EA009898B1 - Способы получения клеток трансгенных растений и трансгенных растений с повышенной продукцией хинолятфосфорибозил-трансферазы и табачный продукт - Google Patents

Abstract

Настоящее изобретение относится к способу получения трансгенных растительных клеток с повышенной продукцией хинолятфосфорибозил трансферазы (ХФРТазы), включающему трансформацию растительных клеток, способных экспрессировать ХФРТазу экзогенной ДНК-конструкцией, содержащей в направлении 5'-3' функциональный растительный промотор, и последовательность ДНК, кодирующую ХФРТазу растения табака, и где указанная последовательность ДНК функционально связана с указанным промотором и указанные трансформированные растительные клетки обладают повышенной продукцией ХФРТазы по сравнению с нетрансформированными растительными клетками. Также изобретение относится к способу получения трансгенного растения с повышенной продукцией ХФРТазы, способу повышения продукции ХФРТазы в растительных клетках, способных продуцировать ХФРТазу, способу получения трансформированных растительных клеток с повышенной продукцией никотина, способу получения трансгенного растения с повышенной продукцией никотина, способу повышения продукции никотина в растительных клетках, способных продуцировать ХФРТазу, трансгенному растению табака, табачному продукту и способу получения табачного продукта.

Description

Данное изобретение осуществлено при поддержке Государства через Национальный фонд по научным исследованиям № МСВ-9206506. Государство имеет определенные права на данное изобретение.

Область техники, к которой относится изобретение

Данное изобретение относится к растительной хинолятфосфорибозил-трансферазе (ХФРТазе) и к ДНК, кодирующей этот фермент. В частности, данное изобретение относится к применению ДНК, кодирующей хинолятфосфорибозил-трансферазу для получения трансгенных растений с генетически измененным соединением никотина, и к растениям, полученным таким образом.

Предпосылки создания изобретения

Производство табака с пониженным содержанием никотина представляет интерес, учитывая способность никотина вызывать зависимость. Кроме того, растения табака с исключительно низким уровнем продуцирования никотина или не продуцирующие никотин привлекательны как реципиенты для трансгенов, экспрессирующих коммерчески ценные продукты, такие как фармацевтические средства, компоненты косметических средств или пищевые добавки. Разработаны различные способы удаления никотина из табака. Однако большинство этих способов удаляет другие ингредиенты из табака помимо никотина, что вредно влияет на табак. Классические методы выращивания культурных растений дают растения табака с более низким содержанием никотина (приблизительно 8%), чем содержание, обнаруженное в растениях табака дикого типа. Желательно получение растений табака и табак с еще меньшим содержанием никотина.

Один из подходов к снижению содержания биологического продукта состоит в необходимости уменьшения количества необходимого фермента в биохимическом каскаде, ведущего к образованию этого продукта. Когда предпочтительный фермент находится в природе в количестве, ограничивающем скорость (относительно других ферментов, необходимых в каскаде реакций), любое снижение представленности фермента будет уменьшать продуцирование конечного продукта. Если количество фермента в естественном состоянии не является ограничивающим скорость, его присутствие в клетке необходимо уменьшить до ограничивающего скорость содержания, чтобы снизить выход каскада реакций. Напротив, если в естественном состоянии количество фермента является ограничивающим скорость, тогда любое возрастание активности фермента приведет к возрастанию выхода конечного продукта биосинтетического каскада реакций. Никотин первоначально образуется в корнях растения табака и затем переносится в листья, где он накапливается (Тко, Р11у8ю1оду апб Вюейетжбу о£ ТоЬассо Р1ап18, р. 233-34, Оо\\бсп. НиШнпкоп & Кокк, ЗйоибкЬигд, Ра. (1972)). Обязательной стадией при биосинтезе никотина является образование никотиновой кислоты из хинолиновой кислоты, которое катализируется ферментом хинолинфосфорибозил-трансферазой (ХФРТазой). Оказывается, что ХФРТаза является ограничивающим скорость ферментом в каскаде реакций, поставляющем никотиновую кислоту для синтеза никотина в табаке. См., например, Ге1й е! а1., РедикШоп ίη ТоЬассо Са11ик о£ Епхуте ЛсШ'Шек о£ 1йе Ксобпе РаШгау, Р1ап!а, 168, р. 402-07 (1986); Уадпег е! а1., Тйе Реди1а1юп о£ Епхуте ЛсЙуШек о£ 1Не Ксобпе Ра111\гау ίπ ТоЬассо, Рйукю1. Р1ап!., 68, р. 667-72 (1986). Изменение содержания никотина в растениях табака путем антисмысловой регуляции экспрессии путресценс-метилтрансферазы (ПМТазы) описывается в патентах США 5369023 и 5260205, №1ка1аш апб Майк. В международной заявке РСТ \УО 94/28142, ХУайаб апб Ма11к, описывается ДНК, кодирующая ПМТ, и применение смысловой и антисмысловой содержащих ПМТ конструкций.

Краткое изложение сущности изобретения

Первым аспектом настоящего изобретения является выделенная молекула ДНК, содержащая последовательность № 1;

последовательности ДНК, кодирующие фермент с последовательностью № 2;

последовательности ДНК, гибридизирующие с такой ДНК и кодирующие фермент хинолятфосфорибозил-трансферазу, и последовательности ДНК, отличающиеся от указанной выше ДНК вследствие вырождения генетического кода.

Пептид, кодированный такой ДНК, составляет другой аспект изобретения.

Другим аспектом настоящего изобретения является ДНК-конструкция, содержащая промотор, функционирующий в растительной клетке, и сегмент ДНК, кодирующий фермент хинолятфосфорибозил-трансферазу, расположенный в прямом направлении от промотора и функционально связанный с ним. ДНК, кодирующая фермент, может находиться в антисмысловом или смысловом направлении.

Другим аспектом настоящего изобретения является способ получения трансгенной растительной клетки с пониженной экспрессией хинолятфосфорибозил-трансферазы (ХФРТазы) путем предоставления растительной клетки типа, известного как экспрессирующего хинолятфосфорибозил-трансферазу; трансформации растительной клетки экзогенной ДНК-конструкцией, содержащей промотор, и ДНК, содержащую часть последовательности, кодирующей мРНК хинолятфосфорибозил-трансферазы.

Другим аспектом настоящего изобретения является трансгенное растение вида Ксобапа с пониженной экспрессией хинолятфосфорибозил-трансферазы (ХФРТазы) относительно нетрансформированного контрольного растения. Клетки таких растений содержат ДНК-конструкцию, включающую сегмент

- 1 009898 последовательности ДНК, которая кодирует мРНК растительной хинолятфосфорибозил-трансферазы.

Другим аспектом настоящего изобретения является способ снижения экспрессии гена хинолятфосфорибозил-трансферазы в растительной клетке путем выращивания растительной клетки, трансформированной с целью включения экзогенной ДНК, где транскрибирующая цепь экзогенной ДНК комплементарна к мРНК хинолятфосфорибозил-трансферазы, эндогенной для клетки. Транскрипция комплементарной цепи снижает экспрессию эндогенного хинолятфосфорибозил-гена.

Другим аспектом настоящего изобретения является способ получения растения табака с пониженным содержанием никотина в листьях растения табака путем выращивания растения табака, клетки которого содержат последовательность экзогенной ДНК, где транскрибирующая цепь экзогенной ДНК комплементарна к эндогенной матричной РНК хинолятфосфорибозил-трансферазы в клетках.

Другим аспектом настоящего изобретения является способ получения трансгенной растительной клетки с повышенной экспрессией хинолятфосфорибозил-трансферазы (ХФРТазы) путем трансформации растительной клетки, известной как экспрессирующая хинолятфосфорибозил-трансферазу, экзогенной ДНК-конструкцией, содержащей последовательность ДНК, кодирующую хинолятфосфорибозилтрансферазу.

Другим аспектом настоящего изобретения является трансгенное растение Ыюобапа с повышенной экспрессией хинолятфосфорибозил-трансферазы (ХФРТазы), где клетки трансгенного растения содержат последовательность экзогенной ДНК, кодирующую растительную хинолятфосфорибозил-трансферазу.

Другим аспектом настоящего изобретения является способ повышения экспрессии гена хинолятфосфорибозил-трансферазы в растительной клетке путем выращивания растительной клетки, трансформированной с целью включения экзогенной ДНК, кодирующей хинолятфосфорибозил-трансферазу.

Другим аспектом настоящего изобретения является способ получения растения табака с повышенным содержанием никотина в листьях путем выращивания растения табака, клетки которого содержат последовательность экзогенной ДНК, которая кодирует хинолятфосфорибозил-трансферазу, функциональную в клетках.

Краткое описание чертежей

Фиг. 1 показывает каскад биосинтетических реакций при образовании никотина. Ферментативные активности, известные как регулируемые Νίοΐ и Νίο2. представляют активность ХФРТазы (хинолятфосфорибозил-трансферазы) и ПМТазы (путресценс-метилтрансферазы).

На фиг. 2А приводится нуклеотидная последовательность кДНК ΝιΟΡΤΙ (последовательность № 1) с кодирующей последовательностью (последовательность № 3), показанной заглавными буквами.

На фиг. 2Б приводится образованная аминокислотная последовательность (последовательность № 2) ХФРТазы табака, кодированной кДНК ΝιΟΡΤΙ.

На фиг. 3 приводятся разложенные в ряд образованная аминокислотная последовательность ΝιΟΡΤΙ и родственные последовательности ККобокршПит шЬтиш, МусоЬас!етшт 1ерге, За1топе11а !урЫтигшт, ЕхсйспсЫа сой, человеческая и Зассйаготусек сегеуШае.

Фиг. 4 показывает результаты комплементации мутанта ЕксйепсЫа со11, лишенного хинолятфосфорибозил-трансферазы (ТН265), с кДНК ΝιΟΡΤΙ. Клетки трансформированы экспрессионным вектором, несущим Ν1ΟΡΤΙ; рост трансформированных клеток ТН265, экспрессирующих ΝίρΡΤΕ на минимальной среде, лишенной никотиновой кислоты, показывает, что ΝιΟΡΤΙ кодирует ХФРТазу.

На фиг. 5 сравниваются содержание никотина и относительное установившееся содержание мРНК ΝιρΡΤΙ в мутантах табака №с1 и ΝΚ2: Виг1еу 21 дикого типа (№с1/№с1 №с2/№с2); Виг1еу 21 №с1 (шс1/шс1 №с2/№с2); Виг1еу 21 ΝΚ2^- (№с1/№с1 шс2/шс2) и Виг1еу 21 ΝΚΕΝΚ2^- (шс1/шс1 шс2/шс2). Сплошные прямоугольники показывают содержание транскриптов мРНК; заштрихованные прямоугольники показывают содержание никотина.

Фиг. 6 является диаграммой относительного содержания мРНК ΝιρΡΤΙ со временем в растениях табака с прищипанной верхушкой по сравнению с неприщипанными контрольными растениями. Сплошные прямоугольники показывают содержание транскриптов мРНК; заштрихованные прямоугольники показывают содержание никотина.

Подробное описание изобретения

Никотин продуцируется в растениях табака путем конденсации никотиновой кислоты и 4-метиламинобутанала. Каскад реакций биосинтеза, приводящий к образованию никотина, поясняется на фиг. 1. Два регуляторных локуса (ΝΚ1 и Νΐο2) действуют как кодоминантные регуляторы образования никотина. Ферментные анализы корней простых и двойных мутантов №с показывают, что активность двух ферментоз хинолятфосфорибозил-трансферазы (ХФРТазы) и путресценс-метилтрансферазы (ПМТазы) прямо пропорциональна уровню бисинтеза никотина. Сравнение ферментативной активности в тканях табака (корень и каллюс) с различной способностью к синтезу никотина показывает, что активность ХФРТазы строго соотносится с содержанием никотина (^адпег апб XV ад пег, Ρ1аηίа, 165:532 (1985)). Заипбегк и ВиШ (Т1агИ Ρйу8^ο1., 64:236 (1979) показали, что содержание ХФРТазы в корнях мутантов с низким содержанием никотина пропорционально содержанию никотина в листьях.

Настоящее изобретение включает последовательность новой кДНК (последовательность № 1), кодирующей растительную хинолятфосфорибозил-трансферазу (ХФРТазу), последовательность № 2. Так

- 2 009898 как активность ХФРТазы строго соотносится с содержанием никотина, создание трансгенных растений табака, в которых содержание ХФРТазы в корнях понижено (по сравнению с содержанием в растениях дикого типа), приведет к растениям с пониженным содержанием никотина в листьях. Настоящее изобретение относится к способам и нуклеотидным конструкциям для получения таких трансгенных растений, а также к таким трансгенным растениям. Такие способы включают экспрессию антисмысловой РНК ΝιΟΡΤΙ, которая снижает количество ХФРТазы в корнях табака. Кроме того, никотин обнаружен в видах и семействах растений, не относящихся к табаку, хотя его количество в них, как правило, значительно меньше, чем в Ν. (аЬаеит.

Настоящее изобретение также относится к молекулам смысловой и антисмысловой рекомбинантной ДНК, кодирующим ХФРТазу, или к молекулам антисмысловой РНК ХФРТазы, и к векторам, содержащим эти молекулы рекомбинантной ДНК, а также к трансгенным растительным клеткам и растениям, трансформированным этими молекулами ДНК и векторами. Трансгенные клетки и растения табака по данному изобретению характеризуются более низким или более высоким содержанием никотина, чем в нетрансформированных контрольных клетках и растений табака.

Растения табака с исключительно низким уровнем продуцирования никотина или не продуцирующие никотин привлекательны как реципиенты для трансгенов, экспрессирующих коммерчески ценные продукты, такие как фармацевтические средства, компоненты косметических средств или пищевые добавки. Табак привлекателен в качестве растения-реципиента для трансгена, кодирующего нужный продукт, так как табак легко поддается обработке методами генной инженерии и продуцирует весьма большую биомассу на акр; растения табака с пониженными ресурсами, предназначенными для продуцирования никотина, соответственно, будут иметь большие ресурсы, доступные для продуцирования трансгенных продуктов. Способы трансформации табака трансгенами, продуцирующими нужные продукты, известны в технике; любой подходящий метод можно использовать для растений табака с низким содержанием никотина настоящего изобретения.

Растения табака, в соответствии с настоящим изобретением, с пониженной экспрессией ХФРТазы и пониженным содержанием никотина будут нужны при получении табачных изделий с пониженным содержанием никотина. Растения табака по настоящему изобретению подойдут для применения в любом традиционном табачном изделии, включая, но не ограничиваясь перечисленным, трубочный, сигарный и сигаретный табак и жевательный табак, который может быть любой формы, включая листовой табак, скрошенный или резаный табак.

Конструкции настоящего изобретения также могут быть полезны при получении трансгенных растений с повышенной экспрессией ХФРТазы и повышенным содержанием никотина в растении. Такие конструкции, способы с использованием этих конструкций и растения, полученные таким образом, могут понадобиться при получении табачных изделий с измененным содержанием никотина или при получении растений с содержанием никотина, повышенным с целью получения инсектицидного действия.

Авторы обнаружили, что ген ТоЬРЭ2 (см. Сопк1шд с1 а1., Р1ап1 Рйу8., 93, 1203 (1990)) кодирует ХФРТазу ΝίοοΙίαηα 1аЬасит и снабжает его последовательностью кДНК ΝιΟΡΤΙ (раньше названную ТоЬКН2) и аминокислотной последовательностью кодируемого фермента. Сравнение аминокислотной последовательности ΝιΟΡΤΙ с базой данных банка генов показывает ограниченное подобие последовательностей с бактериальными белками, которые кодируют ХФРТазу (фиг. 3).

Хинолятфосфорибозил-трансфераза необходима для биосинтеза бе ηονο никотинадениндинуклеотида (ΝΑΌ) как в прокариотах, так и в эукариотах. В табаке высокое содержание ХФРТазы обнаруживается в корнях, но не в листьях. Для того чтобы определить, что ΝιΟΡΤΙ кодирует ХФРТазу, авторы изобретения использовали штамм бактерий ЕксйепсЫа сой (ТН265), являющийся мутантом с утраченной хинолятфосфорибозил-трансферазой (пабС^-). Этот мутант не может расти на минимальной среде, не содержащей никотиновой кислоты. Однако экспрессия белка ΝιΟΡΤΙ в этом бактериальном штамме предоставляет фенотип №1бС (фиг. 4), что подтверждает, что ΝιΟΡΤΙ кодирует ХФРТазу.

Авторы изобретения исследовали действие мутантов ΝΚ1 и ΝΚ2 в табаке и влияние прищипки верхушек растений табака на установившееся содержание мРНК ΝιΟΡΤΙ и содержание никотина. Известно, что удаление апикального доминирования посредством прищипки верхушек в начале цветения приводит к повышенному уровню биосинтеза и переноса никотина в табаке и является обычной практикой в производстве табака. Если ΝιΟΡΤΙ действительно участвует в биосинтезе никотина, следует ожидать, что (1) содержание мРНК ΝιΟΡΤΙ будет ниже в двойных мутантах Νΐο1/Νΐο2, и (2) содержание мРНК ΝιΟΡΤΙ будет возрастать после прищипки верхушек. Обнаружено, что содержание мРНК ΝιΟΡΤΙ в двойных мутантах Νΐο1/Νΐο2 составляет приблизительно 25% от содержания в диком типе (фиг. 5). Кроме того, в течение 6 ч после прищипки верхушек содержание мРНК ΝιΟΡΤΙ в растениях табака повышается примерно в восемь раз. Следовательно, установлено, что ΝιΟΡΤΙ является ключевым геном-регулятором в каскаде реакций биосинтеза никотина.

Трансгенные растительные клетки и растения

Регуляции экспрессии гена в геномах растительной клетки можно достичь путем интеграции гетерологичной ДНК под транскрипционным контролем промотора, который действует в хозяине и в котором транскрибирующаяся цепь гетерологичной ДНК комплементарна к цепи ДНК, которая транскриби

- 3 009898 руется от регулируемого эндогенного гена. Введенная ДНК, отнесенная к антисмысловой ДНК, обеспечивает последовательность РНК, комплементарную к естественно продуцируемой (эндогенной) мРНК и ингибирующую экспрессию эндогенной мРНК. Механизм такой регуляции экспрессии гена с помощью антисмысловой ДНК выяснен не до конца. Несмотря на отсутствие желания придерживаться какой-либо определенной теории, нужно отметить, что теория антисмысловой регуляции предполагает, что транскрипция антисмысловой ДНК продуцирует молекулы РНК, которые присоединяются и предупреждают или ингибируют транскрипцию молекул эндогенной мРНК.

В способах настоящего изобретения антисмысловой продукт может быть комплементарным к кодирующим или некодирующим (или к тем и другим) частям встречающейся в природе РНК-мишени. Антисмысловая конструкция может быть введена в растительные клетки любым подходящим способом и может быть интегрирована в растительный геном для индуцируемой или конститутивной транскрипции антисмысловой последовательности. См., например, патенты США № 5453566 и 5107065, 8йсеттакег е! а1. (включены в настоящее описание в качестве ссылок).

Как принято здесь, экзогенной или гетерологичной ДНК (или РНК) называется ДНК (или РНК), введенная в клетку (или в предшественника клетки) благодаря усилиям человека. Такая гетерологичная ДНК может являться копией последовательности, которая обнаружена в трансформируемой клетке как естественная, или ее фрагментов.

Для того чтобы получить растение табака с пониженным содержанием ХФРТазы и, таким образом, более низким содержанием никотина, чем в нетрансформированном контрольном растении табака, клетку табака можно трансформировать антисмысловой транскрипционной ХФРТ-единицей, содержащей неполную последовательность кДНК ХФРТ, полноразмерную последовательность кДНК ХФРТ, неполную хромосомную последовательность ХФРТ или полноразмерную хромосомную последовательность ХФРТ, в антисмысловой ориентации с соответствующими функционально связанными регуляторными последовательностями. Подходящими регуляторными последовательностями являются последовательность инициации транскрипции (промотор), функционирующая в трансформируемом растении, и последовательность терминации полиаденилирования/транскрипции. Затем для идентификации клонов, несущих последовательности ХФРТазы в антисмысловой ориентации, функционально связанные с регуляторными последовательностями, используют стандартные методы, такие как рестрикционное картирование, Саузерн-блоттинг и анализ нуклеотидной последовательности. Затем из успешно трансформированных клеток регенерируют растения табака. Наиболее предпочтительно, когда используемая антисмысловая последовательность комплементарна к эндогенной последовательности, однако небольшие изменения в экзогенной и эндогенной последовательностях можно допустить.

Предпочтительно, чтобы последовательность антисмысловой ДНК была достаточно подобна последовательности, способной к связыванию с эндогенной последовательностью в регулируемой клетке, в строгих условиях, как описано ниже.

Антисмысловую технологию используют в ряде лабораторий для создания трансгенных растений, характеризующихся количеством специфических ферментов ниже естественного. Например, растения с пониженным уровнем хальконсинтазы фермента биосинтетического каскада реакций образования цветкового пигмента получены путем инсерции антисмыслового гена хальконсинтазы в геном табака и петунии. Эти трансгенные растения табака и петунии образуют цветы с окраской слабее нормальной (Уап бет Кго1 е! а1., Ап Апб-Зепке Сйа1сопе 8уп1йа8е Сеие ίη Тгапкдешс Р1апШ 1пЫЬй§ Р1о\\'ег Р1дтеп!а!юп, ИаШте, 333, р. 866-69 (1988)). Технология антисмысловых РНК также успешно используется для подавления образования фермента полигалактуроназы в томатах (8ιιά1ι е! а1. АпШепке ΡΝΑ 1п1иЬШоп оГ Ро1уда1ас1игопа8е Сепе Ехртекйоп ш Тгапкдешс Тота!ое§, Иа!иге, 334, р. 724-26 (1988); 811ее11у е! а1. Вебис!юп оГ Ро1уда1ас1игопа8е Асбуйу ш Тота!о Етш! Ьу АпШепзе ВИА, Ргос. Νη11. Асаб. 8ст И8А, 85, р. 8805-09 (1988)) и малой субъединицы фермента рибулозбисфосфаткарбоксилазы в табаке (Кобегте1 е! а1. №.1с1еаг-0гдапе11е Шетасбопк: Иис1еаг АпШепке Сепе 1пЫЬЙ8 КтЬиШе ВщрйокрШе СагЬоху1а§е Епхуте ЬеуеЦ ш ТгапкГогтеб ТоЬассо Р1ап!§, Се11, 55, р. 673-81 (1988)). С другой стороны, трансгенные растения, отличающиеся количеством этого фермента, превышающим нормальное, можно создать путем трансформации растений геном для этого фермента в смысловой (т.е. в нормальной) ориентации. Содержание никотина в трансгенных растениях табака по настоящему изобретению можно определить посредством стандартных проб на никотин. Трансформированные растения, в которых содержание ХФРТазы снижено по сравнению с нетрансформированными контрольными растениями, соответственно, будут иметь пониженное содержание никотина по сравнению с контролем; трансформированные растения, в которых содержание ХФРТазы повышено по сравнению с нетрансформированными контрольными растениями, соответственно, будут иметь повышенное содержание никотина по сравнению с контролем.

Гетерологичную последовательность, используемую в антисмысловых способах настоящего изобретения, можно выбрать с таким расчетом, чтобы получить продукт РНК, комплементарный к полной последовательности мРНК ХФРТазы или к ее части.

Последовательность может быть комплементарной к любой следующей последовательности природной матричной РНК, т. е. она может быть комплементарной к последовательности эндогенной мРНК, ближайшей к 5'-концу сайта кэпирования, в прямом направлении от сайта кэпирования, между сайтом

- 4 009898 кэпирования и инициирующим кодоном и может перекрывать всю или только часть некодирующей области, может быть мостиком между некодирующей и кодирующей областью, может быть комплементарной ко всей или к части кодирующей области, комплементарной к З'-концу кодирующей области или комплементарной к З'-нетранслируемой области мРНК. Соответствующие антисмысловые последовательности могут состоять по меньшей мере примерно из 13 до примерно 15 нуклеотидов, по меньшей мере примерно из 16 до примерно 21 нуклеотида, по меньшей мере примерно из 20 нуклеотидов, по меньшей мере примерно из 30 нуклеотидов, по меньшей мере примерно из 50 нуклеотидов, по меньшей мере примерно из 75 нуклеотидов, по меньшей мере примерно из 100 нуклеотидов, по меньшей мере примерно из 125 нуклеотидов, по меньшей мере примерно из 150 нуклеотидов, по меньшей мере примерно из 200 нуклеотидов или из большего их числа. Кроме того, последовательности можно удлинить или укоротить по их 3'- или 5'-концам.

Конкретная антисмысловая последовательность и длина антисмысловой последовательности будут изменяться в зависимости от необходимой степени ингибирования, устойчивости антисмысловой последовательности и подобных факторов. Специалист в этой области техники при выборе соответствующих антисмысловых последовательностей ХФРТазы будет руководствоваться возможностью применения методов, доступных в технике, и приведенными здесь сведениями. В соответствии с фиг. 2А и приведенной на ней последовательности № 1 олигонуклеотид изобретения может представлять собой непрерывный фрагмент последовательности кДНК ХФРТазы в антисмысловой ориентации, любой длины, которой достаточно для достижения необходимого действия при трансформации в растительную клеткуреципиента.

Настоящее изобретение также можно использовать при способах смысловой косупрессии продуцирования никотина. Смысловые ДНК, используемые при осуществлении настоящего изобретения, имеют достаточную длину, чтобы, когда экспрессируются в растительных клетках, подавлять в этой растительной клетке нативную экспрессию растительного белка ХФРТазы, как описано здесь. Такие смысловые ДНК могут представлять собой, по существу, полную геномную или комплементарную ДНК, кодирующую фермент ХФРТазу, или ее фрагмент, причем такие фрагменты, как правило, имеют длину по меньшей мере в 15 нуклеотидов. Способы установления длины смысловой ДНК, которая приведет к подавлению экспрессии нативного гена в клетке, доступны специалистам в этой области техники.

В другом варианте воплощения настоящего изобретения клетки растения ΝίοοΙίηηη трансформируются ДНК-конструкцией, содержащей сегмент ДНК, кодирующий молекулу ферментной РНК (т.е. рибозим), которая направлена против (т.е. расщепляет) транскрипта мРНК ДНК, кодирующей растительную ХФРТазу, как описано здесь. Рибозимы содержат связывающие субстрат домены, которые связываются с доступными областями мРНК-мишени, и домены, которые катализируют расщепление РНК, предотвращая трансляцию и продуцирование белка. Связывающие домены могут содержать антисмысловые последовательности, комплементарные к последовательности мРНК-мишени; каталитический мотив может представлять собой молотообразный мотив или другие мотивы, такие как шпилькообразный мотив. Сайты рибозимного расщепления в пределах РНК-мишени сначала можно идентифицировать путем сканирования молекулы-мишени на сайты расщепления рибозимом (например, последовательности СИЛ, Сии или сис). Сразу после идентификации можно оценить короткие последовательности РНК из 15, 20, 30 или большего числа рибонуклеотидов, соответствующие области гена-мишени, содержащей сайт расщепления, на предсказанные структурные особенности. Пригодность предполагаемых мишеней также можно оценить путем тестирования их доступности для гибридизации с комплементарными олигонуклеотидами, с использованием анализов с рибонуклеазной защитой, известных в технике. ДНК, кодирующую молекулы ферментной РНК, можно получить в соответствии с известными методами. См., например, Т. Сесй е! а1., патент США № 4987071; Кеепе е! а1., патент США № 5559021; Όοηκοη е! а1., патент США № 5589367; Тоггепсе е! а1., патент США № 5583032; 1оуее, патент США № 5580967; Со1б е! а1., патент США № 5595877; Уадпег е! а1., патент США № 5591601 и патент США № 5622854 (все патенты включены в настоящее описание в качестве ссылок). Продуцирование такой молекулы ферментной РНК в растительной клетке и срыв продуцирования белка ХФРТазы снижает активность ХФРТазы в растительных клетках, по существу, таким же образом, как продуцирование молекулы антисмысловой РНК, т.е. путем разрыва трансляции мРНК в клетке, продуцирующей фермент. Термин рибозим здесь используется для описания содержащей РНК нуклеиновой кислоты, которая функционирует как фермент (такой как эндорибонуклеаза) и может использоваться для реципрокного обмена с молекулой ферментной РНК. Настоящее изобретение также относится к ДНК, кодирующей рибозимы, ДНК, кодирующей рибозимы, которая вставлена в экспрессионный вектор, клеткам-хозяевам, содержащим такие векторы, и способам снижения продуцирования ХФРТазы в растениях с использованием рибозимов.

Нуклеотидные последовательности, используемые при осуществлении настоящего изобретения, включают последовательности, подобные последовательности № 1 и кодирующие белок, обладающий активностью хинолятфосфорибозил-трансферазы. Это определение подразумевает охват природных аллельных вариаций в белках ХФРТазах. Таким образом, последовательности ДНК, которые гибридизируют с ДНК последовательности № 1 и кодируют экспрессию ХФРТазы, в частности, растительных ферментов ХФРТаз, также могут использоваться при осуществлении настоящего изобретения.

- 5 009898

Могут существовать многие формы фермента ХФРТ табака. Может существовать множество форм фермента из-за посттрансляционной модификации одного генного продукта или из-за множества форм гена ΝιΟΡΤΙ.

Условия, которые позволяют последовательностям других ДНК, кодирующих экспрессию белка с активностью ХФРТазы, гибридизировать с ДНК последовательности № 1 или с другими последовательностями ДНК, кодирующими белок, данный в виде последовательности № 2, можно определить обычным способом. Например, гибридизацию таких последовательностей можно осуществить в условиях менее строгих или даже в строгих условиях (например, в условиях, представленных строгой промывкой раствором 0,3 Μ Ναί.Ί. 0,03 М цитрата натрия, 0,1% ДСН, при 60°С или даже при 70°С, ДНК, кодирующей белок, приведенный здесь как последовательность № 2, ίη δίΐιι при стандартном анализе гибридизации; см., например, 1 ЗатЬгоок е1 а1. Мо1еси1аг С1ошпд, А ЬаЬота!оту Мапиа1 (2пб еб., 1989) (Со1б Зрппд НатЬот ЬаЬота!огу).

Вообще, такие последовательности будут по меньшей мере на 65% подобны, на 75% подобны, на 80% подобны, на 85% подобны, на 90% подобны или даже на 95% или больше подобны последовательности, приведенной здесь как последовательность № 1, или последовательностям ДНК, кодирующим белки последовательности № 2. (Определения подобия последовательностей проводятся с двумя разложенными в ряд последовательностями по их максимальному совпадению; причем гэпы в любой из двух последовательностей при максимальном соответствии подходят под пару. Длина гэпов 10 или меньше является предпочтительной, более предпочтительна длина гэпов 5 или меньше и еще предпочтительнее длина гэпов 2 или меньше).

Пригодны различные процедуры гибридизации, предусматривающие выделение клонов кДНК, в которых содержание мРНК низкое - примерно 0,05% поли (А⁺) РНК. См. М. Сопкйпд е1 а1. Р1ап1 Рйущок, 93, 1203-1211 (1990). Коротко, библиотеки кДНК скринируют с использованием одноцепочечных кДНК-зондов обратно транскрибирующейся мРНК из растительной ткани (например, корней и/или листьев). Для дифференциального скрининга нитроцеллюлозную или нейлоновую мембрану смачивают в 5х88С, помещают в 96-луночный планшет с отсосом, в каждую лунку помещают 150 мкл стационарной ночной культуры, перенесенной с основного планшета, и применяют вакуум до тех пор, пока вся жидкость не пройдет через фильтр. В каждую лунку помещают 150 мкл денатурирующего раствора (0,5 М №ОН, 1,5 М №1С1) с использованием многопозиционной пипетки и оставляют примерно на 3 мин. Применяют отсос, как описано выше, и фильтр удаляют и нейтрализуют в 0,5 М трис-НС1 (рН 8,0), 1,5 М №С1. Затем его сушат в течение 2 ч в вакууме и инкубируют с соответствующими зондами. При использовании мембранных нейлоновых фильтров и хранении основных планшетов при -70°С в 7% ДМСО фильтры можно скринировать много раз со многими зондами и извлекать соответствующие клоны после нескольких лет хранения.

Используемый здесь термин ген относится к последовательности ДНК, включающей:

(1) регуляторные сигналы в обратном направлении (5'), в том числе промотор;

(2) кодирующую область, определяющую продукт, белок или РНК гена;

(3) области в прямом направлении (3'), в том числе сигналы транскрипции, терминации и полиаденилирования;

(4) ассоциированные последовательности, необходимые для эффективной и специфичной экспрессии.

Последовательность ДНК настоящего изобретения может состоять, по существу, из полученной здесь последовательности (последовательность № 1) или эквивалентных нуклеотидных последовательностей, представляющих аллели или полиморфные варианты этих генов, или их кодирующих областей.

Использование фразы значительное подобие последовательностей в настоящем описании и в формуле изобретения означает, что последовательности ДНК, РНК или аминокислотные последовательности, в которых есть незначительные и не имеющие значения отклонения последовательностей от фактических последовательностей, описанных и заявленных здесь, рассматриваются как эквивалентные последовательностям настоящего изобретения. С этой точки зрения фраза незначительные и не имеющие значения отклонения последовательностей означает, что подобные последовательности (т.е. последовательности, в которых имеется значительное подобие последовательностей с ДНК, РНК или белками, описываемыми и рассматриваемыми здесь) будут функционально эквивалентны последовательностям, описанным и заявленным в настоящем изобретении. Функционально эквивалентные последовательности будут функционировать, по существу, одинаково, с образованием, по существу, таких же композиций, что композиции нуклеиновых кислот и аминокислот, описанные и заявленные здесь.

Описанные здесь последовательности ДНК можно трансформировать во многие клетки-хозяева. Многие подходящие клетки-хозяева с нужными свойствами в отношении роста и обработки легко доступны в технике.

Использование фразы выделенный или по существу, чистый в настоящем описании и формуле изобретения в отношении модификатора ДНК, РНК, полипептидов или белков, означает, что ДНК, РНК, полипептиды или белки с таким определением выделены из своей ίη у1уо клеточной окружающей среды посредством приложения усилий человека.

- 6 009898

Используемые здесь выражения нативная последовательность ДНК или природная последовательность ДНК относятся к последовательности ДНК, которую можно выделить из нетрансгенных клеток или ткани. Нативные последовательности ДНК представляют собой последовательности, которые не изменены искусственно, например путем сайтнаправленного мутагенеза. Когда нативные последовательности ДНК идентифицированы, молекулы ДНК с нативными последовательностями ДНК можно синтезировать химически или получить с использованием известных в технике процедур с рекомбинантными ДНК. Используемая здесь нативная последовательность ДНК растения является последовательностью, которую можно выделить из нетрансгенных растительных клеток или ткани. Используемая здесь нативная последовательность ДНК табака является последовательностью, которую можно выделить из нетрансгенных клеток или ткани табака.

ДНК-конструкции или транскрипционные кассеты настоящего изобретения включают в направлении транскрипции 5'-3' промотор, описанный здесь, описанную здесь последовательность ДНК, функционально связанную с промотором, и, необязательно, последовательность терминации, включающую стоп-сигнал для РНК-полимеразы и сигнал полиаденилирования для полиаденилазы. Все эти регуляторные области должны быть способны работать в клетках трансформируемой ткани. Любой подходящий сигнал терминации может быть использован при осуществлении настоящего изобретения, причем его примерами являются, но не ограничиваются перечисленным, терминатор нопалин-синтаза (пок), терминатор октапин-синтаза (окс), терминатор СаМУ или нативные сигналы терминации, полученные от того же гена, что и область инициации транскрипции, или полученные от другого гена. См., например, Βοζίαη е! а1. (1988) или К.ойегте1 е! а1. (1988).

Используемый здесь термин функционально связанные относится к последовательностям ДНК в молекуле отдельной ДНК, которые связаны таким образом, что функция одной влияет на функцию другой. Таким образом, промотор является функционально связанным с ДНК, когда он способен воздействовать на транскрипцию этой ДНК (т. е. ДНК находится под транскрипционным контролем промотора). Говорят, что промотор находится в обратном направлении от ДНК, о которой, в свою очередь, говорят, что она находится в прямом направлении от промотора.

Транскрипционная кассета может быть представлена в ДНК-конструкции, которая также имеет по меньшей мере одну репликационную систему. Для удобства обычно получают репликационную систему, функциональную в ЕксйепсЫа сой, такую как Со1Е1, р8С101, рАСУС184, или подобную систему. При этом на каждой стадии после каждой манипуляции полученную конструкцию можно клонировать, секвенировать и определить правильность манипуляции. Кроме того, вместо репликационной системы ЕксйепсШа со11 можно использовать широкий ряд хозяев репликационной системы, таких как репликационные системы несовместимых плазмид Р-1, например рКК290. В дополнение к репликационной системе часто будет присутствовать по меньшей мере один маркер, который может быть полезным в одном или нескольких хозяевах, или разные маркеры для отдельных хозяев. Иными словами, можно использовать один маркер для селекции в прокариотном хозяине, в то время как другой маркер можно использовать для селекции в эукариотном хозяине, в частности в хозяине-растении. Маркеры могут быть защитой от биоцидов, таких как антибиотики, токсины, тяжелые металлы или подобные; могут обеспечивать комплементацию путем придания прототрофности ауксотрофному хозяину или могут давать видимый фенотип через продуцирование нового соединения в растении.

Различные фрагменты, содержащие различные конструкции - транскрипционные кассеты, маркеры и подобное, можно ввести последовательно с помощью расщепления рестрикционными ферментами соответствующей репликационной системы и вставки определенной конструкции или фрагмента в доступный сайт.

После лигирования и клонирования ДНК-конструкцию можно выделить для дальнейших действий. Примеры всех эти методов широко представлены в литературе, например в работе I. 8атЬгоок е! а1. Мо1еси1аг С1ошпд, А БаЬогаЮгу Мапиа1 (2пй Ей. 1989) (Со1й 8рппд НагЬог БаЬогаЮгу).

Векторы, которые можно использовать для трансформации растительной ткани нуклеотидными конструкциями настоящего изобретения, включают как векторы АдгоЬас1егшт, так и баллистические векторы, а также векторы, пригодные для опосредованной ДНК трансформации.

Термин промотор относится к области последовательности ДНК, которая включает необходимые сигналы для эффективной экспрессии кодирующей последовательности. Промотор может включать последовательности, с которыми связывается РНК-полимераза, но не ограничивается такими последовательностями, и может включать области, с которыми связываются другие регуляторные белки, вместе с областями, участвующими в контроле трансляции белка, и может включать кодирующие последовательности.

Промоторы, используемые при осуществлении настоящего изобретения, могут быть конститутивно активными промоторами. Доступны многие конститутивно активные промоторы, функционирующие в растениях. Предпочтительным примером является промотор 358 вируса мозаики цветной капусты (СаМУ), который экспрессируется конститутивно в большинстве растительных тканей. С другой стороны, промотор может быть специфическим для корней промотором или промотором, специфическим для кортекса корней, что подробнее поясняется ниже.

- 7 009898

Антисмысловые последовательности экспрессируются в трансгенных растениях табака с использованием промотора 358 вируса мозаики цветной капусты (СаМУ). См., например, е.д., Сотпейккеп е! а1. Во!Ь ΒΝΛ Ьеуе1 апб Ттапк1айоп ЕГГШепсу аге Вебисеб Ьу Ап!1-8епке ΒΝΛ ίη Тгапкдешс ТоЬаеео, ШсШс Ас1бк Век. 17, р. 833-43 (1989); Реха1ап е1 а1. Апй-8епке ΚΝΛκ оГ СиситЬег Мокаю Упик ш Тгапкдешс Р1ап!к Аккеккеб Гог Соп1то1 оГ !Ье Упик, Р1ап1 Мо1еси1аг Вю1оду 11, р. 463-71 (1988); Вобегте1 е1 а1. №.1с1еаг-Огдапе11е йиегасйопк: №.1с1еаг Апйкепке Сепе 1пЬ1Ь1!к В1Ьи1оке В1крЬокрЬа!е СагЬоху1аке Епхуте Ьеуе1к ш ТгапкГогтеб ТоЬассо Р1ап1к, Се11 55, р. 673-81 (1988); 8тйЬ е1 а1. Апйкепке КХА йбнЫйоп оГ Ро1уда1ас!игопаке Сепе Ехргеккюп ш Ттапкдешс Тота1оек, №1й.1ге 334, р. 724-26 (1988); Уап бег Кго1 е1 а1. Ап Апй-8епке СЬа1сопе 8уп!Ьаке Сепе ш Ттапкдешс Р1ап1к 1пЬ1Ь1!к Иотеет РщтегИайоп. №ш.1ге 333, р. 866-69 (1988).

Для экспрессии ХФРТазы в трансформированных клетках и растениях табака данного изобретения предпочтительно применение промотора 358 СаМУ. Подробно описано применение промотора СаМУ для экспрессии других рекомбинантных генов в корнях табака (Ьат е1 а1. 8йе-8ресй1с МШайопк А1!ег 1п Уйто Еас!от Вшбшд апб СЬапде Ргото1ег Ехргеккюп Райетп ш Ттапкдешс Р1ап1к, Ргос. №11. Асаб. 8сЕ И8А, 86, р. 7890-94 (1989); Рои1кеп е1 а1. П1ккесйоп оГ 5' Иркйеат 8ес.|иепсек Гог 8е1ес11уе Ехргеккюп оГ !Ье №сойапа рйппйащшГойа ГЬс8-8В Сепе, Мо1. Сеп. Сепе!., 214, р. 16-23 (1988)).

Другие промоторы, активные только в тканях корней (специфические для корней промоторы) также, в частности, подходят для способов настоящего изобретения. См., например, патент США № 5459252, Сопкйпд е! а1.; Уатато!о е! а1. ТЬе Р1ап! Се11, 3:371 (1991). Также используется промотор, специфический для кортекса корней. См., например, заявку на патент США, рег. № 08/508786, Сопкйпц е! а1., теперь принятую на рассмотрение; РСТ \УО 9705261. Все цитированные здесь патенты включены в настоящее описание в качестве ссылок.

Молекулы рекомбинантной ДНК ХФРТазы и векторы, используемые для получения трансформированных клеток и растений табака данного изобретения, также могут содержать доминантный селектируемый ген-маркер. Подходящие для применения в табаке доминантные селектируемые гены-маркеры включают, среди прочих, гены устойчивости к антибиотикам, кодирующие неомицин-фосфотрансферазу (№ТП), гидромицин-фосфотрансферазу (НРТ) и хлорамфеникол-ацетилтрансферазу (САТ). Другим хорошо известным доминантным селектируемым геном-маркером, подходящим для применения в табаке, является мутантный ген дигидрофолат-редуктазы, который кодирует устойчивую к метотрексату дигидрофолат-редуктазу. Векторы ДНК, содержащие подходящие гены устойчивости к антибиотикам, и соответствующие антибиотики являются коммерчески доступными.

Трансформированные клетки табака отбирают из ближайшей популяции нетрансформированных клеток, помещая смешанную популяцию клеток в культуральную среду, содержащую соответствующую концентрацию антибиотика (или другого соединения, естественно токсичного для клеток табака), устойчивость против которого придает продукт выбранного селектируемого гена-маркера. Таким образом, только эти трансформированные клетки табака будут выживать и размножаться.

Способы получения рекомбинантных растений настоящего изобретения, вообще, включают, вопервых, предоставление растительной клетки, способной к регенерации (причем растительная клетка, как правило, находится в ткани, способной к регенерации). Затем растительную клетку трансформируют ДНК-конструкцией, содержащей транскрипционную кассету настоящего изобретения (описанную здесь), и из трансформированной растительной клетки регенерируют рекомбинантное растение. Как поясняется ниже, стадию трансформации осуществляют методами, известными в технике, включая, но не ограничиваясь перечисленным, бомбардировку растительной клетки микрочастицами, несущими транскрипционную кассету, инфицирование клетки АдгоЬас!епит !итеГас1епсек, содержащим Т1-плазмиду, несущую транскрипционную кассету, или любым другим методом, подходящим для получения трансгенного растения.

Известны многие векторные системы АдгоЬас!етшт, полезные при осуществлении настоящего изобретения. Например, в патенте США № 4459355 описывается способ трансформации восприимчивых растений, включая двудольные, штаммом АдгоЬас!етшт, содержащим Т1-плазмиду. Трансформация древесных растений вектором АдгоЬас!етшт описывается в патенте США № 4795855. Кроме того, в патенте США № 4940838, 8сЫ1регоой е! а1. описывается бинарный вектор АдгоЬас!етшт (т.е. вектор, в котором АдгоЬас!етшт содержит одну плазмиду, имеющую νίτ-область Т1-плазмиды, но не Т-область, и вторую плазмиду, имеющую Т-область, но не νίτ-область), полезный при осуществлении настоящего изобретения.

Микрочастицы, несущие ДНК-конструкцию настоящего изобретения, подходящие для баллистической трансформации растительной клетки, также полезны для получения трансформированных растений настоящего изобретения.

Микрочастица продвигается в растительную клетку для получения трансформированной растительной клетки, из которой восстанавливают растение. В практике настоящего изобретения можно использовать любую подходящую методологию баллистической трансформации клетки и аппаратуру для ее осуществления. Примеры аппаратуры и процедур описываются в патентах США № 4945050, 8апГогб апб ^о1Г и № 5015580, СЬпк!ои е! а1. При использовании процедур баллистической трансформации транскрипционная кассета может быть введена в плазмиду, способную к репликации или интеграции в трансформируемую клетку. Примерами микрочастиц, пригодных для применения в таких системах, яв

- 8 009898 ляются 1-5-микронные золотые шарики. ДНК-конструкцию можно осадить на микрочастицу любым подходящим способом, например путем преципитации.

Вид растения можно трансформировать ДНК-конструкцией настоящего изобретения путем опосредованной ДНК трансформации протопластов растительной клетки и последующей регенерации растения из трансформированных протопластов в соответствии с процедурами, хорошо известными в технике. Слияние протопластов табака с помощью содержащих ДНК липосом или посредством электропорации известно в технике. (8ЫШ1о с! а1. Эйес! Сеие ТгапкГег ίο Рго1ор1аз(8 о£ 0|со1у1ебопон8 апб Мопосо1у1ебопоиз Р1ап!к Ьу а ЫитЬет о£ МеШобз, 1пс1ибшд Е1ес1торота1юп, МеШобз ίη Еп/уто1ос.|у. 153, р. 313-36 (1987)).

Здесь трансформация представляет введение экзогенной ДНК в клетки с тем, чтобы получить трансгенные клетки, устойчиво трансформированные экзогенной ДНК.

Трансформированные клетки индуцируют для регенерации интактных растений табака посредством применения к культуре клеток и ткани табака методов, хорошо известных в технике. Способ регенерации растения выбирают таким образом, чтобы он был совместим со способом трансформации. Устойчивое присутствие и ориентацию последовательности ХФРТазы в трансгенных растениях табака можно проверить с помощью менделирующей наследственности последовательности ХФРТазы, которая обнаруживается стандартными методами анализа ДНК, применяемыми к потомству, получаемому при контрольных скрещиваниях. После регенерации трансгенных растений табака из трансформированных клеток введенная последовательность ДНК легко переносится в другие сорта табака обычными методами выращивания растений и без чрезмерного экспериментирования.

Например, для того чтобы проанализировать расщепление трансгена, можно вырастить регенерированные трансформированные растения (Κ₀) до зрелости, проверить на содержание никотина и размножить инбридингом для получения растений Κ₁. Процент растений Κ₁, содержащих трансген, составляет гомозиготы для трансгена. Для идентификации гомозиготных растений Κι трансгенные растения Κι выращивают до зрелости и размножают инбридингом. Гомозиготные растения Κ будут давать потомство Κ₂, где каждое растение-потомок несет трансген; потомство гетерозиготных растений Κ₁ будет расщепляться 3:1.

Никотин служит в качестве природного пестицида, который помогает защитить растения табака от повреждения вредителями. Поэтому также может оказаться желательной дополнительная трансформация полученных данными способами растений с низким содержанием никотина, или не содержащих никотин, трансгеном (таким как ВасШиз Шипд1епз1з), что будет создавать дополнительную защиту от насекомых.

Предпочтительным растением для применения в способах настоящего изобретения является вид №собапа или табак, в том числе N. 1аЬасит, N. тизбса и N. д1и!шоза. Можно использовать любой штамм или сорт табака. Предпочтительны штаммы, в которых содержание никотина уже низкое, такие как двойные мутанты Νίο1/Νίο2.

Любую растительную ткань, способную к последующему размножению клона путем органогенеза или эмбриогенеза, можно трансформировать вектором настоящего изобретения.

Используемый здесь термин органогенез означает процесс, по которому из меристиматического центра последовательно развиваются побеги и корни; используемый здесь термин эмбриогенез означает процесс, по которому побеги и корни развиваются вместе, согласованно (не последовательно), из соматических клеток или из гамет. Конкретная выбранная ткань будет меняться в зависимости от систем размножения клонов, доступных и наиболее подходящих для конкретного трансформируемого вида. Примерами тканей-мишеней являются листовые диски, пыльца, зародыши, семядоли, гипокотили, ткань каллюса, имеющаяся метистиматическая ткань (например, верхушечные меристемы, пазушные почки и корневые меристемы) и индуцированная меристематическая ткань (например, меристема семядоли и гипокотильная метистема).

Растения настоящего изобретения могут принимать множество форм. Растения могут представлять собой химеры трансформированных и нетрансформированных клеток; могут быть клональными трансформантами (например, все трансформированные клетки содержат транскрипционную кассету); могут содержать привитые части трансформированных и нетрансформированных тканей (например, трансформированный корневой побег, привитый на нетрансформированный привой вида цитрусового растения). Трансформированные растения можно размножать многими способами, такими как размножение клона или классические методы выращивания. Например, первую генерацию (или Т1) трансформированных растений можно вырастить инбриндингом и получить гомозиготную вторую генерацию (или Т2) трансформированных растений, а затем растения Т2 размножать классическими методами выращивания. Для облегчения выращивания транскрипционную кассету можно соединить с доминантным селектируемым маркером (таким как прШ).

В свете вышеуказанного очевидно, что растения, которые можно использовать при практическом применении настоящего изобретения, включают растения рода №собапа.

Специалистам, знакомым с методами рекомбинантных ДНК, описанными выше, будет понятно, что для создания трансгенных клеток и растений табака можно использовать полноразмерную молекулу кДНК ХФРТазы или полноразмерный хромосомный ген ХФРТазы, присоединенный в смысловой ориен

- 9 009898 тации, с соответствующими функционально соединенными регуляторными последовательностями. (Специалистам в этой области техники также будет понятно, что соответствующие регуляторные последовательности для экспрессии генов в смысловой ориентации включают любую из известных эукариотных последовательностей начала трансляции, в дополнение к промотору и последовательностям терминации полиаденилирования транскрипции, описанным выше.) Такие трансформированные растения табака характеризуются повышенным содержанием ХФРТазы и, таким образом, более высоким содержанием никотина, чем нетрансформированные контрольные растения табака.

Следовательно, следует иметь в виду, что использование последовательностей ДНК ХФРТазы для снижения или повышения содержания ХФРТ-фермента и, посредством этого, для снижения или повышения содержания никотина в растениях табака входит в объем настоящего изобретения.

Используемый здесь термин культура включает множество растений настоящего изобретения и одного и того же рода, выращенных вместе на участке для агрокультуры. Под участком для агрокультуры подразумевается обычная делянка или теплица.

Таким образом, настоящее изобретение относится к способу получения культуры растений с измененной активностью ХФРТазы и, следовательно, с повышенным или пониженным содержанием никотина по сравнению с подобной культурой нетрансформированных растений того же вида и сорта.

Приведенные далее примеры даются для пояснения настоящего изобретения и не должны рассматриваться как его ограничение.

Пример 1.

Выделение и секвенирование.

Здесь как последовательность № 1 представлена установленная последовательность кДНК ТоЬКЭ2 (СопкБпд с1 а1., Р1ап1 Ркук., 93, 1203, 1990), а расшифрованная аминокислотная последовательность представлена как последовательность № 2. Было предсказано, что расшифрованная аминокислотная последовательность представляет собой цитозолевый белок. Хотя гены растительной ХФРТазы не описаны, сравнение аминокислотной последовательности ΝίΟΡΤΙ с базой данных банка генов (фиг. 3) показывает ограниченное подобие последовательностей с определенными бактериальными и другими белками; активность хинолятфосфорибозил-трансферазы (ХФРТазы) показана в случае генов 8. 1урЫтигшт, Е. сой и Ν. ЧаЬаеит. Кодированная ΝίΟΡΤΙ ХФРТаза имеет подобие с расшифрованным пептидным фрагментом, кодированным последовательностью Е8Т (метка экспрессионной последовательности) ЛгаЬ1άορκίκ (инвентарный номер банка генов Б20096), который может представлять часть гена ХФРТазы ЛгаЬ1бор515.

Пример 2.

Гибридизация ίη κίΐιι.

Для того чтобы определить пространственное распределение транскрипта мРНК ТоЬКН2 в различных тканях корня, осуществляют гибридизацию ίη κίΐιι в ^трансформированных растениях. Гибридизацию ίη кйи антисмысловой цепи ТоЬКЭ2 с мРНК ТоЬКЭ2 в ткани корня проводят с использованием методов, описанных в Меуеготейх, Р1ап1 Мо1. Вю1. Кер., 5, 242 (1987) и в 8тйй е1 а1. Р1ап1 Мо1. Вю1. Кер., 5, 237 (1987). Корни семидневных всходов табака (Мсойапа 1аЬасит) фиксируют в забуференном фосфатом глутаральдегиде, заливают парапластом-плюс (Мопо)ес1 1пс., Сент-Луис, Миссури) и делают срезы толщиной 8 мм, чтобы получить поперечные срезы, а также продольные срезы. Антисмысловые транскрипты ТоЬКЭ2, синтезированные ш уйго в присутствии 358-АТР, используют в качестве зондов. Меченную РНК перед применением гидролизуют путем обработки щелочью и получают среднюю длину в 100-200 оснований.

Гибридизацию проводят в 50% формамиде в течение 16 ч при 42°С с меченной РНК с числом импульсов в минуту (чим) приблизительно 5х10⁶ на 1 мл раствора для гибридизации. После выдержки предметные стекла проявляют и рассматривают в светлом и темном поле микроскопа.

Сигнал гибридизации локализуется в кортикальном слое клеток в корнях (результаты не приводятся). Сравнение изображений одних и тех же срезов как в светлом, так и в темном поле показывает локализацию транскриптов ТоЬКЭ2 в паренхиматозных клетках кортикального слоя корней. Сигнал гибридизации в эпидермисе или стеле не обнаруживается.

Пример 3.

Содержание мРНК ТоЬКЭ2 в мутантах табака ΝΚ1 и ΝΚ2 и корреляция с содержанием никотина.

Проверяют стационарное содержание мРНК ТоЬКЭ2 в мутантах растений табака №с1 и ΝΚ2. Известно, что №с1 и ΝΚ2 регулируют активность хинолятфосфорибозил-трансферазы и активность путресценс-метилтрансферазы и являются кодоминантными регуляторами продуцирования никотина.

Полученные результаты приводятся на фиг. 5 и показывают, что экспрессия ТоЬКЭ2 регулируется №с1 и ΝΚ2.

Выделяют РНК из корней растений табака Виг1еу 21 дикого типа (№с1/№с1 №с2/№с2); корней №с1^- Виг1еу 21 (шс1/шс1 №с2/№с2); корней ΝΚ2^- Виг1еу 21 (№с1/№с1 шс2/шс2) и корней ΝΚ1-ΝΚ2 Виг1еу 21 (шс1/шс1 шс2/шс2).

Четыре линии табака Виг1еу 21 (шс) выращивают из семян в почве в течение месяца и на один месяц переносят в камеры для гидропоники в аэрированный питательный раствор в теплице. Эти линии

- 10 009898 являются изогенными, за исключением двух локусов с низким содержанием никотина, и имеют генотипы Νίοΐ/Νίοΐ Νίο2/Νίο2, Νίοΐ/Νίοΐ шс2/шс2, шс1/шс1 Νίο2/Νίο2, шс1/шс1 шс2/шс2.

Корни собирают у примерно 20 растений для каждого генотипа и объединяют для выделения РНК. Полную РНК (1 мкг) от каждого генотипа подвергают электрофорезу в 1% агарозном геле, содержащем 1,1 М формальдегида, и переносят на нейлоновую мембрану в соответствии с 8атЬгоок с1 а1. (1989). Мембраны гибридизируют с фрагментами меченной ³²Р кДНК ТоЬКЭ2. Относительную плотность транскриптов ТоЬК02 измеряют посредством денситометрии. Фиг. 5 показывает относительное содержание транскриптов (по сравнению с Νίο1/Νίο1 Νίο2/Νίο2) для каждого из четырех генотипов. Относительное содержание никотина (по сравнению с Νίο1/Νίο1 Νίο2/Νίο2) в четырех генотипах показано заштрихованными прямоугольниками.

На фиг. 5 дается графическое сравнение относительного стационарного содержания мРНК ТоЬКО2 с использованием содержания, обнаруженного в Виг1еу 21 дикого типа (Νίο1/Νίο1 Νίο2/Νίο2). в качестве ссылочного количества. Содержание мРНК ТоЬКО2 в двойных мутантах Νίο1/Νίο2 составляет приблизительно 25% от содержания в табаке дикого типа. На фиг. 5 также сравнивается относительное содержание никотина в почти изогенных линиях табака, исследуемых в этом примере (темные прямоугольники показывают содержание транскрипта ТоЬКО2; заштрихованные прямоугольники показывают содержание никотина). Существует тесная корреляция между содержанием никотина и содержанием транскрипта ТоЬКО2.

Пример 4.

Влияние прищипки верхушек на содержание мРНК ТоЬКО2.

В технике хорошо известно, что удаление цветочной головки растения табака (прищипка верхушки) усиливает рост корней и повышает содержание никотина в листьях растения. Прищипка верхушки растения является обычной практикой при выращивании табака, и специалист в этой области техники может легко определить оптимальное время для прищипки верхушки данного растения табака при известном наборе условий.

Растения табака (Ν. 1аЬасит 8Р1) в течение месяца выращивают из семян в почве и переносят в горшки, содержащие песчаную почву. Растения еще в течение двух месяцев выращивают в теплице до тех пор, пока они не начинают образовывать цветки. Затем у четырех растений удаляют цветочные головки и два узла (прищипка верхушек). Через определенное время часть корней от каждого растения собирают и объединяют для экстракции РНК. Контрольные растения не прищипывают. Полную РНК (1 мкг) на каждый момент времени подвергают электрофорезу в 1% агарозном геле, содержащем 1,1 М формальдегида, и переносят на нейлоновую мембрану в соответствии с 8атЬгоок е1 а1. (1989). Мембраны гибридизируют с фрагментами меченной ³²Р кДНК ТоЬКО2. Относительную плотность транскриптов измеряют посредством денситометрии. Фиг. 6 иллюстрирует относительное содержание транскрипта (по сравнению со временем ноль) для каждого отмеченного времени при прищипке верхушек (темные прямоугольники) и без прищипки (заштрихованные прямоугольники).

Относительное содержание ТоЬКО2 в ткани корней определяют через 24 ч; результаты приводятся на фиг. 6 (темные прямоугольники показывают содержание транскрипта ТоЬКО2 в прищипанных растениях; заштрихованные прямоугольники показывают содержание транскрипта ТоЬКО2 в неприщипанных контрольных растениях). В течение 6 ч после прищипки верхушек растений табака содержание мРНК ТоЬКО2 в прищипанных растениях возрастает приблизительно в 8 раз; в контрольных растениях за это же время возрастания не наблюдается.

Пример 5.

Комплементация бактериального мутанта, лишенного ХФРТазы с ДНК последовательности № 1.

Штамм ЕхсйепсЫа сой ТН265 является мутантом, лишенным хинолятфосфорибозил-трансферазы (пайС^-), и поэтому не может расти на среде, лишенной никотиновой кислоты.

Клетки ТН265 трансформируют экспрессионным вектором (р\М8161), содержащим ДНК последовательности № 1, или трансформируют только экспрессионным вектором (рКК233). Рост трансформированных бактерий сравнивают с ростом трансформантов ТН265 (рКК233) и с ростом нетрансформированного мутанта ТН265 пайС^-. Рост сравнивают на минимальной среде МЕ (лишенной никотиновой кислоты) и на минимальной среде МЕ с добавлением никотиновой кислоты.

Штамм Е. сой с мутацией ХФРТазы (пайС) ТН265 любезно предоставлен д-ром К.Т. Нидйек (Нидйек е1 а1. ί. Васй, 175:479, 1993). Клетки хранятся на среде ЬВ, а компетентные клетки получают так, как описано в 8атЬгоок е1 а1. (1989). Экспрессионную плазмиду создают в рКК2233 (Вгоыик, 1984) с кДНК ТоЬКО2, клонированной под контролем Тас-промотора. Полученную плазмиду р\М8161 трансформируют в клетки ТН265. Затем трансформированные клетки высевают на агаровые пластины в минимальную среду (Уоде1 апй Воппег, 1956) без никотиновой кислоты или с добавлением никотиновой кислоты (0,0002%). На подобные пластины для использования в качестве контроля высевают одни клетки ТН265 и клетки ТН265, трансформированные рКК2233.

Результаты приводятся на фиг. 4. Только клетки ТН265, трансформированные ДНК последовательности № 1, растут на среде, лишенной никотиновой кислоты. Эти результаты показывают, что экспрессия ДНК последовательности № 1 в бактериальных клетках ТН265 придает этим клеткам фенотип

- 11 009898 №1бС. что подтверждает, что эта последовательность кодирует ХФРТазу. Поэтому название ТоЬКЭ2 заменяют на ΝιΟΡΤΙ.

Пример 6.

Трансформация растений табака.

ДНК последовательности № 1 в антисмысловой ориентации функционально связана с растительным промотором (358 СаМУ или специфическим для кортекса корней промотором ТоЬКЭ2). и получают две различные ДНК-кассеты: промотор СаМУ353/антисмысловая последовательность № 1 и промотор ТоЬКЭ2/антисмысловая последовательность № 1.

Отбирают для трансформации линию табака дикого типа и линию табака с низким содержанием никотина. например. табак дикого типа Виг1еу 21 (Νίο1 '/Νίο2') и гомозиготный Виг1еу 21 шс1^-/шс2^-. Трансформируют много клеток растений табака от каждой линии с использованием каждой содержащей ДНК кассеты. Трансформацию проводят с использованием вектора АдтоЬас1егшт. например. бинарного вектора АдгоЬасЧегшт. несущего Τί-пограничные последовательности и ген прШ (придающий устойчивость к канамицину и под контролем пок-промотора (ηρΐΐΐ)).

Трансформированные клетки отбирают и регенерируют в трансгенные растения табака (В_о). Растения Во выращивают до зрелости и проверяют на содержание никотина; подгруппа трансформированных растений табака обнаруживает существенно сниженное содержание никотина по сравнению с нетрансформированными контрольными растениями.

Затем растения К_о размножают инбриндингом. и анализируют расщепление трансгена в потомстве К₁. Потомство К выращивают до зрелости и размножают инбриндингом; расщепление трансгена в потомстве К₂ указывает. что растения Κι являются гомозиготными.

- 12 009898

Список последовательностей (1) ОБЩАЯ ИНФОРМАЦИЯ (I) ЗАЯВИТЕЛЬ: СопкЫпд, Магк А.

Мепди, Νβάίηί

8опд, Иеп (II) НАЗВАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ: Регуляция экспрессии хинолятфосфорибозилтрансферазы (III) ЧИСЛО ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ: 4 (IV) АДРЕС ДЛЯ КОРРЕСПОНДЕНЦИИ:

(A) АДРЕСАТ: КеппеЫэ ЗгЫеу, Ве11 ЗеШгег Рагк & С1Ьзоп (Б) УЛИЦА: Розк О££1се Огаиег 34009 (B) ГОРОД: СНагЬокке (Г) ШТАТ: Северная Каролина (Д) СТРАНА: США (Ε) ΖΙΡ: 28234 (V) ФОРМА КОМПЬЮТЕРНОГО СЧИТЫВАНИЯ:

(A) ТИП СРЕДЫ: дискета (Б) КОМПЬЮТЕР: совместимый с системой ΙΒΜ РС (B) ОПЕРАЦИОННАЯ СИСТЕМА: РС-ООЗ/МЗ-ООЗ (Г) ПРОГРАММНОЕ ОБЕСПЕЧЕНИЕ: РакепЫп

КеаЬеазе #1.0, версия #1.30 (VI) СВЕДЕНИЯ О ТЕКУЩЕЙ ЗАЯВКЕ: ' (A) НОМЕР ЗАЯВКИ:

(B) ДАТА РЕГИСТРАЦИИ:

- 13 009898 (В) КЛАССИФИКАЦИЯ:

(VIII) ИНФОРМАЦИЯ О ПОВЕРЕННОМ/АГЕНТЕ:

(A) ИМЯ: 31Ыеу, КеппеЬН ϋ.

(Б) РЕГИСТРАЦИОННЫЙ НОМЕР: 31665 (B) НОМЕР ДЕЛА/РЕЕСТРА: 5051-338Р (IX) ТЕЛЕКОММУНИКАЦИОННАЯ ИНФОРМАЦИЯ:

(А) ТЕЛЕФОН: 919-420-2200 (Б) ТЕЛЕФАКС: 919-881-3175 (2) ИНФОРМАЦИЯ О ПОСЛЕД. № 1 (I) ХАРАКТЕРИСТИКИ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ:

(A) ДЛИНА: 1399 пар оснований (Б) ТИП: нуклеиновая кислота (B) ЧИСЛО ЦЕПОЧЕК: одноцепочечная

	(Г)	ТОПОЛОГИЯ	: линейная
(II)	ТИП	МОЛЕКУЛЫ:	кДНК
(IX)	ПРИЗНАК:
	(А)	ИМЯ/КЛЮЧ:	СБЗ
	(Б)	ЛОКАЦИЯ:	52..1104

(XI) ОПИСАНИЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ: ПОСЛЕД. № 1

САААААСТАТ ТТТССАСААА АПСАГГТСА СААССССССС АААААААААС С АТС ТП 57 Ме! РЬе

АСА ССТ АП ССТ ПС АСТ ССТ АСА 6Т6 САТ ССТ ТАТ ССА АП АСА ССТ105

Агд АТС Не Рго РЬе ТЬг АТС ТЬг Уа1 Н1з Рго Туг АТС Не ТЬг АТС

1015

ССА АСС ПС СТС СТС ААА АТС ТСА ССА АТА ССС АСС ААС ААТ АСА АСА153

Рго Агд Ьеи \/а1 Уа! 1_уз Ме! Зег А!а Не А!а ТЬг ίγ5 Азп ТЬгАгд

2530

СТС САС ТСА ПА САС СТС ААА ССА ССА ССА САС ССА АСТ ТАТ САТ ПА201 \/а1 61 и 5ег Ьеи 61 и Уа! 1_уз Рго Рго АТС Нтз Рго ТЬг Туг АзрЬеи

40 4550

ААС САА СП АТС ААА СП ССА СТС ТСТ САА САТ ССТ ССС ААТ ПА ССА249

1_у5 С1и Уа! Ме! Суз Ьеи А1а 1_еи 5ег С1и-Азр А!а С!у Азп 1_еи61у

6065

САТ СТС АСТ ТСТ ААС ССС АСА АП ССТ' СП САТ АТС САА ТСС САТ ССТ297

Азр Уа! ТЬг Суз Ьу5 АТС ТЬг Не Рго 1_еи- Азр Ме! 61 и Зег АзрА1а

7580

САТ ПТ СТА ССА ААС САА САС ССС АТС АТА ССА ССА АП ССА СП ССТ345

Нтз РЬе 1_еи АТС Ьуз 61и Азр С1у Не Пе АТС С1у Пе АТС ЬеиАТС

9095

САС АТС АТА ПС ССС САА СП САТ ССТ ТСА ПА ААС СТС САС ТСС ТАТ393

С1и Ме! Пе РЬе АТС С1и Уа! Азр Рго Зег Ьеи (_уз Уа! 61и ТгрТуг

100 105110

СТА ААТ САТ ССС САТ ААА СП САТ ААА 66С ПС ААА ТП ССС ААА СТА441

Уа! Азп Азр 61у Азр Ьуз Уа! Н1з Суз С1у Ьеи 1_уз РЬе С1у ЬузУа!

115 120 125130

САА ССА ААС ССТ ТАС ААС АП СП АТА ССТ САС АСС СП СП СТС ААТ489

61п 61у Азп А!а Туг Азп Пе Уа! Не АТС 61и Агд Уа! Уа! 1_еиАзп

135 140145

ТП АТС САА АСА АТС АСТ. ССА АТА ССТ АСА СТА АСТ ААС САА АТС ССА537

РЬе Ме! 61 п Агд Ме! Зег 61у Не АТС ТЬг Ьеи ТЬг 1_уз 61 и Ме!АТС

150 155160

САТ ССТ ССА САС ССТ ССТ ТАС АТС ПС 6А6 АСТ АСС ААА АСТ 6СТ ССТ585

Азр АТС АТС Нтз Рго АТС Туг Не Ьеи 61 и ТЬг Агд 1_уз ТЬг АТС Рго

165 170175

- 14 009898 сед на сет ж ета сдт ааа тсс ссс ста ле атс сот ссс ссс аас бзз

61у Ьеи Агд Ьеи Уа! Азр Ьуз Тгр Α1 а Уа1 Ьеи Не 61у 61у 61у Ьуз

180 185190

ААТ САС АСА АТС ССС ЛА ТЛ САТ АТС СТА АТС АТА ААА 6АС ААТ САС681

Азп Нтз Агд МеЬ 61 у Ьеи РЬе Азр МеЬ УаТ Μεΐ Не Ьуз Азр АзпНтз 195 200 205210

АТА ТСТ ССТ ОСТ ССА ест 6ТС ССС ААА ОСТ СТА ААА ТСТ СТС САТ САС729

Не Зег АТС АТС 61у 61у Уа! 61у Ьуз АТС Ьеи Ьуз 5ег \/аТ Азр 61п

215 220225

ТАТ Ж САС САА ААТ ААА СЛ САА АТА 666 6Л САС 6Л САА АСС А66777

Туг Ьеи 61и 61п Азп Ьу5 Ьеи 61п Не 61у УаТ СТС Уа1 СТС ТИг Агд

230 235240

АСА АТТ САА САА СТА ССТ САС 6Л СТА САС ТАТ ССА ТСТ САА АСА ААС825

ТИг Не СТС 01 и Уа1 Агд СТС Уа! Ьеи Азр Туг АТС Зег 61 п ТИг Ьуз

245 250255

АСТ ТСС Ж АСТ АСС АТА АТС СТС САС ААТ АТС СП 6Л ССА ЛА ТСТ873

ТИг Зег Ьеи ТИг Агд Не МеЬ Ьеи Азр Азп МеЬ Уа! Уа! Рго ЬеиЗег

260 265270

ААС ССА САТ АЛ САТ СТА ТСС АТС СЛ ААС 6А6 ССТ СТА САА ЛС АТС921

Αεη СТу Азр Не Азр \/а! Зег МеЬ Ьеи Ьуз СТС АТС Уа! 61и Ьеи11е

275 280 285290

ААТ ССС АСС ТЛ САТ АСС ОАО ССТ ТСА ССА ААТ СЛ АСС СЛ САА АСА969

Азп С1у Агд РНе Азр ТИг 61 и АТС Зег 61у Азп Уа! ТИг Ьеи 61 иГИг

295 . 300305

6ТА САС АА6 АЛ 66А САА АСТ 66Т 6Л АССТАС АЛ ТСТ А6Т 66Т ССС1017

Уа1 Нтз Ьуз Не 61у 61п ТИг 61у Уа1 ТИг Туг Не Зег Зег 61уАТС

310 315320

СТ6 АС6 САТ ТСС 6Т6 ААА 6СА СЛ 6АС АЛ ТСС СТС АА6 АТС 6АТ АСА1065

Ьеи ТИг Нтз Зег Уа1 Ьуз АТС Ьеи Азр IIе Зег Ьеи Ьуз Не АзрТИг

325 330335

6А6 СТС 6СС СЛ 6АА 6Л 66А А66 С6Т АСА ААА С6А 6СА Т6А6С6ССАТ1114 и Ьеи АТС Ьеи 61 и Уа1 61у Агд Агд ТИг Ьуз Агд АТС

340 345350

ТАСЛСТ6СТ АТА666Л66 А6ТАААА6СА 6СТ6ААТА6С Т6ААА66Т6С АААТАА6ААТ1174

САТТЛАСТА 6Л6ТСАААС АААА6АТССТ ТСАСТ6Т6ТА АТСАААСААА АА6АТ6ТААА1234

Л6СТ66ААТ АТСТСА6АТ6 6СТСТТЛСС ААССЛАЛ6 СЛ6А6Л66 ТААЛТСАЛ1294

АТА6СТЛ6Т ТЛСАТ6ТЛ САТ66ААТЛ 6ЛАСААТ6А АААТАСЛ6А ЛТАТАА6Л1354

Т66Т6ТАТ6Т ААААЛСТ6Т 6ЛАСЛСАА АТАТТЛ6А6 АТ6Л1399

- 15 009898 (2) ИНФОРМАЦИЯ О ПОСЛЕД. № 2 (I) ХАРАКТЕРИСТИКИ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ:

(А) ДЛИНА: 351 аминокислота (Б) ТИП: аминокислота (Г) ТОПОЛОГИЯ: линейная (II) ТИП МОЛЕКУЛЫ: белок · (XI) ОПИСАНИЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ: ПОСЛЕД. № 2

МеЬ РЬе Агд А1а Не Рго РЬе ТЬг А! а ТЬг Уа1 Нтз Рго Туг А! а Не 1 5 10 15

ТЬг АТа Рго Агд Ьеи \/а1 Уа! Ьуз МеЬ Зег А1а Не А1а ТЬг Ьуз Азп

20

25

30

ТЬг

Агд

Уа1

61 и

Зег

Ьеи

61и

νβΐ

ьуз

Рго

Рго

А1а

Ηί з

Рго

ТЬг

Туг

35

40

45

Азр

Ьеи

Ьуз

61 и

Уа!

МеЬ

Ьуз

Ьеи

А1а

Ьеи

Зег

61и

Азр

А1а

61у

Азп

50

55

60

Ьеи

61у

Азр

Уа!

ТЬг

Суз

Ьуз

А1а

ТЬг

Не

Ррв-

Ьеи

Азр

Μθΐ

61 и

Зег

65

70

75

80

Азр

А1а

Нтз

РЬе

Ьеи 85

А1а

Ьуз

61 и

Азр

61у 90

11е

11е

А1а

61у

Не 95

А1а

Ьеи

А! а

61 и

МеЬ

Не

РЬе

А1а

61 и

7а1

Азр

Рго

Зег

Ьеи

Ьуз

Уа!

61 и

100

105

110

Тгр

Туг

Уа1

Азп

Азр

61у

Азр

Ьуз

Уа1

Н1з

Ьуз

61у

Ьеи

Ьуз

РЬе

61 у

115

120

125

Ьуз

Уа1

61 п

61у

Азп

А1а

Туг

Азп

Не

νβΐ

Не

А1а

61и

Агд

Уа1

Уа1

130

135

140

Ьеи

Азп

РЬе

МеЬ

61 п

Агд

МеТ

Зег

61у

11е

А1а

ТЬг

Ьеи

ТЬг

Ьуз

61 и

145

150

155

160

МеЬ

А1а

Азр

А1 а

А1 а

Нтз

Рго

А! а

Туг

Не

Ьеи

61 и

ТЬг

Агд

Ьуз

ТЬг

165

170

175

А1а Рго 61у Ьеи Агд Ьеи Уа! Азр Ьуз Тгр А1а Уа1 Ьеи Не 61у 61 у

180

185

190

61у

Ьуз

Азп

Нт з

Агд

МеЬ'

61у

Ьеи

РЬе

Азр

МеЬ

Уа!

МеЬ

Не

Ьуз

Азр

195

200

205

Азп

Нтз

Не

Зег

А1а

А1а

61у

61у

УаТ

6!у

Ьуз

А1а

Ьеи

Ьуз

Зег

Уа!

210

215

220

Азр

61 п

Туг

Ьеи

61 и

61 п

Азп

Ьуз

Ьеи

61п

Не

61у

Уа!

61 и

Уа1

61 и

225

230

235

240

- 16 009898

ТЬг

Агд

ТЬг

Не

61 и

61и

Уа!

Агд

61 и

Уа1 Ьеи

Азр

Туг

А! а

Зег

61 п

245

250

255

ТЬг

Ьуз

ТЬг

Зег

Ьеи

ТЬг

Агд

Не

Ме!

Ьеи Азр

Азп

Ме!

Уа1

Уа1

Рго

260

265

270

Ьеи

5ег

Азп

61у

Азр

Не

Азр

Уа!

5ег

Ме! Ьеи

Ьуз

61 и

А1а

Уа1

61и

275

280

285

Ьеи

Не

Азп

61у

Агд

РЬе

Азр

ТЬг

61 и

А1а 5ег

61у

Азп

Уа1

ТЬг

Ьеи

290

295

300

61 и

ТЬг

Уа1

Н15

Ьуз

Пе

61у

61 п

ТЬг

61у Уа!

ТЬг

Туг

Пе

Зег

Зег

305

310

315

320

61у

А! а

Ьеи

ТЬг

Н15

8ег

Уа1

Ьуз

А1а

Ьеи Азр

Не

Зег

Ьеи

Ьуз

Не

325

330

335

Азр ТЬг 61 и Ьеи А! а Ьеи 61 и Уа! 61у Агд Агд ТЬг Ьуз Агд А1а

340 345 350 (2) ИНФОРМАЦИЯ О ПОСЛЕД. № 3 (I) ХАРАКТЕРИСТИКИ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ:

(A) ДЛИНА: 1053 пар оснований (Б) ТИП: нуклеиновая кислота (B) ЧИСЛО ЦЕПОЧЕК: одноцепочечная (Г) ТОПОЛОПИЯ: линейная (II) ТИП МОЛЕКУЛЫ: кДНК (XI) ОПИСАНИЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ: ПОСЛЕД. № 3

АТ6ЛТА6А6 СТАЛССЛТ САСТ6СТАСА 6Т6САТССЛ АТ6СААЛАС А6СТССАА6660

Л66Т66Т6А АААТ6ТСА6С ААТА6ССАСС АА6ААТАСАА 6А6Т66А6ТС АЛА6А66Т6120

АААССАССА6 САСАСССААС ЛАТ6АЛТА АА66АА6ТТА Т6АААСЛ6С АСТСТСТ6АА180

6АТ6СТ666А АТТТА66А6А Т6Т6АСЛ6Т АА66С6АСАА ЛССТСЛ6А ТАТ66ААТСС240

6АТ6СТСАЛ ЛСТА6СААА 66АА6АС666 АТСАТА6СА6 6ААТТ6САСТ Т6СТ6А6АТ6300

АТАТтаССС АА6ТТ6АТСС ЛСАЛААА6 6Т66А6ТС6Т АТ6ТАААТ6А Т66С6АТААА360

6ЛСАТААА6 .6СЛ6АААЛ Т66СААА6ТА САА66АААС6 СЛАСААСАТ ТОТТАТАССТ420

6АЕАСС6Л6 ЛСТСААЛТ ТАТ6СААА6А АТСА6Т66АА ТА6СТАСАСТ ААСТАА66АА480

АТСССА6АТ6 СТ6САСАССС Т6СЛАСАТС Л66А6АСТА 66ААААСТ6С ТССТС6АЛА540

С6ТПС6Т66 АТАААТС66С 66ТАЛ6АТС 66ТС66666А А6ААТСАСА6 ААТС66СЛА600

ЛТ6АТАТ66 ТААТ6АТААА А6АСААТСАС АТАТСТССТ6 СТ66А66Т6Т С66СААА6СТ660

СТААААТСТ6 Т66АТСА6ТА ТЛ66А6САА ААТАААСЛС АААТА6666Т Т6А66Л6АА720

АССА66АСАА Л6АА6АА6Т АС6Т6А66Л СТАСАСТАТ6 САТСТСАААС ААА6АСЛС6780

ЛЕАСТА66А ТААТ6СТ66А СААТАТ66Л 6ЛССАЛАТ СТААСС6А6А ТАЛ6АТ6ТА840

ТССАТ6СЛА А66А66СТ6Т А6ААЛ6АТС ААТ66СА66Т Л6АТАС66А 66СЛСА66А900

ААТ6ЛАССС Л6АААСА6Т АСАСАА6АЛ 66АСАААСТ6 6Т6ЛАССТА САТЛСТА6Т960

66Т6СССТ6А С6САЛСС6Т 6ААА6САСЛ 6АСАЛТССС Т6АА6АТС6А ТАСА6А6СТС1020

6СССЛ6АА6 Л66АА66С6 ТАСААААС6А ОСА1053

Claims (53)

1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

   1. Способ получения трансгенных растительных клеток с повышенной продукцией хинолятфосфорибозил-трансферазы (ХФРТазы), включающий трансформацию растительных клеток, способных экспрессировать ХФРТазу экзогенной ДНК-конструкцией, содержащей в направлении 5'-3' функциональный растительный промотор, и последовательность ДНК, кодирующую ХФРТазу растения табака, и где указанная последовательность ДНК функционально связана с указанным промотором и указанные трансформированные растительные клетки обладают повышенной продукцией ХФРТазы по сравнению с нетрансформированными растительными клетками.
2. 2. Способ по п.1, где указанные трансформированные растительные клетки представляют собой клетки Ксобапа !аЬасит.
3. 3. Способ по п.1 или 2, где указанный промотор является конститутивно активным.
4. 4. Способ по п.1 или 2, где указанный промотор является избирательно активным в клетках ткани корней растения.
5. 5. Способ по п.1 или 2, где указанный промотор является избирательно активным в клетках коры корней растения.
6. 6. Способ по любому из пп.1-5, где указанную стадию трансформации осуществляют путем бомбардировки растительных клеток микрочастицами, несущими указанную ДНК-конструкцию.
7. 7. Способ по любому из пп.1-5, где указанную стадию трансформации осуществляют путем инфицирования растительных клеток бактериями АдгоЬас1егшт ШтеГашепк, содержащими Т1-плазмиду, несущую указанную ДНК-конструкцию.
8. 8. Способ получения трансгенного растения с повышенной продукцией ХФРТазы, включающий регенерацию растения из трансформированных клеток, полученных способом по пп.1-7.
9. 9. Способ по п.8, где растение представляет собой растение табака Ксобапа 1аЬаснт.
10. 10. Способ получения семян растения табака, включающий сбор семян растения табака, полученного способом по п.9.
11. 11. Способ повышения продукции ХФРТазы в растительных клетках, способных продуцировать ХФРТазу, включающий трансформацию указанных клеток экзогенной ДНК-конструкцией, содержащей в направлении 5'-3' функциональный растительный промотор, и последовательность ДНК, кодирующую ХФРТазу растения табака, где указанная последовательность ДНК функционально связана с указанным промотором, в условиях, когда указанная ДНК-конструкция экспрессирует и продуцирует ХФРТазу в указанных трансформированных клетках растения.
12. 12. Способ по п.11, где указанные трансформированные растительные клетки представляют собой клетки Ксобапа 1аЬаснт.
13. 13. Способ по п.11 или 12, где указанная экзогенная ДНК-конструкция интегрируется в геном указанных растительных клеток и содержит в направлении транскрипции:

    а) промотор, функционирующий в указанных растительных клетках;

    б) последовательность ДНК, кодирующую ХФРТазу, функционирующую в указанных клетках, где указанная последовательность ДНК функционально связана с указанным промотором;

    в) область терминации транскрипции, функционирующую в указанных клетках.
14. 14. Способ по п.13, где указанный промотор является конститутивно активным.
15. 15. Способ по п.13, где указанный промотор является избирательно активным в клетках ткани корней растения.
16. 16. Способ по п.13, где указанный промотор является избирательно активным в клетках ткани коры корней растения.
17. 17. Способ получения трансгенного растения с повышенной продукцией ХФРТазы, включающий регенерацию растения из трансформированных клеток, указанных в пп.11-16.
18. 18. Способ по п.17, где растение представляет собой растение табака Ксобапа 1аЬаснт.
19. 19. Способ получения семян растения табака, включающий сбор семян растения табака, полученного способом по п.18.
20. 20. Способ получения трансформированных растительных клеток с повышенной продукцией никотина, включающий трансформацию растительных клеток, способных продуцировать ХФРТазу, экзогенной ДНК-конструкцией, содержащей в направлении 5'-3' растительный функциональный промотор, и последовательность ДНК, кодирующую ХФРТазу растения табака, где указанная ДНКпоследовательность функционально связана с указанным промотором и указанные трансформированные растительные клетки обладают повышенной продукцией никотина по сравнению с нетрансформированными растительными клетками.
21. 21. Способ по п.20, где указанные трансформированные клетки представляют собой клетки Ксобапа !аЬасит.
22. 22. Способ по п.20 или 21, где указанный промотор является конститутивно активным.
23. 23. Способ по п.20 или 21, где указанный промотор является избирательно активным в клетках ткани корней растения.

    - 18 009898
24. 24. Способ по п.20 или 21, где указанный промотор является избирательно активным в клетках ткани коры корней растения.
25. 25. Способ по любому из пп.20-24, где указанную стадию трансформации осуществляют путем бомбардировки растительных клеток микрочастицами, несущими указанную ДНК-конструкцию.
26. 26. Способ по любому из пп.20-24, где указанную стадию трансформации осуществляют путем инфицирования растительных клеток бактериями ЛдгоЬас!егшт !ите£ас1еп8, содержащими Т1-плазмиду, несущую указанную ДНК-конструкцию.
27. 27. Способ получения трансгенного растения с повышенной продукцией никотина, включающий регенерацию растения из трансформированных клеток, полученных способом по пп.20-26.
28. 28. Способ по п.27, где растение предсталяет собой растение табака Мсойапа !аЬасит.
29. 29. Способ получения семян растения табака, включающий сбор семян растения табака, полученного способом по п.28.
30. 30. Способ повышения продукции никотина в растительных клетках, способных продуцировать ХФРТазу, включающий трансформацию указанных клеток экзогенной ДНК-конструкцией, содержащей в направлении 5'-3' функциональный растительный промотор, и последовательность ДНК, кодирующую ХФРТазу растения табака, где указанная последовательность ДНК функционально связана с указанным промотором, в условиях, когда указанная ДНК-конструкция экспрессирует и продуцирует ХФРТазу в указанных трансформированных растительных клетках.
31. 31. Способ по п.30, где указанные трансформированные растительные клетки представляют собой клетки Мсойапа !аЬасит.
32. 32. Способ по п.30 или 31, где указанная экзогенная ДНК-конструкция интегрируется в геном указанных растительных клеток и содержит в направлении транскрипции:

    а) промотор, функционирующий в указанных растительных клетках;

    б) последовательность ДНК, кодирующую ХФРТазу, функционирующую в указанных клетках, где указанная последовательность ДНК функционально связана с указанным промотором; и

    в) область терминации транскрипции, функционирующую в указанных клетках.
33. 33. Способ по п.32, где указанный промотор является конститутивно активным.
34. 34. Способ по п.32, где указанный промотор является избирательно активным в клетках ткани корней растения.
35. 35. Способ по п.32, где указанный промотор является избирательно активным в клетках ткани коры корней растения.
36. 36. Способ получения трансгенного растения с повышенной продукцией никотина, включающий регенерацию растения из трансформированных клеток, указанных в пп.30-35.
37. 37. Способ по п.36, где растение представляет собой растение табака Мсойапа !аЬасит.
38. 38. Способ получения семян растения табака, включающий сбор семян растения табака, полученного способом по п.37.
39. 39. Способ по любому из пп.8-38, где последовательность ДНК, кодирующая ХФРТазу растения табака, выбрана из группы, включающей:

    а) последовательность ДНК 8Е0 ΙΌ N0:1;

    б) последовательность ДНК, которая кодирует ХФРТазу растения табака с аминокислотной последовательностью 8Е0 ΙΌ N0:2;

    в) последовательность ДНК, которая гибридизируется с последовательностью ДНК (а) или (б) в условиях, определяемых жесткостью промывки в 0,3М №С1, 0,03М цитрата натрия и 0,1% 8Ό8 при 70°С, и кодирует ХФРТазу растения табака и

    г) последовательность ДНК, которая отличается от последовательности ДНК (а) или (б) из-за вырожденности генетического кода и кодирует ХФРТазу растения табака.
40. 40. Способ по п.39, где последовательность ДНК представляет собой последовательность ДНК 8Е0 ΙΌ N0:1.
41. 41. Трансгенное растение табака рода Мсойапа с повышенной продукцией ХФРТазы по сравнению с нетрансформированным контрольным растением, содержащее трансгенные растительные клетки, раскрытые в пп.1-9, 11-18.
42. 42. Потомство трансгенного растения по п.41.
43. 43. Семена трансгенного растения табака с повышенной продукцией ХФРТазы по сравнению с нетрансгенным растением, где указанное трансгенное растение представляет собой потомство растения по п.41.
44. 44. Трансгенное растение табака рода МсоДапа с повышенной продукцией никотина по сравнению с нетрансгенным растением, содержащее трансгенные растительные клетки, раскрытые в пп.20-28, 30-37.
45. 45. Потомство трансгенного растения по п.44.
46. 46. Семена трансгенного растения табака с повышенной продукцией никотина по сравнению с нетрансгенным растением, где указанное трансгенное растение представляет собой потомство растения по п.44.
47. 47. Табачный продукт, полученный из растения табака по пп.41, 42, 44 или 45.

    - 19 009898
48. 48. Табачный продукт, содержащий клетки растения табака, полученные способом по любому из пп.2-40.
49. 49. Табачный продукт, содержащий табак растения табака, полученного способом по пп.9, 18, 28 или 37.
50. 50. Табачный продукт по пп.47-49, где последовательность ДНК, кодирующая ХФРТазу растения табака, выбрана из группы, включающей:

    а) последовательность ДНК 8Ε^ ΙΌ ΝΟ:1;

    б) последовательность ДНК, которая кодирует ХФРТазу растения табака, с аминокислотной последовательностью 8Ε^ ΙΌ ΝΟ:2;

    в) последовательность ДНК, которая гибридизируется с последовательностью ДНК (а) или (б) в условиях, определяемых жесткостью промывки в 0,3М ЫаС1, 0,03М цитрата натрия и 0,1%8Ό8 при 70°С, и кодирует ХФРТазу растения табака и

    г) последовательность ДНК, которая отличается от последовательности ДНК (а) или (б) из-за вырожденности генетического кода и кодирует ХФРТазу растения табака.
51. 51. Табачный продукт по п.50, где последовательность ДНК представляет собой последовательность ДНК 8Ер ΙΌ ΝΟ:1.
52. 52. Табачный продукт по любому из пп.47-51, выбранный из группы, включающей табак для табачной трубки, табак для сигары, табак для сигареты, жевательный табак, сигареты и сигары.
53. 53. Способ получения табачного продукта с повышенным содержанием никотина, включающий получение трансгенного растения табака по пп.41, 42, 44 или 45 и получение указанного табачного продукта из указанного растения табака.