RO121968B1 - Reglarea exprimării chinolat fosforibozil transferazei - Google Patents

Reglarea exprimării chinolat fosforibozil transferazei Download PDF

Info

Publication number
RO121968B1
RO121968B1 RO99-01306A RO9901306A RO121968B1 RO 121968 B1 RO121968 B1 RO 121968B1 RO 9901306 A RO9901306 A RO 9901306A RO 121968 B1 RO121968 B1 RO 121968B1
Authority
RO
Romania
Prior art keywords
plant
dna
sequence
plant cell
phosphoribosyl transferase
Prior art date
Application number
RO99-01306A
Other languages
English (en)
Inventor
Mark A. Conkling
Nandini Mendu
Wen Song
Original Assignee
North Carolina State University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=21960004&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=RO121968(B1) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by North Carolina State University filed Critical North Carolina State University
Publication of RO121968B1 publication Critical patent/RO121968B1/ro

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/1048—Glycosyltransferases (2.4)
    • C12N9/1077—Pentosyltransferases (2.4.2)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01H—NEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
    • A01H5/00—Angiosperms, i.e. flowering plants, characterised by their plant parts; Angiosperms characterised otherwise than by their botanic taxonomy
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8242—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits
    • C12N15/8243—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits involving biosynthetic or metabolic pathways, i.e. metabolic engineering, e.g. nicotine, caffeine

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Nutrition Science (AREA)
  • Physiology (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Manufacture Of Tobacco Products (AREA)

Abstract

Invenţia se referă la o moleculă izolată ADN,care codifică o enzimă chinolat fosforibozil transferază vegetală, precum ?i la construcţi care cuprind molecula de ADN menţionată. Invenţiase mai referă la procedee de modificare a expresiei chinolat fosforibozil transferazei.

Description

Această invenție se referă la chinolat fosforibozil transferaza vegetală (QPRT-aza) și la ADN-ul care codifică această enzimă. în particular, această invenție se referă la utilizarea ADN-ului care codifică chinolat fosforibozil transferaza în scopul obținerii de plante transgenice având nivele de nicotină modificate genetic, și la plantele astfel obținute.
Datorită unor considerente legate de natura vicioasă (generatoare de dependență) a nicotinei, producerea unui tutun cu un conținut redus de nicotină prezintă un deosebit interes. în plus, plantele de tutun cu nivele extrem de scăzute ale producerii de nicotină, sau fără producere de nicotină, sunt atractive ca primitori pentru transgenele care exprimă produse cu valoare comercială, cum ar fi: produsele farmaceutice, componentele cosmetice, sau aditivii alimentari. Pentru îndepărtarea nicotinei din tutun au fost concepute diverse procedee. Cu toate acestea, cea mai mare parte a acestor procedee îndepărtează și alte ingrediente din tutun, în afara nicotinei, prin aceasta fiind afectat tutunul. Prin tehnicile clasice de regenerare a plantelor s-au obținut plante de tutun cu conținuturi mai scăzute de nicotină (aproximativ 8%) față de cele care se găsesc în plantele de tutun de tip sălbatic. Sunt de dorit plante de tutun și tutun având reduceri suplimentare ale conținutului de nicotină.
O abordare în scopul reducerii nivelului unui produs biologic este aceea de a reduce cantitatea unei enzime necesare din calea de biosinteză care duce la acel produs. Dacă enzima afectată se găsește, în mod natural, într-o cantitate limitativă de viteză (față de alte enzime necesare din calea de biosinteză), orice diminuare a abundenței acestei enzime va conduce la scăderea producerii produsului final. Dacă cantitatea enzimei nu este, în mod normal, limitativă de viteză, prezența sa într-o celulă trebuie să fie redusă la nivele limitative de viteză, în scopul diminuării randamentului căii. în schimb, dacă cantitatea de enzimă existentă în mod natural este limitativă de viteză, atunci orice creștere a activității enzimatice va avea ca rezultat o creștere a produsului final al căii de biosinteză.
în principiu, nicotină se formează în rădăcinile plantei de tutun și este transportată ulterior spre frunze, unde este depozitată (Tso, Physiology and Biochemistry of Tobacco Plants, pp. 233 - 234, Dowden, Hutchinson & Ross, Stroudsburg, Pa (1972)). O etapă obligatorie în biosinteză nicotinei este formarea acidului nicotinic din acid chinolinic, etapă care este catalizată de enzima chinolin fosforibozil transferaza (QPRT-aza). QPRT-aza pare să fie o enzimă limitativă de viteză din calea de alimentare cu acid nicotinic pentru sinteza nicotinei în tutun. A se vedea, spre exemplu: Feth și colab., “Regulation in Tobacco Callus of Enzyme Activities of the Nicotine Pathway”, Planta, 168, pp. 402 - 407 (1986); Wagner și colab., “The Regulation of Enzyme Activities of the Nicotine Pathway in Tobacco’1, Physiol. Plant, 68, pp. 667 - 672 (1986). Modificarea conținutului de nicotină din plantele de tutun prin reglarea antisens a expresiei metil transferazei de putrefacție (PMT-aza) a fost propusă în brevetele US5369023 și US5260205 de către Nakatani și Malik. Cererea PCT WO 94/28142 a lui Wahad și Malik descrie ADN-ul care codifică PMT și utilizarea construcților PMT sens și antisens.
Invenția se referă la o moleculă izolată de ADN care cuprinde o secvență selecționată din grupul de secvențe alcătuit din:
- secvența SECV. ID Nr.:1;
- secvențe de ADN care codifică o enzimă având secvența de aminoacizi din SECV. ID Nr.:2;
- secvențe de ADN care au cel puțin omologie de 65% cu ADN-ul izolat de la punctele a) și b) și care codifică pentru o enzimă chinolat fosforibozil transferaza; și
- secvențe de ADN care diferă de secvențele ADN de la punctele a), b) sau c) de mai sus, datorită degenerării codului genetic și care codifică pentru o enzimă chinolat fosforibozil transferaza.
RO 121968 Β1
Invenția se mai referă la un construct ADN, care cuprinde, în direcția 5-3’ un pro- 1 motor funcțional într-o celulă vegetală și o secvență de ADN cuprinzând o secvență codificatoare a chinolatfosforibozil transferazei de tipul celei menționate anterior, poziționată 3 în aval față de promotor și asociată funcțional cu acesta.
într-o altă variantă a invenției, constructul ADN cuprinde în direcția 5'-3' un promotor 5 vegetal și o secvență de ADN cuprinzând o secvență codificatoare a chinolat fosforibozil transferazei de tipul celei menționate anterior, poziționată în aval față de promotor și asociată 7 funcțional cu acesta, secvența ADN respectivă fiind în orientare antisens.
Un obiect al invenției îl reprezintă o celulă de plantă care cuprinde unul din 9 constructele ADN menționate anterior.
Un alt obiect al invenției îl constituie o plantă transgenică care cuprinde celulele de 11 plante amintite.
De asemenea, invenția se referă la o peptidă care cuprinde secvența de aminoacizi 13 din SECV. ID Nr.: 2.
Invenția se mai referă la un procedeu de obținere a unei celule vegetale transgenice 15 cu o expresie diminuată a chinolat fosforibozil transferazei care cuprinde:
- furnizarea unei celule de plantă de un tip cunoscut care să exprime chinolat 17 fosforibozil transferaza,
- furnizarea unui construct ADN exogen, care cuprinde, în direcția 5-3' un promotor 19 funcțional într-o celulă vegetală și o secvență heteroloagă de ADN care conține o porțiune a secvenței care codifică ARNm al chinolat fosforibozil transferazei și este selectat din 21 secvențele ADN definite anterior, secvența heteroloagă de ADN fiind asociată funcțional cu promotorul, și 23
- transformarea celulei vegetale respective cu constructul ADN menționat, pentru a produce celule transformate, celula vegetală transformată amintită având o expresie 25 diminuată a QPRT-azei comparativ cu o celulă de plantă netransformată, și ADN-ul heterolog cuprinzând cel puțin 25 de nucleotide din secvența de ADN definită anterior. 27
Un alt obiect al invenției este o plantă transgenică din genul Nicotiana având diminuată expresia chinolatfosforibozil transferazei comparativ cu o plantă de control netrans- 29 formată, care cuprinde celule de plantă transgenică care conțin:
- un construct ADN exogen care cuprinde, în direcția 5'-3', un promotor funcțional în 31 celula vegetală menționată și o secvență ADN heteroloagă care cuprinde un segment al unei secvențe ADN ce codifică un ARNm al chinolatfosforibozil transferazei vegetale, selectat din 33 secvențele ADN amintite, ADN-ul respectiv fiind asociat funcțional cu promotorul;
- planta prezentând o expresie redusă a chinolat fosforibozil transferazei comparativ 35 cu o plantă martor netransformată, și ADN-ul heterolog cuprinzând cel puțin 25 de nucleotide ale unei secvențe ADN de tipul celei menționate. 37
Invenția se referă și la un descendent al plantei transgenice amintite.
Un obiect al invenției îl reprezintă și un procedeu de reducere a expresiei genei 39 pentru chinolat fosforibozil transferaza într-o celulă vegetală, care cuprinde:
- creșterea unei celule vegetale transformate să conțină o secvență heteroloagă de 41
ADN selectată din secvențele ADN menționate mai sus, în care o catenă transcrisă a respectivei secvențe heteroloage de ADN este complementară cu ARNm pentru chinolat 43 fosforibozil transferaza endogen la celula menționată, în care transcrierea respectivei catene complementare reduce expresia genei chinolat fosforibozil transferazei. 45
Invenția se mai referă la un procedeu de obținere a unei plante de tutun cu nivele scăzute de nicotină în frunze care cuprinde: 47
RO 121968 Β1
- creșterea unei plante de tutun sau a unui descendent al acesteia, în care respectiva plantă cuprinde celulele conținând un construct ADN exogen, cuprinzând o regiune de inițiere a transcrierii, funcțională în planta menționată și o secvență de ADN heteroloagă, selectată din secvențele ADN conform invenției, legate funcțional la regiunea de inițiere a transcrierii, în care catena transcrisă a secvenței heteroloage de ADN menționată este complementară cu ARNm endogen pentru chinolat fosforibozil transferază în celulele respective.
De asemenea, invenția se mai referă la un procedeu de obținere a unei celule de plantă transgenică cu nivel crescut al expresiei chinolat fosforibozil transferazei, care cuprinde:
- furnizarea unei celule de plantă de un tip cunoscut pentru a exprima chinolat fosforibozil transferaza,
-furnizarea unui construct ADN exogen, care să conțină, în direcția 5’-3', un promotor funcțional într-o celulă vegetală și o secvență ADN heteroloagă care codifică pentru chinolat fosforibozil transferaza și este selectată din secvențele ADN conform invenției, secvența de ADN heteroloagă fiind asociată funcțional cu promotorul;
-transformarea celulei vegetale respective cu constructul de ADN menționat pentru a produce o celulă vegetală transformată, celula vegetală transformată având o expresie crescută a chinolat fosforibozil transferazei comparativ cu o celulă vegetală netransformată.
Un obiect al invenției îl reprezintă și o plantă transgenică din genul Nicotiana având o expresie crescută a chinolat fosforibozil transferazei comparativ cu o plantă martor netransformată care cuprinde celule de plantă transgenică care conțin:
- un construct ADN exogen care cuprinde, în direcția 5’-3’, un promotor funcțional în celula vegetală amintită și o secvență ADN heteroloagă care codifică o chinolat fosforibozil transferază vegetală selectată dintre secvențele ADN conform invenției, ADN-ul heterolog fiind funcțional asociat cu promotorul;
- planta având o expresie crescută a chinolat fosforibozil transferazei și, prin urmare, nivele crescute de nicotină în frunze, față de o plantă martor netransformată, precum și descendeți ai acesteia.
Invenția se mai referă la un procedeu pentru creșterea expresiei genei chinolat fosforibozil transferazei într-o celulă de plantă care cuprinde:
- creșterea unei celulele vegetale transformată pentru a conține un ADN exogen selectat dintre secvențele de ADN conform invenției, în care ADN-ul exogen codifică pentru chinolat fosforibozil transferază.
Un alt obiect al invenției îl reprezintă un procedeu de obținere a unei plante de tutun cu nivele crescute de nicotină în frunze care cuprinde:
- creșterea unei plante de tutun sau a unui descendent al acesteia, în care planta menționată cuprinde celule conținând un construct ADN exogen cuprinzând o transcriere funcțională a regiunii de inițiere în planta amintită și o secvență heteroloagă de ADN, selectată dintre secvențele ADN conform invenției, legate funcțional la regiunea de inițiere a transcrierii menționată, în care numita secvență heteroloagă de ADN codifică pentru chinolat fosforibozil transferaza funcțională în celulele respective.
Invenția se mai referă și la utilizările celulelor de plantă de tutun conform invenției, pentru fabricarea unui produs de tutun cu un conținut modificat de nicotină.
Un prim aspect al prezentei invenții îl constituie o moleculă de ADN izolată conținând: SECV ID NR: 1; secvențe de ADN care codifică o enzima având SECV ID NR: 2; secvențe de ADN care hibridizează cu un astfel de ADN și care codifică o enzimă - chinolat fosforibozil
RO 121968 Β1 transferaza; și secvențe de ADN care diferă de ADN-ul de mai sus datorită degenerării 1 codului genetic. O peptidă codificată de un asemenea ADN reprezintă un alt aspect al acestei invenții. 3
Un alt aspect al prezentei invenții îl reprezintă un construct ADN conținând un promotor operabil într-o celulă vegetală și un segment de ADN care codifică o enzimă - chinolat 5 fosforibozil transferaza, poziționat în aval de promotor și asociat în mod operativ cu acesta.
ADN-ul care codifică enzima poate fi în direcția antisens sau sens. 7
Un alt aspect al prezentei invenții îl reprezintă un procedeu de obținere a unei celule vegetale transgenice cu o expresie redusă a chinolat fosforibozil transferazei (QPRT-azei), 9 prin furnizarea unei celule vegetale de un tip cunoscut cu capacitatea de a exprima chinolat fosforibozil transferaza; transformarea celulei vegetale cu un construct de ADN exogen 11 conținând un promotor, și ADN-ul conținând o porțiune dintr-o secvență care codifică ARNm-ul pentru chinolat fosforibozil transferaza. 13 încă un aspect al prezentei invenții îl reprezintă o plantă transgenică din specia Nicotiana având o expresie redusă a chinolat fosforibozil transferazei (QPRT-azei), corn- 15 parativ cu o plantă martor netransformată. Celulele unor asemenea plante conțin un construct de ADN care include un segment dintr-o secvență de ADN care codifică un ARNm 17 corespunzător chinolat fosforibozil transferazei (QPRT-azei) vegetale.
Un alt aspect al prezentei invenții îl reprezintă un procedeu pentru reducerea 19 exprimării unei gene pentru chinolat fosforibozil transferaza într-o celulă vegetală, prin cultivarea unei celule vegetale transformate în sensul de a conține ADN-ul exogen, în care o ca- 21 tenă transcrisă a acestui ADN exogen este complementară ARNm-ului endogen, din celulă, corespunzător chinolatfosforibozil transferazei. Transcrierea catenei complementare reduce 23 exprimarea genei endogene pentru chinolat fosforibozil transferază.
încă un aspect al prezentei invenții este dat de un procedeu de obținere a unei plante 25 de tutun cu cantități reduse de nicotină în frunzele plantei de tutun, prin cultivarea unei plante de tutun cu celule care conțin o secvență dintr-un ADN exogen, în care o catenă transcrisă 27 a secvenței de ADN exogen este complementară cu ARNm-ul endogen corespunzător chinolat fosforibozil transferazei din celule. 29 încă un aspect al prezentei invenții îl constituie un procedeu de obținere a unei celule vegetale transgenice cu o expresie crescută a chinolatfosforibozil transferazei (QPRT-azei), 31 prin transformarea unei celule vegetale cunoscută drept producătoare de chinolat fosforibozil transferaza cu un construct de ADN exogen conținând o secvență de ADN care codifică 33 chinolat fosforibozil transferaza.
Un alt aspect al prezentei invenții este reprezentat de o plantă de Nicotiana 35 transgenică, având o exprimare (producere) sporită a chinolat fosforibozil transferazei (QPRT-azei), în care celulele plantei transgenice conțin o secvență de ADN exogen care 37 codifică o chinolat fosforibozil transferaza vegetală.
Un alt aspect al prezentei invenții îl constituie un procedeu de creștere a expresiei 39 unei gene pentru chinolat fosforibozil transferaza într-o celulă vegetală, prin cultivarea unei celule vegetale transformate în sensul de a conține ADN-ul exogen care codifică chinolat 41 fosforibozil transferaza.
încă un aspect al prezentei invenții îl reprezintă un procedeu de obținere a unei plante 43 de tutun având cantități ridicate de nicotină în frunze, prin cultivarea unei plante de tutun cu celule care conțin o secvență de ADN exogen care codifică chinolat fosforibozil transferaza 45 funcțională în celule.
Figuri. 47
- fig. 1 reprezintă calea de biosinteză care conduce la nicotină. Activitățile enzimatice cunoscute ca fiind reglate de genele Nici și Nic2 sunt QPRT-aza (chinolat fosforibozil 49 transferaza) și PMT-aza (metil transferaza de putrefacție).
RO 121968 Β1
- fig.2A furnizează secvența de acid nucleic a cADN-ului NtQPTI (SECV ID NR:1), împreună cu secvența codificatoare (SECV ID NR:3) reprezentate prin majuscule.
- fig.2B redă secvența dedusă a aminoacidului (SECV ID NR:2) corespunzător QPRT-azei din tutun, codificat de către gena cADN NtQPTI.
-fig.3 aliniază secvența dedusă de aminoacid a NtQPT 1 și secvențele asemănătoare din Rhodospirillum rubrum, Mycobacterium lepre, Salmonella typhimurium, Escherichia coli, umane, și Saccharomyces cerevisiae.
- fig.4 prezintă rezultatele complementarizării unui mutant de Escherichia coli căruia îi lipsește chinolat fosforibozil transferaza (TH265), cu gena cADN NtQPTI. Celulele au fost transformate cu un vector de expresie purtător al genei NtQPTI; cultivarea celulelor transformate TH265 care exprimă gena NtQPTI, pe mediu minimal lipsit de acid nicotinic, a demonstrat că gena NtQPTI codifică QPRT-aza.
- fig.5 compară nivelele de nicotină și nivelele relative staționare ale ARNm-ului corespunzător genei NtQPTI în mutantele de tutun: tipul sălbatic Burley 21 (Nici/Nici Nic2/Nic2); Nici - Burley 21 (nic1/nic 1 Nic2/Nic2); Nic2' Burley 21 (Nici/Nici nic2/nic2) și Burley 21 NicT și NicZ (nic1/nic1 nic2/nic2). Barele solide indică nivelele transcriptului ARNm; barele hașurate indică cantitățile de nicotină.
- fig.6 reprezintă grafic nivelele relative ale ARNm-ului corespunzător genei NtQPTI, în timp, în plantele de tutun superioare, comparativ cu plantele martor neperformante. Barele solide indică nivelele transcriptului ARNm; barele hașurate indică nivelele de nicotină.
Nicotină este produsă în plantele de tutun prin condensarea acidului nicotinic cu 4-metilaminobutanal. Calea de biosinteză care conduce la producerea nicotinei este ilustrată în fig. 1. Două locusuri reglatoare (Nici și Nic2) acționează ca reglatori co-dominanți ai producerii nicotinei. Analizele enzimatice ale rădăcinilor de la mutantele mono și dublu Nic arată că activitățile celor două enzime: chinolat fosforibozil transferaza (QPRT-aza) și metil transferază de putrefacție (PMT-aza), sunt direct proporționale cu nivelele de biosinteză a nicotinei. O comparație a activității enzimatice din țesuturile plantei de tutun (rădăcină și calus) cu diferite capacități de sinteză a nicotinei arată că activitatea QPRT-azei este strict corelată cu conținutul în nicotină (Wagner and Wagner, Planta 165:532 (1985)). Saunders și Bush (Plant Physiol. 64:236 (1979) au arătat că nivelul QPRT-azei din rădăcinile mutantelor cu conținuturi scăzute de nicotină este proporțional cu nivelele de nicotină din frunze.
Prezenta invenție cuprinde o nouă secvență a unui cADN (SECV ID NR:1) care codifică o chinolat fosforibozil transferază (QPRT-ază) vegetală având SECV ID NR:2. Cum activitatea QPRT-azei este strâns corelată cu conținutul de nicotină, construirea de plante transgenice de tutun în care nivelele QPRT-azei să fie scăzute în rădăcinile plantei (comparativ cu nivelele din plantele de tip sălbatic) duce la plante cu nivele reduse de nicotină în frunze. Prezenta invenție furnizează metode și constructe de acid nucleic pentru producerea unor asemenea plante transgenice, ca și astfel de plante transgenice. Asemenea metode includ exprimarea ARN-ului antisens pentru gena NtQPTI, prin aceasta reducându-se cantitatea de QPRT-ază din rădăcinile de tutun. Nicotină a mai fost descoperită și în alte specii și familii de plante decât tutunul, deși cantitatea prezentă este, de obicei, mult mai scăzută decât în Nicotiana tabacum.
Prezenta invenție mai prevede și molecule de ADN recombinant sens și antisens care codifică QPRT-aza sau molecule antisens de ARN corespunzător QPRT-azei, și vectori conținând acele molecule de ADN recombinant; precum și celule vegetale transgenice și plante transformate cu acele molecule de ADN și vectori. Celulele și plantele de tutun transgenice din prezenta invenție sunt caracterizate printr-un conținut mai scăzut sau mai ridicat de nicotină față de celulele și plantele de tutun martor, netransformate.
RO 121968 Β1
Plantele de tutun cu niveluri extrem de scăzute ale producerii de nicotină, sau fără 1 producere de nicotină, sunt atractive ca primitori pentru transgenele care exprimă produse valoroase din punct de vedere comercial cum ar fi: produsele farmaceutice, componentele 3 cosmetice sau aditivii alimentari. Tutunul este atractiv ca plantă gazdă pentru o transgenă care codifică un produs dorit, deoarece este ușor de manipulat prin inginerie genetică și 5 produce o cantitate foarte mare de biomasă per acru; plantele de tutun cu resurse scăzute destinate producerii de nicotină vor avea, în consecință, resurse suplimentare disponibile 7 pentru producerea de produse transgenice. Sunt cunoscute în domeniu metode de transformare a tutunului cu transgene producătoare de produse dorite; orice tehnică 9 adecvată poate fi utilizată în cazul plantelor de tutun având un conținut scăzut de nicotină, din această invenție. 11
Plantele de tutun conforme prezentei invenții, cu o expresie redusă a QPRT-azei și cu niveluri scăzute de nicotină, vorfi de dorit în obținerea de produse pe bază de tutun având 13 un conținut redus de nicotină. Plantele de tutun conforme prezentei invenții vorfi adecvate utilizării în orice produs tradițional pe bază de tutun, incluzând, dar nelimitându-se la pipă, 15 țigară sau tutun de țigaretă și la tutunul de mestecat, ci pot fi sub orice formă, inclusiv frunze de tutun, tutun tocat sau tutun tăiat. 17
Constructele din prezenta invenție pot fi, de asemenea, utile în furnizarea de plante transgenice având o expresie crescută a QPRT-azei și un conținut ridicat de nicotină în 19 plantă. Asemenea constructe, metode care utilizează aceste constructe, precum și plantele obținute în acest fel pot fi dezirabile în realizarea de produse pe bază de tutun având un 21 conținut de nicotină alterat, sau în producerea de plante cu un conținut ridicat de nicotină, folosite datorită efectelor insecticide ale nicotinei. 23
Prezenții inventatori au descoperit că gena TobRD2 (a se vedea Conkling și colab.,
Plant Phys. 93, 1203 (1990)) codifică o QPRT-ază din Nicotiana tabacum și au furnizat 25 secvența de cADN a NtQPTI (denumită formal TobRD2), precum și secvența de aminoacizi a enzimei codificate. Comparațiile secvenței de aminoacizi corespunzătoare genei NtQPTI 27 cu bazele de date din Banca de Gene relevă o similaritate de secvențe limitată cu proteinele bacteriene care codifică chinolat fosforibozii transferaza (QPRT-aza) (figura 3). 29
Chinolat fosforibozii transferaza este necesară pentru biosinteza de novo a nicotinadenindinucleotidului (NAD) atât la procariote, cât și la eucariote. în cazul tutunului au 31 fost detectate cantități mari de QPRT-ază în rădăcini, dar nu în frunze. Pentru a determina dacă gena NtQPTI codifică QPRT-aza, prezenții inventatori au utilizat tulpina bacteriană de 33 Escherichia coli (TH265) - o mutantă cu deficiență de chinolat fosforibozii transferaza (nadC+). Această mutantă nu poate crește pe mediu minimal lipsit de acid nicotinic. Cu toate 35 acestea, expresia proteinei NtQPT 1 în această tulpină bacteriană a conferit fenotipul NadC* (figura 4), confirmând faptul că NtQPTI codifică QPRT-aza. 37
Prezenții inventatori au examinat efectele mutantelor Nici și Nic2în tutun, precum și efectele retezării părții superioare a plantelor de tutun asupra nivelelor staționare ale 39 ARNm-ului corespunzător genei NtQPTI și asupra nivelelor de nicotină. (Este binecunoscut faptul că îndepărtarea dominanței apicale prin secționarea părții superioare în stadiul de în- 41 florire are ca rezultat nivele crescute ale biosintezei și transportului nicotinei în tutun, și ea constituie o practică standard în producerea tutunului). Dacă gena NtQPTI este într-adevăr 43 implicată în biosinteza nicotinei, atunci este de așteptat ca: (1) nivelele ARNm-ului corespunzător genei NtQPTI să fie mai mici la mutantele duble Nic1INic2 și (2) nivelele 45 ARNm-ului corespunzător genei NtQPTI să fie crescute după secționarea părții superioare.
S-a constatat că nivelele ARNm-ului corespunzător genei NtQPTI In cazul mutantelor duble 47 Nic1/Nic2 sunt de aproximativ 25 % din cele ale tipului sălbatic (fig. 5). Mai mult, după 6 h
RO 121968 Β1 de la retezarea părții superioare, nivelele ARNm-ului corespunzător genei NtQPTI din plantele de tutun au crescut de aproximativ 8 ori. De aceea, s-a stabilit că gena NtQPT 1 este o genă reglatoare cheie din calea de biosinteza a nicotinei.
Celule vegetale și plante transgenice
Reglarea exprimării genei în genomurile celulare vegetale poate fi realizată prin integrarea ADN-ului heterolog sub controlul transcriptional al unui promotor care este funcțional în gazdă, și în care, catena transcrisa a ADN-ului heterolog este complemetară catenei de ADN care este transcrisă din gena endogenă care trebuie reglată. ADN-ul introdus, sub formă de ADN antisens, oferă o secvență de ARN care este complementară ARNm-urilor produse în mod natural (endogene) și care inhibă exprimarea ARNm-ului endogen. Mecanismul unei astfel de reglări a exprimării genei prin antisens nu este complet înțeles. Cât timp nu se dorește limitarea la o singură teorie, s-a remarcat că o teorie a propunerilor de reglare antisens a acelei transcrieri a ADN-ului antisens produce molecule de ARN care se leagă de/ și împiedică sau inhibă transcrierea moleculelor endogene de ARNm.
în metodele prezentei invenții, produsul antisens poate fi complementar cu porțiunile codificatoare sau necodificatoare (sau cu ambele) ale ARN-ului țintă existent în mod natural. Construcția antisens poate fi introdusă în celulele vegetale prin orice modalitate adecvată și poate fi integrată în genomul plantei pentru transcrierea inductibilă sau constitutivă a secvenței antisens. A se vedea, spre exemplu, brevetele US5453566 și US5107065 ale lui Shewmaker și colab.
Așa cum au fost utilizate aici, denumirile de ADN (sau ARN) heterolog se referă la ADN-ul (sau ARN-ul) care a fost introdus într-o celulă (sau în strămoșul celulei) prin eforturile oamenilor. Un asemenea ADN heterolog poate fi o copie a unei secvențe care se găsește în mod natural în celula astfel transformată, sau fragmente ale acesteia.
Pentru producerea unei plante de tutun cu niveluri scăzute de QPRT-ază și, prin urmare, cu conținut mai mic de nicotină față de o plantă martor de tutun netransformată, se poate transforma o celulă de tutun cu o unitate transcriptională antisens pentru QPRT, exogenă, conținând: o secvență parțială din cADN-ul pentru QPRT; o secvență întreagă din cADN-ul corespunzător pentru QPRT; o secvență cromozomiala parțială pentru QPRT; sau o secvență cromozomiala întreagă pentru QPRT aflată în orientare antisens cu secvențele reglatoare adecvate legate operațional. Secvențele reglatoare adecvate includ o secvență de inițiere a transcrierii (promotor) operabilă în planta supusă transformării și o secvență de terminare a poliadenilării/transcrierii. în continuare, pentru identificarea clonelor purtătoare ale secvențelor pentru QPRT-ază în orientare antisens, legate operațional de secvențele reglatoare, au fost folosite tehnicile standard cum ar fi: realizarea de hărți de restricție, hibridizarea Southern blot și analiza secvențelor nucleotidice. Plantele de tutun sunt apoi regenerate din celulele transformate cu succes. Cel mai convenabil este ca secvența antisens utilizată să fie complementară secvenței endogene; cu toate acestea, pot fi tolerate variații minore în secvențele exogene și endogene. Este preferabil ca secvența antisens de ADN să aibă o similaritate a secvenței suficientă încât să fie capabilă să se lege de secvența endogenă din celula care trebuie reglată, în condiții stricte, așa cum s-a descris mai jos.
în diferite laboratoare a fost utilizată tehnologia antisens pentru crearea de plante transgenice caracterizate prin cantități mai mici decât normalul din unele enzime specifice. Spre exemplu, au fost obținute plante cu nivele scăzute de calcon sintază - o enzimă dintr-o cale de biosinteză a unui pigment floral, prin inserarea unei gene antisens corespunzătoare calcon sintazei în genomul plantelor de tutun și petunie. Aceste plante transgenice de tutun și petunie produc flori cu o colorație mai slabă decât cea normală (Van der Krol și colab., An Anti-Sense Chalcone Synthase Gene in Transgenic Plants Inhibits Flower Pigmentation,
RO 121968 Β1
Nature, 333, pp. 866 - 869 (1988)). De asemenea, tehnologia ARN antisens a fost utilizată 1 cu succes pentru inhibarea producerii enzimei poligalacturonazei la tomate (Smith și colab., Antisense ARN Inhibition of Polygalacturonase Gene Expression in Transgenic Tomatoes, 3 Nature, 334, pp. 724 - 726 (1988); Sheehy și colab., Reduction of Polygalacturonase Activity in Tomato Fruit by Antisense ARN, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85, pp. 8805 -8809 (1988)), 5 și a subunității mici a enzimei ribulozo bisfosfat carboxilaza din tutun (Rodermel și colab., Nuclear-Organelle Interactions: Nuclear Antisens Gene Inhibits Ribulose Bisphosphate 7 Carboxylase Enzyme Levels in Transformed Tobacco Plants, Cell, 55, pp, 673 - 681 (1988)).
în mod alternativ, pot fi create plante transgenice caracterizate prin cantități mai mari decât 9 cele normale dintr-o enzimă dată, prin transformarea plantelor cu ajutorul genei pentru acea enzimă în orientare sens (adică normală). Nivelele de nicotină din plantele transgenice de 11 tutun din prezenta invenție pot fi detectate prin determinările standard de nicotină. Plantele transformate în care nivelul QPRT-azei este redus, comparativ cu cel din plantele martor 13 netransformate vor avea, ca urmare, un nivel de nicotină redus, comparativ cu martorul;
plantele transformate în care nivelul QPRT-azei este crescut comparativ cu plantele martor 15 netransformate vor avea, în consecință, un nivel de nicotină crescut, comparativ cu martorul.
Secvența heteroloagă utilizată în metodele antisens din prezenta invenție poate fi se- 17 lecționată în așa fel încât să conducă la obținerea unui produs ARN complementar cu întreaga secvență de ARNm pentru QPRT-ază, sau cu o porțiune a acesteia. Secvența poate 19 fi complementară oricărei secvențe învecinate a ARNm-ului natural, adică, poate fi complementară cu secvența de ARNm endogen învecinată capătului 5' terminal sau capătului 21 care este izolat în timpul procesului de maturare a ARNm, în aval față de acest ultim capăt menționat, sau între acest capăt și codonul de inițiere și poate acoperi întreaga/ sau doar o 23 porțiune din regiunea necodificatoare, poate uni, printr-o punte, regiunea necodificatoare cu cea codificatoare, poate fi complementară cu toată/ sau cu o parte a regiunii codificatoare, 25 complementară cu capătul 3' terminal al regiunii codificatoare, sau complementară cu regiunea 3' - netradusă a ARNm-ului. Secvențele antisens adecvate pot fi alcătuite din cel 27 puțin 13 până la 15 nucleotide, cel puțin 16 până la 21 de nucleotide, cel puțin 20 de nucleotide, cel puțin aproximativ 30 de nucleotide, cel puțin aproximativ 50 de nucleotide, cel 29 puțin 75 de nucleotide, cel puțin 100 de nucleotide, cel puțin 125 de nucleotide, cel puțin 150 de nucleotide, cel puțin 200 de nucleotide, sau mai multe. în plus, secvențele pot fi extinse 31 sau scurtate la capetele lor 3' sau 5'.
Secvența particulară antisens și lungimea secvenței antisens vor varia în funcție de 33 gradul de inhibare dorit, de stabilitatea secvenței antisens și de alte criterii asemănătoare.
Cineva care este expert în domeniu va fi ghidat în selecția secvențelor antisens pentru 35 QPRT-ază, adecvate, cu ajutorul tehnicilor disponibile în domeniu și al informațiilor furnizate în prezenta descriere. Cu referire la figura 2A și la SECV ID NR:1 din prezenta invenție, o 37 oligonucleotidă a prezentei invenții poate fi un fragment continuu al secvenței pentru QPRT-ază din cADN în orientare antisens, de orice lungime care să fie suficientă pentru 39 realizarea efectelor dorite la transformarea într-o celulă vegetală gazdă.
Prezenta invenție poate fi, de asemenea, utilizată în metodele de co-supresie a pro- 41 ducerii de nicotină. ADN-urile sens folosite în realizarea prezentei invenții au o lungime suficientă pentru a suprima (atunci când se exprimă într-o celulă vegetală) exprimarea nativă 43 a proteinei vegetale QPRT-aza, așa cum s-a descris aici, în acea celulă vegetală. Asemenea ADN-uri sens pot fi, în esență, un întreg ADN genomic sau complementar care codifică 45 enzimă QPRT-aza, sau un fragment din el, cu asemenea fragmente tipice de cel puțin
RO 121968 Β1 nucleotide, ca lungime. La îndemâna experțilorîn domeniu există metode de stabilire a lungimii ADN-ului sens care au drept rezultat suprimarea exprimării unei gene native într-o celulă.
într-o prezentare alternativă a prezentei invenții, celule vegetale de Nicotiana sunt transformate cu ajutorul unui construct ADN conținând un segment de ADN care codifică o moleculă de ARN enzimatică (adică un ribozim ), moleculă de ARN enzimatic care este direcționată spre (adică clivează) transcriptul ARNm al ADN-ului care codifică QPRT-aza vegetală, așa cum s-a descris aici. Ribozimele conțin domenii de legare a substratului care se leagă la regiuni accesibile ale ARNm-ului țintă, precum și domenii care catalizează clivarea ARN-ului, evitând traducerea și producerea proteinei. Domeniile de legare pot conține secvențe antisens complementare secvenței ARNm-ului țintă; motivul (desenul) catalitic poate fi un motiv cap de ciocan sau alte motive, cum ar fi motivul agrafă. Situsurile de clivare dintr-o țintă ARN pot fi identificate, mai întâi, prin scanarea moleculei țintă din punct de vedere al situsurilor de clivare ale ribozimului (ex.: secvențele GUA, GUU sau GUC). Odată identificate, secvențele ARN scurte de 15, 20, 30 sau mai multe ribonucleotide, corespunzătoare regiunii din gena țintă care conține situsul de clivare pot fi evaluate în scopul prevederii caracteristicilor structurale. Cu ajutorul testelor de protecție ribonucleazică cunoscute în domeniu, poate fi evaluată și potrivirea (asemănarea) țintelor candidate, prin testarea disponibilității lor pentru hibridizare cu oligonucleotide complementare. ADN-ul care codifică molecule de ARN enzimatic poate fi produs în conformitate cu tehnicile cunoscute. A se vedea, spre exemplu, T. Cech și colab., US 4987071; Keene și colab., US 5559021; Donson și colab., US 5589367; Torrence și colab., US 5583032; Joyce, US 5580967; Gold și colab., US 5595877; Wagner și colab., US 5591601; și US 5622854. Producerea unei asemenea molecule de ARN enzimatic într-o celulă vegetală și întreruperea producerii proteinei QPRT-aza duc la reducerea activității QPRT-azei în celulele vegetale în aceeași manieră (în esență) ca și producerea unei molecule de ARN antisens: adică, prin întreruperea traducerii ARNm-ului în celula care produce enzimă. Termenul de ribozim este utilizat aici pentru a descrie un acid nucleic conținând ARN care funcționează ca o enzimă (asemenea unei endoribonucleaze) și poate fi utilizat în locul termenului de moleculă de ARN enzimatic. Prezenta invenție include și: ADN care codifică ribozime; ADN care codifică ribozime care a fost inserat într-un vector de expresie; celule gazdă conținând asemenea vectori, precum și metode care utilizează ribozime, de reducere a producției de QPRT-ază în plante.
Secvențele de acid nucleic utilizate în realizarea prezentei invenții le includ pe acelea care au o similaritate a secvenței cu SECV ID NR:1 și care codifică o proteină având activitate de chinolat fosforibozil transferază. Această definiție intenționează să includă variațiile naturale alelice din proteinele QPRT-azice. Astfel, secvențele de ADN care hibridizează cu ADN-ul având secvența SECV ID NR:1 și codifică exprimarea QPRT-azei, în particular enzimele QPRT-azice vegetale, pot fi și ele utilizate în realizarea prezentei invenții.
Pot exista forme multiple ale enzimei QPRT-ază din tutun. Aceste forme multiple ale unei enzime pot fi datorate modificării post-translaționale a unui singur produs al genei, sau formelor multiple ale genei NtQPTI.
Condițiile ce permit altor secvențe de ADN care codifică exprimarea unei proteine având activitate QPRT-azică să hibridizeze cu ADN-ul având secvența SECV ID NR:1 sau cu alte secvențe de ADN care codifică proteina reprezentată prin SECV ID NR:2, potfi determinate printr-o modalitate de rutină. Spre exemplu, hibridizarea unor asemenea secvențe poate fi derulată în condiții de rigurozitate redusă, sau chiar în condiții riguroase (ex. condiții
RO 121968 Β1 reprezentate de o spălare riguroasă cu NaCI 0,3 M, citrat de sodiu 0,03 M, SDS 0,1%, la 1 60°C sau chiar 70’C pentru ADN-ul care codifică proteina reprezentată aici prin SECV ID NR:2, într-un test standard de hibridizare in situ. A se vedea J. Sambrook și colab., 3 Molecular Cloning, A Laboratory Manual (2d Ed. 1989) (Cold Spring Harbor Laboratory)). în general, asemenea secvențe vor fi cel puțin 65% similare, 75% similare, 80% similare, 85% 5 similare, 90% similare, sau chiar 95% similare, sau chiar mai mult, cu secvența reprezentată aici prin SECV ID NR:1, sau cu secvențele de ADN care codifică proteinele având 7 SECV ID NR:2. (Determinările de similaritate a secvențelor au fost făcute cu cele două secvențe aliniate pentru potrivire maximă; pentru sporirea gradului de potrivire sunt permise 9 breșe în oricare dintre cele două secvențe ce sunt asemănate. Sunt preferate lungimi ale breșelor de 10 sau mai puțin, mai preferate sunt lungimile breșelor de 5 sau mai puțin, iar 11 lungimile breșelor de 2 sau mai puțin sunt și mai convenabile).
Există proceduri de hibridizare diferențială care permit izolarea clonelor de cADN ale 13 căror nivele de ARNm sunt de aproximativ 0,05% poli(A+)ARN. A se vedea M. Conkling și colab., Plant Physiol. 93, 1203 - 1211 (1990). Pe scurt, băncile de cADN sunt supuse 15 screeningului, folosind sonde de cADN mono-catenar, din punct de vedere al ARNm-ului revers transcris din țesutul vegetal (ex. rădăcini și/sau frunze). Pentru screeningul diferențial 17 se procedează astfel: o membrană de nitroceluloză sau de nylon este îmbibată de 5 ori în SSC, plasată într-un colector sub vid având 96 de godeuri, 150 pL din cultura staționară 19 peste noapte sunt transferați dintr-o placă stoc (mamă) în fiecare godeu și supuși presiunii sub vid până când tot lichidul trece prin filtru. 150 pl_ din soluția denaturantă (NaOH 0,5 M, 21 NaCI 1,5 M) sunt plasați în fiecare godeu, cu ajutorul unei pipete și lăsați să stea aproximativ 3 min. Se aspiră ca și mai sus, iar filtrul este îndepărtat și neutralizat în Tris-HCI 0,5 M 23 (pH 8,0), NaC11,5 M. Filtrul este uscat apoi 2 h in vacuo și incubatcu sondele relevante. Prin utilizarea filtrelor membranare din nylon și păstrarea plăcilor principale depozitate la -70°C 25 în DMSO 7%, filtrele pot fi supuse screeningului de mai multe ori, cu multiple sonde, iar clonele particulare pot fi recuperate după câțiva ani de depozitare.27
După cum a fost utilizat aici, termenul de “genă” se referă la o secvență de ADN care încorporează: (1) semnale reglatoare, incluzând promotorul, situate în amonte de capătul 5',29 (2) o regiune codificatoare specificând produsul (proteină sau ARN) al genei, (3) regiuni situate în aval de capătul 3', incluzând semnale de poliadenilare și de terminare a transcrierii31 și (4) secvențe asociate, necesare unei exprimări eficiente și specifice.
Secvența de ADN conform prezentei invenții poate fi constituită, în esență, din 33 secvența furnizată în prezenta descriere (SECV ID NR:1), sau din secvențe nucleotidice echivalente reprezentând variante alele sau polimorfe ale acestor gene, sau din regiuni 35 codificatoare, ale acestora.
Utilizarea frazei “similaritate substanțială a secvențelor” în prezenta descriere și în 37 revendicări se referă la faptul că ADN-ul, ARN-ul sau secvențele de aminoacizi care au variații ușoare și lipsite de consecințe de la secvențele reale descrise și revendicate în prezenta 39 cerere sunt considerate a fi echivalente cu secvențele prezentei invenții. Din acest punct de vedere, “variații secvențiale ușoare și lipsite de consecințe” înseamnă că secvențe “similare” 41 (adică, secvențele care au o similaritate substanțială a secvențelor cu ADN-ul, ARN-ul sau cu proteinele descrise și revendicate în prezenta cerere) vor fi echivalente din punct de ve- 43 dere funcțional cu secvențele descrise și revendicate în prezenta invenție. Secvențele echivalente funcțional vor funcționa, în esență, în aceeași manieră pentru a produce, în prin- 45 cipal, aceleași compoziții ca și compozițiile de acizi nucleici și de aminoacizi descrise și revendicate în prezenta lucrare. 47
RO 121968 Β1
Secvențele de ADN furnizate în prezenta invenție pot fi transformate într-o varietate de celule gazdă. în domeniu există și sunt ușor accesibile o varietate de celule gazdă potrivite, având proprietățile de cultivare și de manipulare dorite.
Utilizarea expresiei “izolat” sau “substanțial pur” în prezenta descriere și în revendicări ca un modificator al ADN, ARN, polipeptide sau proteine înseamnă că ADN-ul, ARN-ul, polipeptidele sau proteinele astfel desemnate au fost separate de mediile lor celulare in vivo, prin eforturile oamenilor. Așa cum a fost utilizată aici, o “secvență de ADN nativ” sau “secvența de ADN natural” înseamnă o secvență de ADN care poate fi izolată din țesuturi sau celule netransgenice. Secvențele de ADN nativ sunt acelea care nu au fost alterate artificial, cum arfi prin mutageneza direcționată către un anumit situs. Odată identificate secvențele de ADN nativ, moleculele de ADN având secvențe de ADN nativ pot fi sintetizate chimic sau produse cu ajutorul procedeelor de ADN recombinant, după cum se cunoaște în domeniu. Așa cum este folosită în prezenta invenție, o secvență de ADN vegetal nativ este aceea care poate fi izolată din țesuturi sau celule de plante netransgenice. Așa cum s-a folosit în prezenta invenție, o secvență de ADN nativ din tutun este aceea care poate fi izolată din țesuturi sau celule netransgenice de tutun.
Constructele ADN, sau “casetele de transcriere” din prezenta invenție includ, de la capătul 5' până la capătul 3' în direcția transcrierii: un promotor, așa cum s-a discutat anterior, o secvență de ADN, așa cum s-a discutat anterior în descriere, asociată operațional cu promotorul; și opțional, o secvență de terminare care include semnalul stop pentru ARN polimerază și un semnal de poliadenilare pentru poliadenilază. Toate aceste regiuni reglatoare trebuie să fie capabile să opereze în celulele țesutului care trebuie transformat. Orice semnal de terminare adecvat poate fi folosit în realizarea prezentei invenții, exemple de acest fel incluzând, dar nelimitându-se la: terminatorul pentru nopalin sintază (nos), terminatorul pentru octapin sintază (ocs), terminatorul CaMV sau semnalele native de terminare derivate din aceeași genă ca și regiunea de inițiere transcripțională sau derivate dintr-o genă diferită. A se vedea, spre exemplu: Rezian și colab., (1988) de mai sus, și Rodermel și colab. (1988), de mai sus.
Termenul de “asociat în mod operativ”, așa cum a fost întrebuințat în prezenta descriere, se referă la secvențele de ADN de pe o singură moleculă de ADN, care sunt asociate în așa fel încât funcționarea uneia să fie afectată de către cealaltă. Astfel, un promotor este asociat în mod operativ cu un ADN atunci când este capabil să afecteze transcrierea acelui ADN (adică ADN-ul se află sub controlul transcriptional al promotorului). Se spune că promotorul este în amonte față de ADN, despre care se spune, la rândul său, că este “in aval” fața de promotor.
Caseta de transcriere poate fi furnizată într-un construct ADN care are, de asemenea, cel puțin un sistem de replicare. Pentru comoditate, se obișnuiește să se folosească un sistem de replicare funcțional în Escherichia coli, cum arfi ColE1, pSC101, pACYC184, sau altele de acest fel. în această manieră, la fiecare stadiu, după fiecare manipulare, constructul rezultant poate fi donat, secvențializat și determinată corectitudinea manipulării. în plus, sau în locul sistemului de replicare E.coli, poate fi întrebuințată o gamă largă de sisteme gazdă pentru replicare, cum ar fi sistemul de replicare al plasmideior P-1 de incompatibilitate, spre exemplu, pRK290. în afara sistemului de replicare, există în mod frecvent cel puțin un marker prezent, care poate fi util în una sau mai multe gazde, sau markeri diferiți pentru gazde diferite. Adică, un marker poate fi utilizat pentru selecția într-o gazdă procariotă, în timp ce un alt marker poate fi întrebuințat pentru selecția într-o gazdă eucariotă, în particular, gazda vegetală. Markerii pot oferi protecție împotriva unui biocid, cum este cazul antibioticelor, toxinelor, metalelor grele, sau al altora de acest tip; pot oferi complementaritate prin
RO 121968 Β1 împărțirea prototrofiei cu o gazdă auxotrofă; sau pot oferi un fenotip vizibil, prin producerea 1 unui compus nou în plantă.
Diferite fragmente conținând diverși constructi, casete de transcriere, markeri și altele 3 de acest tip, pot fi introduse consecutiv, prin clivarea enzimei de restricție a unui sistem de replicare adecvat și inserarea constructului sau fragmentului particular în situsul disponibil. 5
După ligare și donare, constructul ADN poate fi izolat pentru manipularea ulterioară. Toate aceste tehnici sunt amplu exemplificate în literatură, așa cum au făcut J. Sambrook și colab., 7
Molecular Cloning, A Laboratory Manual (2d Ed. 1989) (Cold Spring Harbor Laboratory).
Vectorii prevăzuți în prezenta invenție care pot fi utilizați pentru transformarea 9 țesutului vegetal cu constructi de acizi nucleici, includ atât vectori Agrobacterium, cât și vectori balistici, precum și vectori adecvați transformării mediate de ADN. 11
Termenul de “promotor” se referă la o regiune a unei secvențe de ADN care încorporează semnalele necesare pentru exprimarea eficientă a secvenței codificatoare. 13 Acesta include secvențe la care se leagă o ARN polimerază, dar nu se limitează la asemenea secvențe și poate include regiuni la care se leagă alte proteine reglatoare, împreună 15 cu regiuni implicate în controlul traducerii proteice, precum și secvențe de codificare.
Promotorii utilizați în realizarea prezentei invenții pot fi promotori activi constitutiv. 17 Sunt accesibili numeroși promotori activi constitutiv care sunt operabili în plante. Un exemplu convenabil este promotorul 35S al virusului mozaicului conopidei (CaMV = Cauliflower 19 Mosaic Virus ) care este exprimat constitutiv în majoritatea țesuturilor vegetale. Ca alternativă, promotorul poate fi un promotor specific rădăcinii, sau promotor specific cortexului 21 rădăcinii, așa cum se explică mai detaliat, mai jos.
Au fost exprimate secvențe antisens în plante transgenice de tutun, utilizând 23 promotorul 35S al virusului mozaicului conopidei (CaMV). A se vedea, spre exemplu, Cornelissen și colab., “Both RNA Level and Translation Efficiency are Reduced by 25 Anti-Sense RNA in Transgenic Tobacco”, Nucleic Acids Res. 17, pp. 833 - 843 (1989); Rezaian și colab., “Anti-sense RNAs of Cucumber Mosaic Virus in Transgenic Plants 27 Assessed for Control of the Virus, Plant Molecular Biology 11, pp. 463 - 471 (1988); Rodermel și colab., “Nuclear-Organelle Interactions: Nuclear Antisense Gene Inhibits 29 Ribulose Bisphosphate Carboxylase Enzyme Levels in Transformed Tobacco Plants”, Cell 55, pp. 673 - 681 (1988); Smith și colab., “Antisense ARN Inhibition of Polygalacturonase 31 Gene Expression in Transgenic Tomatoes”, Nature 334, pp. 724 - 726 (1988); Van der Krol și colab., An Anti-Sense Chalcone Synthase Gene in Transgenic Plants Inhibits Flower 33 Pigmentation”, Nature 333, pp. 866 - 869 (1988).
Se preferă utilizarea promotorului 35S CaMV pentru exprimarea QPRT-azei în plan- 35 tele și celulele de tutun transformate ale acestei invenții. Utilizarea promotorului CaMV pentru exprimarea altor gene recombinante în rădăcinile de tutun a fost bine descrisă (Lam și 37 colab., “Site-Specific Mutations Alter In Vitro Factor Binding and Change Promoter Expression Pattem in Transgenic Plants”, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 86, pp. 7890 - 7894 39 (1989); Poulsen și colab., “Dissection of 5' Upstream Secquences for Selective Expression of the Nicotiana plumbaginifolia rbcS-8B Gene”, Mol. Gen. Genet. 214, pp. 16-23 (1988)). 41
De asemenea, și alți promotori care sunt activi doarîn țesuturile radiculare (promotori specifici rădăcinii) sunt adecvați, în mod particular, metodelor din prezenta invenție. A se 43 vedea, spre exemplu, brevetul US 5459252 de Conkling și colab.; Yamamoto și colab., The Plani Cell, 3: 371 (1991). Poate fi utilizat, de asemenea, promotorul specific cortexului ră- 45 dăcinii - TobRD2. A se vedea, spre exemplu, cererea de brevet americană SN 08/508.786, admisă lui Conkling et al; PCT WO 9705261. Toate brevetele citate aici vor fi încorporate în 47 întregime aici, ca referințe.
RO 121968 Β1
Moleculele de ADN recombinant pentru QPRT-ază și vectorii utilizați pentru producerea celulelor și plantelor de tutun transformate din prezenta invenție pot conține, în plus, o genă marker selectabilă dominantă. Markerii selectabili dominanți potriviți pentru utilizarea la tutun includ, între altele, gene de rezistență la antibiotice care codifică neomicin fosfotransferaza (NPTII), higromicin fosfotransferaza (HPT) și cloramfenicol acetiltransferaza (CAT). Un alt marker selectabil dominant bine cunoscut, adecvat utilizării la tutun este ogenă mutantă pentru dihidrofolat reductază, care codifică dihidrofolat reductaza rezistentă la metotrexat. Vectori de ADN conținând gene adecvate pentru rezistența la antibiotice, precum și antibioticele corespunzătoare sunt disponibile comercial.
Celulele de tutun transformate sunt separate de populația înconjurătoare a celulelor netransformate prin plasarea populației amestecate de celule într-un mediu de cultură conținând o concentrație corespunzătoare din antibioticul (sau din alt compus toxic pentru celulele de tutun) la care produsul genei marker dominant selectabilă îi conferă rezistență. Astfel, doar acele celule de tutun care au fost transformate vor supraviețui și se vor multiplica.
Metodele de obținere a plantelor recombinante ale prezentei invenții implică, în general, în primul rând, furnizarea unei celule vegetale capabile de regenerare (celula vegetală aflându-se, în mod tipic, într-un țesut capabil de regenerare). Celula vegetală este transformată apoi cu un construct ADN conținând o casetă de transcriere din prezenta invenție (așa cum a fost descrisă anterior) iar din celula vegetală transformată este regenerată o plantă recombinantă. Așa cum este explicat mai jos, etapa de transformare a fost efectuată prin tehnici care sunt cunoscute în domeniu incluzând, dar nelimitându-se la: bombardarea celulei vegetale cu microparticule care poartă caseta de transcriere; infectarea celulei cu un Agrobacterium tumefaciens conținând o plasmidă Ti care poartă caseta de transcriere; sau orice altă tehnică adecvată de producere a unei plante transgenice.
Sunt cunoscute numeroase sisteme vectoare de Agrobacterium, utile în realizarea prezentei invenții. Spre exemplu, brevetul US 4459355 descrie o metodă pentru transformarea plantelor susceptibile, incluzând dicotiledonatele, cu o tulpină de Agrobacterium conținând plasmida Ti. Transformarea plantelor lemnoase cu un vector de Agrobacterium este prezentată în brevetul US 4795855. Mai mult, brevetul US 4940838 al lui Schilperoort și colab. descrie un vector binar de Agrobacterium (adică un vector în care Agrobacterium conține o plasmidă având regiunea vir a unei plasmide Ti, dar nu și regiunea T, și o a doua plasmidă având o regiune T, dar nu și regiunea vir) util în realizarea prezentei invenții.
Microparticulele purtătoare ale unui construct ADN din prezenta invenție - microparticule care sunt adecvate transformării balistice a unei celule vegetale sunt utile, de asemenea, și pentru obținerea plantelor transformate din prezenta invenție. Microparticula este propulsată într-o celulă vegetală pentru a produce o celulă vegetală transformată din care se regenerează o plantă. Pentru realizarea practică a prezentei invenții pot fi utilizate orice metodologii și orice aparatură de transformare balistică a celulei. Aparatură și procedee exemplare au fost descrise de către Sanford și Wolf în brevetul US 4945050 și de către Christou și col., în brevetul US 5015580. La utilizarea procedeelor de transformare balistică, caseta de transcriere poate fi încorporată într-o plasmidă capabilă de replicare în/ sau de integrare în celula care trebuie transformată. Exemple de microparticule potrivite pentru a fi utilizate în asemenea sisteme includ sfere de aur de 1 - 5 pm. Constructul de ADN poate fi depozitat pe microparticulă cu ajutorul oricărei tehnici adecvate, cum ar fi precipitarea.
Specii de plante pot fi transformate cu constructul de ADN din prezenta invenție prin transformarea mediată de ADN a protoplaștilor de celule vegetale și regenerarea ulterioară a plantei din protoplaștii transformați, în conformitate cu procedeele bine cunoscute în
RO 121968 Β1 domeniu. Este cunoscută în domeniu fuziunea protoplaștilor de tutun cu lipozomi conținând 1
ADN sau via electroporare (Shillito și colab., “Direct Gene Transfer to Protoplasts of Dicotyledonous and Monocotyledonous Plants by a Number of Methods, Including 3 Electroporation”, Methods in Enzymology 153, pp. 313 - 336 (1987)).
Așa cum a fost utilizată în prezenta invenției, transformarea se referă la introducerea 5 de ADN exogen în celule ca să producă celule transgenice transformate în mod stabil cu ADN-ul exogen. 7
Celulele transformate sunt induse pentru a regenera plante intacte de tutun prin aplicarea tehnicilor de culturi de celule și de țesuturi de tutun -tehnici care sunt bine cunoscute 9 în domeniu. Metoda regenerării vegetale este aleasă în așa fel încât să fie compatibilă cu metoda de transformare. Prezența stabilă și orientarea secvenței QPRT-azei în plantele 11 transgenice de tutun pot fi verificate prin moștenirea Mendeliană a secvenței QPRT-azei, așa cum s-a relevat prin metodele standard ale analizei ADN-ului aplicate descendentului rezultat 13 din încrucișări controlate. După regenerarea plantelor transgenice de tutun din celule transformate, secvența de ADN introdusă este transferată rapid altor varietăți de tutun prin 15 practicile convenționale de ameliorare a plantelor și fără o experimentare excesivă.
Spre exemplu, pentru a analiza segregarea transgenei, plantele transformate rege- 17 nerate (Ro) pot fi crescute până la maturitate, testate din punctul de vedere al conținutului de nicotină și refăcute pentru a produce plante R,. Un procent de plante R., purtătoare ale 19 transgenei sunt homozigoți pentru transgenă. Pentru identificarea plantelor homozigote R1f plantele transgenice Ri sunt crescute până la maturitate și refăcute. Plantele homozigote Rt 21 vor produce descendentul R2 unde fiecare plantă descendentă este purtătoare a transgenei; descendentul plantelor heterozigote R1 va segrega 3:1. 23
Deoarece nicotină servește drept pesticid natural, ea ajuta la protecția plantelor de tutun de atacul dăunătorilor. De aceea, poate fi de dorit o transformare suplimentară a plan- 25 telor cu conținut redus/ sau lipsite de nicotină produse prin metodele prezente, cu ajutorul unei transgene (cum ar fi Bacillus thuringiensis) care va conferi o protecție suplimentară 27 împotriva insectelor.
O plantă preferată pentru utilizare în prezentele metode este specia Nicotiana, sau 29 tutunul, incluzând: N. tabacum, N. rustica și N. glutinosa. Poate fi utilizată orice tulpină sau varietate de tutun. Sunt preferate tulpinile care au deja un conținut scăzut de nicotină, cum 31 ar fi mutantele duble Nic1/Nic2.
Orice țesut vegetal capabil de propagare clonală ulterioară, fie prin organogeneză, 33 fie prin embriogeneză, poate fi transformat cu un vector din prezenta invenție. Termenul de “organogeneză”, așa cum afostel utilizat în prezenta lucrare, desemnează un procedeu prin 35 care, din centri meristematici se dezvoltă în mod secvențial (în etape) tulpini și rădăcini; termenul de embriogeneză, așa cum a fost utilizat aici, înseamnă un procedeu prin care 37 tulpinile și rădăcinile se dezvoltă împreună, în mod concertat (nu secvențial), fie din celule somatice, fie din gârneți. Țesutul particular ales va varia în funcție de sistemele de propagare 39 clonală disponibile pentru/ și cele mai adecvate pentru speciile particulare care sunt supuse transformării. Țesuturi țintă exemplare includ: discuri din frunze; țesut de: polen, embrion, 41 cotiledoane, hipocotile, calus; țesut meristematic existent (ex. meristeme apicale, muguri axilari și meristeme radiculare); precum și țesut meristemic indus (ex. meristem de cotiledon 43 și meristem de hipocotil).
Plantele din prezenta invenție pot lua o varietate de forme. Plantele pot fi himere de 45 celule transformate și celule netransformate; plantele pot fi transformanți clonali (ex. toate celulele transformate în sensul să conțină caseta de transcriere); plantele pot conține altoi 47 de țesuturi transformate sau netransformate (ex. un trunchi de rădăcină transformată altoită
RO 121968 Β1 pe un butaș netransformat, în cazul speciilor de citrice). Plantele transformate pot fi propagate printr-o varietate de modalități, cum arfi propagarea clonală sau tehnicile clasice de ameliorare. Spre exemplu, prima generație (sau T1) de plante transformate poate fi regenerată pentru a da a doua generație homozigotată (sau T2) de plante transformate, iar plantele T2 propagate ulterior prin tehnici clasice de ameliorare. Un marker selectabil dominant (cum ar fi nptll) poate fi asociat cu caseta de transcriere pentru a ajuta amelioararea.
Având în vedere cele spuse anterior, este evident că plantele care pot fi utilizate în realizarea practică a prezentei invenții le includ pe cele din genul Nicotiana.
Specialiștii familiarizați cu metodele de ADN recombinant descrise anterior vor recunoaște că pentru a construi celule și plante transgenice de tutun se poate folosi o moleculă întreagă de cADN pentru QPRT-ază sau o genă cromozomală completă pentru QPRT-ază, unită în orientare sens, cu secvențele reglatoare corespunzătoare legate operațional. (Experții în domeniu vor admite și faptul că secvențele reglatoare potrivite pentru exprimarea genelor în orientare sens includ oricare dintre secvențele eucariote de inițiere a traducerii, în afara promotorului și a secvențelor de terminare a poliadenilării/transcrierii secvențe descrise anterior). Asemenea plante de tutun transformate sunt caracterizate prin nivele crescute de QPRT-ază și, ca urmare, prin conținuturi mai mari de nicotină față de plantele martor de tutun, netransformate.
De aceea, trebuie înțeles faptul că utilizarea secvențelor de ADN care codifică QPRT-aza pentru a scădea sau pentru a crește nivelele enzimei QPRT-aza și, în felul acesta pentru a reduce sau a spori conținutul de nicotină din plantele de tutun, corespunde scopului prezentei invenții.
Așa cum s-a folosit aici, o cultură conține o mulțime de plante ale prezentei invenții aparținând aceluiași gen, plantate împreună într-un câmp agricol. Prin termenul de câmp agricol se înțelege o bucată de teren, sau o seră. Astfel, prezenta invenție furnizează o metodă de producere a unei culturi de plante având alterată activitatea QPRT-azică și, în felul acesta, având nivele crescute sau scăzute de nicotină, comparativ cu o cultură similară de plante netransformate aparținând aceleiași specii și varietăți.
Se dau în continuare exemple nelimitative care ilustrează prezenta invenție.
Exemplul 1. Izolarea și secvențializarea cADN-ul genei TobRD2 (Conkling și colab., Plant Phys. 93, 1203 (1990)) a fost secvențializat și furnizat în prezenta descriere sub forma SECV ID NR: 1, iar secvența de aminoacizi a fost dedusă ca SECV ID NR: 2. S-a presupus că secvența de aminoacizi dedusă arfi o proteină citosolică. Deși nu au fost raportate gene pentru QPRT-aza vegetală, comparațiile între secvența de aminoacizi a NtPT1 și baza de date a Băncii de Gene (fig. 3) au relevat o similaritate secvențială limitată cu anumite proteine bacteriene sau cu alte proteine; activitatea chinolat fosforibozil transferazică (QPRT-azică) a fost demonstrată pentru gene de la S. typhimurium, E. coli și N. tabacum. QPRT-aza codificată de gena NtQPTI a fost asemănătoare fragmentului peptidic dedus și codificat de o secvență de expresie EST (expression sequence tags) de la Arabidopsis (având numărul de acces la Banca de gene F20096), care poate reprezenta o parte din gena pentru QPRt-ază de la Arabidopsis.
Exemplul 2. Hibridizări in situ
Pentru a determina distribuția spațială a transcripților TobRD2 ai ARNm-ului în diferite țesuturi ale rădăcinii, au fost efectuate hibridizări insituîn plante netransformate. Hibridizările in situ ale catenei antisens pentru TobRD2 cu ARNm-ul pentru TobRD2 în țesut radicular au fost făcute cu ajutorul unortehnici ca acelea descrise de Meyerowitz, Plant Mol. Biol. Rep. 5,
RO 121968 Β1
242 (1987) și Smith și colab., Plant Mol. Biol. Rep. 5, 237 (1987). Rădăcini provenind de la 1 plantule de tutun (Nicotiana tabacum) de 7 zile au fost fixate în glutaraldehidă tamponată în fosfat, introduse în Paraplast Plus (Monoject Inc., St. Louis, MO) și secționate la 8 mm 3 grosime pentru obținerea de secțiuni, atât transversale, cât și longitudinale. Transcripții TobRD2 antisens, sintetizați in vitro în prezență de ATP-35S au fost întrebuințați drept 5 sonde. ARN-ul marcat a fost hidrolizat prin tratament alcalin, cu producerea unei obținânde-se o masă cu lungime medie, înainte de utilizare, de 100 - 200 de baze. 7
Hibridizările au fost făcute în formamidă 50%, timp de 16 h, la 42'C, cu ARN marcat
- aproximativ 5 x 106 unități per minut (cpm = “counts-per-minute”) per mililitru din soluția de 9 hibridizare. După expunere, lamele au fost developate și vizualizate prin microscopie optică (în câmp luminat și neluminat). 11
Semnalul de hibridizare a fost localizat la nivelul stratului cortical al celulelor din rădăcini (nu sunt prezentate rezultatele). Compararea imaginilor în câmp luminat și neluminat 13 a acelorași secțiuni a dus la localizarea transcripțilorTobRD2 în celulele parenchimatoase ale cortexului rădăcinii. în epidermă sau în stern nu a fost vizibil nici un semnal de 15 hibridizare.
Exemplul 3. Nivelele ARNm-ului corespunzător TobRD2 în mutantele de tutun Nici 17 ș/ Nic2 și corelarea lor cu nivelele de nicotină
Au fost examinate nivelele staționare ale ARNm-ului corespunzător genei TobRD2 19 în plantele de tutun mutante Nici și Nic2. Se cunoaște faptul că genele Nici și Nic2 reglează activitatea chinolat fosforibozil transferazei și activitatea metil transferazei de putrefacție și 21 sunt reglatori co-dominanți ai producerii nicotinei. Prezentele rezultate sunt ilustrate în figurile 5A și 5B și arată că exprimarea genei TobRD2 este reglată de către Nici și Nic2. 23
ARN-ul a fost izolat din: rădăcini de plante de tutun de tip sălbatic Burley 21 (Nic1/Nic1 Nic2/Nic2); rădăcini ale Nic1-Burley 21 (nic1/nic1 Nic2/Nic2); rădăcini ale 25 Nic2-Burley 21 (Nic1/Nic1 nic2/nic2) și din rădăcini ale Nic1-Nic2- Burley 21 (nici/nici nic2/nic2). 27
Au fost cultivate în sol, din semințe, patru linii de tutun Burley 21 (nic) timp de o lună, care au fost transferate în camere hidropone în soluție nutritivă aerată, în seră, timp de o 29 lună. Aceste linii au fost izogene, cu excepția celor două locusuri corespunzătoare nivelului scăzut de nicotină și au avut genotipurile Nic1/Nic1 Nic2/Nic2, Nici/Nici nic2/nic2, nic1/nic1 31
Nic2/Nic2, nic1/nic1 nic2/nic2). Au fost prelevate rădăcinile de la aproximativ 20 de plante pentru fiecare genotip și reunite pentru izolarea ARN-ului. ARN-ul total (1 pg) de la fiecare 33 genotip a fost supus electroforezei într-un gel de agaroză 1 % conținând formaldehidă 1,1 M și transferat pe o membrană de nylon, în conformitate cu Sambrook și colab., (1989). Mem- 35 branele au fost hibridizate cu fragmente de cADN pentru TobRD2, marcate cu P32.
Intensitatea relativă a transcripților TobRD2 a fost măsurată prin densitometrie. Figura 5 37 (bare pline) ilustrează nivelele relative ale transcriptului (comparativ cu Nici/Nici Nic2/Nic2) pentru fiecare dintre cele 4 genotipuri. Conținutul relativ al nicotinei (comparativ cu Nic1/Nic1 39 Nic2/Nic2) al celor 4 genotipuri este reprezentat prin bare hașurate.
Fig. 5 compară grafic nivelul relativ, al stării staționare, al ARNm-ului corespunzător 41 genei TobRD2, utilizând drept cantitate de referință nivelul găsit în tipul sălbatic de tutun Burley 21 (Nic1/Nic1 Nic2/Nic2). Nivelele de ARNm corespunzător TobRD2 în mutantele 43 duble Nic1/Nic2 au fost de aproximativ 25% din cele al tutunului de tip sălbatic. Fig. 5B compară suplimentar nivelele relative de nicotină din liniile aproape izogene de tutun studiate 45 în acest exemplu (barele solide indică nivelul transcriptului lui TobRD2 barele hașurate indică nivelul de nicotină). A existat o corelație strânsă între nivelele de nicotină și nivelele 47 transcriptului corespunzător lui TobRD2.
RO 121968 Β1
Exemplul 4. Efectul retezării apicale asupra nivelelor de ARNm corespunzător lui TobRD2.
Este bine cunoscut în domeniu faptul că îndepărtarea capătului floral al unei plante (cârnirea) accelerează creșterea rădăcinii și sporește conținutul de nicotină al frunzelor acelei plante. Cârnirea plantei constituie o practică standard în cultivarea de tutun comercial, iar momentul optim pentru cârnirea unei anumite plante de tutun, într-un set cunoscut de condiții de creștere, poate fi determinat rapid de către un cunoscător din domeniu.
Din semințe au fost obținute plante de tutun (N. tabacum SR1) care au fost cultivate în sol timp de o lună, apoi transferate în vase cu nisip. Plantele au fost crescute în seră timp de încă 2 luni, până când a început înflorirea. Capetele florale și încă 2 noduri au fost îndepărtate de la 4 plante (cârnite). După timpul indicat s-a prelevat câte o parte din rădăcinile fiecărei plante care au fost reunite în scopul extragerii ARN-ului. Plantele martor nu au fost decapitate. ARN-ul total (1 pg) din fiecare moment de timp a fost supus electroforezei într-un gel de agaroză 1% conținând formaldehidă 1,1 M, apoi transferat pe o membrană de nylon, după recomandarea lui Sambrookși colab., (1989). Membranele au fost hibridizate cu fragmente de cADN pentru TobRD2 marcate cu P32. Intensitatea relativă a transcripțilorTobRD2 a fost măsurată prin densitometrie. Fig. 6 ilustrează nivelele relative ale transcriptului (comparativ cu momentul zero) pentru fiecare moment de timp, cu cârnire (bare solide), sau fără cârnire (bare hașurate).
Au fost determinate nivelele relative ale TobRD2 în țesutul radiculardupă 24 h; rezultatele sunt prezentate în fig. 6 (barele solide indică nivelele transcriptului lui TobRD2 în plantele cârnite; barele hașurate indică nivelele transcriptului lui TobRD2 în martorii necârniți). în 6 h de la cârnirea plantelor de tutun, nivelele de ARNm pentru TobRD2 au crescut de aproximativ 8 ori în plantele cârnite; după aceeași perioadă de timp, în plantele martor nu s-a înregistrat nici o creștere.
Exemplul 5. Complementarea mutantei bacteriene cu deficiență de QPRT-ază cu ADN având SECV ID NR: 1
Tulpina TH265 de Escherichia coli este o mutantă cu deficiență de chinolat fosforibozil transferaza (nadC) care, drept urmare, nu poate crește pe medii lipsite de acid nicotinic.
Celulele TH265 au fost transformate cu un vector de exprimare (pWS161) conținând ADN cu SECV ID NR:1, sau transformate doar cu vectorul de exprimare (pKK233). Creșterea bacteriei transformate a fost comparată cu creșterea transformanților TH265 (pKK233) și cu creșterea mutantului netransformat TH265 nadC. Creșterea a fost comparată pe mediu minimal ME (lipsit de acid nicotinic) cu cea de pe mediu minimal ME cu adaos de acid nicotinic.
Tulpina TH265 de E. coli cu mutația QPTază (nadC) a fost oferită cu amabilitate de către Dr. KT. Huges (Huges și colab., J. Bact. 175:479 (1993). Celulele au fost păstrate pe mediu LB, iar celulele competente au fost preparate după metoda lui Sambrook și col. (1989). O plasmidă de exprimare a fost construită în pKK2233 (Brosius, 1984) cu cADN-ul pentru TobRD2 donat sub controlul promotorului Tac. Plasmida rezultantă pWS161 a fost transformată în celule TH265. Celulele transformate au fost trecute apoi pe plăci agarizate conținând mediu minimal (Vogel și Bonner, 1956) cu sau fără acid nicotinic (0,0002%) ca supliment. Celulele TH265 singure și celulele TH265 transformate cu pKK2233 au fost trecute pe plăci similare, pentru a fi utilizate ca martori.
Rezultatele sunt prezentate în fig. 4. Doar celulele TH265 transformate cu ADN având SECV ID NR:1 au crescut pe mediu lipsit de acid nicotinic. Aceste rezultate arată că exprimarea ADN-ului având SECV ID NR:1 în celulele bacteriene TH265 a conferit acestor celule fenotipul NadC+, confirmând faptul că această secvență codifică QPRT-aza. Nomenclatura TobRD2 a fost schimbată astfel în NtQPTI.
RO 121968 Β1
Exemplul 6. Transformarea plantelor de tutun 1
ADN-ul având SECV ID NR:1, aflat în orientare antisens, este legat operațional de un promotor vegetal (CaMV 35S sau promotorul TobRD2 specific cortexului rădăcinii) pentru 3 a produce două casete de ADN diferite: promotor CaMV35S / SECV ID NR: 1 antisens și promotor TobRD2 / SECV ID NR:1 antisens. 5
Au fost selecționate pentru transformare o linie de tutun de tip sălbatic și o linie de tutun cu conținut redus de nicotină, spre exemplu, linia Burley 21 de tip sălbatic 7 (Nici+/Nic2+) și linia Burley 21 homozigotă nic1-/nic2-. O mulțime de celule de tutun de la fiecare linie au fost transformate cu ajutorul fiecărei casete ADN. Transformarea a fost 9 efectuată cu ajutorul unui vector de Agrobacterium, spre exemplu un vector binar de Agrobacterium purtător al secvențelor Ti-graniță și al genei nptll (care conferă rezistența la 11 kanamicină și sub controlul promotorului nos (npt II)).
Celulele transformate sunt selecționate și regenerate în plante transgenice de tutun 13 (Ro). Plantele sunt cultivate până la maturitate și testate din punct de vedere al conținutului de nicotină; un subset de plante de tutun transformate prezintă nivele de nicotină semnificativ 15 scăzute, comparativ cu plantele martor netransformate.
Sunt apoi regenerate plantele Ro, iar segregarea transgenei este analizată în cadrul 17 generației următoare, R,. Generația Ri este cultivată până la maturitate și regenerată; segregarea transgenei printre descendenții R2 indică care plante R., sunt homozigoteîn ceea 19 ce privește transgena.
LISTA DE SECVENȚE
I (1) INFORMAȚII GENERALE (i) SOLICITANT: Conkling, Mark A.25
Mendu, Nandini
Song. Wen27 (ii) TITLUL INVENȚIEI: Reglarea exprimării chinolat fosforibozil transferazei (iii) NUMĂRUL DE SECVENȚE: 429 (iv) ADRESA DE CORESPONDENȚĂ:
(A) ADRESA: Kenneth Sibley, BellSeltzer Park & Gibson31 (B) Post Office Drawer 34009 (C) CITY: Charlotte33 (D) STATE: North Carolina (E) CONTRY: USA35 (F) ZIP:28234 (v) FORMA SUB CARE POATE FI CITITA INFORMAȚIA37 (A) MEDIUL SUPORT AL INFORMAȚIEI: disketă (B) CALCULATOR: IBM PC compatibil39 (C) SISTEM DE OPERARE: PC-DOS/MS-DOS (D) SOFTWARE: Patent In Release # 1,0, Version # 1,3041 (vi) DATE CURENTE PRIVIND CEREREA DE BREVET:
(A) NUMĂRUL CERERII:43 (B) DATA ÎNREGISTRĂRII:
(C) CLASIFICAREA:45 (viii) INFORMAȚII REFERITOARE LA ÎMPUTERNICIT/AGENT (A) NUME: Sibley, Kenneth D.47 (B) NUMĂR DE ÎNREGISTRARE: 31.665
RO 121968 Β1 (C) NUMĂR DE REFERINȚĂ/ROL:5051-338P (ix) INFORMAȚII PRIVIND TELECOMUNICAȚIA:
(A) TELEFON: 919-420-2200 (B) TELEFAX: 919-881-3175 (2) INFORMAȚII REFERITOARE LA SECV. ID. NR. 1:
(i) CARACTERISTICI DE SECVENȚĂ:
(A) LUNGIMEA: 1399 perechi de baze (B) TIPUL: acid nucleic (C) CATENA: mono (D) TOPOLOGIE: lineară (ii) TIPUL MOLECULEI: cADN (ix) TRĂSĂTURĂ:
(A) NUME/COD: CDS (B) LOCALIZARE: 52..1104 (xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SECV. ID. NR: 1
RO 121968 Β1
CAAAAACTAT TTTCCACAM ATTCATîTCA CAACCCCCCC AAMMAAAC C ATG ΤΠ 57 Het Phe
AGA GCT ATT CCT TTC ACT GCT ACA GTG CAT CCT TAT GCA ATT ACA GCT 105 Arg Ala 11« Pro Phe Thr Ala Thr Val Hts Pro Tyr Ala De Thr Ala
1015
CCA AGG KG GTG GTG AAA ATG TCA GCA ATA GCC ACC AAG AAT ACA AGA153
Pro Arg leu Val Val Lys Met Ser Ala Ile A1a Thr Lys Asn PirArg
2530
6Π3 GAG TCA TTA GAG GTG AAA CCA CCA GCA CAC.CCA ACT TAT GAT TTA201
Val Glu Ser Leu Glu Val Lys Pro Pro Ala His Pro Thr Tyr AspLeu
40 4550
AAG GAA GTT ATG AM CIT GCA CTC TCT GAA GAT GCT GGG MT TTA GGA249
Lys Glu Val Met Lys Leu Ala Leu Ser Glu Asp Ala Gly Asn LeuGly
6065
GAT GTG ACT TGT AAG GCG ACA ATT CCT CTT GAT ATG GAA TCC GAT GCT297
Asp Val Thr Cys Lys Ala Thr Ile Pro Leu Asp Mat Glu Ser AspAla
7580
CAT TTT CTA GCA AAG GAA GAC GGG ATC ATA GCA GGA ATT GCA CTT GCT345
His Phe Leu Ala lys Glu Asp Gly Ile Ile Ala Gly 11« Ala LeuAla
9095
GAG ATG ATA ÎTC GCG GAA GTT GAT CCT TCA TTA AAG GTG GAG TGG TAT393
Glu Het Ile Phe Ala Glu Val Asp Pro Ser Leu Lys Val Glu TrpTyr
100 10S110
GTA AAT GAT GGC GAT AAA GTT OT AM GGC TTG AAA TTT GGC AAA GTA441
Val Asn Asp Gly Asp Lys Val His Lys Gly leu Lys Phe Gly Lys Val
115 120 125230
CM GGA AAC GCT TAC MC ATT GTT ATA GCT GAS AGG GTT GTT CTC ΜΓ489
Gin Gly Asn Ala Tyr Asn Ile Val Ile Ala Glu Arg Val Val Leu Asn
135 140145
TTT ATG CM AGA ATG AST. GGA ATA GCT ACA CTA ACT AAG GAA ATG GCA 537 Phe Het Gin Arg Het Ser Gly Ile Ala Tir Leu Thr Lys Glu Het Ala
150 155160
GAT GCT GCA CAC CCT GCT TAC ATC TTC GAS ACT AGG AAA ACT GCT CCT 585 Asp Ala Ala H1s Pro Ala Tyr Ile Leu Glu Thr Arg Lys Thr Ala Pro
165 170175
RO 121968 Β1
GGA ΠΑ CGT TTG GTG GAT AAA TGG GCG GTA TTG ATC GGT GGG GGG AAG
Gly Leu Arg Leu Val Asp Lys lrp Ăla Val Leu Ile Gly Gly GlyLys
180 185190
MT CAC AGA ATG GGC TTA TTT GAT ATG GTA ATG ATA AM GAC AATCAC
Asn His Arg Met Gly Leu Phe Asp Met Val Met Ile Lys Asp AsnHis
195 200 205210
ATA TCT GCT GCT GGA GGT GTC GGC AAA GCT CTA MA TCT GTG GATCAG
Ile Ser Ala Ala Gly Gly Val Gly Lys Ala Leu Lys Ser Val AspGin
215 220225
T AT TTG GAG CM MT AAA CTT CM ATA GGG GTT GAG GTT GAA ACCAGG
Tyr Leu Glu Gin Asn Lys Leu Gin Ile Gly Val Glu Val Glu ThrArg
230 235240
ACA ATT GAA GAA GTA CGT GAG GTT CTA GAC TAT GCA TCT CM ACAAAG
Thr Ile Glu Glu Val Arg Glu Val Leu Asp Tyr Ala Ser Gin ThrLys
245 258255
ACT TCG TTC ACT AfiG ATA ATC CTG GAC AAT ATC GTT GTT CCA TTATCT
Thr Ser Leu Thr Arg II e Met Leu Asp Asn Met Val Val Pro LeuSer
260 265270
AAC GGA GAT ATT GAT GTA TCC ATG CTT AAG GAG GCT GTA GAA TTGATC
Asn Gly Asp Ile Asp Val Ser Met Leu Lys Glu Ala Val Glu LeuIle
275 280 285290
MT GGG AGG TTT GAT ACG GAG GCT TCA GGA AAT GTT ACC CTT GAAACA
Asn Gly Arg Phe Asp Thr Glu Ala Ser Gly Asn Val Thr Leu GluThr
295 300305
GTA CAC MG ATT GGA CAA ACT GGT CTT ACC TAC ATT TCT AGT GGTGCC
Val His Lys Ile Gly Gin Thr Gly Val Thr Tyr Ile Ser Ser GlyAla
310 315320
CTC ACG CAT TCC GTG AAA GCA CTT GAC ATT TCC CTG MG ATC GATACA
Leu Thr His Ser Val Lys Ala Leu Asp Ile Ser Leu Lys Ils AspThr
325 330335
GAG CTC GCC CTT GAA GTT GGA AGG CGT ACA AM CGA GCA TGAGCGCCAT Glu Leu Ala Leu Glu Val Glv Arg Arg Thr Lys Arg Ala
340 345350
TAOTCTGCT ATAGGGTTGG AGTAAMGCA GCTCMTASC TGAMfiGTCC MATAAGAAT CATîTTACTA GTTCTCAAAC AMAGATCCT TCACTGTGTA ATCAAACMA AAfîATGTAAA TTCCTGGMT ATCTCAGATG GCTCTTTTCC MCCTTATTG ClTCAfîTTGG ΤΑΑΤΓΤΟΑΠ ATAGCTHGT TTTCATCTTT CATBGAATÎT GTTACAATGA AMTACITGA TTTATAAGTT TGOTCTATCT MAATTCTGT CTTACTTCM ATATTTTGAG ATGTT
633
681
729
777
825
873
921
969
1017
1065
1114
1174
1234
1294
1354
1399
RO 121968 Β1 (2) INFORMAȚII REFERITOARE LA SECV. ID. NR:2:
(i) CARACTERISTICILE SECVENȚEI:
(A) LUNGIMEA: 351 aminoacizi (B) TIPUL: aminoacid (C) TOPOLOGIE: lineară (ii) TIPUL MOLECULEI: proteină (xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SECV. ID. NR:2
Het Phe Arg Ala Ile Pro Phe Thr Ala Thr /al His Pro Tyr Ala Ile 15 1015
Thr Ala Pro Arg Leu Val Val Lys Met Ser Ala Ile Ala Thr Lys Asn 20 2530
Thr Arg Val Glu Ser Leu Glu Val Lys Pro Pro Ala HIs Pro Thr Tyr 35 4045
Asp Leu Lys Glu Val Met Lys Leu Ala Leu Ser Glu Asq Ala Gly Asn 50 5560
Leu Gly Asp Val Thr Cys Lys Ala Thr ile Pjo Leu Asp Met Glu Ser 65 70 7580
Asp AU His Phe Leu Ala Lys Glu Asp Gly Ile Ile Ala Gly Ile Ah 85 9095
Leu Ah Glu Met He Phe Ala Glu Val Asp Pro Ser Leu Lys Val Glu 100 105110
Trp Tyr Val Asn Asp Gly Asp Lys Val His lys Gly Leu Lys Phe Gly 115 120125
Lys Val Gin Gly Asn Ala Tyr Asn Ile Val Ile Al a Glu Arg Val Val 130 135140
Leu Asn Phe Met Gin Arg Met Ser Gly Ile Ah Thr Leu Thr lysGlu
145 150 155160
Hei Ala Asp Ala Ala Hls Pro Ala Tyr Ile Leu Glu Thr Arg LysThr
165 170175
Ah Pro Gly Leu Arg Leu Val Asp Lys Trp Ah Val Leu Ile Gly Gly 160 185190
Gly Lys Asn His Arg Met’Gly leu Phe Asp Met Val Met Ile Lys Asp 195 200205
Asn His Ile Ser Ala Ala Gly Gly Val Gly Lys Ala Leu Lys Ser Val 210 215220
Asp Gîn Tyr Leu Glu Gin Asn Lys Leu Gin He Gly Val Glu Val Glu 225 230 235240
RO 121968 Β1
Ttir Arg Thr lle Glu Glu Val Arg Glu Văl Leu Asp Tyr Aia Ser Gin
245 250 255
Ihr Lys Thr Ser Leu Thr Arg ne Het Leu Asp Asn Het Val Val Pro
260 265 270
Leu Ser Asn Gly Asp lle Asp Val Ser Het leu Lys Glu Ala Val Glu
275 280 285
Leu lle Asn Gly Arg Phe Asp Thr Glu Ala Ser· Gly Asn Val Thr Leu
290 295 300
Glu ΊΠ1Γ Vd 1 l-lis Lys lle Gly Gin Thr Gly val Thr Tyr lle Ser Ser
305 310 315 320
Gly Ala Leu Ί hr His Ser Val Lys Ala Leu Asp lle Ser Leu Lys lle
325 330 335
Asp Thr Glu Leu 340 Ala Leu GTu Val Gly 345 Arg Arg Thr Lys Arg 350 Ala
(2) INFORMAȚII REFERITOARE LA SECV. ID. NR:3:
(i) CARACTERISTICILE SECVENȚEI:
(A) LUNGIMEA: 1053 perechi de baze (B) TIPUL: acid nucleic (C) CATENĂ: mono (D) TOPOLOGIE: lineară (ii) TIPUL MOLECULEI: cADN (xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SECV. ID. NR:3
RO 121968 Β1
ATGTTTAGAG CTATTCCTTT TIGGT6B1GA AAATGTCAGC AAACCACCAG CACACCCAAC GATGCTGGGA ATITAGGAfiA GATGCTCATT TTCTAGCAAA ATATTCGCGG AAGT1GATCC GnCATAAAG GCTTGAAAn GAGAGGGTTG TTCTCAATTT ATGGCAGATG CTGCACACGC CGTlTGGTGG ATAAATGGGC TnGATATGG TAATGATAAA CTAAAATCTG TGGATCAGTA ACCAGGACM HGAAGAAGT nGACTAGGA TAATGCTGGA TCCATGCTTA AGMCTST MTGTTACCC HGAâACAGT GGTGCCCTGA CGCATTCCCT GCCCTTGAAG HGGAASGCG
CACTGCTACA GTGCATCCTT AATAGCCACC AAGAATACAA TTATGATTTA AAGGAAGTTA TGTGACTTBT AAGGCGACAA GGAAGACGGG AICATAGCAG nCAUAAAG GTGGAGTGGT TGGCAAAGTA CAAGGAAACG TATGCAAAGA ATGAGTGGM TGCT1ACATC HGGAGACTA GGTAKGATC ggtgggggga AGACAATCAC ATATCTGCTG TÎTGGAGCAA AAÎAAACTfC ACGTGAGGTȚ CTAGACTATR CAATATGGTȚ GHTCCAITAT AGAATTCATC AAT6GGAGGT ACACAAGATT GGACAMCTG GAAAGCACTT GACATTTCCC TACAAAACGA GCA
ATGC/WTAC AGCTCCAAGG GAGTGGAGTC AflAGAOGlG TGAAACTTGC ACrCTCTGAA TTCCTCTTGA TATGGAATCC GAAHGCACT TGCTGAGATG ATGTAAATGA TGGCGATAAA CTTACAACAT TGTTATAGCT TAfiCTACACT AACTAAGGAA. GGAAAACTGC TCCTSSAHA AGAATCACAG AATGGGCTÎA CTGGAGG1G1 CGGCAAAGCT AAATAGGGGT TGAGGTFGAA CA7CTCAAAC AAAGACTTCG CTAACGGAGA TAÎTGATCTA UGATACGGA GGCTTCAGGA GTGTTACCTA CATTTCTAGT TGMGATCGA TACAGAGCTC
60
L20 3
180 5
240
300 7
360 9
420
480 11
540 13
600
650 15
720 17
780
340 19
900 21
960 23
1020
1053 25

Claims (46)

  1. Revendicări29
    1. Moleculă izolată de ADN, caracterizată prin aceea că, cuprinde o secvență 31 selecționată din grupul de secvențe alcătuit din:
    a) secvența SECV. ID Nr.:1;33
    b) secvențe de ADN care codifică o enzimă având secvența de aminoacizi din
    SECV. ID Nr.:2; '35
    c) secvențe de ADN care au cel puțin omologie de 65% cu ADN-ul izolat de la punctele a) și b) și care codifică pentru o enzimă chinolat fosforibozil transferaza; și37
    d) secvențe de ADN care diferă de secvențele ADN de la punctele a), b) sau c) de mai sus, datorită degenerării codului genetic și care codifică pentru o enzimă chinolat 39 fosforibozil transferaza.
  2. 2. Construct ADN, caracterizat prin aceea că, cuprinde, în direcția 5'-3’ un promotor 41 funcțional într-o celulă vegetală și o secvență de ADN cuprinzând o secvență codificatoare a chinolat fosforibozil transferazei conform revendicării 1, poziționată în aval față de pro- 43 motorul menționat și asociată funcțional cu acesta.
  3. 3. Construct ADN, caracterizat prin aceea că, cuprinde, în direcția 5'-3' un promotor 45 vegetal și o secvență de ADN cuprinzând o secvență codificatoare a chinolat fosforibozil transferazei conform revendicării 1, poziționată în aval față de promotorul menționat și 47 asociată funcțional cu acesta, secvența ADN respectivă fiind în orientare antisens.
    RO 121968 Β1
  4. 4. Construct ADN, conform revendicării 2, caracterizat prin aceea că, cuprinde, în direcția 5-3' un promotor funcțional într-o celulă vegetală și o secvență de ADN codificatoare a chinolat fosforibozii transferazei vegetale, care are secvența de nucleotidă din SECV. ID NR.:1 conform revendicării 1, ADN-ul respectiv fiind asociat funcțional cu promotorul.
  5. 5. Construct ADN, conform revendicării 3, caracterizat prin aceea că, cuprinde, în direcția 5'-3’ un promotor funcțional într-o celulă vegetală și un ADN care codifică o chinolat fosforibozii transferază vegetală care are secvența de nucleotide din SECV ID NR.:1 conform revendicării 1, ADN-ul respectiv fiind în orientare antisens și asociat funcțional cu promotorul.
  6. 6. Construct ADN, conform revendicărilor 2, 3, 4 sau 5, caracterizat prin aceea că promotorul este constitutiv activ în celulele de plante.
  7. 7. Construct ADN, conform revendicărilor 2, 3, 4 sau 5, caracterizat prin aceea că promotorul este activ în mod selectiv în celulele țesutului radicular al plantei.
  8. 8. Construct ADN, conform oricăreia din revendicările 2-5, caracterizat prin aceea că promotorul este activ în mod selectiv în celulele cortexului radicular al plantei.
  9. 9. Construct ADN, conform oricăreia din revendicările 2-7, caracterizat prin aceea că, conține suplimentar o plasmidă.
  10. 10. Construct ADN, conform oricăreia din revendicările 2-9, caracterizat prin aceea că este purtat de un vector de transformare la plante.
  11. 11. Construct ADN, conform revendicării 10, caracterizat prin aceea că vectorul de transformare la plante este un vector de Agrobacterium tumefaciens.
  12. 12. Celulă de plantă, caracterizată prin aceea că, cuprinde un construct ADN conform oricăreia din revendicările 2-11.
  13. 13. Plantă transgenică, caracterizată prin aceea că, cuprinde celule de plantă definite în revendicarea 12.
  14. 14. Peptidă, caracterizată prin aceea că, cuprinde secvența de aminoacizi din SECV. ID Nr.: 2.
  15. 15. Peptidă, conform revendicării 14, caracterizată prin aceea că este codificată de o secvență de ADN selectată din grupul de secvențe cuprinzând:
    a) secvența SECV. ID Nr.: 1;
    b) secvențe de ADN care au cel puțin omologie de 65% cu ADN-ul izolat de la punctul
    a) de mai sus și care codifică pentru o enzimă chinolat fosforibozii transferaza; și
    c) secvențe de ADN care diferă de secvențele ADN de la punctele a) sau b) de mai sus, datorită degenerării codului genetic și care codifică pentru o enzimă chinolat fosforibozii transferaza.
  16. 16. Procedeu de obținere a unei celule vegetale transgenice cu o expresie diminuată a chinolat fosforibozii transferazei, caracterizat prin aceea că, cuprinde:
    - furnizarea unei celule de plantă de un tip cunoscut care să exprime chinolat fosforibozii transferaza,
    -furnizarea unui construct ADN exogen, care cuprinde, în direcția 5'-3' un promotor funcțional într-o celulă vegetală și o secvență heteroloagă de ADN care conține o porțiune a secvenței care codifică ARNm al chinolat fosforibozii transferazei și este selectat din secvențele ADN definite în revendicarea 1, secvența heteroloagă de ADN fiind asociată funcțional cu promotorul respectiv și
    -transformarea celulei vegetale respective cu constructul ADN menționat, pentru a produce celule transformate, respectiva celulă vegetală transformată având o expresie diminuată a QPRT-azei comparativ cu o celulă de plantă netransformată,și ADN-ul heterolog cuprinzând cel puțin 25 de nucleotide din secvența de ADN definită în revendicarea 1.
    RO 121968 Β1
  17. 17. Procedeu conform revendicării 16, caracterizat prin aceea că secvența 1 heteroloagă de ADN este în orientare antisens.
  18. 18. Procedeu conform revendicării 16, caracterizat prin aceea că secvența 3 heteroloagă de ADN este în orientare sens.
  19. 19. Procedeu conform oricăreia din revendicările 16-18, caracterizat prin aceea că 5 celula de plantă este Nicotiana tabacum.
  20. 20. Procedeu conform oricăreia din revendicările 16-19, caracterizat prin aceea că 7 cuprinde suplimentar regenerarea unei plante din celula vegetală transformată menționată în revendicarea 16.9
  21. 21. Procedeu conform oricăreia din revendicările 16-20, caracterizat prin aceea că promotorul este un promotor constitutiv activ.11
  22. 22. Procedeu conform oricăreia din revendicările 16-20, caracterizat prin aceea că, promotorul este activ în mod selectiv în celulele țesutului radicular al plantei.13
  23. 23. Procedeu conform oricăreia din revendicările 16-20, caracterizat prin aceea că promotorul este activ în mod selectiv în celulele cortexului radicular al plantei.15
  24. 24. Procedeu conform oricăreia din revendicările 16-23, caracterizat prin aceea că etapa de transformare este realizată prin bombardarea celulei vegetale menționate în reven-17 dicarea 16 cu microparticule care poartă constructul ADN menționat în revendicarea 16.
  25. 25. Procedeu conform oricăreia din revendicările 16-23, caracterizat prin aceea că 19 etapa de transformare este realizată prin infectarea celulelor vegetale menționate în revendicarea 16 cu un Agrobacterium tumefaciens care conține o plasmidă Ti care poartă 21 constructul ADN menționat în revendicarea 16.
  26. 26. Procedeu conform oricăreia din revendicările 16-25, caracterizat prin aceea că 23 secvența heteroloagă de ADN cuprinde o secvență codificatoare a chinolat fosforibozil transferazei și este selectată din secvențele ADN conform revendicării 1 și este comple- 25 mentară cu ARNm-ul pentru chinolat fosforibozil transferază exprimat în celula vegetală menționată în revendicarea 16, într-o regiune selectată din: 27
    a) secvența netranslatată de la capătul 5' al ARNm-ului pentru chinolat fosforibozil transferază; 29
    b) secvența netranslatată de la capătul 3’ al ARNm-ului pentru chinolat fosforibozil transferază; și 31
    c) regiunea translatată a ARNm-ului pentru chinolat fosforibozil transferază.
  27. 27. Procedeu conform oricăreia din revendicările 16-26, caracterizat prin aceea că 33 secvența de ADN heteroloagă cuprinde o secvență de codificare a chinolat fosforibozil transferazei și este selectată din secvențele ADN conform revendicării 1 și este complemen- 35 tară cu cel puțin 15 nucleotide ale ARNm-ului pentru chinolat fosforibozil transferază exprimat în celula de plantă menționată în revendicarea 16. 37
  28. 28. Procedeu conform oricăreia din revendicările 16-26, caracterizat prin aceea că secvența de ADN heteroloagă cuprinde o secvență care codifică chinolat fosforibozil 39 transferaza și este selectată din secvențele ADN conform revendicării 1 și este complementară cu cel puțin 200 nucleotide ale ARNm-ului pentru chinolat fosforibozil transferază 41 exprimat în celula de plantă menționată în revendicarea 16.
  29. 29. Procedeu conform oricăreia din revendicările 16-25, caracterizat prin aceea că 43 secvența de ADN heteroloagă cuprinde secvența de nucleotidă care codifică chinolat fosforibozil transferaza, din SECV. ID Nr.: 1, conform revendicării 1. 45
  30. 30. Plantă transgenică din genul Nicotiana având diminuată expresia chinolat fosforibozil transferazei comparativ cu o plantă de control netransformată, caracterizată prin 47 aceea că, cuprinde celule de plantă transgenică care conțin:
    RO 121968 Β1
    a) un construct ADN exogen care cuprinde, în direcția 5'-3', un promotor funcțional în celula vegetală menționată și o secvență ADN heteroloagă care cuprinde un segment al unei secvențe ADN ce codifică un ARNm al chinolat fosforibozil transferazei vegetale, selectat din secvențele ADN conform revendicării 1, ADN-ul respectiv fiind asociat funcțional cu promotorul;
    b) planta prezentând o expresie redusă a chinolat fosforibozil transferazei comparativ cu o plantă martor netransformată, și ADN-ul heterolog cuprinzând cel puțin 25 de nucleotide ale unei secvențe ADN conform revendicării 1.
  31. 31. Plantă conform revendicării 30, caracterizată prin aceea că secvența heteroloagă de ADN este în orientare antisens.
  32. 32. Plantă conform revendicării 30, caracterizată prin aceea că secvența heteroloagă de ADN este în orientare sens.
  33. 33. Plantă transgenică din genul Nicotiana, având o expresie diminuată a chinolat fosforibozil transferazei comparativ cu o plantă martor netransformată, caracterizată prin aceea că este un descendent al plantei conform revendicării 30.
  34. 34. Procedeu de reducere a expresiei genei pentru chinolat fosforibozil transferaza într-o celulă vegetală, caracterizat prin aceea că, cuprinde:
    - creșterea unei celule vegetale transformate să conțină o secvență heteroloagă de ADN selectată din secvențele ADN conform revendicării 1, în care o catenă transcrisă a respectivei secvențe heteroloage de ADN este complementară cu ARNm pentru chinolat fosforibozil transferaza endogen la celula menționată, în care transcrierea respectivei catene complementare reduce expresia genei chinolat fosforibozil transferazei.
  35. 35. Procedeu de obținere a unei plante de tutun cu nivele scăzute de nicotină în frunze, caracterizat prin aceea că, cuprinde:
    - creșterea unei plante de tutun sau a unui descendent al acesteia, în care respectiva plantă cuprinde celulele conținând un construct ADN exogen, cuprinzând o regiune de inițiere a transcrierii, funcțională în planta menționată și o secvență de ADN heteroloagă, selectată din secvențele ADN conform revendicării 1, legate funcțional la regiunea de inițiere a transcrierii amintită, în care catena transcrisă a secvenței heteroloagă de ADN menționată este complementară cu ARNm endogen pentru chinolat fosforibozil transferază în celulele respective.
  36. 36. Procedeu de obținere a unei celule de plantă transgenică cu nivel crescut al expresiei chinolat fosforibozil transferazei, caracterizat prin aceea că, cuprinde:
    - furnizarea unei celule de plantă de un tip cunoscut pentru a exprima chinolat fosforibozil transferaza;
    -furnizarea unui construct ADN exogen, care să conțină, în direcția 5’-3', un promotor funcțional într-o celulă vegetală și o secvență ADN heteroloagă care codifică pentru chinolat fosforibozil transferaza și este selectată din secvențele ADN conform revendicării 1, secvența de ADN heteroloagă fiind asociată funcțional cu promotorul respectiv;
    - transformarea celulei vegetale menționate cu constructul de ADN menționat pentru a produce o celulă vegetală transformată, celula vegetală transformată respectivă având o expresie crescută a chinolat fosforibozil transferazei comparativ cu o celulă vegetală netransformată.
  37. 37. Plantă transgenică din genul Nicotiana având o expresie crescută a chinolat fosforibozil transferazei comparativ cu o plantă martor netransformată, caracterizată prin aceea că, cuprinde celule de plantă transgenică care conțin:
    RO 121968 Β1
    a) un construct ADN exogen care cuprinde, în direcția 5’-3’, un promotor funcțional 1 în celula vegetală menționată și o secvență heteroloagă de ADN care codifică o chinolat fosforibozil transferază vegetală selectată dintre secvențele ADN definite în revendicarea 1, 3
    ADN-ul heterolog respectiv fiind funcțional asociat cu promotorul menționat;
    b) planta având o expresie crescută a chinolat fosforibozil transferazei și prin urmare 5 nivele crescute de nicotină în frunze, față de o plantă martor netransformată.
  38. 38. Celulă de plantă transgenică din genul Nicotiana având o expresie crescută a 7 chinolat fosforibozil transferazei comparativ cu o celulă de plantă netransformată, caracterizată prin aceea că este un descendent al unei plantei conform revendicării 37. 9
  39. 39. Procedeu pentru creșterea expresiei genei chinolat fosforibozil transferazei într-o celulă de plantă, caracterizat prin aceea că, cuprinde: 11
    - creșterea unei celulele vegetale transformată pentru a conține un ADN exogen selectat dintre secvențele de ADN conform revendicării 1, în care ADN-ul exogen codifică 13 pentru chinolat fosforibozil transferază.
  40. 40. Procedeu conform revendicării 39, caracterizat prin aceea că, celula vegetală 15 transformată se obține prin procedeul care cuprinde:
    - integrarea în genomul unei celule vegetale gazdă a unui construct exogen de ADN 17 care cuprinde, în direcția transcrierii, un promotor funcțional în celula vegetală menționată, o secvență heteroloagă de ADN care codifică pentru chinolat fosforibozil transferază 19 funcțională în celula menționată și este selectată dintre secvențele de ADN conform revendicării 1, secvența heteroloagă de ADN fiind asociată funcțional la promotorul menționat și 21 o regiune de terminare a transcrierii, funcțională în celula menționată, prin aceasta obținându-se o celulă vegetală transformată. 23
  41. 41. Procedeu de obținere a unei plante de tutun cu nivele crescute de nicotină în frunze, caracterizat prin aceea că, cuprinde: 25
    - creșterea unei plante de tutun sau a unui descendent al acesteia, în care planta res- pectiva cuprinde celule conținând un construct ADN exogen cuprinzând o transcriere 27 funcțională a regiunii de inițiere în planta menționată și o secvență heteroloagă de ADN, selectată dintre secvențele ADN conform revendicării 1, legate funcțional la regiunea men- 29 ționată de inițiere a transcrierii, în care secvența heteroloagă de ADN menționată codifică pentru chinolat fosforibozil transferaza funcțională în celulele respective. 31
  42. 42. Plantă transgenică conform revendicărilor 30, 33 sau 37 sau celula de plantă transgenică conform revendicării 38, în care genul Nicotiana cuprinde Nicotiana tabacum, 33 Nicotiana rustica și Nicotiana glutinosa.
  43. 43. Utilizarea unei celule de plantă de tutun conform revendicării 12 pentru fabricarea 35 unui produs de tutun cu un conținut mai scăzut de nicotină.
  44. 44. Utilizarea unei celule de plantă de tutun conform revendicărilor 30-33 pentru fa- 37 bricarea unui produs de tutun cu un conținut mai scăzut de nicotină.
  45. 45. Utilizarea unei celule de plantă de tutun conform revendicării 38 pentru fabricarea 39 unui produs de tutun cu un conținut crescut de nicotină.
  46. 46. Utilizarea unei celule de plantă de tutun conform revendicării 37 pentru fabricarea 41 unui produs de tutun cu un conținut crescut de nicotină.
RO99-01306A 1997-06-12 1998-06-10 Reglarea exprimării chinolat fosforibozil transferazei RO121968B1 (ro)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US4947197P 1997-06-12 1997-06-12
PCT/US1998/011893 WO1998056923A1 (en) 1997-06-12 1998-06-10 Regulation of quinolate phosphoribosyl transferase expression

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RO121968B1 true RO121968B1 (ro) 2008-09-30

Family

ID=21960004

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RO99-01306A RO121968B1 (ro) 1997-06-12 1998-06-10 Reglarea exprimării chinolat fosforibozil transferazei

Country Status (37)

Country Link
US (9) US6586661B1 (ro)
EP (3) EP1457563B1 (ro)
JP (4) JP4095678B2 (ro)
KR (1) KR100365969B1 (ro)
CN (2) CN100482799C (ro)
AP (1) AP1169A (ro)
AT (1) ATE262039T1 (ro)
AU (1) AU748514B2 (ro)
BG (1) BG64319B1 (ro)
BR (1) BRPI9810870B1 (ro)
CA (2) CA2484366A1 (ro)
CU (1) CU23174A3 (ro)
CZ (1) CZ297379B6 (ro)
DE (2) DE69822463T2 (ro)
DK (1) DK0991766T3 (ro)
EA (2) EA009898B1 (ro)
EE (1) EE04595B1 (ro)
ES (1) ES2154624T3 (ro)
GE (1) GEP20032871B (ro)
GR (1) GR20010300003T1 (ro)
HU (1) HU225888B1 (ro)
ID (1) ID29311A (ro)
IL (3) IL132184A0 (ro)
LT (1) LT4706B (ro)
LV (1) LV12507B (ro)
NO (1) NO324872B1 (ro)
NZ (1) NZ500963A (ro)
OA (1) OA11219A (ro)
PL (1) PL201266B1 (ro)
PT (1) PT991766E (ro)
RO (1) RO121968B1 (ro)
RS (1) RS49677B (ro)
SI (1) SI20215B (ro)
SK (1) SK161899A3 (ro)
TR (1) TR199902728T2 (ro)
UA (1) UA72187C2 (ro)
WO (1) WO1998056923A1 (ro)

Families Citing this family (53)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6586661B1 (en) * 1997-06-12 2003-07-01 North Carolina State University Regulation of quinolate phosphoribosyl transferase expression by transformation with a tobacco quinolate phosphoribosyl transferase nucleic acid
US20100251425A9 (en) * 1998-05-15 2010-09-30 University Of Central Florida Expression of human interferon in transgenic chloroplasts
DE19926216A1 (de) * 1999-06-09 2001-02-22 Metallgesellschaft Ag Verfahren zur Herstellung von Bariumsulfat, Bariumsulfat und Verwendung des Bariumsulfats
CN1330753C (zh) * 2000-08-30 2007-08-08 北卡罗莱纳州立大学 含有可改变蛋白含量的分子诱导物的转基因植物
DE60128149D1 (en) * 2000-11-07 2007-06-06 Univ North Carolina State Putrescin-n-methyltransferasepromotor
DE10055870A1 (de) 2000-11-10 2002-05-29 Degussa Neue für das nadC-Gen kodierende Nukleotidsequenzen
WO2002037990A2 (en) 2000-11-10 2002-05-16 Vector Tobacco Ltd. Method and product for removing carcinogens from tobacco smoke
CN1954688A (zh) * 2001-06-06 2007-05-02 二十二世纪有限责任公司 烟草生物质的用途
US20060157072A1 (en) * 2001-06-08 2006-07-20 Anthony Albino Method of reducing the harmful effects of orally or transdermally delivered nicotine
WO2005103296A2 (en) * 2004-03-30 2005-11-03 Vector Tobacco, Ltd. Global gene expression analysis of human bronchial epithelial cells exposed to cigarette smoke, smoke condensates, or components thereof
CN1638655A (zh) * 2001-06-08 2005-07-13 韦克多烟草有限公司 修饰烟草中烟碱和亚硝胺的水平
US6730832B1 (en) 2001-09-10 2004-05-04 Luis Mayan Dominguez High threonine producing lines of Nicotiana tobacum and methods for producing
EP1441603A2 (en) * 2001-11-09 2004-08-04 Vector Tobacco Inc. Method and composition for mentholation of charcoal filtered cigarettes
JP2005512554A (ja) * 2001-12-19 2005-05-12 ベクター・タバコ・インコーポレーテッド タバコ製品に清涼効果を付与する方法および組成物
AU2002357903A1 (en) * 2001-12-19 2003-07-09 Vector Tobacco Inc. Method and composition for mentholation of cigarettes
KR20050002921A (ko) * 2002-04-09 2005-01-10 벡터 토바코 리미티드 니코틴과 니트로사민류를 감소시킨 담배
MXPA06001591A (es) 2003-08-19 2006-05-19 22Nd Century Ltd Llc Productos de tabaco de exposicion reducida.
US7920906B2 (en) 2005-03-10 2011-04-05 Dexcom, Inc. System and methods for processing analyte sensor data for sensor calibration
WO2005041151A2 (en) * 2003-10-02 2005-05-06 Vector Tobacco Ltd. Tobacco product labeling system
US9247900B2 (en) 2004-07-13 2016-02-02 Dexcom, Inc. Analyte sensor
US7538071B2 (en) 2003-11-21 2009-05-26 Carl Berger Methods of reducing the nicotine content of tobacco plants and tobacco plants obtained thereby
US8792955B2 (en) 2004-05-03 2014-07-29 Dexcom, Inc. Transcutaneous analyte sensor
US7654956B2 (en) 2004-07-13 2010-02-02 Dexcom, Inc. Transcutaneous analyte sensor
AU2012203977B2 (en) * 2005-02-28 2015-01-29 22Nd Century Limited, Llc Reducing levels of nicotinic alkaloids in plants
JP4892744B2 (ja) * 2005-02-28 2012-03-07 国立大学法人 奈良先端科学技術大学院大学 植物におけるニコチン類縁アルカロイド量を低下させる方法
NZ564025A (en) 2005-05-11 2012-03-30 Vector Tobacco Inc Reduced risk tobacco products and methods of making same
FR2889003A1 (fr) * 2005-07-22 2007-01-26 St Microelectronics Sa Adaptation automatique d'une source video a un recepteur
CA2853387C (en) 2006-06-19 2018-04-17 National Research Council Of Canada Nucleic acid encoding n-methylputrescine oxidase and uses thereof
PL2450446T3 (pl) 2006-09-13 2015-10-30 22Nd Century Ltd Llc Zwiększanie poziomów alkaloidów nikotynowych
US9551003B2 (en) 2006-09-13 2017-01-24 22Nd Century Limited, Llc Increasing levels of nicotinic alkaloids in plants
US9102948B2 (en) 2006-11-17 2015-08-11 22Nd Century Limited, Llc Regulating alkaloids
US9106606B1 (en) 2007-02-05 2015-08-11 F5 Networks, Inc. Method, intermediate device and computer program code for maintaining persistency
US8822757B2 (en) 2007-05-25 2014-09-02 National Research Council Of Canada Nucleic acid sequences encoding transcription factors regulating nicotine alkaloid biosynthesis and their use in modifying plant metabolism
US20100206317A1 (en) * 2007-09-28 2010-08-19 Vector Tobacco, Inc. Reduced risk tobacco products and use thereof
ES2527272T3 (es) * 2007-12-13 2015-01-22 Philip Morris Products S.A. Plantas transgénicas modificadas para el transporte de cadmio reducido, productos derivados y métodos relacionados
WO2011062298A1 (ja) 2009-11-19 2011-05-26 国立大学法人岡山大学 遺伝子発現を上昇させるシステム及び該システムを保持したベクター
WO2011071773A1 (en) 2009-12-11 2011-06-16 Caridianbct, Inc. System for blood separation with shielded extraction port and optical control
WO2011102394A1 (ja) 2010-02-17 2011-08-25 日本たばこ産業株式会社 植物内容成分の調節因子、およびその利用
US9862923B2 (en) 2010-03-26 2018-01-09 Philip Morris Usa Inc. Cultured tobacco cells as a matrix for consumable products
EP2565265A1 (en) 2011-09-02 2013-03-06 Philip Morris Products S.A. Isopropylmalate synthase from Nicotiana tabacum and methods and uses thereof
US8716571B2 (en) 2011-09-21 2014-05-06 Reynolds Technologies, Inc. Tobacco having reduced amounts of amino acids and methods for producing such lines
US9137958B2 (en) 2012-02-08 2015-09-22 Reynolds Technologies, Inc. Tobacco having altered amounts of environmental contaminants
MX2015008084A (es) * 2012-12-21 2016-03-31 Philip Morris Products Sa Reduccion de nitrosamina especifica de tabaco en plantas.
CN103173488B (zh) * 2013-03-14 2014-09-03 浙江省农业科学院 新的融合标签进行水稻转基因快速筛选的方法
US10375910B2 (en) 2013-03-15 2019-08-13 Altria Client Services Llc Development of tobacco varieties with no or significantly reduced anatabine content
EP3291668A4 (en) * 2015-05-05 2019-01-23 North Carolina State University METHOD AND COMPOSITIONS FOR REDUCING TOBACCO-SPECIFIC NITROSAMINE NNK IN TOBACCO
WO2016210303A1 (en) 2015-06-26 2016-12-29 Altria Client Services Llc Compositions and methods for producing tobacco plants and products having altered alkaloid levels
EP3480314A1 (en) 2017-11-03 2019-05-08 Philip Morris Products S.A. Regulation of alkaloid content
US10897925B2 (en) 2018-07-27 2021-01-26 Joseph Pandolfino Articles and formulations for smoking products and vaporizers
US20200035118A1 (en) 2018-07-27 2020-01-30 Joseph Pandolfino Methods and products to facilitate smokers switching to a tobacco heating product or e-cigarettes
WO2021072288A1 (en) * 2019-10-10 2021-04-15 Altria Client Services Llc Compositions and methods based on qpt engineering for producing tobacco plants and products having altered alkaloid levels
CN113528537A (zh) * 2021-08-11 2021-10-22 云南省烟草农业科学研究院 一种降低烟叶烟碱含量的NtQPT2基因突变体及其应用
CN116983432A (zh) * 2023-07-07 2023-11-03 深圳先进技术研究院 用于治疗类风湿性关节炎的药物

Family Cites Families (216)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US38123A (en) * 1863-04-07 Improvement in harvesters
US299541A (en) * 1884-06-03 heae-n
US254285A (en) * 1882-02-28 David w
US819751A (en) * 1905-01-04 1906-05-08 Giuseppe Gianoli Process of charging silk.
US2479526A (en) * 1940-12-11 1949-08-16 Wurton Machine Company Apparatus for curing green tobacco
US2728803A (en) 1951-12-28 1955-12-27 Standard Oil Co Separation of ethylbenzene from other c8 aromatic hydrocarbons by extraction with hf-bf3
US2728603A (en) 1954-12-13 1955-12-27 James H Stagg Lawn and garden sprinkler
DE1917552U (de) 1964-01-31 1965-06-10 Fritz Tautenhahn Flaechig-ornamentales gitterwerk.
US3693631A (en) 1971-04-28 1972-09-26 Reynolds Leasing Corp Tobacco expansion process
US3840025A (en) * 1972-08-14 1974-10-08 Industrial Nucleonics Corp Tobacco moisture control system and method
US3905123A (en) * 1973-10-15 1975-09-16 Industrial Nucleonics Corp Method and apparatus for controlling a tobacco dryer
US4319587A (en) * 1975-06-09 1982-03-16 Irving S. Moser Smoking article
DE7522272U (de) * 1975-07-12 1977-06-02 Deutsche Benkert Gmbh & Co Kg, 4690 Herne Poroeses mundstueckbelagpapier
US4192323A (en) * 1977-09-21 1980-03-11 Gas-Fired Products, Inc. Apparatus and method for automatically controlling curing conditions in a tobacco curing barn
US4557280A (en) 1978-06-15 1985-12-10 Brown & Williamson Tobacco Corporation Process for reduction of nitrate and nicotine content of tobacco by microbial treatment
US4243056A (en) * 1979-01-12 1981-01-06 Philip Morris Incorporated Method for uniform incorporation of additives into tobacco
FR2478958A1 (fr) * 1980-04-01 1981-10-02 Decoufle Dispositif d'alimentation en encre des appareils d'imprimerie pour machines a confectionner les cigarettes
US4499911A (en) * 1980-12-09 1985-02-19 Johnson William H Energy efficient curing and drying system
GB2092149B (en) * 1981-02-03 1985-01-03 Searle & Co Imidazoline hydrazone and hydrazine derivatives production thereof and use in medicine
US4459355A (en) * 1982-07-12 1984-07-10 International Paper Company Method for transforming plant cells
US4762785A (en) 1982-08-12 1988-08-09 Calgene, Inc. Novel method and compositions for introducting alien DNA in vivo
NL8203963A (nl) * 1982-10-14 1984-05-01 Naarden International Nv Werkwijze voor het aromatiseren van droog plantaardig materiaal.
ATE52800T1 (de) 1983-01-13 1990-06-15 Max Planck Gesellschaft Verfahren zum einbringen von expressionsfaehigen genen in pflanzenzellgenome und hybride ti plasmidvektoren enthaltende agrobacterium-staemme verwendbar in diesem verfahren.
US6051757A (en) 1983-01-14 2000-04-18 Washington University Regeneration of plants containing genetically engineered T-DNA
JPH0714349B2 (ja) 1983-01-17 1995-02-22 モンサント カンパニ− 植物細胞での発現に適したキメラ遺伝子
US5034322A (en) 1983-01-17 1991-07-23 Monsanto Company Chimeric genes suitable for expression in plant cells
EP0131620B1 (en) 1983-01-17 1991-08-21 Monsanto Company Genetically transformed plants
US6174724B1 (en) 1983-01-17 2001-01-16 Monsanto Company Chimeric genes suitable for expression in plant cells
US5352605A (en) 1983-01-17 1994-10-04 Monsanto Company Chimeric genes for transforming plant cells using viral promoters
WO1984002919A1 (en) 1983-01-17 1984-08-02 Monsanto Co Plasmids for transforming plant cells
NL8300698A (nl) 1983-02-24 1984-09-17 Univ Leiden Werkwijze voor het inbouwen van vreemd dna in het genoom van tweezaadlobbige planten; agrobacterium tumefaciens bacterien en werkwijze voor het produceren daarvan; planten en plantecellen met gewijzigde genetische eigenschappen; werkwijze voor het bereiden van chemische en/of farmaceutische produkten.
NL8300699A (nl) 1983-02-24 1984-09-17 Univ Leiden Werkwijze voor het inbouwen van vreemd dna in het genoom van tweezaadlobbige planten; werkwijze voor het produceren van agrobacterium tumefaciens bacterien; stabiele cointegraat plasmiden; planten en plantecellen met gewijzigde genetische eigenschappen; werkwijze voor het bereiden van chemische en/of farmaceutische produkten.
US4751348A (en) 1983-07-16 1988-06-14 Cold Spring Harbor Laboratory Nicotiana plants with both altered polyamine levels and flower structures and method for obtaining these plants
US4766855A (en) * 1983-07-20 1988-08-30 Cummins Engine Co., Inc. Plasma jet ignition apparatus
US5190931A (en) 1983-10-20 1993-03-02 The Research Foundation Of State University Of New York Regulation of gene expression by employing translational inhibition of MRNA utilizing interfering complementary MRNA
US5272065A (en) 1983-10-20 1993-12-21 Research Foundation Of State University Of New York Regulation of gene expression by employing translational inhibition of MRNA utilizing interfering complementary MRNA
DE3486479T2 (de) 1983-10-20 2001-09-20 The Research Foundation Of State University Of New York, Albany Regulierung der Genexpression durch Translationshemmung unter Verwendung von mRNA hindernder Komplementär-RNA
US5208149A (en) 1983-10-20 1993-05-04 The Research Foundation Of State University Of New York Nucleic acid constructs containing stable stem and loop structures
US4885248A (en) 1984-02-15 1989-12-05 Lubrizol Genetics, Inc. Transfer vector
US4771002A (en) 1984-02-24 1988-09-13 Lubrizol Genetics, Inc. Transcription in plants and bacteria
NL8401780A (nl) 1984-06-04 1986-01-02 Rijksuniversiteit Leiden En Pr Werkwijze voor het inbouwen van vreemd dna in het genoom van planten.
US5149645A (en) 1984-06-04 1992-09-22 Rijksuniversiteit Leiden Process for introducing foreign DNA into the genome of plants
US4945050A (en) 1984-11-13 1990-07-31 Cornell Research Foundation, Inc. Method for transporting substances into living cells and tissues and apparatus therefor
US5100792A (en) 1984-11-13 1992-03-31 Cornell Research Foundation, Inc. Method for transporting substances into living cells and tissues
US5036006A (en) 1984-11-13 1991-07-30 Cornell Research Foundation, Inc. Method for transporting substances into living cells and tissues and apparatus therefor
EP0189707B1 (en) 1984-12-28 1993-08-25 Plant Genetic Systems N.V. Recombinant dna which can be introduced into plant cells
US6281410B1 (en) 1986-07-31 2001-08-28 Calgene Llc Methods and compositions for regulated transcription and expression of heterologous genes
US4943674A (en) 1987-05-26 1990-07-24 Calgene, Inc. Fruit specific transcriptional factors
US5753475A (en) 1985-01-17 1998-05-19 Calgene, Inc. Methods and compositions for regulated transcription and expression of heterologous genes
US6617496B1 (en) 1985-10-16 2003-09-09 Monsanto Company Effecting virus resistance in plants through the use of negative strand RNAs
NL8502948A (nl) 1985-10-29 1987-05-18 Rijksuniversiteit Leiden En Pr Werkwijze voor het inbouwen van "vreemd dna" in het genoom van dicotyle planten.
US4795855A (en) * 1985-11-14 1989-01-03 Joanne Fillatti Transformation and foreign gene expression with woody species
GB8529851D0 (en) 1985-12-04 1986-01-15 Rothmans Of Pall Mall Linear layered cigarette
US5453566A (en) 1986-03-28 1995-09-26 Calgene, Inc. Antisense regulation of gene expression in plant/cells
IL81737A (en) 1986-03-28 1992-11-15 Calgene Inc Regulation of gene expression in plant cells
US5107065A (en) 1986-03-28 1992-04-21 Calgene, Inc. Anti-sense regulation of gene expression in plant cells
US4700725A (en) * 1986-04-17 1987-10-20 Philip Morris Incorporated Adjustable filter cigarette
US4699158A (en) * 1986-04-17 1987-10-13 Philip Morris Incorporated Adjustable filter cigarette with tactile indicator
ATE39600T1 (de) * 1986-04-23 1989-01-15 Reynolds Tobacco Gmbh Verfahren zur behandlung von tabak und aehnlichen organischen materialien.
US4766911A (en) * 1986-06-23 1988-08-30 R. J. Reynolds Tobacco Company Method for tracing smoking articles
US4962028A (en) 1986-07-09 1990-10-09 Dna Plant Technology Corporation Plant promotors
US5229292A (en) 1986-07-28 1993-07-20 Stine Seed Farm, Inc. Biological control of insects using pseudomonas strains transformed with bacillus thuringiensis insect toxingene
EP0265556A1 (en) 1986-10-31 1988-05-04 Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. Stable binary agrobacterium vectors and their use
US5268463A (en) * 1986-11-11 1993-12-07 Jefferson Richard A Plant promoter α-glucuronidase gene construct
US5015580A (en) * 1987-07-29 1991-05-14 Agracetus Particle-mediated transformation of soybean plants and lines
US4966916A (en) * 1987-02-12 1990-10-30 Abood Leo G Agonists and antagonists to nicotine as smoking deterrents
US4835162A (en) * 1987-02-12 1989-05-30 Abood Leo G Agonists and antagonists to nicotine as smoking deterents
US5356799A (en) 1988-02-03 1994-10-18 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Antisense gene systems of pollination control for hybrid seed production
US5922602A (en) 1988-02-26 1999-07-13 Biosource Technologies, Inc. Cytoplasmic inhibition of gene expression
US5179022A (en) 1988-02-29 1993-01-12 E. I. Du Pont De Nemours & Co. Biolistic apparatus for delivering substances into cells and tissues in a non-lethal manner
US4954442A (en) 1988-08-31 1990-09-04 Purdue Research Foundation Opine enhancement of vir gene induction
US5023179A (en) * 1988-11-14 1991-06-11 Eric Lam Promoter enhancer element for gene expression in plant roots
GB8827592D0 (en) 1988-11-25 1988-12-29 Taniguchi T Improvements in & relating to regulation of expression
US4990607A (en) * 1989-03-14 1991-02-05 The Rockefeller University Alteration of gene expression in plants
US5223419A (en) * 1989-03-14 1993-06-29 The Rockefeller University Alteration of gene expression in plants
US5034323A (en) 1989-03-30 1991-07-23 Dna Plant Technology Corporation Genetic engineering of novel plant phenotypes
US5231020A (en) 1989-03-30 1993-07-27 Dna Plant Technology Corporation Genetic engineering of novel plant phenotypes
GB8916213D0 (en) 1989-07-14 1989-08-31 Ici Plc Dna constructs,cells and plants derived therefrom
US5665543A (en) 1989-07-18 1997-09-09 Oncogene Science, Inc. Method of discovering chemicals capable of functioning as gene expression modulators
EP0483249B1 (en) 1989-07-18 2003-04-23 OSI Pharmaceuticals, Inc. Method of transcriptionally modulating gene expression and of discovering chemicals capable of functioning as gene expression modulators
US5776502A (en) 1989-07-18 1998-07-07 Oncogene Science, Inc. Methods of transcriptionally modulating gene expression
US5580722A (en) 1989-07-18 1996-12-03 Oncogene Science, Inc. Methods of determining chemicals that modulate transcriptionally expression of genes associated with cardiovascular disease
US6203976B1 (en) 1989-07-18 2001-03-20 Osi Pharmaceuticals, Inc. Methods of preparing compositions comprising chemicals capable of transcriptional modulation
US5501967A (en) 1989-07-26 1996-03-26 Mogen International, N.V./Rijksuniversiteit Te Leiden Process for the site-directed integration of DNA into the genome of plants
NL8901931A (nl) 1989-07-26 1991-02-18 Mogen International N V En Rij Werkwijze voor het plaatsgericht introduceren van vreemd dna in het genoom van planten.
US5097025A (en) 1989-08-01 1992-03-17 The Rockefeller University Plant promoters
US5062434A (en) 1989-09-22 1991-11-05 Brown & Williamson Tobacco Corporation Cigarette paper
GB8923716D0 (en) 1989-10-20 1989-12-06 Ici Plc Dna,constructs,cells and plants derived therefrom
US5177308A (en) 1989-11-29 1993-01-05 Agracetus Insecticidal toxins in plants
EP0434616B1 (de) 1989-12-19 1995-11-15 Ciba-Geigy Ag Verfahren und Vorrichtung zur genetischen Transformation von Zellen
JPH0673478B2 (ja) * 1990-01-11 1994-09-21 旭化成工業株式会社 Ｌ―カルニチンの高感度測定法および測定用組成物
WO1991011535A1 (en) 1990-01-30 1991-08-08 Childrens Hospital Of Los Angeles Inhibition of transcription by double-stranded oligonucleotides
CA2036935A1 (en) 1990-02-26 1991-08-27 Paul Christou Plant transformation process with early identification of germ line transformation events
GB9005945D0 (en) 1990-03-16 1990-05-09 Cambridge Advanced Tech Plant promoter
WO1991014790A1 (en) 1990-03-27 1991-10-03 New England Medical Center Hospitals, Inc. Inhibitors of transcription activation activity of papillomaviruses
US5109876A (en) * 1990-04-19 1992-05-05 R. J. Reynolds Tobacco Company Cigarette paper and cigarette incorporating same
US5204253A (en) 1990-05-29 1993-04-20 E. I. Du Pont De Nemours And Company Method and apparatus for introducing biological substances into living cells
US5932782A (en) 1990-11-14 1999-08-03 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Plant transformation method using agrobacterium species adhered to microprojectiles
US5260205A (en) 1990-11-14 1993-11-09 Philip Morris Incorporated Method of purifying putrescine N-methyltransferase from tobacco plant extract with a polyamine
US5668295A (en) 1990-11-14 1997-09-16 Philip Morris Incorporated Protein involved in nicotine synthesis, DNA encoding, and use of sense and antisense DNAs corresponding thereto to affect nicotine content in transgenic tobacco cells and plants
US5035252A (en) 1990-12-14 1991-07-30 Mondre Steven J Nicotine-containing dental floss
US5459252A (en) 1991-01-31 1995-10-17 North Carolina State University Root specific gene promoter
JPH04265569A (ja) * 1991-02-19 1992-09-21 Canon Inc 音声信号記録装置及び再生装置
EP0575518A1 (en) 1991-03-06 1993-12-29 Board Of Regents, The University Of Texas System Methods and compositions for the selective inhibition of gene expression
US5683985A (en) 1991-04-18 1997-11-04 The Salk Institute For Biological Studies Oligonucleotide decoys and methods relating thereto
FR2675803B1 (fr) 1991-04-25 1996-09-06 Genset Sa Oligonucleotides fermes, antisens et sens et leurs applications.
GB9109063D0 (en) 1991-04-26 1991-06-12 Ici Plc Modification of lignin synthesis in plants
WO1993000546A1 (en) 1991-06-20 1993-01-07 Reinforced Plastics/Composites Pty Ltd A connecting system
AU655839B2 (en) 1991-06-27 1995-01-12 Genelabs Technologies, Inc. Screening assay for the detection of DNA-binding molecules
DK152291D0 (da) 1991-08-28 1991-08-28 Danisco Fremgangsmaade og kemiske forbindelser
US5994629A (en) 1991-08-28 1999-11-30 Novartis Ag Positive selection
GB9304200D0 (en) 1993-03-02 1993-04-21 Sandoz Ltd Improvements in or relating to organic compounds
WO1993005646A1 (en) * 1991-09-13 1993-04-01 Technology Management Services, S.A. Reduction of nicotine levels in tobacco
WO1993014768A1 (en) 1992-01-27 1993-08-05 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Methods and compositions for neutralizing intracellular nucleic acid-binding protein biological activity in a cell, including methods and compositions useful to regulate gene function
ES2157217T3 (es) 1992-02-26 2001-08-16 Zeneca Mogen B V Cepas de agrobacterium capaces de recombinacion especifica para el sitio.
US5780051A (en) * 1992-04-02 1998-07-14 Dynagen, Inc. Methods and articles of manufacture for nicotine cessation and monitoring nicotine use
ATE229076T1 (de) * 1992-04-02 2002-12-15 Sembiosys Genetics Inc Cis elemente des ölkörperproteins als regulationische signale
US5626152A (en) * 1992-08-26 1997-05-06 Molins Plc Cigarette making machine
US5469871A (en) * 1992-09-17 1995-11-28 R. J. Reynolds Tobacco Company Cigarette and method of making same
BR9307547A (pt) * 1992-11-27 1999-06-01 Voxel Processo e aparelho para fabricar um holograma
JPH08503853A (ja) 1992-11-30 1996-04-30 チューア，ナム−ハイ 植物における組織−及び発生−特異的な発現を付与する発現モチーフ
IL108367A0 (en) 1993-01-27 1994-04-12 Hektoen Inst For Medical Resea Antisense polynzcleotide inhibition of human growth factor-sensitive cancer cells
JPH08510641A (ja) 1993-05-13 1996-11-12 プラント ジェネティック システムズ，ナームノゼ フェンノートシャップ マーカー遺伝子
EP0701614A1 (en) * 1993-06-01 1996-03-20 Philip Morris Products Inc. Putrescine n-methyltransferase, recombinant dna molecules encoding putrescine n-methyltransferase, and transgenic tobacco plants with decreased alkaloid content
US5540242A (en) * 1993-07-07 1996-07-30 Brown & Williamson Tobacco Corporation Cigarette paper having reduced sidestream properties
US5377697A (en) * 1993-08-27 1995-01-03 Hoechst Celanese Corporation Cigarette filter test apparatus and associated method for measuring filter hot collapse and tobacco consumption
US5810020A (en) * 1993-09-07 1998-09-22 Osmotek, Inc. Process for removing nitrogen-containing anions and tobacco-specific nitrosamines from tobacco products
PT732929E (pt) 1993-10-29 2008-08-26 Brigham & Womens Hospital Utilização terapêutica de ''engodos'' de elementos cis in vivo
US6399376B1 (en) 1993-11-05 2002-06-04 Isis Pharmaceuticals, Inc. Modulation of vascular cell adhesive molecule expression through oligonucleotide interactions
CA2155570C (en) 1993-12-08 2007-06-26 Toshihiko Komari Method for transforming plant and vector therefor
US5394894A (en) * 1994-02-22 1995-03-07 Zade; Ismail Y. Method and apparatus for elimination of smoking
ES2081257B1 (es) 1994-05-12 1996-07-16 Sagrera Jorge Martinez Instalacion y procedimiento para el curado de tabaco.
US5858774A (en) 1994-05-12 1999-01-12 The Research Foundation Of State University Of New York Antisense DNA constructs for expression of hybrid MRNAs driven by inducible, tissue-specific promoters
US5750870A (en) 1994-06-17 1998-05-12 Agritope, Inc. Plant genetic transformation methods and transgenic plants
JP3235934B2 (ja) 1994-08-04 2001-12-04 三菱レイヨン株式会社 ロドコッカス属細菌由来カナマイシン耐性遺伝子
IT1275697B1 (it) * 1994-12-20 1997-10-17 Olmo Giancarlo Dell Metodo per stampare direttamente su carta microincisioni di ologrammi,chinogrammi,reticoli di diffrazione o microincisioni
US5733744A (en) 1995-01-13 1998-03-31 Cornell Research Foundation, Inc. Binary BAC vector
US6262033B1 (en) 1995-02-11 2001-07-17 Fujisawa Pharmaceutical Co., Ltd. Remedy for diseases associated with NF-κB
EP0817856A1 (en) 1995-03-22 1998-01-14 Novo Nordisk A/S Introduction of dna into bacillus strains by conjugation
AU712624B2 (en) 1995-03-30 1999-11-11 Takara Bio Inc. Plant promoter and method for gene expression using said promoter
US5837876A (en) 1995-07-28 1998-11-17 North Carolina State University Root cortex specific gene promoter
GB9517263D0 (en) 1995-08-23 1995-10-25 Cancer Res Campaign Tech Expression systems
US6051409A (en) 1995-09-25 2000-04-18 Novartis Finance Corporation Method for achieving integration of exogenous DNA delivered by non-biological means to plant cells
CA2230966C (en) 1995-09-25 2010-08-24 Novartis Ag Improved integration of exogenous dna delivered to plant cells
US6198827B1 (en) * 1995-12-26 2001-03-06 Rocktron Corporation 5-2-5 Matrix system
US5693512A (en) 1996-03-01 1997-12-02 The Ohio State Research Foundation Method for transforming plant tissue by sonication
WO1997038723A1 (en) 1996-04-16 1997-10-23 Immusol Incorporated Targeted viral vectors
US5851804A (en) 1996-05-06 1998-12-22 Apollon, Inc. Chimeric kanamycin resistance gene
US5713376A (en) 1996-05-13 1998-02-03 Berger; Carl Non-addictive tobacco products
AU737926B2 (en) 1996-05-20 2001-09-06 Government Of The United States Of America, As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services, The Oligonucleotides which specifically bind retroviral nucleocapsid proteins
US6022863A (en) 1996-05-21 2000-02-08 Yale University Regulation of gene expression
US5834236A (en) * 1996-06-27 1998-11-10 The Salk Institute For Biological Studies AATT repeat transcription enhancer element
US5845647A (en) 1996-06-28 1998-12-08 Regent Court Technologies Tobacco and related products
US6135121A (en) 1996-06-28 2000-10-24 Regent Court Technologies Tobacco products having reduced nitrosamine content
US5803081A (en) * 1996-06-28 1998-09-08 Regent Court Technologies Tobacco and related products
USRE38123E1 (en) * 1996-06-28 2003-05-27 Regent Court Technologies, Llc. Tobacco products having reduced nitrosamine content
US6037525A (en) 1996-08-01 2000-03-14 North Carolina State University Method for reducing expression variability of transgenes in plant cells
US5830318A (en) 1996-10-25 1998-11-03 Schweitzer-Mauduit International, Inc. High opacity tipping paper
US5929306A (en) 1996-11-15 1999-07-27 University Of Kentucky Research Foundation KYRT1, a disarmed version of a highly tumorigenic Agrobacterium tumefaciens strain identified as Chry5
US6202649B1 (en) 1996-12-02 2001-03-20 Regent Court Technologies Method of treating tobacco to reduce nitrosamine content, and products produced thereby
US6096947A (en) 1997-01-14 2000-08-01 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Methods for improving transformation efficiency
WO1998032843A2 (en) 1997-01-28 1998-07-30 Ribozyme Pharmaceuticals, Inc. Compositions and method for modulation of alkaloid biosynthesis and flower formation in plants
US6166032A (en) 1997-02-07 2000-12-26 Synapse Pharmaceuticals International, Inc. Method for controlling tobacco use and alleviating withdrawal symptoms due to cessation of tobacco use
ES1036967Y (es) * 1997-04-15 1998-05-01 Techpack Espana S L Cazoleta perfeccionada para estuche de lapiz de labios.
US6163521A (en) * 1997-04-16 2000-12-19 Matsushita Electric Industrial Co., Ltd. Disk having read-only and read-write areas
US6020989A (en) * 1997-05-14 2000-02-01 Affinity Co., Ltd. Laminated bodies and windows using them
US6586661B1 (en) * 1997-06-12 2003-07-01 North Carolina State University Regulation of quinolate phosphoribosyl transferase expression by transformation with a tobacco quinolate phosphoribosyl transferase nucleic acid
AR015873A1 (es) 1997-06-13 2001-05-30 Shell Int Research Un proceso para producir material vegetal modificado geneticamente que comprende una o mas secuencias de adn de interes establemente incorporadas
US6020969A (en) * 1997-07-11 2000-02-01 Philip Morris Incorporated Cigarette making machine including band inspection
US6391547B1 (en) 1997-09-09 2002-05-21 Center For The Application Of Molecular Biology To International Agriculture Microbial β-glucuronidase genes, gene products and uses thereof
US6641996B1 (en) 1997-09-09 2003-11-04 Cambia Microbial β-glucuronidase genes, gene products and uses thereof
JP2001514009A (ja) 1997-08-25 2001-09-11 ヌンヘムス・ザーデン・ベー・ヴェー 植物の改良されたアグロバクテリウム−媒介形質転換法
WO1999014348A1 (en) 1997-09-12 1999-03-25 Performance Plants, Inc. In planta transformation of plants
CA2248622A1 (en) 1997-09-23 1999-03-23 Joe Celeste Biolistic apparatus for delivering substances into cells and tissues
DE69811378T2 (de) * 1997-10-03 2004-02-12 Cary Pharmaceuticals Inc. (n.d.Ges.d. Staates Delaware) Zusammensetzungen zur behandlung von nikotinabhängigkeit, enthaltend mecamylamin und bupropion
US6077992A (en) 1997-10-24 2000-06-20 E. I. Du Pont De Nemours And Company Binary viral expression system in plants
ES2245487T3 (es) 1997-11-18 2006-01-01 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Composiciones y metodos para la modificacion genetica de plantas.
US6060310A (en) 1997-11-24 2000-05-09 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Transcription factor decoy and tumor growth inhibitor
US6153811A (en) 1997-12-22 2000-11-28 Dekalb Genetics Corporation Method for reduction of transgene copy number
US6506559B1 (en) 1997-12-23 2003-01-14 Carnegie Institute Of Washington Genetic inhibition by double-stranded RNA
WO1999043704A1 (en) * 1998-02-27 1999-09-02 The Regents Of The University Of California A NOVEL INHIBITOR OF THE INFLAMMATORY RESPONSE INDUCED BY TNFα AND IL-1
CZ295108B6 (cs) 1998-03-20 2005-05-18 Benitec Australia Ltd Syntetický gen obsahující dispergovanou nebo cizorodou deoxyribonukleovou molekulu a genový konstrukt obsahující tento syntetický gen
JP3444191B2 (ja) 1998-03-31 2003-09-08 日本製紙株式会社 フェニルプロパノイド生合成経路を制御する転写因子
DE69943389D1 (de) 1998-04-08 2011-06-09 Commw Scient Ind Res Org Verfahren und mittel zum erhalt von veränderten phänotypen
US6136799A (en) 1998-04-08 2000-10-24 Abbott Laboratories Cosolvent formulations
US5938017A (en) * 1998-05-04 1999-08-17 Wik; Dennis O. Article for assisting persons to quit smoking and method for same
AR020078A1 (es) 1998-05-26 2002-04-10 Syngenta Participations Ag Metodo para alterar la expresion de un gen objetivo en una celula de planta
AU770309B2 (en) * 1998-06-05 2004-02-19 Regent Court Technologies Monoamine oxidase (MAO) inhibitors and uses thereof
US6271031B1 (en) 1998-08-12 2001-08-07 E.I. Du Pont De Nemours And Company Quinolinate metabolism enzymes
CA2341324A1 (en) 1998-08-31 2000-03-09 Monsanto Company Transgene assay using stable agrobacterium rhizogenes transformation
ATE313635T1 (de) 1998-10-01 2006-01-15 Pioneer Hi Bred Int Methode zur pflanzentransformation
DE19847767A1 (de) * 1998-10-16 2000-04-20 Decoufle Sarl Anordnung zum Zuführen von fließfähiger Druckfarbe zu einem Druckwerk für einen Zigarettenpapierstreifen
DE19852757A1 (de) 1998-11-16 2000-05-18 Eth Zuerich Zuerich Promotoren zur Genexpression in Wurzeln von Pflanzen
EP1140043B1 (en) 1998-12-22 2005-03-02 National Research Council Of Canada Transgenic plants comprising a conditionally lethal gene
WO2000037663A2 (en) 1998-12-23 2000-06-29 The Samuel Roberts Noble Foundation, Inc. Plant transformation process
AR023576A1 (es) 1999-04-19 2002-09-04 Biogemma Fr Metodo para la transformacion de una planta objetivo, uso de agrobacterium para dicho metodo y metodo para producir un tejido de planta transformada.
AU4991500A (en) 1999-05-06 2000-11-21 Michael Timko Regulation of gene expression in tobacco for manipulation of plant growth and secondary metabolism
US6603061B1 (en) 1999-07-29 2003-08-05 Monsanto Company Agrobacterium-mediated plant transformation method
US6314964B1 (en) * 1999-09-15 2001-11-13 Schweitzer-Mauduit International, Inc. Cigarette paper containing carbon fibers for improved ash characteristics
US6809232B1 (en) 1999-11-29 2004-10-26 Midwest Oilseeds, Inc. Methods and compositions for the introduction of molecules into cells
AU782327C (en) 1999-12-16 2006-09-14 Cropdesign N.V. Optimized T-DNA transfer and vectors therefor
US20050229272A1 (en) 1999-12-30 2005-10-13 Monica Driscoll Compositions and methods for gene silencing
AU2778801A (en) 2000-01-07 2001-07-24 Baylor University Antisense compositions and methods
AU2001245793A1 (en) 2000-03-16 2001-09-24 Cold Spring Harbor Laboratory Methods and compositions for rna interference
WO2001077350A2 (en) 2000-04-07 2001-10-18 Large Scale Biology Corporation Compositions and methods for inhibiting gene expression
WO2002002806A2 (en) 2000-06-30 2002-01-10 Epigenomics Ag Method and nucleic acids for analysing the methylation of genes implicated in pharmacogenomics
CN1330753C (zh) * 2000-08-30 2007-08-08 北卡罗莱纳州立大学 含有可改变蛋白含量的分子诱导物的转基因植物
DE60128149D1 (en) 2000-11-07 2007-06-06 Univ North Carolina State Putrescin-n-methyltransferasepromotor
CN1954688A (zh) 2001-06-06 2007-05-02 二十二世纪有限责任公司 烟草生物质的用途
CN1638655A (zh) 2001-06-08 2005-07-13 韦克多烟草有限公司 修饰烟草中烟碱和亚硝胺的水平
US20060157072A1 (en) * 2001-06-08 2006-07-20 Anthony Albino Method of reducing the harmful effects of orally or transdermally delivered nicotine
US6557560B2 (en) * 2001-06-18 2003-05-06 Ctc Canada Inc. Cigarette making machine
MXPA06001591A (es) 2003-08-19 2006-05-19 22Nd Century Ltd Llc Productos de tabaco de exposicion reducida.
JP4892744B2 (ja) 2005-02-28 2012-03-07 国立大学法人 奈良先端科学技術大学院大学 植物におけるニコチン類縁アルカロイド量を低下させる方法
CA2853387C (en) 2006-06-19 2018-04-17 National Research Council Of Canada Nucleic acid encoding n-methylputrescine oxidase and uses thereof
BRPI0717355B1 (pt) 2006-10-13 2018-01-16 North Carolina State University Método para obtenção de uma planta transgênica de nicotina, método para obtenção de uma semente; construto de ácido nucléico recombinante; método de redução da conversão de nicotina em nornicotina em uma planta de nicotina

Also Published As

Publication number Publication date
HUP0003767A3 (en) 2002-10-28
JP2001522250A (ja) 2001-11-13
JP2004290201A (ja) 2004-10-21
US20060191036A1 (en) 2006-08-24
TR199902728T2 (xx) 2000-09-21
US7795509B2 (en) 2010-09-14
YU64899A (sh) 2004-12-31
DK0991766T3 (da) 2004-07-12
EP1457563A1 (en) 2004-09-15
US20030140366A1 (en) 2003-07-24
JP2009112316A (ja) 2009-05-28
HK1069411A1 (en) 2005-05-20
DE69822463D1 (de) 2004-04-22
EP1457563B1 (en) 2012-08-08
BRPI9810870B1 (pt) 2021-06-01
OA11219A (en) 2003-07-17
US20060191035A1 (en) 2006-08-24
CA2287776C (en) 2012-04-03
US7425670B2 (en) 2008-09-16
EA200400186A1 (ru) 2004-08-26
EP0991766B1 (en) 2004-03-17
US20070011774A1 (en) 2007-01-11
ES2154624T3 (es) 2004-11-01
GR20010300003T1 (en) 2001-06-29
SI20215B (sl) 2007-04-30
CN100482799C (zh) 2009-04-29
EP0991766A1 (en) 2000-04-12
US7645925B2 (en) 2010-01-12
EA200000007A1 (ru) 2000-06-26
ES2154624T1 (es) 2001-04-16
JP2008131950A (ja) 2008-06-12
US7605308B2 (en) 2009-10-20
KR100365969B1 (ko) 2002-12-26
JP4095678B2 (ja) 2008-06-04
ID29311A (id) 2001-08-16
US7408098B2 (en) 2008-08-05
GEP20032871B (en) 2003-01-27
EP1457562B1 (en) 2012-08-08
IL132184A0 (en) 2001-03-19
IL192232A0 (en) 2008-12-29
BG64319B1 (bg) 2004-09-30
EE9900575A (et) 2000-08-15
EA009898B1 (ru) 2008-04-28
DE991766T1 (de) 2002-04-04
JP4288206B2 (ja) 2009-07-01
CN1618972A (zh) 2005-05-25
US7304220B2 (en) 2007-12-04
AU748514B2 (en) 2002-06-06
HUP0003767A2 (hu) 2001-02-28
CZ367799A3 (cs) 2000-04-12
AP9901680A0 (en) 1999-12-31
CA2287776A1 (en) 1998-12-17
US6586661B1 (en) 2003-07-01
KR20010013663A (ko) 2001-02-26
PT991766E (pt) 2004-08-31
HK1065066A1 (en) 2005-02-08
AU7829198A (en) 1998-12-30
SK161899A3 (en) 2000-06-12
SI20215A (sl) 2000-10-31
CU23174A3 (es) 2006-09-22
CN1304576C (zh) 2007-03-14
JP4459271B2 (ja) 2010-04-28
CA2484366A1 (en) 1998-12-17
LV12507B (en) 2000-11-20
LV12507A (en) 2000-06-20
CZ297379B6 (cs) 2006-11-15
BG103886A (en) 2000-07-31
UA72187C2 (uk) 2005-02-15
NO996169D0 (no) 1999-12-13
PL337442A1 (en) 2000-08-14
US20040168211A1 (en) 2004-08-26
NO996169L (no) 1999-12-13
US20020108151A1 (en) 2002-08-08
LT4706B (lt) 2000-09-25
IL132184A (en) 2010-11-30
WO1998056923A1 (en) 1998-12-17
EP1457562A1 (en) 2004-09-15
HK1027379A1 (en) 2001-01-12
US6423520B1 (en) 2002-07-23
EE04595B1 (et) 2006-02-15
AP1169A (en) 2003-06-30
ATE262039T1 (de) 2004-04-15
US20060200872A1 (en) 2006-09-07
BR9810870A (pt) 2000-11-14
EA004652B1 (ru) 2004-06-24
NZ500963A (en) 2001-09-28
RS49677B (sr) 2007-11-15
NO324872B1 (no) 2007-12-17
HU225888B1 (en) 2007-11-28
DE69822463T2 (de) 2005-01-20
CN1257542A (zh) 2000-06-21
LT99142A (en) 2000-06-26
PL201266B1 (pl) 2009-03-31

Similar Documents

Publication Publication Date Title
RO121968B1 (ro) Reglarea exprimării chinolat fosforibozil transferazei
AU2004203879B2 (en) Regulation of quinolate phosphoribosyl transferase expression
AU2002300895B2 (en) Regulation of quinolate phosphoribosyl transferase expression
MXPA99011625A (en) Regulation of quinolate phosphoribosyl transferase expression
HK1069411B (en) Regulation of quinolate phosphoribosyl transferase expression in tobacco plants
HK1065066B (en) Increase of quinolate phosphoribosyl transferase expression in plants
HK1027379B (en) Regulation of quinolate phosphoribosyl transferase expression