ES2154624T3 - Regulacion de la expresion de la quinolato fosforribosil transferasa. - Google Patents
Regulacion de la expresion de la quinolato fosforribosil transferasa.Info
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Abstract
Una molécula aislada de ADN que contiene una secuencia seleccionada del grupo formado por: (a) SEQ ID NO:1, (b) secuencias de ADN que codifican una enzima con SEQ ID NO:2, (c) secuencias de ADN que hibridan con ADN aislado de los enunciados (a) o (b) anteriores y que codifican la enzima quinolato fosforribosil transferasa, y (d) secuencias de ADN que difieren de los enunciados (a), (b) o (c) anteriores debido a la degeneración del código genético.
Description
Regulación de la expresión de la quinolato
fosforribosil transferasa.
Esta invención se refiere a la quinolato
fosforribosil transferasa vegetal (QPRTasa) y al ADN que codifica la
enzima. En particular, esta invención se refiere al uso de ADN que
codifica la quinolato fosforribosil transferasa para producir
plantas transgénicas que tienen niveles de nicotina genéticamente
alterados, y a las plantas producidas de este modo.
La producción de tabaco con menores niveles de
nicotina suscita interés dada la preocupación que causa la
naturaleza adictiva de la nicotina. Además, las plantas de tabaco
con niveles extremadamente bajos de producción de nicotina, o sin
producción de nicotina, son atractivas como receptores de transgenes
que expresan productos valiosos desde el punto de vista comercial
tales como productos farmacéuticos, componentes cosméticos o
aditivos alimentarios. Se han diseñado varios procedimientos para la
eliminación de la nicotina del tabaco. Sin embargo, la mayoría de
estos procedimientos eliminan otros ingredientes del tabaco, además
de la nicotina, por tanto afectando de forma adversa al tabaco. Las
técnicas clásicas de cultivo de cosechas han producido plantas de
tabaco con niveles menores de nicotina (aproximadamente del 8%) que
los encontrados en las plantas de tabaco de tipo salvaje. Son
deseables las plantas de tabaco y el tabaco con todavía más
reducciones del contenido de nicotina.
Un enfoque para reducir el nivel de un producto
biológico es reducir la cantidad de una enzima requerida en la ruta
biosintética que conduce a ese producto. Cuando la enzima afectada
se produce de forma natural en una cantidad limitante de la
velocidad (en relación con las otras enzimas requeridas en la ruta),
cualquier reducción de la abundancia de la enzima disminuirá la
producción del producto final. Si la cantidad de la enzima
normalmente no es limitante de la velocidad, su presencia en una
célula debe reducirse a niveles limitantes de la velocidad para
disminuir la producción de la ruta. Por el contrario, si la cantidad
de la enzima producida de forma natural es limitante de la
velocidad, cualquier aumento en la actividad de la enzima dará lugar
a un incremento del producto final de la ruta biosintética.
La nicotina se forma principalmente en las raíces
de la planta de tabaco y posteriormente se transporta a las hojas,
donde se almacena (Tso, Physiology and Biochemistry of Tobacco
Plants, pág. 233-34, Dowden, Hutchinson & Ross,
Stroudsburg, Pa (1972). Una etapa obligatoria en la biosíntesis de
la nicotina es la formación de ácido nicotínico a partir de ácido
quinolínico, etapa que está catalizada por la enzima quinolina
fosforribosil transferasa ("QPRTasa"). La QPRTasa parece ser
una enzima limitante de la velocidad en la ruta que suministra ácido
nicotínico para la síntesis de nicotina en el tabaco. Véase, por
ejemplo, Feth y col., "Regulation in Tobacco Callus of Enzyme
Activities of the Nicotine Pathway", Planta, 168, pág.
402-07 (1986); Wagner y col., "The Regulation of
Enzyme Activities of the Nicotine Pathway in Tobacco", Physiol.
Plant., 68, pág. 667-72 (1986). La modificación de
los niveles de nicotina en las plantas de tabaco mediante regulación
antisentido de la expresión de la Putrescence metil transferasa
(PMTasa) se propone en las patentes de EE.UU. 5.369.023 y 5.260.205
de Nakatani y Malik. La solicitud PCT WO 94/28142 de Wahad y Malik
describe ADN que codifica la PMT y el uso de constructos de PMT en
las orientaciones sentido y antisentido.
Un primer aspecto de la presente invención es una
molécula de ADN aislado que comprende la SEC ID nº 1; secuencias de
ADN que codifican una enzima con la SEC ID nº 2; secuencias de ADN
que tienen al menos un 65% de homología con tal ADN y que codifica
una enzima quinolato fosforribosil transferasa; y secuencias de ADN
que difieren del ADN anterior debido a la degeneración del código
genético. Un péptido codificado por tal ADN es otro aspecto de la
invención.
Otro aspecto de la presente invención es un
constructo de ADN que comprende un promotor que funciona en una
célula vegetal y un segmento de ADN que codifica una enzima
quinolato fosforribosil transferasa en posición aguas arriba del
promotor y operativamente asociado con el mismo. El ADN que codifica
la enzima puede estar en la dirección antisentido o sentido.
Otro aspecto de la presente invención es un
procedimiento para preparar una célula vegetal transgénica con
expresión reducida de la quinolato fosforribosil transferasa
(QPRTasa), proporcionando una célula vegetal de un tipo del que se
sabe que expresa quinolato fosforribosil transferasa; transformando
la célula vegetal con un constructo de ADN exógeno que comprende un
promotor y ADN que comprende una porción de una secuencia que
codifica ARNm de quinolato fosforribosil transferasa.
Otro aspecto de la presente invención es una
planta transgénica de la especie Nicotiana con una expresión
reducida de la quinolato fosforribosil transferasa (QPRTasa)
respecto a una planta control no transformada. Las células de tales
plantas comprenden un constructo de ADN que incluye un segmento de
una secuencia de ADN que codifica un ARNm de quinolato fosforribosil
transferasa vegetal.
Otro aspecto de la presente invención es un
procedimiento para reducir la expresión de un gen de quinolato
fosforribosil transferasa en una célula vegetal mediante el
crecimiento de una célula vegetal transformada para contener ADN
exógeno, donde una hebra transcrita del ADN exógeno es
complementaria al ARNm endógeno de la célula de la quinolato
fosforribosil transferasa. La transcripción de la hebra
complementaria reduce la expresión del gen de la quinolato
fosforribosil endógena.
Otro aspecto de la presente invención es un
procedimiento para producir una planta de tabaco que tienen niveles
disminuidos de nicotina en hojas de la planta de tabaco mediante el
crecimiento de una planta de tabaco con células que comprenden una
secuencia de ADN exógeno, donde una hebra transcrita de la secuencia
de ADN exógena es complementaria al ARN mensajero de la quinolato
fosforribosil transferasa endógena en las células.
Otro aspecto de la presente invención es un
procedimiento para preparar una célula vegetal transgénica con una
expresión aumentada de la quinolato fosforribosil transferasa
(QPRTasa), transformando una célula vegetal de la que se sabe que
expresa quinolato fosforribosil transferasa con un constructo de ADN
exógeno que comprende una secuencia de ADN que codifica quinolato
fosforribosil transferasa.
Otro aspecto de la presente invención es una
planta transgénica Nicotiana que tiene una expresión
aumentada de la quinolato fosforribosil transferasa (QPRTasa), donde
las células de la planta transgénica comprenden una secuencia de ADN
exógeno que codifica una quinolato fosforribosil transferasa
vegetal.
Otro aspecto de la presente invención es un
procedimiento para aumentar la expresión de un gen quinolato
fosforribosil transferasa en una célula vegetal mediante el
crecimiento de una célula vegetal transformada para contener ADN
exógeno que codifica quinolato fosforribosil transferasa.
Otro aspecto de la presente invención es un
procedimiento para producir una planta de tabaco que tiene niveles
aumentados de nicotina en las hojas, mediante el crecimiento de una
planta de tabaco que tiene células que contienen una secuencia de
ADN exógeno que codifica quinolato fosforribosil transferasa
funcional en las células.
La figura 1 muestra la ruta biosintética que
conduce a la nicotina. Las actividades enzimáticas de las que se
sabe que están reguladas por Nic1 y Nic2 son QPRTasa
(quinolato fosforribosil transferasa) y PMTasa (putrescina metil
transferasa).
La figura 2A proporciona la secuencia de ácido
nucleico del ADNc NtQPT1 (SEC ID Nº 1), con la secuencia
codificadora (SEC ID nº 3) que se muestra en letras mayúsculas.
La figura 2B proporciona la secuencia deducida
de aminoácidos (SEC ID nº 2) de la QPRTasa de tabaco codificada por
el ADNc NtQPT1.
La figura 3 alinea la secuencia deducida de
aminoácidos de NtQPT1 y las secuencias relacionadas de
Rhodospirillum rubrum, Mycobacterium lepre,
Salmonella typhimurium, Escherichia coli, humana, y
Saccharomyces cerevisiae.
La figura 4 muestra los resultados de la
complementación de un mutante de Escherichia coli que carece
de quinolato fosforribosil transferasa (TH265) con ADNc de
NtQPT1. Las células se transformaron con un vector de
expresión que lleva NtQPT1; el crecimiento de las células
TH265 transformadas que expresan NtQPT1 en medio mínimo sin
ácido nicotínico demostró que el NtQPT1 codifica la QPRTasa.
La figura 5 compara los niveles de nicotina y el
relativo estado de equilibrio de los niveles de ARNm de
NtQTP1 en los mutantes de tabaco Nic 1 y Nic 2:
Burley 21 salvaje (Nic1/Nic1 Nic2/Nic2); Nic1
Burley 21 (nic1/nic1 Nic2/Nic2); Nic 2 Burley
21 (Nic1/Nic1 nic2/nic2); y Nic1 Nic2 Burley 21
(nic1/nic1 nic2/nic2). Las barras negras indican los
niveles de tránscrito de ARNm; las barras rayadas indican los
niveles de nicotina.
La figura 6 es un representa gráficamente los
niveles relativos de ARNm de NtQPT1 en el tiempo en plantas
de tabaco despuntadas en comparación con plantas control sin
despuntar. Las barras negras indican los niveles de tránscrito de
ARNm; las barras rayadas indican los niveles de nicotina.
La nicotina se produce en las plantas de tabaco
mediante la condensación de ácido nicotínico y
4-metilaminobutanal. La ruta biosintética que da
lugar a la producción de nicotina se ilustra en la figura 1. Dos
loci reguladores (Nic1 y Nic2) actúan como reguladores codominantes
de la producción de nicotina. Los análisis enzimáticos de las raíces
de mutantes Nic sencillos y dobles muestran que las actividades de
dos enzimas, la quinolato fosforribosil transferasa (QPRTasa) y
putrescina metil transferasa (PMTasa) sin directamente
proporcionales a los niveles de biosíntesis de nicotina. Una
comparación de la actividad enzimática en tejidos de tabaco (raíz y
callo) con diferentes capacidades para la síntesis de nicotina
muestra que la actividad QPRTasa se correlaciona estrictamente con
el contenido de nicotina (Wagner y Wagner, Planta 165: 532
(1985)). Saunders y Bush (Plant Physiol 64: 236 (1979) mostró
que el nivel de QPRTasa en las raíces de los mutantes con nicotina
baja es proporcional a los niveles de nicotina en las hojas.
La presente invención abarca una nueva secuencia
de ADNc (SEC ID nº 1) que codifica una quinolato fosforribosil
transferasa vegetal (QPRTasa) de SEC ID nº2. Dado que la actividad
QPTRasa se correlaciona estrictamente con el contenido de nicotina,
la construcción de plantas de tabaco transgénicas en las que los
niveles de QPRTasa están reducidos en las raíces de la planta (en
comparación con los niveles en las plantas de tipo salvaje) da como
resultado plantas que tienen niveles reducidos de nicotina en las
hojas. La presente invención proporciona procedimientos y
constructos de ácido nucleico para producir tales plantas
transgénicas, así como tales plantas transgénicas. Esos
procedimientos incluyen la expresión de ARN antisentido de
NtQPT1, que disminuye la cantidad de QPRTasa en las raíces de
tabaco. Además, se ha encontrado nicotina en especies y familias de
plantas distintas a la del tabaco, aunque la cantidad presente
normalmente es mucho menor que en N. tabacum.
La presente invención también proporciona
moléculas de ADN sentido y antisentido que codifican moléculas de
ARN de QPRTasa o QPRTasa antisentido, y vectores que comprenden
estas moléculas de ADN recombinante, así como células vegetales
transgénicas y plantas transformadas con dichas moléculas de ADN y
dichos vectores. Las células y plantas de tabaco transgénicas de
esta invención se caracterizan por tener un contenido de nicotina
menor o mayor que las células y plantas de tabaco de control sin
transformar.
Las plantas de tabaco con niveles extremadamente
bajos de producción de nicotina, o sin producción de nicotina, son
atractivos como receptores de transgenes que expresan productos
comercialmente valiosos tales como productos farmacéuticos,
componentes cosméticos o aditivos alimentarios. El tabaco es
atractivo como una planta receptor para un transgén que codifica un
producto deseable, ya que el tabaco se puede producir fácilmente por
ingeniería genética y produce una biomasa muy grande por acre; las
plantas de tabaco con pocos recursos dedicados a la producción de
nicotina, en consecuencia tendrá más recursos disponibles para la
producción de productos transgénicos. Los procedimientos para la
transformación del tabaco con transgenes que producen los productos
deseados se conocen en la técnica; cualquier técnica adecuada puede
usarse con las plantas de tabaco con nicotina baja de la presente
invención.
Las plantas de tabaco según la presente invención
con expresión de QPRTasa reducida y niveles reducidos de nicotina
serán deseables en la producción de productos de tabaco con un
contenido de nicotina reducido. Las plantas de tabaco según la
presente serán adecuadas para usar en cualquier producto tradicional
de tabaco, incluidos, pero no limitado a, tabaco de pipa, de puros y
de cigarros, y tabaco masticable, y pueden estar en cualquier forma,
incluyendo hoja de tabaco, tabaco en polvo o tabaco troceado.
Los constructos de la presente invención también
pueden ser útiles para proporcionar plantas transgénicas con una
expresión aumentada de la QPRTasa y un mayor contenido de nicotina
en la planta. Tales constructos, los procedimientos para usar estos
constructos y las plantas producidas de este modo pueden ser
deseables en la producción de productos de tabaco con un contenido
alterado de nicotina o en la producción de plantas con un contenido
de nicotina mayor para sus efectos insecticidas.
Los presentes inventores han descubierto que el
gen TobRD2 (véase Conkling y col., Plant Phys. 93,
1203 (1990)) codifica una QPRTasa de Nicotiana tabacum, y
proporcionan en la presente memoria descriptiva la secuencia de ADNc
de NtQPT1 (antes denominada TobRD2) y la secuencia de
aminoácidos de la enzima codificada. Las comparaciones de la
secuencia de aminoácidos de NtQPT1 con la base de datos
GenBank revelan una similitud de secuencia limitada con proteínas
bacterianas que codifican la quinolato fosforribosil transferasa
(QPRTasa) (Figura 3).
La quinolato fosforribosil transferasa es
necesaria para la biosíntesis de novo de dinucleótido de
nicotinamida adenina (NAD) en procariotas y eucariotas. En el
tabaco, se detectan niveles elevados de QPRTasa en las raíces,
aunque no en las hojas. Para determinar que la QPRTasa codificada
por NtQPT1, los presentes inventores usaron la cepa
bacteriana de Escherichia coli (TH265), un mutante que carece
de quinolato fosforribosil transferasa (nadC^{+}). Este
mutante no puede crecer en medio mínimo sin ácido nicotínico. Sin
embargo, la expresión de la proteína NtQPT1 en esta cepa
bacteriana le confería el fenotipo NadC^{+} (Figura 4), lo
que confirma que el NtQPT1 codifica QPRTasa.
Los presentes inventores examinaron los efectos
de los mutantes Nic1 y Nic2 en el tabaco y los efectos
del despunte de las plantas de tabaco, sobre los niveles
estacionarios del ARNm de NtQPT1 y los niveles de nicotina.
(se sabe que la eliminación de la dominancia apical mediante el
despunte al inicio de la floración da lugar al aumento de los
niveles de biosíntesis de nicotina y transporte en el tabaco, y es
una práctica estándar en la producción de tabaco). Si el
NtQPT1 está en realidad implicado en la biosíntesis de
nicotina, cabría esperar que (1) los niveles de ARNm de
NtQPT1 serían menores en los mutantes dobles Nic1/Nic2
y (2) los niveles de ARNm de NtQPT1 aumentarían tras el
despunte. Se encontró que los niveles de ARNm de NtQPT1 en
los mutantes dobles Nic1/Nic2 eran aproximadamente el 25% de
los que tenía el tipo salvaje (Figura 5). Además, tras seis horas
del despunte, los niveles de ARNm de NtQPT1 En las plantas de
tabaco se multiplicaron por aproximadamente ocho. Por tanto, se
determinó que NtQPT1 era un gen regulador clave en la ruta de
la biosíntesis de la nicotina.
La regulación de la expresión génica en genomas
de células vegetales se puede conseguir mediante la integración de
ADN heterólogo bajo el control transcripcional de un promotor que es
funcional en el huésped y en el que la hebra transcrita de ADN
heterólogo es complementaria a la hebra de ADN que se transcribe del
gen endógeno que se va a regular. El ADN introducido, denominado ADN
antisentido, proporciona una secuencia de ARN que es complementaria
a los ARNm producidos de forma natural (endógenos) y que inhibe la
expresión del ARNm endógeno. El mecanismo de tal regulación de la
expresión génica mediante el antisentido no se entiende por
completo. Aunque no se desea anclarse a ninguna teoría única, se ha
observado que una teoría de la regulación antisentido propone que la
transcripción de ADN antisentido produce moléculas de ARN que se
unen a y previenen o inhiben la transcripción de moléculas de ARNm
endógeno.
En los procedimientos de la presente invención,
el producto antisentido puede ser complementario a las porciones
codificadoras o no codificadoras (o a ambas) del ARN natural
objetivo. La construcción antisentido puede introducirse en las
células de la planta a través de cualquier medio adecuado y puede
integrarse en el genoma de la planta para la transcripción
constitutiva o inducible de la secuencia antisentido. Véase, por
ejemplo, las patentes de EE.UU. números 5.453.566 y 5.107.065
concedida a Shewmaker y col. (Incorporada en la presente en su
totalidad como referencia).
Como se usa en la presente memoria descriptiva,
ADN (o ARN) heterólogo o exógeno se refiere al ADN (o ARN) que se ha
introducido en una célula (o en el ancestro de la células) mediante
los esfuerzos de seres humanos. Tal ADN heterólogo puede ser una
copia de una secuencia que se encuentra de forma natural en la
célula que se está transformando, o fragmentos de la misma.
Para producir una planta de tabaco con niveles
disminuidos de QPRTasa y, por tanto, menor contenido de nicotina,
que una planta de tabaco control sin transformar, una célula de
tabaco puede transformarse con una unidad transcripcional
antisentido exógena de QPRT que comprende una secuencia de ADNc de
QPRT parcial, una secuencia de ADNc de QPRT de longitud total, una
secuencia cromosómica de QPRT parcial o una secuencia cromosómica de
QPRT de longitud total, en la orientación antisentido con las
secuencias reguladoras adecuadas operablemente unidas. Las
secuencias reguladoras adecuadas incluyen una secuencia de
iniciación de la transcripción ("promotor") operable en la
planta que se está transformando, y una secuencia de terminación de
la transcripción/ de poliadenilación. A continuación se usan
técnicas estándar, tales como mapas de restricción, hibridación por
Southern blot y análisis de la secuencia de nucleótidos, para
identificar los clones que llevan las secuencias de QPRTasa en la
orientación antisentido, operablemente unidas a las secuencias
reguladoras. Después se regeneran las plantas de tabaco a partir de
las células transformadas con éxito. Es más preferible que la
secuencia antisentido usada sea complementaria a la secuencia
endógena, sin embargo, pueden tolerarse variaciones menores en las
secuencias exógenas y endógenas. Se prefiere que la secuencia de ADN
antisentido tenga la suficiente similitud se secuencia como para que
pueda unirse a la secuencia endógena en la células que se va a
regular, en condiciones estrictas como se describe más adelante.
La tecnología antisentido se ha usado en varios
laboratorios para crear plantas transgénicas caracterizadas por
cantidades de enzimas específicas menores de lo normal. Por ejemplo,
se han producido plantas con niveles reducidos de chalcone sintasa,
una enzima de la ruta biosintética de un pigmento de flores,
mediante la inserción de un gen antisentido de chalcone sintasa en
el genoma del tabaco y la petunia. Estas plantas de tabaco y de
petunia transgénicas producen flores con una coloración más ligera
de lo normal (Van der Krol y col., "An Anti-Sense
Chalcone Synthase Gene in Transgenic Plants inhibits Flower
Pigmentation", Nature, 333, págs. 866-69
(1988)). La tecnología de ARN antisentido también se ha usado con
éxito para inhibir la producción de la enzima poligalacturonasa en
tomates (Smith y col., "Antisense RNA Inhibition of
Polygalacturonase Gene Expression in Transgenic Tomatoes",
Nature, 334, págs. 724-726 (1988); Sheehy y col.,
"Reduction of Polygalacturonase Activity in Tomato Fruit by
Antisense RNA", Proc. Natl. Acad Sci. USA, 85, págs.
8805-09 (1988)), y la subunidad pequeña de la enzima
ribulosa bifosfato carboxilasa en la planta de tabaco (Rodermel y
col., "Nuclear-Organelle Interactions: Nuclear
Antisense Gene Inhibits Ribulose Biphosphate Carboxylase Enzyme
Levels in Transformed Tobacco Plants", Cell, 55, págs.
673-81 (1988)). Por otro lado, pueden crearse
plantas transgénicas caracterizadas por cantidades superiores a las
normales de una enzima determinada mediante la transformación de las
plantas con el gen para esa enzima en la orientación sentido (es
decir, normal). Los niveles de nicotina en las plantas de tabaco
transgénicas de la presente invención pueden detectarse mediante
ensayos estándar de nicotina. Las plantas transformadas en las que
el nivel de QPRTasa está reducido en comparación con las plantas
control sin transformar tendrán, en consecuencia, un nivel reducido
de nicotina en comparación con el control; las plantas transformadas
en las que el nivel de QPRTasa está aumentado en comparación con las
plantas control sin transformar tendrán, en consecuencia, un nivel
de nicotina aumentado en comparación con el control.
La secuencia heteróloga usada en los
procedimientos antisentido de la presente invención puede
seleccionarse de forma que produzca un producto de ARN
complementario a toda la secuencia de ARNM de la QPRTasa o una
porción de la misma. La secuencia puede ser complementaria a
cualquier secuencia adyacente del ARN mensajero natural, es decir,
puede ser complementaria a la secuencia de ARNm endógeno proximal al
extremo 5' o al sitio de remate, en dirección 3' del sitio de
remate, entre el sitio de remate y el codón de iniciación y puede
cubrir todo o solo una parte de la región no codificadora, puede
unir las regiones codificadora y no codificadora, ser complementaria
a toda o parte de la región codificadora, complementaria al extremo
3' de la región codificadora o complementaria a la región 3' sin
traducir del ARNm. As secuencias antisentido adecuadas pueden ser de
al menos alrededor de 13 a alrededor de 15nucleótidos, al menos
alrededor de 16 a alrededor de 21 nucleótidos, al menos alrededor de
20 nucleótidos, al menos alrededor de 30 nucleótidos, al menos de
alrededor de 50 nucleótidos, al menos alrededor de 75 nucleótidos,
al menos alrededor de 100 nucleótidos, al menos alrededor de 125
nucleótidos, al menos alrededor de 150 nucleótidos, al menos
alrededor de 200 nucleótidos, o más. Además, las secuencias pueden
alargase o acortarse en los extremos 3' 0 5' de las mismas.
La secuencia antisentido concreta y la longitud
de la secuencia antisentido variará en función del grado de
inhibición deseado, la estabilidad de la secuencia antisentido, y
similares. Un experto en la técnica se guiará en la selección de las
secuencias antisentido de QPRTasa adecuadas usando técnicas
disponibles en la técnica y la información que se proporciona en la
presente memoria descriptiva. Respecto a la Figura 2A y la SEC ID nº
1 de la presente memoria descriptiva, un oligonucleótido de la
invención puede ser un fragmento continuo de la secuencia de ADNc de
QPRTasa en la orientación antisentido, de cualquier longitud que sea
suficiente para conseguir los efectos deseados cuando se transforma
en una célula vegetal receptora.
La presente invención también se puede usar en
procedimientos de cosupresión en orientación sentido de la
producción de nicotina. Los ADN con orientación sentido empleados
para llevar a cabo la presente invención son de una longitud
suficiente para que, cuando se expresan en una célula vegetal,
supriman la expresión nativa de la proteína QPRTasa de la planta
como se describe en la presente memoria descriptivaen esa célula
vegetal. Tales ADN sentido pueden ser esencialmente un ADN entero
genómico o complementario que codifica la enzima QPRTasa, o un
fragmento del mismo, en los que tales fragmentos tiene típicamente
al menos 15 nucleótidos de longitud. Los procedimientos para
determinar la longitud del ADN sentido que da lugar a la supresión
de la expresión de un gen nativo en una célula están disponibles
para los expertos en la técnica.
En una forma de realización alternativa de la
presente invención, se transforman células de la planta
Nicotiana con un constructo de ADN que contiene un segmento
de ADN que codifica una molécula de ARN enzimática (es decir una
"ribozima"), estando dirigida la molécula de ARN enzimática
frente a (es decir, fragmenta) el tránscrito de ARNm del ADN que
codifica la QPTRasa de la planta como se describe en la presente
memoria descriptiva. Las ribozimas contienen dominios de unión al
sustrato que se unen a regiones accesibles del ARNm objetivo, y
dominios que catalizan la escisión de ARN, lo que impide la
traducción y la producción de proteínas. Los dominios de unión
pueden comprender secuencias antisentido complementarias a la
secuencia de ARNm objetivo; el motivo catalítico puede ser un motivo
en cabeza de martillo u otros motivos, tales como el motivo en
horquilla. Los sitios de escisión de las ribozimas dentro de un ARN
objetivo pueden identificarse inicialmente mediante rastreo de la
molécula objetivo en busca de los sitios de escisión de las
ribozimas (por ejemplo, secuencias GUA, GUU o GUC). Una vez que se
han identificado, pueden evaluarse las secuencias cortas de ARN de
15, 20, 30 o más ribonucleótidos correspondientes a la región del
gen objetivo que contiene el sitio de escisión, para detectar
características estructurales predichas. La adecuación de los
objetivos candidatos también puede evaluarse comprobando su
accesibilidad a la hibridación con oligonucleótidos complementarios,
usando ensayos de protección de ribonucleasa como se conocen en la
técnica. El ADN que codifica las moléculas de ARN enzimáticas puede
producirse de acuerdo con técnicas conocidas. Véase, por ejemplo, T.
Cech y col., patente de EE.UU. nº 4.987.971; Keene y col., patente
de EE.UU. nº 5.559.021; Donson y col., patente de EE.UU. nº
5.589.387; Torrence y col., patente de EE.UU. nº 5.583.032; Joyce,
patente de EE.UU. nº 5.580.967; Gold y col., patente de EE.UU. nº
5.595.877; Wagner y col., patente de EE.UU. nº 5.591.601 y patente
de EE.UU. nº 5.622.854 (las descripciones de las cuales se
incorporan en la presente memoria descriptiva como referencia en su
totalidad). La producción de tal molécula de ARN enzimática en una
célula vegetal y la alteración de la producción de la proteína
QPRTasa reduce la actividad QPRTasa en las células vegetales de
esencialmente del mismo modo que la producción de la molécula de ARN
antisentido: es decir, alterando la traducción del ARNm en la célula
que produce la enzima. El término "ribozima" se usa en la
presente memoria descriptiva para describir un ácido nucleico que
contiene ARN que funciona como una enzima (tal como una
endorribonucleasa) y puede usarse de forma intercambiable con
"molécula de ARN enzimático". La presente invención también
incluye ADN que codifica las ribozimas, ADN que codifica ribozimas
que se han insertado en un vector de expresión, células huésped que
contienen tales vectores y procedimientos para reducir la producción
de QPRTasa en plantas usando ribozimas.
Las secuencias de ácido nucleico usadas para
llevar a cabo la presente invención incluyen aquellas con secuencia
similar a la SEC ID nº1 y que codifican una proteína con actividad
quinolato fosforribosil transferasa. Se pretende que esta definición
abarque variaciones alélicas naturales en las proteínas QPRTasa. Por
tanto, las secuencias de ADN que hibridan con el ADN de la SEC ID
nº1 y codifican la expresión de QPRTasa, particularmente enzimas
QPRTasa vegetales, también pueden usarse para llevar a cabo la
presente invención.
Pueden existir diversas formas de enzima QPRT de
tabaco. Las diversas formas pueden deberse a modificaciones
postraduccionales de un único producto génico o a varias formas del
gen NtQPT1.
Las condiciones que permiten la hibridación de
otras secuencias de ADN que codifican para la expresión de una
proteína con actividad QPRTasa con el ADN de la SEC ID nº1 u otras
secuencias de ADN que codifican la proteína dad como la SEC ID nº 2
pueden determinarse de forma rutinaria. Por ejemplo, la hibridación
de tales secuencias puede llevarse a cabo en condiciones
restrictivas o incluso en condiciones estrictas (por ejemplo, las
condiciones representadas por una STRINGENCY de lavado de NaCl 0,3
M, citrato sódico 0,03M, SDS al 0,1% a 60ºC o incluso a 70ºC para
ADN que codifica la proteína dada como SEC ID Nº 2 en la presente
memoria descriptiva en un ensayo de hibridación in situ
estándar. Véase J. Sambrook y col., Molecular Cloning, A Laboratory
Manual (2ª Ed. 1989) (Cold Spring Harbor Laboratory)). En general,
tales secuencias tendrán una similitud de al menor el 65%, del 75%,
del 80%, del 85%, del 90% o incluso del 95%, o más, con la secuencia
dada en la presente memoria descriptiva como SEC ID nº 1, o
secuencias de ADN que codifican proteínas de la SEC ID nº2. (Las
determinaciones de la similitud de secuencia se realizan con las dos
secuencias alineadas para que tengan una coincidencia máxima; en una
coincidencia máxima se permiten los huecos en cualquiera de las dos
secuencias que se están emparejando. Se prefieren los huecos de
longitudes de 10 o menores, son más preferidos los huecos de
longitudes de 5 o menores y todavía más preferidos son los huecos de
longitudes de 2 o menores.)
Están disponibles procedimientos de hibridación
diferencial que permiten el aislamiento de clones de ADNc cuyos
niveles de ARNm son tan bajos como de aproximadamente 0,05% de ARN
poli(A^{+}). Véase Conkling y col., Plant Physiol.
93, 1203-1211 (1990).Brevemente, se busca en las
genotecas de ADNc usando sondas de ADNc monocatenarios de ARNm de
transcripción inversa de tejido vegetal (por ejemplo, raíces y/o
hojas). Para la detección selectiva diferencial, una membrana de
nitrocelulosa o de nailon se empapa con 5XSSC, se coloca en un
colector de succión de 96 pocillos, a cada pocillo se transfieren
150 \mul de un cultivo estacionario durante la noche de una placa
madre y se aplicó el vacío hasta que todo el líquido haya pasado a
través de un filtro. En cada pocillo se introducen 150 \mul de
solución de desnaturalización (NaOH 0,5 M, NzCl 1,5M) se introducen
en cada pocillo usando una multipipeta y se dejó reposar durante
aproximadamente 3 minutos. Se aplica succión como antes y se elimina
el filtro y se neutraliza en tris-HCL 0,5M (pH 8,0),
NaCl 1,5M. Después se deja 2 horas al vacío y se incuba con las
sondas relevantes. Mediante el uso de filtros de membrana de nailon
y manteniendo las placas madre almacenadas a -70ºC en DMSO al 7%, se
pueden examinar los filtros varias veces con diversas sondas y se
pueden recuperara los clones adecuados tras varios años de
almacenamiento.
Como se usa en la presente memoria descriptiva,
el término "gen" se refiere a una secuencia de ADN que
incorpora (1) señales reguladoras (5') en dirección 5' en las que
está incluido el promotor, (2) una región codificadora que
especifica el producto, la proteína o el ARN del gen, (3) regiones
(3') en dirección 3' en las que están incluidas señales de
terminación de la transcripción y de poliadenilación y (4)
secuencias asociadas necesarias para una expresión eficiente y
específica.
La secuencia de ADN de la presente invención
puede estar formada esencialmente por la secuencia proporcionada en
la presente memoria descriptiva (SEC ID nº 1) o secuencias
nucleotídicas equivalentes que representan alelos o variantes
polimórficas de estos genes, o regiones codificadores de los
mismos.
El uso de la expresión "similitud sustancial
con la secuencia" en la presente descripción y reivindicaciones
significa que las secuencias de ADN, ARN o de aminoácidos que tienen
variaciones ligeras y sin consecuencias en su secuencia respecto de
las secuencias reales descritas y reivindicadas en la presente
memoria descriptiva se consideran equivalentes a las secuencias de
la presente invención. A este respecto, "variaciones ligeras y sin
consecuencias de la secuencia" significa que secuencias
"similares" (es decir, las secuencias que tienen una similitud
sustancial con el ADN el ARN o las proteínas descritas y
reivindicadas en la presente invención) serán funcionalmente
equivalentes a las secuencias descritas y reivindicadas en la
presente invención. Las secuencias funcionalmente equivalentes
funcionarán sustancialmente de la misma manera para producir
sustancialmente las mismas composiciones que las composiciones de
ácidos nucleicos y aminoácidos descritas y reivindicadas en la
presente memoria descriptiva.
Las secuencias de ADN que se proporcionan en la
presente memoria descriptiva pueden transformarse en una serie de
células huésped. Una serie de células huésped adecuadas, con las
propiedades de crecimiento y manejo deseadas, están disponibles con
facilidad en la técnica.
El uso de la expresión "aislado" o
"sustancialmente puro" en la presente descripción y
reivindicaciones como un modificador de ADN, ARN, polipéptidos o
proteínas significa que el ADN, ARN, polipéptidos o proteínas
designadas de esta forma se han separado de sus entornos celulares
in vivo mediante los esfuerzos de seres humanos.
Como se usa en la presente memoria descriptiva,
una "secuencia de ADN nativo" o "secuencia de ADN natural"
significa una secuencia de ADN que puede aislarse de células o
tejidos no transgénicos. Las secuencias de ADN nativo son aquéllas
que no se han alterado de forma artificial, como por ejemplo
mediante mutagénesis dirigida a sitio. Una vez que se han
identificado las secuencias de ADN nativo, las moléculas de ADN que
tienen secuencias de ADN nativo pueden sintetizarse químicamente o
producirse usando procedimientos de ADN recombinante, como se
conocen en la técnica. Como se usa en la presente memoria
descriptiva, una secuencia de ADN vegetal nativo es aquéllas que
puede aislarse de células o tejidos vegetales no transgénicos. Como
se usa en la presente memoria descriptiva, una secuencia de ADN de
tabaco nativo es aquéllas que se puede aislar de células o tejido de
tabaco no transgénico.
Los constructos de ADN, o "casetes de
transcripción", de la presente invención incluyen de 5' a 3' en
la dirección de la transcripción, un promotor como el analizado en
la presente memoria descriptiva, una secuencia de ADN como se
menciona en la presente memoria descriptiva, asociada operativamente
con el promotor y, opcionalmente, una secuencia de terminación en la
que está incluida una señal de terminación para la ARN polimerasa y
una señal de polimerización para la poliadenilasa. Todas estas
regiones reguladoras deberían poder funcionar en las células del
tejido que se va a transformar. Para llevar a cabo la presente
invención puede usarse cualquier señal de terminación adecuada,
entre los ejemplos las mismas se incluyen, pero no se limita a
ellos, el terminador de nopalina sintasa (nos), el terminador
de octapina sintasa (ocs), el terminador de CaMV, o señales
de terminación nativas derivadas del mismo gen que la región de
iniciación de la transcripción o derivadas de un gen diferente.
Véase, por ejemplo, Rezian y col. (1988) más adelante y Rodermel y
col. (1988), más adelante.
El término "operativamente asociado", como
se usa en la presente memoria descriptiva, se refiere a secuencias
de ADN en una sola molécula de ADN que están asociadas de forma que
la función de una se ve afectada por la otra. Por tanto, un promotor
está operativamente asociado con un ADN cuando es capaz de afectar a
la transcripción de ese ADN (es decir, el ADN está bajo control
transcripciones del promotor). Se dice que el promotor está "en
dirección 5'" del ADN, que a su vez se dice que está " en
dirección 3'" del promotor.
El casete de transcripción puede proporcionarse
en un constructo de ADN que también tiene al menos un sistema de
replicación. Por conveniencia, es habitual tener un sistema de
replicación funcional en Escherichia coli, tal como ColE1,
pSC101, pACYC184, o similares. De este modo, en cada etapa tras cada
manipulación, el constructo resultante puede clonarse, secuenciarse
y se puede determinar la corrección de la manipulación. Además, o en
lugar del sistema de replicación de E. coli, se puede emplear
una amplia gama de sistemas de replicación de huéspedes, tales como
los sistemas de replicación de los plásmidos de incompatibilidad
P-1, por ejemplo pRK290. Además del sistema de
replicación, con frecuencia habrá al menos un marcador, que puede
ser útil en uno o más huéspedes, o marcadores diferentes de
huéspedes individuales. Es decir, se puede usar un marcador para la
selección en un huésped procariota, mientras que puede usarse otro
marcador para la selección en un huésped eucariota, en particular el
huésped vegetal. Los marcadores pueden representar protección frente
a un biocida, tales como antibióticos, toxinas, metales pesados, o
similares; pueden proporcionar complementación impartiendo
prototrofia a un huésped auxotrófico; pueden proporcionar un
fenotipo visible a través de la producción de un compuesto nuevo en
la planta.
Los diversos fragmentos que comprenden los
diversos constructos, casetes de transcripción, marcadores y
similares, pueden introducirse consecutivamente por escisión con
enzimas de restricción de un sistema de replicación adecuado e
inserción del constructo o fragmento concreto en el sitio
disponible. Después de la ligadura y la clonación, el constructo de
ADN puede aislarse para su posterior manipulación. Todas estas
técnicas se ilustran con ejemplos ampliamente en la literatura, como
los ejemplos proporcionados por J. Sambrook y col., Molecular
Cloning. A Laboratory Manual (2ª ed. 1989) (Cold Spring Harbor
Laboratory).
Entre los vectores que pueden usarse para
transformar tejido vegetal con constructos de ácido nucleico de la
presente invención se incluyen vectores de Agrobacterium y
vectores balísticos, así como vectores adecuados para la
transformación mediada por ADN.
El término "promotor" se refiere a una
región de una secuencia de ADN que incorpora las señales necesarias
para la expresión eficaz de una secuencia codificadora. Esto puede
incluir secuencias a las que se une una ARN polimerasa, aunque no
está limitado a tales secuencias y puede incluir regiones a las que
otras proteínas reguladoras se unen junto con regiones implicadas en
el control de la traducción de proteínas y puede incluir secuencias
codificadoras.
Los promotores usados para llevar a cabo la
presente invención pueden ser promotores activos de forma
constitutiva. Están disponibles varios promotores constitutivamente
activos que funcionan en plantas. Un ejemplo preferido es el
promotor 35S del virus del mosaico de la coliflor (CaMV), que se
expresa de forma constitutiva en la mayoría de los tejidos
vegetales. Como alternativa, el promotor puede ser un promotor
específico de la raíz o un promotor específico de la corteza de la
raíz, como a continuación se explica más detalladamente.
En plantas de tabaco transgénicas se han
expresado secuencias antisentido usando el promotor 35S del virus
del mosaico de la coliflor (CaMV). Véase, por ejemplo,
Cornelissen y col., "Both RNA Level and Translation Efficiency are
Reduced by Anti-Sense RNA in Transgenic Tobacco",
Nucleic Acids Res. 17, págs. 833-43 (1989);
Rezaian y col., "Anti-Sense RNAs of Cucumber
Mosaic Virus in Transgenic Plants Assessed for Control of the
Virus", Plant Molecular Biology 11, págs.
463-71 (1988); Rodermel y col.,
"Nuclear-Organelle Intercations: Nuclear Antisense
Gene Inhibits Ribulose Biphosphate Carboxylase Enzyme Levels in
Transformed Tobacco Plants", Cell 55, págs.
673-81 (1988); Smith y col., "Antisense RNA
Inhibition of Polygalacturonase Gene Expression in Transgenic
Tomatoes", Nature 334, págs. 724-26 (1988); Van
der Krol y col., "An Anti-Sense Chalcone Synthase
Gene in Transgenic Plants Inhibits Flower Pigmentation";
Nature 333, págs. 866-69 (1988).
Se prefiere el uso del promotor 35S de CaMV para
la expresión de la QPRTasa en las células y plantas de tabaco
transformadas de esta invención. El uso del promotor CaMV para la
expresión de otros genes recombinantes en las raíces de tabaco se ha
descrito bien (Lam y col., "Site-Specific
Mutations Alter In Vitro Factor Binding and Change Promoter
Expression Pattern in Transgenic Plants", Proc. Nat. Acad.
Sci. USA 86, págs. 7890-94 (1989); Poulsen y
col., "Dissection of 5' Upstream Sequences for Selective
Expression of the Nicotiana plumbaginifolia
rbcS-8B Gene", Mol. Gen. Genet. 214, págs.
16-23 (1988)).
Otros promotores que son activos sólo en los
tejidos radiculares (promotores específicos de raíz) también son
particularmente adecuados para los procedimientos de la presente
invención. Véase, por ejemplo, la patente de EE.UU. nº
5.459.252 concedida a Conkling y col.; Yamamoto y col., The Plant
Cell, 3:371 (1991). También se puede usar el promotor específico
de corteza-raíz TobRD2. Véase, por ejemplo, la
solicitud de patente de EE.UU. SN 08/508.786, ahora permitida,
concedida a Conkling y col.; El documento PCT WO 9705261. Se
pretende incorporar todas las patentes citadas en la presente
memoria descriptiva en su totalidad como referencia.
Las moléculas de ADN recombinante de QPRTasa y
los vectores usados para producir las células y plantas de tabaco
transformadas pueden además comprender un gen marcador dominante
seleccionable. Entre los marcadores seleccionables adecuados para
usar en tabaco se incluyen, entre otros, genes de resistencia a
antibióticos que codifican neomicín fosfotransferasa (NPTII,
higromicín fosfotransferasa (HPT) y cloranfenicol acetiltransferasa
(CAT). Otro marcador seleccionable dominante bien conocido adecuado
para usar en plantas de tabaco es un gen mutante de la dihidrofolato
reductasa que codifica dihidrofolato reductasa resistente a
metotrexato. Los vectores de ADN que contienen los genes adecuados
de resistencia a antibióticos, y los correspondientes antibióticos,
están disponibles en el mercado.
Las células de tabaco transformadas se
seleccionan de la población circundante de células sin transformar
introduciendo la población de células mixtas en un medio de cultivo
que contiene una concentración adecuada del antibiótico (u otro
compuesto generalmente tóxico para las células de tabaco) frente al
cual el producto del gen del marcador seleccionable dominante
escogido confiere resistencia. Por tanto, sólo las células de tabaco
que se han transformado sobrevivirán y se multiplicarán.
En general, los procedimientos para preparar
plantas recombinantes de la presente invención implican, en primer
lugar, proporcionar una célula vegetal capaz de regenerarse (la
célula vegetal que típicamente reside en un tejido capaz de
regeneración). Después, la célula vegetal se transforma con un
constructo de ADN que comprende un casete de transcripción de la
presente invención (como se describe en la presente memoria
descriptiva) y se regenera una planta recombinante a partir de la
célula vegetal transformada. Como se explica a continuación, la
etapa de transformación se lleva a cabo mediante técnicas conocidas
en la materia, incluyendo pero no limitándose al bombardeo de la
célula vegetal con micropartículas que portan el casete de
transcripción, la infección de la célula con una Agrobacterium
tumefaciens que contiene un plásmido Ti portador del casete de
transcripción, o cualquier otra técnica adecuada para la producción
de una planta transgénica.
Se conocen varios sistemas de vectores de
Agrobacterium útiles para llevar a cabo la presente
invención. Por ejemplo, la patente de EE.UU. nº 4.459.355 describe
un procedimiento para transformar plantas susceptibles, incluyendo
dicotiledóneas, con una cepa de Agrobacterium que contiene el
plásmido Ti. La transformación de plantas leñosas con un vector de
Agrobacterium se describe en la patente de EE.UU. nº
4.795.855. Además, la patente de EE.UU. nº 4.940.828 concedida a
Schillperoort y col., describe un vector binario de
Agrobacterium (es decir, uno en el Agrobacterium
contienen un plásmido que tiene la región vir de un plásmido Ti pero
no la región T, y un segundo plásmido que tiene una región T pero no
la región vir) útil para llevar a cabo la presente invención.
Las micropartículas portadoras de un constructo
de ADN de la presente invención, siendo dichas micropartículas
adecuadas para la transformación balística de una célula vegetal,
también son útiles para preparar plantas transformadas de la
presente invención. La micropartícula se impulsa al interior de una
célula vegetal para producir una célula vegetal transformada y a
partir de la célula vegetal transformada se regenera una planta. En
la práctica de la presente invención se puede usar cualquier
metodología y aparato adecuados para la transformación celular
balística. Aparatos y procedimientos ejemplo se describen en Sanford
y Wolf, patente de EE.UU. nº 4.945.050, y en Christou y col.,
patente de EE.UU. nº 5.015.580. Cuando se usan los procedimientos de
transformación balística, el casete de transcripción puede
incorporarse en un plásmido capaz de replicarse o integrarse en la
célula que se va a transformar. Entre los ejemplos de
micropartículas adecuadas para usar en tales sistemas se incluyen
esferas de oro de 1 a 5\mum. El constructo de ADN puede
depositarse en la micropartícula por medio de cualquier técnica
adecuada, como mediante precipitación.
Especies vegetales pueden transformarse con el
constructo de ADN de la presente invención mediante la
transformación mediada por ADN de protoplastos de célula vegetal y
la posterior regeneración de la planta a partir de los protoplastos
transformados de acuerdo con procedimientos bien conocidos en la
técnica. La fusión de protoplastos de tabaco con liposomas que
contienen ADN o mediante electroporación se conoce en la técnica,
(Shillito y col., "Direct Gene Transfer to Protoplasts of
Dicotyledonous and Monocotyledonous Plants by a Number of Methods,
Including Electroporation", Methods in Enzymology 153,
págs. 3131-36 (1987)).
Como se presenta en la presente memoria
descriptiva, la transformación se refiere la introducción de ADN
exógeno en las células, con el fin de producir células transgénicas
transformadas de forma estable con el ADN exógeno.
Las células transformadas se inducen para
regenerar las plantas de tabaco intactas a través de la aplicación
de técnicas de cultivo de tejidos y células de tabaco que se conocen
bien en la técnica. El procedimiento de la regeneración de la planta
se escoge de forma que sea compatible con el procedimiento de
transformación. La presencia estable y la orientación de la
secuencia de QPRTasa en las plantas de tabaco transgénicas se puede
verificar mediante herencia mendeliana de la secuencia de QPRTasa,
como se revela mediante procedimientos de análisis de ADN aplicados
a la progenie resultante de los cruces controlados. Después de la
regeneración de plantas de tabaco transgénicas a partir de las
células transformadas, la secuencia de ADN introducida se transfiere
con facilidad a otras variedades de tabaco por medio de prácticas
convencionales de cultivo de plantas y sin experimentación
indebida.
Por ejemplo, para analizar la segregación del
transgen, se puede hacer crecer las plantas transformadas
regeneradas (R_{0}) hasta que alcancen la madurez, comprobar sus
niveles de nicotina y autopolinizar para producir plantas R_{1}.
Un porcentaje de las plantas R_{1} portadoras del transgén es
homozigotas para el transgén. Para identificar las plantas R_{1}
homozigotas, se induce el crecimiento de las plantas R_{1}
transgénicas hasta su madurez y se las autopoliniza. Las plantas
R_{1} homozigotas producirán progenie R_{2}, donde cada una de
las plantas de la progenie portan el transgen; la progenie de la
plantas R_{1} heterozigotas segregarán 3:1.
Como la nicotina es útil como pesticida natural,
ayuda a proteger a las plantas de tabaco del daño producido por las
plagas. Por tanto, puede ser deseable transformar adicionalmente
plantas con poca o nada nicotina producidas mediante los presentes
procedimientos con un transgén (tal como Bacillus
thuringiensis) que le conferirá más protección frente a
insectos.
Una planta preferida para usar en los presentes
procedimientos son especies de Nicotiana, o tabaco,
incluyendo N. tabacum, N. rustica y N.
glutinosa. Puede usarse cualquier cepa o variedad de tabaco. Se
prefieren las cepas que ya tienen un contenido bajo de nicotina, tal
como mutantes dobles Nic1/Nic2.
Cualquier tejido vegetal capaz de la posterior
propagación clonal, ya sea mediante organogénesis o embriogénesis,
puede transformarse con un vector de la presente invención. El
término "organogénesis", como se usa en la presente memoria
descriptiva, significa un procedimiento por el cual se desarrollan
de forma secuencial brotes y raíces a partir de centros
meristemáticos; el término "embriogénesis", como se usa en la
presente memoria descriptiva, significa un procedimiento por el cual
se desarrollan brotes y raíces juntos de forma concertada (no
secuencialmente), a partir de células somáticas o de gametos. El
tejido concreto escogido variará en función de los sistemas de
propagación clonal disponibles para, y más adecuados, la especie en
concreto que se está transformando. Entre los objetivos tisulares
ejemplo se incluyen discos de hoja, polen, embriones, cotiledones,
hipocotilos, tejido calloso, tejido meristemático existente (por
ejemplo, meristemos apicales, yemas axilares y meristemos
radiculares) y tejido meristemático inducido (por ejemplo, meristemo
de cotiledón y meristemo del hipocotilo).
Las plantas de la presente invención pueden tomar
una serie de formas. Las plantas pueden ser quimeras de células
transformadas y de células sin transformar; las plantas pueden ser
transformantes clonales (por ejemplo, todas las células
transformadas para contener el casete de transcripción); las plantas
pueden comprender injertos de tejidos de transformados y sin
transformar (por ejemplo, una parte de raíz transformada traspasada
a un injerto sin transformar en especies de cítricos). Las plantas
transformadas pueden propagarse mediante una variedad de medios,
tales como propagación clonal o técnicas de cultivo clásicas. Por
ejemplo, la primera generación (o T1) de las plantas transformadas
puede SELFED??? para dar la segunda generación homozigota (o
T2) de plantas transformadas, y las plantas T2 se pueden propagar
más mediante técnicas clásicas de cultivo. Un marcador seleccionable
dominante (tal como nptII) se puede asociar con el casete de
transcripción para ayudar en el cultivo.
En vista de lo anterior, será evidente que las
plantas que pueden usarse para la práctica de la presente invención
incluyen aquéllas del género Nicotiana.
Aquéllos que están familiarizados con los
procedimientos de ADN recombinante descritos anteriormente
reconocerán que se puede usar una molécula de ADNc de QPRTasa de
longitud total o un gen cromosómico de QPRTasa de longitud total,
unidos en la orientación sentido, con las secuencias reguladoras
adecuadas operablemente unidas, para construir células y plantas de
tabaco transgénicas. (Aquellos expertos en la técnica también
reconocerán que las secuencias reguladoras adecuadas para la
expresión de genes en la orientación sentido incluyen una cualquiera
de las secuencias conocidas de inicio de la traducción eucariótica,
además del promotor y de las secuencias de terminación de la
transcripción/poliadenilación descritas antes). Tales plantas de
tabaco transformadas se caracterizan por niveles aumentados de
QPRTasa y, por tanto, por un contenido mayor de nicotina que las
plantas de tabaco control sin transformar.
En consecuencia, debe entenderse que el uso de
secuencias de ADN de la QPRTasa para disminuir o aumentar los
niveles de la enzima QPRT y, por tanto, disminuir o aumentar el
contenido de nicotina en las plantas de tabaco, entra dentro del
alcance de la presente invención.
Como se usa en la presente memoria descriptiva,
una cosecha comprende una pluralidad de plantas de la presente
invención, y del mismo género, plantadas juntas en un campo
agrícola. Por "campo agrícola" se entiende un plano común de
tierra o un invernadero. Por tanto, la presente invención
proporciona un procedimiento para producir una cosecha de plantas
que tienen actividad QPRTasa alterada y, en consecuencia, que tienen
niveles aumentados o disminuidos de nicotina en comparación con una
cosecha similar de plantas sin transformar de la misma especie y
variedad.
Los siguientes ejemplos se establecen para
ilustrar la presente invención y no deben interpretarse como
limitantes de la misma.
El ADNc de TobRD2 (Conkling y col.,
Plant Phys. 93, 1203 (1990)) se secuenció y se proporciona en
la presente memoria descriptiva como la SEC ID nº1, y la secuencia
de aminoácidos deducida como SEC ID nº 2. Se ha predicho que la
secuencia de aminoácidos deducida era una proteína citosólica.
Aunque no se han publicado los genes de QPRTasa vegetal, las
comparaciones de la secuencia de aminoácidos de NtPT1 con la
base de datos GenBank (Figura 3) revelaron una similitud limitada de
la secuencia con ciertas proteínas bacterianas y otras; se ha
demostrado la actividad quinolato fosforribosil transferasa
(QPRTasa) para los genes de S. Typhimurium, E.
coli y N. tabacum. La QPRTasa codificada en NtQPT1
tiene similitud con el fragmento peptídico deducido codificado por
una secuencia EST (Secuencia marcadora de expresión) de
Arabisopsis (número de identificación de Genbank F20096), que
puede representar parte de un gen de QPRTasa de
Arabidopsis.
Para determinar la distribución espacial de los
tránscritos de ARNm de TobRD2 en los diversos tejidos de la raíz, se
realizaron hibridaciones in situ en plantas sin transformar.
Las hibridaciones in situ de la hebra antisentido del TobRD2
con el ARNm de TobRD2 en tejido radicular se realizaron usando
técnicas como se describen en Meyerowitz, Plant Mol. Biol.
Rep. 5.242 (1987) y Smith y col., Plant Mol. Biol. Rep.
5, 237 (1987). Raíces de plantones de tabaco (Nicotiana
tabacum) de siete días se fijaron en glutaraldehído tamponado
con fosfato, se embebieron en Paraplast Plus (Monoject Inc., Saint
Louis, MO) y se seccionaron a 8 mm de espesor para obtener secciones
transversales y longitudinales. Los tránscritos antisentido de
TobRD2, sintetizados in vitro en presencia de AT_35S, se
usaron como sondas. El ARN marcado se hidrolizó mediante tratamiento
alcalino para dar una masa de longitud media de 100 a 200 bases
antes de su uso.
Las hibridaciones se realizaron en formamida al
50% durante 16 horas a 42ºC, con aproximadamente 5 x 10^{6}
cuentas por minuto (cpm) de ARN marcado por mililitro de solución de
hibridación. Tras la exposición, las SLIDES se desarrollaron y se
visualizaron con microscopia de campo claro y oscuro.
La señal de hibridación estaba localizada en la
capa cortical de células en las raíces (los resultados no se
muestran). La comparación de las imágenes de campo oscuro y claro de
las mismas secciones localizó los tránscritos de TobRD2 en las
células parenquimáticas de la corteza radicular. No se observó
ninguna señal de hibridación en la epidermis o la estela.
Los niveles estacionarios de ARNm de TobRD2
se estudiaron en plantas de tabaco mutantes para Nic1 y
Nic2. Se sabe que Nic1 y Nic 2 regulan las
actividades quinolato fosforribosil transferasa y putrescina metil
transferasa, y son reguladores codominantes de la producción de
nicotina. Los presentes resultados se ilustran en las Figuras 5A y
5B y muestran que la expresión de TobRD2 está regulada por
Nic1 y Nic2.
Se aisló ARN de las raíces de plantas de tabaco
de tipo salvaje Burley 21 (Nic1/Nic1 Nic2/Nic2);
raíces de Burley 21-Nic1 (nic1/nic1 Nic2/Nic2);
raíces de Burley 21-Nic2 (Nic1/Nic1 nic2/nic2);
y raíces de Burley21- Nic1-Nic2
(nic1/nic1 nic2/nic2).
Cuatro líneas de tabaco Burley 21 (nic) se
hicieron crecer a partir de las semillas en suelo durante 1 mes y
se transfirieron a cámaras hidropónicas en una solución nutritiva
aireada en un invernadero durante un mes. Estas líneas eran
isogénicas, a excepción de dos loci bajos en nicotina, y tenían
genotipos de Nic1/Nic1 Nic2/Nic2, Nic1/Nic1 nic2/nic2, nic1/nic1
Nic2/Nic2, nic1/nic1 nic2/nic2. Se recogieron las raíces de
aproximadamente 20 plantas para cada genotipo y se almacenaron para
el aislamiento del ARN. El ARN total (1\mug)de cada
genotipo se sometió a electroforesis a través de un gel de agarosa
al 1% que contiene formaldehído 1,1M y se transfirió a una membrana
de nailon según Sambrook y col (1989). Las membranas se hibridaron
con fragmentos de ADNc de TobRD2 marcado con ^{32}P. La
intensidad relativa de los tránscritos de TobRD2 se midió
mediante densitometría. La Figura 5 (barras negras) ilustra los
niveles relativos de tránscrito (comparados con Nic1/Nic1
Nic2/Nic2) para cada uno de los cuatro genotipos. El
contenido relativo de nicotina (comparado con Nic1/Nic1
Nic2/Nic2) de los cuatro genotipos se muestra en las barras a
rayas.
La Figura 5 compara gráficamente el nivel de ARNm
de TobRD2 estacionario relativo, usando el nivel encontrado
en Burley-21 de tipo salvaje (Nic1/Nic1
Nic2/Nic2) como la cantidad de referencia. Los niveles de
ARNm de TobRD2 en los dobles mutantes Nic1/Nic2 fueron
aproximadamente el 2% del tabaco de tipo salvaje. La Figura 5B
además compara los niveles relativos de nicotina en las líneas casi
isogénicas de tabaco estudiadas en este ejemplo (las barras negras
indican el nivel del tránscrito de TobRD2; las barras a rayas
indican el nivel de nicotina). Había una correlación estrecha entre
los niveles de nicotina y los niveles del tránscrito de
TobRD2.
Es bien conocido en la técnica que la eliminación
de la cabeza de la flor de una planta de tabaco (despunte) aumenta
el crecimiento de la raíz e incrementa el contenido de nicotina de
las hojas de esa planta. El despunte de la planta y su práctica
estándar en el cultivo comercial del tabaco y el tiempo óptimo para
el despunte de una planta de tabaco dada en condiciones de
crecimiento establecidas conocidas pueden determinarse con facilidad
por un experto habitual en la técnica.
Las plantas de tabaco (N. tabacum SR1) se
hicieron crecer a partir de semillas en tierra durante un mes y se
transfirieron a macetas que contenían arena. Las plantas crecieron
en un invernadero durante otros dos meses hasta que comenzaron a dar
flores. Después, se eliminaron las cabezas de las flores y dos
nódulos de cuatro plantas (despunte). De cada planta se recogió una
porción de las raíces después del tiempo indicado y se acumuló para
la extracción de ARN. Las plantas control no se decapitaron. El ARN
total (1\mug) de cada punto de tiempo se sometió a electroforesis
a través de un gel de agarosa al 1% con formaldehído 1,1M y se
transfirió a una membrana de nailon según Sambrook y col. (1989).
Las membranas se hibridaron con fragmentos de ADNc de TobRD2
marcados con ^{32}P. La intensidad relativa de los tránscritos de
TobRD2 se midió mediante densitometría. La figura 6 ilustra
los niveles relativos de tránscrito (en comparación con el tiempo
cero) para cada punto de tiempo con despunte (barras negras) o sin
despunte (barras a rayas).
Los niveles relativos de TobRD2 se
determinaron en tejido radicular durante 24 horas; los resultados
se muestran en la Figura 6 (las barras negras indican los niveles de
tránscrito de TobRD2 en las plantas despuntadas; las barras a
rayas indican los niveles del tránscrito de TobRD2 en los
controles sin despuntar). En seis horas de despunte de las plantas
de tabaco, los niveles de ARNm de TobRD2 se multiplicaron
aproximadamente por ocho en las plantas despuntadas; no se observó
ningún aumento en las plantas control en el mismo periodo de
tiempo.
La cepa de Escherichia coli TH265 es un
mutante que carece de la quinolato fosforribosil transferasa (nadC-)
y, por tanto, no puede crecer en un medio sin ácidos
nicotínicos.
Las células TH265 se transformaron con un vector
de expresión (pWS161) que contienen ADN de SEC ID Nº1 o se
transformaron con el vector de expresión (pKK233) solo. El
crecimiento de las bacterias transformadas se comparó con el
crecimiento de los transformantes de TH265 (pKK233) y con el
crecimiento de los mutantes TH265 nadC- sin transformar. El
crecimiento se comparó en medio mínimo ME (sin ácido nicotínico) y
en medio mínimo ME con ácido nicotínico añadido.
La cepa de E. coli con la mutación de la
QTPasa (nadC), TH265, fue amablemente suministrada por el Dr.
K. T. Hughes (Hughes y col., J. Bact. 175: 479 (1993)). Las
células se mantuvieron en medio LB y se prepararon células
competentes como se describe en Sambrook y col. (1989). Se preparó
un plásmido de expresión en pKK2233 (Brosius, 1984) con el ADNc de
TobRD2 clonado bajo el control del promotor Tac. El plásmido
resultante, pWS161, se transformó en células TH265. Las células
transformadas se cultivaron en placas con agar en medio mínimo
(Vogel y Bonner, 1956) con o sin ácido nicotínico (0,0002%) como
complemento. Las células TH265 solas y las TH265 transformadas con
pKK2233 se cultivaron en placas similares para usar como
controles.
Los resultados se muestran en la Figura 4. Sólo
las TH265 transformadas con ADN de SEC ID Nº 1 crecieron en medio
sin ácido nicotínico. Estos resultados muestran que la expresión de
ADN de SEC ID Nº1 en células bacterianas TH265 confirieron a estas
células el fenotipo NadC+, lo que confirma que esta secuencia
codifica QPRTasa. Por tanto, la nomenclatura TobRD2 se cambió a
NiQPT1.
El ADN de la SEC ID Nº 1, en orientación
antisentido, está operablemente unido a un promotor vegetal (35S de
CaMV o promotor específico de raíz-corteza TobRD2)
para producir dos casetes diferentes de ADN: promotor 35S de
CaMV/SEC ID Nº1 antisentido y promotor TobRD2/SEC ID Nº 1
antisentido.
Una línea de tabaco de tipo salvaje y una línea
de tabaco bajo en nicotina se seleccionan para la transformación,
por ejemplo tabaco Burley 21 de tipo salvaje (Nic1+Nic2+) y
Burley 21 homozigoto nic1-nic2-. Una
pluralidad de células de planta de tabaco de cada línea se
transforman usando cada uno de los casetes de ADN. La transformación
se lleva a cabo usando un vector de Agrobacterium, por
ejemplo un vector binario de Agrobacterium portador de
secuencias terminales de T1 y el gen nptII (que confiere resistencia
a kanamicina y está bajo el control del promotor nos
(nptII).
Las células transformadas se seleccionan y
regeneran en plantas de tabaco transgénicas (R_{0}). Las plantas
R_{0} se hacen crecer hasta que maduran y se examinan para
determinar los niveles de nicotina; una subpoblación de las plantas
de tabaco transformadas exhibe niveles significativamente menores de
nicotina en comparación con los que muestran las plantas control no
transformadas.
A continuación, las plantas R_{0} se
autopolinizan y la segregación del transgén se analiza en la
progenie R_{1}.la progenie R_{1}se hace crecer hasta la madurez
y se autopolinizan; la segregación del transgén entre la progenie
R_{2} indica qué plantas R_{1} son homozigotas para el
transgén.
(1) INFORMACIÓN GENERAL
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- SOLICITANTE: Conking, Mark A.
- Mendu, Nandini
- Song, Wen
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TÍTULO DE LA INVENCIÓN: Regulación de la expresión de la quinolato fosforribosil transferasa
\vskip0.666000\baselineskip
- (iii)
- NÚMERO DE SECUENCIAS: 4
\vskip0.666000\baselineskip
- (iv)
- DIRECCIÓN POSTAL:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- DESTINATARIO: Kenneth Sibley. Bell Seltzer Park & Gibson
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- CALLE: Post Office Drawer 34009
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- CIUDAD: Charlotte
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- ESTADO: Carolina del Norte
\vskip0.333000\baselineskip
- (E)
- PAÍS: EE.UU.
\vskip0.333000\baselineskip
- (F)
- CÓDIGO POSTAL: 28234
\vskip0.666000\baselineskip
- (v)
- FORMA DE LECTURA INFORMÁTICA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- TIPO DE MEDIO: Disquete
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- ORDENADOR: IBM compatible con PC
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- SOFTWARE: Patentin Release #1.0. Versión 1.30
\vskip0.666000\baselineskip
- (vi)
- DATOS DE LA SOLICITUD ACTUAL:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- NÚMERO DE SOLICITUD:
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- FECHA DE PRESENTACIÓN:
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- CLASIFICACIÓN:
\vskip0.666000\baselineskip
- (viii)
- INFORMACIÓN AGENTE/ABOGADO:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: Sibley, Kenneth D.
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- NÚMERO DE REGISTRO: 31.665
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE REFERENCIA/REGISTRO: 5061-338P
\vskip0.666000\baselineskip
- (ix)
- INFORMACIÓN DE TELECOMUNICACIÓN:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- TELÉFONO: 919-420-2200
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TELEFAX: 919-881-3175
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID Nº 1
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 1399 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- CADENA: única
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.666000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 52.1104
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 1
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID Nº2:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 351 aminoácidos
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº 2
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID Nº 3:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARATERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 1053 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- CADENA: única
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº3
Claims (40)
1. Una molécula de ADN aislada que comprende una
secuencia seleccionada del grupo formado por:
- (a)
- SEC ID Nº 1;
- (b)
- secuencias de ADN que codifican una enzima que tiene la SEC ID Nº 2;
- (c)
- secuencias de ADN que tienen una homología de la menos el 65% con el ADN aislado de (a) o (b) anteriores y que codifican una enzima quinolato fosforribosil transferasa; y
- (d)
- secuencias de ADN que difieren de l ADN de (a), (b) o (c) anteriores debido a la degeneración del código genético.
2. Un constructo de ADN que comprende un casete
de expresión, comprendiendo dicho constructo, en la dirección 5' a
3', un promotor que funciona en una célula vegetal y una secuencia
de ADN que comprende una secuencia codificadora de quinolato
fosforribosil transferasa según la reivindicación 1 en posición
aguas arriba de dicho promotor y operativamente asociado al
mismo.
3. Un constructo de ADN que comprende un casete
de expresión, comprendiendo dicho constructo, en la dirección 5' a
3', un promotor vegetal y una secuencia de ADN que comprende una
secuencia codificadora de quinolato fosforribosil transferasa según
la reivindicación 1 en posición aguas arriba de dicho promotor y
operativamente asociado al mismo, estando dicha secuencia de ADN en
orientación antisentido.
4. Un constructo de ADN que comprende, en la
dirección 5' a 3', un promotor que funciona en una célula vegetal y
ADN que codifica una quinolato fosforribosil transferasa vegetal
seleccionada de las secuencias de ADN de la reivindicación 1,
estando dicho ADN operativamente asociado con dicho promotor.
5. Un constructo de ADN que comprende, en la
dirección 5' a 3', un promotor que funciona en una célula vegetal y
ADN que codifica una quinolato fosforribosil transferasa vegetal
seleccionada de las secuencias de ADN de la reivindicación 1,
estando dicho ADN en orientación antisentido y operablemente
asociado con dicho promotor.
6. Un constructo de ADN según la reivindicación
2, 3, 4 ó 5, en el que el promotor es constitutivamente activo en
células vegetales.
7. Un constructo de ADN según la reivindicación
2, 3, 4 ó 5, en el que dicho promotor está selectivamente activo en
células vegetales de tejido radicular o en células vegetales de
tejido de corteza radicular.
8. Un constructo de ADN según cualquiera de las
reivindicaciones 2 a 7, en el que dicho constructo además comprende
un plásmido.
9. Un constructo de ADN según cualquiera de las
reivindicaciones 2 a 8 portado por un vector de transformación de
plantas.
10. Un constructo de ADN según la reivindicación
9, en el que el vector de transformación de plantas es un vector
Agrobacterium tumefaciens.
11. Una célula vegetal que contiene un constructo
de ADN según cualquiera de las reivindicaciones 2 a 10.
12. Una planta transgénica que comprende células
vegetales según la reivindicación 11.
13. Un péptido que tiene la SEC ID Nº 2
14. Un péptido codificado por una secuencia de
ADN seleccionada del grupo formado por:
(a) SEC ID Nº 1;
(b) Secuencias de ADN que tienen una homología de
al menos el 65% con ADN aislado de (a) anterior y que codifica una
enzima quinolato fosforribosil transferasa; y
(c) Secuencias de ADN que difieren del ADN de (a)
o (b) anterior debido a la degeneración del código genético.
15. Un procedimiento para preparar una célula
vegetal transgénica que tiene una expresión reducida de quinolato
fosforribosil transferasa (QPRTasa), comprendiendo dicho
procedimiento:
proporcionar una célula vegetal de un tipo que se
sabe que expresa quinolato fosforribosil transferasa;
proporcionar un constructo de ADN exógeno,
comprendiendo dicho constructo, en la dirección 5' a 3', un promotor
que funciona en una célula vegetal y una secuencia de ADN que
codifica un ARNm de quinolato fosforribosil transferasa y
seleccionado de las secuencias de ADN de la reivindicación 1,
estando dicha secuencia de ADN operablemente asociada con dicho
promotor; y
transformar dicha célula vegetal con dicho
constructo de ADN para producir células transformadas, teniendo
dicha célula vegetal una expresión reducida de QPRTasa en
comparación con una célula sin transformar.
16. El procedimiento de la reivindicación 15, en
el que dicho ADN que comprende una porción de secuencia que codifica
ARNm de quinolato fosforribosil transferasa seleccionada de las
secuencias de ADN de la reivindicación 1 está en orientación sentido
o antisentido.
17. El procedimiento de la reivindicación 15 ó
16, en el que dicha célula vegetal es Nicotiana tabacum.
18. El procedimiento de cualquiera de las
reivindicaciones 15 a 17, que además comprende regenerar una planta
a partir de dicha célula vegetal transformada.
19. Un procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 15 a 18, en el que dicho promotor es
constitutivamente activo.
20. Un procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 15 a 18, en el que dicho promotor es selectivamente
activo en células vegetales de tejido radicular o en células
vegetales de corteza radicular.
21. Un procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 15 a 20, en el que dicha etapa de transformación se
lleva a cabo bombardeando dicha célula vegetal con micropartículas
que portan dicho constructo de ADN.
22. Un procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 15 a 20, en el que dicha etapa de transformación se
lleva a cabo infectando dicha célula vegetal con una
Agrobacterium tumefaciens que contiene un plásmido Ti que
porta dicho constructo de ADN.
23. Un procedimiento para producir semillas de
tabaco transgénicas, que comprende recoger la semilla de una planta
de tabaco transgénica producida mediante el procedimiento de la
reivindicación 17.
24. El procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 15 a 23, en el que dicha secuencia de ADN exógeno
comprende una secuencia que codifica la quinolato fosforribosil
transferasa y se selecciona de las secuencias de ADN de la
reivindicación 1 y es complementaria a dicho ARN mensajero (ARNm de
QPRT) de quinolato fosforribosil transferasa expresado en dicha
célula vegetal en una región seleccionada de:
(a) la secuencia 5' sin traducir de dicho ARNm de
QPRT;
(b) la secuencia 3' sin traducir de dicho ARNm de
QPRT; y
(c) la región traducida de dicho ARNm de
QPRT.
25. El procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 15 a 23, en el que dicha secuencia de ADN exógeno
comprende una secuencia codificadora de quinolato fosforribosil
transferasa y se selecciona de las secuencias de ADN de la
reivindicación 1 y es complementaria a al menos 15 nucleótidos de
dicho ARN mensajero de quinolato fosforribosil transferasa expresado
en dicha célula vegetal.
26. El procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 15 a 23, en el que dicha secuencia de ADN exógeno
comprende una secuencia codificadora de quinolato fosforribosil
transferasa y se selecciona de secuencias de ADN de la
reivindicación 1 y es complementaria a al menos 200 nucleótidos de
dicho ARN mensajero de quinolato fosforribosil transferasa expresado
en dicha célula vegetal.
27. El procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 15 a 23, en el que dicha secuencia de ADN exógeno
comprende una secuencia codificadora de quinolato fosforribosil
transferasa seleccionada de las secuencias de ADN de la
reivindicación 1.
28. Una planta transgénica de la especie
Nicotiana que tiene una expresión reducida de quinolato
fosforribosil transferasa (QPRTasa) en relación con una planta
control no transformada, comprendiendo dicha planta transgénica
células vegetales transgénicas que contienen:
un constructo de ADN exógeno que comprende, en la
dirección 5' a 3', un promotor que funciona en dicha célula vegetal
y ADN que comprende un segmento de una secuencia de ADN que codifica
un ARNm de quinolato fosforribosil transferasa vegetal, seleccionada
de las secuencias de ADN de la reivindicación 1, estando dicho ADN
asociado operablemente con dicho promotor, exhibiendo dicha planta
una expresión reducida de QPRTasa en comparación con una planta
control no transformada.
29. La planta de la reivindicación 28, en la que
dicho segmento de ADN que comprende un segmento de una secuencia de
ADN que codifica ARNm de quinolato fosforribosil transferasa se
selecciona de la secuencia de ADN de la reivindicación 1 y tiene una
orientación sentido o antisentido.
30. Una planta transgénica de la especie
Nicotiana con una expresión reducida de quinolato
fosforribosil transferasa (QPRTasa) en relación con una planta
control no transformada, donde dicha planta transgénica es progenie
de una planta según la reivindicación 28 y comprende el transgén de
acuerdo con la reivindicación 1.
31. Semillas de una planta transgénica de la
especie Nicotiana que tienen una expresión reducida de
quinolato fosforribosil transferasa (QPRTasa) en relación con una
planta control no transformada, en la que dicha planta transgénica
es una planta según la reivindicación 28 o progenie de la misma o
cuyas semillas comprenden el transgén de acuerdo con la
reivindicación 1.
32. Una cosecha que comprende una pluralidad de
plantas según la reivindicación 28 plantadas juntas en un campo
agrícola.
33. Un procedimiento para reducir la expresión de
un gen de quinolato fosforribosil transferasa en una célula vegetal,
comprendiendo dicho procedimiento:
el crecimiento de una célula vegetal transformada
para que contenga ADN exógeno seleccionado de la secuencia de ADN de
la reivindicación 1, en la que una hebra transcrita de dicho ADN
exógeno es complementaria al ARNm endógeno de quinolato
fosforribosil transferasa de dicha célula, donde la transcripción de
dicha hebra complementaria reduce la expresión de dicho gen de
quinolato fosforribosil.
34. Un procedimiento para producir una planta de
tabaco que tiene unos niveles reducidos de nicotina en las hojas de
dicha planta de tabaco, comprendiendo dicho procedimiento:
el crecimiento de una planta de tabaco, o plantas
progenie de la misma, donde dicha planta comprende células que
contienen un constructo de ADN que comprende una región funcional
iniciadora de la transcripción en dicha planta y una secuencia de
ADN exógeno seleccionada de las secuencias de ADN de la
reivindicación 1 unida operablemente a dicha región iniciadora de la
transcripción,
en la que una hebra transcrita de dicha secuencia
de ADN es complementaria al ARN mensajero endógeno de quinolato
fosforribosil transferasa en dichas células.
35. Un procedimiento para preparar una célula
vegetal transgénica que tiene una expresión aumentada de quinolato
fosforribosil transferasa (QPRTasa), comprendiendo dicho
procedimiento:
proporcionar una célula vegetal de un tipo del
que se sabe que expresa quinolato fosforribosil transferasa;
proporcionar un constructo de ADN exógeno, comprendiendo dicho
constructo, en la dirección 5' a 3', un promotor que funciona en una
célula vegetal y una secuencia de ADN que codifica quinolato
fosforribosil transferasa, seleccionada de las secuencias de ADN de
la reivindicación 1, estando dicha secuencia de ADN operablemente
asociada con dicho promotor; y
transformar dicha célula vegetal con dicho
constructo de ADN para producir células transformadas, teniendo
dicha célula vegetal una expresión aumentada de QPRTasa en
comparación con una célula sin transformar.
36. Una planta transgénica de la especie
Nicotiana que tiene una expresión aumentada de quinolato
fosforribosil transferasa (QPRTasa) en relación con una planta
control no transformada, comprendiendo dicha planta transgénica
células vegetales transgénicas que contienen:
un constructo de ADN exógeno que comprende, en la
dirección 5' a 3', un promotor que funciona en dicha célula vegetal
y una secuencia de ADN que codifica una quinolato fosforribosil
transferasa vegetal seleccionada de las secuencias de ADN de la
reivindicación 1, estando dicho ADN operablemente asociado con dicho
promotor;
exhibiendo dicha planta una expresión aumentada
de QPRTasa en comparación con una planta control no
transformada.
37. Una planta transgénica de la especie
Nicotiana que tiene una expresión aumentada de quinolato
fosforribosil transferasa (QPRTasa) en relación con una planta
control no transformada, en la que dicha planta transgénica es
progenie de una planta de acuerdo con la reivindicación 36 y
comprende el transgén según la reivindicación 1.
38. Un procedimiento para aumentar la expresión
de un gen de quinolato fosforribosil transferasa en una célula
vegetal, comprendiendo dicho procedimiento:
el crecimiento de una célula vegetal transformada
para contener ADN exógeno seleccionado de las secuencias de ADN de
la reivindicación 1, en el que dicho ADN exógeno codifica quinolato
fosforribosil transferasa.
39. El procedimiento según la reivindicación 38,
en el que dicha célula vegetal transformada se obtiene mediante un
procedimiento que comprende:
integrar en el genoma de una célula vegetal
huésped un constructo que comprende, en la dirección de la
transcripción, un promotor funcional en dicha célula vegetal, una
secuencia de ADN que codifica quinolato fosforribosil transferasa
funcional en dicha célula que se selecciona de las secuencias de ADN
de la reivindicación 1, estando dicha secuencia de ADN operablemente
asociada con dicho promotor, y una región funcional de terminación
de la transcripción en dicha célula, por la que se obtiene una
célula vegetal transformada.
40. Un procedimiento para producir una planta de
tabaco que tiene niveles aumentados de nicotina en las hojas de
dicha planta de tabaco, comprendiendo dicho procedimiento:
el crecimiento de una planta de tabaco, o plantas
progenie de la misma, en el que dicha planta comprende células que
contienen un constructo de ADN que comprende una región funcional de
iniciación de la transcripción en dicha planta y una secuencia de
ADN exógeno seleccionada de las secuencias de ADN de la
reivindicación 1 operablemente unida a dicha región de iniciación de
la transcripción,
en el que dicha secuencia de ADN codifica
quinolato fosforribosil transferasa funcional en dichas células.
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