CZ297379B6 - Izolovaná DNA molekula, DNA konstrukt, rostlinná bunka a transgenická rostlina, peptid, zpusob prípravy transgenické rostlinné bunky, osivo transgenické rostliny, zpusob produkce tabákové rostliny a zpusob snízení a zvýsení exprese genu - Google Patents

Abstract

Izolovaná DNA molekula obsahující sekvenci volenou ze skupiny zahrnující: (e) SEQ ID c.: 1 (f) DNA sekvence, které kódují enzym mající aminokyselinovou sekvenci SEQ ID c.: 2 (g) DNA sekvence, které hybridizují na izolovanou DNA podle (a) nebo (b) uvedenou výse a které kódují enzym chinolát-fosforibosyl-transferázu; a (h) DNA sekvence, které se lisí od DNA podle (a), (b) nebo (c) uvedených výse, díky degeneraci genetického kódu, a které kódují enzym chinolát-fosforibosyl-transferázu, a konstrukty obsahující uvedenou DNA. Zpusoby zmeny exprese chinolát-fosforibosyl-transferázy.

Description

(54) Název vynálezu:

Izolovaná DNA molekula, DNA konstrukt, rostlinná buňka a transgenická rostlina, peptid, způsob přípravy transgenické rostlinné buňky, osivo transgenické rostliny, způsob produkce tabákové rostliny a způsob snížení a zvýšení exprese genu (57) Anotace:

Izolovaná DNA molekula obsahující sekvenci volenou ze skupiny zahrnující:

(e) SEQ ID č.: 1 (f) DNA sekvence, které kódují enzym mající aminokyselinovou sekvenci SEQ ID č.: 2 (g) DNA sekvence, které hybridizují na izolovanou DNA podle (a) nebo (b) uvedenou výše a které kódují enzym chinolát-fosforibosyl-transferázu; a (h) DNA sekvence, které se liší od DNA podle (a), (b) nebo (c) uvedených výše, díky degeneraci genetického kódu, a které kódují enzym chinolát-fosforibosyl-transferázu, a konstrukty obsahující uvedenou DNA.

Způsoby změny exprese chinolát-fosforibosyl-transferázy.

Xys.

Izolovaná DNA molekula, DNA konstrukt, rostlinná buňka a transgenická rostlina, peptid, způsob přípravy transgenické rostlinné buňky, osivo transgenické rostliny, způsob produkce tabákové rostliny a způsob snížení a zvýšení exprese genu

Oblast techniky

Uvedený vynález se týká rostlinné chinolát-fosforibosyl-transferázy a DNA kódující tento enzym. Detailněji se uváděný vynález dotýká použití DNA kódující chinolát-fosforibosyl-transferázu pro produkci transgenických rostlin majících geneticky pozměněné úrovně nikotinu, a takto produkovaných rostlin.

Dosavadní stav techniky

Předmětem zájmu je produkce tabákových rostlin se sníženými úrovněmi nikotinu, uvádějící zájem vzhledem k návykové vlastnosti nikotinu. Dodatečně jsou tabákové rostliny s extrémně nízkými úrovněmi produkce nikotinu nebo žádnou produkcí nikotinu zajímavé jako recipienty transgenů zhodnocujících obchodně užitkové produkty, takové jako farmaceutické prostředky, kosmetické prostředky nebo potravinářské přísady. Pro odstranění nikotinu z tabáku byla navržena řada různých způsobů. Avšak většina těchto způsobů odstraňuje z tabáku společně s nikotinem i další složky, čímž nepříznivě ovlivňuje tabák. Klasické techniky pěstování kultury produkují tabákové rostliny s nižšími úrovněmi nikotinu (přibližně 8 %), než jsou úrovně shledané v plných typech tabákových rostlin. Žádané jsou tabákové rostliny a tabák mající dokonce další redukce obsahu nikotinu.

Jedním způsobem snížení úrovně biologického produktu je snížení množství požadovaného enzymu biosyntetickou cestou vytvářející žádaný produkt. Pokud se ovlivněný enzym přirozeně nachází v množství omezující rychlost reakce (porovnáno s dalšími enzymy nezbytnými pro biosyntézu), bude jakékoliv snížení tohoto množství enzymu snižovat produkci konečného produktu. Jestliže však množství enzymu rychlost běžně neomezuje, musí jeho přítomnost v buňce být snížena na úrovně omezující rychlost reakce s cílem snížit množství konečného produktu biosyntézy. Opačně, jestliže přirozeně se vyskytující množství enzymu omezuje rychlost, potom jakékoliv zvýšení aktivity enzymu bude vést ke zvýšení objemu biosyntetického konečného produktu. Nikotin se utváří původně v kořenech tabákové rostliny a je následně transportován do listů, kde je skladován (Tso, Fyziologie a biochemie tabákových rostlin, str. 233-34, Dowden, Hutchinson & Rss, Strodsburg, Pa (1972)). Povinným krokem biosyntézy nikotinu je vytváření kyseliny nikotinové z kyseliny chinolinové, tedy krok, který je katalyzován enzymem chinolin-fosforibosyl-transferázou („QPRTáza“). QPRTáza se projevuje jako enzym ovlivňující rychlost reakce v průběhu biosyntézy, dodávající kyselinu nikotinu pro syntézu nikotinu v tabáku. Viz např. Feth a kol., „Regulace aktivity enzymů nikotinové cesty v tabákovém kalu“, Planta, 168, str. 402-07 (1986); Wagner a spol.., „Regulace aktivity enzymů nikotinové cesty u tabáku“, Physiol. Plant., 68, str. 667-72 (1986). Modifikace úrovní nikotinu u rostlin tabáku pozitivní regulací hnilobné methyltransferázy (PMTáza) je navrženo v patentech US 5 369 023 a US 5 260 205, od Nakatani a Malik. PCT přihláška WO 94/28142 od Wahad a Malik popisuje DNA kódující PMT a použití antikódujících a kódujících PMT konstruktů.

Podstata vynálezu

Prvním hlediskem předloženého vynálezu je izolovaná DNA molekula obsahující SEQ ID č.: 2; DNA sekvence, které kódují enzym obsahující SEQ ID č.: 2; DNA sekvence, které hybridizují na uváděné DNA a které kódují enzym chinolát-fosforibosyl-transferáza; a DNA sekvence, které se liší od výše uvedených DNA sekvencí díky degeneraci generického kódu. Peptid kódovaný uváděnými DNA je dalším hlediskem vynálezu.

-1 CZ 297379 B6

Dalším hlediskem předloženého vynálezu je DNA konstrukt obsahující promotor schopný působit v rostlinné buňce a DNA část, kódující enzym chinolát-fosforibosyl-transferáza, umístěnou ve směru z promotoru a k tomuto účinně připojenou. DNA kódující enzym může být kódujícím nebo antikódujícím směru.

Dalším hlediskem předloženého vynálezu je metoda přípravy transgenické rostlinné buňky mající sníženou expresi chinolát-fosforibosyl-transferázy QPRTáza) zajištěním rostlinné buňky typu známého pro expresi chinolát-fosforibosyl-transferázy; transformace rostlinné buňky exogenním DNA konstruktem obsahujícím promotor a DNA tvořenou částí sekvence kódující mRNA (mediátorová RNA) chinolát-fosforibosyl-transferázy.

Dalším hlediskem předloženého vynálezu je transgenická rostlina druhů Nicotiana mající sníženou expresi chinolát-fosforibosyl-transferázy (QPRTáza) oproti ne-transformované kontrolní rostlině. Buňky uváděných rostlin obsahují DNA konstrukt, který zahrnuje část DNA sekvence kódující mRNA rostlinné chinolát-fosforibosyl-transferázy.

Dalším hlediskem předloženého vynálezu je metoda snížení exprese genu chinolát-fosforibosyltransferáza v rostlinné buňce pěstováním rostlinné buňky transformované v obsahu exogenní DNA, kdy transkript řetězce exogenní DNA je komplementární k mRNA chinolát-fosforibosyltransferázy, která je pro buňky endogenní. Transkripce komplementárního řetězce snižuje expresi endogenního genu chinolát-fosforibosyl.

Dalším hlediskem předloženého vynálezu je metoda produkce tabákové rostliny se sníženými úrovněmi nikotinu v jejich listech pěstováním tabákové rostliny s buňkami, které obsahují exogenní DNA sekvenci, kdy transkripční řetězec exogenní DNA sekvence je komplementární k endogenní chinolát-fosforibosyl-transferáza-mediátorové RNA v buňkách.

Dalším hlediskem vynálezu je metoda tvorby transgenické rostlinné buňky mající zvýšenou expresi chinolát-fosforibosyl-transferázy (QPRTáza) transformací rostlinné buňky známé pro expresi chinolát-fosforibosyl-transferázy exogenním DNA konstruktem, který obsahuje DNA sekvenci kódující chinolát-fosforibosyl-transferázu.

Dalším hlediskem předloženého vynálezu je transgenická Nicotiana rostliny mající zvýšenou expresi chinolát-fosforibosyl-transferázy (QPRTáza), kdy buňky transgenické rostliny obsahují exogenní DNA sekvenci kódující rostlinnou chinolát-fosforibosyl-transferázu.

Dalším hlediskem předloženého vynálezu je metoda produkce tabákové rostliny mající zvýšené úrovně nikotinu v jejích listech pěstováním tabákové rostliny zahrnující buňky, které obsahují exogenní DNA sekvenci kódující chinolát—fosforibosyl—transferázu, účinnou v buňkách.

Nikotin tabákových rostlin je produkován kondenzací kyseliny nikotinové a 4-methylaminobutanalu. Biosyntetická cesta vedoucí k produkci nikotinu je znázorněná na obrázku 1: Dvě regulační místa genů v chromozómu (Nicl a Nic2) působí jako ko-dominantní (úrovňové) regulátory produkce nikotinu. Analýza enzymů v kořenech jednoduchého a dvojitého Nic mutanta ukazuje, že aktivita dvou enzymů, chinolát-fosforibosyl-transferázy (QPRTáza) a hnilobné methyl-transferázy (PMTáza), je přímo úměrná úrovním biosystému nikotinu.

Porovnání aktivity enzymů v tabákových tkáních (kořenech a kalu) s různou schopností syntézy nikotinu ukazuje, že aktivita QPRTázy je v přesném vzájemném vztahu (koreluje) s obsahem nikotinu (Wagner a Wagner, Planta 165:532 (1985)). Saunders a Bush (Plant Physiol 64:236 (1979) prokazují, že úroveň QPRTázy v kořenech mutantů s nízkými úrovněmi nikotinu je přímo úměrná k úrovním nikotinu v listech.

-2CZ 297379 B6

Předložený vynález zahrnuje novou cDNA sekvenci (SEQ ID č.: 1) kódující rostlinnou chinolátfosforibosyl-transferázu (QPRTáza) sekvence SEQ ID č.: 2. Vzhledem ktomu, že aktivita QPRTázy je v přesném korelačním vztahu s obsahem nikotinu, transgenické tabákové rostliny, ve kterých úrovně QPRTázy jsou v kořenech rostliny sníženy (porovnáno s úrovněmi u planých typů rostlin), vedou k rostlinám majícím snížené úrovně nikotinu v listech. Předložený vynález poskytuje metody a konstrukty nukleových kyselin pro produkci uváděných transgenických rostlin, stejně jako uváděné transgenické rostliny. Uváděné metody zahrnují expresi kódující NtQPTl RNA, která snižuje množství QPRTázy v kořenech tabákových rostlin. Nikotin byl dodatečně shledán v netabákových druzích a čeledích rostlin, ačkoliv přítomné množství je obvykle mnohem nižší než v N. tabacum.

Předložený vynález také zajišťuje molekuly antikódující a kódující rekombinantní DNA kódující QPRTázu nebo molekuly antimediátorové (pozitivní) RNA QPRTázy a vektory obsahující uváděné molekuly rekombinantní DNA, stejně jako buňky transgenických rostlin a rostliny transformované uváděnými DNA molekulami a vektory. Transgenické tabákové buňky a rostliny tohoto vynálezu jsou charakteristické nižším nebo vyšším obsahem nikotinu, oproti netransformovaným kontrolním tabákovým buňkám a rostlinám.

Tabákové rostliny s extrémně nízkými úrovněmi produkce nikotinu nebo žádnou produkcí nikotinu jsou zajímavé jako recipienty transgenů vytvářejících obchodně hodnotné produkty, takové jako farmaceutické prostředky, kosmetické prostředky nebo potravinářské přísady. Tabák je zajímavý jako recipientní rostlina transgenů kódujícího žádaný produkt, jelikož je snadno geneticky upravitelný a produkuje velké množství biomasy najeden akr; tabákové rostliny se sníženými zdroji týkajícími se produkce nikotinu, budou ve shodě s tím zahrnovat více zdrojů využitelných pro produkci transgenických produktů. Metody transformace tabáku transgeny produkujícími požadované produkty jsou v oboru známé; použit může být jakýkoliv vhodný způsob využívající tabákové rostliny s nízkým obsahem nikotinu ve shodě s předloženým vynálezem.

Tabákové rostliny se sníženou expresí QPRTázy a sníženými úrovněmi nikotinu, ve shodě s předloženým vynálezem, budou potřebné pro produkci tabákových výrobků majících snížený obsah nikotinu. Tabákové rostliny ve shodě s předloženým vynálezem budou vhodné pro použití v jakémkoliv tradičním tabákovém produktu, zahrnujícím, ale nikterak omezeným na, tabák do dýmky, doutník a cigaretový tabák a žvýkací tabák, tabákový produkt může být v jakékoliv formě zahrnující listový tabák, sekaný tabák a řezaný tabák.

Provedení předloženého vynálezu mohou být také vhodné pro zajištění transgenických rostlin majících zvýšenou expresi QPRTázy a zvýšený obsah nikotinu v rostlině. Uvedená provedení, metody použití těchto provedení a rostliny takto produkované mohou být potřebné pro výrobu tabákových produktů majících upravený obsah nikotinu nebo pro produkci rostlin majících obsah nikotin zvýšený pro jeho insekticidní účinky.

Současní vynálezci zjistili, že TobRD2 gen (viz Conkling a spol, Plant Phas. 93, 1203 (1990), kóduje QPRTázu Nicotiana tabacum a na tomto místě poskytuje cDNA sekvenci NtQPTl (dříve označovanou jako TobRDT) a amino kyselinovou sekvenci kódovaného enzymu. Porovnání NtQPTl amino kyselinové sekvence s GenBank databází ukazuje omezenou podobnost sekvence bakteriálním protein, které kódují chinolát-fosforibosyl-transferázu (QPRTáza) (obrázek 3).

Chinolát-fosforibosyl-transferáza je nezbytná pro biosyntézu nového nikotin-adenindinukleotidu (NAD) jak v prokaryonech, tak i v eukaryonech. V tabáku jsou vysoké úrovně QPRTázy zjištěny v kořenech, ale ne v listech. K určení, že NtQPTl kóduje QPRTázu, současní vynálezci použili Escherichia coli druhu bakterií (TH265), mutant postrádající chinolát-fosforibosyl-transferázu (nadC). Tento mutant nemůže růst na minimálním médiu postrádajícím kyselinu nikotinovou. Avšak, exprese NtQPTl proteinu u tohoto bakteriálního druhu dodala NadC⁺ fenotyp (obrázek 4) potvrzující, že NtQPTl kóduje QPRTázu.

-3CZ 297379 B6

Současní vynálezci zkoumali účinky Nicl a Nic2 mutantů v tabáku a vlivy upravených tabákových rostlin na úrovně ustáleného stavu mRNA NtQPTl a úrovně nikotinu. (Odstranění apikální dominance vrchní úpravou na počátku období květu je dobře známé a vede ve zvýšené úrovně biosyntézy nikotinu a transportu nikotinu v tabáku a je běžnou praxí při produkci tabáku). Jestliže NtQPTl je ve skutečnosti zahrnuto při biosyntéze nikotinu, očekáváním bude, že (1) NtQPTl mRNA úrovně budou nižší vNicl/Nic2 dvoumutantech a (2) NtQPTl mRNA úrovně budou zvýšeny po vrchní úpravě. NtQPTl mRNA úrovně vNicl/Nic2 dvojitých mutantech byly shledány přibližně 25 % úrovně planému typu (obrázek 5). Dále, po šesti hodinách od provedení vrchní úpravy, NtQPTl mRNA úrovně tabákových rostlin se zvýšily asi osm-krát. NtQPTl bylo takto zjištěno jako klíčový kontrolní gen způsobu biosyntézy nikotinu.

Transfenické rostlinné buňky a rostliny

Kontroly exprese genu v rostlinných buněčných genomech je možné dosáhnout zapojením heterologní DNA pod transkripční kontrolou promotoru účinného v hostiteli, přičemž transkripční řetězec heterologní DNA je komplementární k řetězci DNA, který je přepsán z upravovaného endogenního genu. Zavedená DNA, označovaná jako kódující DNA, zajišťuje RNA sekvenci, která je komplementární k přírodně produkovaným (endogenním) mRNA kyselinám a která potlačuje expresi endogenní mRNA. Mechanismus uvedené regulace exprese genu kódováním není zcela jasný.A niž bychom si přáli být omezeni pouze na jednu jednotlivou teorii, je známé, že jedna teorie regulace kódováním nabízí, aby transkripce kódující DNA vytvářela RNA molekuly, které se váží na a ochraňují nebo potlačují transkripci molekul endogenních mRNA.

Kódující produkt může být podle metod předloženého vynálezu komplementárním ke kódující nebo nekódující (nebo oběma) části přirozeně se vyskytující koncové RNA. Kódující konstrukt může být zaveden do rostlinných buněk jakýmkoliv vhodným způsobem a může být zapojen do rostlinného genomu pro indukovatelnou nebo konstitutivní transkripci pozitivní (kódující) sekvence. Viz např. Patent US 5 453 566 a US 5 107 065, od Sdhewmaker a spol., (v textu zahrnut poznámkami).

Pojmy exogenní nebo heterologní DNA (nebo NRA), jak jsou použity v textu, se vztahují na DNA (nebo RNA), která byla zavedena do buňky (nebo předchůdce buněk) úpravou provedenou člověkem. Uvedená heterologní DNA může být kopií sekvence, která se přirozeně nachází v buňkách určených pro transkripci nebo v jejich částech.

K produkci tabákové rostliny mající snížené úrovně QPRTázy a tudíž nižší obsah nikotinu, než netransformovaná kontrolní tabáková rostlina, mohou být tabákové buňky transformovány exogenním QPRT kódujícím transkripčním celkem obsahujícím neúplnou QPRT cDNA sekvenci, plnou délku QPRT cDNA sekvence, neúplnou QPRT chromozomální sekvenci nebo plnou délku QPRT chromozomální sekvence, v pozitivní (kódující) orientaci s vhodnými účinně propojenými kontrolními sekvencemi. Vhodné kontrolní sekvence zahrnují iniciační sekvenci transkripce („promotor“) účinnou v rostlinách, které mají být transformovány, a polyadenylační/transkripční cílovou koncovou sekvenci. Pro určení klonů nesoucích sekvence QPRTázy v kódujícím (pozitivním) směru účinně připojené na kontrolní sekvence jsou použity běžné techniky, takové jako restrikční mapování, Southemova hybridizace a analýza nukleotidové sekvence. Tabákové rostliny jsou následně regenerovány z úspěšně transformovaných buněk. Je nejvhodnější, aby použitá kódující sekvence byla komplementární k endogenní sekvenci, avšak malé obměny exogenních a endogenních sekvencí mohou být také tolerovány. Je výhodné, aby kódující DNA sekvence byla dostatečně sekvenčně příbuzná tak, aby byla schopná vazby k endogenní sekvenci v kontrolované buňce za striktních podmínek, které jsou popsány dále v textu.

Pro vytvoření transgenických rostlin charakterizovaných nižším než obvyklým množstvím specifického enzymu byla použita v několika laboratořích technologie kódování. Např., rostliny s nižšími úrovněmi chalkonsyntázy, enzymu květního pigmentu biosyntetické cesty, byly vytvořeny dodáním antimediátorového genu chlakonsyntázy do genomu tabáku a petúnie. Tyto trans

-4CZ 297379 B6 genické rostliny tabáku a petúnií vytváří květy světlejší, než je jejich obvyklé zbarvení (Van der Krol a spol., „Antimediátorový gen chalkonsyntázy v transgenických rostlinách potlačuje květní pigmentaci“, Nátuře, 333, str. 866-69 (1988)). Kódující RNA technologie byla také úspěšně použita pro potlačení produkce enzymu polygalakturonázy u rajčat (Smith a spol., „Potlačení exprese genu polygalakturonázy u transgenických rajčat antimediátorovou RNA“, Nátuře, 334, str. 72426 (1988); Sheehy a spol., „Redukce aktivity polygalakturonázy u rajčat antimediátorovou RNA“, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 85, str. 8805-09 (1988)) u malých dílčích částí enzymu ribulóza-bisfosfátkarboxylóza u tabáku (Rodermel a spol., „Vzájemné působení jaderných organel: Jaderný antimediátorový gen potlačuje úrovně enzymu ribulóza-bisfosfát-karboxyláza u transformovaných tabákových rostlin“, Cell, 55, str. 673-81 (1988)). Transgenické rostliny charakterizované vyššími než obvyklými množstvími zmíněného enzymu mohou být případně produkovány transformací rostlin genem pro tento enzym v negativním (tj. normálním) směru. Úrovně nikotinu v transgenických tabákových rostlinách předloženého vynálezu mohou být zjištěny obvyklou zkouškou přítomnosti nikotinu. Transformované rostliny, ve kterých je úroveň OPRTázy v porovnání s netransformovanými kontrolními rostlinami snížena, budou mít shodně úroveň nikotinu v porovnání s kontrolní úrovní sníženou; transformované rostliny, ve kterých je úroveň QPRTázy oproti netransformovaným kontrolním rostlinám zvýšena, budou mít shodně úroveň nikotinu při porovnání s kontrolní úrovní zvýšenou.

Heterologní sekvence použitá v metodách kódování předloženého vynálezu může být volena tak,a by byl vytvořen RNA produkt komplementární k celé mRNA sekvenci QPRTázy nebo kjejí části. Sekvence může být komplenetámíková kjakékoliv sousedící sekvenci přirozené mediátorové RNA, tj. může být komplementární k endogenní mRNA sekvenci proximálně na 5'konci nebo v místě překrytí, ve směru od místa překrytí, mezi místem překrytí a iniciační kodonem a může tvořit celek nebo pouze část nekódované oblasti, může tvořit můstek nekódované a kódované oblasti, být komplementární k celku nebo části kódované oblasti, komplementární k 3'-netranslatované oblasti mRNA. Vhodné kódující sekvence mohou být alespoň od asi 13 do asi 15 nukleotidů, alespoň asi 16 až asi 21 nukleotidů, alespoň asi 20 nukleotidů, alespoň asi 30 nukleotidů, alespoň asi 50 nukleotidů, alespoň asi 75 nukleotidů, alespoň asi 100 nukleotidů, alespoň asi 125 nukleotidů, alespoň asi 150 nukleotidů, alespoň asi 200 nukleotidů, nebo více. Dodatečně, sekvence mohou být prodlouženy nebo zkráceny na 3' nebo 5'jejich koncích.

Jednotlivá kódující sekvence a délka kódující sekvence se bude měnit podle stupně požadovaného útlumu, stabilitě kódující sekvence a podobných. Pracovník zkušený v oboru bude instruován ve výběru vhodných kódujících sekvencí QPRTázy použitím metod dostupných v oboru a informací poskytnutých v tomto textu.

S ohledem na obrázku 2A a SEQ ID č.: 1 uvedenou v textu, oligonukleotid vynálezu může představovat souvislou dílčí část cDNA sekvence QPRTázy v pozitivní orientaci jakékoliv délky, která je dostatečná k dosažení požadovaných účinků, pokud je tato transformovaná do recipientní rostlinné buňky.

Předložený vynález může být také použit v metodách antikódujícího společného potlačení produkce nikotinu. Antikódující DNA sekvence použité v provedení předloženého vynálezu mají délku dostatečnou, jestliže se projevují v rostlinné buňce, k potlačení přirozené exprese rostlinné proteinu QPRTáza podle uváděného textu v této rostlinné buňce. Uváděné antikódující DNA sekvence mohou být základně zcela genomové nebo komplenentámíkové DNA kódující enzym QPRTáza nebo jeho dílčí části, uváděné dílčí části mají obvykle délku alespoň 15 nukleotidů. Metody zjištění délky antikódující DNA, která vede v potlačení exprese nativního genu v buňce, jsou pracovníkům zkušeným v oboru dostupné.

Podle dalšího možného celku předloženého vynálezu, Nicotiana rostlinné buňky jsou transformovány DNA konstruktem obsahujícím DNA část kódující enzymatickou RNA molekulu (tj. „ribozym“), které enzymatická RNA molekula je orientována proti (tj. rozštěpení) mRNAtranskriptu DNA kódující rostlinou QPRTázu podle popisu v textu. Ribozymy obsahují substrá

-5CZ 297379 B6 tové vazebné úseky, které se váží k přístupným úsekům cílové mRNA a oblasti které katalyzují rozštěpení RNA, zamezující přemístění a produkci proteinu. Vazebné úseky mohou zahrnovat kódující sekvence komplementární k cílové mRNA sekvenci; katalytický motiv může představovat kladivový motiv, nebo jiné motivy, takové jako vlásenkový motiv. Štěpná místa ribozymu uvnitř cílové RNA mohou být původně identifikována prohlášením cílové molekuly na štěpná místa ribozymu (např. GUA, GUU nebo GUC sekvence). Jakmile jsou identifikována tato místa, krátké RNA sekvence 15, 20, 30 nebo ribonukleotidů, odpovídající oblasti cílového genu, zahrnují štěpné místo mohou být ohodnoceny předpokládanými strukturálními vlastnostmi. Vhodnost možných cílových míst může být také ohodnocena zkouškou jejich přístupnosti pro hybridizaci volnými oligonukleotidy použitím zkoušky protekce ribonukleázy, která je v oboru známá. DNA sekvence kódující enzymatické RNA molekuly mohou být produkovány známými technikami. Viz např. T. Cech a spol., Patent US 4 987 071; Keene a spol., Patent US 5 559 021; Donson a spol., Patent US 5 589 367; Torrence a spol., Patent US 5 583 032; Joyce, Patent US 5 580 967; Gold a spol., U.S. patent 5 595 877; Wagner a spol., U.S. Patent 5 591 601; a Patent US 5 622 854 (objevy kterých jsou v textu zahrnuty poznámkami celkově). Produkce uvedené enzymatické RNA molekuly v rostlinné buňce a přerušení produkce proteinu QPRTáza snižuje aktivitu QPRTázy v rostlinných buňkách základně stejným způsobem jako produkci kódující RNA molekuly: tj. přerušením kódování mRNA v buňce, která produkuje enzym. Pojem „ribozym“, použitý v textu, popisuje kyselinu nukleovou obsahující RNA, která působí jako enzym (takový jako endoribonukleáza) a může být použit vzájemně zaměnitelně za „enzymatickou RNA molekulu“. Předložený vynález dále zahrnuje DNA kódující ribozymy, DNA kódující ribozymy, která byla vložena do expresívního vektoru, hostitelské buňky obsahující uvedené vektory a metody snížení produkce QPRTázy v rostlinách použitím ribozymů.

Sekvence nukleových kyselin použité pro provedení předloženého vynálezu zahrnuje sekvence se sekvenčními podobnostmi v SEQ ID č: 1 a kódující protein mající aktivitu chinolát-fosforibosyl-transferázy. Tato definice by měla podchytit přírodní alelické variace proteinů QPRTázy. DNA sekvence, které hybridizují na DNA sekvence SEQ ID č.: 1 a kód exprese QPRTázy, především rostlinných enzymů QPRTázy, mohou být tudíž použity pro provedení předloženého vynálezu.

Mohou existovat četné formy QPRT enzymu tabáku. Četné formy enzymu mohou existovat díky post-kódujícím modifikaci jednotlivého genového produktu nebo vzhledem k četným formám NtWPTl genu.

Podmínky, které povolují jiné DNA sekvence kódující expresi proteinu majícího aktivitu QPRTázy k hybridizaci na DNA SEQ ID č.: 1 nebo na jiné DNA sekvence kódující protein uvedený jako SEQ ID č.: 2, mohou být stanoveny běžným způsobem. Např. hybridizace takových sekvencí může být provedena při méně přísných podmínkách nebo dokonce velmi přísných podmínkách (např. podmínkách uvedených pro přesné promývání 0,3 M NaCl, 0,03 M citrátu sodného, 0,1 % SDS při 60 °C nebo dokonce 70 °C na DNA kódující protein uvedený v textu jako SEQ ID č.: 2 standardní zkouškou hybridizace in šitu). Viz J. Sambrook a spol., Molekulární klonování, Laboratorní manuál (druhé vydání 1989) (Cold Spring Harbor Laboratory)). Obecně, uvedené sekvence budou alespoň z 65 % podobné, 75 % podobné, 80 % podobné, 85 % podobné, 90 % podobné nebo dokonce 95 % podobné nebo více s posloupností uvedenou zde jako SEQ ID č: 1 nebo DNA sekvence kódující proteiny sekvence SEQ ID č.: 2 (Určení sekvenční podobnosti byla provedena využitím dvou sekvencí orientovaných promaximální srovnání; rozdíly v jedné ze dvou srovnávaných posloupností jsou pro maximální srovnání povoleny. Délky rozdílů 10 nebo nižší jsou výhodné, délky rozdílů 5 nebo nižší jsou výhodnější a délky rozdílů 2 nebo nižší jsou ještě výhodnější). Dostupné jsou různé metody hybridizace, které berou v úvahu izolaci cDNA klonů, kterých mRNA úrovně jsou co nejnižší, asi 0,05 % poly(A⁺)RNA. Viz M. Conkling a spol., Plant Physiol. 93, 1203-1211 (1990). Ve stručnosti, cDNA knihovny jsou prohledány použitím jedno-řetězcových cDNA nukleotidových sond reverzní transkripční mRNA z rostlinné tkáně (např. kořenů a/nebo listů). Nitrocelulózová nebo nylonová membrána je pro účely diferenciálního prohledávání namočena v 5xSSC, umístěna v 96 komorovém sacím kolektoru, 150 pL

-6CZ 297379 B6 kultury ustálené přes noc je přenesené ze vzorové očkovací plotny do každé komory a vakuuje aplikované, dokud všechna tekutina neprostoupila přes filtr. 150 pL denaturačního roztoku (0,5 M NaOH, 1,5 M NaCl) je umístěno v každé komoře použitím složené pipety a ponecháno asi 3 minuty klesnout. Sání je aplikováno, jak je uvedeno výše, a filtr odstraněn a neutralizován v 0,5 M tris-HCl (pH 8,0), 1,5 M NaCl. Tento je následně sušen ve vakuu a inkubován s příslušnou nukleotidovou sondou. Použitím filtrů nylonových membrán a ponecháním vzorové očkovací plotny skladované při teplotě -70 °C v 7 % DMSO, mohou být filtry několikrát prosévány četnými nukleotidovými sondami a odpovídající klony izolovány po několikaletém skladování.

Pojem „gen“, jak je použit v textu, označuje DNA sekvenci, která inkorporuje (1) protisměrné (5') regulační signály zahrnující promotor, (2) kódující oblast specifikující produkt, protein nebo RNA genu, (3) ve směru (3') oblasti zahrnující transkripční zakončení a polyadenylační signály a (4) přičleněné sekvence požadované pro účinnou a specifickou expresi.

DNA sekvence předloženého vynálezu se může základně sestávat ze sekvence poskytnuté v textu vynálezu (SEQ ID č.: 1) nebo ekvivalentních nukleotidových sekvencí představujících alely nebo polymorfní varianty těchto genů, nebo jejich kódujících oblastí.

Použití fráze „podstatná sekvenční podobnost“ v prezentované specifikaci a nárocích označuje, že DNA, RNA nebo amino kyselinové sekvence, které mají nepatrné a nevyplývající sekvenční variace ze skutečných sekvencí popsaných a nárokovaných ve vynálezu jsou považovány za ekvivalentní k sekvencím předloženého vynález. V tomto ohledu „nepatrné a nevyplývající sekvenční variace“ označují, že „podobné“ sekvence (tj. sekvence, které mají podstatnou sekvenční podobnost s DNA, RNA nebo proteiny odhalenými a nárokovanými v textu) budou funkčně rovnocenné k sekvencím popsaným a nárokovaným v předkládaném vynálezu. Funkčně rovnocenné sekvence budou působit podstatně stejným způsobem k produkci podstatně stejných prostředků jako kyselina nukleová a amino kyselinové prostředky popsané a nárokované vynálezem.

DNA sekvence popsané tímto vynálezem mohou být transformovány do rozmanitosti hostitelských buněk. Rozmanitost vhodných hostitelských buněk majících požadovaný růst a vlastnosti ošetření je snadno dostupná v oboru.

Použití fráze „izolované“ nebo „podstatně čisté“ v předkládané specifikaci a nárocích jako modifikátory DNA, RNA, polynukleotidů nebo proteinů označuje, že DNA, RNA, polynukleotidy nebo proteiny takto označené byly separované z jejich in vivo buněčného prostředí úpravou provedenou člověkem.

Pojmy „přirozená DNA sekvence“ nebo „přírodní DNA sekvence“, jak jsou použity v textu, označují DNA sekvenci, která může být izolována z netransgenických buněk nebo tkání. Přirozené DNA sekvence jsou takové, které nebyly pozměněny synteticky, takové jako místně cílené mutageneze. Jakmile jsou identifikované přírodní DNA sekvence, DNA molekuly mající přírodní DNA sekvence mohou být syntetizovány chemicky nebo produkovány použitím rekombinantních DNA procedur, známých v oboru. Jak je použito v textu, přírodní rostlinná RNA sekvence je taková, která může být izolována z netransgenických rostlin buněk nebo tkání. Jak je použito, přírodní tabáková DNA sekvence je ta, která může být izolována z netransgenických tabákových buněk nebo tkání.

DNA konstrukce nebo „transkripční kazety“ přeloženého vynálezu zahrnují, ve směru transkripce 5' k 3', promotor podle diskuse uvedené v textu, DNA sekvenci diskutovanou v textu účinně spojenou s promotorem a volitelně koncovou sekvenci zahrnující koncový signál RNA polymerázy a polyadenylační signál pro polyadenylaci. Všechny z těchto regulačních oblastí by měly být schopné působení v buňkách tkáně určené pro transformaci. V provedení vynálezu může být použit jakýkoliv vhodný koncový signál, jejich příklady zahrnují, ale nejsou tímto seznamem ve svém rozsahu nikterak limitovány, terminátor napolinsyntázy (nos), terminátor oktapinsyntáze (ocs), CaMV terminátor nebo přírodní koncové signály odvozené ze stejného genu jako

-7CZ 297379 B6 transkripční iniciační oblasti nebo odvozené z různých genů. Viz např. Rezian a spol. (1988), uvedené výše a Rodermel a spol.. (1988), uvedeno výše.

Pojem „účinně spojené“, jak je použit v textu, označuje DNA sekvence na jednotlivé DNA molekule, které jsou spojené tak, že působení jedné je ovlivněno druhou. Promotor je takto účinně spojen s DNA, pokud je tento schopný ovlivnit transkripci této DNA (tj. DNA je transkripčně kontrolována promotorem). Promotor je uveden jako „protisměrný“ z DNA, která je obráceně uvedená jako „ve směru“ z promotoru.

Transkripční kazeta může být zajištěna v DNA konstruktu, kteiý také má alespoň jeden replikační systém. Pro snadnější pochopení, je běžné mít replikační systém funkční v Escherichia coli, takové jako ColEl, pSCIOl, pACYC184 nebo podobné. Tímto způsobem může být výsledný konstrukt v každém stavu po každé manipulaci klonován, sekvenčně seřazen a stanovena správnost úpravy. V dodatku nebo místo E. coli replikačního systému může být použito široké spektrum hostitelských replikačních systémů, takových jako replikační systémy P1 inkompatibilních plazmidů, např. pRK290. V dodatku k replikačnímu systému bude často existovat alespoň jeden přítomný signální znak (indikátor), který může být použitelný v jednom nebo více hostitelských systémech, nebo různé signální znaky individuálních hostitelských systémů. Tj. jeden signální znak může být použit pro selekci v prokaryotní hostiteli, zatímco jiný signální znak může být použit pro selekci v eukaryontním hostiteli, především rostlinném hostiteli. Signální znaky mohou být ochranou proti biocidům, takovým jako antibiotika, toxiny, těžké kovy nebo podobné; mohou zajišťovat doplnění přidáním prototropie do auxotrofního hostitele nebo mohou poskytnout patrný fenotyp přes produkci nové sloučeniny v rostlině.

Různé malé části obsahující různé konstrukty, transkripční kazety, signální znaky a podobné mohou být následně zavedeny štěpením restrikčním enzymem vhodného replikačního sytému a zapojením jednotlivého konstruktu nebo dílčí části do dostupného místa. DNA konstrukt může být izolován pro další úpravy následně po ligaci a klonování. Všechny tyto techniky jsou více než postačitelně doloženy příklady v literatuře, např. J. Sambrook a spol., Klonování molekul, Laboratorní manuál, (druhé vydání, 1989), (Cold Spring Harbor Laboratory).

Vektory, které mohou být použity k transformaci rostlinné tkáně konstrukty nukleových kyselin předloženého vynálezu zahrnují jak konstrukty nukleových kyselin předloženého vynálezu zahrnují jak Agnobacterium vektory a balistické vektory, stejně jako vektory vhodné pro DNA- zprostředkovanou transformaci.

Pojem „promotor“ označuje oblast DNA sekvence, která inkorporuje nezbytné signály pro účinnou expresi kódující sekvence. Tyto mohou zahrnovat sekvence, ke kterým se váže RNA polymeráza, ale nejsou těmito typy sekvencí limitovány, a mohou zahrnovat oblasti, ke kterým se váží jiné regulační proteiny, spolu s oblastmi zahrnutými v regulační částí kódovaní proteinu a mohou zahrnovat kódující sekvence.

Promotory použité v provedení předloženého vynálezu mohou představovat konstitutivní aktivní promotory. Dostupná je celá řada konstitutivních aktivních promotorů, které jsou účinné v rostlinách. Výhodným příkladem je Cauloflower Mosaic Virus(CaMV) 35S promotor, který je konstitutivně vyjádřen ve většině rostlinných tkání. V jiném případě, promotor může představovat promotor specifikovaný pro kořeny nebo promotor specifikovaný pro kořeny a kůru, jak je detailněji vysvětleno dále v textu.

Kódující sekvence byly vyjádřeny v transgenických tabákových rostlinách použitím Cauliflowe Mosaid Virus (CaMV) 35S promotoru. Viz např. Comelissen a spol. „Jak RNA úroveň, tak i účinnost kódování jsou u transgenického tabáku redukovány antimediátorovou RNA“, Nukleové kyseliny Res. 17, str. 833^43 (1989); Rezaian a spol.; „Antimediátorové RNA okurkového mozaikovitého viru u transgenických rostlin určené pro kontrolu viru“, Molekulární biologie rostlin 11, str. 463-71 (1988); Rodermel a spol., „Vzájemné působení nukleárních organel.

-8CZ 297379 B6

Nukleární antimediátorový gen potlačuje úrovně enzymu ribulózobifosfát-karboxylóza u transformovaných tabákových rostlin, Cell 55, str. 673-81 (1988); Smith a spol., „Antimediátorová

RNA inhibice exprese genu polygalakturonázy u transgenických rajčat“, Nátuře 334, str. 724-26 (1988); Van der Krol a spol., „Antimediátorový gen chalkonsyntáza a transgenických rostlin potlačující pigmentaci květin“, Nátuře 333, str. 866-69 (1988).

Použití CaMV 35S promotoru pro expresi QPRTázy v transformovaných tabákových buňkách a rostlinách vynálezu je výhodné. Použití CaMV promotoru pro expresi jiných rekombinantních genů v kořenech tabáku byla přesně popsána (Lam a spol, „Místně specifické mutace přeměňují in vitro faktor vazebnosti a mění formu exprese genu transgenických rostlin“, Proč. Nat. Acad. Sci. (Pojednání národní akademie věd) USA 86, str. 7890-94 (1989); Poulsen a spol., „Rozčlenění 5' protisměrných posloupností pro selektivní expresi genu Nicotiana Plumbaginifolia rbcS8B“, Mol. Gen. genet. (Molekulární genová genetika) 214, str. 16-23 (1988)).

Další promotory, které jsou aktivní pouze v kořenových tkáních (promotory specifické v kořenech) jsou také pro metody předloženého vynálezu velmi výhodné. Viz. např. Patent US 5 459 252, od Conkling a spol..; Yamamoto a spol., Rostlinná buňka 3:371 (1991). TobRD2 specifický promotor kořenů-kůry může být také použit. Viz, např. Patent US SN 08/508 786, nyní přístupná, od Conkling a spol., PCT WO 9705261. Všechny patenty citované v textu jsou určeny pro začlenění v textu poznámkami v jejich celistvosti.

QPRTáza rekombinantní DNA molekuly a vektory použité k produkci transformovaných tabákových buněk a rostlin tohoto vynálezu mohou dále obsahovat dominantní volitelný signální gen. Vhodné dominantní volitelné signální znaky pro použití v tabáku zahrnují mimo jiné antibiotické rezistentní geny kódující neomycinfosfotransferázu (NPTII), hygromycinfosfotransferázu (HPT) a chloramfenikolacetyltransferázu (CAT). Jiný dobře známý dominantní volitelný signální znak vhodný pro použití v tabáku představuje genovou mutantu dihydrofolát reduktázy, která kóduje dihydrofolátreduktázu odolnou vůči metotrexáze. DNA vektory obsahující vhodné antibiotické rezistentní geny a odpovídající antibiotika jsou obchodně dostupné.

Transformované tabákové buňky jsou voleny ze sousední četnosti netransformovaných buněk umístěním smíšené četnosti buněk do kultivačního prostředí obsahujícího vhodnou koncentraci antibiotik (nebo jiných sloučenin běžně toxických k tabákovým buňkám), proti kterým je produkt zvoleného dominantního volitelného signálního genu rezistentní. Takto pouze takové tabákové buňky, které byly transformovány, zůstávají na živu a rozmnožující se.

Metody tvorby rekombinantních rostlin předloženého vynálezu, obecně, zahrnují nejdříve zajištění rostlinné buňky schopné regenerace (rostlinná buňka obvykle spočívá ve stkáni schopné regenerace). Rostlinná buňka je následně transformována DNA konstruktem obsahujícím transkripční kazetu předloženého vynálezu (jak je uvedeno v textu) a rekombinantní rostlina je regenerována z transformované rostlinné buňky. Jak je vysvětleno níže, krok transformace je proveden technikami, které jsou v oboru známé, tyto zahrnují, ale nejsou uvedenými příklady limitovány, ostřelování rostlinné buňky mikročásticemi nesoucími transkripční kazetu, infikování buňky Agrobacterium tumefaciens obsahující Tiplazmid nesoucí transkripční kazetu nebo jakoukoliv jinou techniku vhodnou pro produkci transgenické rostliny.

Rada Agrobacterium vektorových systémů použitelných pro provedení předloženého vynálezu je známá. Např. Patent US 4 459 355 popisuje metodu transformace přístupných rostlin, včetně dikotů, Agrobacterium druhem obsahujícím Tiplazmid. Transformace dřevin Agrobacterium vektorem je popsána v Patentu US 4 795 855. Dále Patent US 4 940 838, od Schilperoort a spol., popisuje binární Agrobacterium vektor (tj. vektor, ve které, Agrobacterium obsahuje jeden plazmid mající oblast Tiplazmidu, ale žádnou T oblast, a druhý plazmid mající T oblast, ale žádnou vir oblast) použitelný pro provedení předloženého vynálezu.

-9CZ 297379 B6

Mikročástice nesoucí DNA konstrukt předloženého vynálezu, které mikročástice je vhodná pro transformaci ostřelováním rostlinné buňky, jsou také použitelné pro vytváření transformovaných rostlin předloženého vynálezu. Mikročástice je vhnána do rostlinné buňky k produkci transformované rostlinné buňky a z transformované rostlinné buňky je vytvořena rostlina. Při provádění předloženého vynálezu může být použita jakákoliv vhodná metoda transformace ostřelováním buněk a přístroje. Příklady přístrojů a procedur jsou popsány v Sanford a Wolf, Patent US 4 945 050 a v Christou a spol, Patent US 5 015 580. Pokud je použita procedura transformace ostřelováním, transkripční kazeta může být inkorporována do plazmidu schopného replikace nebo vázání (intergace) v buňce určené pro transformaci. Příklady mikročástic vhodných pro použití v uváděných systémech zahrnují 1 až 5 pm zlaté kulovité částice. DNA konstrukt může být nanesen na mikročástici jakoukoliv vhodnou technikou, takovou jako vysrážením.

Rostlinné druhy mohou být transformovány DNA konstruktem předloženého vynálezu DNAzprostředkovanou transformací protoplastu rostlinné buňky a následnou regenerací rostliny transformovaného protoplastu metodami, které jsou v oboru velmi dobře známé. Fúze takového protoplastu s lipozomy obsahujícími DNA nebo způsobem elektroporace je v oboru známá. (Shillito a spol., „Přímý přenos genu do protoplastu dvouděložných nebo jednoděložných rostlin řadou metod, zahrnujících elektroporaci“. Metody v enzymologii 153, str. 313-36 (1987)).

Termín „transformace“, jak je použit v textu, označuje zavedené exogenní DNA do buněk k produkci transgenických buněk trvale transformovaných exogenní DNA.

Transformované buňky jsou indukovány k regeneraci intaktních tabákových rostlin přes aplikaci kultivačních technik tabákové tkáně a buňky, které jsou v oboru dobře známé. Metoda regenerace rostliny je volena tak, aby byla kompatibilní s metodou transformace. Stálá přítomnost a orientace sekvence QPRTázy u transgenických tabákových rostlin může být ověřena mendelovskou dědičností sekvence QPRTázy, jak je uvedeno ve standardních metodách DNA analýzy aplikovaných na potomstvo vznikající zkontrolovaného křížení. Následně po regeneraci transgenických tabákových rostlin z transformovaných buněk, introdukovaná DNA sekvence je snadno transferovaná do jiných variet tabáku pomocí běžné praxe pěstování rostlin a bez nenáležitého experimentování.

Např. pro analýzu izolace transgenu, generované transformované rostliny (R_o) mohou být pěstovány do stádia zralosti, testovány pro úrovně nikotinu a samoopyleny k produkci Ri rostlin. Procentický podíl Ri rostlin nesoucích transgen je homozygotní vzhledem k transgenu. K identifikaci homozygotních R, rostlin jsou pěstovány transgenické R] rostliny až do stádia zralosti a samoopyleny. Homozygotní R] rostliny budou produkovat R₂ potomstvo, ve kterém každá rostlina potomstva nese transgen; potomstvo heterozygotních R] rostlin se bude oddělovat 3:1.

Nikotin slouží jako přírodní pesticid, který napomáhá ochraně tabákových rostlin před napadením škodlivým hmyzem. Proto se může stát žádoucí dodatečná transformace rostlin s nízkým nebo žádným obsahem nikotinu, produkovaných předkládanými metodami, transgeny (takovým jako Bacillus thuringiensis) které dodatečně budou poskytovat ochranu proti hmyzu.

Výhodnými rostlinami vhodnými pro použití v předložených metodách jsou druhy Nicotiana nebo tabáku, včetně N. tabacum, N. rustica a N. glutinosa. Použití mohou být jakékoliv druhy nebo čeledě tabáku. Výhodnými jsou druhy, které již mají nízký obsah nikotinu, takové jako Nicl/Nic2 dvojitý mutant.

Jakákoliv rostlinná tkáň schopná klonového šíření, organogenezí nebo embryogenezí, mohou být transformovány vektorem předloženého vynálezu. Termín „organogeneze“, jak je použit v textu, označuje proces, ve kterém jsou nadzemní části rostlin a kořeny vyvinuty postupně z meristematických středů; termín „embryogeneze“, jak je použit v textu, označuje způsob, kterým jsou společně vyvinuty nadzemní části testu rostliny a kořenové části rostliny současně probíhajícím způsobem (ne následně), jestli ze somatických buněk nebo gamet. Jednotlivá zvolená tkáň se

-10CZ 297379 B6 bude měnit podle systému šíření klonování dostupného pro a nejlépe se hodícího pro individuální druhy určené ke zpracování. Příkladové cílové tkáně zahrnují listy, pyl, klíčky, děložní lístky, hypokotyl, tkáně kalu, existující meristematická tkáň (např. apikální meristém, laterální pupen a kořenový meristém) a indukované meristematické tkáně (např. meristém děložních lístků a meristém hypokotylu).

Rostliny předloženého vynálezu mohou mít různé podoby. Rostliny mohou představovat chiméry transformovaných buněk a netransformovaných buněk; rostliny mohou představovat klonální transformace (např. všechny buňky transformované k obsahu transkripční kazety); rostliny mohou být očkovány transformovanými a netransformovanými tkáněmi (např. transformovaný kořenový svazek naočkovaný na netransformovaných štěp z citrusových plodů). Transformované rostliny mohou být šířeny různými prostředky, takovými jako klonální šíření nebo klasickými technikami pěstování. Např. první generace (nebo TI) transformovaných rostlin může být samoopylena za vzniku homozygotní druhé generace (nebo T2) transformovaných rostlin dále šířené klasickými technikami pěstování. Dominantní volitelný signální znak (takový jako nptll) může být spojen s transkripční kazetou usnadňující pěstování.

Z pohledu výše uvedeného bude jasné, že rostliny, které mohou být využity při praxi přeloženého vynálezu, zahrnují rostliny rodu Nicotiana.

Těm, kteří jsou velmi dobře obeznámeni s metodami rekombinantních DNA, které jsou popsané výše, pochopí, že jeden může použít plnou délku cDNA molekuly QPRTázy nebo plnou délku chromozomálního genu QPRTázy, spojené v antikódujícím směru s vhodně účinně spojenými řídícími sekvencemi pro konstrukci transgenických tabákových buněk a rostlin. (Pracovníci zkušení v oboru budou také chápat, že vhodné řídicí sekvence pro expresi genu v antikódujícím směru zahrnují jakékoliv ze známých eukaryontních kódujících počátečních sekvencí, v dodatku k promotoru a polyadenylačních/transkripčních koncových sekvencí popsaných výše). Uvedené transformované tabákové rostliny jsou charakterizovány zvýšenou úrovní QPRTáz a tudíž i vyšším obsahem nikotinu, než netransformované kontrolní tabákové rostliny.

Mělo by být tudíž jasné, že použití DNA sekvence QPRTázy pro snížení nebo zvýšení úrovní QPRT enzymu a tím také snížení nebo zvýšení obsahu nikotinu u tabákových rostlin spadá do rozsahu předloženého vynálezu.

Podle vyjádření v textu zahrnuje úroda většinu rostlin předloženého vynálezu a stejného rodu, které jsou pěstovány společně na zemědělském poli. Pojem „zemědělské pole“ označuje obvyklý malý pozemek pro skleník. Předložený vynálezu tímto poskytuje metodu produkce úrody rostlin mající pozměněnou aktivitu QPRTázy a tím mající snížené nebo zvýšené úrovně nikotinu porovnáno s podobnou úrodou netransformovaných rostlin stejného druhu a čeledi.

Příklady, které následují, jsou sestaveny pro ilustraci předloženého vynálezu a nejsou nikterak konstruovány ve smyslu jeho omezení.

Přehled obrázků na výkresech

Obrázek 1 znázorňuje biosyntetickou cestu vedoucí k nikotinu. Aktivita enzymu známá jako kontrolovatelná pomocí Nicl a Nic2 představuje QPRTázu (chinolát-fosforibosyl-transferáza) a PMTázu (hnilobná methyl-transferáza).

Obrázek2A uvádí sekvenci nukleové kyseliny NtQPTl cDNA (SEQ ID č.: 1) škodující sekvencí (SEQ ID č.: 3) znázorněnou velkými písmeny.

Obrázek 2B uvádí odvozenou amino kyselinovou sekvenci (SEQ ID č.: 2) QPRTázy tabáku kódovanou NtQPTl cDNA.

-11 CZ 297379 B6

Obrázek 3 srovnává odvozenou NtQPTl amino kyselinovou posloupnost a příslušné sekvence

Rhodospirillum rubrum, Mycobacterium lepře, Salmonella typhimurium, Escherichia coli, lidské a Saccharomyces cerevisiae.

Obrázek 4 ukazuje výsledky doplnění mutantu Escherichia coli postrádajícího chinolát-fosforibosyl-transferázu (TH265) s NtQPTl cDNA. Buňky byly transformovány expresívním vektorem nesoucím NtQPTl; růst transformovaných TH265 buněk vyjadřujících NtQPTl na minimálním médiu postrádajícím kyselinu nikotinovou ukázal, že NtQPTl kóduje QPRTázu.

Obrázek 5 porovnává úrovně nikotinu a relativně ustálený stav úrovní NtQPTl mRNA v Nicl a Nic2 tabákových mutantech: planý typ Burley 21 (Nicl/Nicl Nic2/Nic2); Nicl Burley 21 (nicl/nicl Nic2/Nic2); Nic2 Burley 21 (Nicl/Nicl nic2/nic2); a Nicl Nic2 Burley 21 (nicl/nicl nic2/nic2). Celé sloupce označují mRNA transkripční úrovně; šrafované sloupce označují úrovně nikotinu.

Obrázek 6 graficky znázorňuje relativní úrovně NtQPTl mRNA za určitou dobu u upravených tabákových rostlin porovnáno s neupravenými kontrolními rostlinami. Celé slupce ukazují mRNA transkripční úrovně; šrafované sloupce označují úrovně nikotinu.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1: Izolování a sekvenční analýza

TobRD2 cDNA (Conkling a spol., Plant Phys. 93, 1203 (1990)) byl podroben sekvenční analýze a je v textu označen jako SEQ ID č.: 1, a odvozená amino kyselinová sekvence jako SEQ ID č.: 2. Odvozená amino kyselinová posloupnost byla odhadnuta jako cytosolický protein. Ačkoliv rostlinné geny QPRTázy nebyly uvedeny, porovnány NtPTl amino kyselinové posloupnosti s GenBank databází (obrázek 3) odhalilo omezené sekvenční podobnosti s jistými bakteriálními a jinými proteiny; aktivita chinolát-fosforibosyl-transferázy (QPRTáza) byla ukázána pro S. typhimurium, E. coli a N. tabacum geny. NtQPTl kódující QPRTázu má podobnost k odvození dílčí části peptidu kódované Arabidopsis EST (označení exprese sekvence) sekvencí (Genbank Accession number F20096), která může představovat část genu Arabidopsis QPTáza.

Příklad 2: In-situ hydridizace

Pro určení prostorového rozložení TobRD2 mRNA transkriptů v různých tkáních kořenů, byla u netransformovaných rostlin uskutečněna in sítu hybridizace. In sítu hybridizace kódující části řetězce TobRD2 na TobRD2 mRNA v kořenové tkáni byla provedena použitím technik, které byly popsány v Meyerowitz, Plant Mol. Biol. Rep. 5,242 (1987) a Smith a spol., Plant Mol. Biol. Repl 5,237 (1987). Sedm dní staré tabákové (Nicotinia tabuacum) kořenové sazenice byly ustáleny v glutaraldehydu tlumeném fosfátem, uložené v Paraplast Plus (Monoject lne., St. Louis, MO) a rozděleny na tloušťku 8 mm k získání příčných stejně jako podélných bloků. Kódující TobRD2 transkripty syntetizované in vitro s přítomností 35S-ATP, byly použity jako nukleotidové sondy. Označená RNA byla hydrolýzována alkalickou úpravou k získání 100 až 200 základní průměrné délky média před použitím.

Hybridizace byly prováděny v 50 % formamidu po dobu 16 hodin při teplotě 42 °C s průměrným 5 χ 10⁶ počtem odčítacích impulzů za minutu (cpm) označené RNA na mililitr hybridizačního roztoku. Destičky se vyvinuly následně po aplikaci požadovaných vlivů a tyto byly zviditelněny pod světlými a tmavých poli mikroskopu. Hybridizační signál byl lokalizován v rohovité vrstvě buněk kořenů (výsledky nebyly znázorněny). Porovnání jak světlých, tak i tmavých obrazů polí

- 12CZ 297379 B6 stejných částí lokalizovalo TobRD2 transkripty parenchymatických buněk vnější kůry kořenů.

V epidermu nebo stele nebyl viditelný žádný hybridizační signál.

Příklad 3: TobRD2 MRNA Úrovně u Nicl a Nic2 tabákových mutantech a vzájemný vztah k úrovním nikotinu

Ustálený stav mRNA úrovně na TobRD2 byl zkoušen vNicl a Nic2 mutantních tabákových rostlinách. Nicl a Nic2 jsou pro regulaci aktivity chinolát-fosforibosyl-transferázy a aktivity hnilobné methyl-transferázy známé a jsou ko-dominantními regulátory produkce nikotinu. Prezentované výsledky jsou ilustrované na obrázku 5A a 5B, ukazujícím že TobRD2 exprese je regulována Nicl aNic2.

RNA byla izolována z kořenů planého typu Burley 21 tabákových rostlin (Nicl/Nicl Nic2/Nic2); kořenů Nicl - Burley 21 (nicl/nicl Nic2/Nic2); kořenů Nic2 - Burley 21 (Nicl/Nicl nic2/nic2); a kořenů Nicl-Nic2-Burley 21 (nicl/nicl nic2/nic2).

Čtyři Burley 21 tabákové řady (nic) byly pěstovány po dobu jednoho měsíce v půdě ze semene a přemístěny do hydroponických komor v provzdušněném živném roztoku ve skleníku na dobu jeden měsíc. Tyto řady byly izogenní, kromě dvou loci s nízkým obsahem nikotinu a měly genotypy Nicl/Nicl Nic2/Nic2, Nicl/Nicl nic2/nic2, nicl/nicl Nic2/Nic2, nicl/nicl nic2/nic2. Kořeny byly sklizeny z asi 20 rostlin pro každý genotyp a upraveny pro izolaci RNA. Celková RNA (Ipg) z každého genotypu byla podrobena elektroforézi přes 1 % gel agarózy obsahující 1,1 M formaldehydu a transferována do nylonové membrány podle Sambrook a spol. (1989). Membrány byly hybridizovány s ³²P-označenými TobRD2 cDNA malými částmi. Relativní intenzity TobRD2 transkriptů byly měřeny využitím denzitometrie. Obrázek 5 (celé sloupce) ilustruje relativní transkripční úrovně (porovnáno k Nicl/Nicl Nic2/Nic2) pro každý ze čtyř genotypů. Relativní obsah nikotinu (porovnáno v Nicl/Nicl Nic2/Nic2) čtyř genotypů je znázorněn šrafovanými sloupci.

Obrázek 5 graficky porovnává relativně ustálený stav TobRD2 mRNA úrovně, využitím úrovně zjištěné u planého typu Burley 21 (Nicl/Nicl Nic2/Nic2) jako referenční (kontrolního) množství. TobRD úrovně mRNA vNicl/Nic2 dvojitých mutantech byly přibližně 25 % úrovní planého typu tabáku. Obrázek 5B dále porovnává relativní úrovně nikotinu v blízkosti izogenní řadě tabáku studované v tomto příkladu (celé sloupce označují TobRD2 transkripční úrovně; šrafované sloupce označují úrovně nikotinu). Existují těsné vzájemné vztahy mezi úrovněmi nikotinu a TobRD2 transkripčními úrovněmi.

Příklad 4: Vliv nanášení na TobRD2 mRA úrovně

V oboru je známé, že odstranění horní části květu tabákové rostliny (vrchní úprava) zvyšuje růst kořenů a zvyšuje obsah nikotinu v listech rostliny. Vrchní úprava rostlin je obvyklou praxí pěstování tabáku pro obchodní účely a optimální čas pro vrchní úpravu dané tabákové úrody při známých podmínkách pěstování může být snadno určeno odborným pracovníkem.

Tabákové rostliny (N. tabacum SRÍ) byly pěstovány v půdě ze semene po dobu 1 měsíce a přeneseny do nádob obsahujících písek. Rostliny byly pěstovány ve skleníku další dva měsíce, pokud nezačaly nasazovat květy. Horní části květů a dva uzly byly ze čtyř řad rostlin odstraněny (vrchní úprava). Kořenová část byla z každé rostliny po udaném čase sklizena a nahromaděna pro extrakci RNA. Kontrolní rostliny nebyly podrobeny vrchní úpravě. Celková RNA (1 pg) každého časového bodu byla podrobena elektroforéze přes 1 % genu agarózy obsahujícího 1,1 M formaldehydu a transformována na nylonovou membránu podle Sambrook a spol., (1989). Membrány byly hybridizovány ³²P-označenými TobRD2 cDNA malými částmi. Relativní intenzity TobRD2 transkriptů byly měřeny využitím denzitometrie. Obrázek 6 ilustruje relativní transkripční úrovně

- 13 CZ 297379 B6 (porovnáno s nulovou hodnotou času) pro každý časový úsek s vrchní úpravou (celé sloupce) nebo bez vrchní úpravy (šrafované sloupce).

Relativní úrovně TobRD2 byly stanoveny v kořenové tkáni po 24 hodinách; výsledky jsou znázorněny na obrázku 6 (celé sloupce udávají TobRD2 transkripční úrovně v rostlin s vrchní úpravou; šrafované sloupce udávají TobRD2 transkripční úrovně u kontrolních rostlin bez povrchové úpravy). Během šesti hodin po provedení vrchní úpravy tabákových rostlin se mRNA úrovně pro TobRD zvýšily přibližně osm-krát u rostlin s vrchní úpravou; po stejnou dobu nebylo zjištěno žádné zvýšení u kontrolních rostlin).

Příklad 5: Doplnění bakteriálního mutantu postrádajícího QPRTázu DNA sekvencí SEQ ID

č.: 1

Escherichia coli druh TH265 představuje mutant postrádající chinolát-fosforibosyl-transferázu (nadC-j a tudíž nemůže růst v prostředí postrádajícím kyseliny nikotinové.

TH265 buňky byly transformovány expresívním vektorem (pWSlól) obsahujícím DNA sekvenci SEQ ID č.: 1 nebo transformovány expresívním vektorem (pKK.233), pouze. Růst transformovaných bakterií byl porovnáván s růstem TH265 (pKK.233) transformovaného typu a s růstem netransformovaného TH265 nadC- mutanta. Růst byl porovnán na minimálním médiu molekulární elektronikou (postrádajícím kyseliny nikotinovou) a na minimálním médiu s dodanou kyselinou nikotinovou také molekulární elektronikou.

E. coli druh s QPTáza mutací (nadC), TH265, byl poskytnu způsobem podle Dr.K.T. Hughes (Hughes a spol., J. Bact. 175:479 (1993). Buňky byly udržovány na LB médiu a způsobilé buňky připraveny podle popisu od Sambrook a spol. (1989). Expresívní plazmid byl vytvořen v pKK2233 (Brosius, 1984) a TobRD2 cDNA klonovanou pod kontrolou Tac promotoru. Výsledný plazmid, pWSlól, byl transformován do Th265 buněk. Transformované buňky byly následně očkovány na minimální médium (Vogel a Bonner, 1956) agarové plotny bez nebo s využitím kyseliny nikotinové (0,0002 %) jako suplementu. TH265 buňky samotné a TH265 transformované s pKK223 byly očkovány na podobných deskách za účelem použití jako kontrolního vzorku.

Výsledky jsou znázorněny na obrázku 4. Pouze TH265 transformované DNA sekvencí SEQ ID č.: 1 rostla v prostředí postrádajícím kyselinu nikotinovou. Tyto výsledky ukazují, že exprese DNA sekvence SEQ ID č. 1: v TH265 bakteriálních buňkách dodává NacC+ fenotyp k těmto buňkám, potvrzující, že tato sekvence kóduje QPRTázu. TobRD2 název byl tudíž pozměněn na NtQPTl.

Příklad 6: Transformace tabákových rostlin

DNA sekvence SEQ ID č.: 1, orientace proti směruje účinně připojena k rostlinnému promotoru (CaMV 35S nebo TobRD2 specifického promotoru kořene-kůra) k produkci dvou různých DNA kazet: CaMV35S promotor/kódující SEQ ID č. 1: a TobRD2 promotor/kódující SEQ ID č.: 1.

Planý typ tabáku a tabák s nízkým obsahem nikotinu jsou vybrány pro transformaci, např. planý typ Burley 21 tabák (Nicl+/Nic2+) a homozygotní nicl-/nic2- Burley 21. Většina tabákových rostlinných buněk každé řady jsou transformovány použitím každé DNA kazety. Transformace je provedena použitím Agrobacterium vektoru, např. Agrobacterium-Vmámího vektoru nesoucího Ti-okrajové sekvence a nptll gen (dodávající odolnost proti kanamycinu a kontrolované nos promotorem (nptlPj).

- 14CZ 297379 B6

Transformované buňky jsou vybrané a regenerované na transgenické tabákové rostliny (Rq). Rq rostliny jsou pěstovány dozralého stádia a testovány pro úrovně nikotinu; podskupina transformovaných tabákových rostlin ukázala výrazně nižší úrovně nikotinu v porovnání k netransformovaným kontrolním rostlinám.

Ro rostliny jsou následně samoopyleny a v R] potomstvu je analyzováno vyštěpení transgenu. R| potomstva jsou pěstovány do zralého stádia a samoopylena; vyštěpení transgenu mezi R₂ potomstvem označuje, které Ri rostliny jsou homozygotní pro transgen.

SEKVENCE (1) Obecné informace (i) Žadatel: Conkling, Mark A

Mendu, Nandini

Song, Wen (ii) Název vynálezu:

(iii) Počet sekvencí: 4 (iv) Korespondenční adresa:

(A) Adresa: Kenneth Sibley, Seli Seltzer Park & Gibson (B) Ulice: Post Office Drawer 34009 (C) Město: Charlotte (D) Stát: North Carolina (E) Země: USA (F) Kód: 28234 (v) Údaje o počítačovém systému (A) Typ média: Floppy disk (B) Počítač: IBM PC kompatibilní (C) Operační systém: PC-Dos/S-DOS (D) Software: Patentln Release #1.0. Verze #1.30 (vi) Běžné údaje o aplikaci:

(A) Číslo aplikace:

(B) Datum podání:

(C) Klasifikace:

(viii) Informace o zástupei/zmocnění:

(A) Jméno: Sibley, Kenneth D.

(B) Číslo registrace: 31,665 (C) Referenční/jednací číslo: 5051-338P (ix) Telekomunikační informace:

(A) Telefon: 919-420-2200 (B) Telefax: 919-881-3175 (2) Informace o SEQ ID č.: 1 (i) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 1399 párů bází (B) Typ: kyselina nukleová

- 15 CZ 297379 B6 (C) Typ řetězce: jednoduchý (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: cDNA (ix) Vlastnosti:

(A) Jména/Klíč. CDS (B) Umístění: 52..1104 (xi) Popis sekvence: SEQ ID č.: 1

CAAAAACTAT THCCACAAA ATTCATTTCA CAACCCCCCC AAAAAAAAAC C ATG TTT 57 Met Phe

AGA GCT ATT CCT TTC ACT GCT ACA GTG CAT CCT TAT GCA ATT ACA GCT105

Arg Ala Ile Pro Phe Thr Ala Thr Val His Pro Tyr Ala Ile Thr Ala

1015

CCA AGG TTG GTG GTG AAA ATG TCA GCA ATA GCC ACC AAG AAT ACA AGA153

Pro Nrg Leu Val Val Lys Met Ser Ala Ile Ala Thr Lys Asn ThrArg

2530

GTG GAG TCA HA GAG GTG AAA CCA CCA GCA CAC CCA ACT TAT GAT TTA201

Val Glu Ser Leu Glu Val Lys Pro Pro Ala His Pro Thr Tyr AspLeu

40 4550

AAG GAA GTT ATG AAA CTT GCA CTC TCT GAA GAT GCT GGG AAT TTA GGA249

Lys Glu Val Met Lys Leu Ala Leu Ser Glu Asp Ala Gly Asn LeuGly

6065

GAT GTG ACT TGT AAG GCG ACA ATT CCT CTT GAT ATG GAA TCC GAT GCT297

Asp Val Thr Cys Lys Ala Thr Ile Pro Leu Asp Met Glu Ser AspAla

7580

CAT TTT CTA GCA AAG GAA GAC GGG ATC ATA GCA GGA ATT GCA CH GCT345

His Phe Leu Ala Lys Glu Asp Gly Ile Ile Ala Gly Ile Ala LeuAla

9095

GAG ATG ATA HC GCG GAA GH GAT CCT TCA HA AAG GTG GAG TGG TAT393

Glu Met Ile Phe Ala Glu Val Asp Pro Ser Leu Lys Val Glu TrpTyr

100 105 110

GTA AAT GAT GGC GAT AAA Gn CAT AAA GGC HG AAA TH GGC AAA GTA441

Val Asn Asp Gly Asp Lys Val His Lys Gly Leu Lys Phe Gly LysVal

115 120 125130

CAA GGA AAC GCT TAC AAC ΑΠ GH ATA GCT GAG AGG GH Gn CTC AAT489

Gin Gly Asn Ala Tyr Asn Ile Val Ile Ala Glu Arg Val Val LeuAsn

135 140145

ΤΠ ATG CAA AGA ATG AGT. GGA ATA GCT ACA CTA ACT AAG GAA ATG GCA537

Phe Met Gin Arg Met Ser Gly Ile Ala Thr Leu Thr Lys Glu HetAla

150 155160

GAT GCT GCA CAC CCT GCT TAC ATC nG GAG ACT AGG AAA ACT GCT CCT585

Asp Ala Ala His Pro Ala Tyr Ile Leu Glu Thr Arg Lys Thr AlaPro

165 170175

- 16CZ 297379 B6

GGA TTA CGT TTG GTG GAT AAA TGG GCG GTA TTG ATC GGT GGG GGG AAG 633

Gly Leu Arg Leu Val Asp Lys Trp Ala Val Leu Ile Gly Gly Gly Lys

180 185 190

AAT CAC AGA ATG GGC TTA TTT GAT ATG GTA ATG ATA AAA GAC AAT CAC681

Asn His Arg Met Gly Leu Phe Asp Met Val Met Ile Lys Asp Asn His

195 200 205210

ATA TCT GCT GCT GGA GGT GTC GGC AAA GCT CTA AAA TCT GTG GAT CAG729

Ile Ser Ala Ala Gly Gly Val Gly Lys Ala Leu Lys Ser Val Asp Gin

215 220225

TAT KG GAG CAA AAT AAA CTT CAA ATA GGG GTT GAG GTT GAA ACC AGG777

Tyr Leu Glu Gin Asn Lys Leu Gin Ile Gly Val Glu Val Glu Thr Arg

230 235240

ACA ATT GAA GAA GTA CGT GAG GTT CTA GAC TAT GCA TCT CAA ACA AAG825

Thr Ile Glu Glu Val Arg Glu Val Leu Asp Tyr Ala Ser Gin Thr Lys

245 250255

ACT TCG TTG ACT AGG ATA ATG CTG GAC AAT ATG GTT GTT CCA TTA TCT873

Thr Ser Leu Thr Arg Ile Met Leu Asp Asn Met Val Val Pro LeuSer

260 265270

AAC GGA GAT ATT GAT GTA TCC ATG CTT AAG GAG GCT GTA GAA TTG ATC921

Asn Gly Asp Ile Asp Val Ser Met Leu Lys Glu Ala Val Glu LeuIle

275 280 285290

AAT GGG AGG TTT GAT ACG GAG GCT TCA GGA AAT GTT ACC CTT GAA ACA969

Asn Gly Arg Phe Asp Thr Glu Ala Ser Gly Asn Val Thr Leu GluThr

295 300305

GTA CAC AAG ATT GGA CAA ACT GGT GTT ACC TAC ATT TCT AGT GGT GCC1017

Val His Lys Ile Gly Gin Thr Gly Val Thr Tyr Ile Ser Ser GlyAla

310 315320

CTG ACG CAT TCC GTG AAA GCA CTT GAC ATT TCC CTG AAG ATC GAT ACA1065

Leu Thr His Ser Val Lys Ala Leu Asp Ile Ser Leu Lys Ile AspThr

325 330335

GAG CTC GCC CIT GAA GTT GGA AGG CGT ACA AAA CGA GCA TGAGCGCCAT1114

Glu Leu Ala Leu Glu Val Gly Arg Arg Thr Lys Arg Ala

340 345350

TACTTCTGCT ATAGGGTTGG AGTAAAAGCA GCTGAATAGC TGAAAGGTGC AAATAAGAAT1174

CATTTTACTA GTTGTCAAAC AAAAGATCCT TCACTGTGTA ATCAAACAAA AAGATGTAAA1234

TTGCTGGAAT ATCTCAGATG GCTCT1TTCC AACCTTATTG CTTGAGTTGG TAATTTCATT1294

ATAGCTTTGT TTrCATGTTT CATGGAATTT GTTACAATGA AAATACTTGA TTTATAAGTT1354

TGGTGTATGT AAAATTCTGT GTTACTTCAA ATATTTTGAG ATGTT1399 (2) Informace o SEQ ID č.: 2 (i) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 351 amino kyselin (B) Typ: amino kyselina (C) Topologie: lineární ío (ii) Typ molekuly: protein

- 17CZ 297379 B6 (ix) Popis sekvence: SEQ ID č.: 2

Met

Phe

Arg

Ala

Ile

Pro

Phe

Thr

Ala

Thr Val

His

Pro

Tyr Ala

Ile

1

5

10

15

Thr

Ala

Pro

Arg

Leu

Val

Val

Lys

Met

Ser Ala

Ile

Ala

Thr Lys

Asn

20

25

30

Thr

Arg

Val

Glu

Ser

Leu

Glu

Val

Lys

Pro Pro

Ala

His

Pro Thr

Tyr

35

40

45

Asp

Leu

Lys

Glu

Val

Met

Lys

Leu

Ala

Leu Ser

Glu

Asp

Ala Gly

Asn

50

55

60

Leu

Gly

Asp

Val

Thr

Cys

Lys

Ala

Thr

Ile Pfo-

Leu

Asp

Met Glu

Ser

65

70

75

80

Asp

Ala

His

Phe

Leu

Ala

Lys

Glu

Asp

Gly Ile

Ile

Ala

Gly Ile

Ala

85

90

95

Leu

Ala

Glu

Met

Ile

Phe

Ala

Glu

Val

Asp Pro

Ser

Leu

Lys Val

Glu

100

105

110

Trp

Tyr

Val

Asn

Asp

Gly

Asp

Lys

Val

His Lys

Gly

Leu

Lys Phe

Gly

115

120

125

Lys

Val

Gin

Gly

Asn

Ala

Tyr

Asn

Ile

Val Ile

Ala

Glu

Arg Val

Val

130

135

140

Leu

Asn

Phe

Met

Gin

Arg

Met

Ser

Gly

Ile Ala

Thr

Leu

Thr Lys

Glu

145

150

155

160

Met

Ala

Asp

Ala

Ala

His

Pro

Ala

Tyr

Ile Leu

Glu

Thr

Arg Lys

Thr

165

170

175

Ala

Pro

Gly

Leu

Arg

Leu

Val

Asp

Lys

Trp Ala

Val

Leu

Ile Gly

Gly

180

185

190

Gly

Lys

Asn

His

Arg

Met

Gly

Leu

Phe

Asp Met

Val

Met

Ile Lys

Asp

195

200

205

Asn

His

Ile

Ser

Ala

Ala

Gly

Gly

Val

Gly Lys

Ala

Leu

Lys Ser

Val

210

215

220

Asp

Gin

Tyr

Leu

Glu

Gin

Asn

Lys

Leu

Gin Ile

Gly

Val

Glu Val

Glu

225

230

235

240

-18CZ 297379 B6

Thr

Arg

Thr

lle

Glu

Glu

Val

Arg

Glu

Val

Leu

Asp

Tyr

Ala

Ser

Gin

245

250

255

Thr

Lys

Thr

Ser

Leu

Thr

Arg

lle

Met

Leu

Asp

Asn

Met

Val

Val

Pro

260

265

270

Leu

Ser

Asn

Gly

Asp

lle

Asp

Vůl

Ser

Met

Leu

Lys

Glu

Ala

Val

Glu

275

280

285

Leu

lle

Asn

Gly

Arg

Phe

Asp

Thr

Glu

Ala

Ser

Gly

Asn

Val

Thr

Leu

290

295

300

Glu

Thr

Val

His

Lys

lle

Gly

Gin

Thr

Gly

Val

Thr

Tyr

lle

Ser

Ser

305

310

315

320

Gly

Ala

Leu

Thr

His

Ser

Val

Lys

Ala

Leu

Asp

lle

Ser

Leu

Lys

lle

325

330

335

Asp

Thr

Glu

Leu

Ala

Leu

Glu

Val

Gly

Arg

Arg

Thr

Lys

Arg

Ala

340

345

350

(2) Informace o SEQ ID č.: 3 (i) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 1053 párů bází (B) Typ: kyselina nukleová (C) Typ řetězce: jednoduchý (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: cDNA (ix) Popis sekvence: SEQ ID č.: 3

ATGTTTAGAG CTATTCCTTT CACTGCTACA GTGCATCCTT ATGCAATTAC AGCTCCAAGG60

TTGGTGGTGA AAATGTCAGC AATAGCCACC AAGAATACAA GAGTGGAGTC ATTAGAGGTG120

AAACCACCAG CACACCCAAC TTATGATTTA AAGGAAGKA TGAAACTTGC ACTCTCTGAA180

GATGCTGGGA ATTTAGGAGA TGTGACHGT AAGGCGACAA nCCTCTTGA TATGGAATCC240

GATGCTCATT TTCTAGCAM GGAAGACGGG ATCATAGCAG GAATTGCACT TGCTGAGATG300

ATATTCGCGG AAGTTGATCC TTCAITAAAG GTGGAGTGGT ATGTAAATGA TGGCGATAAA360

GTTCATAAAG GCTTGAAATT TGGCAAAGTA CAAGGAAACG CTTACAACAT TGTTATAGCT420

GAGAGGGHG TTCTCAATTT TATGCAAAGA ATGAGTGGAA TAGCTACACT AACTAAGGAA480

ATGGCAGATG CTGCACACCC TGCTTACATC TTGGAGACTA GGAAAACTGC TCCTGGATTA540

CGTTTGGTGG ATAAATGGGC GGTATTGATC GGTGGGGGGA AGAATCACAG AATGGGCTTA600

-19CZ 297379 B6

TTTGATATGG TAATGATAAA AGACAATCAC ATATCTGCTG CTGGAGGTGT CGGCAAAGCT660

CTAAAATCTG TGGATCAGTA TTTGGAGCAA AATAAACTTC AAATAGGGGT TGAGGTTGAA720

ACCAGGACAA TTGAAGAAGT ACGTGAGGTT CTAGACTATG CATCTCAAAC AAAGACTTCG780

TTGACTAGGA TAATGCTGGA CAATATGGTT GTTCCATTAT CTAACGGAGA TATTGATGTA840

TCCATGCTTA AGGAGGCTGT AGAATTGATC AATGGGAGGT TTGATACGGA GGCTTCAGGA900

AATGTTACCC TTGAAACAGT ACACAAGATT GGACAAACTG GTGTTACCTA CATTTCTAGT960

GGTGCCCTGA CGCATTCCGT GAAAGCACTF GACATTTCCC TGAAGATCGA TACAGAGCTC1020

GCCCTTGAAG HGGAAGGCG TACAAAACGA GCA1053

PATENTOVÉ NÁROKY

Claims (44)

1. Izolovaná DNA molekula obsahující sekvenci volenou ze skupiny zahrnující:

(a) SEQIDč.:l (b) DNA sekvence, které kódují enzym mající aminokyselinovou sekvenci SEQ ID č.: 2 (c) DNA sekvence, které hybridizují na izolovanou DNA podle (a) nebo (b) uvedenou výše a které kódují enzym chinolát-fosforibosyl-transferázu; a (d) DNA sekvence, které se liší od DNA podle (a), (b) nebo (c) uvedených výše, díky degeneraci genetického kódu, a které kódují enzym chinolát-fosforibosyl-transferázu.

2. DNA konstrukt obsahující ve směru 5' k 3' promotor účinný v rostlinné buňce a molekulu DNA podle nároku 1 umístěnou ve směru od uvedeného promotoru a účinně s tímto spojenou.

3. DNA konstrukt obsahující ve směru 5' k 3' rostlinný promotor a molekulu DNA podle nároku 1 umístěnou ve směru uvedeného promotoru a účinně s tímto spojenou, uvedená část DNA má orientaci proti směru.

4. DNA konstrukt obsahující ve směru 5' k 3' promotor účinný v rostlinné buňce a DNA mající nukleotidovou sekvenci SEQ ID č.: 1 kódující enzym rostlinné chinolát-fosforibosyl-transferázy, uvedená DNA je účinně spojená s uvedeným promotorem.

5. DNA konstrukt obsahující ve směru 5' k 3' promotor účinný v rostlinné buňce a DNA mající nukleotidovou sekvenci SEQ ID č.: 1 kódující enzym rostlinné chinolát-fosforibosyl-transferázy, uvedená DNA má orientaci po směru a účinně spojená s uvedeným promotorem.

6. DNA konstrukt podle nároků 2, 3, 4 nebo 5, kde promotor je konstitutivně aktivní v rostlinných buňkách.

7. DNA konstrukt podle nároků 2, 3, 4 nebo 5, kde promotor je selektivně aktivní v buňkách rostlinné kořenové tkáně.

8. DNA konstrukt podle nároků 2, 3, 4 nebo 5, kde jeho promotor je selektivně aktivní v buňkách rostlinné tkáně kůry kořenů.

-20CZ 297379 B6

9. DNA konstrukt podle nároků 2, 3, 4 nebo 5, kde konstrukt dále obsahuje plazmid.

10. DNA konstrukt podle nároků 2, 3, 4 nebo 5, přičemž tento je přenášen rostlinným transformačním vektorem.

11. DNA konstrukt podle nároků 2, 3, 4 nebo 5, přičemž tento je přenášen rostlinným transformačním vektorem, přičemž rostlinný transformační vektor představuje Agrobacterium tumefaciens vektor.

12. Rostlinná buňka obsahující DNA konstrukt podle nároků 2, 3, 4 nebo 5.

13. Transgenická rostlina obsahující rostlinné buňky podle nároku 12.

14. Izolovaný peptid obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID č.: 2.

15. Izolovaný peptid kódovaný DNA sekvencí volenou ze skupiny zahrnující:

(a) SEQ ID č.: 1 (b) DNA sekvence, které hybridizují na izolovanou DNA podle bodu (a) výše a které kódují enzym chinolát-fosforibosyl -transferázu a (c) DNA sekvence, které se liší od DNA bodu podle (a) nebo (b) výše díky degeneraci genetického kódu, a které kódují enzym chinolát-fosforybosyl-transferázu.

16. Způsob výroby transformované rostlinné buňky mající sníženou produkci chinolátfosforibosyl-transferázy (QPRTázy), vyznačující se tím, že se:

transformuje typ rostlinné buňky, o kterém je známo, že produkuje chinolát-fosforybosyl-transferázu, exogenním DNA konstruktem, který ve směru 5'—3' zahrnuje promotor účinný v rostlinné buňce a heterologní DNA účinně spojenou s promotorem, k produkci transformované rostlinné buňky/buněk, a transformovaná rostlinná buňka má sníženou produkci chinolát-fosforibosyltransferázy ve srovnání s netransformovanou rostlinnou buňkou; a kde heterologní DNA zahrnuje nejméně 20 nukleotidů z nukleotidové sekvence volené ze skupiny zahrnující (a) SEQ ID č.: 1 (b) DNA sekvence, které kódují enzym mající aminokyselinovou sekvenci SEQ ID č.: 2 (c) DNA sekvence, které hybridizují na izolovanou DNA sekvenci podle (a) nebo (b) uvedenou výše a které kódují enzym chinolát-fosforibosyl-transferázu; a (d) DNA sekvence, které se liší od DNA podle (a), (b) nebo (c), uvedených výše, díky degeneraci genetického kódu, a které kódují enzym chinolát-fosforibosyl-transferázu.

17. Způsob podle nároku 16, vyznačující se tím, že heterologní DNA má orientaci proti směru.

18. Způsob podle nároku 16, vyznačující se tím, že heterologní DNA má orientaci po směru.

19. Způsob podle nároku 16, vyznačující se tím, že uvedená rostlinná buňka je z rostliny Nicotiana tabacum.

20. Způsob podle nároku 16, vyznačující se tím, že dále zahrnuje regeneraci rostliny z uvedené transformované rostlinné buňky.

21. Způsob podle nároku 16, vyznačující se tím, že uvedený promotor je konstitutivně aktivní.

-21 CZ 297379 B6

22. Způsob podle nároku 16, vyznačující aktivní v buňkách rostlinné kořenové tkáně.

23. Způsob podle nároku 16, vyznačující aktivní k buňkám rostlinné tkáně kořenové kůry.

se tím, že uvedený promotor je selektivně se tím, že uvedený promotor je selektivně

24. Způsob podle nároku 16, vyznačující se tím, že uvedený krok transformace je proveden ostřelováním uvedené rostlinné buňky mikročásticemi nesoucími uvedený DNA konstrukt.

25. Způsob podle nároku 16, vyznačující se tím, že uvedený krok transformace je proveden infikováním uvedené rostlinné buňky s Agrobacterium tumefaciens obsahujícím Tiplazmid nesoucí uvedený DNA konstrukt.

26. Způsob produkce osiva transgenického tabáku, vyznačující se tím, že zahrnuje sběr osiva z transgenické tabákové rostliny produkované způsobem podle nároku 20.

27. Způsob podle nároku 16, vyznačující se tím, že transformovaná rostlinná buňka má exprimovanou endogenní mediátorovou RNA chinolát-fosforibosyl-transferázy a heterologní DNA je komplementární k uvedené mediátorové RNA chinolát-fosforibosyl-transferázy (QPRT mRNA) exprimované v uvedené rostlinné buňce v oblasti volené z:

(a) 5'-netranslatované sekvence uvedené QPRT mRNA, (b) 3'-netranslatované sekvence uvedené QPRT mRNA a (c) translatované oblasti uvedené QPRT mRNA.

28. Způsob podle nároku 27, vyzn aču j ící se tím, že heterologní DNA ke komplementární alespoň k 15 nukleotidům uvedené mediátorové RNA chinolát-fosforibosyl-transferázy exprimované v uvedené rostlinné buňce.

29. Způsob podle nároku 27, vyznačující se tím, že heterologní DNA je komplementární alespoň k 200 nukleotidům uvedené mediátorové RNA chinolát-fosforibosyl-transferázy exprimované v uvedené rostlinné buňce.

30. Způsob podle nároku 16, v y z n a č u j í c í se tím, že heterologní DNA obsahuje sekvenci kódující chinolát-fosforibosyl-transferázu volenou z DNA sekvencí podle nároku 1.

31. Transgenická rostlina rodu Nicotiana mající sníženou produkci chinolát-fosforibosyl-transferázy (QPRTáza) oproti netransformované kontrolní rostlině, uvedená transgenická rostlina obsahuje transgenické rostlinné buňky obsahující:

exogenní DNA konstrukt obsahující ve směru 5' k 3' promotor účinný v uvedené rostlinné buňce a heterologní DNA účinně spojenou s uvedeným promotorem;

uvedená rostlina projevuje sníženou produkci QPRTázy ve srovnání s netransformovanou kontrolní rostlinou, a heterologní DNA zahrnuje nejméně 15 nukleotidů ze sekvence volené ze skupiny zahrnující (a) SEQ ID č.: 1 (b) DNA sekvence, které kódují enzym mající aminokyselinovou sekvenci SEQ ID č.: 2 (c) DNA sekvence, které hybridizují na izolovanou DNA podle (a) nebo (b) uvedenou výše a které kódují enzym chinolát-fosforibosyl-transferázu a (d) DNA sekvence, které se liší od DNA podle (a), (b) nebo (c), uvedených výše, díky degeneraci genetického kódu, a které kódují enzym chinolát-fosforibosyl-transferázu.

32 Transgenická rostlina podle nároku 31, kde heterologní DNA má orientaci proti směru.

33. Transgenická rostlina podle nároku 31, kde že heterologní DNA má orientaci po směru.

-22CZ 297379 B6

34. Transgenická rostlina rodu Nicotiana mající sníženou produkci chinolát-fosforibosyl-transferázy (QPRTáza) oproti netransformované kontrolní rostlině, kdy uvedená transgenická rostlina představuje potomstvo rostlin podle nároku 31.

35. Osivo transgenické rostliny rodu Nicotiana mající sníženou produkci chinolát-fosforibosyltransferázy (QPRTáza) oproti netransformované kontrolní rostlině, kdy uvedená transgenická rostlina je rostlinou podle nároku 31 nebo jejím potomstvem.

36. Způsob snížení exprese genu chinolát-fosforibosyl-transferázy v rostlinné buňce, vyznačující se tím, že se:

pěstuje rostlinná buňka transformovaná tak, aby obsahovala heterologní DNA, kdy transkribované vlákno heterologní DNA je komplementární k mediátorové RNA chinolát-fosforibosyl-transferázy endogenní v rostlinné buňce, čímž transkripce komplementárního vlákna snižuje expresi genu chinolát-fosforibosylu; heterologní DNA zahrnuje nejméně 15 nukleotidů ze sekvence volené ze skupiny zahrnující (a) SEQ ID č.: 1 (b) DNA sekvence, které kódují enzym mající aminokyselinovou sekvenci SEQ ID č.: 2 (c) DNA sekvence, které hybridizují na izolovanou DNA podle (a) nebo (b) uvedenou výše a které kódují enzym chinolát-fosforibosyl-transferázu; a (d) DNA sekvence, které se liší od DNA podle (a), (b) nebo (c), uvedených výše, díky degeneraci genetického kódu, a které kódují enzym chinolát-fosforibosyl-transferázu.

37. Způsob produkce transgenické tabákové rostliny se sníženou úrovní nikotinu v listech, vyznačující se tím, že se transformuje tabáková rostlinná buňka molekulou heterologní DNA obsahující nejméně 30 nukleotidů z DNA sekvence volené ze skupiny zahrnující (a) SEQ ID č.: 1 a (b) DNA sekvence kódující enzym mající aminokyselinovou sekvenci SEQ ID č.: 2 k získání transformované tabákové buňky, a z transformované buňky tabákové rostliny se vypěstuje transgenická tabáková rostlina se sníženou úrovní nikotinu v listech.

38. Způsob přípravy transformované rostlinné buňky mající zvýšenou produkci chinolát-fosforibosyl-transferázy (QPRTázy), vyznačující se tím, že se:

transformuje rostlinná buňka, která produkuje chinolát-fosforibosyl-transferázu exogenním DNA konstruktem, který obsahuje ve směru 5-3' promotor účinný v rostlinné buňce a heterologní DNA sekvenci kódující chinolát-fosforibosyl-transferázu k produkci transformované rostlinné buňky/buněk, uvedená transformovaná rostlinná buňka má zvýšenou produkci chinolát-fosforibosyl-transferázy ve srovnání s netransformovanou rostlinnou buňkou, kde heterologní DNA sekvence je vybíraná ze skupiny skládající se z (a) SEQ ID č.: 1 (b) DNA sekvence, které kódují enzym mající aminokyselinovou sekvenci SEQ ID č.: 2 (c) DNA sekvence, které hybridizují na izolovanou DNA podle (a) nebo (b) uvedenou výše a které kódují enzym chinolát-fosforibosyl-transferázu a (d) DNA sekvence, které se liší od DNA podle (a), (b) nebo (c), uvedených výše, díky degeneraci genetického kódu, a které kódují enzym chinolát-fosforibosyl-transferázu.

39. Transgenická rostlina rodu Nicotiana mající zvýšenou produkci chinolát-fosforibosyl-transferázy (QPRTázy) oproti netransformované kontrolní rostlině, uvedená transgenická rostlina obsahuje transformované rostlinné buňky obsahující:

exogenní DNA konstrukt obsahující ve směru 5' k 3' promotor účinný v uvedené rostlinné buňce a heterologní DNA sekvenci kódující enzym rostlinné chinolát-fosforibosyl-transferázy, uvedená DNA je účinně spojená s uvedeným promotorem;

-23 CZ 297379 B6 uvedená rostlina má zvýšenou produkci QPRTázy ve srovnání s netransformovanou kontrolní rostlinou a heterologní DNA sekvence je volená ze skupiny zahrnující (a) SEQ ID č.: 1 (b) DNA sekvence, které kódují enzym mající aminokyselinovou sekvenci SEQ ID č.: 2 (c) DNA sekvence, které hybridizují na izolovanou DNA podle (a) nebo (b) uvedenou výše a které kódují enzym chinolát-fosforibosyl-transferázu; a (d) DNA sekvence, které se liší od DNA podle (a), (b) nebo (c), uvedených výše, díky degeneraci genetického kódu, a které kódují enzym chinolát-fosforibosyl-transferázu.

40. Transgenická rostlina rodu Nicotiana mající zvýšenou produkci chinolát-fosforibosyl-transferázy (QPRTázy) oproti netransformované kontrolní rostlině, kdy uvedená transgenická rostlina je potomstvem rostliny podle nároku 39.

41. Způsob zvýšení exprese genu chinolát-fosforibosyl-transferázy v rostlinné buňce, vyznačující se tím, že pěstuje rostlinná buňka transformovaná tak, aby obsahovala heterologní DNA, kde heterologní DNA kóduje enzym chinolát-fosforibosyl-transferázu a je volená ze skupiny zahrnující (a) SEQ ID č.: 1 (b) DNA sekvence, které kódují enzym mající aminokyselinovou sekvenci SEQ ID č.: 2 (c) DNA sekvence, které hybridizují na izolovanou DNA podle (a) nebo (b) uvedenou výše a které kódují enzym chinolát-fosforibosyl-transferázu; a (d) DNA sekvence, které se liší od DNA podle (a), (b) nebo (c), uvedených výše, díky degeneraci genetického kódu, a které kódují enzym chinolát-fosforibosyl-transferázu.

42. Způsob podle nároku 41,vyznačující se tím, že uvedená transformovaná rostlinná buňka je získána způsobem zahrnujícím:

začlenění konstruktu obsahujícího ve směru transkripce promotor funkční v uvedené rostlinné buňce DNA sekvenci kódující chinolát-fosforibosyl-transferázu funkční v uvedené rostlinné buňce do genomu hostitelské rostlinné buňky, uvedená DNA sekvence je účinně spojená s uvedeným promotorem a transkripční koncovou oblastí funkční v uvedené buňce, čímž je získána transformovaná rostlinná buňka.

43. Způsob produkce tabákové rostliny se zvýšenou úrovní nikotinu v listech uvedené tabákové rostliny, vyznačující se tím, že se:

pěstuje tabáková rostlina nebo její rostlinné potomstvo, kdy uvedená rostlina obsahuje buňky obsahující exogenní DNA konstrukt zahrnující transkripční iniciační oblast funkční v uvedené tabákové rostlině a heterologní DNA sekvenci účinně spojenou s uvedenou transkripční iniciační oblastí, kdy uvedená heterologní DNA sekvence kóduje enzym chinolát-fosforibosyl-transferázu funkční v uvedených buňkách a kde heterologní DNA sekvence je volená ze skupiny zahrnující (a) SEQ ID ě.: 1 (b) DNA sekvence, které kódují enzym mající aminokyselinovou sekvenci SEQ ID č.: 2 (c) DNA sekvence, které hybridizují na izolovanou DNA podle (a) nebo (b) uvedenou výše a které kódují enzym chinolát-fosforibosyl-transferázu; a (d) DNA sekvence, které se liší od DNA podle (a), (b) nebo (c), uvedených výše, díky degeneraci genetického kódu, a které kódují enzym chinolát-fosforibosyl-transferázu.

44. Tabákový výrobek, vyznačující se tím, že je vyrobený z tabákové rostliny podle kteréhokoli z nároků 31 až 34, 40 nebo 41.