EA004652B1 - ХИНОЛЯТФОСФОРИБОЗИЛ-ТРАНСФЕРАЗА (ХФРТаза) РАСТЕНИЯ ТАБАКА, КОДИРУЮЩАЯ УКАЗАННЫЙ ФЕРМЕНТ ДНК И СПОСОБЫ ИХ ПРИМЕНЕНИЯ, В ТОМ ЧИСЛЕ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ ТРАНСГЕННЫХ РАСТЕНИЙ - Google Patents

Abstract

Описываются ДНК, кодирующая растительный фермент хинолятфосфорибозил-трансферазу (ХФРТазу), и конструкции, содержащие такую ДНК. Описываются способы изменения экспрессии хинолятфосфорибозил-трансферазы.

Description

Исследования, спонсированные Федеральными органами

Данное изобретение осуществлено при поддержке государства через Национальный Фонд по научным исследованиям № МСВ9206506. Государство имеет определенные права на данное изобретение.

Область техники, к которой относится изобретение

Данное изобретение относится к растительной хинолятфосфорибозил-трансферазе (ХФРТазе) и к ДНК, кодирующей этот фермент. В частности, данное изобретение относится к применению ДНК, кодирующей хинолятфосфорибозил-трансферазу, для получения трансгенных растений с генетически измененным содержанием никотина, и к растениям, полученным таким образом.

Предпосылки создания изобретения

Производство табака с пониженным содержанием никотина представляет интерес, учитывая способность никотина вызывать зависимость. Кроме того, растения табака с исключительно низким уровнем продуцирования никотина или не продуцирующие никотин привлекательны как реципиенты для трансгенов, экспрессирующих коммерчески ценные продукты, такие как фармацевтические средства, компоненты косметических средств или пищевые добавки. Разработаны различные способы удаления никотина из табака. Однако большинство этих способов удаляет другие ингредиенты из табака помимо никотина, что вредно влияет на табак. Классические методы выращивания культурных растений дают растения табака с более низким содержанием никотина (приблизительно 8%), чем содержание, обнаруженное в растениях табака дикого типа. Желательно получение растений табака и табак с еще меньшим содержанием никотина.

Одним из подходов к снижению содержания биологического продукта состоит в необходимости уменьшения количества необходимого фермента в биохимическом каскаде, ведущего к образованию этого продукта. Когда предпочтительный фермент находится в природе в количестве, ограничивающем скорость (относительно других ферментов, необходимых в каскаде реакций), любое снижение представленности фермента будет уменьшать продуцирование конечного продукта. Если количество фермента в естественном состоянии не является ограничивающим скорость, его присутствие в клетке необходимо уменьшить до ограничивающего скорость содержания, чтобы снизить выход каскада реакций. Напротив, если в естественном состоянии количество фермента является ограничивающим скорость, тогда любое возрастание активности фермента приведет к возрастанию выхода конечного продукта биосинтетического каскада реакций.

Никотин первоначально образуется в корнях растения табака и затем переносится в листья, где он накапливается (Тко, Рйу8ю1оду апб ВюейстЫгу о£ ТоЬаеео Р1ап1з. рр. 233-34, Όονбеп, НШсйиъоп & Ро55. 31гоиб8Ьигд, Ра. (1972)). Обязательной стадией при биосинтезе никотина является образование никотиновой кислоты из хинолиновой кислоты, которое катализируется ферментом хинолинфосфорибозил-трансферазой (ХФРТазой). Оказывается, что ХФРТаза является ограничивающим скорость ферментом в каскаде реакций, поставляющем никотиновую кислоту для синтеза никотина в табаке. См., например, ЕеШ е! а1., К.еди1а!юп ίη ТоЬассо Са11и5 о£ Епхуте Асйуйгек о£ Ше №со1ше РаШгау, Р1ап!а, 168, рр. 402-07 (1986); №адпег е! а1., Тйе К.еди1а1юп о£ Епхуте ΛαίνίПек о£ 1йе Мсойпе РаШгау ίη ТоЬассо, Рйу8ю1. Р1ап!., 68, рр. 667-72 (1986). Изменение содержания никотина в растениях табака путем антисмысловой регуляции экспрессии путресценсметилтрансферазы (ПМТазы) описывается в патентах США 5369023 и 5260205, Ыака1аш апб Майк. В международной заявке РСТ №О 94/28142, №айаб апб Майк, описывается ДНК, кодирующая ПМТ, и применение смысловой и антисмысловой содержащих ПМТ конструкций.

Краткое изложение сущности изобретения

Первым аспектом настоящего изобретения является выделенная молекула ДНК, содержащая ПОСЛЕД. № 1; последовательности ДНК, кодирующие фермент с ПОСЛЕД. № 2; последовательности ДНК, гибридизирующие с такой ДНК и кодирующие фермент хинолятфосфорибозил-трансферазу; и последовательности ДНК, отличающиеся от указанной выше ДНК вследствие вырождения генетического кода. Пептид, кодированный такой ДНК, составляет другой аспект изобретения.

Другим аспектом настоящего изобретения является ДНК-конструкция, содержащая промотор, функционирующий в растительной клетке, и сегмент ДНК, кодирующий фермент хинолятфосфорибозил-трансферазу, расположенный в прямом направлении от промотора и функционально связанный с ним. ДНК, кодирующая фермент, может находиться в антисмысловом или смысловом направлении.

Другим аспектом настоящего изобретения является способ получения трансгенной растительной клетки с пониженной экспрессией хинолятфосфорибозил-трансферазы (ХФРТазы) путем предоставления растительной клетки типа, известного как экспрессирующего хинолятфосфорибозил-трансферазу; трансформации растительной клетки экзогенной ДНКконструкцией, содержащей промотор и ДНК, содержащую часть последовательности, кодирующей мРНК хинолятфосфорибозилтрансферазы.

Другим аспектом настоящего изобретения является трансгенное растение вида Мсойапа с пониженной экспрессией хинолятфосфорибозил-трансферазы (ХФРТазы) относительно нетрансформированного контрольного растения. Клетки таких растений содержат ДНКконструкцию, включающую сегмент последовательности ДНК, которая кодирует мРНК растительной хинолятфосфорибозил-трансферазы.

Другим аспектом настоящего изобретения является способ снижения экспрессии гена хинолятфосфорибозил-трансферазы в растительной клетке путем выращивания растительной клетки, трансформированной с целью включения экзогенной ДНК, где транскрибирующая цепь экзогенной ДНК комплементарна к мРНК хинолятфосфорибозил-трансферазы, эндогенной для клетки. Транскрипция комплементарной цепи снижает экспрессию эндогенного хинолятфосфорибозил-гена.

Другим аспектом настоящего изобретения является способ получения растения табака с пониженным содержанием никотина в листьях растения табака путем выращивания растения табака, клетки которого содержат последовательность экзогенной ДНК, где транскрибирующая цепь экзогенной ДНК комплементарна к эндогенной матричной РНК хинолятфосфорибозил-трансферазы в клетках.

Другим аспектом настоящего изобретения является способ получения трансгенной растительной клетки с повышенной экспрессией хинолятфосфорибозил-трансферазы (ХФРТазы) путем трансформации растительной клетки, известной как экспрессирующая хинолятфосфорибозил-трансферазу, экзогенной ДНКконструкцией, содержащей последовательность ДНК, кодирующую хинолятфосфорибозилтрансферазу.

Другим аспектом настоящего изобретения является трансгенное растение Мсобапа с повышенной экспрессией хинолятфосфорибозилтрансферазы (ХФРТазы), где клетки трансгенного растения содержат последовательность экзогенной ДНК, кодирующую растительную хинолятфосфорибозил-трансферазу.

Другим аспектом настоящего изобретения является способ повышения экспрессии гена хинолятфосфорибозил-трансферазы в растительной клетке путем выращивания растительной клетки, трансформированной с целью включения экзогенной ДНК, кодирующей хинолятфосфорибозил-трансферазу.

Другим аспектом настоящего изобретения является способ получения растения табака с повышенным содержанием никотина в листьях путем выращивания растения табака, клетки которого содержат последовательность экзогенной ДНК, которая кодирует хинолятфосфорибозил-трансферазу, функциональную в клетках.

Краткое описание чертежей

Фиг. 1 показывает каскад биосинтетических реакций при образовании никотина. Ферментативные активности, известные как регули руемые №с1 и Νΐο2, представляют активность ХФРТазы (хинолятфосфорибозил-трансферазы) и ПМТазы (путресценс-метилтрансферазы).

На фиг. 2А приводится нуклеотидная последовательность кДНК ΝίβΡΤΙ (ПОСЛЕД. №

1) с кодирующей последовательностью (ПОСЛЕД. № 3), показанной заглавными буквами.

На фиг. 2Б приводится образованная аминокислотная последовательность (ПОСЛЕД. №

2) ХФРТазы табака, кодированной кДНК ΝίβΡΤΙ.

На фиг. 3 приводятся разложенные в ряд образованная аминокислотная последовательность ΝίβΡΤΙ и родственные последовательности К.йобокрт11ит гиЬгит, МусоЬас!епит 1ерге, Ба1топе11а (урЫтипит, ЕксйепсЫа соБ, человеческая, и Бассйаготусек сегесыае.

Фиг. 4 показывает результаты комплементации мутанта ЕксйепсЫа сой, лишенного хинолятфосфорибозил-трансферазы (ТН265), с кДНК ΝίβΡΤΙ. Клетки трансформированы экспрессионным вектором, несущим ΝίβΡΤΙ; рост трансформированных клеток ТН265, экспрессирующих ΝίβΡΤΙ, на минимальной среде, лишенной никотиновой кислоты, показывает, что ΝίβΡΤΙ кодирует ХФРТазу.

На фиг. 5 сравниваются содержание никотина и относительное установившееся содержание мРНК ΝίβΡΤΙ в мутантах табака ΝΒ1 и Νΐο2: Виг1еу 21 дикого типа (ΝΒ1/ΝΒ1 Νΐο2/Νΐο2); Виг1еу 21 №с1^- (шс1/шс1 №с2/№с2); Виг1еу 21 ΝΒ2^- (ΝΒ1/Νκ1 шс2/шс2); и Виг1еу 21 ΝΒ1^-Νκ2^- (шс1/шс1 шс2/шс2). Сплошные прямоугольники показывают содержание транскриптов мРНК; заштрихованные прямоугольники показывают содержание никотина.

Фиг. 6 является диаграммой относительного содержания мРНК ΝίβΡΤΙ со временем в растениях табака с прищипанной верхушкой по сравнению с неприщипанными контрольными растениями. Сплошные прямоугольники показывают содержание транскриптов мРНК; заштрихованные прямоугольники показывают содержание никотина.

Подробное описание изобретения

Никотин продуцируется в растениях табака путем конденсации никотиновой кислоты и 4-метиламинобутанала. Каскад реакций биосинтеза, приводящий к образованию никотина, поясняется на фиг. 1. Два регуляторных локуса (Νκ1 и Νΐο2) действуют как кодоминантные регуляторы образования никотина. Ферментные анализы корней простых и двойных мутантов Νΐο показывают, что активность двух ферментов хинолятфосфорибозил-трансферазы (ХФРТазы) и путресценс-метилтрансферазы (ПМТазы) прямо пропорциональна уровню бисинтеза никотина. Сравнение ферментативной активности в тканях табака (корень и каллюс) с различной способностью к синтезу никотина показывает, что активность ХФРТазы строго соотносится с содержанием никотина (Аадпег апб Аадпег,

Р1ап!а, 165:532 (1985)). §аипбетк и Викй (Р1ап1 Рйузюй, 64:236 (1979) показали, что содержание ХФРТазы в корнях мутантов с низким содержанием никотина пропорционально содержанию никотина в листьях.

Настоящее изобретение включает последовательность новой кДНК (ПОСЛЕД. № 1), кодирующей растительную хинолятфосфорибозил-трансферазу (ХФРТазу) ПОСЛЕД. № 2. Так как активность ХФРТазы строго соотносится с содержанием никотина, создание трансгенных растений табака, в которых содержание ХФРТазы в корнях понижено (по сравнению с содержанием в растениях дикого типа), приведет к растениям с пониженным содержанием никотина в листьях. Настоящее изобретение относится к способам и нуклеотидным конструкциям для получения таких трансгенных растений, а также к таким трансгенным растениям. Такие способы включают экспрессию антисмысловой РНК ΝιΟΡΤΙ. которая снижает количество ХФРТазы в корнях табака. Кроме того, никотин обнаружен в видах и семействах растений, не относящихся к табаку, хотя его количество в них, как правило, значительно меньше, чем в Ν. 1аЬаеиш.

Настоящее изобретение также относится к молекулам смысловой и антисмысловой рекомбинантной ДНК, кодирующим ХФРТазу, или к молекулам антисмысловой РНК ХФРТазы, и к векторам, содержащим эти молекулы рекомбинантной ДНК, а также к трансгенным растительным клеткам и растениям, трансформированным этими молекулами ДНК и векторами. Трансгенные клетки и растения табака по данному изобретению характеризуются более низким или более высоким содержанием никотина, чем в нетрансформированных контрольных клетках и растений табака.

Растения табака с исключительно низким уровнем продуцирования никотина или не продуцирующие никотин привлекательны как реципиенты для трансгенов, экспрессирующих коммерчески ценные продукты, такие как фармацевтические средства, компоненты косметических средств или пищевые добавки. Табак привлекателен в качестве растения-реципиента для трансгена, кодирующего нужный продукт, так как табак легко поддается обработке методами генной инженерии и продуцирует весьма большую биомассу на акр; растения табака с пониженными ресурсами, предназначенными для продуцирования никотина, соответственно, будут иметь большие ресурсы, доступные для продуцирования трансгенных продуктов. Способы трансформации табака трансгенами, продуцирующими нужные продукты, известны в технике; любой подходящий метод можно использовать для растений табака с низким содержанием никотина настоящего изобретения.

Растения табака, в соответствии с настоящим изобретением, с пониженной экспрессией ХФРТазы и пониженным содержанием никоти на будут нужны при получении табачных изделий с пониженным содержанием никотина. Растения табака по настоящему изобретению подойдут для применения в любом традиционном табачном изделии, включая, но не ограничиваясь перечисленным, трубочный, сигарный и сигаретный табак, и жевательный табак, который может быть любой формы, включая листовой табак, скрошенный или резаный табак.

Конструкции настоящего изобретения также могут быть полезны при получении трансгенных растений с повышенной экспрессией ХФРТазы и повышенным содержанием никотина в растении. Такие конструкции, способы с использованием этих конструкций и растения, полученные таким образом, могут понадобиться при получении табачных изделий с измененным содержанием никотина или при получении растений с содержанием никотина, повышенным с целью получения инсектицидного действия.

Авторы обнаружили, что ген ТоЬРБ2 (см. Соикйпд е! а1., Р1ап1 Рйук., 93, 1203 (1990)) кодирует ХФРТазу Жсойаиа 1аЬасиш и снабжает его последовательностью кДНК МОРТ1 (раньше названную ТоЬВЭ2) и аминокислотной последовательностью кодируемого фермента. Сравнение аминокислотной последовательности №ОРТ1 с базой данных банка генов показывает ограниченное подобие последовательностей с бактериальными белками, которые кодируют хинолятфосфорибозил-трансферазу (ХФРТазу) (фиг. 3).

Хинолятфосфорибозил-трансфераза необходима для биосинтеза бе поуо никотинадениндинуклеотида (ΝΑΌ) как в прокариотах, так и в эукариотах. В табаке высокое содержание ХФРТазы обнаруживается в корнях, но не в листьях. Для того чтобы определить, что МОРТ1 кодирует ХФРТазу, авторы изобретения использовали штамм бактерий ЕксйепсЫа сой (ТН265), являющийся мутантом с утраченной хинолятфосфорибозил-трансферазой (пабС^-). Этот мутант не может расти на минимальной среде, не содержащей никотиновой кислоты. Однако экспрессия белка МОРТ1 в этом бактериальном штамме предоставляет фенотип №1бС' (фиг. 4), что подтверждает, что МОРТ1 кодирует ХФРТазу.

Авторы изобретения исследовали действие мутантов №с1 и №с2 в табаке и влияние прищипки верхушек растений табака на установившееся содержание мРНК МОРТ1 и содержание никотина. (Известно, что удаление апикального доминирования посредством прищипки верхушек в начале цветения приводит к повышенному уровню биосинтеза и переноса никотина в табаке и является обычной практикой в производстве табака. Если №ОРТ1 действительно участвует в биосинтезе никотина, следует ожидать, что (1) содержание мРНК МОРТ1 будет ниже в двойных мутантах Νΐο1/Νΐο2, и (2) содержание мРНК ΝιΟΡΤΙ будет возрастать после прищипки верхушек. Обнаружено, что содержание мРНК ΝιΟΡΤΙ в двойных мутантах Νίε1/Νίε2 составляет приблизительно 25% от содержания в диком типе (фиг. 5). Кроме того, в пределах 6 ч после прищипки верхушек содержание мРНК ΝιΟΡΤΙ в растениях табака повышается примерно в 8 раз. Следовательно, установлено, что ΝίΟΡΤΙ является ключевым геномрегулятором в каскаде реакций биосинтеза никотина.

Трансгенные растительные клетки и растения

Регуляции экспрессии гена в геномах растительной клетки можно достичь путем интеграции гетерологичной ДНК под транскрипционным контролем промотора, который действует в хозяине, и в котором транскрибирующаяся цепь гетерологичной ДНК комплементарна к цепи ДНК, которая транскрибируется от регулируемого эндогенного гена. Введенная ДНК, отнесенная к антисмысловой ДНК, обеспечивает последовательность РНК, комплементарную к естественно продуцируемой (эндогенной) мРНК и ингибирующую экспрессию эндогенной мРНК. Механизм такой регуляции экспрессии гена с помощью антисмысловой ДНК выяснен не до конца. Несмотря на отсутствие желания придерживаться какой-либо определенной теории, нужно отметить, что теория антисмысловой регуляции предполагает, что транскрипция антисмысловой ДНК продуцирует молекулы РНК, которые присоединяются и предупреждают или ингибируют транскрипцию молекул эндогенной мРНК.

В способах настоящего изобретения антисмысловой продукт может быть комплементарным к кодирующим или некодирующим (или к тем и другим) частям встречающейся в природе РНК-мишени. Антисмысловая конструкция может быть введена в растительные клетки любым подходящим способом и может быть интегрирована в растительный геном для индуцируемой или конститутивной транскрипции антисмысловой последовательности. См., например, патенты США №№ 5453566 и 5107065, 8йететакег е1 а1. (включены в настоящее описание в качестве ссылок).

Как принято здесь, экзогенной или гетерологичной ДНК (или РНК) называется ДНК (или РНК), введенная в клетку (или в предшественника клетки) благодаря усилиям человека. Такая гетерологичная ДНК может являться копией последовательности, которая обнаружена в трансформируемой клетке как естественная, или ее фрагментов.

Для того чтобы получить растение табака с пониженным содержанием ХФРТазы и, таким образом, более низким содержанием никотина, чем в нетрансформированном контрольном растении табака, клетку табака можно трансформировать антисмысловой транскрипционной ХФРТ-единицей, содержащей неполную после довательность кДНК ХФРТ, полноразмерную последовательность кДНК ХФРТ, неполную хромосомную последовательность ХФРТ или полноразмерную хромосомную последовательность ХФРТ, в антисмысловой ориентации с соответствующими функционально связанными регуляторными последовательностями. Подходящими регуляторными последовательностями являются последовательность инициации транскрипции (промотор), функционирующая в трансформируемом растении, и последовательность терминации полиаденилирования/транскрипции. Затем для идентификации клонов, несущих последовательности ХФРТазы в антисмысловой ориентации, функционально связанные с регуляторными последовательностями, используют стандартные методы, такие как рестрикционное картирование, Саузернблоттинг и анализ нуклеотидной последовательности. Затем из успешно трансформированных клеток регенерируют растения табака. Наиболее предпочтительно, когда используемая антисмысловая последовательность комплементарна к эндогенной последовательности, однако, небольшие изменения в экзогенной и эндогенной последовательностях можно допустить. Предпочтительно, чтобы последовательность антисмысловой ДНК была достаточно подобна последовательности, способной к связыванию с эндогенной последовательностью в регулируемой клетке, в строгих условиях, как описано ниже.

Антисмысловую технологию используют в ряде лабораторий для создания трансгенных растений, характеризующихся количеством специфических ферментов ниже естественного. Например, растения с пониженным уровнем хальконсинтазы - фермента биосинтетического каскада реакций образования цветкового пигмента - получены путем инсерции антисмыслового гена хальконсинтазы в геном табака и петунии. Эти трансгенные растения табака и петунии образуют цветы с окраской слабее нормальной (Уай бег Кго1 е! а1., Ап Апб-8епке С11а1еопе 8уп1йаке Оепе ίη ^апк^етс Р1ап1к 1пШЪ148 Потеег РщтегИаЦоп. №11иге. 333, рр. 86669 (1988)). Технология антисмысловых РНК также успешно используется для подавления образования фермента полигалактуроназы в томатах (8ιηίΐ1ι е1 а1., Апбкепке ΡΝΛ 1пЬ1Ъ1(1оп о£ Ро1уда1ас1игопаке Оепе Ехргеккюп ш Τ^аηκдешс Τота1оеκ, №1иге, 334, рр. 724-26 (1988); 811ее11у е1 а1., Кебисбоп о£ Ро1уда1ас1игопаке АсΙίνίίν ш ^таФ Егий Ъу Апбкепке ΡΝΆ, Ргос. ЫаИ. Асаб. 8с1. И8А, 85, рр. 8805-09 (1988)) и малой субъединицы фермента рибулозбисфосфаткарбоксилазы в табаке (Робегте1 е1 а1., Νυс1еаг-Огдапе11е ФФгасбопк: М.1с1еаг АпФепке Оепе ΙπΙιΦΦ КгЪиФке ВкрйокрйаФ СагЪоху1аке Епхуте Ьеуе1к ш Τπ-πικίοπικά ^Ъа^о Р1ап1к, Се11, 55, рр. 673-81 (1988)). С другой стороны, трансгенные растения, отличающиеся количест вом этого фермента, превышающим нормальное, можно создать путем трансформации растений геном для этого фермента в смысловой (т.е., в нормальной) ориентации. Содержание никотина в трансгенных растениях табака по настоящему изобретению можно определить посредством стандартных проб на никотин. Трансформированные растения, в которых содержание ХФРТазы снижено по сравнению с нетрансформированными контрольными растениями, соответственно, будут иметь пониженное содержание никотина по сравнению с контролем; трансформированные растения, в которых содержание ХФРТазы повышено по сравнению с нетрансформированными контрольными растениями, соответственно, будут иметь повышенное содержание никотина по сравнению с контролем.

Гетерологичную последовательность, используемую в антисмысловых способах настоящего изобретения, можно выбрать с таким расчетом, чтобы получить продукт РНК, комплементарный к полной последовательности мРНК ХФРТазы или к ее части. Последовательность может быть комплементарной к любой следующей последовательности природной матричной РНК, т.е. она может быть комплементарной к последовательности эндогенной мРНК, ближайшей к 5'-концу сайта кэпирования, в прямом направлении от сайта кэпирования, между сайтом кэпирования и инициирующим кодоном, и может перекрывать всю или только часть некодирующей области, может быть мостиком между некодирующей и кодирующей областью, быть комплементарной ко всей или к части кодирующей области, комплементарной к З'-концу кодирующей области или комплементарной к З'-нетранслируемой области мРНК. Соответствующие антисмысловые последовательности могут состоять по меньшей мере примерно из 13 до примерно 15 нуклеотидов, по меньшей мере примерно из 16 до примерно 21 нуклеотида, по меньшей мере примерно из 20 нуклеотидов, по меньшей мере примерно из 30 нуклеотидов, по меньшей мере примерно из 50 нуклеотидов, по меньшей мере примерно из 75 нуклеотидов, по меньшей мере примерно из 100 нуклеотидов, по меньшей мере примерно из 125 нуклеотидов, по меньшей мере примерно из 150 нуклеотидов, по меньшей мере примерно из 200 нуклеотидов или из большего их числа. Кроме того, последовательности можно удлинить или укоротить по их 3'- или 5'концам.

Конкретная антисмысловая последовательность и длина антисмысловой последовательности будут изменяться в зависимости от необходимой степени ингибирования, устойчивости антисмысловой последовательности и подобных факторов. Специалист в этой области техники при выборе соответствующих антисмысловых последовательностей ХФРТазы бу дет руководствоваться возможностью применения методов, доступных в технике, и приведенными здесь сведениями. В соответствии с фиг. 2 А и приведенной на ней ПОСЛЕД. № 1, олигонуклеотид изобретения может представлять собой непрерывный фрагмент последовательности кДНК ХФРТазы в антисмысловой ориентации, любой длины, которой достаточно для достижения необходимого действия при трансформации в растительную клетку-реципиента.

Настоящее изобретение также можно использовать при способах смысловой косупрессии продуцирования никотина. Смысловые ДНК, используемые при осуществлении настоящего изобретения, имеют достаточную длину, чтобы, когда экспрессируются в растительных клетках, подавлять в этой растительной клетке нативную экспрессию растительного белка ХФРТазы, как описано здесь. Такие смысловые ДНК могут представлять собой, по существу, полную геномную или комплементарную ДНК, кодирующую фермент ХФРТазу, или ее фрагмент, причем такие фрагменты, как правило, имеют длину по меньшей мере в 15 нуклеотидов. Способы установления длины смысловой ДНК, которая приведет к подавлению экспрессии нативного гена в клетке, доступны специалистам в этой области техники.

В другом варианте воплощения настоящего изобретения клетки растения ΝίοοΙίαηα трансформируются ДНК-конструкцией, содержащей сегмент ДНК, кодирующий молекулу ферментной РНК (т.е., рибозим), которая направлена против (т.е. расщепляет) транскрипта мРНК ДНК, кодирующей растительную ХФРТазу, как описано здесь. Рибозимы содержат связывающие субстрат домены, которые связываются с доступными областями мРНКмишени, и домены, которые катализируют расщепление РНК, предотвращая трансляцию и продуцирование белка. Связывающие домены могут содержать антисмысловые последовательности, комплементарные к последовательности мРНК-мишени; каталитический мотив может представлять собой молотообразный мотив или другие мотивы, такие как шпилькообразный мотив. Сайты рибозимного расщепления в пределах РНК-мишени сначала можно идентифицировать путем сканирования молекулымишени на сайты расщепления рибозимом (например, последовательности ΟϋΑ, Οϋϋ или ОиС). Сразу после идентификации можно оценить короткие последовательности РНК из 15, 20, 30 или большего числа рибонуклеотидов, соответствующие области гена-мишени, содержащей сайт расщепления, на предсказанные структурные особенности. Пригодность предполагаемых мишеней также можно оценить путем тестирования их доступности для гибридизации с комплементарными олигонуклеотидами, с использованием анализов с рибонуклеазной защитой, известных в технике. ДНК, кодирую11 щую молекулы ферментной РНК, можно получить в соответствии с известными методами. См., например, Т. Сесй с! а1., патент США № 4987071; Кеепе е! а1., патент США № 5559021; Όοηκοη е! а1., патент США № 5589367; Тоггепсе е! а1., патент США № 5583032; 1оусе, патент США № 5580967;

Со1б е! а1., патент США № 5595877; ХУадоег е! а1., патент США № 5591601; и патент США № 5622854 (все патенты включены в настоящее описание в качестве ссылок). Продуцирование такой молекулы ферментной РНК в растительной клетке и срыв продуцирования белка ХФРТазы снижает активность ХФРТазы в растительных клетках, по существу, таким же образом, как продуцирование молекулы антисмысловой РНК, т. е. путем разрыва трансляции мРНК в клетке, продуцирующей фермент. Термин рибозим здесь используется для описания содержащей РНК нуклеиновой кислоты, которая функционирует как фермент (такой как эндорибонуклеаза) и может использоваться для реципрокного обмена с молекулой ферментной РНК. Настоящее изобретение также относится к ДНК, кодирующей рибозимы, ДНК, кодирующей рибозимы, которая вставлена в экспрессионный вектор, клеткам-хозяевам, содержащим такие векторы, и способам снижения продуцирования ХФРТазы в растениях с использованием рибозимов.

Нуклеотидные последовательности, используемые при осуществлении настоящего изобретения, включают последовательности, подобные ПОСЛЕД. № 1, и кодирующие белок, обладающий активностью хинолятфосфорибозил-трансферазы. Это определение подразумевает охват природных аллельных вариаций в белках ХФРТазах. Таким образом, последовательности ДНК, которые гибридизируют с ДНК ПОСЛЕД. № 1 и кодируют экспрессию ХФРТазы, в частности, растительных ферментов ХФРТаз, также могут использоваться при осуществлении настоящего изобретения.

Могут существовать многие формы фермента ХФРТ табака. Может существовать множество форм фермента из-за посттрансляционной модификации одного генного продукта или из-за множества форм гена ΝιΟΡΤΙ.

Условия, которые позволяют последовательностям других ДНК, кодирующих экспрессию белка с активностью ХФРТазы, гибридизировать с ДНК ПОСЛЕД. № 1 или с другими последовательностями ДНК, кодирующими белок, данный в виде ПОСЛЕД. № 2, можно определить обычным способом. Например, гибридизацию таких последовательностей можно осуществить в условиях менее строгих или даже в строгих условиях (например, в условиях, представленных строгой промывкой раствором 0,3 М №С1, 0,03 М цитрата натрия, 0,1% ДСН, при 60°С или даже при 70°С, ДНК, кодирующей белок, приведенный здесь как ПОСЛЕД. № 2, ίη

8Йи при стандартном анализе гибридизации; см., например, 1. 8атЬтоок е! а1.. Мо1еси1аг Οοηίημ. А ЬаЬота!огу Магша1 (26 Еб. 1989) (Со1б 8рппд НагЬог ЬаЬота!огу)). Вообще, такие последовательности будут по меньшей мере на 65% подобны, на 75% подобны, на 80% подобны, на 85% подобны, на 90% подобны, или даже на 95% или больше подобны последовательности, приведенной здесь как ПОСЛЕД. № 1, или последовательностям ДНК, кодирующим белки ПОСЛЕД. № 2. (Определения подобия последовательностей проводятся с двумя разложенными в ряд последовательностями по их максимальному совпадению; причем гэпы в любой из двух последовательностей при максимальном соответствии подходят под пару. Длина гэпов 10 или меньше является предпочтительной, более предпочтительна длина гэпов 5 или меньше, и еще предпочтительнее длина гэпов 2 или меньше.)

Пригодны различные процедуры гибридизации, предусматривающие выделение клонов кДНК, в которых содержание мРНК низкое примерно 0,05% поли (А⁺) РНК. См. М. СопК 1ίη§ е! а1., Р1ай РЬуяок, 93, 1203-1211 (1990). Коротко, библиотеки кДНК скринируют с использованием одноцепочечных кДНК-зондов обратно транскрибирующейся мРНК из растительной ткани (например, корней и/или листьев). Для дифференциального скрининга нитроцеллюлозную или нейлоновую мембрану смачивают в 5х88С, помещают в 96-луночный планшет с отсосом, в каждую лунку помещают 150 мкл стационарной ночной культуры, перенесенной с основного планшета, и применяют вакуум до тех пор, пока вся жидкость не пройдет через фильтр. В каждую лунку помещают 150 мкл денатурирующего раствора (0,5 М №ОН, 1,5 М №1С1) с использованием многопозиционной пипетки и оставляют примерно на 3 мин. Применяют отсос, как описано выше, и фильтр удаляют и нейтрализуют в 0,5 М трисНС1 (рН 8,0), 1,5 М №С1. Затем его сушат в течение 2 ч в вакууме и инкубируют с соответствующими зондами. При использовании мембранных нейлоновых фильтров и хранении основных планшетов при -70°С в 7% ДМСО фильтры можно скринировать много раз со многими зондами и извлекать соответствующие клоны после нескольких лет хранения.

Используемый здесь термин ген относится к последовательности ДНК, включающей (1) регуляторные сигналы в обратном направлении (5'), в том числе, промотор, (2) кодирующую область, определяющую продукт, белок или РНК гена, (3) области в прямом направлении (3'), в том числе, сигналы транскрипции, терминации и полиаденилирования, и (4) ассоциированные последовательности, необходимые для эффективной и специфичной экспрессии.

Последовательность ДНК настоящего изобретения может состоять, по существу, из полу ченной здесь последовательности (ПОСЛЕД. № 1) или эквивалентных нуклеотидных последовательностей, представляющих аллели или полиморфные варианты этих генов, или их кодирующих областей.

Использование фразы значительное подобие последовательностей в настоящем описании и в формуле изобретения означает, что последовательности ДНК, РНК или аминокислотные последовательности, в которых есть незначительные и не имеющие значения отклонения последовательностей от фактических последовательностей, описанных и заявленных здесь, рассматриваются как эквивалентные последовательностям настоящего изобретения. С этой точки зрения фраза незначительные и не имеющие значения отклонения последовательностей означает, что подобные последовательности (т.е. последовательности, в которых имеется значительное подобие последовательностей с ДНК, РНК или белками, описываемыми и рассматриваемыми здесь) будут функционально эквивалентны последовательностям, описанным и заявленным в настоящем изобретении. Функционально эквивалентные последовательности будут функционировать, по существу, одинаково, с образованием, по существу, таких же композиций, каковы композиции нуклеиновых кислот и аминокислот, описанные и заявленные здесь.

Описанные здесь последовательности ДНК можно трансформировать во многие клеткихозяева. Многие подходящие клетки-хозяева с нужными свойствами в отношении роста и обработки легко доступны в технике.

Использование фразы выделенный или по существу, чистый в настоящем описании и формуле изобретения в отношении модификатора ДНК, РНК, полипептидов или белков, означает, что ДНК, РНК, полипептиды или белки с таким определением выделены из своей ίη νίνο клеточной окружающей среды посредством приложения усилий человека.

Используемые здесь выражения нативная последовательность ДНК или природная последовательность ДНК относятся к последовательности ДНК, которую можно выделить из нетрансгенных клеток или ткани. Нативные последовательности ДНК представляют собой последовательности, которые не изменены искусственно, например, путем сайтнаправленного мутагенеза. Когда нативные последовательности ДНК идентифицированы, молекулы ДНК с нативными последовательностями ДНК можно синтезировать химически или получить с использованием известных в технике процедур с рекомбинантными ДНК. Используемая здесь нативная последовательность ДНК растения является последовательностью, которую можно выделить из нетрансгенных растительных клеток или ткани. Используемая здесь нативная последовательность ДНК табака является по следовательностью, которую можно выделить из нетрансгенных клеток или ткани табака.

ДНК-конструкции или транскрипционные кассеты настоящего изобретения включают, в направлении транскрипции 5'-3', промотор, описанный здесь, описанную здесь последовательность ДНК, функционально связанную с промотором, и, необязательно, последовательность терминации, включающую стоп-сигнал для РНК-полимеразы и сигнал полиаденилирования для полиаденилазы. Все эти регуляторные области должны быть способны работать в клетках трансформируемой ткани. Любой подходящий сигнал терминации может быть использован при осуществлении настоящего изобретения, причем его примерами являются, но не ограничиваются перечисленным, терминатор нопалин-синтаза (пок), терминатор октапинсинтаза (оке), терминатор СаМУ, или нативные сигналы терминации, полученные от того же гена, что и область инициации транскрипции, или полученные от другого гена. См., например, Ροζίοη с1 а1. (1988), цит. выше, или Робсгтс1 с1 а1. (1988), цит. выше.

Используемый здесь термин функционально связанные относится к последовательностям ДНК в молекуле отдельной ДНК, которые связаны таким образом, что функция одной влияет на функцию другой. Таким образом, промотор является функционально связанным с ДНК, когда он способен воздействовать на транскрипцию этой ДНК (т.е. ДНК находится под транскрипционным контролем промотора). Говорят, что промотор находится в обратном направлении от ДНК, о которой, в свою очередь, говорят, что она находится в прямом направлении от промотора.

Транскрипционная кассета может быть представлена в ДНК-конструкции, которая также имеет по меньшей мере одну репликационную систему. Для удобства, обычно получают репликационную систему, функциональную в ЕксйепсЫа сой, такую как Со1Е1, рЗС101, рАСУС184, или подобную систему. При этом на каждой стадии после каждой манипуляции полученную конструкцию можно клонировать, секвенировать и определить правильность манипуляции. Кроме того, или вместо репликационной системы ЕксйепсЫа сой, можно использовать широкий ряд хозяев репликационной системы, таких как репликационные системы несовместимых плазмид Р-1, например, рКК290. В дополнение к репликационной системе часто будет присутствовать по меньшей мере один маркер, который может быть полезным в одном или нескольких хозяевах, или разные маркеры для отдельных хозяев. Иными словами, можно использовать один маркер для селекции в прокариотном хозяине, в то время как другой маркер можно использовать для селекции в эукариотном хозяине, в частности, в хозяине-растении. Маркеры могут быть защи той от биоцидов, таких как антибиотики, токсины, тяжелые металлы или подобные; могут обеспечивать комплементацию путем придания прототрофности ауксотрофному хозяину; или могут давать видимый фенотип через продуцирование нового соединения в растении.

Различные фрагменты, содержащие различные конструкции - транскрипционные кассеты, маркеры и подобное, можно ввести последовательно с помощью расщепления рестрикционными ферментами соответствующей репликационной системы и вставки определенной конструкции или фрагмента в доступный сайт. После лигирования и клонирования ДНКконструкцию можно выделить для дальнейших действий. Примеры всех эти методов широко представлены в литературе, например, в работе 1. 8атЬгоок е! а1., Мо1еси1аг Скопищ, А ЬаЬота!огу Мапиа1 (2к Ек. 1989) (Со1к 8рппд НагЬог ЬаЬота!огу).

Векторы, которые можно использовать для трансформации растительной ткани нуклеотидными конструкциями настоящего изобретения, включают как векторы АдгоЬас!етшт, так и баллистические векторы, а также векторы, пригодные для опосредованной ДНК трансформации.

Термин промотор относится к области последовательности ДНК, которая включает необходимые сигналы для эффективной экспрессии кодирующей последовательности. Промотор может включать последовательности, с которыми связывается РНК-полимераза, но не ограничивается такими последовательностями, и может включать области, с которыми связываются другие регуляторные белки, вместе с областями, участвующими в контроле трансляции белка, и может включать кодирующие последовательности.

Промоторы, используемые при осуществлении настоящего изобретения, могут быть конститутивно активными промоторами. Доступны многие конститутивно активные промоторы, функционирующие в растениях. Предпочтительным примером является промотор 358 вируса мозаики цветной капусты (СаМУ), который экспрессируется конститутивно в большинстве растительных тканей. С другой стороны, промотор может быть специфическим для корней промотором или промотором, специфическим для кортекса корней, что подробнее поясняется ниже.

Антисмысловые последовательности экспрессируются в трансгенных растениях табака с использованием промотора 358 вируса мозаики цветной капусты (СаМУ). См., например, е.д., Сотпейззеп е! а1., Во(11 ΚΝΑ Ьеуе1 апк Тгапз1а11оп ЕГйаепсу аге Кекисек Ьу Ап!1-8епзе ΚΝΑ ίη Ттапздешс ТоЬассо, ШсШс Аакз Кез. 17, рр. 833-43 (1989); Кеха1ап е! а1., Апй-8епзе КНАз о! СиситЬет Мозак Уииз ίη Ттапздешс Р1ап!з Аззеззек Гог СоПго1 о! Фе Уииз, Р1ап! Мо1еси1аг

Вю1оду 11, рр. 463-71 (1988); Кокегте1 е! а1., М1с1еаг-0г§апе11е 1п!етасйопз: М1с1еаг Апйзепзе Сепе !пВ1Ь1(з К!Ьи1озе В1зрйозрйа!е СагЬоху1азе Епхуте Ьеуе1з ш ТгапзГогтек ТоЬассо Р1ап!з, Се11 55, рр. 673-81 (1988); 8тйй е! а1., Апйзепзе КНА 1пВ1Ь111оп оГ Ро1уда1ас!игопазе Сепе Ехргеззюп 1п Тгапздешс Тота!оез, №Ш1ге 334, рр. 72426 (1988); Уап кег Кго1 е! а1., Ап Апй-8епзе Сйа1сопе 8уп!йазе Сепе 1п Тгапздешс Р1ап!з 1пЫЬйз Е1о\\сг Рщтепкйоп, На!иге 333, рр. 86669 (1988).

Для экспрессии ХФРТазы в трансформированных клетках и растениях табака данного изобретения предпочтительно применение промотора 358 СаМУ. Подробно описано применение промотора СаМУ для экспрессии других рекомбинантных генов в корнях табака (Ьат е! а1., 8йе-8ресШс Микйопз А1!ег 1п Уйто Еас!ог В1пк1пд апк Сйапде Ргото!ег Ехртеззюп Ра!!егп 1п Ттапздешс Р1ап!з, Ргос. На!. Асак. 8ск И8А, 86, рр. 7890-94 (1989); Рои1зеп е! а1., П1ззес!юп оГ 5' Ирзкеат 8ес.|иепсез Гог 8е1есйуе Ехртеззюп оГ Фе Мсойапа рктЬащшГоНа гЬс8-8В Сепе, Мо1. Сеп. Сепе!., 214, рр. 16-23 (1988)).

Другие промоторы, активные только в тканях корней (специфические для корней промоторы) также, в частности, подходят для способов настоящего изобретения. См., например, патент США № 5459252, Сопкйпд е! а1.; Уатато!о е! а1.; Тйе Р1ап! Се11, 3:371 (1991). Также используется промотор, специфический для кортекса корней. См., например, заявку на патент США, рег. № 08/508786, Сопк1йк.| е! а1., теперь принятую на рассмотрение; РСТ XVО 9705261. Все цитированные здесь патенты включены в настоящее описание в качестве ссылок.

Молекулы рекомбинантной ДНК ХФРТазы и векторы, используемые для получения трансформированных клеток и растений табака данного изобретения, также могут содержать доминантный селектируемый ген-маркер. Подходящие для применения в табаке доминантные селектируемые гены-маркеры включают, среди прочих, гены устойчивости к антибиотикам, кодирующие неомицин-фосфотрансферазу (№ТП), гидромицин-фосфотрансферазу (НРТ) и хлорамфеникол-ацетилтрансферазу (САТ). Другим хорошо известным доминантным селектируемым геном-маркером, подходящим для применения в табаке, является мутантный ген дигидрофолат-редуктазы, который кодирует устойчивую к метотрексату дигидрофолатредуктазу. Векторы ДНК, содержащие подходящие гены устойчивости к антибиотикам, и соответствующие антибиотики являются коммерчески доступными.

Трансформированные клетки табака отбирают из ближайшей популяции нетрансформированных клеток, помещая смешанную популяцию клеток в культуральную среду, содержащую соответствующую концентрацию антибио тика (или другого соединения, естественно токсичного для клеток табака), устойчивость против которого придает продукт выбранного селектируемого гена-маркера. Таким образом, только эти трансформированные клетки табака будут выживать и размножаться.

Способы получения рекомбинантных растений настоящего изобретения, вообще, включают, во-первых, предоставление растительной клетки, способной к регенерации (причем растительная клетка, как правило, находится в ткани, способной к регенерации). Затем растительную клетку трансформируют ДНКконструкцией, содержащей транскрипционную кассету настоящего изобретения (описанную здесь), и из трансформированной растительной клетки регенерируют рекомбинантное растение. Как поясняется ниже, стадию трансформации осуществляют методами, известными в технике, включая, но не ограничиваясь перечисленным, бомбардировку растительной клетки микрочастицами, несущими транскрипционную кассету, инфицирование клетки АдгоЬае!егшт ШтсГаС1спес5. содержащим Τί-плазмиду, несущую транскрипционную кассету, или любым другим методом, подходящим для получения трансгенного растения.

Известны многие векторные системы АдгоЬае!егшт, полезные при осуществлении настоящего изобретения. Например, в патенте США № 4459355 описывается способ трансформации восприимчивых растений, включая двудольные, штаммом АдгоЬае!егшт, содержащим Τί-плазмиду. Трансформация древесных растений вектором АдгоЬае1егшт описывается в патенте США № 4795855. Кроме того, в патенте США № 4940838, ЗеЫ1регооп е! а1., описывается бинарный вектор АдгоЬае1егшт (т.е. вектор, в котором АдгоЬае1егшт содержит одну плазмиду, имеющую νίτ-область Τί-плазмиды, но не Тобласть, и вторую плазмиду, имеющую Тобласть, но не νίτ-область), полезный при осуществлении настоящего изобретения.

Микрочастицы, несущие ДНКконструкцию настоящего изобретения, подходящие для баллистической трансформации растительной клетки, также полезны для получения трансформированных растений настоящего изобретения. Микрочастица продвигается в растительную клетку для получения трансформированной растительной клетки, и из трансформированной растительной клетки восстанавливают растение. В практике настоящего изобретения можно использовать любую подходящую методологию баллистической трансформации клетки и аппаратуру для ее осуществления. Примеры аппаратуры и процедур описываются в патенте США № 4945050, ЗаиГогб апб ^о1Г, и в патенте США № 5015580, Сйпйои е! а1. При использовании процедур баллистической трансформации транскрипционная кассета может быть введена в плазмиду, способную к репликации или инте грации в трансформируемую клетку. Примерами микрочастиц, пригодных для применения в таких системах, являются 1-5-мкм золотые шарики. ДНК-конструкцию можно осадить на микрочастицу любым подходящим способом, например, путем преципитации.

Вид растения можно трансформировать ДНК-конструкцией настоящего изобретения путем опосредованной ДНК трансформации протопластов растительной клетки и последующей регенерации растения из трансформированных протопластов в соответствии с процедурами, хорошо известными в технике. Слияние протопластов табака с помощью содержащих ДНК липосом или посредством электропорации известно в технике. (8И1Ш1о е! а1., Ииее! Сепе ТгапкГег !о Рго1ор1ак18 оГ И1ео1у1ебопои8 апб МопоеоЕу 1ебопоик Р1ап18 Ьу а ЫитЬег оГ Ме!1обк, 1пе1ибшд Е1ее1горога1юп, Мебюбк ш Епхуто1оду, 153, рр. 313-36 (1987)).

Здесь трансформация представляет введение экзогенной ДНК в клетки с тем, чтобы получить трансгенные клетки, устойчиво трансформированные экзогенной ДНК.

Трансформированные клетки индуцируют для регенерации интактных растений табака посредством применения к культуре клеток и ткани табака методов, хорошо известных в технике. Способ регенерации растения выбирают таким образом, чтобы он был совместим со способом трансформации. Устойчивое присутствие и ориентацию последовательности ХФРТазы в трансгенных растениях табака можно проверить с помощью менделирующей наследственности последовательности ХФРТазы, которая обнаруживается стандартными методами анализа ДНК, применяемыми к потомству, получаемому при контрольных скрещиваниях. После регенерации трансгенных растений табака из трансформированных клеток введенная последовательность ДНК легко переносится в другие сорта табака обычными методами выращивания растений и без чрезмерного экспериментирования.

Например, для того, чтобы проанализировать расщепление трансгена, можно вырастить регенерированные трансформированные растения (Во) до зрелости, проверить на содержание никотина и размножить инбридингом для получения растений В₁. Процент растений В₁, содержащих трансген, составляет гомозиготы для трансгена. Для идентификации гомозиготных растений Κι трансгенные растения Κι выращивают до зрелости и размножают инбридингом. Гомозиготные растения Κι будут давать потомство В₂, где каждое растение-потомок несет трансген; потомство гетерозиготных растений В! будет расщепляться 3:1.

Никотин служит в качестве природного пестицида, который помогает защитить растения табака от повреждения вредителями. Поэтому также может оказаться желательной дополнительная трансформация полученных данными способами растений с низким содержанием никотина, или не содержащих никотин, трансгеном (таким как ВасШик ΐΗυΓίβίοηκίκ). что будет создавать дополнительную защиту от насекомых.

Предпочтительным растением для применения в способах настоящего изобретения является вид Ысойапа или табак, в том числе N. 1аЬаснт. N. гнкБса и N. ДнБпока. Можно использовать любой штамм или сорт табака. Предпочтительны штаммы, в которых содержание никотина уже низкое, такие как двойные мутанты №с1/№с2.

Любую растительную ткань, способную к последующему размножению клона путем органогенеза или эмбриогенеза, можно трансформировать вектором настоящего изобретения. Используемый здесь термин органогенез означает процесс, по которому из меристиматического центра последовательно развиваются побеги и корни; используемый здесь термин эмбриогенез означает процесс, по которому побеги и корни развиваются вместе, согласованно (не последовательно), или из соматических клеток, или из гамет. Конкретная выбранная ткань будет меняться в зависимости от систем размножения клонов, доступных и наиболее подходящих для конкретного трансформируемого вида. Примерами тканей-мишеней являются листовые диски, пыльца, зародыши, семядоли, гипокотили, ткань каллюса, имеющаяся метистиматическая ткань (например, верхушечные меристемы, пазушные почки и корневые меристемы) и индуцированная меристематическая ткань (например, меристема семядоли и гипокотильная метистема).

Растения настоящего изобретения могут принимать множество форм. Растения могут представлять собой химеры трансформированных клеток и нетрансформированных клеток; растения могут быть клональными трансформантами (например, все трансформированные клетки содержат транскрипционную кассету); растения могут содержать привитые части трансформированных и нетрансформированных тканей (например, трансформированный корневой побег, привитый на нетрансформированный привой вида цитрусового растения). Трансформированные растения можно размножать многими способами, такими как размножение клона или классические методы выращивания. Например, первую генерацию (или Т1) трансформированных растений можно вырастить инбриндингом и получить гомозиготную вторую генерацию (или Т2) трансформированных растений, а затем растения Т2 размножать классическими методами выращивания. Для облегчения выращивания транскрипционную кассету можно соединить с доминантным селектируемым маркером (таким как ηρΐΙΙ).

В свете вышеуказанного, очевидно, что растения, которые можно использовать при практическом применении настоящего изобретения, включают растения рода ЫсоБапа.

Специалистам, знакомым с методами рекомбинантных ДНК, описанными выше, будет понятно, что для создания трансгенных клеток и растений табака можно использовать полноразмерную молекулу кДНК ХФРТазы или полноразмерный хромосомный ген ХФРТазы, присоединенный в смысловой ориентации, с соответствующими функционально соединенными регуляторными последовательностями. (Специалистам в этой области техники также будет понятно, что соответствующие регуляторные последовательности для экспрессии генов в смысловой ориентации включают любую из известных эукариотных последовательностей начала трансляции, в дополнение к промотору и последовательностям терминации полиаденилирования транскрипции, описанным выше.) Такие трансформированные растения табака характеризуются повышенным содержанием ХФРТазы и, таким образом, более высоким содержанием никотина, чем нетрансформированные контрольные растения табака.

Следовательно, следует иметь в виду, что использование последовательностей ДНК ХФРТазы для снижения или повышения содержания ХФРТ-фермента и, посредством этого, для снижения или повышения содержания никотина в растениях табака входит в объем настоящего изобретения.

Используемый здесь термин культура включает множество растений настоящего изобретения и одного и того же рода, выращенных вместе на участке для агрокультуры. Под участком для агрокультуры подразумевается обычная делянка или теплица. Таким образом, настоящее изобретение относится к способу получения культуры растений с измененной активностью ХФРТазы и, следовательно, с повышенным или пониженным содержанием никотина по сравнению с подобной культурой нетрансформированных растений того же вида и сорта.

Приведенные далее примеры даются для пояснения настоящего изобретения и не должны рассматриваться как его ограничение.

Пример 1. Выделение и секвенирование.

Здесь как ПОСЛЕД. № 1 представлена установленная последовательность кДНК ТоЬКО2 (Сопк1шд е! а1., Р1ап! Рйук., 93, 1203 (1990)), а расшифрованная аминокислотная последовательность представлена как ПОСЛЕД. № 2. Было предсказано, что расшифрованная аминокислотная последовательность представляет собой цитозолевый белок. Хотя гены растительной ХФРТазы не описаны, сравнение аминокислотной последовательности Ν1ΟΡΤΙ с базой данных банка генов (фиг. 3) показывает ограниченное подобие последовательностей с определенными бактериальными и другими белками; активность хинолятфосфорибозил-трансферазы (ХФРТазы) показана в случае генов 8. !урЫтигшт, Е. сой и Ν. !аЬасит. Кодированная ΝιΟΡΤΙ ХФРТаза имеет подобие с расшифрованным пептидным фрагментом, кодированным последовательностью Е8Т (метка экспрессионной последовательности) ЛгаЬИор818 (инвентарный номер банка генов Е20096), который может представлять часть гена ХФРТазы ЛгаЬ1бор818.

Пример 2. Гибридизация ίη зйи.

Для того, чтобы определить пространственное распределение транскрипта мРНК ТоЬКП2 в различных тканях корня, осуществляют гибридизацию ίη зйи в нетрансформированных растениях. Гибридизацию ίη δίΐιι антисмысловой цепи ТоЬКИ2 с мРНК ТоЬКИ2 в ткани корня проводят с использованием методов, описанных в Мсусго\\'Цх. Р1аШ Мо1. Бю1. Кер., 5, 242 (1987), и в διηίΐΐι е! а1., Р1аШ Мо1. Бю1. Кер., 5, 237 (1987). Корни семидневных всходов табака (Меойапа !аЬасит) фиксируют в забуференном фосфатом глутаральдегиде, заливают парапластом-плюс (Мооо)ес1 1пс., СентЛуис, Миссури) и делают срезы толщиной 8 мм, чтобы получить поперечные срезы, а также продольные срезы. Антисмысловые транскрипты ТоЬКИ2, синтезированные ίη νίΙΐΌ в присутствии 358-АТР, используют в качестве зондов. Меченную РНК перед применением гидролизуют путем обработки щелочью, и получают среднюю длину в 100-200 оснований.

Гибридизацию проводят в 50% формамиде в течение 16 ч при 42°С с меченной РНК с числом импульсов в минуту (чим) приблизительно 5х10⁶ на миллилитр раствора для гибридизации. После выдержки предметные стекла проявляют и рассматривают в светлом и темном поле микроскопа.

Сигнал гибридизации локализуется в кортикальном слое клеток в корнях (результаты не приводятся). Сравнение изображений одних и тех же срезов как в светлом, так и в темном поле показывает локализацию транскриптов ТоЬКИ2 в паренхиматозных клетках кортикального слоя корней. Сигнал гибридизации в эпидермисе или стеле не обнаруживается.

Пример 3. Содержание мРНК ТоЬКИ2 в мутантах табака ΝΚ1 и ΝΚ2 и корреляция с содержанием никотина.

Проверяют стационарное содержание мРНК ТоЬКИ2 в мутантах растений табака ΝΚ1 и Νίο2. Известно, что N^с 1 и ΝΚ2 регулируют активность хинолятфосфорибозил-трансферазы и активность путресценс-метилтрансферазы и являются кодоминантными регуляторами продуцирования никотина. Полученные результаты приводятся на фиг. 5А и 5Б и показывают, что экспрессия ТоЬКИ2 регулируется ΝΚ1 и ΝΚ2.

Выделяют РНК из корней растений табака Виг1еу 21 дикого типа (ΝΚ1/ΝΚ1 ΝΚ2/ΝΚ2): корней ΝΚ1^- Виг1еу 21 (шс1/шс1 ΝΚ2/ΝΚ2): корней ΝΚ2^- Виг1еу 21 (ΝΚ1/ΝΚ1 шс2/шс2) и корней ΝΚ1-ΝΚ2^- Виг1еу 21 (шс1/шс1 шс2/шс2).

Четыре линии табака Виг1еу 21 (шс) выращивают из семян в почве в течение месяца и на 1 месяц переносят в камеры для гидропоники в аэрированный питательный раствор в теплице. Эти линии являются изогенными, за исключением двух локусов с низким содержанием никотина, и имеют генотипы Νίο1/Νίο1 ΝΚ2/ΝΚ2, ΝΚ1/ΝΚ1 шс2/шс2, шс1/шс1 ΝΚ2/ΝΚ2, шс1/шс1 шс2/шс2.

Корни собирают у примерно 20 растений для каждого генотипа и объединяют для выделения РНК. Полную РНК (1 мкг) от каждого генотипа подвергают электрофорезу в 1% агарозном геле, содержащем 1,1 М формальдегида, и переносят на нейлоновую мембрану в соответствии с 8атЬтоок е! а1. (1989). Мембраны гибридизируют с фрагментами меченной ³²Р кДНК ТоЬКИ2. Относительную плотность транскриптов ТоЬКИ2 измеряют посредством денситометрии. Фиг. 5 (темные прямоугольники) показывает относительное содержание транскриптов (по сравнению с Νίο1/Νίο1 Νίο2/Νίο2) для каждого из четырех генотипов. Относительное содержание никотина (по сравнению с Νίο1/Νίο1Νίο2/Νίο2) в четырех генотипах показано заштрихованными прямоугольниками.

На фиг. 5 дается графическое сравнение относительного стационарного содержания мРНК ТоЬКИ2 с использованием содержания, обнаруженного в Виг1еу 21 дикого типа (ΝίΜ/ΝίΜ Νίο2/Νίο2), в качестве ссылочного количества. Содержание мРНК ТоЬКИ2 в двойных мутантах Νίο1/Νίο2 составляет приблизительно 25% от содержания в табаке дикого типа. На фиг. 5Б также сравнивается относительное содержание никотина в почти изогенных линиях табака, исследуемых в этом примере (темные прямоугольники показывают содержание транскрипта ТоЬКИ2; заштрихованные прямоугольники показывают содержание никотина). Существует тесная корреляция между содержанием никотина и содержанием транскрипта ТоЬКИ2.

Пример 4. Влияние прищипки верхушек на содержание мРНК ТоЬКИ2.

В технике хорошо известно, что удаление цветочной головки растения табака (прищипка верхушки) усиливает рост корней и повышает содержание никотина в листьях растения. Прищипка верхушки растения является обычной практикой при выращивании табака, и специалист в этой области техники может легко определить оптимальное время для прищипки верхушки данного растения табака при известном наборе условий.

Растения табака (Ν. !аЬасит 8К1) в течение месяца выращивают из семян в почве и переносят в горшки, содержащие песчаную почву. Растения еще в течение 2 месяцев выращивают в теплице до тех пор, пока они не начинают образовывать цветки. Затем у четырех растений удаляют цветочные головки и два узла (прищипка верхушек). Через определенное время часть корней от каждого растения собирают и объединяют для экстракции РНК. Контрольные растения не прищипывают. Полную РНК (1 мкг) на каждый момент времени подвергают электрофорезу в 1% агарозном геле, содержащем 1,1 М формальдегида, и переносят на нейлоновую мембрану в соответствии с ЗатЬгоок е! а1. (1989). Мембраны гибридизируют с фрагментами меченной ³²Р кДНК ТоЬРЭ2. Относительную плотность транскриптов измеряют посредством денситометрии. Фиг. 6 иллюстрирует относительное содержание транскрипта (по сравнению со временем ноль) для каждого отмеченного времени при прищипке верхушек (темные прямоугольники) и без прищипки (заштрихованные прямоугольники).

Относительное содержание ТоЬКЭ2 в ткани корней определяют через 24 ч; результаты приводятся на фиг. 6 (темные прямоугольники показывают содержание транскрипта ТоЬКЭ2 в прищипанных растениях; заштрихованные прямоугольники показывают содержание транскрипта ТоЬКЭ2 в неприщипанных контрольных растениях). В течение 6 ч после прищипки верхушек растений табака содержание мРНК ТоЬКЭ2 в прищипанных растениях возрастает приблизительно в 8 раз; в контрольных растениях за это же время возрастания не наблюдается.

Пример 5. Комплементация бактериального мутанта, лишенного ХФРТазы с ДНК ПОСЛЕД № 1.

Штамм ЕксйейсЫа сой ТН265 является мутантом, лишенным хинолятфосфорибозилтрансферазы (пабС^-) , и поэтому не может расти на среде, лишенной никотиновой кислоты.

Клетки ТН265 трансформируют экспрессионным вектором (рУЗ161), содержащим ДНК ПОСЛЕД № 1, или трансформируют только экспрессионным вектором (рКК233). Рост трансформированных бактерий сравнивают с ростом трансформантов ТН265 (рКК233) и с ростом нетрансформированного мутанта ТН265 пабС^-. Рост сравнивают на минимальной среде МЕ (лишенной никотиновой кислоты) и на минимальной среде МЕ с добавлением никотиновой кислоты.

Штамм Е. сой с мутацией ХФРТазы (пабС) ТН265 любезно предоставлен д-ром К.Т. Нидйек (Нидйек е! а1., 1. Вас!., 175:479 (1993). Клетки хранятся на среде ЬВ, а компетентные клетки получают так, как описано в ЗатЬгоок е! а1. (1989). Экспрессионную плазмиду создают в рКК2233 (Втокшк, 1984) с кДНК ТоЬКО2, клонированной под контролем Тас-промотора. Полученную плазмиду рУЗ161 трансформируют в клетки ТН265. Затем трансформированные клетки высевают на агаровые пластины в минимальную среду (Уоде1 апб Вопиет, 1956) без никотиновой кислоты или с добавлением никотиновой кислоты (0,0002%). На подобные пластины для использования в качестве контроля высевают одни клетки ТН265 и клетки ТН265, трансформированные рКК2233.

Результаты приводятся на фиг. 4. Только клетки ТН265, трансформированные ДНК ПОСЛЕД. № 1, растут на среде, лишенной никотиновой кислоты. Эти результаты показывают, что экспрессия ДНК ПОСЛЕД. № 1 в бактериальных клетках ТН265 придает этим клеткам фенотип №1бСчто подтверждает, что эта последовательность кодирует ХФРТазу. Поэтому название ТоЬКЭ2 заменяют на Ы!ОРТ1.

Пример 6. Трансформация растений табака.

ДНК ПОСЛЕД. № 1, в антисмысловой ориентации, функционально связана с растительным промотором (35З СаМУ или специфическим для кортекса корней промотором ТоЬКЭ2), и получают две различные ДНКкассеты: промотор СаМУ35З/антисмысловая ПОСЛЕД. № 1 и промотор ТоЬКЭ2/антисмысловая ПОСЛЕД. № 1.

Отбирают для трансформации линию табака дикого типа и линию табака с низким содержанием никотина, например, табак дикого типа Виг1еу 21 (№с1⁺/№с2⁺) и гомозиготный Виг1еу 21 шс1^-/шс2^-. Трансформируют много клеток растений табака от каждой линии с использованием каждой содержащей ДНК кассеты. Трансформацию проводят с использованием вектора АдгоЬас!епит, например, бинарного вектора АдгоЬас!етшт, несущего Т1пограничные последовательности и ген пр!11 (придающий устойчивость к канамицину и под контролем пок-промотора (пр!11)).

Трансформированные клетки отбирают и регенерируют в трансгенные растения табака (К₀). Растения К₀ выращивают до зрелости и проверяют на содержание никотина; подгруппа трансформированных растений табака обнаруживает существенно сниженное содержание никотина по сравнению с нетрансформированными контрольными растениями.

Затем растения Ко размножают инбриндингом, и анализируют расщепление трансгена в потомстве К. Потомство Κι выращивают до зрелости и размножают инбриндингом; расщепление трансгена в потомстве К₂ указывает, что растения Κ1 являются гомозиготными.

Список последовательностей (1) ОБЩАЯ ИНФОРМАЦИЯ (I) ЗАЯВИТЕЛЬ: СопкИпд, Магк А.

Мепс1и, Νβάίηί (II) НАЗВАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ: Регуляция экспрессии хинолятфосфорибозил трансферазы (III) ЧИСЛО ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ: 4 (IV) АДРЕС ДЛЯ КОРРЕСПОНДЕНЦИИ:

САААААСТАТ ТГТССАСААА АПСАПТСА СААССССССС АААААААААС С АТ6 ТГТ 57 Ме! РЬе

АСА ССТ АТТ ССТ КС АСТ ССТ АСА СТС САТ ССТ ТАТ ССА АТТ АСА ССТ105

Агд А1а Не Рго РЬе ТЬг А1а ТЬг Уа1 Ж$ Рго Туг А1а Не ТЬг А1а

1015

ССА АСС Кб СТС 6Т6 ААА АТС ТСА ССА АТА ССС АСС ААС ААТ АСА АСА153

Рго Агд Ьеи \/а1 УаТ Ьуз Ме! Зег А1а Не А1а ТЬг Ьуз Азп ТЬгАгд

2530

СТС САС ТСА КА САС СТС ААА ССА ССА ССА САС ССА АСТ ТАТ САТ КА201

Уа1 61 и Зег Ьеи 61 и Уа1 Ьуз Рго Рго А1а Ж 5 Рго ТЬг Туг АзрЬеи

40 4550

АА6 САА 6К АТС ААА СК ССА СТС ТСТ 6АА САТ 6СТ 666 ААТ КА 66А249

Ьуз 61и Уа1 Ме! Ьуз Ьеи А1а Ьеи 5ег 61иЛ5р А1а 61у Азп Ьеи61у

6065

САТ 6Т6 АСТ Т6Т ААС 6С6 АСА АК ССТ СК 6АТ АТ6 6АА ТСС 6АТ 6СТ297

Азр Уа1 ТЬг Суз Ьуз А1а ТЬг Не Рго Ьеи Азр Ме! 61и Зег АзрА1а

7580

САТ КТ СТА 6СА АА6 6АА САС 666 АТС АТА 6СА 66А АК 6СА СТТ 6СТ 345 (А)

АДРЕСАТ: КеппеДЬ 31Ыеу, Ве11 5е1!гег Рагк & (э1Ьзоп

(Б)	УЛИЦА	: Роз! О££1се Огаиег 34009
(В)	ГОРОД	: СЬаг1о!Ье
(Г)	ШТАТ:	Северная Каролина
(Д)	СТРАНА: США
(Е)	2ΙΡ: '	28234

Жз

РЬе Ьеи

А1а

Ьуз

61 и

Азр

61у

Не

Не

А1а

61у

Не

А1а

Ьеи

А1а

85

90

95

6А6

АТ6 АТА

КС

6С6

САА

6К

6АТ

ССТ

ТСА

КА

АА6

6Т6

6А6

Т66

ТАТ

393

61и

Ме! Не

РЬе

А1а

61 и

Уа1

Азр

Рго

5ег

Ьеи

Ьуз

Уа1

61 и

Тгр

Туг

100

105

по

6ТА

ААТ 6АТ

66С

6АТ

ААА

6К

САТ

ААА

66С

Кб

ААА

ТГТ

66С

ААА

6ТА

441

Уа1

Азп Азр

61у

Азр

Ьуз

Уа1

Ж 5

Ьуз

61у

Ьеи

Ьуз

РЬе

61у

Ьуз

Уа1

115

Д20

125

130

САА

66А ААС

6СТ

ТАС

ААС

АК

6К

АТА

6СТ

6А6

А66

6К

6К

СТС

ААТ

489

61п

61у Азп

А1а

Туг

Азп

11е

Уа1

Пе

А1а

61 и

Агд

Уа1

Уа1

Ьеи

Азп

135

140

145

(V) ФОРМА КОМПЬЮТЕРНОГО СЧИТЫВАНИЯ:

(А)

ТИП СРЕДЫ: дискета

ТГТ АТС САА А6А АТС А6Т.66А АТА 6СТ АСА СТА АСТ ААС 6АА АТ6 6СА 537

РЬе Ме! 61 п Агд Ме! Зег 61у Не А1а ТЬг Ьеи ТЬг Ьуз 61 и Ме! А1а

150 155 160 (Б)

КОМПЬЮТЕР: совместимый с системой ΙΒΜ РС

ОПЕРАЦИОННАЯ СИСТЕМА: РС-ООЗ/МЗ-ООЗ (Г)

ПРОГРАММНОЕ ОБЕСПЕЧЕНИЕ: Ра!еп!1п

Неа1еазе #1.0, версия #1.30 (VI) СВЕДЕНИЯ О ТЕКУЩЕЙ ЗАЯВКЕ:

(А)

НОМЕР ЗАЯВКИ:

(В) (В)

ДАТА РЕГИСТРАЦИИ: КЛАССИФИКАЦИЯ:

(VIII) ИНФОРМАЦИЯ О ПОВЕРЕННОМ/АГЕНТЕ:

6АТ 6СТ ОСА САС ССТ ССТ ТАС АТС Кб 6А6 АСТ А66 ААА АСТ 5СТ ССТ585

Азр А1а А1а Ж5 Рго А1а Туг Не Ьеи 61и ТЬг Агд Ьуз ТЬг А1а Рго

165 170175

66А КА С6Т Кб 6Т6 6АТ ААА Т66 6С6 6ТА ТТ6 АТС 66Т 666 666 АА6633

61у Ьеи Агд Ьеи Уа1 Азр Ьуз Тгр А1а Уа1 Ьеи Не 61у 61у 61уЬуз

180 185190

ААТ САС А6А АТ6 66С КА ТГТ 6АТ АТ6 6ТА АТ6 АТА ААА 6АС ААТ САС681

Азп Жз Агд Ме! 61у Ьеи РЬе Азр Ме! Уа1 Ме! Не Ьуз Азр АзпН1з

195 200 205210

АТА ТСТ 6СТ 6СТ 66А 66Т 6ТС 66С ААА 6СТ СТА ААА ТСТ 6Т6 6АТ СА6729

Не Зег А1а А1а 61у 61у Уа1 61у Ьуз А1а Ьеи Ьуз Зег Уа1 Азр61п

215 220225

ТАТ Кб 6А6 САА ААТ ААА СК САА АТА 666 6К 6А6 6П 6АА АСС А66777

Туг Ьеи 61 и 61 п Азп Ьуз Ьеи 61п Не 61у Уа1 61и Уа1 61 и ТЬгАгд

230 235240

АСА АК 6АА 6АА 6ТА ССТ 6А6 6К СТА 6АС ТАТ 6СА ТСТ САА АСА АА6825

ТЬг Не 61и 61 и Уа1 Агд 61и Уа1 Ьеи Азр Туг А1а Зег 61п ТЬгЬуз

245 250255 (А)

ИМЯ: 51Ыеу, КеппекЬ Э.

РЕГИСТРАЦИОННЫЙ НОМЕР: 31665 (В)

НОМЕР ДЕЛА/РЕЕСТРА: 5051-338Р

АСТ ТСб Кб АСТ Абб ΑΤΑ АТ6 СТ6 6АС ААТ АТ6 6К 6К ССА КА ТСТ 873

ТЬг

Зег

Ьеи

ТЬг

Агд

Пе

Ме!

Ьеи

Азр Азп

Ме!

Уа1

Уа1

Рго

Ьеи

Зег

260

265

270

ААС

66А

6АТ

АК

6АТ

6ТА

ТСС

АТ6

СК АА6

6А6

6СТ

6ТА

6АА

Кб

АТС

921

Азп

61у

Азр

Не

Азр

Уа1

Зег

Ме!

Ьеи Ьуз

61 и

А1а

Уа1

61 и

Ьеи

11е

275

280

285

290

(IX) ТЕЛЕКОММУНИКАЦИОННАЯ ИНФОРМАЦИЯ:

(А) ТЕЛЕФОН: 919-420-2200 (Б) ТЕЛЕФАКС: 919-881-3175 (2) ИНФОРМАЦИЯ О ПОСЛЕД. № 1 (I) ХАРАКТЕРИСТИКИ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ:

(A) ДЛИНА: 1399 пар оснований (Б) ТИП: нуклеиновая кислота (B) ЧИСЛО ЦЕПОЧЕК: одноцепочечная (Г) ТОПОЛОГИЯ: линейная (II) ТИП МОЛЕКУЛЫ: кДНК (IX) ПРИЗНАК:

(А) ИМЯ/КЛЮЧ: СЭ5 (Б) ЛОКАЦИЯ: 52..1104 (XI) ОПИСАНИЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ: ПОСЛЕД. Ν’ 1

ААТ 666 А66 КТ 6АТ АСб 6А6 6СТ ТСА 66А ААТ 6К АСС СК 6АА АСА969

Азп 61у Агд РЬе Азр ТЬг 61и А1а Зег 61у Азп Уа1 ТЬг Ьеи 61и ТЬг

295 . 300305

6ТА САС АА6 АК 66А САА АСТ 66Т 6К АСС ТАС АК ТСТ А6Т 66Т 6СС1017

Уа1 Жз Ьуз Не 61у 61п ТЬг 61у Уа1 ТЬг Туг Не Зег Зег 61уА1а

310 315320

СТб АС6 САТ ТСС 6Т6 ААА 6СА СТТ 6АС АК ТСС СТ6 АА6 АТС 6АТ АСА1065

Ьеи ТЬг Н1з Зег Уа1 Ьуз А1а Ьеи Азр Не Зег Ьеи Ьуз Не АзрТЬг

325 330335

6А6 СТС 6СС СК 6АА 6К 66А А66 С6Т АСА ААА С6А 6СА Т6А6С6ССАТ 1114 61и Ьеи А1а Ьеи 61и Уа1 61у Агд Агд ТЬг Ьуз Агд А1а

340 345350

ТАСКСТ6СТ АТА666К66 А6ТАААА6СА 6СТ6ААТА6С Т6ААА66Т6С АААТАА6ААТ1174

САТТКАСТА 6К6ТСАААС АААА6АТССТ ТСАСТ6Т6ТА АТСАААСААА АА6АТ6ТААА1234

К6СТ66ААТ АТСТСА6АТ6 6СТСТПТСС ААССТТАК6 СК6А6ТТ66 ТААГГТСАК1294

АТА6СПТ6Т ТКСАТ6ТК САТ66ААТГТ 6КАСААТ6А АААТАСТТ6А ΤΚΑΤΑΑ6Κ1354

Т66Т6ТАТ6Т ААААКСТ6Т 6КАСКСАА АТАТТК6А6 АТ6К1399 (2) ИНФОРМАЦИЯ О ПОСЛЕД. № 2 (I) ХАРАКТЕРИСТИКИ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ:

(А) ДЛИНА: 351 аминокислота (Б) ТИП: аминокислота (Г) ТОПОЛОГИЯ: линейная (II) ТИП МОЛЕКУЛЫ: белок (XI) ОПИСАНИЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ: ПОСЛЕД. № 2

Ме1

РЬе

Агд

А1а

Не

Рго

РЬе

ТЬг

А1а

ТЬг

УаТ

Н1з

Рго

Туг

АТа

Пе

1

5

10

15

ТЬг

А1а

Рго

Агд

Ьеи

УаТ

Уа1

Ьуз

МеЬ

5ег

АТа

Пе

А1 а

ТЬг

Ьуз

Азп

20

25

30

ТЬг

Агд

Уа1

61 и

Зег

Ьеи

61 и

УаТ

Ьуз

Рго

Рго

А1а

Нтз

Рго

ТЬг

Туг

35

40

45

Азр

Ьеи

Ьуз

61 и

Уа1

МеЬ

Ьуз

Ьеи

А1 а

Ьеи

5ег

61и

Азр

А1а

61у

Азп

50

55

60

Ьеи 65

61у

Азр

УаТ

ТЬг

Суз 70

Ьуз

АТа

ТЬг

Не

Еро- 75

Ьеи

Азр

МеЬ

61 и

5ег 80

Азр

А1а

Нтз

РЬе

Ьеи 85

АТа

ЬУЗ

61 и

Азр

61у 90

Пе

Пе

А1 а

61у

Пе 95

А1 а

Ьеи

АТа

61 и

МеЬ

Пе

РЬе

А1а

61 и

УаТ

Азр

Рго

5ег

Ьеи

Ьуз

УаТ

61 и

100

105

110

Тгр

Туг

УаТ 115

Азп

Азр

61у

Азр

Ьуз 120

УаТ

Нтз

Ьуз

61у

Ьеи 125

Ьуз

РЬе

61у

Ьу5

Уа1

61 п

61 у

Азп

А1а

Туг

Азп

Не

Уа1

Пе

АТа

61 и

Агд

Уа1

Уа1

130

135

140

Ьеи

Азп

РЬе

МеЬ

61 п

Агд

МеЬ

5ег

61у

Не

А1а

ТЬг

Ьеи

ТЬг

Ьуз

61и

145

150

155

160

МеЬ

А1а

Азр

А1а

А1 а

Н15

Рго

АТа

Туг

Не

Ьеи

61 и

ТЬг

Агд

ьуз

ТЬг

165

170

175

А1а Рго 61 у Ьеи Агд

180

Е1у Ьуз Азп Н15 Агд 195

Азп Нтз Пе 5ег АТа

210

Ьеи	УаТ	Азр	Ьуз Тгр 185	АТа	УаТ	Ьеи	Пе 190	61у	61у
МеЬ	61у	Ьеи	РЬе Азр	МеЬ	УаТ	МеЬ	Пе	Ьуз	Азр
	200			205
АТа	61у	61у	УаТ 61у	Ьуз	А1 а	Ьеи	ьуз	Зег	УаТ
	215			220

Азр 61 п Туг Ьеи 61 и 61 п Азп Ьуз 1еи 225 230

ТЬг Агд ТЬг Не 61и В1и УаТ Агд В1и

245

61п Не 61у Уа1 61и Уа1 61и

235 240

Уа1 1_еи Азр Туг А1а Зег 31 п

250 255

ТНг Ьуз ТЬг Зег Ьеи ТЬг Агд

260

Пе МеЬ Ьеи Азр Азп МеЬ Уа1 УаТ 265 270

Рго

Ьеи Зег Азп 61у Азр Пе Азр Уа1 Зег МеЬ Ьеи Ьуз 61и АТа Уа1

275 280 285 и

Ьеи

Не

Абп

61у

Агд

РЬе

Азр

ТЬг

61и

АТа

Зег

61у

Азп

Уа1

ТЬг

Ьеи

290

295

300

61 и

ТЬг

Уа1

Н15

Ьуз

11е

61у

61п

ТЬг

61у

УаТ

ТЬг

Туг

Пе

Зег

Зег

305

310

315

320

61 у

АТа

Ьеи

ТЬг

Н1$

Зег

Уа1

Ьуз

А1а

Ьеи

Азр

Не

Зег

Ьеи

Ьуз

Не

325

330

335

Азр

ТЬг

61 и

Ьеи

АТа

Ьеи

61 и

Уа1

61у

Агд

Агд

ТЬг

Ьуз

Агд

А1а

340

345

350

(2) ИНФОРМАЦИЯ О ПОСЛЕД. № 3 (I) ХАРАКТЕРИСТИКИ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ:

(A) ДЛИНА: 1053 пар оснований (Б) ТИП: нуклеиновая кислота (B) ЧИСЛО ЦЕПОЧЕК: одноцепочечная (Г) ТОПОЛОПИЯ: линейная (II) ТИП МОЛЕКУЛЫ: кДНК (XI)„ОПИСАНИЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ: ПОСЛЕД. № 3

АТ6ТТТАВАВ СТАТТССТГТ САСТ6СТАСА ВТВСАТССТТ АТВСААТТАС А6СТССАА6660

ТТВ6ТВ6Т6А АААТ6ТСА6С ААТАВССАСС ААВААТАСАА 6А5Т66АДТС АТТАВА66Т6120

АААССАССАВ САСАСССААС ТТАТЗАТТТА АА66ААВТТА ТВАААСТТВС АСТСТСТЗАА180

ВАТ6СТ66ВА АТГТА66А6А Т6Т6АСТТВТ ААВВСВАСАА ТГССТСТГВА ТАТСЗААТСС240

ВАТВСТСАТТ ТТСТАВСААА В6АА6АС6В6 АТСАТАЗСАЕ ВААТТВСАСТ Т6СТ6АЗАТ6300

АТАТТС6С63 ААВП6АТСС ТТСАТТАААВ 6Т63АЕТ66Т АТ6ТАААТ6А Т66С6АТААА 360 ВТТСАТАААВ ВСТТВАААТТ ТВВСААА6ТА СААВВАААСВ СТТАСААСАТ ТВТТАТАВСТ 420 6А6А6В6ТТ6 ТТСТСААТТТ ТАТВСАААВА АТВА6Т66АА ТА6СТАСАСТ ААСТААВВАА 480 АТ63СА6АТ6 СТ6САСАССС Т6СТТАСАТС ТТВВАВАСТА В6ААААСТВС ТССТВВАТТА 540 сбтттейтсе атааатвввс встаттватс езтеазебЗА аваатсасав аатвввстта боо ТГТВАТАТВВ ТААТ6АТААА АЙАСААТСАС АТАТСТ6СТ6 СТСВАВВТВТ С66САААССТ 660 СТААААТСТ6 ТВВАТСАВТА ТТТВВАВСАА ААТАААСТТС АААТА666БТ ТВАВВТТВАА 720 АССАЕВАСАА ТГВААВААВТ АСВТВАВВТТ СТАЗАСТАТ6 САТСТСАААС ААА6АСТТС6 780 ТТВАСТАВВА ТААТЗСТ66А СААТАТ66ТТ ВТТССАТТАТ СТААСВВАВА ТАТТВАТВТА 840 ТССАТЕСПА А&ЙАВ6СТ6Т А6ААТТВАТС ΑΑΤΒ6ΒΑ66Τ ТТВАТАС6ВА ВВСТТСАВВА 900 ААТВТТАССС ТТВАААСАВТ АСАСААВАП ВВАСАААСТВ ВТВТТАССТА САТТТСТАЕТ 960 ВВТВСССТВА СВСАТТССВТ ВАААВСАСТТ ВАСАТТТССС Т6АА6АТС6А ТАСАВАВСТС 1020 ВСССТТ6АА6 ТТ66ААВ6С6 ТАСААААСВА ВСА 1053

Claims (46)

1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

   1. Выделенная молекула ДНК, кодирующая хинолятфосфорибозил-трансферазу (ХФРТазу) растения табака, выбранная из группы, включающей (а) ДНК с последовательностью БЕО ΙΌ N0:1, приведенной в Перечне последовательностей;

   (б) ДНК, кодирующую фермент ХФРТазу растения табака с аминокислотной последовательностью БЕО ΙΌ N0:2, приведенной в Перечне последовательностей;

   (в) ДНК, которая гибридизуется с указанными в (а) или (б) молекулами ДНК в жестких условиях, определяемых жесткостью промывки в 0,3 М №С1, 0,03 М цитрата натрия и 0,1% 8Ό8 при 70°С;

   (г) ДНК, отличающуюся от указанных в (а) или (б) молекул ДНК вследствие вырожденности генетического кода; и (д) ДНК, содержащую по крайней мере 30 последовательно расположенных нуклеотидов БЕО ΙΌ ^:1.
2. 2. Выделенная ДНК по п.1, отличающаяся тем, что характеризуется последовательностью 8ЕО ΙΌ NО:1, приведенной в Перечне последовательностей.
3. 3. Выделенная ДНК по п.1, отличающаяся тем, что кодирует фермент ХФРТазу растения табака с аминокислотной последовательностью 8ЕО ΙΌ N0:2, приведенной в Перечне последовательностей.
4. 4. Выделенная ДНК по п.1, отличающаяся тем, что гибридизуется в жестких условиях, определяемых жесткостью промывки в 0,3 М №С1, 0,03 М цитрата натрия и 0,1% 8Ό8 при 70°С, с последовательностями по пп.2-3.
5. 5. Выделенная ДНК по п.1, отличающаяся от последовательностей по пп.2-3 вследствие вырожденности генетического кода.
6. 6. Выделенная молекула ДНК, кодирующая хинолятфосфорибозил-трансферазу (ХФРТазу) растения табака, содержащая по крайней мере 30 последовательно расположенных нуклеотидов БЕЕ) ΙΌ ^:1.
7. 7. Выделенная молекула ДНК, кодирующая хинолятфосфорибозил-трансферазу (ХФРТазу) растения табака, содержащая по крайней мере

   50 последовательно расположенных нуклеотидов 8ЕО ΙΌ N0:1.
8. 8. Экзогенная ДНК-конструкция, включающая экспрессионную кассету, содержащую в направлении 5'-3' промотор, функционирующий в растительной клетке, и ДНК по п.1, расположенную ниже указанного промотора и функционально связанную с ним.
9. 9. Экзогенная ДНК-конструкция, включающая экспрессионную кассету, содержащую в направлении 5'-3' промотор, функционирующий в растительной клетке, и ДНК по п.1, расположенную ниже указанного промотора и функционально связанную с ним, причем указанная ДНК располагается в антисмысловой ориентации.
10. 10. Экзогенная ДНК-конструкция, содержащая в направлении 5'-3' промотор, функционирующий в растительной клетке, и ДНК, кодирующую хинолятфосфорибозил-трансферазу табака, имеющую последовательность 8Е0 ΙΌ NО:1, причем указанная ДНК функционально связана с указанным промотором.
11. 11. Экзогенная ДНК-конструкция, содержащая в направлении 5'-3' промотор, функционирующий в растительной клетке, и ДНК, кодирующую хинолятфосфорибозил-трансферазу табака, имеющую последовательность 8Е0 ΙΌ NО:1, причем указанная ДНК располагается в антисмысловой ориентации и функционально связана с указанным промотором.
12. 12. Экзогенная ДНК-конструкция, включающая экспрессионную кассету, содержащую в направлении 5'-3' промотор, функционирующий в растительной клетке, и ДНК, содержащую по крайней мере 50 последовательно расположенных нуклеотидов 8Е0 ΙΌ NО:1, расположенную ниже указанного промотора и функционально связанную с ним.
13. 13. Экзогенная ДНК-конструкция по любому из пп.8-12, отличающаяся тем, что указанный промотор конститутивно активен в растительных клетках.
14. 14. Экзогенная ДНК-конструкция по любому из пп.8-12, отличающаяся тем, что указанный промотор селективно активен в клетках ткани корней растения.
15. 15. Экзогенная ДНК-конструкция по любому из пп.8-12, отличающаяся тем, что указанный промотор селективно активен в клетках коры корней растения.
16. 16. Экзогенная ДНК-конструкция по любому из пп.8-12, отличающаяся тем, что указанная конструкция представляет собой плазмиду.
17. 17. Вектор для трансформации растений, включающий ДНК-конструкцию по любому из пп.8-12.
18. 18. Вектор для трансформации растений, включающий ДНК-конструкцию по любому из пп.8-12, представляющий собой вектор на основе ЛдюЬасГепит ШтсГааспк.
19. 19. Трансгенное растение, содержащее ДНК-конструкцию по любому из пп.8-12.
20. 20. Трансгенная растительная клетка, содержащая ДНК-конструкцию по любому из пп.8-12.
21. 21. Выделенный фермент хинолятфосфорибозил-трансфераза растения табака, кодируемый последовательностью ДНК, указанной в (а), (в) и (г) по п.1.
22. 22. Выделенный фермент хинолятфосфорибозил-трансфераза растения табака, имеющий аминокислотную последовательность 8Е0 ΙΌ N0:2.
23. 23. Способ получения трансгенных растительных клеток с пониженной экспрессией хинолятфосфорибозил-трансферазы (ХФРТазы), включающий получение растительных клеток, способных экспрессировать хинолятфосфорибозилтрансферазу; и трансформацию указанных растительных клеток экзогенной ДНК-конструкцией по любому из пп.8-16 с получением трансгенных клеток, имеющих пониженную экспрессию ХФРТазы по сравнению с нетрансформированными клетками.
24. 24. Способ по п.23, отличающийся тем, что указанная растительная клетка является клеткой МсоБапа 1аЬаеит.
25. 25. Способ по п.23, отличающийся тем, что стадию трансформации осуществляют путем бомбардировки растительных клеток микрочастицами, несущими указанную ДНКконструкцию.
26. 26. Способ по п.23, отличающийся тем, что стадию трансформации осуществляют путем инфицирования растительных клеток бактериями ЛдгоЬас1епит 1итсГас1Спк. содержащими Τίплазмиду, несущую указанную ДНКконструкцию.
27. 27. Способ по п.23, отличающийся тем, что указанные растительные клетки экспрессируют эндогенную матричную РНК хинолятфосфорибозил-трансферазы (мРНК ХФРТазы), при том, что ДНК в составе указанной конструкции комплементарна указанной мРНК ХФРТазы в области, выбранной из (а) 5'-нетранслируемой последовательности указанной мРНК ХФРТазы;

    (б) 3'-нетранслируемой последовательности указанной мРНК ХФРТазы и (в) транслируемой области указанной мРНК ХФРТазы.
28. 28. Способ по п.23, отличающийся тем, что указанные растительные клетки экспрессируют эндогенную матричную РНК хинолятфосфорибозил-трансферазы (мРНК ХФРТазы), при том, что ДНК в указанной конструкции комплементарна по меньшей мере 200 нуклеотидам указанной мРНК ХФРТазы.
29. 29. Способ получения трансгенного растения с пониженной экспрессией ХФРТазы, включающий получение растительных клеток по любому из пп.23 и 24 и регенерацию из них трансгенного растения.
30. 30. Способ получения трансгенных семян растения табака, включающий культивирование трансгенного растения по п.19, представляющего собой растение табака, с получением семян из трансгенного растения табака.
31. 31. Трансгенное растение вида Меойапа с пониженной экспрессией хинолятфосфорибозил-трансферазы (ХФРТазы) относительно нетрансформированного контрольного растения, полученное способом по п.29.
32. 32. Потомство трансгенного растения по п.31.
33. 33. Семена трансгенного растения вида Меойапа с пониженной экспрессией хинолятфосфорибозил-трансферазы (ХФРТазы) относительно нетрансформированного контрольного растения, причем указанное трансгенное растение является растением по п.31 или его потомством по п.32.
34. 34. Множество растений по п.31, выращенных вместе на сельскохозяйственном поле.
35. 35. Способ снижения экспрессии гена хи- нолятфосфорибозил-трансферазы в растительной клетке, включающий трансформацию растительной клетки экзогенной ДНКконструкцией по любому из пп.8-16, при том, что ДНК в составе указанной конструкции комплементарна мРНК хинолятфосфорибозилтрансферазы, эндогенной для указанной клетки, за счет чего транскрипция указанной комплементарной ДНК снижает экспрессию указанного гена хинолятфосфорибозил-трансферазы.
36. 36. Способ получения растения вида Меойапа с пониженным содержанием никотина в листьях указанного растения, включающий выращивание растения вида Меойапа или его потомства, причем указанное растение содержит клетки, трансформированные экзогенной ДНК-конструкцией по любому из пп.8-16, при том что ДНК в составе указанной конструкции комплементарна эндогенной матричной РНК хинолятфосфорибозил-трансферазы в указанных клетках.
37. 37. Способ получения трансгенных растительных клеток с повышенной экспрессией хинолятфосфорибозил-трансферазы (ХФРТазы), включающий получение растительных клеток, способных экспрессировать хинолятфосфорибозилтрансферазу; и трансформацию указанных растительных клеток экзогенной ДНК-конструкцией по любому из пп.8-16 с получением трансгенных клеток, имеющих повышенную экспрессию ХФРТазы по сравнению с нетрансформированными клетками.
38. 38. Трансгенное растение вида N Кобана с повышенной экспрессией хинолятфосфорибозил-трансферазы (ХФРТазы) относительно нетрансформированного контрольного растения, причем указанное трансгенное растение содержит растительные клетки, трансформированные экзогенной ДНК-конструкцией по любому из пп.8-16 и имеющие повышенную экспрессию ХФРТазы по сравнению с нетрансформированными клетками.
39. 39. Потомство трансгенного растения по п.38.
40. 40. Способ повышения экспрессии гена хинолятфосфорибозил-трансферазы в растительной клетке, включающий трансформацию растительной клетки экзогенной ДНКконструкцией по любому из пп.8-16.
41. 41. Способ по п.40, отличающийся чем, что указанную растительную клетку получают интеграцией указанной экзогенной ДНКконструкции в геном растительной клеткихозяина.
42. 42. Способ получения растения вида Меойаиа с повышенным содержанием никотина в листьях указанного растения, включающий выращивание растения вида Меойаиа или его потомства, причем указанное растение содержит клетки, трансформированные экзогенной ДНК-конструкцией по любому из пп.8-16.
43. 43. Трансгенное растение табака Меойапа 1аЬаеиш, содержащее экзогенную ДНКконструкцию по п.12.
44. 44. Табачный продукт, полученный из трансгенного растения табака, содержащего экзогенную ДНК-конструкцию по любому из пп.8-16.
45. 45. Табачный продукт, полученный из трансгенного растения табака, содержащего экзогенную ДНК-конструкцию по п.12.
46. 46. Способ получения табачного продукта со сниженным уровнем никотина, включающий получение трансгенного растения табака по п.43 и получение указанного табачного продукта из указанного растения табака.