MXPA99011625A - Regulacion de la expresion de quinolato fosforribosil transferasa - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere a ADN que codifica para la enzima quinolato fosforribosil transferasa, QPRTasa, y construcciones que comprenden dicho ADN;se proveen también métodos para alterar la expresión de la quinolato fosforribosil transferasa.

Description

REGULACIÓN PE LA EXPRESIÓN DE QUINOLATO FOSFORRIBOSIL TRANSFERASA INVESTIGACIÓN FEDERALMENTE PATROCINADA Esta invención fue hecha con apoyo gubernamental bajo la concesión No. MCB-9206506 de la National Science Foundation. El gobierno tiene ciertos derechos sobre esta invención.

CAMPO DE LA INVENCIÓN Esta invención se refiere a quinolato fosforribosil transferasa (QPRTasa) de plantas, y ADN que codifica para esta enzima. En particular, esta invención se refiere al uso de ADN que codifica para quinolato fosforribosil transferasa para producir plantas transgénicas que tengan niveles de nicotina genéticamente alterados, y las plantas producidas de esta manera.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN La producción de tabaco con niveles de nicotina disminuidos es de interés, dados los intereses respecto a la naturaleza adictiva de la nicotina. Adicionalmente, las plantas de tabaco con niveles extremadamente bajos de producción de nicotina, o producción nula de la misma, son atractivas como receptores de transgenes que expresan productos comercialmente valiosos tales como compuestos farmacéuticos, componentes de cosmético o aditivos de alimentos. Varios procedimientos se han desarrollado para la remoción de nicotina del tabaco. Sin embargo, la mayoría de dichos procedimientos remueven otros ingredientes del tabaco además de la nicotina, afectando así adversamente al tabaco. Las técnicas clásicas de producción de cultivos han producido plantas de tabaco con niveles menores de nicotina (aproximadamente 8%) que los encontrados en plantas de tabaco de tipo silvestre. Son deseables plantas de tabaco y tabaco que tengan reducciones incluso mayores en el contenido de nicotina. Una alternativa para reducir el nivel de un producto biológico, es reducir la cantidad de una enzima requerida en la vía biosintética que conduce a ese producto. En los casos donde la enzima afectada ocurre naturalmente en una cantidad limitante de la proporción (respecto a las otras enzimas que se requieren en la vía), cualquier reducción en la abundancia de esa enzima disminuirá la producción del producto final. Si la cantidad de la enzima no es normalmente limitante de la proporción, su presencia en una célula debe ser reducida a niveles limitantes de la proporción para disminuir el rendimiento de la vía. A la inversa, si la cantidad de enzima que ocurre naturalmente es limitante de la proporción, entonces cualquier incremento en la actividad de la enzima dará como resultado un incremento en el producto final de la vía biosintética.

La nicotina se forma principalmente en las raíces de la planta de tabaco, y es transportada subsecuentemente hacia las hojas, donde se almacena (Tso, Physiology and Biochemistry of Tobacco Plants, pp. 233-34, Dowden, Huitchinson & Ross, Stroudsburg, Pa. (1972)). Un paso obligatorio en la biosíntesis de nicotina es la formación de ácido nicotínico a partir de ácido quinolínico, cuyo paso es catalizado por la enzima quinolino fosforribosil transferasa ("QPRTasa"). La QPRTasa parece ser una enzima limitante de la proporción en la vía que suministra ácido nicotínico para la síntesis de nicotina en el tabaco. Véase, por ejemplo, Feth y otros, "Regulation in Tobacco Callus of Enzyme Activities of the Nicotine Pathway", Planta, 168, pp. 402-07 (1986); Wagner y otros, "The Regulation of Enzyme Activities of the Nicotine Pathway in Tobacco", Physiol. Plant., 68, pp. 667-72 (1986). La modificación de los niveles de nicotina en plantas de tabaco, mediante regulación antisentido de la expresión de la metil transferasa de putrescencia (PMTasa), se propone en las Patentes de E.U.A. 5,369,023 y 5,260,205 a Nakatani y Malik. La solicitud de PCT WO 94/28142 a Wahad y Malik, describe ADN que codifica para PMT, y el uso de construcciones de PMT sentido y antisentido.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN Un primer aspecto de la presente invención es una molécula de ADN aislado que comprende SEQ ID NO:1 ; secuencias de ADN que codifican para una enzima que tiene SEQ ID NO:2; secuencias de ADN que hibridan con dicho ADN y que codifican para una enzima quinolato fosforribosil transferasa; y secuencias de ADN que difieren del ADN anterior debido a la degeneración del código genético. Un péptido codificado por dicho ADN es un aspecto adicional de la invención. Un aspecto más de la presente invención es una construcción de ADN que comprende un promotor operable en una célula vegetal, y un segmento de ADN que codifica para una enzima quinolato fosforribosil transferasa situado hacia el extremo 3' del promotor y asociado operablemente con el mismo. El ADN que codifica para la enzima puede estar en dirección sentido o antisentido. Un aspecto más de la presente invención es un método para obtener una célula vegetal transgénica que tenga expresión reducida de quinolato fosforribosil transferasa (QPRTasa), proveyendo una célula vegetal de un tipo que se sabe expresa quinolato fosforribosil transferasa; transformar la célula vegetal con una construcción de ADN exógeno que comprenda un promotor y ADN que comprenda una porción de una secuencia que codifique para ARN mensajero para quinolato fosforribosil transferasa. Otro aspecto de la presente invención es una planta transgénica de la especie Nicotiana que tenga expresión reducida de quinolato fosforribosil transferasa (QPRTasa) respecto a una planta control no transformada. Las células de dichas plantas comprenden una construcción de ADN que incluye un segmento de una secuencia de ADN que codifica para un ARN mensajero para quinolato fosforribosil transferasa de plantas.

Un aspecto más de la presente invención es un método para reducir la expresión de un gen para quinolato fosforribosil transferasa en una célula vegetal, desarrollando una célula vegetal transformada que contenga ADN exógeno, en donde una cadena transcrita del ADN exógeno sea complementaria al ARN mensajero endógeno para quinolato fosforribosil transferasa para la célula. La transcripción de la cadena complementaria reduce la expresión del gen endógeno para quinolato fosforribosil transferasa. Un aspecto más de la presente invención es un método para producir una planta de tabaco que tenga niveles de nicotina disminuidos en las hojas de la planta de tabaco, desarrollando una planta de tabaco con células que comprendan una secuencia de ADN exógeno, en donde una cadena transcrita de la secuencia de ADN exógeno sea complementaria al ARN mensajero endógeno para quinolato fosforribosil transferasa en las células. Otro aspecto de la presente invención es un método para obtener una célula vegetal transgénica que tenga expresión incrementada de quinolato fosforribosil transferasa (QPRTasa), transformando una célula vegetal que se sabe expresa dicha enzima con una construcción de ADN exógeno que comprenda una secuencia de ADN que codifique para quinolato fosforribosil transferasa. Otro aspecto de la presente invención es una planta de Nicotiana transgénica que tenga expresión incrementada de quinolato fosforribosil transferasa (QPRTasa), en donde las células de la planta transgénica comprendan una secuencia de ADN exógeno que codifique para una quinolato fosforribosil transferasa de plantas. Otro aspecto más de la presente invención es un método para incrementar la expresión de un gen para quinolato fosforribosil transferasa en una célula vegetal, desarrollando una célula vegetal transformada que contenga ADN exógeno que codifique para quinolato fosforribosil transferasa. Finalmente, otro aspecto de la presente invención es un método para producir una planta de tabaco que tenga niveles incrementados de nicotina en las hojas, desarrollando una planta de tabaco que tenga células que contengan una secuencia de ADN exógeno que codifique para quinolato fosforribosil transferasa funcional en las células.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La figura 1 muestra la vía biosintética que conduce a la nicotina.

Las actividades enzimáticas que se sabe son reguladas por Nid y Nic2 son QPRTasa (quinolato fosforribosil transferasa) y PMTasa (metil transferasa de putrescencia). La figura 2A muestra la secuencia de ácido nucleico del ADNc de NtQPTI (SEQ ID NO:1 ), con la secuencia de codificación (SEQ ID NO:3) mostrada en letras mayúsculas. La figura 2B muestra la secuencia deducida de aminoácidos (SEQ ID NO:2) de la QPRTasa de tabaco codificada por el ADNc de NtQPTL La figura 3 alinea la secuencia deducida de aminoácidos de NtQPTI y secuencias relacionadas de Rhodospiríllum rubrum, Mycobacterium lepre, Salmonella typhimurium, Escherichia coli, humano y Saccharomyces cerevisiae. La figura 4 muestra los resultados de la complementación de un mutante de Escherichia coli que carece de quinolato fosforribosil transferasa (TH265) con ADNc de NtQPTL Las células fueron transformadas con un vector de expresión que posee NtQPTI; el desarrollo de células TH265 transformadas que expresan NtQPTI en medio mínimo que carece de ácido nicotínico, demostró que NtQPTI codifica para QPRTasa. La figura 5 compara los niveles de nicotina y los niveles de estado estable relativos de ARN mensajero de NtQTPI en mutantes de tabaco Nid y Nic2: Burley 21 de tipo silvestre (Nic1/Nic1 Nic2/Nic2); Burley 21 Nic1~ (nid/nid Nic2/Nic2); Burley 21 Nic2~ (Nic1/Nic1 nic2/nic2); y Burley 21 NicTNic2'(nic1/nic1 nic2/nic2). Las barras sólidas indican los niveles de transcritos de ARN mensajero; y las barras punteadas indican los niveles de nicotina. La figura 6 muestra los niveles relativos del ARN mensajero de NtQPTI con el tiempo en plantas de tabaco desmochadas, comparativamente con plantas control no desmochadas. Las barras sólidas indican los niveles de transcritos de ARN mensajero; y las barras sombreadas indican los niveles de nicotina.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN La nicotina se produce en las plantas de tabaco mediante la condensación de ácido nicotínico y 4-metilaminobutanal. La vía biosintética que da como resultado la producción de nicotina se muestra en la figura 1. Dos loci reguladores (Nid y Nic2) funcionan como reguladores codominantes en la producción de nicotina. Los análisis enzimáticos de raíces de mutantes Nic sencillos y dobles muestran que las actividades de dos enzimas, quinolato fosforribosil transferasa (QPRTasa) y metil transferasa de putrescencia (PMTasa), son directamente proporcionales a los niveles de biosíntesis de nicotina. Una comparación de la actividad enzimática en tejidos de tabaco (raíz y callo) con diferentes capacidades de síntesis de nicotina, muestra que la actividad de QPRTasa está estrictamente correlacionada con el contenido de nicotina (Wagner y Wagner, Planta 165:532 (1985)). Saunders y Bush (Plant Physiol 64:236 (1979) mostraron que el nivel de QPRTasa en las raíces de mutantes de bajo nivel de nicotina, es proporcional a los niveles de nicotina en las hojas. La presente invención abarca una secuencia de ADNc novedosa (SEQ ID NO:1 ) que codifica para una quinolato fosforribosil transferasa de plantas (QPRTasa) de (SEQ ID NO:2). Puesto que la actividad de QPRTasa está correlacionada estrictamente con el contenido de nicotina, la construcción de plantas de tabaco transgénicas en las cuales los niveles de QPRTasa están reducidos en las raíces de las plantas (comparativamente con los niveles de la misma en plantas de tipo silvestre), da como resultado plantas que tienen niveles reducidos de nicotina en las hojas. La presente invención provee métodos y construcciones de ácido nucleico para producir dichas plantas transgénicas, así como también dichas plantas transgénicas. Dichos métodos incluyen la expresión de ARN antisentido para NtQPTI, el cual reduce la cantidad de QPRTasa en las raíces de plantas de tabaco. Además, se ha encontrado nicotina en especies y familias de plantas no de tabaco, aunque la cantidad presente es usualmente mucho menor que en N. tabacum. La presente invención provee también moléculas de ADN recombinante sentido y antisentido que codifican para QPRTasa, o moléculas de ARN antisentido para QPRTasa, y vectores que comprenden dichas moléculas de ADN recombinante, así como también células vegetales y plantas transgénicas transformadas con dichas moléculas y vectores de ADN. Las células y plantas de tabaco transgénicas de esta invención se caracterizan por un contenido de nicotina menor o mayor que las células y plantas de tabaco control no transformadas. Las plantas de tabaco con niveles extremadamente bajos de producción de nicotina, o sin producción de la misma, son atractivas como receptores de transgenes que expresan productos comercialmente valiosos tales como compuestos farmacéuticos, componentes de cosmético o aditivos de alimentos. El tabaco es atractivo como planta receptora de un transgen que codifica para un producto deseable, ya que el tabaco es fácilmente manipulado genéticamente y produce una biomasa muy grande por acre; las plantas de tabaco con recursos reducidos dedicados a la producción de nicotina, tendrán por consiguiente más recursos disponibles para la producción de productos transgénicos. Métodos para transformar tabaco con transgenes que producen productos deseables son conocidos en la técnica; cualquier técnica adecuada se puede utilizar con las plantas de tabaco de bajo contenido de nicotina de la presente invención. Las plantas de tabaco de conformidad con la presente invención con expresión reducida de QPRTasa y niveles de nicotina reducidos, serán convenientes para la producción de productos de tabaco que tengan contenido de nicotina reducido. Las plantas de tabaco de conformidad con la presente invención serán adecuadas para usarse en cualquier producto de tabaco tradicional incluyendo, pero no limitado a, tabaco para pipa, cigarro y cigarrillo, y tabaco de mascar, y puede estar en cualquier forma incluyendo hojas de tabaco, tabaco desmenuzado o tabaco cortado. Las construcciones de la presente invención también pueden ser útiles para proveer plantas transgénicas que tengan expresión de QPRTasa incrementada y contenido de nicotina incrementado en la planta. Dichas construcciones, los métodos para usar estas construcciones y las plantas así producidas, pueden ser convenientes en la producción de productos de tabaco que tengan contenido de nicotina alterado, o para la producción de plantas que tengan contenido de nicotina incrementado por sus efectos insecticidas.

Los presentes inventores han descubierto que el gen TobRD2 (véase Conkling y otros, Plant Phys. 93, 1203 (1990)) codifica para una QPRTasa de Nicotiana tabacum, y se provee en la presente la secuencia de ADNc de NtQPTI (denominada inicialmente TobRD2), así como la secuencia de aminoácidos de la enzima codificada. Las comparaciones de la secuencia de aminoácidos de NtQPTI con la base de datos del banco de genes, revela similitud de secuencia limitada para proteínas bacterianas que codifican para quinolato fosforribosil transferasa (QPRTasa) (figura 3). La quinolato fosforribosil transferasa se requiere para la biosíntesis de novo de nicotina adenin dinucléotido (NAD) tanto en procariontes como en eucariontes. En el tabaco, los altos niveles de QPRTasa se detectan en raíces, pero no en hojas. Para determinar que NtQPTI codifica para QPRTasa, los presentes inventores utilizaron la cepa bacteriana TH265 de Escherichia coli, un mutante que carece de quinolato fosforribosil transferasa (nad ). Este mutante no puede crecer en medio mínimo que carezca de ácido nicotínico. Sin embargo, la expresión de la proteína de NtQPTI en esta cepa bacteriana confirió el fenotipo NadC* (figura 4), confirmando que NtQPTI codifica para QPRTasa. Los presentes inventores examinaron los efectos de mutantes Nid y Nic2 en el tabaco y los efectos del desmoche de plantas de tabaco, sobre los niveles de nicotina y los niveles de ARN mensajero de estado estable de NtQPTL (Es bien sabido que la remoción de la dominancia apical mediante el desmoche al inicio de la floración, da como resultado niveles incrementados de biosíntesis y transporte de nicotina en el tabaco, y es una práctica común en la producción de tabaco). Si NtQPTI interviene de hecho en la biosíntesis de nicotina, se esperaría que (1 ) los niveles de ARN mensajero de NtQPTI fueran menores en mutantes dobles Nid y Nic2 y (2) los niveles de ARN mensajero de NtQPTI se incrementarían después del desmoche. Se encontró que los niveles de ARN mensajero de NtQPTI en mutantes dobles Niel y Nic2 son aproximadamente 25% de los observados en plantas de tipo silvestre (figura 5.). Además, dentro de 6 horas del desmoche, los niveles de ARN mensajero de NtQPTI en plantas de tabaco aumentaron aproximadamente 8 veces. Por consiguiente, se determinó que NtQPTI es un gen regulador clave en las vía biosintética de nicotina.

Células vegetales y plantas transqénicas La regulación de la expresión génica en los genomas de células vegetales se puede lograr mediante la integración de ADN heterólogo bajo el control de transcripción de un promotor el cual sea funcional en el hospedero, y en el cual la cadena transcrita de ADN heterólogo sea complementaria a la cadena de ADN que es transcrita a partir del gen endógeno que será regulado. El ADN introducido, referido como ADN antisentido, provee una secuencia de ARN la cual es complementaria a las moléculas de ARN mensajero producidas naturalmente (endógenas), y la cual inhibe la expresión del ARN mensajero endógeno. No se conoce del todo bien el mecanismo de dicha regulación de la expresión génica mediante antisentido. Aunque no se desee que sea limitado por teoría alguna, una teoría de la regulación antisentido propone que dicha transcripción del ADN antisentido produce moléculas de ARN las cuales se unen a, y previenen o inhiben la transcripción de, moléculas de ARN mensajero endógenas. En los métodos de la presente invención, el producto antisentido puede ser complementario a porciones de codificación o de no codificación (o ambas) de ARN objetivo que ocurra naturalmente. La construcción antisentido puede ser introducida en las células vegetales mediante cualquier medio adecuado, y puede ser integrada en el genoma de la planta para la transcripción inducible o constitutiva de la secuencia antisentido. Véase, por ejemplo, las Patentes de E.U.A. Nos. 5,453,566 y 5,107,065 a Shewmaker y otros, incorporadas en su totalidad en la presente como referencia. Como se usa en la presente, ADN (o ARN) exógeno o heterólogo se refiere a ADN (o ARN) el cual ha sido introducido en una célula (o en el ancestro de la célula) a través de los esfuerzos de humanos. Dicho ADN heterólogo puede ser una copia de una secuencia que se encuentra naturalmente en la célula que está siendo transformada, o fragmentos de la misma. Para producir una planta de tabaco que tenga niveles de QPRTasa reducidos, y de esta manera menor contenido de nicotina que una planta de tabaco control no transformada, una célula de tabaco puede ser transformada con una unidad de transcripción antisentido exógena para QPRTasa que comprenda una secuencia parcial de ADNc para QPRTasa, una secuencia de ADNc para QPRTasa de longitud total, una secuencia cromosómica parcial de QPRTasa, o una secuencia cromosómica para QPRT de longitud total en orientación antisentido, con secuencias reguladoras apropiadas enlazadas operablemente. Secuencias reguladoras apropiadas incluyen una secuencia de inicio de la transcripción ("promotor") operable en la planta que está -siendo transformada, y una secuencia de poliadenilación/terminación de la transcripción. Técnicas estándar, tales como mapeo de restricción, hibridación Southern blot y análisis de secuencia de nucleótidos, se utilizan entonces para identificar clones que posean secuencias para QPRTasa en orientación antisentido, enlazadas operablemente a las secuencias reguladoras. Se regeneran entonces plantas de tabaco a partir de células exitosamente transformadas. Es más preferible que la secuencia antisentido utilizada sea complementaria a la secuencia endógena; sin embargo, pueden ser toleradas variaciones menores en las secuencias exógenas y endógenas. Se prefiere que la secuencia de ADN antisentido sea de similitud de secuencia suficiente que sea capaz de unirse a la secuencia endógena en la célula que será regulada, bajo condiciones astringentes, como se describe más adelante. Se ha utilizado la tecnología antisentido en varios laboratorios para crear plantas transgénicas caracterizadas por cantidades de enzimas específicas menores de lo normal. Por ejemplo, se han producido plantas con niveles reducidos de calcona sintetasa, una enzima de una vía biosintética de pigmentos de la flor, insertando un gen antisentido para calcona sintetasa en el genoma de plantas de tabaco y de petunia. Estas plantas de tabaco y de petunia transgénicas producen flores con coloración más clara de lo normal (Van der Krol y otros, "An Anti-Sense Chalcone Synthase Gene in Transgenic Plants Inhibits Flower Pigmentation", Nature, 333, pp. 866-68 (1988)). La tecnología del ARN antisentido se ha usado también exitosamente para inhibir la producción de la enzima poligalacturonasa en tomates (Smith y otros, "Antisense RNA Inhibition of Polygalacturonase Gene Expression in Transgenic Tomatoes", Nature, 334, pp. 724-26 (1998); Sheehy y otros, "Reduction of Polygalacturonase Activity in Tomato Fruit by Antisense RNA", Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85, pp. 8805-09 (1988)), y la subunidad pequeña de la enzima ribulosa bisfosfato carboxilasa en el tabaco (Rodermel y otros, "Nuclear-Organelle Interactions: Nuclear Antisense Gene Inhibits Ribulose Bisphosphate Carboxylase Enzyme Levéis in Transformed Tobacco Plants", Cell, 55, pp. 673-81 (1988)). Alternativamente, se pueden crear plantas transgénicas caracterizadas por cantidades mayores de lo normal de una enzima dada, transformando las plantas con el gen para la enzima en orientación sentido (es decir, normal). Los niveles de nicotina en las plantas de tabaco transgénicas de la presente invención se pueden detectar mediante pruebas de nicotina estándar. Las plantas transformadas en las cuales el nivel de QPRTasa es reducido comparativamente con plantas control no transformadas, tendrán por consiguiente un nivel de nicotina reducido comparativamente con el control; las plantas transformadas en las cuales el nivel de QPRTasa está incrementado comparativamente con plantas control no transformadas, tendrán por consiguiente un nivel de nicotina incrementado comparativamente con el control. Se puede seleccionar la secuencia heteróloga utilizada en los métodos antisentido de la presente invención para producir un producto de ARN complementario a la secuencia completa de ARN mensajero para QPRTasa, o para una porción de la misma. La secuencia puede ser complementaria a cualquier secuencia contigua del ARN mensajero natural, es decir, puede ser complementaria a la secuencia del ARN mensajero endógeno proximal al extremo 5' o sitio de bloque, hacia el extremo 5' del sitio de bloque, entre el sitio de bloque y el codón de inicio, y puede abarcar toda la porción del sitio de no codificación, o parte de la misma, puede unir mediante un puente la región de codificación y de no codificación, ser complementaria a toda la región de codificación, o parte de la misma, complementaria al extremo 3' de la región de codificación, o complementaria a la región 3' no traducida del ARN mensajero. Las secuencias antisentido adecuadas pueden ser de por lo menos aproximadamente 13 a aproximadamente 15 nucleótidos, por lo menos aproximadamente 16 a aproximadamente 21 nucleótidos, por lo menos aproximadamente 20 nucleótidos, por lo menos aproximadamente 30 nucleótidos, por lo menos aproximadamente 50 nucleótidos, por lo menos aproximadamente 75 nucleótidos, por lo menos aproximadamente 100 nucleótidos, por lo menos aproximadamente 125 nucleótidos, por lo menos aproximadamente 150 nucleótidos, por lo menos aproximadamente 200 nucleótidos, o más. Además, las secuencias pueden ser extendidas o acortadas en los extremos 3' y 5' de las mismas. La secuencia antisentido particular y la longitud de la secuencia antisentido fluctuarán dependiendo del grado de inhibición deseado, la estabilidad de la secuencia antisentido, etc. El experto en la técnica será guiado en la selección de secuencias antisentido para QPRTasa apropiadas usando técnicas disponibles en la materia.así como la información provista en la presente. Con relación a la figura 2A y SEQ ID NO:1 de la presente, un oligonucleótido de la invención puede ser un fragmento continuo de la secuencia de ADNc para QPRTasa en orientación antisentido, o cualquier longitud que sea suficiente para lograr los efectos deseados cuando sea transformado en una célula vegetal receptora. La presente invención se puede usar también en los métodos de cosupresión sentido de producción de nicotina. Las moléculas de ADN sentido utilizadas para llevar a cabo la presente invención son de una longitud suficiente para, cuando son expresadas en una célula vegetal, suprimir la expresión nativa de la proteína QPRTasa como se describe en la presente en dicha célula vegetal. Dichas moléculas de ADN sentido pueden ser esencialmente un ADN genómico o complementario completo que codifique para la enzima QPRTasa, o un fragmento del mismo, en donde dichos fragmentos sean típicamente de por lo menos 15 nucleótidos de longitud. Métodos para investigar la longitud del ADN sentido que den como resultado la supresión de la expresión de un gen nativo de una célula, están disponibles para los expertos en la técnica. En una modalidad alternativa de la presente invención, células vegetales de Nicotiana son transformadas con una construcción de ADN que contiene un segmento de ADN que codifica para una molécula de ARN enzimática (es decir, una "ribozima"), cuya molécula de ARN enzimática es dirigida contra (es decir, corta) el transcrito de ARN mensajero del ADN que codifica para la QPRTasa, como se describe en la presente. Las ribozimas contienen dominios de unión al sustrato que se unen a regiones accesibles del ARN mensajero objetivo, y dominios que catalizan el corte del ARN, evitando la traducción y la producción de proteínas. Los dominios de unión pueden comprender secuencias antisentido complementarias a la secuencia del ARN mensajero objetivo; el motivo catalítico puede ser un motivo de cabeza de martillo u otros motivos, tales como el motivo de pasador. Los sitios de corte por ribozima dentro de un objetivo de ARN pueden ser identificados inicialmente escudriñando la molécula objetivo para sitios de corte por ribozima (por ejemplo, las secuencias GUA, GUU o GUC). Una vez identificadas, las secuencias cortas de ARN de 15, 20, 30 o más ribonucleótidos que correspondan a la región del gen objetivo que contiene al sitio de corte, pueden ser evaluadas para características estructurales predichas. La conveniencia de objetivos candidatos se puede evaluar también poniendo a prueba su accesibilidad a hibridación con oligonucleótidos complementarios, usando pruebas de protección de ribonucleasa, como es bien sabido en la técnica. Se puede producir ADN que codifique para moléculas de ARN enzimáticas de conformidad con técnicas conocidas. Véase, por ejemplo, T. Cech y otros, patente de E.U.A. No. 4,987,071 ; Keene y otros, patente de E.U.A. No. 5,559,021 ; Donson y otros, patente de E.U.A. No. 5,589,367; Torrence y otros, patente de E.U.A. No. 5,583,032; Joyce, patente de E.U.A No. 5,580,967; Gold y otros, patente de E.U.A. No. 5,595,877; Wagner y otros, patente de E.U.A. No. 5,591 ,601 ; y patente de E.U.A. No. 5,662,854 (cuyas descripciones se incorporan en su totalidad en la presente como referencia). La producción de dicha molécula de ARN enzimática en una célula vegetal y la interrupción de la producción de la proteína QPRTasa, reduce la actividad de QPRTasa en células vegetales en esencialmente la misma forma que la producción de una molécula de ARN antisentido; es decir, interrumpiendo la traducción del ARN mensajero en la célula que produce la enzima. El término "ribozima" se usa en la presente para describir un ácido nucleico que contiene ARN que funciona como una enzima (tal como una endorribonucleasa), y se puede usar intercambiablemente con "molécula de ARN enzimática". La presente invención incluye además ADN que codifica para las ribozimas, ADN que codifica para ribozimas que han sido insertadas en un vector de expresión, células hospederas que contienen dichos vectores, y métodos para disminuir la producción de QPRTasa en plantas usando ribozimas. Las secuencias de ácido nucleico utilizadas para llevar a cabo la presente invención incluyen aquellas con similitud de secuencia con SEQ ID NO:1 y que codifican para una proteína que tiene actividad de quinolato fosforribosil transferasa. Se pretende que esta definición abarque las variaciones alélicas naturales en las proteínas QPRTasa. De esta manera, las secuencias de ADN que hibridan con el ADN de SEQ ID NO:1 y que codifican para la expresión de QPRTasa, en particular enzimas QPRTasa de plantas, se pueden utilizar también para llevar a cabo la presente invención. Pueden existir formas múltiples de enzima QPRT de tabaco. Las formas múltiples de una enzima se pueden deber a modificación de post traducción de un producto génico individual, o a formas múltiples del gen NtQPTL Las condiciones que permiten otras secuencias de ADN que codifican para la expresión de una proteína que tiene actividad de QPRTasa para hibridar con el ADN de SEQ ID NO:1 u otras secuencias de ADN que codifican para la proteína dada como SEQ ID NO:2, se pueden determinar en forma habitual. Por ejemplo, la hibridación de dichas secuencias se puede llevar a cabo bajo condiciones de astringencia reducida o condiciones incluso astringentes (por ejemplo, condiciones representadas por una astringencia de lavado de NaCI a 0.3 M; citrato de sodio a 0.03 M, SDS a 0.1% a 60°C o incluso a 70°C para ADN que codifica la proteína dada como SEQ ID NO:2 en la presente, en una prueba estándar de hibridación in situ. Véase, por ejemplo, J. Sambrook y otros, Molecular Cloning, A Laboratory Manual (2a. Ed. 1989) (Cold Spring Harbor Laboratory)). En general, dichas secuencias serán por lo menos 65% similares, 75% similares, 80% similares, 85% similares, 90% similares, o incluso 95% similares, o más, con la secuencia dada en la presente como SEQ ID NO:1 , o secuencias de ADN que codifican para proteínas de SEQ ID NO:2. (Las determinaciones de la similitud de secuencia se hacen con las dos secuencias alineadas para apareamiento máximo; se dejan espacios en cualquiera de las dos secuencias que están siendo apareadas para aumentar al máximo el apareamiento. Las longitudes de espacio de 10 o menos son preferidas, las longitudes de espacio de 5 o menos son más preferidas, y las longitudes espacio de dos o menos son aún más preferidas). Existen procedimientos de hibridación diferencial que permiten el aislamiento de clones de ADN cuyos niveles de ARN mensajero son tan bajos como aproximadamente 0.05% de ARN poly(A+). Véase M. Conkling y otros, Plant Physiol. 93, 1203-1211 (1990). En resumen, se seleccionan genotecas de ADNc usando sondas de ADNc de cadena sencilla de ARN mensajero transcrito en forma inversa proveniente de tejidos vegetales (por ejemplo, raíces y/u hojas). Para selección diferencial, una membrana de nitrocelulosa o de nylon se sumerge en 5xSSC, se coloca en un múltiple de succión de 96 pozos, 150 µl de cultivo estacionario durante la noche se transfieren de una placa maestra a cada pozo, y se aplica vacío hasta que todo el líquido haya pasado a través del filtro. Se colocan 150 µl de solución desnaturalizante (NaOH a 0.5M, NaCI a 1.5 M) en cada pozo usando un pipeteador múltiple, y se deja que se asienten durante aproximadamente 3 minutos. Se aplica succión como se hizo anteriormente, y el filtro se remueve y se neutraliza en Tris-HCl a 0.5M (pH 8.0) y NaCI a 1.5 M. Se hornea entonces durante 2 horas en vacío, y se incuba con las sondas relevantes. Usando filtros de membrana de nylon, y manteniendo las placas maestras almacenadas a -70°C en DMSO a 7%, se pueden tamizar los filtros múltiples veces con sondas múltiples, y se pueden recuperar clones apropiados después de varios años de almacenamiento. Como se usa en la presente, el término 'gen' se refiere a una secuencia de ADN que incorpora (1 ) señales reguladoras hacia el extremo 5", incluyendo el promotor, (2) una región de codificación que especifica el producto, proteína o ARN del gen, (3) regiones hacia el extremo 3' que incluyen señales de poliadenilación y de terminación de la transcripción, y (4) secuencias asociadas requeridas para expresión eficiente y específica. La secuencia de ADN de la presente invención puede consistir esencialmente de la secuencia provista en la presente (SEQ ID NO:1 ), o secuencias de nucleótidos equivalentes que representen alelos o variantes polimórficas de esos genes, o regiones de codificación de las mismas. El uso de la frase "similitud de secuencia sustancial" en la presente especificación y las reivindicaciones significa que secuencias de ADN, ARN o de aminoácidos que tienen variaciones de secuencia ligeras y no cosecuenciales de las secuencias reales descritas y reclamadas en la presente, son consideradas como equivalentes de las secuencias de la presente invención. A este respecto, las "variaciones de secuencia ligeras y no cosecuenciales" significan que las secuencias "similares" (es decir, las secuencias que tienen similitud de secuencia sustancial con el ADN, ARN o las proteínas descritas y reclamadas en la presente) serán funcionalmente equivalentes a las secuencias descritas y reclamadas en la presente invención. Las secuencias funcionalmente equivalentes funcionarán en sustancialmente la misma forma para producir sustancialmente las mismas composiciones que las composiciones de ácido nucleico y de aminoácidos descritas y reclamadas en la presente. Las secuencias de ADN provistas en la presente pueden ser transformadas en una variedad de células hospederas. Una variedad de células hospederas adecuadas, que tengan propiedades deseables de crecimiento y de manejo, están fácilmente disponibles en la técnica. El uso de la frase "aislados" o "sustancialmente puros" en la presente especificación y las reivindicaciones como modificador de ADN, ARN, polipéptidos o proteínas, significa que el ADN, ARN, polipéptidos o proteínas designados de esta manera han sido separados de sus ambientes celulares in vivo a través de los esfuerzos de seres humanos. Como se usa en la presente, una "secuencia de ADN nativa" o "secuencia de ADN natural" significa una secuencia de ADN la cual puede ser aislada de células o tejidos no transgénicos. Las secuencias de ADN nativas son aquellas que no han sido alteradas artificialmente, tal como mediante mutagénesis dirigida a sitio. Una vez que las secuencias de ADN nativas son identificadas, las moléculas de ADN que tienen secuencias de ADN nativas pueden ser sintetizadas químicamente o producidas usando procedimientos de ADN recombinante, como es sabido en la técnica. Como se usa en la presente, usa secuencia de ADN nativa de plantas es aquella que se puede aislar a partir de células o tejidos de plantas no transgénicas. Como se usa en la presente, una secuencia de ADN nativa de tabaco es aquella que se puede aislar de células o tejidos de tabaco no transgénicos. Las construcciones de ADN o "cassettes de transcripción" de la presente invención incluyen, 5' a 3' en la dirección de la transcripción, un promotor como se describe en la presente, una secuencia de ADN como se describe en la presente asociada operablemente con el promotor y, opcionalmente, una secuencia de terminación que incluye señal de detención para ARN polimerasa y una señal de poliadenilación para poliadenilasa. Todas estas regiones reguladoras deben ser capaces de operar en las células del tejido que será transformado. Cualquier señal de terminación adecuada se puede utilizar para llevar a cabo la presente invención, ejemplos de la misma incluyendo, pero no estando limitados a, el terminador de nopalina sintetasa (nos), el terminador de octapina sintetasa (oes), el terminador de CaMV, o señales de terminación nativas derivadas del mismo gen que la región de inicio de la transcripción o derivadas de un gen diferente. Véase, por ejemplo, Rezian y otros (1988), citado anteriormente, y Rodermel y otros (1988), citado anteriormente. El término "asociadas operablemente", como se usa en la presente, se refiere a secuencias de ADN en una molécula de ADN sencilla las cuales están asociadas, de modo que la función de una es afectada por las otras. De esta manera, un promotor está asociado operablemente con un ADN cuando es capaz de afectar la transcripción de ése ADN (es decir, el ADN está bajo el control de la transcripción del promotor). Se dice que el promotor está "hacia el extremo 5'" del ADN, el cual a su vez se dice que está "hacia el extremo 3'" del promotor. El cassette de transcripción se puede proveer en una construcción de ADN que tenga también por lo menos un sistema de replicación. Por conveniencia, es común tener un sistema de replicación funcional en Escherichia coli, tal como Co1 E1 , pSC101 , pACYC184, o similares. De esta manera, en cada etapa después de cada manipulación, la construcción resultante puede ser clonada, secuenciada, y se puede determinar la exactitud de la manipulación. Además, o en lugar del sistema de replicación de E. coli, se puede utilizar un sistema de replicación de amplio rango de hospederos, tales como los sistemas de replicación de los plásmidos de incompatibilidad P-1 , por ejemplo, pRK290. Además del sistema de replicación, habrá con frecuencia por lo menos un marcador presente, el cual puede ser útil en uno o más hospederos, o diferentes marcadores para hospederos individuales. Es decir, se puede utilizar un marcador para selección en una célula procariótica, mientras que se puede utilizar otro marcador para selección en una célula eucariótica, particularmente la planta hospedera. Los marcadores pueden ser para protección contra un biocida, tales como antibióticos, toxinas, metales pesados, o similares; pueden proveer complementación, impartiendo prototrofia a un hospedero auxótrofo; o pueden proveer un fenotipo visible mediante la producción de un compuesto novedoso en la planta. Los diferentes fragmentos que comprenden las diferentes construcciones, cassettes de transcripción, marcadores, y similares, pueden ser introducidos consecutivamente mediante corte por enzima de restricción de un sistema de replicación apropiado, e inserción de la construcción o fragmento particular en el sitio disponible. Después de ligación y clonación, la construcción de ADN puede ser aislada para manipulación adicional. Todas estas técnicas son ejemplificadas ampliamente en la literatura, como es ejemplificado por J. Sambrook y otros, Molecular Cloning, A Laboratory Manual (2a Ed. 1989) (Cold Spring Harbor Laboratory). Los vectores que se pueden usar para transformar tejidos de plantas con construcciones de ácido nucleico de la presente invención, incluyen vectores de Agrobacterium y vectores balísticos, así como también vectores adecuados para transformación mediada por ADN. El término "promotor" se refiere a una región de una secuencia de ADN que incorpora las señales necesarias para la expresión eficiente de una secuencia de codificación. Esto puede incluir secuencias a las cuales una ARN polimerasa se une, pero no está limitado a dichas secuencias, y puede incluir regiones a las cuales otras proteínas reguladoras se unen con regiones que intervienen en el control de la traducción de proteínas, y puede incluir secuencias de codificación.

Los promotores utilizados para llevar a cabo la presente invención pueden ser promotores constitutivamente activos. Existen numerosos promotores constitutivamente activos que son operables en plantas. Un ejemplo preferido es el promotor 35S del virus del mosaico de la coliflor (CaMV), el cual es expresado constitutivamente en la mayoría de los tejidos vegetales. En la alternativa, el promotor puede ser un promotor específico de la raíz o promotor específico de la corteza de la raíz, como se explica en mayor detalle más adelante. Se han expresado secuencias antisentido en plantas de tabaco transgénicas utilizando el promotor 35S del virus del mosaico de la coliflor (CaMV). Véase, por ejemplo, Cornelissen y otros, "Both RNA Level and Translation Efficiency are Reduced by Anti-Sense RNA in Transgenic Tobacco", Nucleic Acids Res. 17, pp. 833-43 (1989); Rezaian y otros, "Anti-Sense RNAs of Cucumber Mosaic Virus in Transgenic Plants Assessed for Control of the Virus", Plant Molecular Biology 11 , pp. 463-71 (1988); Rodermel y otros, "Nuclear-Organelle Interactions: Nuclear Antisense Gene Inhibits Ribulose Bisphosphate Carboxylase Enzyme Levéis ¡n Transformed Tobacco Plants", Cell 55, pp. 673-81 (1988); Smith y otros, "Antisense RNA Inhibition of Polygalacturonase Gene Expression in Transgenic Tomatoes", Nature 334, pp. 724-26 (1988); y Van der Krol y otros, "An Anti-Sense Chalcone Synthase Gene ¡n Transgenic Plants Inhibits Flower Pigmentation", Nature 333, pp. 866-69 (1988).

Se prefiere el uso del promotor 35S del CaMV para la expresión de QPRTasa en las células y plantas de tabaco transformadas de esta invención. Se ha descrito adecuadamente el uso del promotor del CaMV para la expresión de otros genes recombinantes en raíces de tabaco (Lam y otros, "Site-Specific Mutations Alter In Vitro Factor Binding and Change Promoter Expression Pattern in Transgenic Plants", Proc. Nat. Acad. Sci. USA 86, pp. 7890-94 (1989); Poulsen y otros, "Dissection of 5' Upstream Sequences for Selective Expression of the Nicotiana plumbaginifolia rbcS-8B Gene", Mol. Gen. Genet. 214, pp. 16-23 (1988). Otros promotores que son activos sólo en tejidos de la raíz (promotores específicos de la raíz) son también particularmente adecuados para los métodos de la presente invención. Véase, por ejemplo, patente de E.U.A. No 5,459,252 a Conkling y otros; Yamamoto y otros, The Plant Cell, 3:371 (1991 ). También se puede utilizar el promotor TobRD2 específico de la corteza de la raíz. Véase, por ejemplo, solicitud de patente de E.U.A. SN 08/508,786, ahora asignada a Conkling y otros; documento de PCT WO 9705261. Se pretende que todas las patentes citadas en la presente sean incorporadas en su totalidad en la presente como referencia. Las moléculas de ADN recombinante para QPRTasa, y los vectores usados para producir las células y plantas de tabaco transformadas de esta invención, pueden comprender además un gen marcador seleccionable dominante. Los marcadores seleccionables dominantes adecuados para usarse en el tabaco incluyen, entre otras cosas, genes para resistencia a antibióticos que codifican para neomicina fosfotransferasa (NPTII), higromicina fosfotransferasa (HPT) y cloranfericol acetiltransférasa (CAT). Otro marcador seleccionable dominante bien conocido para usarse en el tabaco, es un gen dominante para dihidrofoliato reductasa que codifica para dihidrofoliato reductasa para resistencia a metotrexato. Vectores de ADN que contienen genes adecuados para resistencia a antibióticos, y los antibióticos correspondientes, están disponibles comercialmente. Se seleccionan células de tabaco transformadas de la población circundante de células no transformadas, colocando la población mixta de células en un medio de cultivo que contenga una concentración apropiada del antibiótico (u otro compuesto normalmente tóxico para las células de tabaco) contra el cual el producto del gen marcador seleccionable dominante elegido confiere resistencia. De esta manera, únicamente aquellas células de tabaco que hayan sido transformadas sobrevivirán y se multiplicarán. Los métodos para obtener plantas recombinantes de la presente invención, en general, implican proveer primero una célula vegetal capaz de sufrir regeneración (la célula vegetal residiendo típicamente en un tejido capaz de sufrir regeneración). La célula vegetal es transformada entonces con una construcción de ADN que comprenda un cassette de transcripción de la presente invención (como se describe en la presente), y se regenera una planta recombinante a partir de la célula vegetal transformada. Como se explica más adelante, el paso de transformación se lleva a cabo mediante técnicas bien conocidas en la materia incluyendo, pero no limitadas a, bombardeo de la célula vegetal con micropartículas que poseen el cassette de transcripción, infección de la célula con Agrobacterium tumefaciens que contenga un plásmido Ti que posea el cassette de transcripción, o cualquier otra técnica adecuada para la producción de una planta transgénica. Se conocen numerosos sistemas de vector de Agrobacterium útiles para llevar a cabo la presente invención. Por ejemplo, la patente de E.U.A. No 4,459,355 describe un método para transformar plantas susceptibles, incluyendo dicotiledóneas, con una cepa de Agrobacterium que contenga el plásmido Ti. La transformación de plantas leñosas con un vector de Agrobacterium se describe en la patente de E.U.A. No. 4,795,855. Además, la patente de E.U.A. No 4,940,838 a Schilperoort y otros describe un vector binario de Agrobacterium (es decir, uno en el cual Agrobacterium contiene un plásmido que tiene la región vir de un plásmido Ti, pero no la región T, y un segundo plásmido que tiene una región T, pero no la región vir) útil para llevar a cabo la presente invención. Las micropartículas que poseen una construcción de ADN de la presente invención, cuya micropartícula es adecuada para la transformación balística de una célula vegetal, son también útiles para obtener plantas transformadas de la presente invención. La micropartícula es impulsada en una célula vegetal para producir una célula vegetal transformada, y se regenera una planta a partir de la célula vegetal transformada. Se puede usar cualquier metodología y aparato para la transformación balística adecuada de células para poner en práctica la presente invención. Ejemplos de aparatos y procedimientos se describen en Sanford y Wolf, patente de E.U.A. No. 4,945,050, y en Christou y otros, patente de E.U.A. No. 5,015,580. Cuando se usan procedimientos de transformación balística, el cassette de transcripción se puede incorporar en un plásmido capaz de replicarse o de integrarse en la célula que será transformada. Ejemplos de micropartículas adecuadas para usarse en dicho sistema ¡ncluyen esferas de oro de 1 a 5 µm. La construcción de ADN se puede depositar sobre la micropartícula mediante cualquier técnica adecuada, tal como mediante precipitación. Las especies vegetales pueden ser transformadas con la construcción de ADN de la presente invención mediante la transformación de protoplastos de la célula vegetal mediada por ADN, y la regeneración subsecuente de la planta a partir de los protoplastos transformados de conformidad con procedimientos bien conocidos en la materia. Se conoce en la técnica la fusión de protoplastos de tabaco con liposomas que contienen ADN, o mediante electroporación (Shillito y otros, "Direct Gene Transfer to Protoplasts of Dicotyledonous and Monocotyledonous Plants by a Number of Methods, Including Electroporation", Methods in Enzymology 153, pp. 313-36 (1987). Como se usa en la presente, la transformación se refiere a la introducción de ADN exógeno en las células para producir células transgénicas transformadas establemente con el ADN exógeno. Las células transformadas son inducidas para regenerar plantas de tabaco intactas mediante la aplicación de técnicas de cultivo de células y de tejidos de tabaco que son bien conocidas en la materia. Se elige el método de regeneración de plantas para que se compatible con el método de transformación. La presencia estable y la orientación de la secuencia de QPRTasa en plantas de tabaco transgénicas, se puede verificar mediante herencia mendeliana de la secuencia de QPRTasa, como es revelado mediante métodos estándar de análisis de ADN aplicados a la progenie resultado de cruzas controladas. Después de la regeneración de plantas de tabaco transgénicas a partir de células transformadas, la secuencia de ADN introducida es transferida fácilmente a otras variedades de tabaco a través de prácticas convencionales de fitomejoram.ento y sin experimentación indebida. Por ejemplo, para analizar la segregación del transgen, las plantas transformadas regeneradas (R0) pueden ser desarrolladas hasta la madurez, puestas a prueba para determinar los niveles de nicotina, y autofecundadas para producir plantas R-i. Un porcentaje de plantas Ri que poseen el transgen son homocigóticas para el transgen. Para identificar plantas Ri homocigóticas, las plantas Ri transgénicas se desarrollan hasta la madurez y se autofecundan. Las plantas Ri homocigóticas producirán progenie R2, en donde cada planta de la progenie posee el transgen; la progenie de plantas Ri heterocigóticas segregará de acuerdo a la relación 3:1.

Puesto que la nicotina funciona como un plaguicida natural que ayuda a proteger a las plantas de tabaco del daño por plagas, puede ser conveniente por lo tanto transformar adicionalmente plantas con bajo nivel de nicotina o sin la misma y producidas mediante los presentes métodos, con un transgen (tal como el de Bacillus thuringiensis) que conferirá protección adicional contra insectos. Una planta preferida para usarse en los presentes métodos son las especies de Nicotiana, o tabaco, incluyendo N. tabacum, N. rustica y N. glutinosa. Se puede usar cualquier cepa o variedad de tabaco. Se prefieren las cepas que tengan ya bajo contenido de nicotina, tales como los mutantes dobles Nic1/Nic2. Cualquier tejido vegetal capaz de sufrir propagación clonal subsecuente, ya sea mediante organogénesis o embriogénesis, puede ser transformado con un vector de la presente invención. El término "organogénesis", como se usa en la presente, significa un procedimiento mediante el cual se desarrollan secuencialmente brotes y raíces a partir de centros meristemáticos; el término "embriogénesis, como se usa en la presente, significa un procedimiento mediante el cual se desarrollan en conjunto brotes y raíces en forma concertada (no secuencialmente), ya sea a partir de células somáticas o gametos. El tejido elegido en particular variará dependiendo de los sistemas de propagación clonal disponibles y adecuados para la especie en particular que está siendo transformada. Ejemplos de tejidos blanco incluyen discos foliares, polen, embriones, cotiledones, hipocotilos, tejido de callo, tejido meristemático existente (por ejemplo, meristemos apicales, yemas axilares y meristemos de la raíz), y tejido meristemático inducido (por ejemplo, meristemos de cotiledón y meristemos de hipocotilo).

Las plantas de la presente invención pueden adoptar varias formas. Las plantas pueden ser quimeras de células transformadas y células no transformadas; las plantas pueden ser transformantes clónales (por ejemplo, todas las células transformadas contienen el cassette de transcripción); o las plantas pueden comprender injertos de tejidos transformados y no transformados (por ejemplo, un patrón de injerto transformado injertado en una púa no transformada en especies de cítricos). Las plantas transformadas se pueden propagar mediante varios medios, tales como mediante propagación clonal o técnicas de reproducción clásicas. Por ejemplo, las plantas transformadas de primera generación (o T1 ) pueden ser autofecundadas para dar plantas homocigóticas transformadas de segunda generación (o T2), y las plantas T2 pueden ser propagadas además mediante técnicas de reproducción clásicas. Un marcador seleccionable dominante (tal como npfll) se puede asociado con el cassette de transcripción para facilitar la reproducción. En vista de lo anterior, será evidente que las plantas que se pueden utilizar para poner en práctica la presente invención incluyen aquellas del género Nicotiana. Los familiarizados con los métodos de ADN recombinante descritos anteriormente, reconocerán que se puede utilizar una molécula de ADNc para QPRTasa de longitud total o un gen cromosómico para QPRTasa de longitud total, unidos en orientación sentido, con secuencias reguladoras apropiadas operablemente enlazadas, para construir células y plantas de tabaco transgénicas (los expertos en la técnica reconocerán también que las secuencias reguladoras apropiadas para la expresión de genes en orientación sentido, incluyen cualquiera de las secuencias conocidas de inicio de la traducción en eucariontes, además de las secuencias de promotor y de terminación de la transcripción/poliadenilación descritas anteriormente). Dichas plantas de tabaco transformadas se caracterizan por niveles incrementados de QPRTasa, y de esta manera por un contenido mayor de nicotina que las plantas de tabaco control no transformadas. Por lo tanto, se debe entender que el uso de secuencias de ADN para QPRTasa para disminuir o para incrementar los niveles de la enzima QPRT, y para disminuir o aumentar de esta manera el contenido de nicotina en plantas de tabaco, está dentro del alcance de la presente invención. Como se usa en la presente, un cultivo comprende una pluralidad de plantas de la presente invención, y del mismo género, sembradas juntas en un campo agrícola. Por "campo agrícola" se entiende una parcela común de suelo o un invernadero. De esta manera, la presente invención provee un método para producir un cultivo de plantas que tengan actividad alterada de QPRTasa, y que tengan de esta manera niveles de nicotina incrementados o disminuidos, comparativamente con un cultivo similar de plantas no transformadas de la misma especie y variedad. Los ejemplos siguientes se dan para ilustrar la presente invención, y no deberá considerarse que son limitantes de la misma.

EJEMPLO 1 Aislamiento y secuenciación ADNc de TobRD2 (Conkling y otros, Plant Phys. 93, 1203 (1990)) fue secuenciado, y se provee en la presente como SEQ ID NO:1 , y la secuencia deducida de aminoácidos como SEQ ID NO:2. Se pronosticó que la secuencia deducida de aminoácidos es una proteína citosólica. Aunque no se han reportado genes para QPRTasa en plantas, las comparaciones de la secuencia de aminoácidos de NtPT1 con la base de datos del banco de genes (figura 3), revelaron similitud de secuencia limitada con ciertas proteínas bacterianas y de otro tipo; se ha demostrado actividad de quinolato fosforribosil transferasa (QPRTasa) para los genes de S. typhimurium, E. coli y N. tabacum. La QPRTasa codificada por NtQPTI tiene similitud con el fragmento deducido de péptidos codificado por la secuencia EST de Arabidopsis (marca de secuencia de expresión) (número de acceso F20096 del banco de genes), el cual puede representar parte de un gen para QPRTasa de Arabidopsis.

EJEMPLO 2 Hibridaciones in situ Para determinar la distribución espacial de transcritos de ARN mensajero de TobRD2 en los diferentes tejidos de la raíz, se llevaron a cabo hibridaciones in situ en plantas no transformadas. Las hibridaciones in situ de la cadena antisentido de TobRD2 con el ARN mensajero de TobRD2 en el tejido de la raíz, se llevaron a cabo usando técnicas tales como se describe en Meyerowitz, Plant Mol. Biol. Rep. 5, 242 (1987) y Smith y otros, Plant Mol, Biol. Rep. 5, 237 (1987). Raíces de plántulas de tabaco (Nicotiana tabacum) de siete días, fueron fijadas en glutaraldehído regulado en su pH con fosfato, incluidas en Paraplast Plus (Monoject Inc., St. Louis, MO) y seccionadas a un espesor de 8 mm, para obtener secciones transversales así como también secciones longitudinales. Se usaron como sondas transcritos de TobRD2 antisentido, sintetizados in vitro en presencia de 35S-ATP. El ARN marcado fue hidrolizado mediante tratamiento con sustancia alcalina para producir una longitud promedio en masa de 100 a 200 bases antes del uso. Las hibridaciones se llevaron a cabo en formamida a 50% durante 16 horas a 42°C, con aproximadamente 5 x 106 conteos por minuto (cpm), y ARN marcado por mililitro de solución de hibridación. Después de la exposición, los portaobjetos fueron desarrollados y visualizados bajo microscopía del campo brillante y oscuro. La señal de hibridación fue localizada hacia la capa cortical de células de la raíz (resultados no mostrados). La comparación de las imágenes de campo brillantes y oscuras de las mismas secciones, permitió localizar transcritos de TobRD2 hacia las células parenquimatosas de la corteza de la raíz. No se observó señal de hibridación alguna en la epidermis o el estele.

EJEMPLO 3 Niveles de ARN mensajero de TobRD2 en mutantes de tabaco Niel y Nic2, y correlación con los niveles de nicotina Se examinaron los niveles de ARN mensajero de estado estable de TobRD2 en plantas de tabaco mutantes Niel y Nic2. Se sabe que Nid y Nic2 regulan la actividad de la quinolato fosforribosil transferasa y la actividad de la metil transferasa de putrescencia, y que son reguladores codominantes de la producción de nicotina. Los presentes resultados se ilustran en las figuras 5A y 5B, y muestran que la expresión de TobRD2 es regulada por Nid y Nic2. Se aisló ARN de las raíces de plantas de tabaco Burley 21 de tipo silvestre (Nic1/Nic1 Nic2/Nic2); raíces de Burley 21 NicT (nid/nic2 Nic2/Nic2); raíces de Burley 21 NicZ (Nic1/Nic1 nic2/nic2); y raíces de Burley 21 Nid'NicZ (nic1/nic1 nic2/nic2). Se desarrollaron 4 líneas de tabaco Burley 21 (nic) a partir de semillas sembradas en suelo durante 1 mes, y se transfirieron a cámaras hidropónicas en solución nutritiva aereada en un invernadero durante 1 mes. Estas líneas eran isogénicas, excepto para los dos loci de bajo contenido de nicotina, y tenían genotipos de Nic1/Nic1 Nic2/Nic2, Nic1/Nic1 nic2/nic2, nid/nic1 Nic2/Nic2, nic1/nid nic2/nic2. Se cosecharon las raíces de aproximadamente 20 plantas para cada genotipo, y se agruparon para el aislamiento de ARN. Se sometió a electroforesis ARN total (1µg) de cada genotipo a través de un gel de agarosa a 1% conteniendo formaldehído a 1.1 M, y se transfirió a una membrana de nylon de conformidad con Sambrook y otros (1989). Las membranas fueron hibridadas con fragmentos de ADNc para TobRD2 marcadas con 32P. La intensidad relativa de los transcritos de TobRD2 se midió mediante densitometría. La figura 5 (barras sólidas) ilustra los niveles relativos de los transcritos (comparativamente con Nic1/Nic1 Nic2/Nic2) para cada uno de los 4 genotipos. El contenido relativo de nicotina (comparativamente con Nic1/Nic1 Nic2/Nic2) de los cuatro genotipos, se muestra mediante las barras sombreadas. La figura 5 compara gráficamente el nivel de ARN mensajero de TobRD2 de estado estable relativo, usando el nivel encontrado en la variedad Burley 21 de tipo silvestre (Nic1/Nic1 Nic2/Nic2) como cantidad de referencia. Los niveles de ARN mensajero de TobRD2 en mutantes dobles Nic1/Nic2, fueron aproximadamente 25% de los encontrados en plantas de tabaco de tipo silvestre. La figura 5B compara además los niveles de nicotina relativos en las líneas isogénicas cercanas de tabaco estudiadas en este ejemplo (las barras sólidas indican el nivel de transcritos de TobRD2; las barras sombreadas indican el nivel de nicotina). Hubo una correlación estrecha entre los niveles de nicotina y los niveles de transcritos de TobRD2.

EJEMPLO 4 Efecto del desmoche sobre los niveles de ARN mensajero de TobRD2 Es bien sabido en la técnica que la remoción de la cabezuela floral (desmoche) de una planta de tabaco incrementa el crecimiento de la raíz e incrementa el contenido de nicotina en las hojas de la planta. El desmoche de la planta es una práctica estándar en el cultivo comercial de tabaco, y el tiempo óptimo para desmochar una planta de tabaco determinada bajo una serie conocida de condiciones de crecimiento, puede ser determinado fácilmente por el experto en la técnica. Se desarrollaron plantas de tabaco (SR1 de N. tabacum) a partir de semillas sembradas en suelo durante 1 mes, y se transfirieron a macetas conteniendo arena. Las plantas se desarrollaron en un invernadero durante otros dos meses hasta que iniciaran su floración. Se removieron entonces cabezuelas florales y dos nudos de cuatro plantas (desmoche). Se cosechó una porción de las raíces de cada planta después del tiempo indicado, y se agrupó para extracción de ARN. Las plantas control no fueron desmochadas. El ARN total (1 µg) de cada punto de tiempo se sometió a electroforesis a través de gel de agarosa a 1 % conteniendo formaldehído a 1.1 M, y se transfirió a membrana de nylon de conformidad con Sambrook y otros (1989). Las membranas fueron hibridadas con fragmentos de ADNc para TobRD2 marcadas con 32P. La intensidad relativa de los transcritos de TobRD2 se determinó mediante densitometría. La figura 6 ilustra los niveles relativos de transcritos (comparativamente con el tiempo cero) para cada punto de tiempo con desmoche (barras sólidas) o sin desmoche (barras sombreadas). Se determinaron los niveles relativos de TobRD2 en tejido de la raíz durante 24 horas; los resultados se muestran en la figura 6 (las barras sólidas indican los niveles de transcritos de TobRD2 en plantas desmochadas; las barras sombreadas indican los niveles de transcritos de TobRD2 en controles no desmochados). Dentro de seis horas del desmoche de las plantas de tabaco, los niveles de ARN mensajero de TobRD2 aumentaron aproximadamente ocho veces en las plantas desmochadas; no se observó incremento alguno en plantas control durante el mismo período.

EJEMPLO 5 Complementación de mutante bacteriano que carece de QPRTasa con ADN de SEQ ID NO:1 La cepa TH265 de Escherichia coli es un mutante que carece de quinolato fosforribosil transferasa (nadC-) y, por lo tanto, no puede crecer en medios que carezcan de ácidos nicotínicos. Células TH265 fueron transformadas con un vector de expresión (pWS161 ) que contiene ADN de SEQ ID NO:1 , o transformadas únicamente con el vector de expresión (pKK233). Se comparó el crecimiento de las bacterias transformadas con el crecimiento de transformantes TH265 (pKK233) y con el crecimiento del mutante no transformado nadC- de las células TH265. El crecimiento se comparó en medios mínimos ME (que carecen de ácido nicotínico) y en medios mínimos ME con ácido nicotínico añadido. La cepa TH265 de E. coli con la mutación de QPTasa (nadC), fue provista amablemente por el Dr. K. T. Hughes (Hughes y otros, J. Bact. 175-479 (1993). Las células se mantuvieron en medios LB, y las células competentes se prepararon como se describe en Sambrook y otros (1989). Se construyó un plásmido de expresión en pKK2233 (Brosius, 1984) con el ADNc de TobRD2 clonado bajo el control del promotor Tac. El plásmido resultante, pWS161 , fue transformado en células TH265. Las células transformadas fueron depositadas entonces en placas de agar de medio mínimo (Vogel y Bonner, 1956) con o sin ácido nicotínico (0.0002%) como complemento. Las células TH265 solas y células TH265 transformadas con pKK2233 fueron depositadas en placas similares para usarse como controles. Los resultados se muestran en la figura 4. Únicamente las células TH265 transformadas con ADN de SEQ ID NO:1 crecieron en medios que carecían de ácido nicotínico. Estos resultados muestran que la expresión del ADN de SEQ ID NO:1 en células bacterianas TH265 confirió el fenotipo NadC-- en estas células, confirmando que esta secuencia codifica para QPRTasa. La nomenclatura de TobRD2 fue cambiada así a NtQPTL EJEMPLO 6 Transformación de plantas de tabaco El ADN de SEQ ID NO:1 , en orientación antisentido, es enlazado operablemente a un promotor de plantas (promotor específico de la corteza de la raíz de TobRD2 o 35S del CaMV) para producir dos cassettes de ADN diferentes: promotor 35S del CaMV/SEQ ID NO:1 antisentido, y promotor de TobRD2/SEQ ID NO:1 antisentido. Se seleccionaron para transformación una línea de tabaco de tipo silvestre y una línea de tabaco de bajo contenido de nicotina, por ejemplo, tabaco Burley 21 de tipo silvestre (Niel +/Nic2+) y Burley 21 nic1-/níc2-homocigótico. Una pluralidad de células de plantas de tabaco de cada línea es transformada usando cada uno de los cassettes de ADN. La transformación se lleva a cabo usando un vector de Agrobacterium, por ejemplo, un vector binario de Agrobacterium, que posea secuencias limítrofes T1 y el gen nptll (que confiere resistencia a kanamicina y bajo el control del promotor nos (nptll)). Las células transformadas son seleccionadas y regeneradas en plantas de tabaco transgénicas (R0). Las plantas R0 se desarrollan hasta la madurez y se ponen a prueba para los niveles de nicotina; un subconjunto de las plantas de tabaco transformadas exhibe niveles significativamente menores de nicotina, comparativamente con plantas control no transformadas.

Las plantas R0 son entonces autofecundadas, y la segregación del transgen se analiza en la progenie R-i. La progenie Ri se desarrolla hasta la madurez y se autofecunda; la segregación del transgen entre la progenie R2 indica que las plantas Ri son homocigóticas para el transgen.

LISTADO DE SECUENCIAS (1 ) INFORMACIÓN GENERAL (i) SOLICITANTE: Conkling, Mark A. Mendu, Nandini Song, Wen (ii) TITULO DE LA INVENCIÓN: Regulación de la expresión de quinolato fosforribosil transferasa (¡ii) NUMERO DE SECUENCIAS: 4 (iv) DIRECCIÓN PARA CORRESPONDENCIA: (A) DESTINATARIO: Kenneth Sibley, Bell Seitzer Park & Gibson (B) CALLE: Post Office Drawer 34009 (C) CIUDAD: Charlotte (D) ESTADO: Carolina del Norte (E) PAÍS: ESTADOS UNIDOS DE NORTEAMÉRICA (F) CÓDIGO POSTAL: 28234 (v) FORMA LEGIBLE DE COMPUTADORA: (A) TIPO DE MEDIO: Disco Flexible (B) COMPUTADORA: compatible con PC IBM (C) SISTEMA OPERATIVO: PC-DOC/MS-DOS (D) PROGRAMAS: Patentln Reléase -#1.0, Versión #1.30 (vi) DATOS COMUNES DE LA SOLICITUD: (A) SOLICITUD NUMERO: (B) FECHA DE PRESENTACIÓN: (C) CLASIFICACIÓN: (viii) INFORMACIÓN DEL APODERADO/AGENTE: (A) NOMBRE: Sibley, Kenneth D. (B) REGISTRO NUMERO: 31 ,665 (C) REFERENCIA/CASO NUMERO: 5051-338P (ix) INFORMACIÓN DE TELECOMUNICACIÓN: (A) TELEFONO: 919-420-2200 (B) TELEFAX: 919-881-3175 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:1 : (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 1399 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADENA: sencilla (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOMBRE/CLAVE: CDS (B) LOCALIZACION: 52..1104 (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:1 : caaaaactat tttccacaaa attcatttca caaccccccc aaaaaaaaac c atg ttt 57 Met Phe aga gct att ect ttc act gct acá gtg cat ect tat gca att acá gct 105 Arg Ala lie Pro Phe Thr Ala Thr Val His Pro Tyr Ala lie Thr Ala 5 10 15 cea agg ttg gtg gtg aaa atg tea gca ata gcc acc aag aat acá aga 153 Pro Arg Leu Val Val Lys Met Ser Ala He Ala Thr Lys Asn Thr Arg 20 25 30 gtg gag tea tta gag gtg aaa cea cea gca cae cea act tat gat tta 201 Val Glu Ser Leu Glu Val Lys Pro Pro Ala His Pro Thr Tyr Asp Leu 40 45 50 aag gaa gtt atg aaa ctt gca etc tet gaa gat gct ggg aat tta gga 249 Lys Glu Val Met Lys Leu Ala Leu Ser Glu Asp Ala Gly Asn Leu Gly 55 60 65 gat gtg act tgt aag gcg acá att ect ctt gat atg gaa tec gat gct 297 Asp Val Thr Cys Lys Ala Thr lie Pro Leu Asp Met Glu Ser Asp Ala 70 75 80 cat ttt cta gca aag gaa gac ggg ate ata gca gga att gca ctt gct 345 His Phe Leu Ala Lys Glu Asp Gly lie He Ala Gly lie Ala Leu Ala 85 90 95 gag atg ata ttc gcg gaa gtt gat ect tea tta aag gtg gag tgg tat 393 Glu Met lie Phe Ala Glu Val Asp Pro Ser Leu Lys Val Glu Trp Tyr 100 105 110 gta aat gat ggc gat aaa gtt cat aaa ggc ttg aaa ttt ggc aaa gta 441 Val Asn Asp Gly Asp Lys Val His Lys Gly Leu Lys Phe Gly Lys Val 115 120 125 130 caá gga aac gct tac aac att gtt ata gct gag agg gtt gtt etc aat 489 Gln Gly Asn Ala Tyr Asn lie Val He Ala Glu Arg Val Val Leu Asn 135 140 145 ttt atg caá aga atg agt gga ata gct acá cta act aag gaa atg gca 537 Phe Met Gln Arg Met Ser Gly lie Ala Thr Leu Thr Lys Glu Met Ala 150 155 160 gat gct gca cae ect gct tac ate ttg gag act agg aaa act gct ect 585 Asp Ala Ala His Pro Ala Tyr lie Leu Glu Thr Arg Lys Thr Ala Pro 165 170 175 gga tta cgt ttg gtg gat aaa tgg gcg gta ttg ate ggt ggg ggg aag 633 Gly Leu Arg Leu Val Asp Lys Trp Ala Val Leu lie Gly Gly Gly Lys 180 185 190 aat cae aga atg ggc tta ttt gat atg gta atg ata aaa gac aat cae 681 Asn His Arg Met Gly Leu Phe Asp Met Val Met lie Lys Asp Asn His 195 200 205 210 ata tet gct gct gga ggt gtc ggc aaa gct cta aaa tet gtg gat cag 729 lie Ser Ala Ala Gly Gly Val Gly Lys Ala Leu Lys Ser Val Asp Gln 215 220 225 tat ttg gag caá aat aaa ctt caá ata ggg gtt gag gtt gaa acc agg 777 Tyr Leu Glu Gln Asn Lys Leu Gln He Gly Val Glu Val Glu Thr Arg 230 235 240 acá att gaa gaa gta cgt gag gtt cta gac tat gca tet caá acá aag 825 Thr He Glu Glu Val Arg Glu Val Leu Asp Tyr Ala Ser Gln Thr Lys 245 250 255 act teg ttg act agg ata atg ctg gac aat atg gtt gtt cea tta tet 873 Thr Ser Leu Thr Arg He Met Leu Asp Asn Met Val Val Pro Leu Ser 260 265 270 aac gga gat att gat gta tec atg ctt aag gag gct gta gaa ttg ate 921 Asn Gly Asp He Asp Val Ser Met Leu Lys Glu Ala Val Glu Leu He 275 280 285 290 aat ggg agg ttt gat acg gag gct tea gga aat gtt acc ctt gaa acá 969 Asn Gly Arg Phe Asp Thr Glu Ala Ser Gly Asn Val Thr Leu Glu Thr 295 300 305 gta cae aag att gga caá act ggt gtt acc tac att tet agt ggt gcc 1017 Val His Lys He Gly Gln Thr Gly Val Thr Tyr He Ser Ser Gly Ala 310 315 320 ctg acg cat tec gtg aaa gca ctt gac att tec ctg aag ate gat acá 1065 Leu Thr His Ser Val Lys Ala Leu Asp lie Ser Leu Lys lie Asp Thr 325 330 335 gag etc gcc ctt gaa gtt gga agg cgt acá aaa cga gca tgagcgccat 1114 Glu Leu Ala Leu Glu Val Gly Arg Arg Thr Lys Arg Ala 340 345 350 tacttctgct atagggttgg agtaaaagea gctgaatagc tgaaaggtgc aaataagaat 1174 cattttacta gttgtcaaac aaaagatect tcactgtgta atcaaacaaa aagatgtaaa 1234 ttgetggaat atetcagatg gctcttttcc aaccttattg ettgagttgg taattteatt 1294 atagctttgt tttcatgttt catggaattt gttacaatga aaatacttga tttataagtt 1354 tggtgtatgt aaaattctgt gttacttcaa atattttgag atgtt 1399 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID N0:2: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 351 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGÍA: lineal (¡i) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:2: Met Phe Arg Ala lie Pro Phe Thr Ala Thr Val His Pro Tyr Ala He 1 5 10 15 Thr Ala Pro Arg Leu Val Val Lys Met Ser Ala He Ala Thr Lys Asn 20 25 30 Thr Arg Val Glu Ser Leu Glu Val Lys Pro Pro Ala His Pro Thr Tyr 40 45 Asp Leu Lys Glu Val Met Lys Leu Ala Leu Ser Glu Asp Ala Gly Asn 50 55 60 Leu Gly Asp Val Thr Cys Lys Ala Thr He Pro Leu Asp Met Glu Ser 65 70 75 80 Asp Ala His Phe Leu Ala Lys Glu Asp Gly He He Ala Gly He Ala 85 90 95 Leu Ala Glu Met lie Phe Ala Glu Val Asp Pro Ser Leu Lys Val Glu 100 105 110 Trp Tyr Val Asn Asp Gly Asp Lys Val His Lys Gly Leu Lys Phe Gly 115 120 125 Lys Val Gln Gly Asn Ala Tyr Asn He Val lie Ala Glu Arg Val Val 130 135 140 Leu Asn Phe Met Gln Arg Met Ser Gly He Ala Thr Leu Thr Lys Glu 145 150 155 160 Met Ala Asp Ala Ala His Pro Ala Tyr He Leu Glu Thr Arg Lys Thr 165 170 175 Ala Pro Gly Leu Arg Leu Val Asp Lys Trp Ala Val Leu He Gly Gly 180 185 190 Gly Lys Asn His Arg Met Gly Leu Phe Asp Met Val Met lie Lys Asp 195 200 205 Asn His He Ser Ala Ala Gly Gly Val Gly Lys Ala Leu Lys Ser Val 210 215 220 Asp Gln Tyr Leu Glu Gln Asn Lys Leu Gln lie Gly Val Glu Val Glu 225 230 235 240 Thr Arg Thr lie Glu Glu Val Arg Glu Val Leu Asp Tyr Ala Ser Gln 245 250 255 Thr Lys Thr Ser Leu Thr Arg lie Met Leu Asp Asn Met Val Val Pro 260 265 270 Leu Ser Asn Gly Asp lie Asp Val Ser Met Leu Lys Glu Ala Val Glu 275 280 285 Leu lie Asn Gly Arg Phe Asp Thr Glu Ala Ser Gly Asn Val Thr Leu 290 295 300 Glu Thr Val His Lys He Gly Gln Thr Gly Val Thr Tyr He Ser Ser 305 310 315 320 Gly Ala Leu Thr His Ser Val Lys Ala Leu Asp He Ser Leu Lys lie 325 330 335 Asp Thr Glu Leu Ala Leu Glu Val Gly Arg Arg Thr Lys Arg Ala 340 345 350 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:3: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 1053 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADENA: sencilla (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:3: atgtttagag ctattccttt cactgctaca gtgcatcctt atgcaattac agctccaagg 60 ttggtggtga aaatgtcagc aatagccacc aagaatacaa gagtggagtc attagaggtg 120 aaaccaccag cacacccaac ttatgattta aaggaagtta tgaaacttgc actctctgaa 180 gatgctggga atttaggaga tgtgacttgt aaggcgacaa ttcctcttga tatggaatcc 240 gatgctcatt ttctagcaaa ggaagacggg atcatagcag gaattgcact tgctgagatg 300 atattcgcgg aagttgatcc ttcattaaag gtggagtggt atgtaaatga tggcgataaa 360 gtteataaag gettgaaatt tggcaaagta caaggaaacg cttacaacat tgttataget 420 gagagggttg ttctcaattt tatgcaaaga atgagtggaa tagetacact aactaaggaa 480 atggcagatg ctgcacaccc tgcttacatg ttggagacta ggaaaactgc tcctggatta 540 cgtttggtgg ataaatgggc ggtattgatc ggtgggggga agaatcacag aatgggctta 600 tttgatatgg taatgataaa agacaatcac atatctgctg ctggaggtgt cggcaaagct 660 ctaaaatctg tggatcagta tttggagcaa aataaacttc aaataggggt tgaggttgaa 720 accaggacaa ttgaagaagt acgtgaggtt ctagactatg catctcaaac aaagaetteg 780 ttgactagga taatgetgga caatatggtt gttecattat ctaacggaga tattgatgta 840 tecatgetta aggaggctgt agaattgatc aatgggaggt ttgatacgga ggcttcagga 900 aatgttaccc ttgaaacagt acacaagatt ggacaaactg gtgttaccta catttctagt 960 ggtgccctga cgcattccgt gaaageaett gacatttccc tgaagatega tacagagetc 1020 gcccttgaag ttggaaggcg tacaaaacga gca 1053

Claims (44)

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN REIVINDICACIONES

1.- Una molécula de ADN aislado, caracterizada porque comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste de: (a) SEQ ID NO:1 ; (b) secuencias de ADN que codifican para una enzima que tiene SEQ ID NO:2; (c) secuencias de ADN que hibridan con ADN aislado de los incisos (a) o (b) anteriores, y que codifican para una enzima quinolato fosforribosil transferasa; y (d) secuencias de ADN que difieren del ADN de los incisos (a), (b) o (c) anteriores debido a la degeneración del código genético.

2.- Una construcción de ADN que comprende un cassette de expresión, caracterizada porque dicha construcción comprende, en dirección 5' a 3', un promotor operable en una célula vegetal, y un segmento de ADN de conformidad con la reivindicación 1 situado hacia el extremo 3' de dicho promotor y asociado operablemente con el mismo.

3.- Una construcción de ADN que comprende un cassette de expresión, caracterizada porque dicha construcción comprende, en dirección 5' a 3', un promotor de plantas y un segmento de ADN de conformidad con la reivindicación 1 situado hacia el extremo 3' de dicho promotor y asociado operablemente con el mismo, dicho segmento de ADN estando en orientación antisentido.

4.- Una construcción de ADN que comprende, en dirección 5' a 3', un promotor operable en una célula vegetal, y ADN que codifica para una quinolato fosforribosil transferasa de plantas, dicho ADN estando asociado operablemente con dicho promotor.

5.- Una construcción de ADN que comprende, en dirección 5' a 3', un promotor operable en una célula vegetal, y ADN que codifica para una quinolato fosforribosil transferasa de plantas, dicho ADN estando en orientación antisentido y asociado operablemente con dicho promotor.

6.- Una construcción de ADN de conformidad con las reivindicaciones 2, 3, 4 o 5, caracterizada porque el promotor es constitutivamente activo en células vegetales.

7.- Una construcción de ADN de conformidad con las reivindicaciones 2, 3, 4 o 5, caracterizada además porque dicho promotor es selectivamente activo en células de tejido de la raíz de la planta.

8.- Una construcción de ADN de conformidad con las reivindicaciones 2, 3, 4 o 5, caracterizada además porque dicho promotor es selectivamente activo en células de tejido de la corteza de la raíz de la planta.

9.- Una construcción de ADN de conformidad con las reivindicaciones 2, 3, 4 o 5, caracterizada además porque dicha construcción comprende además un plásmido.

10.- Una construcción de ADN de conformidad con las reivindicaciones 2, 3, 4 o 5, caracterizada además porque es llevada por un vector de transformación de plantas.

11.- Una construcción de ADN de conformidad con las reivindicaciones 2, 3, 4 o 5, caracterizada además porque es llevada por un vector de transformación de plantas, cuyo vector de transformación de plantas es un vector de Agrobacterium tumefaciens.

12.- Una célula vegetal que contiene una construcción de ADN de conformidad con las reivindicaciones 2, 3, 4 o 5.

13.- Una planta transgénica que comprende células vegetales de conformidad con la reivindicación 12.

14.- Un péptido que tiene la secuencia SEQ ID NO:2.

15.- Un péptido codificado por una secuencia de ADN seleccionada del grupo que consiste de: (a) SEQ ID NO:1 ; (b) secuencias de ADN que hibridan con ADN aislado del inciso (a) anterior, y que codifican para una enzima quinolato fosforribosil transferasa; y (c) secuencias de ADN que difieren del ADN de los incisos (a) o (b) anteriores debido a la degeneración del código genético.

16.- Un método para obtener una célula vegetal transgénica que tiene expresión reducida de quinolato fosforribosil transferasa (QPRTasa), dicho método comprendiendo: proveer una célula vegetal de un tipo que se sabe expresa quinolato fosforribosil transferasa; proveer una construcción de ADN exógeno, cuya construcción comprenda, en dirección 5' a 3', un promotor operable en una célula vegetal, y ADN que comprenda una porción de una secuencia que codifique para ARN mensajero para quinolato fosforribosil transferasa, dicho ADN estando asociado operablemente con dicho promotor; y transformar dicha célula vegetal con dicha construcción de ADN para producir células transformadas; dicha célula vegetal teniendo expresión reducida de QPRTasa comparativamente con una célula no transformada.

17.- El método de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado porque dicho ADN que comprende una porción de una secuencia que codifica para ARN mensajero para quinolato fosforribosil transferasa, está en orientación antisentido.

18.- El método de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado además porque dicho ADN que comprende una porción de una secuencia que codifica para ARN mensajero para quinolato fosforribosil transferasa, está en orientación sentido.

19.- El método de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado además porque dicha célula vegetal es Nicotiana tabacum.

20.- El método de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado además porque comprende regenerar una planta a partir de dicha célula vegetal transformada.

21.- El método de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado además porque dicho promotor es constitutivamente activo.

22.- El método de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado además porque dicho promotor es selectivamente activo en células de tejido de la raíz de la planta.

23.- El método de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado además porque dicho promotor es selectivamente activo en células de tejido de la corteza de la raíz de la planta.

24.- El método de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado además porque dicho paso de transformación se lleva a cabo bombardeando dicha célula vegetal con micropartículas que poseen dicha construcción de ADN.

25.- El método de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado además porque dicho paso de transformación se lleva a cabo infectando dicha célula vegetal con Agrobacterium tumefaciens que contiene un plásmido Ti que posee dicha construcción de ADN.

26.- Un método para producir semillas de tabaco transgénicas, caracterizado porque comprende colectar semilla de una planta de tabaco transgénica producida mediante el método de conformidad con la reivindicación 19.

27.- El método de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado además porque dicha secuencia de ADN exógeno es complementaria a dicho ARN mensajero para quinolato fosforribosil transferasa (ARN mensajero para QPRT) expresada en dicha célula vegetal en una región seleccionada de: (a) la secuencia 5' no traducida de dicho ARN mensajero para QPRT; (b) la secuencia 3' no traducida de dicho ARN mensajero para QPRT; y (c) la región traducida de dicho ARN mensajero para QPRT.

28.- El método de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado además porque dicha secuencia de ADN exógeno es complementaria a por lo menos 15 nucleótidos de dicho ARN mensajero para quinolato fosforribosil transferasa expresada en dicha célula vegetal.

29.- El método de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado además porque dicha secuencia de ADN exógeno es complementaria a por lo menos 200 nucleótidos de dicho ARN mensajero para quinolato fosforribosil transferasa expresada en dicha célula vegetal.

30.- El método de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado además porque dicha secuencia de ADN exógeno comprende una secuencia que codifica para quinolato fosforribosil transferasa seleccionada de las secuencias de ADN de conformidad con la reivindicación 1.

31.- Una planta transgénica de la especie Nicotiana que tiene expresión reducida de quinolato fosforribosil transferasa (QPRTasa) respecto a una planta control no transformada, dicha planta transgénica comprendiendo células vegetales transgénicas que contienen: una construcción de ADN exógeno que comprende, en dirección 5' a 3', un promotor operable en dicha célula vegetal, y ADN que comprende un segmento de una secuencia de ADN que codifica para un ARN mensajero para quinolato fosforribosil transferasa, dicho ADN estando asociado operablemente con dicho promotor; dicha planta exhibiendo expresión reducida de QPRTasa comparativamente con una planta control no transformada.

32.- El método de conformidad con la reivindicación 31 , caracterizado además porque dicho segmento de ADN que comprende un segmento de una secuencia de ADN que codifica para ARN mensajero para quinolato fosforribosil transferasa, está en orientación antisentido.

33.- El método de conformidad con la reivindicación 31 , caracterizado además porque dicho segmento de ADN que comprende un segmento de una secuencia de ADN que codifica para ARN mensajero para quinolato fosforribosil transferasa, está en orientación sentido.

34.- Una planta transgénica de la especie Nicotiana que tiene expresión reducida de quinolato fosforribosil transferasa (QPRTasa) respecto a una planta control no transformada, caracterizada porque dicha planta transgénica es una progenie de una planta de conformidad con la reivindicación 31.

35.- Semillas de una planta transgénica de la especie Nicotiana que tiene expresión reducida de quinolato fosforribosil transferasa (QPRTasa) respecto a una planta control no transformada, caracterizadas porque dicha planta transgénica es una planta de conformidad con la reivindicación 31 , o una progenie de la misma.

36.- Un cultivo que comprende una pluralidad de plantas de conformidad con la reivindicación 31 sembradas juntas en un campo agrícola.

37.- Un método para reducir la expresión de un gen para quinolato fosforribosil transferasa en una célula vegetal, dicho método comprendiendo: desarrollar una célula vegetal transformada para que contenga ADN exógeno, en donde una cadena transcrita de dicho ADN exógeno es complementaria al ARN mensajero para quinolato fosforribosil transferasa endógeno a dicha célula, según lo cual la transcripción de dicha cadena complementaria reduce la expresión de dicho gen para quinolato fosforribosil transferasa.

38.- Un método para producir una planta de tabaco que tenga niveles reducidos de nicotina en las hojas de dicha planta de tabaco, dicho método comprendiendo: desarrollar una planta de tabaco, o plantas de la progenie de la misma, en donde dicha planta comprende células que contienen una construcción de ADN que comprende una región de inicio de la transcripción funcional en dicha planta, y una secuencia de ADN exógeno unida operablemente a dicha región de inicio de la transcripción, en donde una cadena transcrita de dicha secuencia de ADN es complementaria al ARN mensajero endógeno para quinolato fosforribosil transferasa en dichas células.

39.- Un método para obtener una célula vegetal transgénica que tenga expresión incrementada de quinolato fosforribosil transferasa (QPRTasa), dicho método comprendiendo: proveer una célula vegetal de un tipo que se sabe expresa quinolato fosforribosil transferasa; proveer una construcción de ADN exógeno, cuya construcción comprenda, en dirección 5' a 3', un promotor operable en una célula vegetal, y una secuencia de ADN que codifique para quinolato fosforribosil transferasa, dicha secuencia de ADN estando asociada operablemente con dicho promotor; y transformar dicha célula vegetal con dicha construcción de ADN para producir células transformadas, dicha célula vegetal teniendo expresión incrementada de QPRTasa comparativamente con una célula no transformada.

40.- Una planta transgénica de la especie Nicotiana que tiene expresión incrementada de quinolato fosforribosil transfersa (QPRTasa) respecto a una planta control no transformada, dicha planta transgénica comprendiendo células vegetales transgénicas que contienen: una construcción de ADN exógeno que comprende, en dirección 5' a 3', un promotor operable en dicha célula vegetal, y una secuencia de ADN que codifica para quinolato fosforribosil transferasa de plantas, dicho ADN estando asociado operablemente con dicho promotor; dicha planta exhibiendo expresión incrementada de QPRTasa comparativamente con una planta control no transformada.

41.- Una planta transgénica de la especie Nicotiana que tiene expresión incrementada de quinolato fosforribosil transferasa (QPRTasa) respecto a una planta control no transformada, en donde dicha planta transgénica es una progenie de una planta de conformidad con la reivindicación 34.

42.- Un método para incrementar la expresión de un gen para quinolato fosforribosil transferasa en una célula vegetal, dicho método comprendiendo: desarrollar una célula vegetal transformada para que contenga ADN exógeno, en donde dicho ADN exógeno codifica para quinolato fosforribosil transferasa.

43.- El método de conformidad con la reivindicación 42, caracterizado además porque dicha célula vegetal transformada se obtiene mediante un método que comprende: integrar en el genoma de una célula vegetal hospedera una construcción que comprenda, en dirección de la transcripción, un promotor funcional en dicha célula vegetal, una secuencia de ADN que codifique para quinolato fosforribosil transferasa funcional en dicha célula, dicha secuencia de ADN estando asociada operablemente con dicho promotor, y una región de terminación de la transcripción funcional en dicha célula, con lo cual se obtiene una célula vegetal transformada.

44.- Un método para producir una planta de tabaco que tenga niveles incrementados de nicotina en las hojas de dicha planta de tabaco, dicho método comprendiendo: desarrollar una planta de tabaco, o plantas de la progenie de la misma, en donde dicha planta comprende células que contienen una construcción de ADN que comprende una región de inicio de la transcripción funcional en dicha planta, y una secuencia de ADN exógeno unida operablemente a dicha región de inicio de la transcripción, en donde dicha secuencia de ADN codifica para quinolato fosforribosil transferasa funcional en dichas células.