HU225888B1 - Regulation of quinolate phosphoribosyl transferase expression - Google Patents

Regulation of quinolate phosphoribosyl transferase expression Download PDF

Info

Publication number
HU225888B1
HU225888B1 HU0003767A HUP0003767A HU225888B1 HU 225888 B1 HU225888 B1 HU 225888B1 HU 0003767 A HU0003767 A HU 0003767A HU P0003767 A HUP0003767 A HU P0003767A HU 225888 B1 HU225888 B1 HU 225888B1
Authority
HU
Hungary
Prior art keywords
plant
dna
phosphoribosyl transferase
sequence
tobacco
Prior art date
Application number
HU0003767A
Other languages
English (en)
Inventor
Mark A Conkling
Nandini Mendu
Wen Song
Original Assignee
Univ North Carolina State
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=21960004&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=HU225888(B1) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Univ North Carolina State filed Critical Univ North Carolina State
Publication of HUP0003767A2 publication Critical patent/HUP0003767A2/hu
Publication of HUP0003767A3 publication Critical patent/HUP0003767A3/hu
Publication of HU225888B1 publication Critical patent/HU225888B1/hu

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/1048—Glycosyltransferases (2.4)
    • C12N9/1077—Pentosyltransferases (2.4.2)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01H—NEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
    • A01H5/00—Angiosperms, i.e. flowering plants, characterised by their plant parts; Angiosperms characterised otherwise than by their botanic taxonomy
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8242—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits
    • C12N15/8243—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits involving biosynthetic or metabolic pathways, i.e. metabolic engineering, e.g. nicotine, caffeine

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Nutrition Science (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Physiology (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Manufacture Of Tobacco Products (AREA)

Description

A találmány tárgyát képezi az 1. a. sz. szekvenciával vagy a 2. a. sz. aminosavszekvenciájú, növényi kinolátfoszforibozil-transzferáz (QPRT-áz) enzimet kódoló DNS-szekvenciával legalább 65% homológiát mutató és kinolát-foszforibozil-transzferázt kódoló DNS, továbbá a kinolát-foszforibozil-transzferáz DNS-ének genetikai eljárással megváltoztatott nikotinszintű transzgenikus növény előállítására történő alkalmazása, valamint az így előállított növények.
A csökkentett nikotinszintü dohánynövény előállítása nagy jelentőséggel bír a nikotin függőséget kialakító természetére való tekintettel. Ráadásul a nikotint rendkívül alacsony szinten termelő, vagy nikotint nem termelő dohánynövények előnyösek olyan transzgének recipienseként, amelyek kereskedelmi értéket hordozó termékeket, például gyógyszer- vagy kozmetikai készítmények összetevőit, vagy élelmiszer-kiegészítőket expresszálnak. A nikotin dohányból történő eltávolítására különböző eljárásokat dolgoztak ki. A legtöbb eljárás azonban a nikotin mellett (2) más alkotórészeket is eltávolít a dohányból, a dohánynövényt kedvezőtlenül megváltoztatva. A hagyományos termesztési eljárások a vad típusú dohánynövényekhez viszonyítva alacsonyabb (kb. 8%-os) nikotinszintű dohánynövényeket eredményeznek. Továbbra is szükség van még alacsonyabb nikotintartalmú dohánynövényekre és dohányra.
Egy biológiai termék szintje csökkentésének egyik megközelítési módja a termék keletkezéséhez vezető bioszintetikus folyamathoz szükséges enzim mennyiségének csökkentése. Olyan esetben, ahol a módosítani kívánt enzim (a bioszintézis folyamatához szükséges más enzimhez viszonyítva) sebességmeghatározó mennyiségben van jelen, az enzim mennyiségének bármilyen mértékű csökkentése a keletkező végtermék mennyiségének csökkenéséhez vezet. Ha az enzim mennyisége természetes körülmények között nem sebességmeghatározó, mennyiségét a sejtben sebességmeghatározó mennyiségre kell csökkenteni ahhoz, hogy a folyamat termelését csökkentsük. Ezzel szemben akkor, amikor természetes körülmények között az enzim mennyisége sebességmeghatározó, az enzimaktivitás bármilyen mértékű növekedése a bioszintetikus folyamat végtermékének mennyiségi növekedéséhez vezet.
A nikotin eredetileg a dohánynövény gyökereiben termelődik, majd a levelekbe transzportálódik, ahol raktározódik [Tso, Physiology and Biochemistry of Plants, 233-234 szerk.: Dowden, kiad.: Hutchinson & Ross, Stroudsburg, PA (1972)]. A nikotin bioszintézisének alapvető fontosságú lépése a nikotinsav keletkezése kinolinsavból, amely lépést a kinolin-foszforibozil-transzferáz („QPRT-áz”) enzim katalizál. Valószínű, hogy a QPRT-áz a sebességmeghatározó enzim abban a folyamatban, amely a dohánynövényben a nikotinszintézishez a nikotinsavat szolgáltatja [lásd még Feth és munkatársai, „Regulation in Tobacco Callus of Enzyme Activities of the Nicotine Pathway, Planta 168: 402-407 (1986); Wagner és munkatársai, „The Regulation of Enzyme Activities of the Nicotine Pathway in Tobacco”, Physiol. Plánt. 68: 667-672 (1986)]. Nakati és Malik amerikai egyesült államokbeli 5.369.023-as és 5.260.205-ös számú szabadalmi iratának tárgyát képezi a dohánynövény nikotinszintjének a putreszcin-metiltranszferáz (PMT-áz) antiszensz szabályozással történő módosítása. Wahad és Malik WO 94/28142-es számú nemzetközi bejelentésének tárgya a PMT-t kódoló DNS és a „szensz” és „antiszensz” PMT-konstrukciók alkalmazása.
Az alábbiakban röviden összefoglaljuk a találmány lényegét.
A találmány tárgyát képezi elsősorban egy 1. azonosító számú szekvenciát (röviden: 1. a. sz. sz.) tartalmazó izolált DNS-molekula; a 2. a. sz. szekvenciájú enzimet kódoló DNS-szekvenciák; az ilyen DNS-sel hibridizáló DNS-szekvenciák, amelyek egy kinolátfoszforibozil-transzferáz enzimet kódolnak; ezenkívül olyan DNS-szekvenciák, amelyek a fent említett DNSmolekuláktól a genetikai kód degenerált volta miatt különböznek. Az ilyen DNS által kódolt peptid is a találmány tárgyát képezi.
A találmány tárgyát képezi továbbá egy olyan DNSkonstrukció, amely tartalmaz egy növényi sejtben működőképes promotert, valamint a promotertől 3'-irányban („downstream”) elhelyezkedő, annak szabályozóhatása alá helyezett, kinolát-foszforibozil-transzferázt kódoló DNS-szegmenst. Az enzimet kódoló DNS irányítottsága lehet „szensz vagy „antiszensz”.
A találmány tárgyát képezi továbbá csökkentett kinolát-foszforibozil-transzferáz (QRTP-áz)-expressziót mutató transzgenikus növényi sejt előállítására szolgáló eljárás, amely során biztosítunk egy olyan típusú növényi sejtet, amely expresszálja a kinolát-foszforiboziltranszferázt; a növényi sejtet transzformáljuk egy olyan exogén DNS-konstrukcióval, amely egy promotert és egy kinolát-foszforibozil-transzferáz mRNS-ét kódoló szekvencia egy részét tartalmazó DNS-t tartalmaz.
A találmány tárgyát képezi továbbá egy transzgenikus Nicotiana növény, amely a kinolát-foszforiboziltranszferázt (QRTP-ázt) a nem transzformált kontrolinövényhez viszonyítva csökkentett mértékben expresszálja. Az ilyen növény sejtjei tartalmaznak egy DNS-konstrukciót, amely egy növényi kinolát-foszforibozil-transzferáz mRNS-ét kódoló DNS-szegmenst foglal magában.
A találmány tárgyát képezi továbbá eljárás egy növényi sejt kinolát-foszforibozil-transzferáz-gén-expressziójának csökkentésére, amely során szaporítunk egy növényi sejtet, amelyet olyan módon transzformáltunk, hogy az tartalmazzon olyan exogén DNS-konstrukciót, amelynek átíródó lánca a sejt endogén kinolátfoszforibozil-transzferáz mRNS-ével komplementer. A komplementer lánc átíródása csökkenti az endogén kinolát-foszforibozil-gén expressziójának mértékét.
A találmány tárgyát képezi továbbá eljárás a leveleiben csökkentett nikotinszinttel rendelkező dohánynövény előállítására, amely során olyan dohánynövényt termesztünk, amelynek sejtjei tartalmaznak exogén DNS-szekvenciát, amely exogén DNS-szekvencia átíródó lánca a sejt endogén kinolát-foszforiboziltranszferáz mRNS-ével komplementer.
HU 225 888 Β1
A találmány tárgyát képezi továbbá eljárás megnövelt kinolát-foszforibozil-transzferáz (QRTP-áz)-expresszióval jellemezhető transzgenikus növényi sejt előállítására, amely során egy kinolát-foszforibozil-transzferázt expresszáló növényi sejtet egy exogén, a kinolátfoszforibozil-transzferázt kódoló DNS-szekvenciát tartalmazó DNS-konstrukcióval transzformálunk.
A találmány tárgyát képezi továbbá egy, kinolátfoszforibozil-transzferáz (QRTP-áz) megnövelt expressziójával jellemezhető transzgenikus Nicotiana növény, ahol a transzgenikus növény sejtjei egy exogén, növényi kinolát-foszforibozil-transzferázt (QRTP-ázt) kódoló DNS-szekvenciát tartalmaznak.
A találmány tárgyát képezi továbbá eljárás egy kinolát-foszforibozil-transzferáz-gén expressziójának növényi sejtben történő felerősítésére, amely során szaporítunk egy növényi sejtet, amelyet olyan módon transzformáltunk, hogy az tartalmazzon egy kinolátfoszforibozil-transzferázt kódoló exogén DNS-t.
A találmány tárgyát képezi továbbá eljárás a leveleiben megnövelt nikotinszinttel rendelkező dohánynövény előállítására, amely során termesztünk egy olyan dohánynövényt, amelynek sejtjei a sejtekben működőképes kinolát-foszforibozil-transzferázt kódoló exogén DNS-szekvenciát tartalmaznak.
Az alábbiakban röviden ismertetjük a leíráshoz tartozó ábrákat.
Az 1. ábra a nikotin keletkezéséhez vezető bioszintézis folyamatát mutatja be. A Nic1 és a Nic2 által szabályozott enzimaktivitások: a QPRT-áz (kinolát-foszforibozil-transzferáz) és a PMT-áz (putreszcin-metiltranszferáz).
A 2A. ábra az NTQPT1 cDNS nukleinsavszekvenciáját mutatja be (1. a. sz. sz.) a kódolószekvenciával (3. a. sz. sz.), amelyet nagybetűkkel jelöltünk.
A 2B. ábrán az NTQPT1 cDNS által kódolt dohányQPRT-áz származtatott aminosavszekvenciáját tüntettük fel.
A 3. ábra az NTQPT1 származtatott szekvenciáját és a Rhodospiríllum rubrum, a Mycobacteríum lepre, a Salmonella Typhimurium, az Escherichia coli, a humán és a Salmonella cerevisiae NTQPT1 származtatott szekvenciájával rokon szekvenciáit mutatja be.
A 4. ábra a kinolát-foszforibozil-transzferáz (enzimben) hiányos Escherichia coli (TH265) NTQPT1 cDNS-sel történő komplementálását mutatja be. A sejteket NTQPT1-et hordozó expressziós vektorral transzformáltuk; az NTQPT1-ei expresszáló transzformált TH265 sejtek nikotinsavmentes, „minimár-tápközegben történő szaporodása bizonyítja, hogy az NTQPT1 a QPRT-ázt kódolja.
Az 5. ábra a Nic1 és a Nic2 dohánymutánsok nikotinszintjeit és viszonylagos állandósult állapotú („steady State) NTQPT1 mRNSszintjeit hasonlítja össze: vad típusú Burley 21 (Nic1/Nic1 Nic2/Nic2); Nic1~ Burley 21 (nic1/nic1 Nic2/Nic2); Nic2~ Burley 21 (Nic1/Nic1 nic2/nic2) és Nic1~ Nic2~ Burley 21 (nic1/nic1 nic2/nic2). A folytonos vonallal az mRNS-átiratok szintjét, a szaggatott vonallal a nikotinszintet jelöltük.
A 6. ábra a tetejezett dohánynövény nem tetejezett kontrolldohánynövényhez viszonyított NTQPT1 mRNS-szintjeit mutatja az idő függvényében. A folytonos vonallal az mRNS-átiratok szintjeit, a szaggatott vonallal a nikotinszinteket jelöltük.
Az alábbiakban a találmányt részletesen ismertetjük.
A nikotin a dohánynövényekben a nikotinsav és a 4-metil-amino-butanál kondenzációjával jön létre. A nikotin keletkezéséhez vezető bioszintézis folyamatát az 1. ábra mutatja be. Két szabályozólokusz (a Nic1 és a Nic2) működik a nikotintermelés két kodomináns szabályozójaként. Egyszeres és kétszeres N/'c-mutáns gyökerek enzimjeinek vizsgálata azt mutatta, hogy két enzim, a kinolát-foszforibozil-transzferáz (QPRT-áz) és a putreszcin-metil-transzferáz (PMT-áz) aktivitása egyenesen arányos a nikotinbioszintézis szintjével. A dohány különböző nikotinszintézis-kapacitással rendelkező szövetei (a gyökér és a kallusz) enzimaktivitásának összehasonlítása azt mutatja, hogy a QPRT-áz aktivitása szigorúan összefügg a nikotintartalommal [Wagner és Wagner, Planta 165: 532 (1985)]. Saunders és Bush [Saunders és Bush, Plánt. Physiol. 64: 236 (1979)] kimutatta, hogy az alacsony nikotinszintű mutánsok gyökereinek QPRT-áz-szintje a levelek nikotinszintjével arányos. A találmány tárgyát képezi egy új cDNS-szekvencia (1. a. sz. sz.), amely egy, a 2. a. sz. szekvenciájával rendelkező növényi kinolát-foszforibozil-transzferázt (QPRT-ázt) kódol. Mivel a QPRT-áz-aktivitás szigorúan összefügg a nikotintartalommal, a gyökereiben (a vad típusú növény szintjeihez viszonyítva) csökkentett QPRT-áz-szinttel rendelkező transzgenikus dohánynövény létrehozása a leveleiben csökkentett nikotinszintű növényt eredményez. A találmány tárgyát képezik az ilyen transzgenikus növények előállítására szolgáló eljárások és nukleinsavkonstrukciók, valamint az ilyen transzgenikus növények. Ezek az eljárások magukban foglalják az antiszensz NfQPTí-RNS expresszióját, amely csökkenti a QPRT-áz mennyiségét a dohány gyökereiben. A nikotint ráadásul kimutatták a dohánytól eltérő fajokba és családokba tartozó növényekben, azonban mennyisége az N. tabacumhoz viszonyítva sokkal alacsonyabb.
A találmány tárgyát képezi továbbá a QPRT-ázt vagy a QPRT-áz antiszensz RNS-ét kódoló rekombináns „szensz” vagy „antiszensz DNS-molekulák, és e rekombináns DNS-molekulákat tartalmazó vektorok, valamint e DNS-molekulákkal és vektorokkal transzformáit transzgenikus növényi sejtek és növények. A találmány tárgyát képező transzgenikus dohánysejtek és növények a nem transzformált kontrolldohánysejtekhez
HU 225 888 Β1 és -dohánynövényekhez viszonyítva alacsonyabb vagy magasabb nikotintartalommal jellemezhetőek.
A szélsőségesen alacsony szintű nikotintermeléssel jellemezhető, vagy nikotint nem termelő dohánynövények előnyösek a kereskedelmi szempontból értékes termékeket, mint például gyógyhatású anyagokat, kozmetikumok összetevőit vagy élelmiszer-adalékokat expresszáló transzgének recipienseiként. A dohány előnyös recipiensnövény egy kívánt terméket kódoló transzgén számára, mivel a dohány könnyűszerrel módosítható genetikailag, és adott területen igen nagy mennyiségű biomasszát állít elő; ezzel összhangban a nikotintermelésre csökkentett forrásokat igénylő dohánynövények a transzgén termék előállítására több erőforrást biztosítanak. A dohánynövénynek a kívánt termék előállítására alkalmas transzgénnel történő transzformálására alkalmas eljárások a szakirodalomban jói ismertek; a találmány szerinti alacsony nikotinszintű dohánynövény esetében bármely megfelelő módszer alkalmazható.
A találmány szerinti csökkentett QPRT-áz-expresszióval és csökkentett nikotinszinttel jellemezhető dohánynövényekre csökkentett nikotintartalmú dohánytermékek előállításánál van igény és szükség. A találmány szerinti dohánynövények alkalmasak bármely hagyományos dohánytermékben történő alkalmazásra, többek között, de nem kizárólagosan pipa-, szivar- vagy cigarettadohányban, rágódohányban; leveles, darabolt vagy vágott dohány formájában.
A találmány szerinti konstrukciók alkalmasak lehetnek megnövelt QPRT-áz-expresszióval és nikotintartalommal jellemezhető transzgenikus növények előállítására. Az ilyen konstrukciók, az ilyen konstrukciókat alkalmazó eljárások és az így előállított növények előnyösek lehetnek a megváltoztatott nikotintartalmú dohánytermékek előállítására, vagy a rovarirtó hatása miatt megnövelt nikotintartalmú növények előállítására.
Arra a felismerésre jutottunk, hogy a TobRD2-gén [lásd Conkling és munkatársai, Plánt. Phys. 93: 1203 (1990)] egy Nicotiana tabacum QPRT-ázt kódol, és itt megadjuk az NtQPtl (régebbi neve: TobRD2) cDNSszekvenciáját és az általa kódolt enzim szekvenciáját. Az NtQPtl aminosavszekvenciáját a GenBank adatbázissal összevetve korlátozott szekvenciahasonlóságot mutattunk ki kinolát-foszforibozil-transzferázt (QPRTázt) kódoló bakteriális fehérjékkel (3. ábra).
A kinolát-foszforibozil-transzferáz prokarióta és eukarióta szervezetekben egyaránt szükséges a nikotinadenin-dinukleotid (NAD) de novo szintéziséhez. A dohányban a QPRT-áz magas szintjét mutatták ki a gyökerekben, de a levelekben nem. Az Escherichia coli baktérium kinolát-foszforibozil-transzferázában hiányos (nadC~) törzsét (TH265) alkalmaztuk annak bizonyítására, hogy az NtQPtl QPRT-ázt kódol. Ez a mutáns nem képes növekedni nikotinsavmentes minimáltápközegben. Az NTQPT1-fehérje expressziója ebben a baktériumtörzsben azonban biztosította a NADC+ fenotípust a baktérium számára (4. ábra), ez megerősítette azt, hogy az NtQPtl QPRT-ázt kódol.
Tanulmányoztuk a Nic1 és a Nic2 mutációk hatását a dohányban, és a „tetejezés” („topping) hatását az NtQPtl állandósult mRNS-szintjére. (Az apikális dominancia v. csúcshajtás metszéssel történő eltávolítása a virágzás kezdetekor közismert módon a nikotinbioszintézis és transzport szintjének növekedését eredményezi, és általánosan alkalmazott eljárás a dohánytermesztésben.) Ha az NtQPtl valóban szerepet játszik a nikotin bioszintézisében, azt várjuk, hogy 1. az NtQPtl mRNS-szintje a Nic1/Nic2 kettős mutánsban alacsonyabb lesz, és 2. az NtQPtl mRNS-szintje a tetejezés után növekedni fog. Az NtQPtl mRNS-szintje a Nic1/Nic2 kettős mutánsban a vad típushoz viszonyítva körülbelül 25% volt (5. ábra). Ráadásul a tetejezés után hat órán belül a dohánynövényben az NtQPtl mRNS-szintje körülbelül nyolcszorosára emelkedett, így az NtQPtl-ről bebizonyítottuk, hogy meghatározó fontosságú szabályozógén a nikotin bioszintézisének folyamatában.
Transzgenikus növényi sejtek és növények A növényi sejtek génexpressziójának szabályozása megvalósítható úgy, hogy heterológ DNS-t helyezünk a gazdában működőképes promoter transzkripcionális szabályozóhatása alá, és a heterológ DNS átíródó lánca a szabályozni kívánt endogén gén átíródó láncával komplementer. A bejuttatott DNS, amelyet antiszensz DNS-nek nevezünk, olyan RNS-szekvenciát biztosít, amely komplementer a természetes körülmények között keletkező (endogén) mRNS-sel, és amely az endogén mRNS expresszióját gátolja. A génexpresszió ilyen, antiszensz szabályozásának mechanizmusa nem teljesen ismert. Noha nem kívánjuk elkötelezni magunkat egyik elmélet mellett sem, megjegyezzük, hogy az antiszensz szabályozás egyik elmélete feltételezi, hogy az antiszensz DNS átíródásakor olyan RNSmolekula keletkezik, amely az endogén mRNS-molekulához kötődik, és megakadályozza vagy gátolja annak átíródását.
A találmány szerinti eljárásokban az antiszensz termék komplementer lehet a természetes körülmények között előforduló, célzott RNS kódoló vagy nem kódoló részével (vagy mindkettővel). Az antiszensz konstrukciót bejuttathatjuk a növényi sejtbe bármely alkalmas eljárással, és beépíthetjük a növény genomjába az antiszensz szekvencia indukálására vagy konstitutív átíródásra alkalmas módon [lásd például a Shewmaker és munkatársai által benyújtott amerikai egyesült államokbeli 5.453.566 számú és 5.107.065 számú szabadalmi iratot (ezek a kitanítás részét képezik)].
Az exogén és a heterológ DNS (vagy RNS) alatt olyan DNS-t (vagy RNS-t) értünk, amelyeket a sejtbe (vagy abba a sejtbe, amelyből az származik) emberi beavatkozás által (művileg) juttattak be. Az ilyen heterológ DNS lehet a transzformált sejtben természetes körülmények között előforduló szekvencia egy kópiája vagy annak fragmensei.
A nem transzformált dohánynövényhez viszonyítva csökkentett QPRT-áz-szintű, és így alacsonyabb nikotintartalmú dohánynövény előállítására a dohánysejtet
HU 225 888 Β1 transzformálhatjuk egy olyan exogén QPRT antiszensz transzkripcionális egységgel, amely tartalmaz egy részleges QPRT-áz-cDNS-szekvenciát, egy teljes hosszúságú QPRT-áz-cDNS-szekvenciát, egy részleges QPRT kromoszomális szekvenciát vagy egy teljes hosszúságú QPRT kromoszomális szekvenciát antiszensz orientációban a megfelelő szabályozószekvenciák szabályozóhatása alá helyezve. Megfelelő szabályozószekvencia többek között egy olyan transzkripciós iniciációs szekvencia („promoter”), amely működőképes a transzformálni kívánt növényi sejtben, és egy poliadenilációs/transzkripcionális terminációs szekvencia. Az általánosan alkalmazott, standardmódszerekkel, mint például a restrikciós térképezés, Southernblot-hibridizáció és a nukleotidszekvencia-analízis alkalmazásával a szabályozórégió hatása alá helyezett QPRT-áz-szekvenciát antiszensz orientációban tartalmazó kiónokat azonosíthatjuk. A sikeresen transzformált sejtekből ezután a dohánynövényeket regenerálhatjuk. A legelőnyösebb esetben az alkalmazott antiszensz szekvencia az endogén szekvenciával komplementer, azonban az exogén és az endogén szekvenciák között kisebb eltérések megengedhetőek. Előnyösen az antiszensz DNS-szekvencia szekvenciahasonlósága olyan mértékű, hogy a szabályozni kívánt sejtben az endogén szekvenciához kapcsolódhasson az alábbiakban ismertetett, szigorú („stringent”) körülmények között.
Az antiszensz technológiát néhány laboratóriumban alkalmazzák olyan transzgenikus növények előállítására, amelyek specifikus enzimekből a természetes körülmények között előfordulónál kevesebbet tartalmaznak. Például a kalkon-szintáz (a virágpigment bioszintézisében szerepet játszó enzimjében) csökkentett szintjével rendelkező növényeket állítottak elő a kalkon-szintáz antiszensz génjének a dohány és a petúnia genomjába történő bejuttatásával. Ezeken a transzgenikus dohányés petúnianövényeken a természetes színezettségnél világosabb virágok nyíltak [Van dér Kral és munkatársai, „An Anti-Sense Chalcone Synthase Gene in Transgenic Plants Inhibits Flower Pigmentation”, Natúré 333: 866-869 (1988)]. Az antiszensz RNS-technológiát szintén sikeresen alkalmazták a poligalakturonáz enzim paradicsomban történő termelődésének gátlására [Smith és munkatársai, „Antisense RNA inhibition of Poligalacturonase Gene Expression in Transgenic Tomatoes” Natúré 334: 724-726 (1988); Sheehy és munkatársai, „Reduction of Polygalacturonase Activity in Tomato Fruit by Antisense RNA”, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85.8805-8809 (1988)] és a ribulóz-biszfoszfát-karboxiláz kis alegységének gátlására dohányban [Rodermel és munkatársai, „Nuclear-Organelle Interactions: Nuclear Antisense Gene Inhibits Ribulose Bisphosphate Carboxylase Enzyme Levels in Transformed Tobacco Plants”, Cell 55: 673-681 (1988)]. Ennek alternatívájaként a természetes körülmények között előfordulónál nagyobb mennyiségű, adott enzimmel jellemezhető transzgenikus növényeket állíthatunk elő, ha a növényt az enzim szensz (azaz természetes) orientációjú génjével transzformáljuk. A találmány szerinti transzgenikus dohánynövények nikotinszintjét az általánosan alkalmazott, standard nikotinkimutatási eljárásokkal kimutathatjuk. A nem transzformált kontrollnövényekhez viszonyítva csökkentett QPRT-áz-szintű transzformált növények nikotinszintje ennek megfelelően a kontrolihoz viszonyítva alacsonyabb lesz; a nem transzformált kontrollnövényekhez viszonyítva megnövelt QPRT-áz-szintű transzformáit növények nikotinszintje ennek megfelelően a kontrolihoz viszonyítva magasabb lesz.
A találmány szerinti antiszensz eljárásokban alkalmazott heterológ szekvencia lehet olyan, amely esetében a teljes QPRT-áz mRNS-szekvenciájával, vagy olyan, amely esetében annak egy részével komplementer RNS-termék keletkezik. A szekvencia lehet komplementer a természetes mRNS-t határoló bármely szekvenciával, azaz lehet komplementer az endogén mRNS-sel közvetlenül szomszédos 5’-terminális vagy „sapka-régióval („capping”), a „sapka-régiótól a 3'-irányban („downstream) elhelyezkedő szekvenciával, a „sapka”-régió és az iniciációs kodon közötti szekvenciával, lefedheti az egész kódolórégiót vagy annak egy részét, áthidalhatja a kódoló- és a nem kódoló régiót, lehet komplementer a kódolórégió teljes egészével vagy annak egy részével, a kódolórégió 3’-végével vagy az mRNS nem transzlálódó 3’-régiójával. Az alkalmazható antiszensz szekvenciák hossza lehet legalább körülbelül 13-15 nukleotid, legalább körülbelül 16-21 nukleotid, legalább kb. 20 nukleotid, legalább kb. 30 nukleotid, legalább kb. 50 nukleotid, legalább kb. 75 nukleotid, legalább kb. 100 nukleotid, legalább kb. 125 nukleotid, legalább kb. 150 nukleotid, legalább kb. 200 nukleotid vagy ennél is több nukleotid. Ráadásul e szekvenciákat a 3’- vagy az 5’-végeken rövidíthetjük vagy meghosszabbíthatjuk.
A közelebbi antiszensz szekvencia és az antiszensz szekvencia hosszúsága függ a kívánt gátlás mértékétől, az antiszensz szekvencia stabilitásától és ehhez hasonlóktól. A szakember számára a megfelelő QPRT-áz-szekvencia kiválasztása a szakirodalomban megtalálható technikák és az itt megadott információk alapján megoldható feladat. A 2. ábrára és az 1. a. sz. szekvenciára hivatkozva a találmány szerinti oligonukleotid lehet a QPRT-áz cDNS-szekvenciája egy folyamatos, bármilyen hosszúságú fragmense antiszensz orientációban, amely elegendő a recipiens növényi sejt transzformálásakor a kívánt hatás eléréséhez.
A találmány szerinti megoldásokat alkalmazhatjuk a nikotintermelés „szensz” koszuppresszlójára szolgáló eljárásokban. A találmány szerinti eljárások megvalósításában alkalmazott „szensz DNS-ek elegendően hosszúak ahhoz, hogy növényi sejtben expresszálva elnyomják az ismertetett módon az adott növényi sejt növényi QPRT-áz fehérjéjének expresszióját. Az ilyen szensz DNS-ek alapvetően lehetnek a QPRT-ázt kódoló teljes genomi vagy komplementer DNS-ek, vagy ezek fragmense; az ilyen fragmensek jellemző módon legalább 15 nukleotid hosszúságúak. A sejtben a natív gén expresszióját eredményező „szensz” DNS hosszúságának megállapítására szolgáló eljárások a szakember számára hozzáférhetőek.
HU 225 888 Β1
A találmány megvalósításának egy alternatív módja szerint Nicotiana növényi sejteket egy olyan enzimatikus RNS-molekulát (azaz „ribozimot) kódoló DNSszegmenst tartalmazó DNS-konstrukcióval transzformálunk, amely enzimatikus RNS-molekula a növényi QPRT-ázt kódoló DNS mRNS-átirata ellen irányul (azaz hasítja azt), az alább ismertetett módon. A ribozimok tartalmaznak szubsztrátkötő doméneket, amelyek a célzott mRNS hozzáférhető régióihoz kötődnek, és olyan doméneket, amelyek az RNS hasítását katalizálják, így gátolva a transzlációt és a fehérjetermelést. A kötődőmének a célzott mRNS-sel komplementer antiszensz szekvenciákat tartalmazhatnak; a katalitikus szerkezet lehet „kalapácsfej” („hammerhead”) motívum vagy más, például hajtű („hairpin) motívum. A ribozim hasítóhelyeit a célzott RNS-ben kezdetben azonosíthatjuk a célmolekulának a ribozim-hasítóhely (azaz GUA-, GUU- vagy GUC-szekvenciák) keresésével történő átvizsgálásával („scanning”). Azonosítás után a gén hasítóhelyét tartalmazó régiónak megfelelő, 15, 20, 30 vagy több ribonukleotidot tartalmazó, rövid, a jósolt szerkezeti sajátosságoknak megfelelő RNS-szekvenciákat fejleszthetünk ki. A feltételezett célmolekulák alkalmasságát elbírálhatjuk úgy is, hogy meghatározzuk hozzáférhetőségüket komplementer oligonukleotidokkal történő hibridizáció esetében, ribonukleázvédelmi vizsgálati eljárásokkal („ribonuclease protection assay), amelyek leírása a szakirodalomban megtalálható. Az enzimatikus RNS-molekulákat kódoló DNS-t ismert eljárásokkal állíthatjuk elő [lásd például a T. Cech és munkatársai által benyújtott amerikai egyesült államokbeli 4.987.071 számú szabadalmi iratot; a Keene és munkatársai által benyújtott amerikai egyesült államokbeli 5.559.021 számú szabadalmi iratot; a Donson és munkatársai által benyújtott amerikai egyesült államokbeli 5.589.367 számú szabadalmi iratot; a Torrence és munkatársai által benyújtott amerikai egyesült államokbeli 5.583.032 számú szabadalmi iratot; a Joyce által benyújtott amerikai egyesült államokbeli 5.580.967 számú szabadalmi iratot; a Gold és munkatársai által benyújtott amerikai egyesült államokbeli 5.595.877 számú szabadalmi iratot; a Wagner és munkatársai által benyújtott amerikai egyesült államokbeli 5.591.601 számú szabadalmi iratot és az amerikai egyesült államokbeli 5.622.854 számú szabadalmi iratot] (ezek a hivatkozások a kitanítás részét képezik; ezekre úgy hivatkozunk, mintha minden hivatkozásnál külön-külön jeleztük volna, hogy a kitanítás részét képezik). Az ilyen enzimatikus RNS-molekulák növényi sejtben történő előállítása és a QPRT-áz fehérje termelésének gátlása a QPRT-áz-aktivitást a növényi sejtben alapvetően ugyanolyan módon csökkenti, mint az antiszensz RNS-molekula előállítása: az enzim létrehozásában szerepet játszó mRNS transzlációjának a sejtben történő megakadályozásával. A „ribozim” kifejezéssel enzimként működő, RNS-tartalmú nukleinsavat (például egy endoribonukleázt) jelölünk, és az „enzimatikus RNS-molekula” kifejezéssel azonos értelemben alkalmazzuk. A találmány tárgyát képezi továbbá a ribozimokat kódoló DNS, expressziós vektorba illesztett, ribozimokat kódoló DNS, az ilyen vektorokat tartalmazó gazdasejtek és a QPRT-áz termelésének ribozimok alkalmazásával, növényekben történő csökkentésére szolgáló eljárások.
A találmány szerinti eljárás megvalósítására alkalmas nukleinsavszekvenciák többek között azok, amelyek az 1. a. sz. szekvenciával szekvenciahasonlóságot mutatnak, és kinolát-foszforibozil-transzferáz-aktivitással rendelkező fehérjét kódolnak. Ez a definíció magában foglalja a QPRT-áz fehérjék természetben előforduló allélváltozatait is. (gy az 1. a. sz. szekvenciával hibridizáló és QPRT-ázt, különösen növényi QPRT-ázt expresszáltatás céljából alkalmas módon kódoló DNSszekvenciák szintén alkalmazhatóak a találmány megvalósításában.
A dohány QPRT-enzimjének több formája létezhet. Egy enzim létezhet többféle formában egyetlen géntermék poszttranszlációs módosítása vagy az NtQPTI gén különböző formái miatt.
Az olyan körülmények, amelyek között lehetséges egy QPRT-áz-aktivitással rendelkező fehérjét kódoló másik DNS-szekvencia és az 1. a. sz. szekvencia közötti, vagy a 2. a. sz. szekvencia által megadott fehérjét kódoló más DNS-szekvenciák közötti hibridizáció, szokásos, rutinszerűen alkalmazott eljárásokkal meghatározhatóak. Például az ilyen szekvenciák hibridizációját megvalósíthatjuk mérsékelten szigorú („stringent”) vagy akár szigorú körülmények között (azaz olyan körülmények között, melyekre a következő mosási körülmények jellemzőek: 0,3 M NaCI, 0,03 M nátrium-citrát, 0,1% SDS 60 °C-on vagy 70 °C-on a 2. a. sz. szekvencia által megadott fehérjét kódoló DNS-re vonatkozóan, a standard in situ hibridizációs vizsgálati eljárásban) [lásd J. Sambrook és munkatársai Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2. kiadás, kiad.: Cold Spring Harbor Laboratory (1989)]. Általában az ilyen szekvenciák legalább 65%-ban, 70%-ban, 75%-ban, 80%-ban, 85%-ban, 90%-ban vagy akár 95%-ban, vagy még nagyobb mértékű hasonlóságot mutatnak az
1. a. sz. szekvenciával megadott szekvenciákkal, vagy a 2. a. sz. szekvencia által megadott fehérjét kódoló DNS-szekvenciákkal. (A szekvenciahasonlóság meghatározása úgy történik, hogy a két szekvenciát a maximális egyezés eléréséhez egymás mellé rendezzük; rések beillesztése a két, egymáshoz rendezett szekvencia egyikében vagy mindkettőben megengedhető a maximális egyezés eléréséhez. Előnyösek a 10-es hosszúságú vagy annál rövidebb rések; 5-ös hosszúságú rések előnyösebbek és a 2-es hosszúságú rések még előnyösebbek.)
Rendelkezésre állnak olyan, differenciális hibridizációs eljárások, amelyek lehetővé teszik mindössze 0,05% poli(A+)RNS-nek megfelelő mRNS-szintű cDNS-klónok izolálását [lásd Conkling és munkatársai, Plánt. Physiol. 93:1203-1211 (1990)]. Röviden: cDNSkönyvtárakat szűrünk („screening”) a növényi szövetből (például gyökérből és/vagy levelekből) származó mRNS reverz transzkripciójával előállított, egyes szálú cDNS-próbákkal. Differenciális szűréshez egy nitrocellulóz- vagy nejlon-alapanyagú membránt 5*SSC
HU 225 888 Β1 (-pufferben) áztatunk, majd 96 csatornás vákuumszűrőre helyezzük, és 150 μΙ-es stacionárius, egyéjszakás tenyészetet helyezünk a másolatlemezről („masterplate”) mindegyik lyukba; vákuum alatt tartjuk mindaddig, amíg minden folyadék át nem halad a membránon. 150 μΙ denaturálóoldatot (0,5 M NaOH, 1,5 M NaCI) teszünk minden lyukba sokcsatornás pipettával, és 3 percig állni hagyjuk. Vákuum alá helyezzük, mint a fentiekben ismertettük, a membránt levesszük és 0,5 M Tris-HCI, 1,5 M NaCI (pH 8,0) oldattal semlegesítjük. Ezután 2 órán át szárítjuk (! régen sütötték, de most már nem, az elnevezés azonban megmaradt! 14. old) in vacuo, és a megfelelő próbákkal inkubáljuk. Nejlon membránszűrők alkalmazásával és a másolatlemez megőrzése mellett, -70 °C-on 7% DMSO-ban tárolva a membránok többször vizsgálhatók („szkrínelhetők”), több mintával, és a megfelelő kiónok néhány éves tárolás után visszanyerhetők.
A „gén” kifejezés alatt olyan DNS-szekvenciát értünk, amely tartalmazza 1. az 5’-irányban elhelyezkedő („upstream”), a promotert is magában foglaló szabályozójeleket („szignálokat), 2. a terméket, a fehérjét vagy a gén RNS-ét meghatározó kódolórégiót, 3. a transzkripciós terminációs és a poliadenilációs szignált tartalmazó 3’ („downstream”) régiót és 4. a hatékony és specifikus expresszióhoz szükséges kapcsolt régiókat.
A találmány szerinti DNS-szekvenciák alapvetően állhatnak a megadott szekvenciából (1. a. sz. szekvencia) vagy azzal egyenértékű nukleotidszekvenciákból, amelyek a gén vagy a kódolórégiók alléljait vagy azok polimorf változatait képviselik.
Az „alapvető szekvenciahasonlóság” kifejezés alatt a szabadalmi leírásban és az igénypontok esetén olyan DNS-, RNS- vagy aminosavszekvenciákat értünk, amelyek a feltárt és az oltalmi igénykörbe tartozó adott szekvenciáktól csekély mértékben térnek el, azoknak csak a nem konzervatív régióit érintő változatai, és amelyeket a találmány szerinti szekvenciákkal egyenértékűnek tekintünk. Ebből a szempontból a „csekély mértékű, a nem konzervatív régiókat érintő változat azt jelenti, hogy a „hasonló szekvenciák (azaz a szekvenciák, amelyek a feltárt és az oltalmi körbe tartozó DNS-sel, RNS-sel vagy fehérjével alapvetően hasonlóságot szekvenciák) funkcionálisan egyenértékűek a találmányban feltárt és az oltalmi körbe tartozó szekvenciákkal. A funkcionálisan egyenértékű szekvenciák alapvetően azonosan működnek, alapvetően az itt feltárt és az oltalmi körbe tartozó nukleinsav- és animosawegyületekkel azonos összetételű vegyületeket termelnek.
A találmány szerinti DNS-szekvenciákat sokféle gazdasejtbe bejuttathatjuk. Az alkalmas szaporodási tulajdonságokkal rendelkező és könnyen kezelhető gazdasejtek nagy választékának leírása megtalálható a szakirodalomban.
A szabadalmi leírásban és az igénypontok esetében az „izolált” és az „alapvetően tiszta” kifejezés azt jeleni, hogy az így említett DNS, RNS, polipeptidek vagy fehérjék in vivő celluláris környezetétől mesterségesen, emberi munka befektetésével választottuk el.
A „natív DNS-szekvencia” vagy „természetes DNSszekvencia” kifejezés alatt olyan DNS-szekvenciát értünk, amelynek nem transzgenikus sejtből vagy szövetből történő izolálása lehetséges. Natív DNS-szekvenciáknak nevezzük azokat a DNS-szekvenciákat, amelyeket mesterségesen, például irányított mutagenezissel nem változtattunk meg. A már azonosított, natív DNS-szekvenciákat kémiai eljárással megszintetizálhatjuk vagy a szakirodalomban leírt rekombináns DNS technikákkal előállíthatjuk. A natív növényi DNS-szekvencia alatt olyan DNS-szekvenciákat értünk, amelyek izolálása nem transzgenikus növényi sejtből vagy szövetből lehetséges. Natív dohányeredetű DNS-szekvencia alatt olyan DNS-szekvenciát értünk, amelyek izolálása nem transzgenikus dohánysejtből vagy dohányszövetből lehetséges.
A találmány szerinti DNS-konstrukciók vagy „transzkripciós kazetták” magukban foglalnak többek között a transzkripció irányában (5’-től a 3’-irányban) felsorolva egy itt ismertetésre kerülő promotert, egy itt ismertetésre kerülő, a promoter szabályozóhatása alatt álló DNS-szekvenciát, és tetszés szerint egy „stop” jelzést az RNS-polimeráz számára és egy poliadenilációs jelzést magában foglaló terminációs szekvenciát poliadeniláz számára. A transzformált sejtben vagy szövetben a szabályozórégiók mindegyikének működőképesnek kell lennie. A találmány megvalósításában bármely alkalmas terminációs jelzés alkalmazható, többek között, de nem kizárólag a nopalin-szintáz (nos) terminátora, az oktapin-szintáz (öcs) terminátora, a CaMV-terminátor, vagy a transzkripciós iniciációs régióval azonos génből vagy egy más génből származó terminációs jelzések [lásd például Rezian és munkatársai, mint fent, és Roderman és munkatársai, mint fent].
A „szabályozó hatása alatt álló kifejezést olyan DNS-szekvenciák és egy DNS-molekula esetében alkalmazzuk, amelyek úgy kapcsolódnak egymáshoz, hogy az egyik működése a többiek működését befolyásolja. így egy promoter szabályozóhatása alatt tartja a DNS-t akkor, ha képes a DNS (azaz a promoter transzkripcionális hatása alatt álló DNS) transzkripcióját befolyásolni. A promoter a DNS-től az 5’-irányban („upstream” irányban), a DNS a promotertől 3'-irányban („downstream” irányban) helyezkedik el.
A transzkripciós kazetta lehet olyan DNS-konstrukcióban, amely tartalmaz legalább egy replikációs rendszert. Az egyszerűbb alkalmazás kedvéért általában Escherichia coliban működőképes replikációs rendszert, például a ColE1-et, a pSC101-et, a pACYC184-et és ehhez hasonlóakat alkalmaznak. így minden beavatkozás után a kapott konstrukciókat klónozhatjuk, szekvenálhatjuk, és a beavatkozás sikeressége ellenőrizhető. Ráadásul, vagy az E. coli replikációs rendszere helyett a gazdasejtek széles skálájának replikációs rendszere alkalmazható, mint például a P-1 inkompatibilitási plazmidokon, például a pRK290plazmidon alapuló replikációs rendszer. A replikációs rendszer mellett gyakran ráadásul beillesztenek legalább egy markert, amely egy vagy több gazdában alkalmazható; vagy egy adott gazdában alkalmazható,
HU 225 888 Β1 különböző markereket. így az egyik marker alkalmazható prokarióta gazdában történő szelekcióra, míg egy másik eukarióta gazdában, közelebbről növényi gazdában történő szelekcióra. A marker védelmet nyújthat biocid anyag, például antibiotikum, toxin, nehézfém vagy ehhez hasonlókkal szemben; nyújthat komplementációt auxotróf gazdában prototófia juttatása által; vagy a növényben új vegyület előállításával okozhat látható fenotípusváltozást.
A különböző konstrukciókat, transzkripciós kazettákat, markereket és ehhez hasonlóakat tartalmazó fragmenseket célba juttathatjuk egymást követően egy alkalmas replikációs rendszer restrikciós enzimekkel történő hasításával és az adott konstrukció vagy fragmens megfelelő helyre történő beillesztésével. A ligálást és klónozást követően a DNS-konstrukciót izolálhatjuk a további beavatkozás céljaira. Mindezekre a technikákra a szakirodalomban bőségesen találhatunk példákat [lásd például J. Sambrook és munkatársai Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2. kiadás, kiad.: Cold Spring Harbor Laboratory (1989)].
A találmány szerinti nukleinsavkonstrukciók növényi sejtek transzformálására történő alkalmazására alkalmasak az Agrobacferium-eredetű vektorok és ballisztikus vektorok is, valamint a DNS-közvetített transzformáció céljára megfelelő vektorok is.
A „promoter” kifejezésen olyan DNS-régiót értünk, amely a kódolószekvencia hatékony expressziójához szükséges jelzéseket magában foglalja. Tartalmazhat, többek között, nem kizárólagosan RNS-kötő szekvenciákat és kötőrégiót más szabályozófehérjék számára, olyan régiókkal együtt, amelyek a fehérjetranszláció szabályozásában játszanak szerepet, valamint tartalmazhat kódolószekvenciákat.
A találmány megvalósítása során alkalmazott promoterek lehetnek konstitutív módon aktív promoterek. Sok, a növényekben működőképes konstitutív promoter hozzáférhető. Előnyös például a karfiol mozaikvírusának (CaMV) 35S (- méretű) promotere, amelyet a legtöbb növényi szövet konstitutívan expresszál. Ennek alternatívájaként alkalmazhatunk gyökérspecifikus vagy gyökérkortex-specifikus promotert, amint arra az alábbiakban részletesebb magyarázatot adunk.
Transzgenikus dohánynövényben fejeztek ki antiszensz szekvenciákat a karfiol-mozaikvírus (CaMV) 35S promoterét alkalmazva [lásd például Cornelisse és munkatársai, „Both RNA Level and Translation Efficiency are Reduced by Anti-Sense RNA in Transgenic Tobacco”, Nucl. Acids Rés. 17:833-43 (1989); Rezaian és munkatársai, „Anti-Sense RNA-s of Cucumber Mosaic Vírus in Transgenic Plants Assessed fór Control of the Vírus”, Plánt Molecular Biology 11:463-71 (1988); Rodermel és munkatársai, „Nuclear-Organelle Interactions: Nuclear Antisense Gene inhibits Ribulose Bisphosphate Carboxylase Enzyme Levels in Transformed Tobacco Plants”, Cell 55: 673-81 (1988); Smith és munkatársai, „Antisense RNA Inhibition of Polygalacturonase Gene Expression in Transgenic Tomatoes”, Natúré 334: 724-26 (1988); Van dér Kral és munkatársai, „An Anti-Sense Chalcone Synthase Gene in Transgenic Plants Inhibits Flower Pigmentation”, Natúré 333: 866-69 (1988)].
A QPRT-áz expressziójának a találmány szerinti transzformált dohánysejtekben és dohánynövényekben történő expressziójára előnyös a CaMV 35S promoter alkalmazása. A szakirodalomban a CaMV 35S promoter más rekombináns géneknek dohánygyökérben történő expressziójában történő alkalmazásának kielégítő leírását találjuk [Lám és munkatársai, „SiteSpecific Mutations Altér In Vitro Factor Binding and Change Promoter Expression Pattern in Transgenic Plants”, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 7890-94 (1989); Poulsen és munkatársai, „Dissection of 5' Upstream Sequences fór Selective Expression of the Nicotiana plumbaginifolia rbc-8B Gene”, Mól. Ge. Génét. 214:16-23 (1988)].
Más, csak a gyökérszövetben aktív promoterek (gyökérspecifikus promoterek) szintén különösen alkalmasak a találmány szerinti megoldás megvalósításában [lásd például a Conkling és munkatársai által benyújtott amerikai egyesült államokbeli 5.459.252 számú szabadalmi iratot; valamint lásd Yamamoto és munkatársai, The Plánt Cell 3: 371 (1991)]. A TobRD2 gyökérkéreg-specifikus promoter szintén alkalmazható [lásd például a Conkling és munkatársai által benyújtott, azóta engedélyezett amerikai egyesült államokbeli SN 08/508.786-os számú szabadalmi bejelentést; valamint a PCT WO 9705261-es nemzetközi közzétételi iratot]. Az itt idézett szabadalmi iratok a kitanítás részét képezik.
A találmány szerinti transzformált dohánysejtek és növények előállítására alkalmazott rekombináns QPRT-áz-DNS-molekulák ráadásul tartalmazhatnak egy domináns, szelekcióra alkalmas markergént. A dohányban történő alkalmazáshoz megfelelő domináns, szelekcióra alkalmas markerek, többek között, a neomicin-foszfotranszferázt (NPTII), a higromicin-foszfotranszferázt (HPT) és a kloramfenikol-acetiltranszferázt (CAT) kódoló antibiotikumrezisztencia-gének. Egy másik, közismert, a dohányban alkalmazható domináns, szelekcióra alkalmas marker egy mutáns dihidrofolátreduktáz gén, amely metotrexátrezisztens mutáns dihidrofolát-reduktázt kódol. Alkalmas antibiotikumrezisztencia-gént tartalmazó DNS-vektorok a kereskedelmi forgalomban beszerezhetőek.
A transzformált dohánysejteket a környező, nem transzformált sejtektől úgy választjuk el, hogy a kevert sejtpopulációt a kiválasztott domináns, szelektálható markergénterméke által biztosított rezisztenciának megfelelő antibiotikum (vagy más, természetes körülmények között a dohányra toxikus vegyület) megfelelő koncentrációját tartalmazó tápközegbe helyezzük. így csak a transzformált dohánysejtek maradnak életben és osztódnak.
A találmány szerinti rekombináns növények előállítására szolgáló eljárások első lépése általában egy regenerálódásra képes növényi sejt (ami jellemző módon regenerálódásra képes szövetben helyezkedik el) izolálása. A növényi sejtet ezután transzformáljuk egy DNS-konstrukcióval, amely tartalmazza a találmány
HU 225 888 Β1 szerinti transzkripciós kazettát (amint azt részletesen ismertetjük), és a transzformált sejtből egy rekombináns növényt regenerálunk. Amint azt az alábbiakban részletesen ismertetjük, a transzformációs lépést a szakirodalomban ismertetett módszerekkel valósítjuk meg, amely többek között, de nem kizárólagosan lehet a növényi sejtnek a transzkripciós kazettát hordozó mikrorészecskékkel történő bombázása, a sejtnek a transzkripciós kazettát hordozó Ti-plazmidot tartalmazó Agrobacterium tumefaciensszel való fertőzése vagy bármely más, transzgenikus növény előállítására alkalmas módszer.
A találmány szerinti megoldás megvalósítására alkalmas számos Agrobacterium-veMor ismeretes. Például a 4.459.355 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi irat az arra fogékony, például kétszikű növényeknek a Ti-plazmidot tartalmazó Agrobacteriumtörzzsel történő transzformációját tárja fel. A fás szárú növények Agrobacterium-vektorrat történő transzformációját a 4.795.855 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi irat tárja fel. Azonkívül a Schiperoort és munkatársai által benyújtott 4.940.838 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi irat egy bináris Agrobacterium-vektort tár fel (azaz egy olyan vektort, amelyben az Agrobacterium tartalmaz egy olyan plazmidot, amely hordozza a Ti-plazmid vir régióját, de a T-régiót nem, és egy másik plazmidot, amely hordozza a T-régiót, de a vir régiót nem), amely alkalmas a találmány szerinti megoldás megvalósítására.
A találmány szerinti DNS-konstrukciókat hordozó olyan mikrorészecskék, amelyek alkalmasak egy növényi sejt ballisztikus transzformációjára, szintén alkalmasak a találmány szerinti transzformált növények előállítására. A mikrorészecskét a transzformált növényi sejt előállítása céljából egy növényi sejtbe juttatjuk, és a transzformált növényi sejtből egy növényt regenerálunk. A találmány megvalósítására bármely megfelelő ballisztikus sejttranszformálási eljárás és készülék alkalmazható. Irányadó készülékeket és eljárásokat tár fel a Sanford és Wolf által benyújtott 4.945.050 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi irat és a Christou és munkatársai által benyújtott 5.015.580 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi irat. A ballisztikus transzformációs eljárások alkalmazásakor a transzkripciós kazettát a transzformálni kívánt sejtben replikációra vagy integrációra képes plazmidba építjük be. Az ilyen rendszerekben alkalmazható mikrorészecskék például többek között az 1-5 pm méretű aranygömbök. A DNS-konstrukciót a mikrorészecskén bármely alkalmas eljárással, például csapadékképzéssel helyezhetjük el.
Megtalálható a szakirodalomban az olyan növényfajok leírása, amelyek a találmány szerinti DNS-konstrukciók alkalmazásával, a növényi sejtprotoplaszt DNS-közvetített transzformációjával és a transzformált protoplasztból a növény azt követő regenerálásával történő transzformálásra alkalmasak. A dohányprotoplaszt DNS-tartalmú liposzómákkal történő fúziója vagy az elektroporáció leírása is megtalálható a szakirodalomban [Shillito és munkatársai, „Direct Gene Transfer to Protoplast of Dicotyledonous and Monocoyledonous Plants by a Number of Methods, Including Electroporation”, Methods in Emzymology 153:313-36 (1987)].
A transzformáció alatt azt az eljárást értjük, amelynek során exogén DNS-sel stabilan transzformált transzgenikus sejtek létrehozása céljából exogén DNSsejtekbe juttatunk.
A szakirodalomban megtalálható a leírása annak, hogy a transzformált sejtek esetében az intakt dohánynövénnyé való regenerálódás hogyan indukálható dohánysejtek tenyésztésében és a dohányszövet tenyésztésében alkalmazott módszerek alkalmazásával. A növény regenerálódására szolgáló eljárást úgy választjuk meg, hogy az a transzformációra szolgáló eljárással összeférhető legyen. A QPRT-áz-szekvencia stabil jelenlétét és helyes orientációját a transzgenikus dohánynövényben a QPRT-áz-szekvencia mendeli szabályokat követő öröklődésével igazolhatjuk, bizonyítva azt az ellenőrzött keresztezés! kísérletekből származó utódon alkalmazott általános, standard DNSanalízissel. A transzgenikus dohánynövény transzformáit sejtből történő regenerálódása után a bevitt DNSszekvencia hagyományos növénytermesztési eljárásokkal könnyen átvihető más dohányváltozatokba, a szakembertől el nem várható mértékű kísérleti munka nélkül.
Például a transzgén szegregációjának vizsgálatához a transzformált növényt (Ro) teljes érettségig felnövesztjük, nikotinszintjét megmérjük, és önbeporzással létrehozzuk az R-i-növényeket. A transzgént hordozó Rrnövények egy bizonyos százaléka homozigóta a transzgénre nézve. A homozigóta Rrnövények azonosítása céljából a transzgenikus Rrnövényeket érettségig felnövesztjük és beporozzuk. A homozigóta Ri-növények hozzák létre az R2-utódnemzedéket, ahol minden utódnövény hordozza a transzgént, a heterozigóta R-ι-növények esetében a szegregáció aránya 3:1.
A nikotin természetes rovarirtó szerként szolgál, amely a dohánynövény rovar kártevők elleni védelmét segíti elő. Ezért továbbra is szükség lehet arra, hogy a találmány szerinti eljárással előállított alacsony nikotintartalmú vagy nikotinmentes növényeket ráadásul egy olyan transzgénnel transzformáljuk (mint például a Bacillus thuringiensis), amely a rovarok ellen további védelmet biztosít.
A találmány szerinti eljárások alkalmazásában előnyösek a Nicotiana, vagyis dohány fajai, többek között az N. tabacum, az N. rustica és az N. glutinosa. A dohány bármely fajtája vagy változata alkalmazható. Előnyösek az olyan fajták, amelyek eleve alacsony nikotintartalmúak, mint például a Nic1/Nic2 kettős mutánsok.
Bármely növényi szövet transzformálható a találmány szerinti vektorral, amely azt követő klonális szaporítása organogenezissel vagy akár embriogenezissel lehetséges. Az „organogenezis” kifejezés alatt olyan folyamatot értünk, amely során a merisztémaközpontokból egymás után képződnek hajtások és gyökerek; az „embriogenezis” kifejezés alatt olyan folyamatot értünk, amely során a hajtások és a gyökerek egyszerre, összehangolt módon (nem egymás után) képződnek,
HU 225 888 Β1 függetlenül attól, hogy szomatikus sejtekből vagy gamétákból származnak. A konkrét szövet kiválasztásakor a hozzáférhető szaporítási rendszereket és a transzformálni kívánt konkrét fajokat kell figyelembe venni. Irányadó módon szöveti célpontok lehetnek többek között a levélkorongok, a virágpor (pollen), az embriók, a sziklevelek (kotiledon), a szik alatti (hipokotil) szövet, a kalluszszövet, a létező meritémaszövet (például az apikális merisztémák, a hónaljrügyek és a gyökérmerisztémák) és az indukált merisztémaszövetek (például a sziklevél-merisztéma és a szik alatti merisztéma).
A találmány szerinti növények változatos formát ölthetnek. A növény lehet transzformált sejtek és nem transzformált sejtek kimérája; lehet klonális transzformáns (például minden sejt transzformálva van a transzkripciós kazettával); a növény tartalmazhat transzformált és nem transzformált szöveti oltványokat [például transzformált gyökértörzsre nem transzformált oltóvesszőt („scion) oltunk citrusfélék esetében], A transzformált növényt különböző eljárásokkal szaporíthatjuk, például klonális szaporítással vagy hagyományos szaporítási eljárásokkal. Például a transzformált növények első generációját (T1) szaporíthatjuk önmegporzással a transzformált növények homozigóta második generációjának (T2) előállítása céljából, majd tovább szaporíthatjuk hagyományos szaporítási módszerekkel. Egy domináns szelektálható markert adhatunk a transzkripciós kazettához a szaporítás elősegítésére.
Az előzőek fényében nyilvánvaló, hogy a találmány megvalósításában alkalmazható növények többek között azok, amelyek Nicotiana nemzetségbe tartoznak.
A fent ismertetett rekombináns DNS eljárásokat ismerő szakember felismeri, hogy transzgenikus dohánysejt és dohánynövény előállítására alkalmazhatunk teljes hosszúságú QPRT-áz-cDNS-molekulát vagy teljes hosszúságú QPRT-áz kromoszomális gént, szensz orientációban kapcsolva megfelelő szabályozószekvenciákhoz és azok szabályozóhatása alá helyezve. (A szakember felismeri azt is, hogy a szensz orientációjú gének expressziójára alkalmas megfelelő szabályozószekvenciák magukban foglalhatják bármely, ismert eukarióta transzlációs startszekvenciát, a fent ismertetett promoter és poliadenilációs/transzkripciós terminációs szekvenciákon kívül.) Az ilyen transzformált dohánynövények megnövekedett QPRT-áz-szinttel, és így a nem transzformált dohánynövényhez viszonyítva magasabb nikotintartalommal jellemezhetőek.
így magától értetődik, hogy a találmány oltalmi körébe tartozik a QPRT-áz-DNS-szekvenciák alkalmazása a QPRT-áz enzim szintjének növelésére vagy csökkentésére, ezáltal a dohánynövény nikotintartalmának csökkentése vagy növelése céljából.
A „termés” kifejezés alatt a találmány szerinti növények sokaságát értjük, amelyeket együtt ültettünk el mezőgazdasági termőföldön. A „mezőgazdasági termőföld alatt hagyományos értelemben szántóföldet vagy üvegházi ágyást értünk. így a találmány tárgyát képezi az ugyanolyan fajba és változatba tartozó, a nem transzformált növény terméséhez viszonyítva megváltoztatott QPRT-áz-aktivitással, és így megnövelt vagy lecsökkenteti nikotinszinttel rendelkező növényekből álló növényi termés előállítására szolgáló eljárás.
A következőkben ismertetett példák csak illusztrálják a találmányt, de nem szűkítik annak oltalmi körét.
1. példa
Izolálás és szekvenálás
A TobRD2 cDNS-t [Conkling és munkatársai, Plánt Phys. 93:1203 (1990)] szekvenáltuk, és itt közöljük az 1. a. sz. szekvenciaként, és az arról származtatott aminosavszekvenciát a 2. a. sz. szekvenciaként közöljük. A származtatott aminosavszekvencia alapján feltételezzük, hogy a fehérje a citoszolban helyezkedik el. Növényi QPRT-áz nincs leközölve a szakirodalomban, azonban az NtPTI aminosavszekvencia és a GenBank adatbázisának összevetése (3. ábra) néhány bakteriális és más eredetű fehérjével korlátozott mértékű szekvenciahasonlóságot mutatott ki; a kinolát-foszforiboziltranszferáz (QPRT-áz)-aktivitást kimutatták S. typhimurium, E. coli és N. tabacum gének esetében. Szekvenciahasonlóságot találtunk az NtQPTI által kódolt QPT-áz és az Arabidopsis EST (expressziós szekvenciatoldalék, „tag”; GenBank F20096. kát. sz.) szekvencia által kódolt fragmensből származtatott peptid között; a peptid az Arabidopsis QPT-áz génjének egy részét képviselheti.
2. példa
In situ hibridizációs kísérletek
Nem transzformált növények esetén in situ hibridizációs kísérletekkel határoztuk meg a TobRD2 mRNS térbeli eloszlását a gyökér különböző szöveteiben. A gyökérszövet TobRD2 mRNS antiszensz láncának in situ hibridizációját a Meyerowitz és Smith [Meyerowitz, Plánt. Mól. Bioi. Rep. 5:242 (1987); Smith és munkatársai, Plánt. Mól. Bioi. Rep. 5: 237 (1987)] által leírt eljárással valósítottuk meg. Hétnapos dohánycsíranövény (Nicotiana tabacum) gyökereit foszfáttal pufferolt glutáraldehidben rögzítettük, Paraplast Plusba (Monoject Inc., St. Louis, MO) ágyaztuk, és 8 mm vastagságú, keresztirányú és hosszirányú metszeteket készítettünk. 35S-ATP jelenlétében, in vitro szintetizált TobRD2 antiszensz transzkriptumokat alkalmaztunk próbaként. A jelölt RNS-t alkalmazása előtt lúgos kezeléssel hidrolizáltuk, átlagosan 100-200 bázis hosszúságú fragmensek keletkezéséig.
A hibridizációt 50%-os formaldehidben 16 órán át, 42 °C-on, jelölt RNS [körülbelül 5*106 beütésszám/perc (cpm)/ml] hibridizációs oldattal hajtottuk végre. Exponálás után a metszeteket előhívtuk, majd világos és sötét látóterű mikroszkóppal vizsgáltuk.
A hibridizációs jel a gyökérsejtek kortikális rétegében lokalizálódott (az eredményeket nem mutatjuk be). Az adott metszet világos és sötét látóterű képének összehasonlítása alapján a TobRD2 transzkriptumok a gyökérkortex parenchimasejtjeiben helyezkednek el. Nem volt látható hibridizációs jel az epidermiszben vagy a központi hengerben.
HU 225 888 Β1
3. példa
A TobRD2-szint a Nic1 Nic2 dohánymutánsokban és összefüggés a nikotinszinttel
Megmértük a Nic1- és N/c2-mutáns dohánynövényekben a TobRD2-mRNS állandósult állapotú szintjeit. Ismert tény, hogy a Nic1 és Nic2 a kinolát-foszforibozil-transzferáz-aktivitást és a putreszcin-metiltranszferáz-aktivitást szabályozza, és ezek kodomináns módon szabályozzák a nikotintermelést. Az eredmények szerint, amelyeket az 5A. és 5B. ábrán mutatunk be, a TobRD2 expresszióját a Nic1 és Nic2 szabályozza.
RNS-t izoláltunk a vad típusú Burley 21 dohánynövényből (Nic1/Nic1 Nic2/Nic2); a Nic1- Burley 21 dohánynövény gyökereiből (nic1/nic1 Nic2/Nic2); a Nic2- Burley 21 dohánynövény gyökereiből (Nic1/Nic1 nic2/nic2) és a Nic1- Nic2 Burley 21 gyökereiből (nic1/nic1 nic2/nic2).
Négy Burley 21 dohányvonal (nic) egyedeit egy hónapig növesztettünk magról termőföldben, majd levegőztetett tápoldatban, vízkultúrás kamrában üvegházban neveltük egy hónapig. Ezek a vonalak izogének voltak a két alacsony nikotinszintért felelős lokuszt kivéve, és a Nic1/Nic1 Nic2/Nic2, Nic1/Nic1 nic2/nic2, nic1/nic1 Nic2/Nic2, nic1/nic1 nic2/nic2 genotípussal voltak jellemezhetőek. Minden genotípus 20 növényének gyökereit összegyűjtöttük és az RNS izolálásáig tároltuk. Minden genotípusból teljes RNS-t (1 pg) elektroforézisnek vetettünk alá 1,1 M formaldehidet tartalmazó, 1%-os agarózgélen, és a Sambrook [Sambrook és munkatársai, (1989)] által leírt eljárással egy nejlonalapanyagú membránra vittünk. A membránokat 32Pral jelölt TobRD2 cDNS-fragmensekkel hibridizáltattuk. A TobRD2 transzkriptumok relatív intenzitását denzitometrálással határoztuk meg. Az 5. ábra mutatja be (folytonos vonallal) a négy genotípus transzkriptumainak (a Nic1/Nic1 Nic2/Nic2 genotípushoz viszonyított) relatív szintjeit. A négy genotípus (Nic1/Nic1 Nic2/Nic2 genotípushoz viszonyított) relatív nikotintartalmát szaggatott vonallal ábrázoltuk.
Az 5. ábra a ToóRD2-mRNS állandósult állapotú szintjének összehasonlító ábrázolását mutatja, a vad típusú Burley 21 dohánynövény (Nic1/Nic1 Nic2/Nic2) mRNS-szintjét alkalmazva referenciaként. A Nic1/Nic2 kettős mutáns TobRD2 mRNS-szintje a vad típushoz viszonyítva kb. 25% volt. Az 5B. ábra a példában tanulmányozott, közel izogén dohányvonal relatív nikotinszintjeinek további összehasonlítását mutatja be (a folytonos vonallal a TobRD2 transzkriptumok szintjét, a szaggatott vonallal a nikotinszintet jelezzük). A nikotinszintek és a TobRD2 transzkriptumok között szoros összefüggést tapasztaltunk.
4. példa
A tetejezés hatása a TobRD2-mRNS-szintekre
A szakirodalomban ismert jelenség az, hogy a dohánynövény virágfejének eltávolítása (tetejezés) serkenti a gyökémövekedést, és növeli a növény leveleinek nikotintartalmát. A növény tetejezése a dohány nagyüzemi termesztésében szokásos eljárás, és az adott dohánynövény tetejezésének optimális időpontját a termesztési körülmények ismeretében a szakember által könnyen meghatározható.
Dohánynövényeket (N. tabacum SR1) magról növesztettünk egy hónapon át termőföldben, majd homokot tartalmazó cserepekbe ültettük át. A növényeket további két hónapon át növesztettük üvegházban, a virágzás kezdetéig. A virágfejeket és két „csomót” (rügyet v. hónaljrügyet) eltávolítottunk négy növényről (tetejezés). Minden növényről begyűjtöttük a gyökerek egy részét a jelzett időpontban és RNS-extrakcióhoz egyesítettük. A kontrollnövények virágját nem távolítottuk el. A különböző időpontokból származó teljes RNSmintákat (1 pg) elektroforézisnek vetettük alá 1,1 M formaldehidet tartalmazó, 1%-os agarózgélen, és a Sambrook [Sambrook és munkatársai, (1989)] által leírt eljárással egy nejlon-alapanyagú membránra vittük. A membránokat 32P-ral jelölt TobRD2 cDNS-fragmensekkel hibridizáltattuk, A TobRD2 transzkriptumok relatív intenzitását denzitometrálással határoztuk meg. A 6. ábra a viszonylagos transzkriptumszinteket ábrázolja (a 0 időponthoz viszonyítva) a tetejezésen átesett (folytonos vonal) és át nem esett (szaggatott vonal) növények esetében.
A gyökérszövet viszonylagos 7oőRD2-szintjeit 24 órán át figyeltük; az eredményeket a 6. ábrán foglaltuk össze (a folytonos vonallal a tetejezett növények 7oőRD2-szintjeit jelöltük; a szaggatott vonallal a nem tetejezett kontrollnövények 7ofaRD2-szintjeit jelöltük). A dohánynövény tetejezését követő hat órán belül a 7bőRD2-mRNS szintjei a tetejezett növényekben megközelítőleg nyolcszorosra emelkedtek; a kontrolinövényekben ugyanabban az időszakban nem tapasztaltunk növekedést.
5. példa
A QPRT-ázban hiánymutáns baktérium komplementálása az 1. a. sz. szekvenciával jelölt DNS-sel
A TH265-ÖS Escherichia coli törzs egy kinolát-foszforibozil-transzferázában hiányos mutáns (nadC-), és így nem képes szaporodni a nikotinsavmentes táptalajon.
TH265-ÖS sejteket transzformáltunk egy 1. a. sz. szekvenciájú DNS-t tartalmazó expressziós vektorral (pWS161) vagy az üres expressziós vektorral (pKK233). A transzformált baktériumok szaporodását a TH265-ÖS (pKK233-as) transzformált baktériumok szaporodásával és a nem transzformált TH265-ÖS nadCmutánsok szaporodásával vetettük össze. Az összehasonlító kísérleteket ME „minimál”- (nikotinsavhiányos) tápközegben és nikotinsavval kiegészített ME „minimál”-tápközegben végeztük el.
A TH265-ÖS, QPT-ázában hiánymutáns (nadC) E. coli törzseket dr. K. T. Hughes bocsátotta rendelkezésünkre [Hughes és munkatársai, J. Bact. 175: 479 (1993)]. A sejteket LS-tápközegben tartottuk fenn, és kompetens sejteket készítettünk a Sambrook [Sambrook és munkatársai (1989)] által leírt eljárás szerint. Egy expressziós plazmidot készítettünk a pKK223311
HU 225 888 Β1 bán [Brosius (1984)] a Tac-promoter szabályozóhatása alá helyezett TobRD2 cDNS-sel. A kapott pWS161-es plazmidot TH265-ÖS sejtekbe transzformáltuk.
A transzformált sejteket ezután nikotinsawal kiegészített (0,0002%) és nem kiegészített „minimál” agar táp- 5 talajlemezre [Vogel és Bonner (1956)] helyeztük. Kontrollként a pKK2233-mal transzformált és a nem transzformáit TH265-ÖS sejteket helyeztük hasonló táptalajra.
Az eredményeket a 4. ábrán mutatjuk be. Csak az
1. a. sz. szekvenciájú DNS-sel transzformált TH265- 10 ős sejtek szaporodtak a nikotinsavmentes táptalajon.
Ezek az eredmények azt mutatják, hogy az 1. a. sz. szekvenciájú DNS TH265-ÖS sejtekben történő expressziója nadC+ fenotípust adott a ezeknek a sejteknek, megerősítve azt, hogy ez a szekvencia QPRT-ázt 15 kódol. A TobRD2 elnevezést így NtQPT1-re változtattuk.
6. példa
A dohánynövények transzformációja 20
Az 1. a. sz. szekvenciát antiszensz orientációban egy növényi promoter (CaMV 35S vagy TobRD2 gyökérkortex-specifikus promoter) szabályozóhatása alá helyeztük két különböző DNS-kazetta: a „CaMV35Spromoter - antiszensz 1. a. sz. sz.” és a „TobRD2-promoter - antiszensz 1. a. sz. sz.” előállítása céljából.
A transzformációhoz egy vad típusú és egy alacsony nikotintartalmú dohányvonalat, azaz a vad típusú Buriey 21 dohányt (Nic1+/Nic2+) és a homozigóta nic1-/nic2- Buriey 21 dohányt választottuk. Minden vonalból dohánysejtek sokaságát transzformáltuk mindegyik DNS-kazettával. A transzformációt Agrobacterium-vektor, például egy Ti-határszekvenciát és az (nos-promoter szabályozása alatt álló és kanamicinrezisztenciát adó) nfp//-gént hordozó bináris Agrobacterám-vektor alkalmazásával hajtottuk végre.
A transzformált sejteket szelektáltuk és transzgenikus dohánynövényekké regeneráltuk (Ro). Az R0-növényeket érettségig növesztettük és nikotinszintjüket meghatároztuk; a transzformált dohánynövények egy részének nikotinszintje jelentős mértékben alacsonyabb volt, mint a nem transzformált kontrollnövények nikotinszintje.
Az R0-növényeket ezután önbeporzásnak vetettük alá, és a transzgén szegregációját az Rrutódokban vizsgáltuk. Az Rrutódokat érettségig növesztettük és önbeporzásnak vetettük alá; az R2-utódokban a transzgén szegregációja jelezte, hogy mely Rrnövények homozigóták a transzgénre nézve.
SZEKVENCIALISTA
AZ 1. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
HOSSZA: 1399 bázispár
TÍPUSA: nukleinsav
HÁNY SZÁLÚ: egy
TOPOLÓGIÁJA: lineáris
MOLEKULATÍPUS: cDNS
SAJÁTSÁG:
NÉV/MEGJELÖLÉS: cds
ELHELYEZKEDÉS: 52...1104
AZ 1. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
CAAAAACTAT TTTCCACAAA ATTCATTTCA CAACCCCCCC AAAAAAAAAC C ATG TTT 57
Met Phe
AGA Arg GCT ATT CCT Pro TTC Phe ACT Thr GCT ACA GTG CAT His CCT Pro TAT Tyr GCA Alá 15 ATT Ile ACA Thr GCT Alá 105
Alá Ile 5 Alá Thr 10 Val
CCA AGG TTG GTG GTG AAA ATG TCA GCA ATA GCC ACC AAG AAT ACA AGA 153
Pro Arg Leu Val Val Lys Met Ser Alá Ile Alá Thr Lys Asn Thr Arg
20 25 30
GTG GAG TCA TTA GAG GTG AAA CCA CCA GCA CAC CCA ACT TAT GAT TTA 201
Val Glu Ser Leu Glu Val Lys Pro Pro Alá His Pro Thr Tyr Asp Leu
35 40 45 50
AAG GAA GTT ATG AAA CTT GCA CTC TCT GAA GAT GCT GGG AAT TTA GGA 249
Lys Glu Val Met Lys Leu Alá Leu Ser Glu Asp Alá Gly Asn Leu Gly
55 60 65
GAT GTG ACT TGT AAG GCG ACA ATT CCT CTT GAT ATG GAA TCC GAT GCT 297
Asp Val Thr Cys Lys Alá Thr Ile Pro Leu Asp Met Glu Ser Asp Alá
70 75 80
HU 225 888 Β1
CAT His TTT Phe CTA GCA AAG GAA GAC GGG Gly 90 ATC Ile ATA GCA GGA ATT GCA Alá CTT Leu GCT Alá 345
Leu 85 Alá Lys Glu Asp Ile Alá Gly Ile 95
GAG ATG ATA TTC GCG GAA GTT GAT CCT TCA TTA AAG GTG GAG TGG TAT 393
Glu Met Ile Phe Alá Glu Val Asp Pro Ser Leu Lys Val Glu Trp Tyr
100 105 110
GTA AAT GAT GGC GAT AAA GTT CAT AAA GGC TTG AAA TTT GGC AAA GTA 441
Val Asn Asp Gly Asp Lys Val His Lys Gly Leu Lys Phe Gly Lys Val
115 120 125 130
CAA GGA AAC GCT TAC AAC ATT GTT ATA GCT GAG AGG GTT GTT CTC AAT 489
Gin Gly Asn Alá Tyr Asn Ile Val Ile Alá Glu Arg Val Val Leu Asn
135 140 145
TTT ATG CAA AGA ATG AGT GGA ATA GCT ACA CTA ACT AAG GAA ATG GCA 537
Phe Met Gin Arg Met Ser Gly Ile Alá Thr Leu Thr Lys Glu Met Alá
150 155 160
GAT GCT GCA CAC CCT GCT TAC ATC TTG GAG ACT AGG AAA ACT GCT CCT 585
Asp Alá Alá His Pro Alá Tyr Ile Leu Glu Thr Arg Lys Thr Alá Pro
165 170 175
GGA TTA CGT TTG GTG GAT AAA TGG GCG GTA TTG ATC GGT GGG GGG AAG 633
Gly Leu Arg Leu Val Asp Lys Trp Alá Val Leu Ile Gly Gly Gly Lys
180 185 190
AAT CAC AGA ATG GGC TTA TTT GAT ATG GTA ATG ATA ATKA GAC AAT CAC 681
Asn His Arg Met Gly Leu Phe Asp Met Val Met Ile Lys Asp Asn His
195 200 205 210
ATA TCT GCT GCT GGA GGT GTC GGC AAA GCT CTA AAA TCT GTG GAT CAG 729
Ile Ser Alá Alá Gly Gly Val Gly Lys Alá Leu Lys Ser Val Asp Gin
215 220 225
TAT TTG GAG CAA AAT AAA CTT CAA ATA GGG GTT GAG GTT GAA ACC AGG 777
Tyr Leu Glu Gin Asn Lys Leu Gin Ile Gly Val Glu Val Glu Thr Arg
230 235 240
ACA ATT GAA GAA GTA CGT GAG GTT CTA GAC TAT GCA TCT CAA ACA AAG 825
Thr Ile Glu Glu Val Arg Glu Val Leu Asp Tyr Alá Ser Gin Thr Lys
245 250 255
ACT TCG TTG ACT AGG ATA ATG CTG GAC AAT ATG GTT GTT CCA TTA TCT 873
Thr Ser Leu Thr Arg Ile Met Leu Asp Asn Met Val Val Pro Leu Ser
260 265 270
AAC GGA GAT ATT GAT GTA TCC ATG CTT AAG GAG GCT GTA GAA TTG ATC 921
Asn Gly Asp Ile Asp Val Ser Met Leu Lys Glu Alá Val Glu Leu Ile
275 280 285 290
AAT GGG AGG TTT GAT ACG GAG GCT TCA GGA AAT GTT ACC CTT GAA ACA 969
Asn Gly Arg Phe Asp Thr Glu Alá Ser Gly Asn Val Thr Leu Glu Thr
295 300 305
GTA CAC AAG ATT GGA CAA ACT GGT GTT ACC TAC ATT TCT AGT GGT GCC 1017
Val His Lys Ile Gly Gin Thr Gly Val Thr Tyr Ile Ser Ser Gly Alá
310 315 320
HU 225 888 Β1
CTG Leu ACG Thr CAT His 325 TCC Ser GTG Val AAA Lys GCA Alá CTT Leu 330 GAC Asp ATT Ile TCC Ser CTG Leu AAG Lys 335 ATC Ile GAT Asp ACA Thr 1065
GAG CTC GCC CTT GAA GTT GGA AGG CGT ACA AAA CGA GCA TGAGCGCCAT 1114
Glu Leu Alá Leu Glu Val Gly Arg Arg Thr Lys Arg Alá
340 345 350
TACTTCTGCT ATAGGGTTGG AGTAAAAGCA GCTGAATAGC TGAAAGGTGC AAATAAGAAT 1174
CATTTTACTA GTTGTCAAAC AAAAGATCCT TCACTGTGTA ATCAAACAAA AAGATGTAAA 1234
TTGCTGGAAT ATCTCAGATG GCTCTTTTCC AACCTTATTG CTTGAGTTGG TAATTTCATT 1294
ATAGCTTTGT TTTCATGTTT CATGGAATTT GTTACAATGA AAATACTTGA TTTATAAGTT 1354
TGGTGTATGT AAAATTCTGT GTTACTTCAA ATATTTTGAG ATGTT 1399
A 2. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
HOSSZA: 351 aminosav
TÍPUSA: aminosav
HÁNY SZÁLÚ: egy
TOPOLÓGIÁJA: lineáris
MOLEKULATÍPUS: protein
A 2. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
Met Phe Arg Alá Ile Pro Phe Thr Alá Thr Val His Pro Tyr Alá Ile 15 10 15
Thr Alá Pro Arg Leu Val Val Lys Met Ser Alá Ile Alá Thr Lys Asn 20 25 30
Thr Arg Val Glu Ser Leu Glu Val Lys Pro Pro Alá His Pro Thr Tyr 35 40 45
Asp Leu Lys Glu Val Met Lys Leu Alá Leu Ser Glu Asp Alá Gly Asn 50 55 60
Leu Gly Asp Val Thr Cys Lys Alá Thr Ile B-ro Leu Asp Met Glu Ser
70 75 80
Asp Alá His Phe Leu Alá Lys Glu Asp Gly Ile Ile Alá Gly Ile Alá
90 95
Leu Alá Glu Met Ile Phe Alá Glu Val Asp Pro Ser Leu Lys Val Glu 100 105 110
Trp Tyr Val Asn Asp Gly Asp Lys Val His Lys Gly Leu Lys Phe Gly 115 120 125
Lys Val Gin Gly Asn Alá Tyr Asn Ile Val Ile Alá Glu Arg Val Val 130 135 140
Leu Asn Phe Met Gin Arg Met Ser Gly Ile Alá Thr Leu Thr Lys Glu
145 150 155 160
Met Alá Asp Alá Alá His Pro Alá Tyr Ile Leu Glu Thr Arg Lys Thr
165 170 175
Alá Pro Gly Leu Arg Leu Val Asp Lys Trp Alá Val Leu Ile Gly Gly 180 185 190
Gly Lys Asn His Arg Met Gly Leu Phe Asp Met Val Met Ile Lys Asp 195 200 205
HU 225 888 Β1
Asn His Ile Ser Alá Alá Gly Gly Val Gly Lys Alá Leu Lys Ser Val 210 215 220
Asp Gin Tyr Leu Glu Gin Asn Lys Leu Gin Ile Gly Val Glu Val Glu
225 230 235 240
Thr Arg Thr Ile Glu Glu Val Arg Glu Val Leu Asp Tyr Alá Ser Gin
245 250 255
Thr Lys Thr Ser Leu Thr Arg Ile Met Leu Asp Asn Met Val Val Pro 260 265 270
Leu Ser Asn Gly Asp Ile Asp Val Ser Met Leu Lys Glu Alá Val Glu 275 280 285
Leu Ile Asn Gly Arg Phe Asp Thr Glu Alá Ser Gly Asn Val Thr Leu 290 295 300
Glu Thr Val His Lys Ile Gly Gin Thr Gly Val Thr Tyr Ile Ser Ser
305 310 315 320
Gly Alá Leu Thr His Ser Val Lys Alá Leu Asp Ile Ser Leu Lys Ile
325 330 335
Asp Thr Glu Leu Alá Leu Glu Val Gly Arg Arg Thr Lys Arg Alá 340 345 350
A 3. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
HOSSZA: 1053 bázispár
TlPUSA: nukleinsav
HÁNY SZÁLÚ: egy
TOPOLÓGIÁJA: lineáris
MOLEKULATiPUS: cDNS
A 3. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
ATGTTTAGAG CTATTCCTTT CACTGCTACA GTGCATCCTT ATGCAATTAC AGCTCCAAGG 60 TTGGTGGTGA AAATGTCAGC AATAGCCACC AAGAATACAA GAGTGGAGTC ATTAGAGGTG 120 AAACCACCAG CACACCCAAC TTATGATTTA AAGGAAGTTA TGAAACTTGC ACTCTCTGAA 180 GATGCTGGGA ATTTAGGAGA TGTGACTTGT AAGGCGACAA TTCCTCTTGA TATGGAATCC 240 GATGCTCATT TTCTAGCAAA GGAAGACGGG ATCATAGCAG GAATTGCACT TGCTGAGATG 300 ATATTCGCGG AAGTTGATCC TTCATTAAAG GTGGAGTGGT ATGTAAATGA TGGCGATAAA 360 GTTCATAAAG GCTTGAAATT TGGCAAAGTA CAAGGAAACG CTTACAACAT TGTTATAGCT 420 GAGAGGGTTG TTCTCAATTT TATGCAAAGA ATGAGTGGAA TAGCTACACT AACTAAGGAA 480 ATGGCAGATG CTGCACACCC TGCTTACATC TTGGAGACTA GGAAAACTGC TCCTGGATTA 540 CGTTTGGTGG ATAAATGGGC GGTATTGATC GGTGGGGGGA AGAATCACAG AATGGGCTTA 600 TTTGATATGG TAATGATAAA AGACAATCAC ATATCTGCTG CTGGAGGTGT CGGCAAAGCT 660 CTAAAATCTG TGGATCAGTA TTTGGAGCAA AATAAACTTC AAATAGGGGT TGAGGTTGAA 720 ACCAGGACAA TTGAAGAAGT ACGTGAGGTT CTAGACTATG CATCTCAAAC AAAGACTTCG 780 TTGACTAGGA TAATGCTGGA CAATATGGTT GTTCCATTAT CTAACGGAGA TATTGATGTA 840 TCCATGCTTA AGGAGGCTGT AGAATTGATC AATGGGAGGT TTGATACGGA GGCTTCAGGA 900 AATGTTACCC TTGAAACAGT ACACAAGATT GGACAAACTG GTGTTACCTA CATTTCTAGT 960 GGTGCCCTGA CGCATTCCGT GAAAGCACTT GACATTTCCC TGAAGATCGA TACAGAGCTC 1020 GCCCTTGAAG TTGGAAGGCG TACAAAACGA GCA 1053

Claims (44)

  1. SZABADALMI IGÉNYPONTOK
    1. Egy izolált DNS-molekula, amely (a) 1. a. sz. szekvenciát, vagy (b) 2. a. sz. aminosavszekvenciájú enzimet kódoló DNS-szekvenciát, vagy (c) az 1. (a) vagy 1. (b) pontok bármelyike szerinti izolált DNS-sel legalább 65% homológiát mutató és kinolát-foszforibozil-transzferázt kódoló DNS-szekvenciát; vagy (d) az 1. (a), 1. (b) vagy 1. (c) pontok szerinti DNSszekvenciák bármelyikétől csak a genetikai kód degenerált volta miatt különböző DNS-szekvenciát tartalmaz.
  2. 2. Expressziós kazettát tartalmazó DNS-konstrukció, amely, 5-3' irányban, egy növényi sejtben működőképes promotert és a promotertől 3’-irányban az 1. igénypont szerinti, a promoterhez működőképesen kapcsolt, kinolát-foszforibozil-transzferázt kódoló szekvenciát tartalmazó DNS-szekvenciát tartalmaz.
  3. 3. Expressziós kazettát tartalmazó DNS-konstrukció, amely, 5-3' irányban, egy növényi promotert és a promotertől 3’-irányban az 1. igénypont szerinti, kinolátfoszforibozil-transzferázt kódoló szekvenciát tartalmazó DNS-szekvenciát tartalmaz, a promoterhez működőképesen kapcsolt formában, antiszensz orientációban.
  4. 4. DNS-konstrukció, amely, 5-3’ irányban, egy növényi sejtben működőképes promotert és egy növényi kinolát-foszforibozil-transzferázt kódoló, a növényi sejtben működőképes promoterrel működőképesen kapcsolt DNS-t tartalmaz, amely az 1. igénypont szerint meghatározott DNS-szekvenciák bármelyike.
  5. 5. DNS-konstrukció, amely, 5-3’ irányban, egy növényi sejtben működőképes promotert és egy növényi kinolát-foszforibozil-transzferázt kódoló, a növényi sejtben működőképes promoterrel működőképesen kapcsolt, antiszensz orientációjú DNS-t tartalmaz, amely az 1. igénypont szerint meghatározott DNS-szekvenciák bármelyike.
  6. 6. A 2., 3., 4. vagy 5. igénypontok bármelyike szerinti DNS-konstrukció, amelyben a promoter konstitutív módon aktív növényi sejtekben.
  7. 7. A 2., 3., 4. vagy 5. igénypontok bármelyike szerinti DNS-konstrukció, amelyben a promoter szelektív módon növényi gyökérszövet sejtjeiben vagy növényi gyökérkortexszövet sejtjeiben aktív.
  8. 8. A 2-7. igénypontok bármelyike szerinti DNSkonstrukció, amely plazmidot is tartalmaz.
  9. 9. A 2-8. igénypontok bármelyike szerinti DNSkonstrukció, amelyet egy növényi transzformációs vektor hordoz.
  10. 10. A 9. igénypont szerinti DNS-konstrukció, amelyet növényi transzformációs vektorként egy Agrobacterium tumefaciens vektor hordoz.
  11. 11. Növényi sejt, amely a 2-10. igénypontok bármelyike szerinti DNS-konstrukciót tartalmaz.
  12. 12. Transzgenikus növény, amely a 11. igénypont szerinti növényi sejtet tartalmaz.
  13. 13. Izolált peptid, amelynek szekvenciája megegyezik a 2. a. sz. aminosavszekvenciával.
  14. 14. Izolált peptid, amelyet (a) az 1. a. sz. szekvencia; vagy (b) a 14. (a) pont szerinti izolált DNS-sel legalább 65% homológiát mutató és kinolát-foszforibozil-transzferázt kódoló DNS-szekvenciák bármelyike, vagy (c) a 14. (a) vagy a 14. (b) pontok szerinti DNSszekvenciáktól csak a genetikai kód degenerált volta miatt különböző DNS-szekvenciák bármelyike kódol.
  15. 15. Eljárás kinolát-foszforibozil-transzferázt (QPRT-áz) csökkentett mértékben expresszáló, transzgenikus növényi sejt előállítására, azzal jellemezve, hogy
    - kinolát-foszforibozil-transzferázt expresszáló növényi sejtet biztosítunk;
    - 5-3’ irányban felsorolva, növényi sejtben működőképes promotert és azzal működőképesen kapcsolt növényi kinolát-foszforibozil-transzferázmRNS-t kódoló, az 1. igénypont szerinti DNSszekvenciák közül választott DNS-t tartalmazó, exogén DNS-konstrukciót biztosítunk; és
    - a DNS-konstrukcióval transzformáljuk a növényi sejtet, és ezáltal egy nem transzformált sejthez viszonyítva a QPRT-ázt csökkentett mértékben expresszáló növényi sejtet állítunk elő.
  16. 16. A 15. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy DNS-konstrukcióként a kinolát-foszforiboziltranszferáz-mRNS-t kódoló szekvencia egy részét tartalmazó DNS-t szensz vagy antiszensz orientációban tartalmazó DNS-konstrukciót alkalmazunk.
  17. 17. A 15. vagy a 16. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a növényi sejtként a Nicotiana tabacum növényi sejtet alkalmazzuk.
  18. 18. A 15-17. igénypontok szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a transzformált növényi sejtből növényt regenerálunk.
  19. 19. A 15-18. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy promoterként konstitutív módon aktív promotert tartalmazó DNS-konstrukciót alkalmazunk.
  20. 20. A 15-18. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy promoterként a növényi gyökérszövetben vagy a növényi gyökérkortexszövetben szelektív módon aktív promotert tartalmazó DNSkonstrukciót alkalmazunk.
  21. 21. A 15-20. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a transzformációs lépésben a növényi sejtet a DNS-t hordozó mikrorészecskékkel bombázzuk.
  22. 22. A 15-20. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a transzformációs lépésben a növényi sejtet a DNS-konstrukciót hordozó Ti-plazmidot tartalmazó Agrobacterium tumefaciensszel fertőzzük.
  23. 23. Eljárás transzgenikus dohánymagvak előállítására, azzal jellemezve, hogy az 1. igénypont szerint definiált transzgént tartalmazó magvakat gyűjtünk a 17. igénypont szerinti eljárással előállított transzgenikus dohánynövényről.
  24. 24. A 15-23. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy exogén DNS-szekvencia16
    HU 225 888 Β1 ként a növényi sejtben expresszált kinolát-foszforiboziltranszferáz mRNS-ének (QPRT-mRNS)
    - az 5' nem transzlálódó szekvenciájával, vagy
    - a 3' nem transzlálódó szekvenciájával vagy
    - a transzlálódó régiójával komplementer, kinolát-foszforibozil-transzferázszekvenciát kódoló szekvenciát tartalmazó, az 1. igénypont szerinti DNS-szekvenciák közül választott DNS-szekvenciát alkalmazunk.
  25. 25. A 15-23. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy kinolát-foszforibozil-transzferáz-szekvenciát kódoló szekvenciát tartalmazó, az 1. igénypont szerinti DNS-szekvenciák közül választott, exogén DNS-szekvenciaként a növényi sejtben expresszálódó kinolát-foszforibozil-transzferáz mRNSének legalább 15 nukleotidjával komplementer DNSszekvenciát alkalmazunk.
  26. 26. A 15-23. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy kinolát-foszforibozil-transzferáz-szekvenciát kódoló szekvenciát tartalmazó, az 1. igénypont szerinti DNS-szekvenciák közül választott, exogén DNS-szekvenciaként a növényi sejtben expresszálódó kinolát-foszforibozil-transzferáz mRNSének legalább 200 nukleotidjával komplementer DNSszekvenciát alkalmazunk.
  27. 27. A 15-23. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy exogén DNS-szekvenciaként az 1. igénypont szerinti, kinolát-foszforiboziltranszferázt kódoló DNS-szekvenciák bármelyikét tartalmazó DNS-szekvenciát alkalmazunk.
  28. 28. A Nicotiana nemzetségbe tartozó transzgenikus növény, amelynek kinolát-foszforibozil-transzferáz-expressziója egy nem transzformált kontrollnövényhez viszonyítva csökkentett mértékű, és amely transzgenikus növény
    - 5-3’ irányban felsorolva a növényi sejtben működőképes promotert és azzal működőképesen kapcsolt - növényi kinolát-foszforibozil-transzferáz-mRNS-t kódoló, az 1. igénypont szerinti DNS-szekvenciák közül választott DNS-szekvencia egy 15 nukleotid hosszúságú szegmensét tartalmazó - DNS-t hordozó exogén DNS-konstrukciót tartalmazó sejtet tartalmaz,
    - és amely növénynek egy nem transzformált kontrollnövényhez viszonyítva csökkent mértékű QPRT-áz-aktivitása van.
  29. 29. A 28. igénypont szerinti transzgenikus növény, amelyben az 1. igénypont szerinti DNS-szekvenciák közül választott, a kinolát-foszforibozil-transzferázmRNS-t kódoló szekvencia egy szegmensét tartalmazó DNS szensz vagy antiszensz orientációban van.
  30. 30. A Nicotiana nemzetségbe tartozó transzgenikus növény, amelynek kinolát-foszforibozil-transzferáz-expressziója egy nem transzformált kontrollnövényhez viszonyítva csökkentett mértékű, és amely transzgenikus növény a 28. igénypont szerinti növény leszármazottja, és az 1. igénypont szerint definiált transzgént tartalmaz.
  31. 31. A Nicotiana nemzetségbe tartozó, transzgenikus növény magva, amely növény kinolát-foszforiboziltranszferáz-expressziója egy nem transzformált kontrollnövényhez viszonyítva csökkentett mértékű, és amely transzgenikus növény a 31. igénypont szerinti növény vagy annak leszármazottja, és amely mag az 1. igénypont szerint definiált transzgént tartalmaz.
  32. 32. Növényállomány, amely a 28. igénypont szerinti, mezőgazdasági termőföldre együttesen kiültetett növények halmazát tartalmazza.
  33. 33. Eljárás egy kinolát-foszforibozil-transzferáz-gén növényi sejtben történő expressziójának csökkentésére, azzal jellemezve, hogy egy transzformált növényi sejtet szaporítunk, amely a transzformálás következtében egy, a sejt endogén kinolát-foszforibozil-transzferáz mRNS-ével komplementer átíródó láncú, az 1. igénypont szerint definiált DNSszekvenciák közül választott, exogén DNS-t tartalmaz, ahol a komplementer lánc átíródása csökkenti a kinolát-foszforibozil-transzferáz-gén expresszióját.
  34. 34. Eljárás dohánynövény előállítására, amelynek csökkentett nikotinszintű levelei vannak, azzal jellemezve, hogy egy, az adott növényben működőképes transzkripciós iniciációs régiót és ahhoz működőképesen kapcsolt, az 1. igénypont szerint definiált DNS-szekvenciák közül választott, exogén DNS-szekvenciát tartalmazó DNS-konstrukciót tartalmazó sejteket tartalmazó dohánynövényt vagy leszármazottját termesztjük, ahol a DNS-szekvencia átíródó szála az adott növény sejtjeinek endogén kinolát-foszforibozil-transzferázának mRNS-ével komplementer.
  35. 35. Eljárás megnövelt kinolát-foszforibozil-transzferáz-expressziójú (QPRT-áz-expressziójú) transzgenikus növényi sejt előállítására, azzal jellemezve, hogy
    - kinolát-foszforibozil-transzferázt expresszáló növényi sejtet biztosítunk; valamint
    - 5-3’ irányban, egy növényi sejtben működőképes promotert és növényi kinolát-foszforiboziltranszferázt kódoló, a promoterrel működőképesen kapcsolt, az 1. igénypont szerint definiált DNS-szekvenciák közül választott DNS-szekvenciát tartalmazó exogén DNS-konstrukciót biztosítunk;
    - a DNS-konstrukcióval transzformáljuk a növényi sejtet, amivel egy nem transzformált sejthez viszonyítva a QPRT-ázt megnövelt mértékben expresszáló növényi sejtet állítunk elő.
  36. 36. A Nicotiana nemzetségbe tartozó transzgenikus növény, amelynek kinolát-foszforibozil-transzferáz-expressziója egy nem transzformált kontrollnövényhez viszonyítva megnövelt mértékű, és amely transzgenikus növény sejtjei
    5-3’ irányban, az adott növényi sejtben működőképes promotert és egy azzal működőképesen kapcsolt, egy növényi kinolát-foszforibozil-transzferázt kódoló, az 1. igénypont szerint definiált DNS-szekvenciák közül választott DNS-szekvenciát tartalmazó exogén DNS-konstrukciót tartalmaznak, és a növénynek egy nem transzformált kontrollnövényhez viszonyítva megnövelt mértékű QPRT-áz-aktivitása van.
    HU 225 888 Β1
  37. 37. A Nicotiana nemzetségbe tartozó transzgenikus növény, amelynek kinolát-foszforibozil-transzferáz-expressziója egy nem transzformált kontrollnövényhez viszonyítva megnövelt mértékű, és amely transzgenikus növény a 36. igénypont szerinti növény leszármazottja, és az 1. igénypont szerint definiált transzgént tartalmaz.
  38. 38. Eljárás kinolát-foszforibozil-transzferáz-gén növényi sejtben történő expressziójának növelésére, azzal jellemezve, hogy kinolát-foszforibozil-transzferázt kódoló, az 1. igénypont szerint definiált szekvenciák közül választott, exogén DNS-sel transzformált növényi sejtet szaporítunk.
  39. 39. A 38. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a transzformált növényt az alábbiakat tartalmazó eljárással állítjuk elő:
    egy konstrukciót, amely az átíródás irányában felsorolva az adott növényi sejtben működőképes promotert, a sejtben működőképes kinolát-foszforiboziltranszferázt kódoló, a promoterrel működőképesen kapcsolt, az 1. igénypont szerint definiált DNS-szekvenciák közül választott DNS-szekvenciát és a sejtben működőképes transzkripciós terminációs szekvenciát tartalmaz, egy gazdasejt genomjába építünk be, amivel transzformált növényi sejtet hozunk létre.
  40. 40. Eljárás dohánynövény előállítására, amelynek megnövelt nikotinszintű levelei vannak, azzal jellemezve, hogy egy növényben működőképes transzkripciós iniciációs régiót és egy, azzal működőképesen kapcsolt, a sejtekben működőképes kínolát-foszforibozil-transzferázt kódoló, az 1. igénypont szerint definiált DNS-szekvenciák közül választott, exogén DNS-szekvenciát tartalmazó DNS-konstrukciöt tartalmazó sejteket tartalmazó dohánynövényt vagy egy leszármazottját termesztjük.
  41. 41. Csökkentett nikotintartalmú dohánytermék, amely 12., 28., 29. vagy 30. igénypontok bármelyike szerinti dohánynövényből származó dohányt tartalmaz, és amelyben a dohánytermék növényi sejtjei exogén, transzgenikus növényben kinolát-foszforibozil-transzferáz (QPRT-áz) expressziójának csökkentésére alkalmas DNS-konstrukciót tartalmaznak, amely 5-3' irányban felsorolva tartalmazza a következőket:
    - a növényi sejtben működőképes promotert és
    - növényi kinolát-foszforibozil-transzferáz-mRNS-t kódoló, az 1. igénypont szerinti DNS-szekvenciák közül választott DNS-szekvencia egy legalább 15 nukleotid hosszúságú szegmensét tartalmazó DNS-t, amely DNS a promoterrel működőképesen kapcsolt.
  42. 42. Csökkentett nikotintartalmú dohánytermék, amely a 2-10. igénypontok bármelyike szerinti nukleinsavkonstrukciót tartalmaz, exogén DNS-konstrukcióként.
  43. 43. Csökkentett nikotintartalmú dohánytermék, amelyben a dohánytermék növényi sejtjei a 11. igénypont szerinti növényi sejtek.
  44. 44. Fokozott nikotintartalmú dohánytermék, amely 36-37. igénypontok bármelyike szerinti növényből származó dohányt tartalmaz, és a dohánytermék növényi sejtjei exogén DNS-konstrukciót tartalmaznak, amely 5-3’irányban felsorolva tartalmazza a következőket:
    - a növényi sejtben működőképes promotert és
    - növényi kinolát-foszforibozil-transzferázt kódoló, az 1. igénypont szerinti DNS-szekvenciák közül választott DNS-szekvenciát, amely DNS-szekvencia a promoterrel működőképesen kapcsolt.
HU0003767A 1997-06-12 1998-06-10 Regulation of quinolate phosphoribosyl transferase expression HU225888B1 (en)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US4947197P 1997-06-12 1997-06-12
PCT/US1998/011893 WO1998056923A1 (en) 1997-06-12 1998-06-10 Regulation of quinolate phosphoribosyl transferase expression

Publications (3)

Publication Number Publication Date
HUP0003767A2 HUP0003767A2 (hu) 2001-02-28
HUP0003767A3 HUP0003767A3 (en) 2002-10-28
HU225888B1 true HU225888B1 (en) 2007-11-28

Family

ID=21960004

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
HU0003767A HU225888B1 (en) 1997-06-12 1998-06-10 Regulation of quinolate phosphoribosyl transferase expression

Country Status (38)

Country Link
US (9) US6586661B1 (hu)
EP (3) EP0991766B1 (hu)
JP (4) JP4095678B2 (hu)
KR (1) KR100365969B1 (hu)
CN (2) CN100482799C (hu)
AP (1) AP1169A (hu)
AT (1) ATE262039T1 (hu)
AU (1) AU748514B2 (hu)
BG (1) BG64319B1 (hu)
BR (1) BRPI9810870B1 (hu)
CA (2) CA2484366A1 (hu)
CU (1) CU23174A3 (hu)
CZ (1) CZ297379B6 (hu)
DE (2) DE69822463T2 (hu)
DK (1) DK0991766T3 (hu)
EA (2) EA004652B1 (hu)
EE (1) EE04595B1 (hu)
ES (1) ES2154624T3 (hu)
GE (1) GEP20032871B (hu)
GR (1) GR20010300003T1 (hu)
HK (3) HK1027379A1 (hu)
HU (1) HU225888B1 (hu)
ID (1) ID29311A (hu)
IL (3) IL132184A0 (hu)
LT (1) LT4706B (hu)
LV (1) LV12507B (hu)
NO (1) NO324872B1 (hu)
NZ (1) NZ500963A (hu)
OA (1) OA11219A (hu)
PL (1) PL201266B1 (hu)
PT (1) PT991766E (hu)
RO (1) RO121968B1 (hu)
RS (1) RS49677B (hu)
SI (1) SI20215B (hu)
SK (1) SK161899A3 (hu)
TR (1) TR199902728T2 (hu)
UA (1) UA72187C2 (hu)
WO (1) WO1998056923A1 (hu)

Families Citing this family (51)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6586661B1 (en) * 1997-06-12 2003-07-01 North Carolina State University Regulation of quinolate phosphoribosyl transferase expression by transformation with a tobacco quinolate phosphoribosyl transferase nucleic acid
US20100251425A9 (en) * 1998-05-15 2010-09-30 University Of Central Florida Expression of human interferon in transgenic chloroplasts
DE19926216A1 (de) * 1999-06-09 2001-02-22 Metallgesellschaft Ag Verfahren zur Herstellung von Bariumsulfat, Bariumsulfat und Verwendung des Bariumsulfats
JP2004507250A (ja) * 2000-08-30 2004-03-11 ノース・キャロライナ・ステイト・ユニヴァーシティ タンパク質含量を変化させる分子デコイを含有するトランスジェニック植物
US7189570B2 (en) * 2000-11-07 2007-03-13 North Carolina State University Putrescine-n-methyltransferase promoter
DE10055870A1 (de) * 2000-11-10 2002-05-29 Degussa Neue für das nadC-Gen kodierende Nukleotidsequenzen
EA200400005A1 (ru) * 2001-06-06 2004-08-26 22 Сенчури Лимитед, Ллс Утилизация табачной биомассы
US20060157072A1 (en) * 2001-06-08 2006-07-20 Anthony Albino Method of reducing the harmful effects of orally or transdermally delivered nicotine
SG132542A1 (en) * 2001-06-08 2007-06-28 Vector Tobacco Ltd Modifying nicotine and nitrosamine levels in tobacco
WO2005103296A2 (en) * 2004-03-30 2005-11-03 Vector Tobacco, Ltd. Global gene expression analysis of human bronchial epithelial cells exposed to cigarette smoke, smoke condensates, or components thereof
US6730832B1 (en) 2001-09-10 2004-05-04 Luis Mayan Dominguez High threonine producing lines of Nicotiana tobacum and methods for producing
EP1441603A2 (en) * 2001-11-09 2004-08-04 Vector Tobacco Inc. Method and composition for mentholation of charcoal filtered cigarettes
EP1455609A2 (en) * 2001-12-19 2004-09-15 Vector Tobacco Inc. Method and compositions for imparting cooling effect to tobacco products
DE60215385T2 (de) * 2001-12-19 2007-10-25 Vector Tobacco Inc.(N.D.Ges.D.Staates Virginia) Verfahren und zusammensetzung zur mentholanreicherung von zigaretten
WO2003086076A1 (en) * 2002-04-09 2003-10-23 Vector Tobacco Ltd. Tobacco having reduced nicotine and nitrosamines
CN1838878A (zh) 2003-08-19 2006-09-27 二十二世纪有限公司 低危害的烟草产品
US7920906B2 (en) 2005-03-10 2011-04-05 Dexcom, Inc. System and methods for processing analyte sensor data for sensor calibration
EP1684603A2 (en) * 2003-10-02 2006-08-02 Vector Tobacco Ltd. Tobacco product labeling system
US9247900B2 (en) 2004-07-13 2016-02-02 Dexcom, Inc. Analyte sensor
US7538071B2 (en) 2003-11-21 2009-05-26 Carl Berger Methods of reducing the nicotine content of tobacco plants and tobacco plants obtained thereby
US8792955B2 (en) 2004-05-03 2014-07-29 Dexcom, Inc. Transcutaneous analyte sensor
US7713574B2 (en) 2004-07-13 2010-05-11 Dexcom, Inc. Transcutaneous analyte sensor
KR101672423B1 (ko) 2005-02-28 2016-11-03 22엔디 센츄리 리미티드, 엘엘씨 식물의 니코틴 알칼로이드 수준의 감소
AU2012203977B2 (en) * 2005-02-28 2015-01-29 22Nd Century Limited, Llc Reducing levels of nicotinic alkaloids in plants
NZ564025A (en) 2005-05-11 2012-03-30 Vector Tobacco Inc Reduced risk tobacco products and methods of making same
FR2889003A1 (fr) * 2005-07-22 2007-01-26 St Microelectronics Sa Adaptation automatique d'une source video a un recepteur
CN104894158B (zh) 2006-06-19 2018-05-25 22世纪有限责任公司 编码n-甲基腐胺氧化酶之核酸及其应用
US9551003B2 (en) 2006-09-13 2017-01-24 22Nd Century Limited, Llc Increasing levels of nicotinic alkaloids in plants
PL2450446T3 (pl) 2006-09-13 2015-10-30 22Nd Century Ltd Llc Zwiększanie poziomów alkaloidów nikotynowych
US9102948B2 (en) 2006-11-17 2015-08-11 22Nd Century Limited, Llc Regulating alkaloids
US9106606B1 (en) 2007-02-05 2015-08-11 F5 Networks, Inc. Method, intermediate device and computer program code for maintaining persistency
CN102171344B (zh) 2007-05-25 2016-03-16 22世纪有限责任公司 编码调节生物碱合成之转录因子的核酸序列及其在改良植物代谢中的应用
US20100206317A1 (en) * 2007-09-28 2010-08-19 Vector Tobacco, Inc. Reduced risk tobacco products and use thereof
DK2231861T3 (en) * 2007-12-13 2015-01-19 Philip Morris Products Sa Transgenic plants modified to produce less cadmium transport, derivative products and related methods.
CN102741405B (zh) 2009-11-19 2015-03-04 国立大学法人冈山大学 提高基因表达的系统和保持有该系统的载体
US8535210B2 (en) 2009-12-11 2013-09-17 Terumo Bct, Inc. System for blood separation with shielded extraction port and optical control
WO2011102394A1 (ja) 2010-02-17 2011-08-25 日本たばこ産業株式会社 植物内容成分の調節因子、およびその利用
US9862923B2 (en) 2010-03-26 2018-01-09 Philip Morris Usa Inc. Cultured tobacco cells as a matrix for consumable products
EP2565265A1 (en) 2011-09-02 2013-03-06 Philip Morris Products S.A. Isopropylmalate synthase from Nicotiana tabacum and methods and uses thereof
US8716571B2 (en) 2011-09-21 2014-05-06 Reynolds Technologies, Inc. Tobacco having reduced amounts of amino acids and methods for producing such lines
US9137958B2 (en) 2012-02-08 2015-09-22 Reynolds Technologies, Inc. Tobacco having altered amounts of environmental contaminants
CA2894955C (en) * 2012-12-21 2023-10-31 Philip Morris Products S.A. Tobacco specific nitrosamine reduction in plants
CN103173488B (zh) * 2013-03-14 2014-09-03 浙江省农业科学院 新的融合标签进行水稻转基因快速筛选的方法
US10375910B2 (en) 2013-03-15 2019-08-13 Altria Client Services Llc Development of tobacco varieties with no or significantly reduced anatabine content
EP3291668A4 (en) * 2015-05-05 2019-01-23 North Carolina State University METHOD AND COMPOSITIONS FOR REDUCING TOBACCO-SPECIFIC NITROSAMINE NNK IN TOBACCO
EP3313173A1 (en) 2015-06-26 2018-05-02 Altria Client Services LLC Compositions and methods for producing tobacco plants and products having altered alkaloid levels
EP3480314A1 (en) 2017-11-03 2019-05-08 Philip Morris Products S.A. Regulation of alkaloid content
US20200035118A1 (en) 2018-07-27 2020-01-30 Joseph Pandolfino Methods and products to facilitate smokers switching to a tobacco heating product or e-cigarettes
US10897925B2 (en) 2018-07-27 2021-01-26 Joseph Pandolfino Articles and formulations for smoking products and vaporizers
JP2022552261A (ja) * 2019-10-10 2022-12-15 アルトリア クライアント サーヴィシーズ リミテッド ライアビリティ カンパニー 変化したアルカロイドレベルを有するタバコ植物およびタバコ製品を作製するためのｑｐｔ操作に基づく組成物および方法
CN113528537A (zh) * 2021-08-11 2021-10-22 云南省烟草农业科学研究院 一种降低烟叶烟碱含量的NtQPT2基因突变体及其应用

Family Cites Families (178)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US38123A (en) * 1863-04-07 Improvement in harvesters
US299541A (en) 1884-06-03 heae-n
US254285A (en) 1882-02-28 David w
US819751A (en) * 1905-01-04 1906-05-08 Giuseppe Gianoli Process of charging silk.
US2479526A (en) 1940-12-11 1949-08-16 Wurton Machine Company Apparatus for curing green tobacco
US2728803A (en) * 1951-12-28 1955-12-27 Standard Oil Co Separation of ethylbenzene from other c8 aromatic hydrocarbons by extraction with hf-bf3
US2728603A (en) 1954-12-13 1955-12-27 James H Stagg Lawn and garden sprinkler
DE1917552U (de) 1964-01-31 1965-06-10 Fritz Tautenhahn Flaechig-ornamentales gitterwerk.
US3693631A (en) 1971-04-28 1972-09-26 Reynolds Leasing Corp Tobacco expansion process
US3840025A (en) 1972-08-14 1974-10-08 Industrial Nucleonics Corp Tobacco moisture control system and method
US3905123A (en) 1973-10-15 1975-09-16 Industrial Nucleonics Corp Method and apparatus for controlling a tobacco dryer
US4319587A (en) 1975-06-09 1982-03-16 Irving S. Moser Smoking article
DE7522272U (de) 1975-07-12 1977-06-02 Deutsche Benkert Gmbh & Co Kg, 4690 Herne Poroeses mundstueckbelagpapier
US4192323A (en) 1977-09-21 1980-03-11 Gas-Fired Products, Inc. Apparatus and method for automatically controlling curing conditions in a tobacco curing barn
US4557280A (en) 1978-06-15 1985-12-10 Brown & Williamson Tobacco Corporation Process for reduction of nitrate and nicotine content of tobacco by microbial treatment
US4243056A (en) 1979-01-12 1981-01-06 Philip Morris Incorporated Method for uniform incorporation of additives into tobacco
FR2478958A1 (fr) 1980-04-01 1981-10-02 Decoufle Dispositif d'alimentation en encre des appareils d'imprimerie pour machines a confectionner les cigarettes
US4499911A (en) 1980-12-09 1985-02-19 Johnson William H Energy efficient curing and drying system
GB2092149B (en) * 1981-02-03 1985-01-03 Searle & Co Imidazoline hydrazone and hydrazine derivatives production thereof and use in medicine
US4459355A (en) 1982-07-12 1984-07-10 International Paper Company Method for transforming plant cells
US4762785A (en) 1982-08-12 1988-08-09 Calgene, Inc. Novel method and compositions for introducting alien DNA in vivo
NL8203963A (nl) 1982-10-14 1984-05-01 Naarden International Nv Werkwijze voor het aromatiseren van droog plantaardig materiaal.
EP0116718B2 (en) 1983-01-13 1996-05-08 Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. Process for the introduction of expressible genes into plant cell genomes and agrobacterium strains carrying hybrid Ti plasmid vectors useful for this process
US6051757A (en) 1983-01-14 2000-04-18 Washington University Regeneration of plants containing genetically engineered T-DNA
US6174724B1 (en) 1983-01-17 2001-01-16 Monsanto Company Chimeric genes suitable for expression in plant cells
EP0131623B2 (en) 1983-01-17 1999-07-28 Monsanto Company Chimeric genes suitable for expression in plant cells
US5352605A (en) 1983-01-17 1994-10-04 Monsanto Company Chimeric genes for transforming plant cells using viral promoters
WO1984002919A1 (en) 1983-01-17 1984-08-02 Monsanto Co Plasmids for transforming plant cells
US5034322A (en) 1983-01-17 1991-07-23 Monsanto Company Chimeric genes suitable for expression in plant cells
SU1582990A3 (ru) 1983-01-17 1990-07-30 Монсанто Компани (Фирма) Способ получени трасформированных клеток двудольных растений
NL8300698A (nl) 1983-02-24 1984-09-17 Univ Leiden Werkwijze voor het inbouwen van vreemd dna in het genoom van tweezaadlobbige planten; agrobacterium tumefaciens bacterien en werkwijze voor het produceren daarvan; planten en plantecellen met gewijzigde genetische eigenschappen; werkwijze voor het bereiden van chemische en/of farmaceutische produkten.
NL8300699A (nl) 1983-02-24 1984-09-17 Univ Leiden Werkwijze voor het inbouwen van vreemd dna in het genoom van tweezaadlobbige planten; werkwijze voor het produceren van agrobacterium tumefaciens bacterien; stabiele cointegraat plasmiden; planten en plantecellen met gewijzigde genetische eigenschappen; werkwijze voor het bereiden van chemische en/of farmaceutische produkten.
US4751348A (en) 1983-07-16 1988-06-14 Cold Spring Harbor Laboratory Nicotiana plants with both altered polyamine levels and flower structures and method for obtaining these plants
US4766855A (en) * 1983-07-20 1988-08-30 Cummins Engine Co., Inc. Plasma jet ignition apparatus
EP0140308B2 (en) 1983-10-20 2001-10-17 The Research Foundation Of State University Of New York Regulation of gene expression by employing translational inhibition utilizing mRNA interfering complementary RNA
US5272065A (en) 1983-10-20 1993-12-21 Research Foundation Of State University Of New York Regulation of gene expression by employing translational inhibition of MRNA utilizing interfering complementary MRNA
US5208149A (en) 1983-10-20 1993-05-04 The Research Foundation Of State University Of New York Nucleic acid constructs containing stable stem and loop structures
US5190931A (en) 1983-10-20 1993-03-02 The Research Foundation Of State University Of New York Regulation of gene expression by employing translational inhibition of MRNA utilizing interfering complementary MRNA
US4885248A (en) 1984-02-15 1989-12-05 Lubrizol Genetics, Inc. Transfer vector
US4771002A (en) 1984-02-24 1988-09-13 Lubrizol Genetics, Inc. Transcription in plants and bacteria
US5149645A (en) 1984-06-04 1992-09-22 Rijksuniversiteit Leiden Process for introducing foreign DNA into the genome of plants
NL8401780A (nl) 1984-06-04 1986-01-02 Rijksuniversiteit Leiden En Pr Werkwijze voor het inbouwen van vreemd dna in het genoom van planten.
US4945050A (en) 1984-11-13 1990-07-31 Cornell Research Foundation, Inc. Method for transporting substances into living cells and tissues and apparatus therefor
US5036006A (en) 1984-11-13 1991-07-30 Cornell Research Foundation, Inc. Method for transporting substances into living cells and tissues and apparatus therefor
US5100792A (en) 1984-11-13 1992-03-31 Cornell Research Foundation, Inc. Method for transporting substances into living cells and tissues
DE3587548T2 (de) 1984-12-28 1993-12-23 Bayer Ag Rekombinante DNA, die in pflanzliche Zellen eingebracht werden kann.
US4943674A (en) 1987-05-26 1990-07-24 Calgene, Inc. Fruit specific transcriptional factors
US6281410B1 (en) 1986-07-31 2001-08-28 Calgene Llc Methods and compositions for regulated transcription and expression of heterologous genes
US5753475A (en) 1985-01-17 1998-05-19 Calgene, Inc. Methods and compositions for regulated transcription and expression of heterologous genes
US6617496B1 (en) 1985-10-16 2003-09-09 Monsanto Company Effecting virus resistance in plants through the use of negative strand RNAs
NL8502948A (nl) 1985-10-29 1987-05-18 Rijksuniversiteit Leiden En Pr Werkwijze voor het inbouwen van "vreemd dna" in het genoom van dicotyle planten.
US4795855A (en) 1985-11-14 1989-01-03 Joanne Fillatti Transformation and foreign gene expression with woody species
GB8529851D0 (en) 1985-12-04 1986-01-15 Rothmans Of Pall Mall Linear layered cigarette
IL81737A (en) 1986-03-28 1992-11-15 Calgene Inc Regulation of gene expression in plant cells
US5453566A (en) 1986-03-28 1995-09-26 Calgene, Inc. Antisense regulation of gene expression in plant/cells
US5107065A (en) 1986-03-28 1992-04-21 Calgene, Inc. Anti-sense regulation of gene expression in plant cells
US4699158A (en) 1986-04-17 1987-10-13 Philip Morris Incorporated Adjustable filter cigarette with tactile indicator
US4700725A (en) 1986-04-17 1987-10-20 Philip Morris Incorporated Adjustable filter cigarette
EP0242418B1 (de) 1986-04-23 1989-01-04 R.J. Reynolds Tobacco GmbH Verfahren zur Behandlung von Tabak und ähnlichen organischen Materialien
US4766911A (en) 1986-06-23 1988-08-30 R. J. Reynolds Tobacco Company Method for tracing smoking articles
US4962028A (en) 1986-07-09 1990-10-09 Dna Plant Technology Corporation Plant promotors
US5229292A (en) 1986-07-28 1993-07-20 Stine Seed Farm, Inc. Biological control of insects using pseudomonas strains transformed with bacillus thuringiensis insect toxingene
EP0265556A1 (en) 1986-10-31 1988-05-04 Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. Stable binary agrobacterium vectors and their use
US5268463A (en) 1986-11-11 1993-12-07 Jefferson Richard A Plant promoter α-glucuronidase gene construct
US5015580A (en) 1987-07-29 1991-05-14 Agracetus Particle-mediated transformation of soybean plants and lines
US4966916A (en) 1987-02-12 1990-10-30 Abood Leo G Agonists and antagonists to nicotine as smoking deterrents
US4835162A (en) 1987-02-12 1989-05-30 Abood Leo G Agonists and antagonists to nicotine as smoking deterents
US5356799A (en) 1988-02-03 1994-10-18 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Antisense gene systems of pollination control for hybrid seed production
US5922602A (en) 1988-02-26 1999-07-13 Biosource Technologies, Inc. Cytoplasmic inhibition of gene expression
US5179022A (en) 1988-02-29 1993-01-12 E. I. Du Pont De Nemours & Co. Biolistic apparatus for delivering substances into cells and tissues in a non-lethal manner
US4954442A (en) 1988-08-31 1990-09-04 Purdue Research Foundation Opine enhancement of vir gene induction
US5023179A (en) 1988-11-14 1991-06-11 Eric Lam Promoter enhancer element for gene expression in plant roots
GB8827592D0 (en) 1988-11-25 1988-12-29 Taniguchi T Improvements in & relating to regulation of expression
US5223419A (en) 1989-03-14 1993-06-29 The Rockefeller University Alteration of gene expression in plants
US4990607A (en) 1989-03-14 1991-02-05 The Rockefeller University Alteration of gene expression in plants
US5231020A (en) 1989-03-30 1993-07-27 Dna Plant Technology Corporation Genetic engineering of novel plant phenotypes
US5034323A (en) 1989-03-30 1991-07-23 Dna Plant Technology Corporation Genetic engineering of novel plant phenotypes
GB8916213D0 (en) 1989-07-14 1989-08-31 Ici Plc Dna constructs,cells and plants derived therefrom
US5665543A (en) 1989-07-18 1997-09-09 Oncogene Science, Inc. Method of discovering chemicals capable of functioning as gene expression modulators
JPH04506902A (ja) 1989-07-18 1992-12-03 オンコジーン・サイエンス・インコーポレイテッド 遺伝子発現の転写変調方法及び遺伝子発現モジュレーターとして作用できる化学物質の検出方法
US5776502A (en) 1989-07-18 1998-07-07 Oncogene Science, Inc. Methods of transcriptionally modulating gene expression
US6203976B1 (en) 1989-07-18 2001-03-20 Osi Pharmaceuticals, Inc. Methods of preparing compositions comprising chemicals capable of transcriptional modulation
US5580722A (en) 1989-07-18 1996-12-03 Oncogene Science, Inc. Methods of determining chemicals that modulate transcriptionally expression of genes associated with cardiovascular disease
US5501967A (en) 1989-07-26 1996-03-26 Mogen International, N.V./Rijksuniversiteit Te Leiden Process for the site-directed integration of DNA into the genome of plants
US5097025A (en) 1989-08-01 1992-03-17 The Rockefeller University Plant promoters
US5062434A (en) 1989-09-22 1991-11-05 Brown & Williamson Tobacco Corporation Cigarette paper
GB8923716D0 (en) 1989-10-20 1989-12-06 Ici Plc Dna,constructs,cells and plants derived therefrom
US5177308A (en) 1989-11-29 1993-01-05 Agracetus Insecticidal toxins in plants
DE59009881D1 (de) 1989-12-19 1995-12-21 Ciba Geigy Ag Verfahren und Vorrichtung zur genetischen Transformation von Zellen.
JPH0673478B2 (ja) * 1990-01-11 1994-09-21 旭化成工業株式会社 Ｌ―カルニチンの高感度測定法および測定用組成物
CA2036935A1 (en) 1990-02-26 1991-08-27 Paul Christou Plant transformation process with early identification of germ line transformation events
US5109876A (en) 1990-04-19 1992-05-05 R. J. Reynolds Tobacco Company Cigarette paper and cigarette incorporating same
US5204253A (en) 1990-05-29 1993-04-20 E. I. Du Pont De Nemours And Company Method and apparatus for introducing biological substances into living cells
US5260205A (en) 1990-11-14 1993-11-09 Philip Morris Incorporated Method of purifying putrescine N-methyltransferase from tobacco plant extract with a polyamine
US5668295A (en) 1990-11-14 1997-09-16 Philip Morris Incorporated Protein involved in nicotine synthesis, DNA encoding, and use of sense and antisense DNAs corresponding thereto to affect nicotine content in transgenic tobacco cells and plants
US5932782A (en) 1990-11-14 1999-08-03 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Plant transformation method using agrobacterium species adhered to microprojectiles
US5035252A (en) 1990-12-14 1991-07-30 Mondre Steven J Nicotine-containing dental floss
US5459252A (en) 1991-01-31 1995-10-17 North Carolina State University Root specific gene promoter
JPH04265569A (ja) * 1991-02-19 1992-09-21 Canon Inc 音声信号記録装置及び再生装置
US5683985A (en) 1991-04-18 1997-11-04 The Salk Institute For Biological Studies Oligonucleotide decoys and methods relating thereto
GB9109063D0 (en) 1991-04-26 1991-06-12 Ici Plc Modification of lignin synthesis in plants
EP0593618B1 (en) 1991-06-27 1998-04-22 Genelabs Technologies, Inc. Screening assay for the detection of dna-binding molecules
GB9304200D0 (en) 1993-03-02 1993-04-21 Sandoz Ltd Improvements in or relating to organic compounds
US5994629A (en) 1991-08-28 1999-11-30 Novartis Ag Positive selection
WO1993005646A1 (en) * 1991-09-13 1993-04-01 Technology Management Services, S.A. Reduction of nicotine levels in tobacco
DE69330227T2 (de) 1992-02-26 2001-10-25 Zeneca Mogen B V Zur ortsspezifischen rekomination fähige agrobakterium stämme
US5780051A (en) 1992-04-02 1998-07-14 Dynagen, Inc. Methods and articles of manufacture for nicotine cessation and monitoring nicotine use
JP3660354B2 (ja) 1992-04-02 2005-06-15 セムバイオシス ジェネティクス インコーポレイテッド 調節シグナルとしてのオイルボディタンパク質シスエレメント
US5626152A (en) 1992-08-26 1997-05-06 Molins Plc Cigarette making machine
US5469871A (en) 1992-09-17 1995-11-28 R. J. Reynolds Tobacco Company Cigarette and method of making same
JPH08506909A (ja) 1992-11-27 1996-07-23 ボクセル ホログラムを形成する方法および装置
WO1994012015A1 (en) 1992-11-30 1994-06-09 Chua Nam Hai Expression motifs that confer tissue- and developmental-specific expression in plants
IL108367A0 (en) 1993-01-27 1994-04-12 Hektoen Inst For Medical Resea Antisense polynzcleotide inhibition of human growth factor-sensitive cancer cells
ATE203772T1 (de) 1993-05-13 2001-08-15 Aventis Cropscience Nv Markiergen
WO1994028142A1 (en) * 1993-06-01 1994-12-08 Philip Morris Products Inc. Putrescine n-methyltransferase, recombinant dna molecules encoding putrescine n-methyltransferase, and transgenic tobacco plants with decreased alkaloid content
US5540242A (en) 1993-07-07 1996-07-30 Brown & Williamson Tobacco Corporation Cigarette paper having reduced sidestream properties
US5377697A (en) 1993-08-27 1995-01-03 Hoechst Celanese Corporation Cigarette filter test apparatus and associated method for measuring filter hot collapse and tobacco consumption
US5810020A (en) 1993-09-07 1998-09-22 Osmotek, Inc. Process for removing nitrogen-containing anions and tobacco-specific nitrosamines from tobacco products
ES2287933T3 (es) 1993-12-08 2007-12-16 Japan Tobacco Inc. Procedimiento de transformacion de plantas y vector para ello.
US5394894A (en) 1994-02-22 1995-03-07 Zade; Ismail Y. Method and apparatus for elimination of smoking
US5858774A (en) 1994-05-12 1999-01-12 The Research Foundation Of State University Of New York Antisense DNA constructs for expression of hybrid MRNAs driven by inducible, tissue-specific promoters
ES2081257B1 (es) 1994-05-12 1996-07-16 Sagrera Jorge Martinez Instalacion y procedimiento para el curado de tabaco.
JP3235934B2 (ja) 1994-08-04 2001-12-04 三菱レイヨン株式会社 ロドコッカス属細菌由来カナマイシン耐性遺伝子
IT1275697B1 (it) * 1994-12-20 1997-10-17 Olmo Giancarlo Dell Metodo per stampare direttamente su carta microincisioni di ologrammi,chinogrammi,reticoli di diffrazione o microincisioni
AU5001496A (en) 1995-03-22 1996-10-08 Novo Nordisk A/S Introduction of dna into bacillus strains by conjugation
KR100424844B1 (ko) 1995-03-30 2004-07-05 다카라 홀딩즈 가부시키가이샤 식물프로모터 및 이 프로모터를사용한 유전자 발현방법
PT824918E (pt) 1995-05-12 2007-06-22 Anges Mg Inc Tratamento e prevenção para doenças causadas pelo nf-kb
US5837876A (en) 1995-07-28 1998-11-17 North Carolina State University Root cortex specific gene promoter
GB9517263D0 (en) 1995-08-23 1995-10-25 Cancer Res Campaign Tech Expression systems
US6051409A (en) 1995-09-25 2000-04-18 Novartis Finance Corporation Method for achieving integration of exogenous DNA delivered by non-biological means to plant cells
US6198827B1 (en) * 1995-12-26 2001-03-06 Rocktron Corporation 5-2-5 Matrix system
US5693512A (en) 1996-03-01 1997-12-02 The Ohio State Research Foundation Method for transforming plant tissue by sonication
US5851804A (en) 1996-05-06 1998-12-22 Apollon, Inc. Chimeric kanamycin resistance gene
US5713376A (en) 1996-05-13 1998-02-03 Berger; Carl Non-addictive tobacco products
US6022863A (en) 1996-05-21 2000-02-08 Yale University Regulation of gene expression
US5834236A (en) * 1996-06-27 1998-11-10 The Salk Institute For Biological Studies AATT repeat transcription enhancer element
US6135121A (en) * 1996-06-28 2000-10-24 Regent Court Technologies Tobacco products having reduced nitrosamine content
US5845647A (en) 1996-06-28 1998-12-08 Regent Court Technologies Tobacco and related products
US5803081A (en) 1996-06-28 1998-09-08 Regent Court Technologies Tobacco and related products
USRE38123E1 (en) * 1996-06-28 2003-05-27 Regent Court Technologies, Llc. Tobacco products having reduced nitrosamine content
US5830318A (en) 1996-10-25 1998-11-03 Schweitzer-Mauduit International, Inc. High opacity tipping paper
US5929306A (en) 1996-11-15 1999-07-27 University Of Kentucky Research Foundation KYRT1, a disarmed version of a highly tumorigenic Agrobacterium tumefaciens strain identified as Chry5
US6202649B1 (en) * 1996-12-02 2001-03-20 Regent Court Technologies Method of treating tobacco to reduce nitrosamine content, and products produced thereby
US6166032A (en) * 1997-02-07 2000-12-26 Synapse Pharmaceuticals International, Inc. Method for controlling tobacco use and alleviating withdrawal symptoms due to cessation of tobacco use
ES1036967Y (es) * 1997-04-15 1998-05-01 Techpack Espana S L Cazoleta perfeccionada para estuche de lapiz de labios.
US6163521A (en) * 1997-04-16 2000-12-19 Matsushita Electric Industrial Co., Ltd. Disk having read-only and read-write areas
US6020989A (en) * 1997-05-14 2000-02-01 Affinity Co., Ltd. Laminated bodies and windows using them
US6586661B1 (en) * 1997-06-12 2003-07-01 North Carolina State University Regulation of quinolate phosphoribosyl transferase expression by transformation with a tobacco quinolate phosphoribosyl transferase nucleic acid
US6020969A (en) * 1997-07-11 2000-02-01 Philip Morris Incorporated Cigarette making machine including band inspection
CA2248622A1 (en) 1997-09-23 1999-03-23 Joe Celeste Biolistic apparatus for delivering substances into cells and tissues
JP2001518520A (ja) * 1997-10-03 2001-10-16 キャリー メディカル コーポレイション ニコチンレセプターアンタゴニストおよび抗抑うつ薬または抗不安薬を含有するニコチン嗜癖を治療する組成物
US6077992A (en) 1997-10-24 2000-06-20 E. I. Du Pont De Nemours And Company Binary viral expression system in plants
US6060310A (en) * 1997-11-24 2000-05-09 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Transcription factor decoy and tumor growth inhibitor
US6153811A (en) 1997-12-22 2000-11-28 Dekalb Genetics Corporation Method for reduction of transgene copy number
WO1999043704A1 (en) * 1998-02-27 1999-09-02 The Regents Of The University Of California A NOVEL INHIBITOR OF THE INFLAMMATORY RESPONSE INDUCED BY TNFα AND IL-1
JP3444191B2 (ja) * 1998-03-31 2003-09-08 日本製紙株式会社 フェニルプロパノイド生合成経路を制御する転写因子
CN1202246C (zh) 1998-04-08 2005-05-18 联邦科学和工业研究组织 获得修饰表型的方法和措施
US6136799A (en) 1998-04-08 2000-10-24 Abbott Laboratories Cosolvent formulations
US5938017A (en) * 1998-05-04 1999-08-17 Wik; Dennis O. Article for assisting persons to quit smoking and method for same
EP1083913A4 (en) * 1998-06-05 2004-03-17 Regent Court Technologies MONOAMINE OXIDASE (MAO) INHIBITORS AND USES THEREOF
US6271031B1 (en) 1998-08-12 2001-08-07 E.I. Du Pont De Nemours And Company Quinolinate metabolism enzymes
ATE313635T1 (de) * 1998-10-01 2006-01-15 Pioneer Hi Bred Int Methode zur pflanzentransformation
DE19847767A1 (de) * 1998-10-16 2000-04-20 Decoufle Sarl Anordnung zum Zuführen von fließfähiger Druckfarbe zu einem Druckwerk für einen Zigarettenpapierstreifen
AU4991500A (en) 1999-05-06 2000-11-21 Michael Timko Regulation of gene expression in tobacco for manipulation of plant growth and secondary metabolism
US6314964B1 (en) * 1999-09-15 2001-11-13 Schweitzer-Mauduit International, Inc. Cigarette paper containing carbon fibers for improved ash characteristics
ATE538205T1 (de) 1999-11-29 2012-01-15 Midwest Oilseeds Inc Verfahren, medien und vorrichtung zur einführung von molekülen in pflanzenzellen und bakterien mittels aerosolstrahlen
WO2001051630A1 (en) 2000-01-07 2001-07-19 Baylor University Antisense compositions and methods
EP1272630A2 (en) 2000-03-16 2003-01-08 Genetica, Inc. Methods and compositions for rna interference
AU2001253255A1 (en) 2000-04-07 2001-10-23 Large Scale Biology Corporation Compositions and methods for inhibiting gene expression
JP2004507250A (ja) 2000-08-30 2004-03-11 ノース・キャロライナ・ステイト・ユニヴァーシティ タンパク質含量を変化させる分子デコイを含有するトランスジェニック植物
US7189570B2 (en) * 2000-11-07 2007-03-13 North Carolina State University Putrescine-n-methyltransferase promoter
EA200400005A1 (ru) 2001-06-06 2004-08-26 22 Сенчури Лимитед, Ллс Утилизация табачной биомассы
SG132542A1 (en) * 2001-06-08 2007-06-28 Vector Tobacco Ltd Modifying nicotine and nitrosamine levels in tobacco
US20060157072A1 (en) * 2001-06-08 2006-07-20 Anthony Albino Method of reducing the harmful effects of orally or transdermally delivered nicotine
US6557560B2 (en) * 2001-06-18 2003-05-06 Ctc Canada Inc. Cigarette making machine
KR101672423B1 (ko) 2005-02-28 2016-11-03 22엔디 센츄리 리미티드, 엘엘씨 식물의 니코틴 알칼로이드 수준의 감소
CN104894158B (zh) 2006-06-19 2018-05-25 22世纪有限责任公司 编码n-甲基腐胺氧化酶之核酸及其应用
BRPI0717355B1 (pt) 2006-10-13 2018-01-16 North Carolina State University Método para obtenção de uma planta transgênica de nicotina, método para obtenção de uma semente; construto de ácido nucléico recombinante; método de redução da conversão de nicotina em nornicotina em uma planta de nicotina

Also Published As

Publication number Publication date
KR20010013663A (ko) 2001-02-26
US20060191036A1 (en) 2006-08-24
GR20010300003T1 (en) 2001-06-29
HUP0003767A2 (hu) 2001-02-28
EA200400186A1 (ru) 2004-08-26
CA2484366A1 (en) 1998-12-17
LT99142A (en) 2000-06-26
YU64899A (sh) 2004-12-31
CZ367799A3 (cs) 2000-04-12
US7304220B2 (en) 2007-12-04
KR100365969B1 (ko) 2002-12-26
US20030140366A1 (en) 2003-07-24
CA2287776A1 (en) 1998-12-17
JP4095678B2 (ja) 2008-06-04
US7605308B2 (en) 2009-10-20
CN1304576C (zh) 2007-03-14
NZ500963A (en) 2001-09-28
IL132184A (en) 2010-11-30
EA200000007A1 (ru) 2000-06-26
ES2154624T1 (es) 2001-04-16
NO996169L (no) 1999-12-13
US6586661B1 (en) 2003-07-01
US7795509B2 (en) 2010-09-14
EE04595B1 (et) 2006-02-15
UA72187C2 (uk) 2005-02-15
ATE262039T1 (de) 2004-04-15
SI20215A (sl) 2000-10-31
LT4706B (lt) 2000-09-25
EP0991766B1 (en) 2004-03-17
SK161899A3 (en) 2000-06-12
BG103886A (en) 2000-07-31
US6423520B1 (en) 2002-07-23
CZ297379B6 (cs) 2006-11-15
AU7829198A (en) 1998-12-30
HK1069411A1 (en) 2005-05-20
US7408098B2 (en) 2008-08-05
JP2001522250A (ja) 2001-11-13
US7645925B2 (en) 2010-01-12
ID29311A (id) 2001-08-16
RS49677B (sr) 2007-11-15
US20040168211A1 (en) 2004-08-26
DE991766T1 (de) 2002-04-04
US20060191035A1 (en) 2006-08-24
NO324872B1 (no) 2007-12-17
LV12507B (en) 2000-11-20
BRPI9810870B1 (pt) 2021-06-01
CU23174A3 (es) 2006-09-22
JP4459271B2 (ja) 2010-04-28
HK1027379A1 (en) 2001-01-12
AP1169A (en) 2003-06-30
DK0991766T3 (da) 2004-07-12
EE9900575A (et) 2000-08-15
BG64319B1 (bg) 2004-09-30
US7425670B2 (en) 2008-09-16
SI20215B (sl) 2007-04-30
CN100482799C (zh) 2009-04-29
JP2008131950A (ja) 2008-06-12
US20070011774A1 (en) 2007-01-11
EA004652B1 (ru) 2004-06-24
DE69822463D1 (de) 2004-04-22
EP1457563B1 (en) 2012-08-08
US20060200872A1 (en) 2006-09-07
IL132184A0 (en) 2001-03-19
AP9901680A0 (en) 1999-12-31
OA11219A (en) 2003-07-17
US20020108151A1 (en) 2002-08-08
AU748514B2 (en) 2002-06-06
EA009898B1 (ru) 2008-04-28
CN1257542A (zh) 2000-06-21
CN1618972A (zh) 2005-05-25
RO121968B1 (ro) 2008-09-30
WO1998056923A1 (en) 1998-12-17
DE69822463T2 (de) 2005-01-20
HUP0003767A3 (en) 2002-10-28
PL337442A1 (en) 2000-08-14
IL192232A0 (en) 2008-12-29
EP1457562B1 (en) 2012-08-08
EP0991766A1 (en) 2000-04-12
JP2004290201A (ja) 2004-10-21
GEP20032871B (en) 2003-01-27
CA2287776C (en) 2012-04-03
JP2009112316A (ja) 2009-05-28
PT991766E (pt) 2004-08-31
HK1065066A1 (en) 2005-02-08
LV12507A (en) 2000-06-20
NO996169D0 (no) 1999-12-13
PL201266B1 (pl) 2009-03-31
EP1457563A1 (en) 2004-09-15
ES2154624T3 (es) 2004-11-01
BR9810870A (pt) 2000-11-14
TR199902728T2 (xx) 2000-09-21
EP1457562A1 (en) 2004-09-15
JP4288206B2 (ja) 2009-07-01

Similar Documents

Publication Publication Date Title
AP1169A (en) Regulation of quinolate phosphoribosyl transferase expression.
AU2002300895B2 (en) Regulation of quinolate phosphoribosyl transferase expression
AU2004203879B2 (en) Regulation of quinolate phosphoribosyl transferase expression
MXPA99011625A (en) Regulation of quinolate phosphoribosyl transferase expression

Legal Events

Date Code Title Description
TH4A Erratum