qual está naturalmente associado, promotor esse que também está em seu ambiente nativo.

[0410] A sequência de nucleotídeos para utilização na presente invenção pode estar presente em um vetor em que a sequência de nucleotídeos está operacionalmente ligada a sequências reguladoras capazes de proporcionar a expressão da sequência de nucleotídeos por um organismo hospedeiro adequado. As construções para uso na presente invenção podem ser transformadas em uma célula hospedeira adequada, conforme descrito neste documento, para fornecer a expressão de um polipeptídeo da presente invenção. A escolha do vetor, por exemplo, um plasmídeo, cosmídeo ou vetor fágico dependerá frequentemente da célula hospedeira na qual será introduzido. Os vetores podem ser usados in vitro, por exemplo, para a produção de RNA ou usados para transfectar, transformar, traduzir ou infectar uma célula hospedeira.

[0411] Em algumas aplicações, a sequência de nucleotídeos para uso na presente invenção está operacionalmente ligada a uma sequência reguladora que é capaz de fornecer a expressão da sequência de nucleotídeos, tal como pela célula hospedeira escolhida. A título de exemplo, a presente invenção cobre um vetor que compreende a sequência de nucleotídeos do gene que codifica uma proteína de repetição Armadillo como descrito aqui operacionalmente ligada a tal sequência reguladora, isto é, o vetor é um vetor de expressão.

[0412] O termo "operacionalmente ligado" refere-se a uma justaposição em que os componentes descritos estão em uma relação que lhes permite funcionar da maneira pretendida. Uma sequência reguladora "operacionalmente ligada" a uma sequência de codificação é ligada de tal forma que a expressão da sequência de codificação é alcançada em condições compatíveis com as sequências de controle.

[0413] O termo "sequências reguladoras" inclui promotores e intensificadores e outros sinais de regulação de expressão. O termo "promotor" é usado no sentido do senso normal da arte, por exemplo, um sítio de ligação da RNA polimerase. A sequência de nucleotídeos dentro de uma construção que codifica o gene que codifica uma proteína de repetição Armadillo pode estar operacionalmente ligada a pelo menos um promotor.

[0414] O termo "construção" - que é sinônimo de termos como "cassete" ou "vetor" - inclui uma sequência de nucleotídeos para uso de acordo com a presente invenção diretamente ou indiretamente ligada a um promotor.

[0415] Um exemplo de uma ligação indireta é o fornecimento de um grupo espaçador adequado, como uma sequência de íntron, como o íntron Sh1 ou o íntron ADH, intermediário do promotor e da sequência de nucleotídeos da presente invenção. O mesmo é verdadeiro para o termo "fundido" em relação à presente invenção que inclui ligação direta ou indireta. Em alguns casos, os termos não cobrem a combinação natural da sequência de nucleotídeos que codifica a proteína normalmente associada ao promotor do gene tipo selvagem e quando ambos estão em seu ambiente natural. A construção pode até conter ou expressar um marcador, que permite a seleção da construção genética.

[0416] Em algumas concretizações, um promotor pode ser operacionalmente ligado à sequência de nucleotídeos em uma construção ou vetor que é usado para modular a concentração e/ou o teor total de nicotina em uma célula ou cultura de células ou planta de tabaco ou parte da mesma.

[0417] Em algumas concretizações, o promotor pode ser selecionado a partir do grupo que consiste de: um promotor constitutivo, um promotor tecido específico, um promotor regulado pelo desenvolvimento e um promotor induzível.

[0418] Em uma concretização, o promotor pode ser um promotor constitutivo.

[0419] Um promotor constitutivo direciona a expressão de um gene através das várias partes de uma planta continuamente durante o desenvolvimento da planta, embora o gene possa não ser expresso no mesmo nível em todos os tipos de células. Exemplos de promotores constitutivos conhecidos incluem aqueles associados ao vírus do mosaico de couve-flor 35S transcrito (Odell JT, Nagy F, Chua NH. (1985). Identificação de sequências de DNA necessárias para a atividade do promotor 35S do vírus de mosaico da couve-flor. Nature. 313 810-2), o gene da actina 1 do arroz (Zhang W, McElroy D, Wu R. (1991). Análise da atividade da região 5'do arroz Act1 em plantas de arroz transgênicas. Plant Cell 3 1155-65) e o gene da ubiquitina 1 do milho (Cornejo MJ,

Luth D, Blankenship KM, Anderson OD, Blechl AE. (1993). Atividade de um promotor de ubiquitina de milho em arroz transgênico. Plant Molec. Biol. 23 567-81). Promotores constitutivos, tais como o promotor Vírus Anel Gravado de Cravos (CERV) (Hull R, Sadler J, LongstaffM (1986) (CaMV/35S), promotor 35S do vírus do mosaico da figueira. A sequência de DNA do vírus anel gravado de cravos: comparação com vírus de mosaico de couve-flor e retrovírus, EMBO Journal, 5(2): 3083-3090).

[0420] O promotor constitutivo pode ser selecionado de um: um promotor do vírus anel gravado de cravos (CERV), um vírus do mosaico de couve-flor (promotor CaMV 35S), um promotor do gene da actina 1 do arroz ou do gene da ubiquitina 1 do milho.

[0421] O promotor pode ser um promotor tecido específico. Um promotor tecido específico é aquele que dirige a expressão de um gene em uma (ou algumas) partes de uma planta, geralmente ao longo da vida dessas partes da planta. A categoria de promotor tecido específico comumente também inclui promotores cuja especificidade não é absoluta, isto é, eles também podem direcionar a expressão em um nível inferior em tecidos diferentes do tecido preferido. Os promotores específicos do tecido incluem o promotor da faseolina, promotor da legumina b4, promotor usp, promotor sbp, promotor ST-LS1, B33 (promotor da classe I da patatina).

[0422] Em outra concretização, o promotor pode ser um promotor regulado pelo desenvolvimento.

[0423] Um promotor regulado pelo desenvolvimento direciona uma mudança na expressão de um gene em uma ou mais partes de uma planta em um momento específico durante o desenvolvimento da planta. O gene pode ser expresso nessa parte da planta em outros momentos em um nível diferente (geralmente mais baixo) e também pode ser expresso em outras partes da planta.

[0424] Em uma concretização, o promotor pode ser um promotor induzível.

[0425] Um promotor induzível é capaz de direcionar a expressão de um gene em resposta a um indutor. Na ausência do indutor, o gene não será expresso. O indutor pode atuar diretamente sobre a sequência do promotor ou pode atuar neutralizando o efeito de uma molécula repressora. O indutor pode ser um agente químico, como um metabólito, uma proteína, um regulador de crescimento (como auxina e ácido salicílico que ativam o promotor OCS) ou um elemento tóxico, um estresse fisiológico, como calor, luz (como o promotor SSU da soja), ferimento (por exemplo, o nos, promotor da nopalina sintase) ou pressão osmótica, ou uma consequência indireta da ação de um patógeno ou praga. Um promotor regulado pelo desenvolvimento pode ser descrito como um tipo específico de promotor induzível respondendo a um indutor endógeno produzido pela planta ou a um estímulo ambiental em um ponto particular no ciclo de vida da planta. Exemplos de promotores induzíveis conhecidos incluem aqueles associados à resposta à ferida, tal como descrito por Warner SA, Scott R, Draper J. ((1993) Plant J. 3 191-201), resposta à temperatura conforme divulgado por Benfey & Chua (1989) (Benfey, PN e Chua, NH. ((1989) Science 244 174-181), e induzido quimicamente, como descrito por Gatz ((1995) Methods in Cell Biol. 50 411-424).

[0426] Uma sequência de nucleotídeos que codifica uma proteína que tem as propriedades específicas como um gene que codifica uma proteína de repetição Armadillo como definida aqui ou uma proteína que é adequada para modificação pode ser identificada e/ou isolada e/ou purificada de qualquer célula ou organismo que produza a referida proteína. Vários métodos são bem conhecidos na arte para a identificação e/ou isolamento e/ou purificação de sequências de nucleotídeos. A título de exemplo, as técnicas de amplificação por PCR para preparar mais de uma sequência podem ser utilizadas uma vez que uma sequência adequada tenha sido identificada e/ou isolada e/ou purificada.

[0427] Adicionalmente, em outra alternativa, a sequência de nucleotídeos que codifica a proteína de repetição Armadillo pode ser preparada sinteticamente por métodos padrão estabelecidos, por exemplo, o método de fosforamidita descrito por Beucage SL et al., (1981) Tetrahedron Letters 22, p 1859-1869 que é incorporado aqui por referência, ou o método descrito por Matthes et al., (1984) EMBO J. 3, p. 801-805 que é incorporado aqui por referência. No método da fosforamidita, os oligonucleotídeos são sintetizados, por exemplo, em um sintetizador automático de DNA, purificados, anelados, ligados e clonados em vetores apropriados.

[0428] Conforme usado neste documento, o termo "sequência de aminoácidos" é sinônimo do termo "polipeptídeo" e/ou o termo "proteína". Em alguns casos, o termo "sequência de aminoácidos" é sinônimo do termo "peptídeo". Em alguns casos, o termo "sequência de aminoácidos" é sinônimo do termo "enzima".

[0429] A presente invenção também abrange o uso de sequências com um grau de identidade de sequência ou homologia de sequência com as sequências de aminoácidos de um polipeptídeo contendo as propriedades específicas definidas aqui ou de qualquer sequência de nucleotídeos, ou seja, gene de proteína de repetição Armadillo que codifica tal polipeptídeo (doravante referido como uma

"sequência(s) homóloga(s)"). Aqui, o termo "homólogo" significa uma entidade com uma certa homologia com as sequências de aminoácidos em questão e as sequências de nucleotídeos em questão. Aqui, o termo “homologia” pode ser equiparado a “identidade”.

[0430] A sequência de aminoácidos homóloga e/ou sequência de nucleotídeos e/ou fragmentos devem fornecer e/ou codificar um polipeptídeo que retém a atividade funcional e/ou aumenta a atividade do gene da proteína de repetição Armadillo. Tipicamente, as sequências homólogas compreenderão os mesmos sítios ativos, etc. que a sequência de aminoácidos em questão, por exemplo, ou codificarão os mesmos sítios ativos. Embora a homologia também possa ser considerada em termos de semelhança (isto é, resíduos de aminoácidos com propriedades/funções químicas semelhantes), no contexto da presente invenção é preferido expressar homologia em termos de identidade de sequência. As sequências homólogas normalmente retêm domínios ou padrões funcionais. Adequadamente, homólogos de proteínas de repetição Armadillo podem conter domínios de proteína de repetição Armadillo e um sítio ativo compreendendo um resíduo de lisina conservado.

[0431] Em uma concretização, uma sequência homóloga é considerada como incluindo uma sequência de aminoácidos ou sequência de nucleotídeos que tem uma, duas ou várias adições, deleções e/ou substituições em comparação com a sequência objeto.

IDENTIDADE DE SEQUÊNCIA

[0432] As comparações de identidade de sequência podem ser realizadas a olho nu ou, mais comumente, com o auxílio de programas de comparação de sequência prontamente disponíveis.

Esses programas de computador disponíveis comercialmente podem calcular a % de homologia entre duas ou mais sequências. A % de homologia ou % de identidade pode ser calculada sobre sequências contínuas, isto é, uma sequência é alinhada com a outra sequência e cada aminoácido em uma sequência é diretamente comparado com o aminoácido correspondente na outra sequência, um resíduo de cada vez. Isso é chamado de alinhamento “sem gap”. Normalmente, esses alinhamentos sem gaps são realizados apenas sobre um número relativamente curto de resíduos.

[0433] Embora este seja um método muito simples e consistente, o mesmo falha em levar em consideração que, por exemplo, em um par de sequências idênticas, uma inserção ou deleção fará com que os seguintes resíduos de aminoácidos sejam colocados fora do alinhamento, resultando potencialmente em uma grande redução na % de homologia quando um alinhamento global é executado. Consequentemente, a maioria dos métodos de comparação de sequência são projetados para produzir alinhamentos ótimos que levam em consideração possíveis inserções e deleções sem penalizar indevidamente a pontuação de homologia geral. Isso é conseguido inserindo “gaps” no alinhamento da sequência para tentar maximizar a homologia local.

[0434] No entanto, esses métodos mais complexos atribuem "penalidades de gap" a cada gap que ocorre no alinhamento de modo que, para o mesmo número de aminoácidos idênticos, um alinhamento de sequência com o menor número de gaps possível - refletindo maior parentesco entre as duas sequências comparadas - alcançará uma pontuação mais alta do que um com muitos gaps. “Custos de gap afim” são normalmente usados para cobrar um custo relativamente alto pela existência de um gap e uma penalidade menor para cada resíduo subsequente no gap. Este é o sistema de pontuação de gap mais comumente usado. As penalidades altas de gap certamente produzirão alinhamentos otimizados com menos gaps. A maioria dos programas de alinhamento permite que as penalidades de gap sejam modificadas. No entanto, é preferível usar os valores padrão ao usar esse software para comparações de sequência.

[0435] O cálculo da% de homologia máxima, portanto, requer em primeiro lugar a produção de um alinhamento ótimo, levando em consideração as penalidades de folga. Um programa de computador adequado para realizar esse alinhamento é o Vector NTI (Invitrogen Corp.). Exemplos de software que podem realizar comparações de sequência incluem, mas não estão limitados a, o pacote BLAST (ver Ausubel et al. 1999 Short Protocols in Molecular Biology, 4ª Ed - Capítulo 18), BLAST 2 (ver FEMS Microbiol Lett 1999 174 (2): 247-50; FEMS Microbiol Lett 1999 177 (1): 187-8 e tatiana@ncbi.nlm.nih.gov), FASTA (Altschul et al. 1990 J. Mol. Biol. 403-410) e AlignX para exemplo. Pelo menos BLAST, BLAST 2 e FASTA estão disponíveis para pesquisa offline e online (ver Ausubel et al. 1999, páginas 7-58 a 7-60).

[0436] Embora a % de homologia final possa ser medida em termos de identidade, o processo de alinhamento em si normalmente não é baseado em uma comparação de par tudo ou nada. Em vez disso, uma matriz de pontuação de similaridade em escala é geralmente usada para atribuir pontuações a cada comparação de pares com base na similaridade química ou distância evolutiva. Um exemplo dessa matriz comumente usada é a matriz BLOSUM62 - a matriz padrão para o conjunto de programas BLAST. Os programas Vector NTI geralmente usam os valores padrão públicos ou uma tabela de comparação de símbolos personalizada, se fornecida (consulte o manual do usuário para obter mais detalhes). Para alguns aplicativos, é preferível usar os valores padrão para o pacote Vector NTI.

[0437] Alternativamente, porcentagens de homologia podem ser calculadas usando o recurso de alinhamento múltiplo em Vector NTI (Invitrogen Corp.), com base em um algoritmo, análogo a CLUSTAL (Higgins DG & Sharp PM (1988), Gene 73 (1), 237-244). Uma vez que o software produziu um alinhamento ótimo, é possível calcular a % de homologia, de preferência a % de identidade de sequência. O software normalmente faz isso como parte da comparação de sequência e gera um resultado numérico.

[0438] Devem ser utilizadas penalidades de gap ao determinar a identidade de sequência, então, preferencialmente, os seguintes parâmetros são usados para alinhamento de pares:

PARA BLAST ABERTURA DE GAP 0 EXTENSÃO DE GAP 0

PARA CLUSTAL DNA PROTEÍNA TAMANHO DA PALAVRA 2 1 K triplo PENALIDADE DE GAP 15 10 EXTENSÃO DE GAP 6,66 0,1

[0439] Em uma concretização, CLUSTAL pode ser usado com a penalidade de gap e extensão de gap definida como definido acima. Em algumas concretizações, as penalidades de gap usadas para o alinhamento BLAST ou CLUSTAL podem ser diferentes daquelas detalhadas acima. O especialista apreciará que os parâmetros padrão para realizar os alinhamentos BLAST e CLUSTAL podem mudar periodicamente e será capaz de selecionar os parâmetros apropriados com base nos parâmetros padrões detalhados para os algoritmos de alinhamento BLAST ou CLUSTAL no momento.

[0440] Adequadamente, o grau de identidade em relação a uma sequência de nucleotídeos é determinado em pelo menos 50 nucleotídeos contínuos, de preferência em pelo menos 60 nucleotídeos contínuos, de preferência em pelo menos 7 0 nucleotídeos contínuos, de preferência em pelo menos 80 nucleotídeos contínuos, de preferência ao longo de pelo menos 90 nucleotídeos contínuos, de preferência ao longo de pelo menos 100 nucleotídeos contínuos, de preferência ao longo de pelo menos 150 nucleotídeos contínuos, de preferência ao longo de pelo menos 200 nucleotídeos contínuos, de preferência ao longo de pelo menos 250 nucleotídeos contínuos, de preferência ao longo de pelo menos 300 nucleotídeos contínuos, de preferência ao longo pelo menos 350 nucleotídeos contínuos, de preferência pelo menos 400 nucleotídeos contínuos, de preferência pelo menos 450 nucleotídeos contínuos, de preferência pelo menos 500 nucleotídeos contínuos, de preferência pelo menos 550 nucleotídeos contínuos, de preferência pelo menos 600 nucleotídeos contínuos, de preferência pelo menos 650 nucleotídeos contínuos, ou de preferência ao longo de pelo menos 700 nucleotídeos contínuos.

[0441] Adequadamente, o grau de identidade em relação a um nucleotídeo, cDNA, cds ou sequência de aminoácidos pode ser determinado ao longo de toda a sequência.

[0442] As sequências também podem ter deleções, inserções ou substituições de resíduos de aminoácidos que produzem uma mudança silenciosa e resultam em uma substância funcionalmente equivalente. Substituições deliberadas de aminoácidos podem ser feitas com base na similaridade na polaridade, carga, solubilidade, hidrofobicidade, hidrofilicidade e/ou natureza anfipática dos resíduos, desde que a atividade de ligação secundária da substância seja retida. Por exemplo, aminoácidos carregados negativamente incluem ácido aspártico e ácido glutâmico; aminoácidos carregados positivamente incluem lisina e arginina; e aminoácidos com grupos de cabeça polar sem carga tendo valores de hidrofilicidade semelhantes incluem leucina, isoleucina, valina, glicina, alanina, asparagina, glutamina, serina, treonina, fenilalanina e tirosina.

[0443] Substituições conservativas podem ser feitas, por exemplo, de acordo com a Tabela abaixo. Os aminoácidos no mesmo bloco na segunda coluna e de preferência na mesma linha na terceira coluna podem ser substituídos uns pelos outros: ALIFÁTICO Apolar GAP

ILV Polar – sem

C S T M carga

N Q

Polar – com

D E carga

K R AROMÁTICO H F W Y

[0444] A presente invenção também abrange substituição homóloga (substituição e realocação são ambas usadas aqui para significar a troca de um resíduo de aminoácido existente, com um resíduo alternativo) que pode ocorrer, ou seja, substituição semelhante por semelhante, como básico por básico, ácido por ácido, polar para polar etc. A substituição não homóloga também pode ocorrer, isto é, de uma classe de resíduo para outra ou, alternativamente, envolvendo a inclusão de aminoácidos não naturais, como ornitina (doravante referida como Z), ácido diaminobutírico ornitina (doravante referida como B), norleucina ornitina (doravante referida como O), piriilalanina, tienilalanina, naftilalanina e fenilglicina.

[0445] As substituições também podem ser feitas por aminoácidos não naturais incluem; aminoácidos alfa* e alfa- dissubstituídos*, aminoácidos N-alquil*, ácido láctico*, derivados halogenados de aminoácidos naturais, tais como trifluortirosina*, p-Cl-fenilalanina*, p-Br-fenilalanina*, pI- fenilalanina*, L-alil-glicina*, ß-alanina*, ácido L-α-amino butírico*, ácido L-α -amino butírico*, ácido L- α -amino isobutírico*, ácido L- ε-amino capróico#, ácido 7-amino heptanóico*, L-metionina sulfona#*, L-norleucina*, L-norvalina*, p-nitro-L-fenilalanina*, L-hidroxiprolina#, L-tioprolina*,

derivados metil de fenilalanina (Phe), tais como 4-metil-Phe*, pentametil-Phe*, L-Phe (4-amino)#, L-Tyr(metil)*, L-Phe (4- isopropil)*, L-Tic (Ácido 1,2,3,4 tetrahidroisoquinolina-3- carboxílico)*, ácido L-diaminopropiônico# e L-Phe (4-benzil)*. A notação * foi utilizada para o propósito da discussão acima (relativa à substituição homóloga ou não homóloga), para indicar a natureza hidrofóbica do derivado, enquanto # foi utilizado para indicar a natureza hidrofílica do derivado, #* indicam características anfipáticas.

[0446] As sequências de aminoácidos variantes podem incluir grupos espaçadores adequados que podem ser inseridos entre quaisquer dois resíduos de aminoácidos da sequência, incluindo grupos alquil, tais como grupos metil, etil ou propil, além de espaçadores de aminoácidos, tais como resíduos de glicina ou β- alanina. Uma forma adicional de variação envolve a presença de um ou mais resíduos de aminoácidos na forma peptoide, que será bem compreendida pelos especialistas na arte. Para que não restem dúvidas, “a forma peptoide” é utilizado para se referir a variante de resíduos de aminoácidos em que o grupo substituinte α-carbono está no átomo de nitrogênio do resíduo em vez do α- carbono. Os processos para a preparação de peptídeos na forma peptoide são conhecidos na arte, por exemplo Simon RJ et al., PNAS (1992) 89 (20), 9367-9371 e Horwell DC, Trends Biotechnol. (1995) 13 (4), 132-134.

[0447] As sequências de nucleotídeos para uso na presente invenção podem incluir dentro delas nucleotídeos sintéticos ou modificados. Vários tipos diferentes de modificação de oligonucleotídeos são conhecidos na arte. Estes incluem estruturas de metilfosfonato e fosforotioato e/ou a adição de cadeias de acridina ou polilisina nas extremidades 3 'e/ou 5' da molécula. Para os fins da presente invenção, deve ser entendido que as sequências de nucleotídeos descritas aqui podem ser modificadas por qualquer método disponível na arte. Tais modificações podem ser realizadas a fim de aumentar a atividade in vivo ou a duração de vida das sequências de nucleotídeos da presente invenção.

[0448] A presente invenção também abrange sequências que são complementares às sequências de ácido nucleico da presente invenção ou sequências que são capazes de hibridizar com as sequências da presente invenção ou com sequências que são complementares às mesmas. O termo "hibridização", tal como utilizado aqui, deve incluir "o processo pelo qual uma fita de ácido nucleico se junta a uma fita complementar por meio do emparelhamento de bases", bem como o processo de amplificação conforme realizado em tecnologias de reação em cadeia da polimerase (PCR).

[0449] A presente invenção também se refere a sequências de nucleotídeos que podem hibridizar com as sequências de nucleotídeos da presente invenção (incluindo sequências complementares daquelas apresentadas aqui). Preferivelmente, a hibridização é determinada de acordo com rigor das condições (por exemplo 50 °C e 0,2xSSC {1xSSC = NaCl a 0,15 M, 0,015 M de Na3citrato de pH 7,0}). Mais preferivelmente, a hibridização é determinada de acordo com elevado rigor das condições (por exemplo 65 °C e 0,1xSSC {1xSSC = NaCl a 0,15 M, 0,015 M de Na3citrato de pH 7,0}).

[0450] Uma revisão das técnicas gerais usadas para transformar plantas pode ser encontrada em artigos de Potrykus

(Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol [1991] 42: 205-225) e Christou (Agro-Food-Industry Hi-Tech Março/Abril de 1994 17-27), que são incorporado aquis por referência. Outros ensinamentos sobre a transformação de plantas podem ser encontrados em EP-A- 0449375, incorporado aqui por referência.

[0451] A menos que definido de outra forma, todos os termos técnicos e científicos usados neste documento têm o mesmo significado como comumente entendido por alguém habilitado na arte à qual esta divulgação pertence. Singleton, et al., DICTIONARY OF MICROBIOLOGY AND MOLECULAR BIOLOGY, 20 ED., John Wiley and Sons, New York (1994), e Hale & Marham, THE HARPER COLLINS DICTIONARY OF BIOLOGY, Harper Perennial, NY (1991) fornecem uma das habilidades com um dicionário geral de muitos dos termos usados nesta divulgação.

[0452] Esta divulgação não é limitada pelos métodos e materiais exemplares divulgados neste documento, e quaisquer métodos e materiais semelhantes ou equivalentes aos descritos neste documento podem ser usados na prática ou testagem de concretizações desta divulgação. Os intervalos numéricos incluem os números que definem o intervalo. Salvo indicação em contrário, quaisquer sequências de ácido nucleico são escritas da esquerda para a direita na orientação 5 'para 3'; as sequências de aminoácidos são escritas da esquerda para a direita na orientação amino para carboxi, respectivamente.

[0453] Os títulos fornecidos neste documento não são limitações dos vários aspectos ou concretizações desta divulgação que podem ser tidos por referência ao relatório descritivo como um todo. Consequentemente, os termos definidos imediatamente abaixo são definidos de forma mais completa por referência ao relatório descritivo como um todo.

[0454] Os aminoácidos são aqui referidos usando o nome do aminoácido, a abreviatura de três letras ou a abreviatura de uma única letra. O termo "proteína", tal como utilizado aqui, inclui proteínas, polipeptídeos e peptídeos. Tal como utilizado aqui, o termo "sequência de aminoácidos" é sinônimo do termo "polipeptídeo" e/ou do termo "proteína". Em alguns casos, o termo "sequência de aminoácidos" é sinônimo do termo "peptídeo". Em alguns casos, o termo "sequência de aminoácidos" é sinônimo do termo "enzima".

[0455] Na presente divulgação e reivindicações, os códigos convencionais de uma e três letras para resíduos de aminoácidos podem ser usados. O código de três letras para aminoácidos, conforme definido em conformidade com a IUPACIUB Joint Commission on Biochemical Nomenclature (JCBN). É também entendido que um polipeptídeo pode ser codificado por mais de uma sequência de nucleotídeos devido à degenerescência do código genético.

[0456] Outras definições de termos podem aparecer ao longo da especificação. Antes que as concretizações exemplares sejam descritas em mais detalhes, deve-se entender que esta divulgação não se limita a concretizações particulares descritas, pois podem, é claro, variar. Também deve ser entendido que a terminologia usada neste documento tem a finalidade de descrever concretizações particulares apenas e não se destina a ser limitante, uma vez que o escopo da presente divulgação será limitado apenas pelas reivindicações anexas.

[0457] Onde um intervalo de valores é fornecido, entende-se que cada valor intermediário, até o décimo da unidade do limite inferior, a menos que o contexto dite claramente o contrário, entre os limites superior e inferior desse intervalo também é especificamente divulgado. Cada intervalo menor entre qualquer valor declarado ou valor intermediário em um intervalo declarado e qualquer outro valor declarado ou intermediário nesse intervalo declarado é englobado nesta divulgação. Os limites superior e inferior desses intervalos menores podem ser incluídos ou excluídos independentemente na faixa, e cada faixa em que nenhum ou ambos os limites estão incluídos nas faixas menores também é englobado nesta divulgação, sujeito a qualquer limite especificamente excluído no intervalo declarado. Quando a faixa declarada inclui um ou ambos os limites, intervalos excluindo um ou ambos os limites incluídos também estão incluídos nesta divulgação.

[0458] Deve-se notar que, como usado aqui e nas reivindicações anexas, as formas singulares "um", "uma" e "o/a" incluem referentes plurais, a menos que o contexto dite claramente o contrário. Assim, por exemplo, a referência a "uma enzima" ou "uma nitrato redutase" inclui uma pluralidade de tais agentes candidatos e seus equivalentes conhecidos pelos habilitados na arte e assim por diante.

VANTAGENS

[0459] Foi surpreendentemente descoberto que ao modular a expressão de pelo menos uma proteína de repetição Armadillo como ensinado neste documento que atua como um regulador positivo da nicotina no tabaco, o teor de alcaloides (por exemplo, teor de nicotina e/ou nornicotina e/ou PON) e/ou o teor de TSNA das plantas pode ser modulado (por exemplo, diminuído). Dessa forma, produtos de tabaco com teor de alcaloides modulado (por exemplo, teor de nicotina e/ou nornicotina e/ou PON) e/ou teor de TSNA e características comercialmente desejáveis buscadas pelos consumidores de produtos de tabaco podem ser produzidos.

[0460] Os presentes inventores surpreendentemente determinaram um método de modulação (por exemplo, diminuição) do teor de alcaloides (por exemplo, teor de nicotina e/ou nornicotina e/ou PON), e/ou teor de TSNA de uma planta (por exemplo, planta de tabaco) por modulação (por exemplo, diminuição) da expressão de uma proteína de repetição Armadillo. Teor de alcaloides (por exemplo, teor de nicotina) ou teor de TSNA de uma planta (por exemplo, planta de tabaco) pode ser diminuído pela diminuição ou inibição da expressão do gene que codifica uma proteína de repetição Armadillo. Teor de alcaloides (por exemplo, teor de nicotina) ou teor de TSNA de uma planta (por exemplo, planta de tabaco) pode ser aumentado pelo aumento da expressão do gene que codifica uma proteína de repetição Armadillo. Antes da presente invenção, não era conhecido que a modulação da expressão de uma proteína de repetição Armadillo como descrita aqui poderia ser usada para modular o teor de alcaloides (por exemplo, teor de nicotina e/ou nornicotina e/ou PON) e/ou teor de TSNA de uma planta (por exemplo, uma planta de tabaco).

[0461] Os presentes inventores determinaram que a inibição da expressão de um gene que codifica uma proteína de repetição Armadillo pode reduzir o teor de alcaloides (por exemplo, teor de nicotina) da planta modificada para um nível surpreendentemente baixo.

[0462] As publicações discutidas aqui são fornecidas apenas para sua divulgação antes da data de depósito do presente pedido. Nada neste documento deve ser interpretado como uma admissão de que tais publicações constituem a arte anterior às reivindicações anexas.

EXEMPLOS Exemplo 1 - A superexpressão transitória de uma proteína de repetição Armadillo aumenta o teor de alcaloides nas folhas Métodos e Materiais Clonagem

1. Vetor de expressão da proteína de repetição Armadillo

[0463] A sequência do gene (SEQ ID No. 3) foi amplificada a partir de uma biblioteca de cDNA compatível com Gateway™ usando iniciadores localizados fora dos sítios de restrição que flanqueiam a sequência do gene. A sequência do gene foi então transferida para um vetor de expressão.

[0464] O plasmídeo resultante foi sequenciado e transformado em Agrobacterium tumefaciens GV3101pMP90 por choque térmico e expresso de forma transiente em folhas TN90.

Expressão transiente de genes

[0465] As linhagens de Agrobacterium tumefaciens GV3101 portadoras da construção de interesse foram cultivadas durante a noite em meio Luria-Bertani (LB) suplementado com antibióticos apropriados. As culturas são centrifugadas e ressuspensas em tampão contendo MgCl2 10 mM, MES 10 mM pH 5,6 e acetosiringona 100 µM até OD600 = 0,6 e incubadas durante uma hora à temperatura ambiente. A infiltração é realizada com uma seringa sem agulha nas folhas de TN90. As amostras são colhidas 5 dias após a infiltração.

[0466] Os testes foram realizados em três repetições biológicas.

Medição de alcaloides

[0467] O teor relativo de alcaloides piridínicos foi determinado por cromatografia líquida de alta eficiência de fase reversa com espectrometria de massa em tandem (LC-MS/MS). A separação cromatográfica é obtida usando uma coluna Gemini-NX (100 mm × 3,0 mm, tamanho de partícula 3 μm, Phenomenex) e separação cromatográfica de gradiente usando tampão de acetato de amônio 6,5 mM (aq) (pH10) e metanol.

[0468] O espectrômetro de massa opera em modo positivo de eletrospray (ESI) usando aquisição de dados MRM programada. Duas transições MRM são monitoradas para cada analito e uma para o padrão interno marcado com isótopo.

Analito Íon Precursor Íon Filho(quant/confirm) Nicotina 163,1 130/106 Nicotinad4 167,1 134,1 Anabasina 163,1 80/120 Anatabina 161,1 144/80 Nornicotina 149,1 80/130 Nornicotina d4 153,1 84,1 PON 176.1 106,0/148 PON d4 183,1 110,0

Análise Estatística

[0463] As significâncias estatísticas baseadas em análises ANOVA unidirecional são realizadas com o software Prism 5.01 (GraphPad Software).

Resultados

[0464] O teor de alcaloides de folhas de TN90 com 5 semanas de idade que expressam a construção Nitab4.5_0002810g0020.2 é mostrado na Figura 1. O teor de nicotina, nornicotina e PON é representado em relação ao controle e compreende três réplicas biológicas analisadas por ANOVA unidirecional e pós-teste de comparação múltipla de Tukey. Os valores são apresentados como médias ± SEM. Os asteriscos indicam signiﬁcância estatística do P-valor ≤ 0,001.

[0465] A superexpressão de Nitab4.5_0002810g0020.2 leva a um aumento significativo no teor de nicotina, nornicotina e PON nas folhas.

Conclusões

[0466] Nitab4.5_0002810g0020.2 é um regulador positivo do teor de alcaloides, em particular nicotina, nornicotina e PON nas folhas e é um regulador dos alcaloides piridínicos no tabaco.

Exemplo 2 - Silenciamento de genes induzido por vírus (VIGS) de uma proteína de repetição Armadillo diminui o teor de alcaloides nas folhas Silenciamento de gene induzido por vírus (VIGS)

[0467] Para o silenciamento de genes induzido por vírus, um fragmento de cDNA de 300 nucleotídeos foi sintetizado e clonado com o kit de clonagem In-Fusion em pTV00 (entre os sítios EcoRI e XhoI) usando os seguintes iniciadores Nitab4.5_0002810g0020.2_InFusion 5’ 'TGAGTAAGGTTACCGAATTC (SEQ ID No. 4); e Nitab4.5_0002810g0020.2_InFusion 3' CTCGAGGCCCGGGCATGTCC (SEQ ID No. 5) para formar TRV2- Nitab4.5_0002810g0020.2. O plasmídeo foi então transformado em A. tumefaciens GV3101.

[0468] O vetor TRV compreendendo (TRV RNA1) e (TRV RNA2) compreendendo a sequência de nucleotídeos alvo foram propagados separadamente em A. tumefaciens. Estas culturas foram misturadas (1: 1) e infiltração com seringa em plantas TN90 com 2 semanas de idade. O efeito de silenciamento foi avaliado cinco semanas após a infecção do vírus, avaliando o nível de expressão do gene alvo.

Silenciamento

[0469] Os ensaios VIGS foram realizados conforme descrito anteriormente (Ratcliff et al., 2001) Ratcliff, F., et al., (2001), The Plant Journal, 25: 237-245 (incorporado aqui por referência). Resumidamente, culturas independentes de A. tumefaciens GV3101 contendo os plasmídeos TRV2 e TRV1 foram propagadas durante a noite em meio LB suplementado com antibióticos apropriados. As culturas foram ressuspensas em tampão VIGS (ácido morfolinometanossulfônico 10 mM pH 5,6, MgCl2 10 mM e acetociringona 100 µM) ajustando a densidade óptica para OD600 = 1 e incubadas durante a noite à temperatura ambiente no escuro. Estas culturas foram misturadas (1:1) e infiltradas com seringa em plantas TN90 com 2 semanas de idade. O efeito de silenciamento foi avaliado duas semanas após a infecção do vírus, avaliando o nível de expressão do gene alvo. TRV-Luciferase foi usado como controle negativo e TRV-PDS (teor reduzido de clorofila das folhas silenciadas) foi usado como controle fenotípico de silenciamento.

Resultados

[0470] O teor de nicotina, nornicotina e PON de folhas de TN90 com 5 semanas de idade expressando construções que silenciam Nitab4.5_0002810g0020.2 são mostrados na Figura 2. O teor é representado em relação ao controle e compreende três réplicas biológicas analisadas pelo teste t. Os valores são apresentados como médias ± SEM. Os asteriscos indicam signiﬁcância estatística do P-valor ≤ 0,001.

[0471] O silenciamento do Nitab4.5_0002810g0020.2 leva a uma redução do teor de nicotina, nornicotina e PON nas folhas.

Conclusões

[0472] Nitab4.5_0002810g0020.2 é um regulador positivo do teor de alcaloides, em particular nicotina, nornicotina e PON nas folhas e é um regulador dos alcaloides piridínicos no tabaco.

Exemplo 3 - A regulação mediada por Nitab4.5_0002810g0020.2 do teor de alcaloides requer o domínio Arm

[0473] A fim de determinar se o domínio Arm é necessário para a regulação do teor de alcaloides, uma construção foi feita em que o domínio Arm de Nitab4.5_0002810g0020.2 foi excluído (Delta- Arm).

[0474] O método para expressar esta construção é conforme descrito no Exemplo 1.

Resultados

[0475] Teor de alcaloides de folhas TN90 com 5 semanas de idade que expressam Nitab4.5_0002810g0020.2 e

Nitab4.5_0002810g0020.2 Delta-Arm são mostrados na Figura 3. O teor alcaloides é representado em relação ao controle e compreende três réplicas biológicas analisadas por ANOVA unidirecional e pós-teste de comparação múltipla de Tukey. Os valores são apresentados como médias ± SEM. Os asteriscos indicam signiﬁcância estatística de P-valor ≤ 0,001.

[0476] As folhas que expressam a construção Nitab4.5_0002810g0020.2-DeltaArm contêm menos nicotina, nornicotina e PON em comparação com as folhas que expressam a construção Nitab4.5_0002810g0020.2.

Conclusão

[0477] A regulação mediada por Nitab4.5_0002810g0020.2 do teor de alcaloides requer o domínio Arm.

Exemplo 4 - A superexpressão transiente de antissenso de Nitab4.5_0002810g0020.2 leva a uma redução significativa da nicotina, nornicotina e PON

[0478] Teor de alcaloides de folhas TN90 com 5 semanas de idade que expressam Nitab4.5_0002810g0020.2 e um antissenso direcionado contra Nitab4.5_0002810g0020.2 são mostrados na Figura 4. O teor de alcaloides é representado em relação ao controe e compreende três réplicas biológicas analisadas por ANOVA unidirecional e pós-teste de comparações múltiplas de Tukey. Os valores são apresentados como médias ± SEM. Os asteriscos indicam signiﬁcância estatística de P-valor ≤ 0,001.

[0479] As folhas que compreendem o antissenso de Nitab4.5_0002810g0020.2 contêm menos nicotina, nornicotina e PON em comparação com as folhas que expressam a construção Nitab4.5_0002810g0020.2.

Conclusão

[0480] A superexpressão transitória de antissenso Nitab4.5_0002810g0020.2 leva a uma redução significativa da nicotina, nornicotina e PON.

Exemplo 5 - Expressão transiente de miRNA artificial direcionado a Nitab4.5_0002810g0020.2 leva a uma redução significativa na nicotina, nornicotina e PON

[0481] O teor alcaloides de folhas de TN90 com 5 semanas que expressam Nitab4.5_0002810g0020.2 e um miRNA artificial direcionado a Nitab4.5_0002810g0020.2 (SEQ ID No. 6) são mostrados na Figura 5. O teor alcaloides é representado em relação ao controle e compreende três repetições biológicas analisadas por ANOVA unidirecional e pós-teste de comparação múltipla de Tukey. Os valores são apresentados como médias ± SEM. Os asteriscos indicam signiﬁcância estatística de P-valor ≤ 0,001.

Conclusão

[0482] A expressão transiente de miRNA artificial direcionado a Nitab4.5_0002810g0020.2 leva a uma redução significativa da nicotina, nornicotina e PON.

Exemplo 6 - Linhagens selecionadas T1 estáveis que superexpressam Nitab4.5_0002810g0020.2 aumentaram o teor de alcaloides

[0483] O teor de nicotina, nornicotina e PON de plantas TN90 cultivadas em estufa no estágio de 12 folhas superexpressando Nitab4.5_0002810g0020.2 são mostrados na Figura 6.

[0484] Cada ponto representa a média de 24 medições amostradas da folha inferior até folha superior.

[0485] A Figura 6 mostra que as linhagens T1 estáveis que superexpressam a proteína de repetição Armadillo aumentaram o teor de alcaloides, em particular o aumento do teor de nicotina, nornicotina e PON.

Exemplo 7 - Plantas adultas silenciadas para Nitab4.5_0002810g0020.2 diminuíram o teor de alcaloides

[0486] O teor de alcaloides de plantas TN90 cultivadas em estufa silenciadas para Nitab4.5_0002810g0020.2 é mostrado na Figura 7.

[0487] O teor alcaloide é representado em relação ao controle e compreende três medições de 20 plantas/genótipo analisadas por ANOVA unidirecional e pós-teste de comparação múltipla de Tukey. Os valores são apresentados como médias ± SEM. Os asteriscos indicam signiﬁcância estatística do P-valor ≤ 0,001.

[0488] A Figura 7 mostra que as plantas adultas que são silenciadas para a proteína de repetição Armadillo diminuíram o teor de alcaloides, em particular, os teores de nicotina, nornicotina e PON diminuíram.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Método de modulação (por exemplo, diminuição) do teor de alcaloides de uma planta ou parte da mesma, ou uma cultura de células, o método caracterizado pelo fato de que compreende a modificação da referida planta ou cultura de células: modulando (por exemplo, diminuindo) a expressão de pelo menos uma proteína de repetição Armadillo que: a) compreende uma sequência de aminoácidos conforme estabelecido em: SEQ ID No. 1 ou uma variante funcional ou fragmento funcional ou ortólogo da mesma, ou uma sequência que tem pelo menos 80% de identidade com SEQ ID No. 1; ou b) é codificada por uma sequência de nucleotídeos conforme estabelecida em SEQ ID No. 2 ou 3; ou uma variante funcional ou fragmento funcional ou ortólogo de SEQ ID No. 2 ou 3; ou uma sequência de ácido nucleico que tem pelo menos 80% de identidade com a SEQ ID No. 2 ou 3.

2. Método de modulação (por exemplo, diminuição) do teor de uma nitrosamina tabaco específica (TSNA) ou um precursor de uma TSNA em uma planta de tabaco ou parte da mesma planta, o método caracterizado pelo fato de que compreende a modificação da referida planta ou cultura de células: pela modulação (por exemplo, diminuição) da expressão de pelo menos uma proteína de repetição Armadillo que: a) compreende uma sequência de aminoácidos conforme estabelecido em: SEQ ID No. 1 ou uma variante funcional ou fragmento funcional ou ortólogo da mesma, ou uma sequência que tem pelo menos 80% de identidade com SEQ ID No. 1; ou b) é codificada por uma sequência de nucleotídeos conforme estabelecida em SEQ ID No. 2 ou 3; ou uma variante funcional ou fragmento funcional ou ortólogo de SEQ ID No. 2 ou 3; ou uma sequência de ácido nucleico que tem pelo menos 80% de identidade com a SEQ ID No. 2 ou 3.

3. Uso de pelo menos um gene que codifica uma proteína de repetição Armadillo para modular o teor de alcaloides de uma célula ou planta ou parte da mesma ou uma cultura de células; caracterizado pelo fato de que a proteína de repetição Armadillo: a) compreende uma sequência de aminoácidos conforme estabelecido em: SEQ ID No. 1 ou uma variante funcional ou fragmento funcional ou ortólogo da mesma, ou uma sequência que tem pelo menos 80% de identidade com SEQ ID No. 1; ou b) é codificada por uma sequência de nucleotídeos conforme estabelecida em SEQ ID No. 2 ou 3; ou uma variante funcional ou fragmento funcional ou ortólogo de SEQ ID No. 2 ou 3; ou uma sequência de ácido nucleico que tem pelo menos 80% de identidade com a SEQ ID No. 2 ou 3.

4. Método para produzir uma planta ou parte da mesma, uma cultura de células, um material de propagação de plantas, uma folha, uma folha colhida cortada, uma folha processada ou uma folha cortada e processada, contendo (por exemplo, diminuído) o teor de alcaloides modulado, o método caracterizado por compreender a modificação da referida planta ou cultura de células para: modular (por exemplo, diminuir) a expressão de pelo menos uma proteína de repetição Armadillo que: a) compreende uma sequência de aminoácidos conforme estabelecido em: SEQ ID No. 1 ou uma variante funcional ou fragmento funcional ou ortólogo da mesma, ou uma sequência que tem pelo menos 80% de identidade com SEQ ID No. 1; ou b) é codificada por uma sequência de nucleotídeos conforme estabelecida em SEQ ID No. 2 ou 3; ou uma variante funcional ou fragmento funcional ou ortólogo de SEQ ID No. 2 ou 3; ou uma sequência de ácido nucleico que tem pelo menos 80% de identidade com a SEQ ID No. 2 ou 3.

5. Método ou uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 4, caracterizado pelo fato de que a modificação na sequência de ácido nucleico de pelo menos um gene que codifica uma proteína de repetição Armadillo está em um domínio de repetição Armadillo.

6. Método ou uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que o teor de alcaloides é modulado (por exemplo, diminuído) em comparação com uma planta ou cultura de células que não foi modificada para: modular a expressão de pelo menos uma proteína de repetição Armadillo; ou para modificar a sequência de ácido nucleico de pelo menos um gene que codifica a proteína de repetição Armadillo.

7. Planta ou parte da mesma ou uma cultura de células que foi modificada para atingir uma modulação (por exemplo, diminuição) no teor de alcaloides em comparação com uma planta não modificada ou cultura de células não modificada, caracterizada pelo fato de que a modificação é a modulação da expressão de pelo menos uma proteína de repetição Armadillo que: a) compreende uma sequência de aminoácidos conforme estabelecido em: SEQ ID No. 1 ou uma variante funcional ou fragmento funcional ou ortólogo da mesma, ou uma sequência que tem pelo menos 80% de identidade com SEQ ID No. 1; ou b) é codificada por uma sequência de nucleotídeos conforme estabelecida em SEQ ID No. 2 ou 3; ou uma variante funcional ou fragmento funcional ou ortólogo de SEQ ID No. 2 ou 3; ou uma sequência de ácido nucleico que tem pelo menos 80% de identidade com a SEQ ID No. 2 ou 3.

8. Material de propagação de plantas caracterizado por ser obtenível (por exemplo, obtido) de uma planta conforme definida na reivindicação 7 ou de uma planta ou cultura de células produzida pelo método conforme definido em qualquer uma das reivindicações de 1 a 6.

9. Método ou uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 6, ou planta ou parte da mesma ou cultura de células, de acordo com a reivindicação 7, ou material de propagação de planta, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que o teor de alcaloides da planta é diminuído em comparação com uma planta ou cultura de células que não foi modificada para modular (por exemplo, diminuir) a expressão de pelo menos uma proteína de repetição Armadillo, ou para modificar a sequência de ácido nucleico de pelo menos um gene que codifica a referida proteína de repetição Armadillo.

10. Método ou uso de acordo com a reivindicação 9, planta ou parte da mesma ou cultura de células de acordo com a reivindicação 7, ou material de propagação de planta de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que a expressão da referida pelo menos uma proteína de repetição Armadillo é diminuída em comparação com uma planta ou cultura de células que não foi modificada para modular a expressão de pelo menos um gene que codifica uma proteína de repetição Armadillo, ou para modificar a sequência de ácido nucleico de pelo menos um gene que codifica a referida proteína de repetição Armadillo.

11. Método ou uso de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 6 ou de 9 a 10, uma planta ou parte da mesma ou cultura de células de acordo com a reivindicação 7 ou de 9 a 10, ou um material de propagação de planta de acordo com as reivindicações de 8 a 10, caracterizado pelo fato de que o teor total de alcaloides da planta ou cultura celular é modulado (por exemplo, diminuído).

12. Método ou uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 6 ou de 9 a 11, planta ou parte da mesma ou cultura de células de acordo com a reivindicação 7 ou de 9 a 11, ou material de propagação de planta de acordo com as reivindicações de 8 a 11, caracterizado pelo fato de que o teor de um ou mais alcaloides selecionados de nicotina, nornicotina, PON, anabasina, miosmina e anatabina é modulado (por exemplo, diminuído), de preferência o teor de nicotina, nornicotina e/ou PON é modulado (por exemplo, diminuído).

13. Método ou uso de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 6 ou de 9 a 12, uma planta ou parte da mesma ou cultura de células de acordo com a reivindicação 7 ou de 9 a 12, ou um material de propagação de planta de acordo com as reivindicações de 8 a 12, caracterizado pelo fato de que a planta ou célula vegetal é do gênero Nicotiana.

14. Método ou uso de acordo com a reivindicação 13, planta ou parte da mesma ou cultura de células de acordo com a reivindicação 13, ou material de propagação de planta de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que a planta é uma planta de tabaco e o teor de nicotina é modulado.

15. Método ou uso de acordo com a reivindicação 14, uma planta de tabaco ou parte da mesma ou cultura de células de tabaco de acordo com a reivindicação 14, ou um material de propagação de planta de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que o teor de nicotina é reduzido.

16. Uso de uma planta ou parte da mesma ou de cultura de células de acordo com qualquer uma das reivindicações 7 ou de 9 a 15, ou de uma planta produzida pelo método de qualquer uma das reivindicações de 1 a 6, ou de 9 a 15 caracterizado pelo fato de que é para produzir uma planta.

17. Uso de uma planta ou parte da mesma ou de uma cultura de células de acordo com qualquer uma das reivindicações 7 ou de 9 a 15, ou de uma planta produzida pelo método de qualquer uma das reivindicações de 1 a 6, ou de 9 a 15 para gerar um produto.

18. Uso de uma planta ou parte da mesma de acordo com qualquer uma das reivindicações 7 ou de 9 a 15, ou de uma planta produzida pelo método de qualquer uma das reivindicações de 1 a 6 ou de 9 a 15 caracterizado pelo fato de que é para cultivar uma cultura.

19. Uso de uma planta ou parte da mesma de acordo com qualquer uma das reivindicações 7 ou de 9 a 15, ou de uma planta produzida pelo método de qualquer uma das reivindicações de 1 a 6, ou de 9 a 15 caracterizado pelo fato de que é para produzir uma folha.

20. Folha caracterizado pelo fato de que é de colheita de uma planta conforme definida em qualquer uma das reivindicações 7 ou de 9 a 15, ou pode ser obtenível (por exemplo, obtida) a partir de uma planta propagada a partir de um material de propagação conforme definido em qualquer uma das reivindicações de 8 a 15, ou pode ser obtenível (por exemplo, obtida) a partir de uma planta obtida por um uso conforme definido em qualquer uma das reivindicações 3 ou de 5 a 7 ou de 9 a 19, ou obtenível (por exemplo, obtida) a partir de uma planta produzida pelo método conforme definido em qualquer uma das reivindicações de 1 a 6 ou de 9 a 15.

21. Folha colhida de uma planta de acordo com a reivindicação 20, caracterizada pelo fato de que a folha colhida de uma planta é uma folha colhida cortada.

22. Folha processada, de preferência uma folha de tabaco processada, de preferência uma folha de tabaco processada não viável caracterizado pelo fato de que é: obtenível (por exemplo, obtida) a partir de uma planta obtenível (por exemplo, obtida) a partir de um uso conforme definido em qualquer uma das reivindicações 3 ou de 5 a 6 ou de 9 a 19; obtenível (por exemplo, obtida) por processamento de uma planta conforme definido em qualquer uma das reivindicações 7 ou de 9 a 15; obtenível (por exemplo, obtida) de uma planta propagada a partir de um material de propagação de planta conforme definido em qualquer uma das reivindicações de 8 a 15; ou obtenível (por exemplo, obtida) por processamento de uma folha colhida de uma planta conforme definida em qualquer uma das reivindicações 20 ou 21; ou obtenível (por exemplo, obtido) de uma planta produzida pelo método conforme definido em qualquer uma das reivindicações de 1 a 6 ou de 9 a 15.

23. Folha processada de acordo com a reivindicação 22, caracterizada pelo fato de que a folha é processada por cura, fermentação, pasteurização ou uma combinação das mesmas.

24. Folha processada de acordo com a reivindicação 22 ou 23, caracterizada pelo fato de que a folha processada é uma folha processada cortada.

25. Material de tabaco curado caracterizado pelo fato de que é feito de uma planta ou parte da mesma, conforme definida com a reivindicação 14 ou 15, ou um extrato da mesma.

26. Mistura de tabaco, caracterizada pelo fato de que compreende o referido material de tabaco curado conforme definido na reivindicação 25.

27. Produto da indústria do tabaco caracterizado por ser preparado a partir de: uma planta de tabaco conforme definida em qualquer uma das reivindicações de 14 a 15, ou uma parte da mesma ou uma cultura de células de tabaco conforme definida em qualquer uma das reivindicações de 14 a 15; uma planta de tabaco ou parte da mesma propagada a partir de um material de propagação de planta de tabaco conforme definida em qualquer uma das reivindicações de 8 a 15; uma folha colhida de uma planta conforme definido em qualquer uma das reivindicações de 14 a 15;

uma folha colhida conforme definida na reivindicação 20 ou 21; folha processada conforme definida em qualquer uma das reivindicações de 22 a 24, em que a planta é tabaco; ou planta produzida pelo método conforme definido em qualquer uma das reivindicações 14 ou 15.

28. Produto da indústria do tabaco, de acordo com a reivindicação 27, caracterizado pelo fato de que o produto do tabaco é: a) um artigo de fumo combustível; b) um produto de tabaco sem fumaça; ou c) um sistema de provisão de aerossol não combustível, como um dispositivo de aquecimento de tabaco ou um dispositivo gerador de aerossol.

29. Artigo de fumo combustível, sistema de provisão de aerossol não combustível, produto de tabaco sem fumaça ou dispositivo de aquecimento de tabaco, caracterizado pelo fato de que compreende uma planta ou uma parte da mesma conforme definida em qualquer uma das reivindicações 7 ou de 9 a 15, ou um extrato (por exemplo, um extrato de tabaco) ou uma cultura de células de tabaco conforme definido em qualquer uma das reivindicações 7 ou de 9 a 15; ou um material de tabaco curado conforme definido na reivindicação 25; ou uma mistura de tabaco conforme definida na reivindicação 26.

30. Uso de uma sequência de nucleotídeos que codifica uma proteína de repetição Armadillo caracterizado pelo fato de que: a) compreende uma sequência de aminoácidos conforme estabelecido em: SEQ ID No. 1 ou uma variante funcional ou fragmento funcional ou ortólogo da mesma, ou uma sequência que tem pelo menos 80% de identidade com SEQ ID No. 1; ou b) é codificada por uma sequência de nucleotídeos conforme estabelecida em SEQ ID No. 2 ou 3; ou uma variante funcional ou fragmento funcional ou ortólogo de SEQ ID No. 2 ou 3; ou uma sequência de ácido nucleico que tem pelo menos 80% de identidade com a SEQ ID No. 2 ou 3, para selecionar uma planta com teor de alcaloide modulado (por exemplo, reduzido) e/ou teor modulado (por exemplo, reduzido) de nitrosamina tabaco específica (TSNA) ou um precursor de uma TSNA.

31. Mutante de uma planta que carrega uma mutação hereditária em uma sequência de nucleotídeos, caracterizado pelo fato de que: a) compreende uma sequência de aminoácidos conforme estabelecida em: SEQ ID No. 1 ou uma variante funcional ou fragmento funcional ou ortólogo da mesma, ou uma sequência que tem pelo menos 80% de identidade com SEQ ID No. 1; ou b) é codificado por uma sequência de nucleotídeos conforme estabelecida em SEQ ID No. 2 ou 3; ou uma variante funcional ou fragmento funcional ou ortólogo de SEQ ID No. 2 ou 3; ou uma sequência de ácido nucleico que tem pelo menos 80% de identidade com a SEQ ID No. 2 ou 3, em que a referida mutação hereditária modula (por exemplo, diminui) a expressão da proteína de repetição Armadillo e em que a planta mutante tem o teor de alcaloides modulado (por exemplo, diminuído) e/ou o teor de uma nitrosamina tabaco específica (TSNA) modulado ou um precursor de uma TSNA em relação a uma planta comparável que não carrega a referida mutação hereditária.

32. Progênie ou semente de uma planta mutante caracterizado pelo fato de que carrega a mutação hereditária conforme definida na reivindicação 31.

33. Folha colhida, uma folha processada ou material de tabaco curado produzido a partir de uma planta caracterizada pelo fato de que compreende uma modificação em uma sequência de nucleotídeos que: a) compreende uma sequência de aminoácidos conforme estabelecido em: SEQ ID No. 1 ou uma variante funcional ou fragmento funcional ou ortólogo da mesma, ou uma sequência que tem pelo menos 80% de identidade com SEQ ID No. 1; ou b) é codificada por uma sequência de nucleotídeos conforme estabelecida em SEQ ID No. 2 ou 3; ou uma variante funcional ou fragmento funcional ou ortólogo de SEQ ID No. 2 ou 3; ou uma sequência de ácido nucleico que tem pelo menos 80% de identidade com a SEQ ID No. 2 ou 3; em que a referida modificação modula (por exemplo, diminui) a expressão de pelo menos um gene que codifica uma proteína de repetição Armadillo e em que a referida planta tem o teor de alcaloides modulado (por exemplo, diminuído) e/ou o teor de uma nitrosamina tabaco específica (TSNA) modulado ou um precursor de uma TSNA relativo a uma planta comparável que não carrega a referida modificação em pelo menos um gene que codifica uma proteína de repetição Armadillo.