LT4706B - Fosforibozilo chinolato transferazės ekspresijos reguliavimas - Google Patents

Fosforibozilo chinolato transferazės ekspresijos reguliavimas Download PDF

Info

Publication number
LT4706B
LT4706B LT99-142A LT99142A LT4706B LT 4706 B LT4706 B LT 4706B LT 99142 A LT99142 A LT 99142A LT 4706 B LT4706 B LT 4706B
Authority
LT
Lithuania
Prior art keywords
plant
dna
phosphoribosyl
quinolate
transferase
Prior art date
Application number
LT99-142A
Other languages
English (en)
Other versions
LT99142A (lt
Inventor
Mark A. Conkling
Nandini Mendu
Wen Song
Original Assignee
North Carolina State University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=21960004&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=LT4706(B) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by North Carolina State University filed Critical North Carolina State University
Publication of LT99142A publication Critical patent/LT99142A/lt
Publication of LT4706B publication Critical patent/LT4706B/lt

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/1048—Glycosyltransferases (2.4)
    • C12N9/1077—Pentosyltransferases (2.4.2)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01H—NEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
    • A01H5/00—Angiosperms, i.e. flowering plants, characterised by their plant parts; Angiosperms characterised otherwise than by their botanic taxonomy
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8242—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits
    • C12N15/8243—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits involving biosynthetic or metabolic pathways, i.e. metabolic engineering, e.g. nicotine, caffeine

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Nutrition Science (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Physiology (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Manufacture Of Tobacco Products (AREA)

Description

Išradimas liečia augalo fosforibozilo chinolato transferazę ( QPRtazė) ir DNR. koduojančią šį enzimą. Ypač šis išradimas liečia DNR, koduojančią fosforibozilo chinolato transferazę. kad galima būtų gauti transgeninius augalus, turinčius genetiškai pakeistus nikotino lygius, ir tokiu būdu gautus augalus.
Išradimo sukūrimo prielaidos
Domėjimosi objektas yra tabako su sumažintu nikotino lygiu gamyba, atsižvelgiant į įprastą nikotino prigimtį. Papildomai, tabako augalai su ypač žemu nikotino susidarymo lygiu arba visai be nikotino yra patrauklūs kaip recipientai transgenų ekspresijai komerciškai vertingai produkcijai, tokiai kaip medikamentai, kosmetiniai komponentai arba maisto priedai. Nikotino pašalinimui iš tabako yra taikomi įvairūs būdai. Vis dėlto, dauguma šių būdų kartu su nikotinu pašalina ir kitus ingredientus, tuo būdu nepalankiai paveikdami tabaką. Klasikinė pasėlių veisimo metodika gavo tabako augalus su žemesniu nikotino lygiu (apytikriai 8%) būdingu laukinėms tabako augalų rūšims. Tabako augalai ir tabakas, turintys dar mažesnį nikotino kiekį, yra pageidaujami.
Vienas iš būdų sumažinti biologinių produktų lygį yra reikiamų fermentų kiekio sumažinimas biosintezės, vedančios į produktą, kelyje. Kur tiriamas fermentas natūraliai yra reakcijos greitį ribojančiu kiekiu (kitų fermentų atžvilgiu), bet kokia šio fermento pertekliaus redukcija sumažins galutinio produkto produkciją. Jeigu fermento kiekis nėra paprastai greiti ribojantis, jo buvimas ląstelėje turi būti redukuotas iki greitį ribojančio kiekio, siekiant sumažinti biosintezės išeigą. Atvirkščiai, jei natūraliai paplitęs fermento kiekis yra greitį ribojantis, tada bet koks fermento aktyvumo padidėjimas sąlygos biosintezės produkto kiekio padidėjimą.
Nikotinas pirmiausiai yra suformuojamas tabako augalo šaknyse ir vėliau yra perkeliamas į lapus, kur jis yra saugomas (Tso, Physiology cind Biochemistry of Tobaco plants. p. 233-34. Dovvden. Hutchinson & Ross, Stroudsburg. Pa. (1972)). Privaloma nikotino biosintezės pakopa yra nikotino rūgšties susidarymas iš chinolato rūgšties, kuri yra katalizuojama fosforibozilo chinolato transferazės fermentu (QPRtazė). QPRtazė pasirodo esanti reakcijos greiti ribojantis fermentas nikotino rūgšties tiekimo nikotino sintezei tabake etape. Žiūrėti, pav.. Feth ir kt.. Regulation in Tobacco Gailus of enzyme Activities of the Nicotine Path\vay, Plauta. 168. p. 402-07 (1986): Wagner ir kt.. The Regulation of Enzyme Activities of the Nicotine Patlmvay , Physiol. Plant.. 68. p. 667-72 (1986). Nikotino lygių pakeitimas tabako augaluose putrescino metilo transferazės (PMtazė) ekspresijos antisensiniu reguliavimu yra pasiūlytas JAV patentuose 5,369,023 ir 5,260,205 Nakatini ir Malik. VVahad ir Malik. PCT paraiška WO 94G28142 aprašo DNR koduojančią PMT ir sensinės bei antisensinės PMT konstrukcijos naudojimą.
IŠRADIMO SANTRAUKA
Šio išradimo pirmasis aspektas yra išskirta DNR molekulė, apimanti seką SEQ ID NO.l: DNR sekos, kurios koduoja fermentą, turintį seką SEQ ID No:2; DNR sekos, kurios hibridizuojasi į tokią DNR ir kurios koduoja fosforibozilo chinolato transferazės fermentą; ir DNR sekos, kurios skiriasi nuo anksčiau paminėtos DNR dėl genetinio kodo degeneracijos. Peptidas, koduojamas tokia DNR. yra dar vienas išradimo aspektas.
Kitas šio išradimo aspektas yra DNR konstrukcija, turinti promotorių, veikiantį augalo ląstelėje, ir DNR segmentą, koduojantį fosforibozilo chinolato transferazės fermentą, esantį pasroviui nuo promotoriaus ir funkcionaliai susijusį su juo. DNR. koduojanti fermentą, gali būti antisensinėje arba sensinėje kryptyje.
Kitas šio išradimo aspektas yra transgeninės augalo ląstelės, turinčios sumažintą fosforibozilo chinolato transferazės (QPRtazė) ekspresiją, gamybos būdas, sukuriant tokio tipo augalo ląstelę, kuri ekspresuotų fosforibozilo chinolato transferazę: transformuojant augalo ląstelę egzogenine DNR konstrukcija, turinčia promotorių, ir DNR. turinčią dalį sekos, koduojančios fosforibozilo chinolato transferazės mRNR.
Kitas šio išradimo aspektas yra transgeninis augalas iš rūšių Nicotiana. turintis; sumažintą fosforibozilo chinolato transferazės (QPRtazė) ekspresiją, lyginant su: netransformuotu kontroliniu augalu. Tokių augalų ląstelės turi DNR konstrukciją.: kuri apima segmentą DNR sekos, koduojančios fosforibozilo chinolato transferazės mRNR.
Kitas šio išradimo aspektas yra fosforibozilo chinolato transferazės geno ekspresijos sumažinimo būdas augalo ląstelėje, užauginant augalo ląstelę transformuotą taip. kad turėtų egzogeninę DNR. kur transkribuota egzogeninės DNR vija yra komplementari ( papildančioj i) fosforibozilo chinolato transferazės mRNR. kuri yra endogeninė ląstelei. Papildančiosios vijos transkripcija sumažina endogeninio fosforibozilo chinolato geno ekspresiją.
Kitas šio išradimo aspektas yra tabako augalo, turinčio sumažintus nikotino lygius tabako augalo lapuose, gamybos būdas, užauginant tabako augalą su ląstelėmis.
turinčiomis egzogeninę DNR seką. kur transkribuota egzogeninės DNR sekos vija yra komplementari (papildančioji) endogeninei fosforibozilo chinolato transferazės informacinei RNR ląstelėse.
Kitas šio išradimo aspektas yra transgeninės augalo ląstelės, turinčios padidintą fosforibozilo chinolato transferazės (QPRtazė) ekspresiją, gamybos būdas, transformuojant augalo ląstelę taip. kad ji išreikštų fosforibozilo chinolato transferazę egzogenine DNR konstrukcija, kuri apima DNR seką. koduojančią fosforibozilo chinolato transferazę.
Kitas šio išradimo aspektas yra transgeninis Nicoticma augalas, turintis padidinta fosforibozilo chinolato transferazės (QPRtazė) ekspresiją, kur transgeninio augalo ląstelės turi egzogeninę DNR seką. koduojančią augalo fosforibozilo chinolato transferazę.
Kitas šio išradimo aspektas yra fosforibozilo chinolato transferazės geno ekspresijos augalo ląstelėje padidinimo būdas, užauginant augalo ląstelę transformuotą taip. kad ji turėtų egzogeninę DNR. koduojančią fosforibozilo chinolato transferazę.
Kitas šio išradimo aspektas yra tabako augalo, turinčio padidintus nikotino lygius lapuose, gamybos būdas, užauginant tabako augalą, turintį ląsteles su egzogenine DNR seka. koduojančia fosforibozilo chinolato transferazę funkcionuojančią ląstelėse.
TRUMPAS FIGŪRŲ APRAŠYMAS
Figūra 1 rodo biosintezės kelią vedantį į nikotiną. Fermento aktyvumai, kuriuos reguliuoja Nicl ir i\ic2, yra QPRtazė (fosforibozilo chinolato transferazė) ir PMtazė (putrescino metilo transferazė).
Figūra 2A pateikia branduolio rūgšties seEa NtOPTI cDNR (SEQ ID NO:1). su koduojančia seka (SEQ ID NO:3) parodyta didžiosiomis raidėmis.
Figūra 2B pateikia išvestą aminorūgšties seką (SEQ ID NO:2).tabako QPRtazės. koduotos NtOPTI cDNR.
Figūra 3 pateikia išvestą NtOPTI aminorūgšties seką ir susijusias Rhodospirillum rubrum. Mycobacterium lepre, Salmonella typhimurium, Escherichia coli ir Scicchciromvces cerevisiae sekas.
Figūra 4 rodo Escherichia coli mutanto, kuriam trūksta fosforibozilo chinolato transferazės (TH265). papildymo su NtQPTl cDNR rezultatus. Ląstelės buvo transformuotos ekspresijos vektoriumi, pernešančių NtQPTl: Transformuotų TH265 ląstelių, ekspresuotų NtQPTl minimalioje terpėje, kuriai trūksta nikotino rūgšties, augimas, parodė, kad NtQPTl koduoja QPRtazę.
Figūra 5 palygina nikotino lygius ir santykinius pastovios būsenos NtOPTI1 mRNR lygius Nicl ir Nic2 tabako mutantuose: laukinis tipas Burlev 21 (Nicl/Nicl Nic2/Nic2): Nicl Burlev 21 (nicl/nicl Nic2/Nic2\, Nic2 Burley 21 (Nicl/Nicl nic2'iiic2): ir Nicl Nic2 Burley 21 (nicl/nicl nic2/nic2). Vientisos linijos nurodo mRNR transkripto lygius: išskaidytos linijos nurodo nikotino lygius.
Figūra 6 vaizduoja santykinius NtOPTI mRNR lygius per tam tikrą laiką tabako augaluose nupjautomis viršūnėmis palyginus su kontroliniais nenupjautomis viršūnėmis augalais. Vientisos linijos nurodo mRNR transkripto lygius: išskaidytos linijos nurodo nikotino lygius.
IŠSAMUS IŠRADIMO APRAŠYMAS
Tabako augaluose nikotinas yra gaminamas kondensuojantis nikotino rūgščiai ir 4-metilaminobutanaliui. Biosintezės kelias, pasibaigiantis nikotino gamyba yra pavaizduotas Figūroje 1. Du lokuso reguliatoriai (NicI ir Nie2) veikia kaip bendrai vyraujantys nikotino gamybos reguliatoriai. Viengubų ir dvigubų Nic mutantų šaknų fermentų analizės rodo. kad dviejų fermentų, fosforibozilo chinolato transferazės (QPRtazė) ir putrescino metilo transferazės (PMtazė). aktyvumai yra tiesiogiai proporcingi nikotino biosintezės lygiams. Fermentų aktyvumų tabako audiniuose (šaknyse ir kaliuje) palyginimas su skirtingais nikotino sintezės produktyvumais parodo, kad QPRtazės aktyvumas yra griežtai koreliuojamas su nikotino kiekiu (Wagner ir Wagner, Planta 165:532 (1985)). Saunders ir Bush (Plant Physiol 64:236 (1979)) parodė, kad QPRtazės lygis žemo nikotino lygio mutantų šaknyse yra proporcingas nikotino lygiams lapuose.
Šis išradimas apima naują cDNR seką (SEQ ID NO:1). koduojančią SEQ ID NO:2 augalo fosforibozilo chinolato transferazę (QPRtazė). Kadangi QPRtazės veikimas yra griežtai koreliuojamas su nikotino kiekiu, transgeninių tabako augalų konstravimas, kuriuose QPRtazės lygiai augalo šaknyse (palyginus su lygiais laukinio tipo augaluose) yra sumažinti, baigiasi augalais, turinčiais sumažintus nikotino lygius lapuose. Siūlomas išradimas pateikia būdus ir branduolio rūgšties konstrukcijas tokių transgeninių augalų gamybai, bei tokius transgeninius augalus. Tokie būdai apima antisensinę NtOPTl RNR ekspresiją, kuri sumažina QPRtazės kiekį tabako šaknyse. Nikotinas buvo papildomai rastas netabakinėse augalų rūšyse bei šeimose, nors esantis kiekis yra paprastai daug žemesnis nei Λ'. tabacuni.
Šis išradimas taip pat pateikia sensines ir antisensines rekombinantines DNR molekules, koduojančias QPRtazės arba QPRtazės antisensines RNR molekules, ir vektorius apimančius tas rekombinantines DNR molekules bei transgenines augalo ląsteles ir augalus, transformuotus tomis DNR molekulėmis ir vektoriais.
Transgeninės tabako ląstelės ir augalai šiame išradime yra charakterizuojami žemesniu arba aukštesniu nikotino kiekiu negu netransformuotos kontrolinės tabako ląstelės ir augalai.
Tabako augalai su ypatingai žemais nikotino gamybos lygiais arba be jokios nikotino gamybos yra patrauklūs kaip transgenų recipientai, išreiškiantys komerciškai vertingus produktus, tokius, kaip medikamentai, kosmetikos komponentai arba maisto priedai. Tabakas yra patrauklus kaip recipientinis augalas transgenui, koduojančiam norimą produktą, kadangi tabakas yra lengvai genetiškai konstruojamas ir gamina labai didelę biomasę į akrą: tabako augalai su sumažintais resursais . skirtais nikotino gamybai, atitinkamai turės daugiau resursų galimų transgeninių produktų gamybai. Būdai transformuoti tabaką transgenais. gaminant reikiamus produktus, yra žinomi technikos lygiu: šio išradimo tabako augalams, turintiems žemą nikotino lygį. gali būti panaudota bet kuri tinkama technika.
Tabako augalai pagal šį išradimą su sumažinta QPRtazės ekspresija ir sumažintais,: nikotino lygiais bus pageidaujami tabako produktų, turinčių sumažintą nikotino kiekį, gamyboje. Tabako augalai pagal šį išradimą bus tinkami naudojimui bet kuriame tradiciniame tabako produkte, apimant, bet ne apsiribojant, pypkės, cigaro ir cigaretės tabaką, ir kramtomą tabaką, ir gali bet kuria forma apimti lapų tabaką, plėšytą tabaką arba smulkintą tabaką.
Šio išradimo konstrukcijos gali taip pat būti naudingos gaminant trangeninius augalus, turinčius padidintą QPRtazės ekspresiją ir padidintą nikotino kiekį augale. Tokios konstrukcijos, būdai, naudojant šias konstrukcijas, ir taip pagaminti augalai gali būti pageidaujami tabako produktų, turinčių pakeistą nikotino kiekį, gamyboje arba augalų, turinčių padidintą nikotino kiekį, gamyboje dėl jo insekticidinių savybių
Esami išradėjai atrado, kad TobRD2 genas (žiūrėti Conkling ir kt., Plant Physs. 93. 1203 (1990)) koduoja Nicotiana tabacum QPRtazę. ir duoda čia NtQPTl seką cDNR (anksčiau vadintą TobRD2) ir koduojamo fermento aminorūgšties seką. NtOPTl aminorūgšties sekos palyginimai su GenBank duomenų baze atskleidžia ribotą sekos panašumą i bakterijų proteinus, kurie koduoja fosforibozilo chinolato transferazę (QPRtazė). (Figūra 3).
Fosforibozilo chinolato transferazė yra reikalinga de novo nikotino adenino dinukleotido (NAD) biosintezei ir prokariotuose, ir eukariotuose. Dideli lygiai QPRtazės yra aptikti tabako šaknyse, bet ne lapuose. Kad galima būtų nustatyti, kad NtOPTl kodavo QPRtazę. esami išradėjai panaudojo Escherichia coli bakterijos štamą (TH265). mutantą, kuriam trūksta fosforibozilo chinolato transferazės (ncidC). Šis mutantas negali augti minimalioje terpėje, kurioje trūksta nikotino rūgšties. Vis dėlto, NtQPTl proteino ekspresija šiame bakteriniame štame suteikė NadC~ fenotipą (Figūra 4). patvirtinantį, kad NtOPTl koduoja QPRtazę.
Esami išradėjai ištyrė Nicl ir Nic2 mutantų poveikį tabake, ir tabako augalų dekapitavimo poveikį. NtOPTl pastovios būsenos rnRNR lygiams ir nikotino lygiams. (Gerai žinoma, kad viršūnės dominavimo pašalinimas dekapituojant žydėjimo pradžioje pasireiškia padidėjusiais nikotino biosintezės lygiais ir pernešimu tabake ir yra standartinė tabako gamybos praktika). Jei NtQPTl yra iš tikrųjų įtrauktas į nikotino biosintezę, tikimasi, kad (1) NtOPTl mRNR lygiai bus žemesni Nicl/Nic2 dvigubuose mutantuose ir (2) NtQPTl mRNR lygiai padidės po dekapitacijos. NtOPTl mRNR lygiai Nicl/Nic2 dvigubuose mutantuose buvo nustatyti esantys apytiksliai 25% . palyginus su laukiniais augalais (Figūra 5). Toliau, po šešių valandų po dekapitacijos. NtOPTl mRNR lygiai tabako augaluose padidėjo aštuoneriopai. Todėl, NtOPTl buvo nustatytas kaip pagrindinis reguliavimo genas nikotino biosintezės kelyje.
Transgeninės augalu ląstelės ir augalai
Geno ekspresijos reguliavimas augalo ląstelės genomuose gali būti pasiektas integruojant heterogeninę DNR pagal transkripcinę kontrolę promotoriaus. kuris veikia šeimininke ir kuriame transkribuota heterogeninės DNR vija yra komplementari (papildančioji) DNR vijai, kuri yra transkribuota iš endogeninio geno, kurį reikia reguliuoti. Introdukuota DNR, vadinama antisensine DNR. duoda RNR seką. kuri yra komplementari (papildančioji) natūraliai gaminamoms (endogeninėms) mRNR ir kuri slopina endogeninės mRNR ekspresiją. Toks geno ekspresijos antisensinio reguliavimo mechanizmas nėra visiškai suprastas. Kol nepageidaujama laikytis jokios vieningos teorijos, yra pastebėta, kad viena antisensinio reguliavimo teorija teigia, kad antisensinės DNR transkripcija gamina RNR molekules, kurios susijungia ir sutrukdo arba slopina endogeninių mRNR? molekulių transkripciją.
Šio išradimo būduose antisensinis produktas gali būti komplementarus koduojančioms arba nekoduojančioms (arba abejoms) dalims natūraliai išplitusios taikinio RNR. Antisensine konstrukcija gali būti įvesta į augalo ląsteles bet kuriuo tinkamu būdu ir gali būti integruota į augalo genomą indukuotai arba struktūrinei antisensinės sekos transkripcijai. Žiūr., pvz., JAV patentus Nr. 5.453.566 ir 5.107.065 Shevvmaker ir kt. (įtraukti remiantis jų bendra visuma).
Kaip čia panaudota, egzogeninė ar heterologinė DNR (arba RNR) liečia tik DNR (arba RNR). kuri buvo įvesta į ląstelę (arba ląstelės prototipą) žmonių pastangomis. Tokia heterologinė DNR gali būti kopija sekos, kuri yra natūraliai surasta transformuojamoje ląstelėje, arba jos fragmentai.
Tabako augalo, turinčio sumažintus QPRtazės lygius, ir tokiu būdu žemesnį nikotino kiekį, nei netransformuotas kontrolinis tabako augalas, gamybai tabako ląstelė gali būti transformuota egzogeniniu QPRT antisensiniu perrašymo vienetu, turinčiu dalinę QPRT cDNR seką. pilną QPRT cDNR seką. dalinę QPRT chromosominę seką arba pilną QPRT chromosominę seką; antisensinėje orientacijoje su atitinkamomis išvien veikiančiomis reguliavimo sekomis. Atitinkamos reguliavimo sekos apima transkripcijos iniciacijos seką (''promotorių·), veikiantį keičiamame augale ir poliadenilinimo / transkripcijos nutraukimo seką. Yra panaudojamos standartinės technikos, tokios kaip apribojimo pažymėjimas. Southern blot hibridizacija ir nukleotido sekos analizė, kad galima būtų nustatyti tapatybę klonų. turinčių QPRtazės sekas antisensinėje orientacijoje, veikiančiomis išvien su reguliavimo sekomis. Tada tabako augalai yra regeneruojami iš sėkmingai transformuotų ląstelių. Labiausiai pageidaujama, kad naudojama antisensinė seka būtų komplementari (papildančioji) endogeninei sekai, vis dėlto, gali būti toleruojamos nedidelės variacijos egzogeninėse ir endogeninėse sekose. Pageidaujama, kad antisensinė DNR seka būtų iš pakankamai panašios sekos, kurią galima būtų sujungti su endogenine seka ląstelėje, kuri bus reguliuojama, esant griežtoms sąlygoms, kaip aprašyta žemiau.
Antisensinė technologija buvo naudojama keliose laboratorijose, kad galima būtų pagaminti transgeninius augalus, charakterizuojamus žemesniais nei normalūs specialių fermentų ly giais. Pavyzdžiui, augalai su sumažintais chalkono sintazės ly giais. gėlių pigmento biosintezės fermentai, buvo gaminami įterpiant chalkono sintazės geną į tabako ir petunijos genomą. Šie transgeniniai tabako ir petunijos augalai gamina gėles (žiedus) su šviesesniu nei normalus atspalviu (Van der Krol ir kt.. An Anti-sense Chalcone Synthase Gene in Transgenic Plants Inhibits Flo\ver Pigmentation. Nature, , 333. P. 866-69 (1988)). Antisensinė RNR technologija taip pat buvo sėkmingai panaudota poligalakturonazės fermento gamybos slopinimui pomidoruose (Smith ir kt.. ''Antisense RNA Inhibition of Polygalacturonase Gene Expression in Transgenic Tomatoes “. Nature. 334. P.
724-26 (1988); Sheehy ir kt., Reduction of Polygalacturonase Activity in Tomato Fruit by Antisense RNA, Proc. Natl. Accid. Sci. JAV. 85. P. 8802-09 (1988)). ir mažo subvieneto ribuliozės bisfosfato karboksilazės fermento tabake (Rodermel ir kt.. Nuclear- Organelle Interactions: Nuclear Antisense Gene Inhibits Ribulose Biphosphate Carboxylase Enzyme Levels in Transformed Tobaco Plants . Ce/Z. 55. P. 673-81 (1988)). Pasirinktinai, transgeniniai augalai, charakterizuojami didesniais nei normaliai duotojo fermento kiekiais, gali būti sukurti transformuojant augalus genu šiam fermentui sensinėje (t.y.. normalioje) orientacijoje. Šio išradimo nikotino lygiai transgeniniuose tabako augaluose gali būti aptikti standartiniais nikotino bandymais. Transformuoti augalai, kuriuose QPRtazės lygis yra sumažintas, palyginus su netransformuotais kontroliniais augalais, atitinkamai turės sumažintą nikotino lygį palyginus su kontroliniais; transformuoti augalai, kuriuose QPRtazės lygis yra padidintas palyginus su netransformuotais kontroliniais augalais, atitinkamai turės padidintą nikotino lygi palyginus su kontroliniais.
.· f.
Heterologinė seka. naudojama šio išradimo antisensiniuose būduose, gali būti* parinkta taip. kad RNR produktas būtų gaminamas kaip komplementarus'(papildantysis) visai QPRtazės mRNR sekai arba jos daliai. Seka gali būti komplementari (papildančioji) bet kuriai artimai natūralios informacinės RNR sekai. t.y.. ji gali būti papildančioji endogeninės mRNR sekai proksimaliai 5‘galiniam arba kepingo (capping) saitui, pasroviui nuo kepingo saito, tarp kepingo saito ir inicijuojančio kodono ir gali padengti visą arba dalį nekoduojančio regiono, gali jungti nekoduojantį ir koduojantį regioną, būti komplementari (papildančioji) viso arba dalies koduojančio regiono atžvilgiu, komplementari (papildančioji) 3'-galiniam koduojančiam regionui arba komplementari (papildančioji) 3’-netransliuotam mRNR regionui. Tinkamos antisensinės sekos gali būti mažiausiai iš 13 iki 15 nukleotidų. mažiausiai iš 16 iki 21 nukleotidų. mažiausiai apie 20 nukleotidų. mažiausiai apie 30 nukleotidų. mažiausiai apie 50 nukleotidų. mažiausiai apie 70 nukleotidų. mažiausiai apie 100 nukleotidų.
mažiausiai apie 125 nukleotidus, mažiausiai apie 150 nukleotidų. mažiausiai apie
200 nukleotidų arba daugiau. Papildomai, sekos gali būti išplėstos arba sutrumpintos 3' arba 5' galuose.
Konkreti antisensinė seka ir antisensinės sekos ilgis keisis priklausomai nuo norimo apribojimo laipsnio, antisensinės sekos stabilumo, ir panašiai. Vienas iš srities sugebėjimų bus parinkimas atitinkamų QPRtazės antisensinių sekų. naudojant metodus, žinomus šioje srityje, ir žemiau pateiktą informaciją. Remiantis čia pateikta Figūra 2A ir seka SEQ ID NO:1 išradimo oligonukleotidas gali būti QPRtazės cDNR sekos vientisas fragmentas antisensinėje orientacijoje, bet kurio ilgio, pakankamo gauti norimus efektus transformuojant į gavėjo augalo ląstelę.
Šis išradimas taip pat gali būti naudojamas nikotino gamybos sensinio bendranuslopinimo būduose. Sensinių DNR'ų. naudojamų atlikti šį išradimą, ilgis yra toks. kuris, kai ekspresuojama augalo ląstelėje, yra pakankamas nuslopinti įgimtą augalo QPRtazės proteino ekspresiją šioje augalo ląstelėje, kaip čia aprašyta.Tokios sensinės DNR gali būti iš esmės visa genominė arba komplementari (papildančioji) DNR. koduojanti QPRtazės fermentą, arba jos fragmentas, kai tokio fragmento ilgis yra tipiškai mažiausiai 15 nukleotidų. Sensinės DNR. kuri slopina įgimto geno ekspresiją ląstelėje, ilgio nustatymo metodai yra žinomi šios srities specialistams.
Alternatyviame šio išradimo įgyvendinime, Nicoticinci augalo ląstelės yra transformuojamos DNR konstrukcija, turinčia DNR segmentą, koduojantį fermento RNR molekulę (t.y.. ribozimą). kai ši fermento RNR molekulė yra nukreipiama prieš (t.r.,skaldo) mRNR DNR transkriptą. koduojantį augalo QPRtazę kaip aprašyta čia. Ribozimai apima substrato prijungimo domenus, kurie prisijungia prie pasiekiamų taikinio mRNR regionų, ir domenus, kurie katalizuoja RNR skaldymą, užkirsdami kelią baltymo sintezei. Prijungimo domenai gali turėti antisensines sekas, papildomas taikinio mRNR sekai: katalitinis fragmentas gali būti ••plaktuko”tipo arba kitoks fragmentas, toks. kaip segtuko tipo. Ribozimo skaldymo taškai taikinio RNR gali iš pradžių būti identifikuoti skanuojant taikinio molekulę ribozimo skaldymo saitų atžvilgiu (pvz.. GUA. GUU. arba GUC sekos). Vienąkart identifikuotos, trumpos RNR sekos iš 15. 20.· 30 ar daugiau ribonukleotidų. atitinkančių taikinio geno regionui, turinčiam skaldymo saitus, gali būti įvertintos pagal prognozuojamas struktūrines savybes. Galimų taikinių tinkamumas taip pat gali būti įvertintas bandant jų galimumą hibridizuotis su papildančiaisiais oligonukleotidais. naudojant ribonukleazės apsaugos bandv mus. žinomus šiame dalyke. DNR. koduojanti fermento RNR molekules, gali būti pagaminta pagal žinomas technologijas. Žiūrėti, pav., T. Cech ir kt.. JAV patentas Nr. 4.987,071: Keene ir kt., JAV patentas Nr. 5.559,021: Donson ir kt.. JAV patentas Nr. 5,589,367: Torrence ir kt., JAV patentas Nr. 5.583.032: Joyce. JAV patentas Nr. 5.580.967: Gold ir kt. JAV patentas No. 5.595.877; Wagner ir kt.. JAV patentas No. 5,591.601; ir US patentas Nr. 5,622,854 ( pateikti atskleidimai.' atsižvelgiant į jų visumą). Tokios fermento RNR molekulės gamyba augalo’’ ląstelėje ir QPRtazės proteino gamybos nutraukimas sumažina QPRtazės veikimą’ augalo ląstelėse iš esmės tokiu pačiu būdu, kaip ir antisensines RNR molekulės gamyba: t.y., nutraukiant mRNR baltymų sintezę ląstelėje, gaminančioje fermentą. Terminas ribozimas yra naudojamas čia aprašymui RNR turinčios nukleino rūgšties, kuri veikia kaip fermentas (toks. kaip endoribonukleazė). ir gali būti naudojama pakaitomis su 'fermento RNR molekule'. Sis išradimas toliau apima DNR. koduojančią ribozimus. DNR koduojančią ribozimus. kurie buvo įterpti į ekspresijos vektorių, šeimininko ląsteles, turinčias tokius vektorius ir QPRtazės gamybos sumažinimo būdus augaluose,naudojant ribozimus.
Nukleino rūgšties sekos, naudojamos vykdant šį išradimą, apima tas, kurios panašios į sekąSEQ ID NO:1, ir koduoja proteiną, turintį fosforibozilo chinolato transferazės veikimą. Šis apibrėžimas yra skirtas apimti natūralias alelines variacijas QPRtazės proteinuose. Tokiu būdu. DNR sekos, kurios hibridizuojasi į
SEQ ID NO:1 DNR ir koduojasi QPRtazės ekspresijai, ypač augalo QPRtazės fermentai, gali taip pat būti panaudotos vykdant šį išradimą.
Gali egzistuoti Įvairiarūšės tabako QPRT fermento formos. Įvairiarūšės formos fermento gali būti dėl pobaltyminės sintezės modifikacijos atskiro geno produkto, arba dėl įvairiarūšių NtOPTl geno formų.
Sąlygos, kurios leidžia kitoms DNR sekoms, kurios koduoja proteino, turinčio QPRtazės aktyvumą, ekspresiją hibridizuotis su seka SEQ ID NO.T DNR arba kitomis DNR sekomis, koduojančiomis proteiną, parodytą kaip seka SEQ ID NO:2. gali būti apibrėžtos kaip įprastinės. Pavyzdžiui, tokių sekų hibridizacija gali būti atlikta esant sumažinto griežtumo sąlygoms arba net griežtoms sąlygoms (pavyzdžiui, sąlygoms, būdingoms perplaunant DNR, koduojančią proteiną, parodytą čia kaip seką SEQ ID NO:2, 0,3 M NaCI. 0,03 M sodos citrato. 0.1% SDS esant 60()C arba net 70°C standartiniame in situ hibridizacijos bandyme. Žiūrėti J. Sambrook ir kt.. Molecular Cloning. A Laboratory Manual (2d Ed. 1989) (Cold Spring Harbor Laboratory)). Paprastai, tokios sekos bus bent 65% panašios. 75% panašios. 80% panašios, 85% panašios, 90% panašios, arba net 95% panašios, arba daugiau, su seka. duota čia kaip seka SEQ ID NO.T. arba DNR sekomis, koduojančiomis proteinus, turinčius seką SEQ ID NO:2. (sekų panašumo apibrėžimai yra padaryti su dvejomis sekomis, pritaikytomis maksimaliam priderinimui: spragos bet kurioje iš šių dvejų sekų yra leidžiamos maksimizuojant priderinimą. Spragų ilgiai iš 10 arba mažiau yra pageidaujami, spragų ilgiai iš 5 arba mažiau yra labiau pageidaujami, ir spragų ilgiai iš 2 arba mažiau vis dar yra labiau pageidaujami).
Yra galimos diferencinės hibridizacijos procedūros, kurios leidžia izoliuoti cDNR klonus. kurių mRNR lygiai žemesni nei 0.05% poli(AT)RNR. Žiūrėti M. Cokling ir kt.. Plcint Physiol. 93. 1203-121 1 (1990). Trumpai. cDNR bibliotekos yra atrinktos naudojant vienos vijos cDNR bandinius atvirkščiai transkribuotos mRNR iš augalo audinio (pavyzdžiui, šaknų ir / arba lapų). Diferenciniam atrinkimui, nitroceliuliozės arba nailono membrana yra išmirkyta 5xSSC. esančiame 96 šulinėlių siurbimo kolektoriuje, 150ųL laikytos per naktį kultūros pernešta nuo pagrindinės plokštelės į kiekvieną šulinėlį. ir buvo siurbiama iki kol skystis praėjo pro filtrą. 150 ųL denatūravimo skysčio (0.5M NaOH. 1,-5M NaCI) buvo patalpinta į kiekvieną šulinėlį. naudojant daugiafunkcinę pipetę ir laikoma apie 3 minutes. Taikytas siurbimas kaip anksčiau ir filtras pašalintas ir neutralizuotas 0.5M Tris-HCI (pH 8.0). 0.5M NaCI. Tada jis buvo džiovinamas 2 valandas in vacuo ir inkubuojamas su atitinkamais bandiniais. Naudojant nailono membranos filtrus ir saugant pagrindines plokšteles 7% DMSO prie -70()C. filtrai gali būti naudojami daug kartų su įvairiarūšiais bandiniais ir atitinkami klonai. atgaminami po keleto laikymo metų.
Kaip čia panaudota, terminas 'genas’ reiškia DNR seką. kuri apima (1) kryptim? prieš srovę (5‘) einančius reguliavimo signalus, turinčius promotorių. (2) kodavimo regioną, kuris apibūdina produktą, proteiną arba geno RNR. (3)' kryptimi pasroviui (3’) einančius regionus, turinčius transkripcijos nutraukimo ir poliadenilinimo signalus ir (4) susijusias sekas, reikalingas veiksmingai ir specifinei ekspresijai.
Šio išradimo DNR seka gali iš esmės susidėti iš čia pateiktos (SEQ ID NO:1) sekos, arba iš ekvivalenčių nukleotidinių sekų. atspindinčių šių genų alelinius arba polimorfinius variantus, arbajuos koduojančius regionus.
Frazės realus sekos panašumas naudojimas šiame aprašyme ir apibrėžtyje reiškia, kad DNR. RNR arba aminorūgšties sekos, kurios turi nežymias ir neturinčias pasekmių sekos variacijas iš dabartinių sekų, atskleistų ir apibrėžtų čia. yra laikomos ekvivalenčiomis šio išradimo sekoms. Dėl to, nežymios ir neturinčios pasekmių sekos variacijos reiškia, kad panašios sekos (t.y., sekos, kurios turi realų sekų panašumą su DNR. RNR arba proteinais, atskleistais ir apibrėžtais čia) bus funkciškai ekvivalenčios sekoms, atskleistoms ir apibrėžtoms šiame išradime. Funkciškai ekvivalenčios sekos veiks realiai tokiu pačiu būdu.
realiai gamindamos tokias pat kompozicijas, kaip nukleino rūgšties arba aminorūgšties kompozicijos, atskleistos ir aprašytos čia.
DNR sekos, pateiktos čia, gali būti transformuotos į įvairiarūšes šeimininko ląsteles. Dauguma tinkamų šeimininko ląstelių, turinčių reikiamas augimo ir priežiūros savybes, yra lengvai įmanomos šioje srityje.
Frazės izoliuotas arba realiai grynas naudojimas šiame aprašyme ir apibrėžtyje kaip DNR. RNR. polipeptidų arba proteinų modifikatoriaus reiškia, kad taip nurodyti DNR. RNR. polipeptidai. proteinai buvo atskirti nuo jų in vivo ląstelinės aplinkos žmonių pastangoms.
Kaip čia panaudota. įgimta DNR seka“ arba natūrali DNR seka reiškia DNR seką. kuri gali būti izoliuota nuo netransgeninių ląstelių arba audinio. Įgimtos DNR sekos yra tos. kurios nebuvo dirbtinai pakeistos, taip. kaip į saitus nukreipta mutagenezė. Kai įgimtos DNR sekos yra nustatytos. DNR molekulės, turinčios įgimtas DNR sekas, gali būti chemiškai sintezuojamos arba gaminamos naudojant rekombinantines DNR procedūras, kaip yra žinoma šioje srityje. Kaip čia panaudota. įgimta augalo DNR seka yra ta. kuri gali būti izoliuota nuo netransgeninių augalo ląstelių arba audinio. Kaip čia panaudota. įgimta tabako DNR seka yra ta. kuri gali būti izoliuota nuo netransgeninių tabako ląstelių arba audinio.
DNR konstrukcijos arba transkripcijos kasetės šiame išradime apima kryptimi nuo 5' iki 3' transkripcijos promotorių, kaip čia aptarta. DNR seką. operatyviai susijusią su promotoriumi. kaip čia aptarta, ir. pasirinktinai, nutraukimo seką. apimančią stop signalą RNR polimerazei ir poliadenilinimo signalą poliadenilazei. Visi šie reguliavimo regionai turėtų būti valdomi audinio, kuris bus transformuojamas, ląstelėse. Bet koks tinkamas nutraukimo signalas gali būti panaudotas vykdant šį išradimą, kurio pavyzdžiai apima, bet ne apriboja, nopalino sintazės (nos) terminatorių. oktapino sintazės (ocs) terminatorių. CaMV terminatorių arba įgimto terminavimo signalus, kilusius iš to paties geno kaip ir transkripcinis iniciacijos regionas arba kilusius iš skirtingų genų. Žiūrėti, pvz, Rezian ir kt. (1988), kaip ankščiau (tekste) ir Rodermel ir kt. (1988). kaip ankščiau (tekste).
Terminas ''operatyviai susijęs, kaip čia panaudota, remiasi DNR sekomis vienoje DNR molekulėje, kurios yra susijusios taip, kad vienos funkcija yra veikiama kitos. Tokiu būdu, promotorius yra operatyviai susijęs su DNR. kai juo galima paveikti šios DNR transkripciją (t.y., DNR yra transkriptiškai kontroliuojama promotoriaus). Promotorius yra laikomas esantis kry ptimi prieš srovę nuo DNR, kuri. tuo pačiu, yra kryptimi pasroviui nuo promotoriaus.
Transkripcijos kasetė gali būti įterpta į DNR konstrukciją, kuri taip pat turi mažiausiai vieną replikacijos sistemą. Patogumui yra įprasta turėti replikacinę sistemą, veikiančią Escherichici coli. tokioje, kaip ColEl, pSCIOl. pACYC184. arba panašiai. Tokiu būdu. kiekvienoje pakopoje po kiekvienos manipuliacijos konstrukcija gali būti klonuota, nustatyta jos seka ir nustatytas manipuliacijos teisingumas. Papildomai, arba vietoje E. coli replikacijos sistemos, gali būti panaudota didelio skaičiaus šeimininkų replikacijos sistema, tokia, kaip P-l nesuderinamumo plazmidžių replikacijos sistemos, pavyzdžiui pRK290. Be replikacijos sistemos, dažnai bus mažiausiai vienas markeris, kuris gali būti naudingas viename ar daugiau šeimininkų, arba skirtingi markeriai individualiems šeimininkams. Tai yra. vienas markeris gali būti panaudotas pasirinktinai prokariotiniame šeimininke, kai tuo tarpu kitas markeris gali būti panaudotas pasirinktinai eukariotiniame šeimininke, ypač augalo šeimininke. Markeriai gali būti apsauga nuo biocido, tokio, kaip antibiotikai, toksinai, sunkieji metalai arba panašiai; gali suteikti papildymą perteikiant prototrofiją auksotrofmiam šeimininkui; arba gali suteikti matomą fenotipą gaminant augale naująjungini.
(vairūs fragmentai, turintys įvairias konstrukcijas, transkripcijos kasetes, markerius, ir panašiai, gali būti įvesti nuosekliai skaidant restrikcijos fermentais atitinkamas replikacijos sistemas, ir įterpiant konkrečią konstrukciją arba fragmentą į esamą saitą. Po ligavimo ir klonavimo DNR konstrukcija gali būti izoliuota tolimesnei manipuliacijai. Visi šie metodai yra plačiai pateikti pavyzdžiais literatūroje, pavyzdžiu J. Sambrook ir kt., Molecular Cloning, A Laboratory Manual (2d Ed. 1989) (Cold Spring Harbor Laboratory Manual (2d Ed. 1989) (Cold Spring Harbor Laboratory).
Vektoriai, kurie gali būti panaudoti transformuojant augalo audinį nukleino rūgšties konstrukcija, šiame išradime apima tiek Agrobacterium vektorius, tiek balistinius vektorius, taip pat vektorius, tinkamus DNR-medijuojamai transformacijai.
Terminas 'promotorius' remiasi regionu DNR sekos, kuri apima reikalingus signalus efektyviai koduojančios sekos ekspresijai. Tai gali apimti sekas, prie kurių prisiriša RNR polimerazė, bet neapsiribojama tokiomis sekomis, ir gali apimti regionus, prie kurių prisiriša kiti reguliaciniai proteinai kartu su regionais, įtrauktais į proteino baltymo sintezės kontrolę, ir gali apimti koduojančias sekas.
Promotoriai, naudojami vykdyti šį išradimą, gali būti struktūriškai aktyvūs promotoriai. Yra daug struktūriškai aktyvių promotorių, kurie veikia augaluose. Pageidautinas pavyzdys yra žiedinio kopūsto mozaikinio viruso (CaMV) 35S promotorius, kuris yra struktūriškai išreikštas daugelyje augalo audinių. Alternatyviai, promotorius gali būti specialus šaknies promotorius arba specialus šaknies žievės promotorius, kaip detaliau paaiškinta žemiau.
Antisensinės sekos buvo išreikštos transgeniniuose tabako augaluose, naudojant žiedinio kopūsto mozaikinio viruso (CaMV) 35S promotorių. Žiūrėti, pvz., Cornelissen ir kt.. ”Both RNA Level and Translation Efficiency are Reduced by Anti-Sense RNA in Transgenic Tobacco”. Nucleic Acid Res. 17. P. 833-43 (1989): Rezaian ir kt.. Anti-Sense RNAs of Cucumber Mosaic Virus in Transgenuc Plants Assessed for Control of the Virus”. Picini Molekulciry Biology 11, P. 463-71 (1988); Redermel ir kt.. Nuclear-Organelle Interactions: Nuclear Antisense Gene Inhibits Ribulose Biphosphate Carboxylase Enzyme Levels in Transformed Tobacco Plants. Cell 55, P. 673-81 (1988): Smith ir kt.. Antisense RNA Inhibition of Polygalacturonase Gene Expression in Transgenic Tomatoes. Nature 334. P. 724-26 (1988); Van der Krol ir kt.. Anti-Sense Chalcone in Transgenic Plants Inhibits Flovver Pigmentation“. Nature 333. P. 866-69 (1988).
CaMV 35S promotoriaus naudojimas QPRtazės ekspresijai transformuotose tabako ląstelėse ir augaluose šiame išradime yra pageidautinas. CaMV promotoriaus naudojimas kitų rekombinantinių genų ekpresijai tabako šaknyse buvo aprašytas (Lam ir kt.. Site-Specific Mutations Alter In Vitro Factor Binding and Change Promoter Expression Pattern in Transgenic Plants”. Proc. Neit. Acad. Sci. JAV 86. P. 7890-94 (1989); Poulsen ir kt., Dissection of 5' Upstream Seųuences for Selective Expression of the Nicotiana plumbaginifolia rbc-8B Gene”. Mol. Gen. Genet. 241. P. 16-23 (1988)).
Kiti promotoriai, kurie yra aktyvūs tik šaknų audiniuose (specifiniai šaknų promotoriai), yra taip pat ypač tinkantys šio išradimo būdams. Žiūrėti, pvz., JAV patentą Nr. 5.459.252 Conkling ir kt.; Yamamoto ir kt., The Plant Cell. 3:371 (1991). Taip pat gali būti panaudotas specifinis TobRD2 šaknies žievės promotorius Žiūrėti, pvz., dabar paduotą JAV patentinę paraišką SN 08/508.786. Conkling ir kt.; PCT WO 9705261. Visi čia cituoti patentai yra laikomi atskleistais remiantis jų bendra visuma.
QPRtazės rekombinantines molekulės ir vektoriai, naudojami gaminti transformuotas tabako ląsteles ir augalus šiame išradime gali toliau apimti dominuojantį selekcinį markerinį geną. Tinkami naudojimui tabake dominuojantys selekciniai markeriai apima, tarp kitko, antibiotikams atsparius genus, koduojančius neomicino fosfotransferazę (NPTII). hidromicino fosfotransferazę (ΉΡΤ). ir chloramfenikolo acetiltransferazę (CAT). Kitas gerai žinomas dominuojantis selekcinis markeris tinkamas naudojimui tabake, yra mutantinis dihidrofoliato reduktazės genas, kuris koduoja atsparią metotreksatui dihidrofoliato reduktazę. DNR vektoriai, turintys tinkamus antibiotikams atsparius genus, ir atitinkami antibiotikai yra komerciškai prieinami.
Transformuotos tabako ląstelės yra parinktos iš netransformuotų aplinkos populiacijos ląstelių, patalpinant įvairiarūšę ląstelių populiaciją į kultūros terpę, turinčią atitinkamą antibiotiko koncentraciją (arba kito mišinio normaliai toksiško tabako ląstelėms), kurioms atitinkamas geno produkto dominuojantis selekcinis markeris suteikė atsparumą. Tokiu būdu, tik tos tabako ląstelės, kurios buvo transformuotos, išgyvens ir dauginsis.
Rekombinantinių augalų gamybos būdai šiame išradime, apskritai, pirmiausia apima augalo ląstelę, galinčią regeneruoti (augalo ląstelę, kuri tipiškai reiškiasi regeneruoti galinčiame augale). Augalo ląstelė yra tada transformuojama DNR konstrukcija, apimančia šio išradimo transkripcijos kasetę (kaip čia aprašyta) ir rekombinantinis augalas yra regeneruojamas iš transformuotos augalo ląstelės. Kaip paaiškinta žemiau, transformacijos pakopa yra įvykdyta būdais, žinomais šioje srityje, apimant, bet ne ribojant, augalo ląstelės bombardavimą mikrodalelėmis. turinčiomis transkripcijos kasetę. ląstelės infekavimą Agrobcicteriuni tuniefciciens, apimančiais Ti plazmidę, pernešančią transkripcijos kasetę, arba daugiau kitų metodų, tinkamų transgeninio augalo gamybai.
Yra žinoma daug Agrobacterium vektorių sistemų, tinkamų vykdant ši išradimą. Pavyzdžiui. JAV patentas Nr. 4.459,355 atskleidžia būdą transformuoti jautrius augalus, apimant dv iskilčius. Agrobacterium kamienu, turinčiu Ti plazmidę. Sumedėjusių augalų transformacija Agrobacterium vektoriumi yra atskleista JAV patente Nr. 4.795,855. Toliau. JAV patentas Nr. 4,940.838 Schilperoort ir kt.. atskleidžia binarinį Agrobacterium vektorių (t.y., tą. kuriame Agrobacterium turi vieną plazmidę. turinčią Ti plazmidės vir regioną bet neturinčią T regiono, ir kitą plazmidę. turinčią T regioną, bet neturinčią vir regiono), naudingą vykdant šį išradimą. ·
Mikrodalelės. turinčios šio išradimo DNR konstrukciją, kai mikrodalelė yra tinkama balistinei augalo ląstelės transformacijai, yra taip pat naudingos daryti šio išradimo transformuotus augalus. Mikrodalelė yra įterpiama į augalo ląstelę, kad gaminti transformuotą augalo ląstelę, ir iš transformuotos augalo ląstelės yra regeneruojamas augalas. Bet kuri tinkama balistinės ląstelės transformacijos metodologija ir aparatas gali būti naudojamas vykdant šį išradimą. Pavyzdinis aparatas ir būdai yra atskleisti Sanford ir Wolf JAV patente Nr. 4.945.050. ir Christou ir kt.. JAV patente Nr. 5.015,580. Naudojant balistinės transformacijos procedūras transkripcijos kasetė gali būti įvesta į plazmidę. galinčią pasikartoti arba integruotis į transformuojamą ląstelę. Mikrodalelių. tinkamų naudojimui tokiose sistemose, pavyzdžiai apima nuo 1 iki 5 ųm auksinių sferų. DNR konstrukcija gali būti užnešta ant mikrodalelės bet kuriuo tinkamu būdu. tokiu kaip nusėdimas.
Pagal šį išradimą augalo rūšys gali būti transformuotos DNR konstrukcija. DNRmedijuojamu būdu transformuojant augalo ląstelės protoplastus. ir po to regeneruojant augalą iš transformuotų protoplastų sutinkamai su būdais, gerai žinomais šioje srityje. Tabako protoplastų susiliejimas su DNR turinčiomis liposomomis arba elektroporacija yra žinomi šioje srityje. (Shillito ir kt., Direct Gene Transfer to Protoplasts of Dicotyledonous and Monocotyledonous Plants by a Number of Methods Including Electroporation Methods in Enzymologyl53. P.
313-36 (1987)).
Kaip čia panaudota, transformacija remiasi egzogeninės DNR įvedimu į ląsteles, taip. kad galima būtų gaminti transgenines ląsteles, pastoviai transformuotas egzogenine DNR.
Transformuotos ląstelės yra įjungiamos kad regeneruotų nepažeistus tabako augalus taikant tabako ląstelės ir audinio techniką, kuri yra gerai žinoma šioje srityje. Augalo regeneracijos būdas yra pasirinktas toks. kad jį galima būtų suderinti su transformacijos būdu. Pastovus QPRtazės sekos buvimas ir orientacija transgeniniuose tabako augaluose gali būti patvirtintas QPRtazės sekos Mendelio paveldimumu, kaip nustatyta standartiniais DNR analizės metodais, pritaiky tais palikuoniui, gautam iš kontoliuojamų kryžminimų. Po transgeninių tabako augalų regeneracijos iš transformuotų ląstelių, įvesta DNR seka yra lengvai pervedama į kitas tabako atmainas, taikant bendrai priimtas augalų selekcijos metodikas ir be nereikalingų eksperimentų.
Pavyzdžiui. transgeno atsiskyrimo analizei, regeneruoti transformuoti augalai (Ro) gali būti išauginami iki subrendimo, nustatomas nikotino kiekis, ir apdulkinami gaminti R, augalus. Dalis Ri augalų, turinčių transgeną. yra homozigotiniai transgenui. Kad nustatyti homozigotinius Ri augalus, transgeniniai R| augalai yra auginami iki subrendimo ir apdulkinami. Homozigotiniai R| augalai gamins R2 palikuonius, kur kiekvienas palikuonio augalas turi transgeną: heterozigotinių R| augalų palikuoniai atsiskirs 3:1.
Nikotinas veikia kaip natūralus pesticidas, kuris padeda apsaugoti tabako augalus nuo kenkėjų pažeidimų. Todėl gali būti pageidaujama papildomai transformuoti turinčius mažai arba be nikotino augalus, gaminamus šiais būdais transgenu (tokiu kaip Bacillus thuringlensis), kuris suteiks papildomą apsaugą nuo vabzdžių.
Pageidaujamas naudojimui augalas šiuose būduose yra rūšys Nicotiana, arba tabakas, apimant N. tabacum, N. rustica ir N. glutinosa. Gali būti naudojama bet kuri tabako gentis arba atmaina. Pageidautinos yra gentys, kurios jau turi žemą nikotino turinį, tokios kaip Nicl/Nic2 dvigubi mutantai.
Bet kuris augalo audinys, kurį galima vėliau klonuoti organogeneze arba einbriogeneze gali būti transformuotas šio išradimo vektoriumi. Terminas organogenezė”. kaip čia panaudota, reiškia procesą, kuriuo pumpurai ir šaknys yra išauginami vienas po kito iš meristeminių centrų; terminas embriogenezė. kaip čia panaudota, reiškia procesą, kuriuo pumpurai ir šaknys auga kartu suderintu būdu (ne paeiliui) , arba iš somatinių ląstelių, arba iš lytinių ląstelių. Atskiras audinys keisis priklausomai nuo galimų klonavimo sistemų, ir geriausiu atveju, nuo ypatingųjų transformuojamų rūšių. Pavyzdiniai audinio taikiniai apima lapų diskus, žiedadulkes, embrionus, sėklaskiltes. hipokotilius, kabaus audinį.“ egzistuojantį meristeminį audinį (pavyzdžiui, viršūnines meristemas. pažastinius” pumpurus ir šaknų meristemas). ir indukuotą meristemos audinį (pavyzdžiui, sėklaskiltes meristema ir hipokotilinė meristema).
Augalai šiame išradime gali turėti daug formų. Augalai gali būti transformuotų ląstelių ir netransformuotų ląstelių chimeros; augalai gali būti kloniniai trasnformantai (pavyzdžiui, visos ląstelės pakeistos, kad turėtų transkripcijos kasetę); augalai gali turėti transformuotų ir netransformuotų audinių skiepus (pavyzdžiui, transformuotos .šaknies šeima įskiepyta į netransformuotą atžalą citruso rūšyse). Transformuoti augalai gali būti dauginami daugeliu būdų. tokių, kaip klonavimas arba klasikiniais selekcijos būdais. Pavyzdžiui, pirmos kartos (arba Tl) transformuoti augalai gali būti apdulkinti kad duotų homozigotinius antros kartos (arba T2) transformuotus augalus, ir T2 augalai toliau dauginami klasikiniais selekcijos būdais. Dominantinis selekcinis markeris (toks. kaip /zprll) gali būti susietas su transkripcijos kasete, kad dalyvautų selekcijoje.
Sekant tolimesniu aprašymu, paaiškės, kad augalai, kurie gali būti panaudoti šio išradimo praktikoje apima tuos genus, kurie yra iš genų Nicotiana.
Pripažinti anksčiau žinomi būdai su rekombinantine DNR molekule aprašo, kad vienas iš jų gali naudoti pilną QPRtazės cDNR molekulę arba pilną QPRtazės chromosominį geną. pridėtą sensinėje orientacijoje, veikiantį išvien su reguliacinėmis sekomis, kad suformuotų transgenines tabako ląsteles ir augalus. (Tie. kurie nusimano šioje srityje, taip pat pastebės, kad atitinkamos reguliacinės sekos genų ekspresijai sensinėje orientacijoje apima bet kurias iš žinomų eukariotinės baltymų sintezės paleidimo sekas, be to, promotoriaus ir poliadenilinimo/transkripcijos nutraukimo sekas, aprašytas anksčiau). Tokie transformuoti tabako augalai yra apibūdinami padidėjusiais QPRtazės lygiais ir tuo pačiu aukštesniu nikotino kiekiu, nei netransformuoti kontroliniai tabako augalai.
Todėl turėtų būti suprasta, kad QPRtazės DNR sekų naudojimas QPRT fermento lygių sumažinimui arba padidinimui, ir tuo būdu nikotino turinio sumažinimui arba padidinimui tabako augaluose, patenka į šio išradimo akiratį.
Kaip čia panaudota, derlius apima daugumą šio išradimo augalų ir tuo pačiu genų, pasėtų kartu agrokultūriniame plote. Sakant agrokultūrinis plotas, turima galvoje bendrasis dirvožemio arba šiltnamio plotas. Tokiu būdu. šis išradimas pateikia būdą gaminti derlių augalų, turinčių pakeistą QPRtazės veikimą ir tokiu būdu turinčių padidintus arba sumažintus nikotino lygius, palyginus su panašiu tos pačios rūšies ir daugumos netransformuotų augalų derliumi.
Pateikti pa\yzdžiai iliustruoja šį išradimą, bet ir nėra traktuojami kaip ribojantys anksčiau aprašytus dalykus.
PAVYZDYS
Išskyrimas ir sekos nustatymas
TobRD2 cDNR (Conkling ir kt.. Plant Phys. 93, 1203 (1990)) seka nustatyta ir yra pateikiama čia kaip seka SEQ ID NO:1 ir išvestinė aminorūgščių seka kaip seka SEQ ID NO:2. Išvestinė aminorūgščių seka buvo ’ numatyta esanti citozolinis proteinas. Nors ir QPRtazės genai nebuvo aprašyti. NtPTl aminorūgščių sekos palyginimai su GenBank duomenų baze (Figūra 3) atskleidė ribotą sekos panašumą su tam tikrais bakteriniais ir kitais proteinais: fosforibozilo chinolato transferazės (QPRtazė) aktyvumas buvo pademonstruotas su S. typhimurium, E. coli ir N. tabacuni genais. NtQPTl koduota QPRtazė turi panašumą su išvestu peptido fragmentu, koduotu Arabidopsis ĖST (ekspresijos sekos žymė) sekos (Genbank priėjimo kodas F20096). kuri gali atspindėti dalį Arabidopsis QPRtazės geno.
PAVYZDYS In-Situ hibridizacijos
TobRD2 mRNR transkriptų erdvinio paskirstymo nustatymui įvairiuose šaknies audiniuose, buvo atliktos in situ hibridizacijos netransformuotuose augaluose. TobRD2 į TobRD2 mRNR antisensinės vijos in situ hibridizacijos šaknies audinyje buvo atliktos naudojant būdus, kaip aprašyta Meyerovvitz. Plant Mol. Biol. Rep. 5.242 (1987) ir Smith ir kt.. Plant Moi. Biol. Rep. 5.237 (1987). Septynių dienų tabako (Nic.otiana tabcicam) daigo šaknys buvo fiksuojamos fosfato gliutaraldehido buferiu. įkastos į Paraplast Plūs (Monoject Ine.. St. Louis. MO) ir supjaustytos 8 mm storiu, kad gauti skersinius, taip pat ir išilginius pjūvius. Antisensiniai TobRD2 transkriptai. sintezuoti in vitro esant 35S-ATP. buvo naudojami kaip zondai. Pažymėta RNR buvo hidrolizuota veikiant šarmu kad galima būtų gauti išeigą nuo 100 iki 200 pagrindinės masės vidurkio intervalo buvusio prieš naudojimą.
Hibridizacijos truko 16 valandų 50% formamide prie 42°C su maždaug 5 xl06 impulsų-per-minutę (cpm) pažymėta RNR vienam mililitrui hibridizacijos tirpalo. Po išlaikymo, slaidai buvo išryškinti ir vizualizuoti šviesaus ir tamsaus fono mikroskopija.
Hibridizacijos signalas buvo lokalizuotas žievės ląstelių sluoksnyje šaknyse (rezultatai neparodyti). Abiejų, šviesaus ir tamsaus fono laukų palyginimas parodė, kad tų pačių pjūvių TobRD2 transkriptai lokalizuoti parenchiminėse šaknies žievės ląstelėse. Nebuvo matyti jokio hibridizacijos signalo epidermyje arba stelėje.
PAVYZDYS
TobRD2 mRNR lygiai Nicl ir Nic2 tabako mutantuose ir koreliacija su nikotino lygiais
TobRD2 pastovios būsenos mRNR lygiai buvo ištirti Nicl ir Nic2 mutantiniuose tabako augaluose. Nicl ir Nic2 yra žinomi, kaip galintys reguliuoti fosforibozilo chinolato transferazės veikimą ir putrescino metil-transferazės veiklą, ir yra bendradominantiniai nikotino gamybos reguliatoriai. Šie rezultatai yra iliustruoti Figūrose 5A ir 5B ir parodo, kad TobRD2 ekspresija yra reguliuojama Nicl ir Nic 2.
RNR buvo izoliuotas nuo laukinio tipo Burley 21 tabako augalų šaknų (Nicl/Nicl Nic2>Nic2): Nicl- Burley 21 šaknų (nicl/nicl Nic2/Nic2)\ Nic2- Burley 21 šaknų (Nicl- Nicl nic2/nic2): ir Nicl- A7c2-Burley 21 šaknų (nicl/nicl nic2/nic2).
Keturios Burley 21 tabako linijos (nic) buvo auginamos iš sėklų dirvožemyje mėnesi ir perkeltos į hidroponines kameras aeruotame maistingame tirpale šiltnamyje vienam mėnesiui. Šios linijos buvo izogeninės. išskyrus du žemo nikotino lygio lokusus. ir turėjo genotipus Nicl/Nicl Nic2/Nic2, Nicl/Nicl nic2/nic2. nicl/nicl Nic2/Nic2, nicl/nicl nic2/nic2. Šaknys buvo nuimtos nuo maždaug 20 augalų kiekvienam genotipui ir apjungtos RNR išskyrimui. Bendras RNR (lųg) iš kiekvienos vietos taško buvo elektroforezuotas 1% agarozės gelyje, turinčiame 1.1 M formaldehido, ir perkeltas į nailono membraną, pagal Sambrook ir kt. (1989). Membranos buvo hibridizuotos su ?2P-pažymetais TobRD2 cDNR fragmentais. Santykinis TobRD2 transkriptų intensyvumas buvo išmatuotas densitometrijos būdu. Figūra 5 (vientisos linijos) iliustruoja santykinius transkriptinius lygius (palyginus su Nicl/Nicl Nic2/Nic2) kiekvienam iš keturių genotipų. Keturių genotipų santykinis nikotino kiekis (palyginus su Nicl/Nicl \ic2/Nic2) yra parodytas skaidytomis linijomis.
Figūra 5 grafiškai palygina santykinį pastovios būsenos TobRD2 mRNR lygį. naudojantis lygiu, rastu laukinio tipo Burley 21 (Nicl/Nicl Nic2/\ic2). kaip standartu. TobRD2 mRNR lygiai Nicl/Nic2 dvigubuose mutantuose buvo maždaug 25% laukinio tipo tabako lygio. Figūra 5B toliau palygina santykinius nikotino lygius artimose izogeninėse linijose tabako, ištirtose šiame pavyzdyjė (vientisos linijos nurodo TobRD2 transkripto lygi: skaidytos linijos nurodo nikotino lygį). Tarp nikotino lygių ir TobRD2 transkripto lygių buvo artima koreliacija.
PAVYZDYS
Dekapitacijos įtaka TobRD2 mRNR kiekiams
Yra gerai žinoma šioje srityje, kad tabako augalo viršūnės pašalinimas (dekapitacija) padidina šaknų augimą ir padidina augalo lapų nikotino turinį. Komerciniame tabako veisime augalo dekapitacija yra standartinė praktika, ir optimalų tabako augalo dekapitacijos laiką pagal eilę žinomų auginimo sąlygų gali lengvai nustatyti eilinis tos srities specialistas.
Tabako augalai (N. tabcicum SR1) buvo auginami iš sėklos dirvožemyje vieną mėnesį ir perkelti į katiliukus, pripildytus smėlio. Augalai buvo auginami šiltnamyje dar du mėnesius, kol pradėjo pumpuruotis. Tada nuo keturių augalų (dekapitacija) buvo nuimtos žiedų galvutės ir du bambliai. Po nurodyto laiko nuo kiekvieno augalo buvo nuimta dalis šaknų ir sujungta RNR ekstrakcijai. Kontroliniai augalai nebuvo dekapituoti. Bendras RNR (lug) iš kiekvienos vietos taško buvo elektroforezuotas 1% agarozės gelyje, turinčiame 1.1M formadelhido, ir perkeltas į nailono membraną pagal Sambrook. ir kt. (1989). Membranos buvo hibridizuotos j2P-pažymėtais TobRD2 cDNR fragmentais. TobRD2 transkriptų santykinis intensyvumas buvo išmatuotas densitometrija. Figūra 6 iliustruoja santy kinius transkripto lygius (palyginus su nuliniu laiku) kiekvienam laiko taškui su dekapitacija (vientisos linijos) arba be dekapitacijos (skaidytos linijos).
Šaknų audinyje per 24 valandas buvo nustatyti santykiniai TobRD2 lygiai; rezultatai yra parodyti Figūroje 6 (vientisos linijos nurodo TobRD2 transkripto lygius dekapituotame augale: skaidytos linijos nurodo TobRD2 transkripto lygius nedekapituotuose kontroliuojamuose augaluose). Per šešias valandas dekapituotų tabako augalų mRNR lygiai TobRD2 padidėjo maždaug aštuoneriopai: kontroliniuose augaluose per tą patį laiko periodą padidėjimo nebuvo.
PAVYZDYS
Bakterinio mutanto, kuriam trūksta QPRtazės, papildymas DNR seka SEQ ID NO:1
Echerichia coli kamienas TH265 yra mutantas, kuriam trūksta fosforibozilo chinolato transferazės (nadC-h ir tokiu būdu negali augti terpėje, kurioje trūksta nikotino rūgščių.
TD265 ląstelės buvo transformuotos ekspresijos vektoriumi (pWS161). turinčiu DNR seką SEQ ID NO:1. arba transformuotos tiktai ekspresijos vektoriumi (pKI<233). Transformuotos bakterijos augimas buvo palygintas su TH265 (pKI<233) transformantų augimu ir su netransformuoto TH265 ncidC- mutanto augimu. Augimas buvo palygintas ant ME minimalios terpės (kuriai trūksta nikotino rūgšties) ir ant ME minimalios terpės su pridėta nikotino rūgštimi.
E. coli kamienas su QPtazės mutacija ( nadC ), TH265. buvo maloniai pateiktas Dr. K.T. Hughes (Hughes ir kt.. J.Bact. 175:479 (1993). Ląstelės buvo palaikomos ant LB terpės ir imliosios ląstelės paruoštos kaip aprašyta Sambrook ir kt. (1989). Ekspresijos plazmidė buvo sukonstruota pl<l<2233 (Brosius. 1984) su TobRD2 cDNR. klonuota kontroliuojant Tac promotoriui. Gauta plazmidė. pWS 161. buvo transformuota į TH265 ląsteles. Transformuotos ląstelės buvo patalpintos minimalioje terpėje (Vogei ir Bonner, 1956) ant agaro lėkščių su arba be nikotino rūgšties (0.0002%) priedu. TH265 ląstelės tokios, kokios yra. ir TH265 transformuotos pKK2233 buvo pasėtos ant tokių pačių lėkščių kontroliniam palyginimui.
Rezultatai yra parodyti Figūroje 4. Tik TH265 transformuotos DNR seka SEQ ID NO:1 augo terpėje, kuriai trūksta nikotino rūgšties. Rezultatai parodo, kad DNR. turinčios seką SEQ ID NO:1, ekspresija TH265 bakterinėse ląstelėse suteikė NciclC- fenotipą šiose ląstelėse, patvirtinantį, kad ši seka koduoja QPRtazę. TobRD2 nomenklatūra tokiu būdu buvo pakeista į NtOPTl.
PAV YZDYS
Tabako augalų transformacija
Seką SEQ ID NO:1 turinti DNR antisensinėje kryptyje funkcionaliai sujungta su augalo promotoriumi (CaMV 35S arba TobRD2 šaknies žievės specifiniu promotoriumi). kad gamintų dvi skirtingas DNR kasetes: CaMV35S promotoriaus/antisensinę SEQ ID NO:1 ir TobRD2 promotoriaus/antisensinę SEQ ID NO:1.
Transformacijai yra parinktos laukinio tipo tabako linija ir žemo nikotino kiekio tabako linija, pavyzdžiui, laukinio tipo Burley 21 tabakas (Nicl- /Nic2+) ir homozigotinis nicl-/ nic2- Burley 21. Dauguma tabako augalo ląstelių iš kiekvienos linijos yra transformuojamos naudojant kiekvieną iš DNR kasečių. Transformacija atliekama naudojant Agrobcicterium vektorių, pavyzdžiui. Agrobacterium- binarinį vektorių, turintį Ti-ribos sekas ir nptll geną (suteikiantį atsparumą kanamicinui ir kontroliuojant nos promotoriui (nptll)).
Transformuotos ląstelės yra atrenkamos ir regeneruojamos į transgeninius tabako augalus (Ro). Ro augalai yra auginami iki subrendimo ir nustatomi nikotino kiekiai juose: transformuotų tabako augalų subsėjiniai parodo žymiai mažesnius nikotino kiekius, palyginus su netransformuotais standartiniais augalais.
Tada R() augalai yra apdulkinami ir transgeno izoliavimas yra analizuojamas R| palikuoniuose. R| palikuoniai yra auginami iki subrendimo ir apdulkinami: izoliavimas transgeno tarp R2 palikuonių nurodo, kurie R, augalai yra homozigotiniai transgenui.
SEKŲ SĄRAŠAS (1) BENDRA INFORMACIJA:
(i) PAREIŠKĖJAI : Conkling, Mark A.
Mendu, Nandini Song, Wen (ii) IŠRADIMO PAVADINIMAS : Fosforibozilo chinolato transferazės ekspresijos reguliavimas (iii) SEKŲ SKAIČIUS : 4 (iv) KORESPONDENCIJOS ADRESAS :
(A) ADRESATAS : Kenneth Sibley, Bell Seltzer Park & Gibson (B) GATVĖ : Post Office Dravver 34009 (C) MIESTAS : Charlotte (D) VALSTIJA : North Carolina (E) ŠALIS : JAV (F) PAŠTO INDEKSAS : 28234 (v) KOMPIUTERINĖ FORMA :
(A) LAIKMENA : - diskelis (B) KOMPIUTERIS : IBM PC (C) OPERACINĖ SISTEMA : PC-DOS/MS-DOS (D) PROGRAMINE ĮRANGA : Patentln Release #1.0,versija #1.30 (vi) EINAMOSIOS PARAIŠKOS DUOMENYS :
(A) PARAIŠKOS NUMERIS:
(B) PADAVIMO DATA:
(C) KLASIFIKACIJA:
(viii) INFORMACIJA APIE PATIKĖTINĮ/AGENTĄ :
(A) PAVARDĖ : Sibley, Kenneth D.
(B) REGISTRACIJOS NUMERIS : 31, 665 (C) REJESTRO NUMERIS : 5051-338P (ix) RYŠIO INFORMACIJA :
(A) TELEFONAS : 919-420-2200 (B) FAKSAS :919-881-3175 (2) INFORMACIJA SEQ ID NO: 1:
(i) SEKOS CHARAKTERISTIKA :
(A) ILGIS : 1399 bazinių porų (B) TIPAS : nukleino rūgštis (C) GRANDINĖ : vienaeilė (D) TOPOLOGIJA : linijinė (ii) MOLEKULĖS TIPAS : cDNA (ix) POŽYMIAI :
(A) PAVADINIMAS/RAKTAS : CDS (B) PADĖTIS : 52..1104 (xi) SEKOS APRAŠYMAS : SEQ ID NO: 1:
CAAAAACTAT TTTCCACAAA AKCATKCA CAA.CCCCCCC AAAAAAAAAC C ATG ITT 57 Ket Phe
AGA GCT ATT CCT Tie ACT GCT ACA GTG CAT CCT TAT GCA ATT ACA GCT 105
Aro Ala lle Pro Pbe Thr Ala Thr Vai His Pro Tyr Ala lle Thr Ala
5 10 15
CCA AGG KG GTG GTG AM ATG TCA GCA ATA GCC ACC MG AAT ACA AGA 153
Pro Aro Leu Vai Vai Lys Met Ser Ala lle Ala Thr Lys Asn Thr Arg
20 25 30
GTG GAG TCA KA GAG GTG MA rp A CCA GCA CAC CCA ACT TAT GAT KA 201
Vai Glu Ser Leu Glu Vai Lys Pro Pro Ala His Pro Tnr Tyr Asp Leu
35 40 45 50
AAG GAA GK ATG AAA CK GCA CTG TCT GAA GAT GCT GGG AAT T i.A GuA 249
Lys Glu Vai Met Lys Leu Ala Leu Ser Glu Asp Ala Gly Asn Leu Gly
55 60 65
GAT GTG ACT TGT AAG GCG ACA ATI' CCT CK GAT ATG GAA TCC GAT GCT 297
Asp Vai Thr Cys Lys Ala Thr lle Pro Leu Asp Met Glu Ser Aso Ala
70 75 80
CAT ITT CTA GCA AAG GAA GAC GcG ATC ATA GCA GGA AK GCA CKi GCT 345
Hi s Pbe Leu Ala Lys Glu Asp Gly lle lle Ala Gly lle Ala Leu Ala
85 90 95
GAG ATG ATA HC GCG GAA GTT GAT CCT TCA KA AAG GTG GAG 1GG TAT K
GI u Met lle Phe Ala Glu Vai Asp Pro Ser Leu Lys Vai Glu Trp Tyr
i oo 105 110
GTA ΑΛΤ GAT GGC GAT AAA GK CAT AAA GGC KG AM KT GGC AAA GTA 441
Vai Asn Aso Gly Asp Lys Vai His Lys Gly Leu Lys Phe Gly Lys Vai
115 120 125 130
CM GGA AAC GCT TAC AAC ATT GTT ATA GCT GAG Aoo GTT GTT CTC AAT 489
G k, Gly Asn Ala Tyr Asn Ue Vai Ės Ala Glu Arg Vai Vai Leu Asn
135 140 145
TTT ATG CAA AGA ATG AGT. GGA ATA GCT ACA CJA ACT AAG GAA ATG GCA 537
Phe h e i Gln Arg Met Ser Gly 11 e A i a Thr Leu Thr Lys Glu Met Ala
150 155 160
GAT GCT GCA CAC CCT GCT TAC ATC TTG GAG ACT Abu .AM ACT GCT CCT 585
Asp Al?. Ala HIS Pro Ala Tyr lle Leu Glu Thr Arg Lys Thr Ala Pro
165 170 175
GGA TTA CGT KG GTG GAT AM TGG GCG GTA TTG ATC GGT GGG GGG AAG 633
Gly Leu Arg Leu Vai Asp Lys Trp Ala Vai Leu lle Gly Gly Gly Lys
180 185 190
AAT CAC AGA ATG GGC TTA TTT GAT ATG GTA ATG ATA AAA GAC AAT CAC 681
Asn His Arg Met Gly Leu Phe Asp Met Vai Met lle Lys Asp Asn His
195 200 205 210
ATA TCT GCT GCT GGA GGT GTC GGC AAA GCT CTA AAA TCT GTG GAT CAG 729
lle Ser Ala Ala Gly Gly Vai Gly Lys Ala Leu Lys Ser Vai Asp Girt
215 220 225
TAT HG GAG CAA AAT AM CTT CAA ATA GGG GTT GAG GTT GAA ACC AGG 777
Tyr Leu Glu Gln Asn Lys Leu Gln lle Gly Vai Glu Vai Glu Thr Arg
230 235 240
ACA ATT GAA GAA GTA CGT GAG GTf CTA GAC TAT GCA TCT CAA ACA MG 825
Thr lle Glu Glu Vai Arg Glu Vai Leu Asp Tyr Ala Ser Gln Thr Lys
245 250 2o5
ACT TCG TTG ACT AGG ATA ATG CTG GAC AAT ATG GTT GTT CCA πΑ TCT 873
Thr Ser Leu Thr Arg lle Met Leu Asp Asn Met Vai Vai Pro Leu Ser
260 265 270
AAC GGA GAT ATT GAT GTA TCC ATG CTT AAo GAG GCT GTA GAA HG ATC 921
Asn Gly Asp lle Ase Va i Ser Met Leu Lys Glu Ala Vai Glu Leu lle
275 280 ’ 285 290
AAT GGG AGG ΤΤΓ GAT ACG GAG GCT TCA GGA AAT GTT ACC CTT GM ACA 969
Asn Gly Arg Phe Asp Trr Glu Ala Ser Gly Asn Vai Thr Leu Glu Thr
295 300 305
GTA CAC MG ATT GGA CM ACT GGT GTT ACC TAC ATT TCT AGT GGT GCC
Vai His Lys lle Gly Gln Thr Gly Va 1 Thr Tyr ne Ser Ser Gly Al a
310 315 320
CTG ACG CAT TCC GTG .AM GCA CTT GA\_ ATT TC.C CTG AAG ATC GAT ACA
Leu Thr His Ser Vai Lys Ala Leu As p lle Ser Leu Lys Ils Asp Thr
325 330 335
GAG CTC GCC CTT GAA GTT GGA AGG CGT ACA AAA CGA GCA TGAGCGCCAT
Glu Leu Ala Leu Glu Vai Gly Arg Ara Thr Lys Arg Ala
340 345 350
1114
TACTTCTGCT ATAGGGHGG AGTAAAAGCA GCTGAATAGC TGMAGGTGC AWMGMT CATTTTACTA GTTGTCAAAC AAAAGATCCT TCACTGTGTA ATCAAACAAA AASATGTAM TTGCTGGAAT ATCTCAGATG GCTCDTTCC AACCTTATTG CTTGAGTTGG TAATTTCATT ATAGCTTTGT TTTCATGTTT CATGGAATTT GTTACAATGA AAATACTIGA TTTATAAGTT TGGTGTATGT AAAAHCTGT 6TTACTTCAA ATATTTTGAG ATGTT
1174
1234
1294
1354
1399 (2) INFORMACIJA SEQ ID N0;2:
(i) SEKOS CHARAKTERISTIKOS :
(A) ILGIS : 351 amino rūgštis (B) TIPAS : amino rūgštis (C) TOPOLOGIJA: Unijinė (ii) MOLEKULĖS TIPAS : proteinas (xi) SEKOS APRAŠYMAS : SEQ ID N0:2:
Met 1 Phe Arg Ala lle 5 Pro Phe Thr Ala Thr Vai 10 His Pro Tyr Ala lle 15
Thr Ala Pro Arg Leu Vai Vai Lys Met Ser Ala lle Ala Thr Lys Asn
20 25 30
Thr Arg Vai 35 Glu- Ser Leu GI u Vai 40. Lys Pro Pro Ala His 45 Pro Thr Tyr
Asp Leu Lys du Vai Met Lys Leu Ala Leu Ser Glu Asp Ala Gly Asn
50 55 60
Leu 65 Gly Asp Vai Thr Cys 70 Lys Ala Thr lle Pr<r Leu 75 Ar-n Μοβ Met Glu Ser 80
Asp Ala Hi s P r; e Leu Ala Lys Glu Asp Gly lle lle Ala Gly Ils Ala
85 90 95
Leu Ala GI u Met lle Phe Al a Glu Vai Asp Pro Ser Leu Lys Vai Glu
100 105 110
Trp Tyr Vai Ase Asp Gly Asp Lys Vai Uis Lys Gly Leu Lys Phe Gly
115 120 125
Lys Vai i Gln i Gly , Asn , Ala Tyr , Asn Ile Vai Ile , 41a ! Glu Arg Vai Vai
130 135 140
Leu Asn Phe i Met i Gln , Arg Met Ser Gly Ile , Ala ' Thr i _eu Thr Lys i Glu
145 150 155 160
Het Ala Asp Ala Ala His Pro Ala Tyr Ile Leu Glu Thr srg Lys Thr
165 170 175
Ala Pro Gly Leu Arg Leu Vai Asp Lys Trp Ala Vai Leu Ile (Gly Gly
ISO 135 190
Gly Lys Asn His Arg Met’ Gly Leu Phe Asp Met Vai Met Ile Lys Asp
195 200 205
Asn His Ile Ser Ala Ala Gly Gly Vai Gly Lys Ala Leu Lys Ser Vai
210 215 220
Asp Gln Tyr Leu Glu Gln Asn Lys Leu Gln Ile Gly Vai Glu Vai Glu
225 230 235 240
Thr Arg Thr Ile Glu Glu Vai Arg Glu Vai Leu Asp Tyr Ala Ser Gln
245 250 255
Thr Lys Thr Ser Leu Thr Arg Ile Met Leu Asp Asn Met Vai Vai Pro
260 265 270
Leu Ser Asn Gly Asp Ile Asp Vai Ser Met Leu Lys Glu Ala Vai Glu
275 2S0 285
Leu Ile Asn Gly Arg Phe Asp Thr Glu Al a Ser Gly Asn Vai Thr Leu
290 295 300
Glu Thr Vai His Lys Ile Gly Gln Thr Gly Vai Thr Tyr Ile Ser Ser
305 310 315 320
Gly Ala Leu Tnr His Ser Vai Lys Ala Leu Asp Ile Ser Leu Lys Ile
325 330 335
Asp Thr Glu Leu Ala Leu Glu Vai Gly Arg A ”9 Thr Lys Arg Ala
340 345 350
(2) INFORMACIJA SEQ ID NO:3:
(i) SEKOS CHARAKTERISTIKA :
(A) ILGIS : 1053 bazinių porų (B) TIPAS : nukleino rūgštis (C) GRANDINĖ : vienguba (D) TOPOLOGIJA : linijinė (ii) MOLEKULĖS TIPAS : cDNA (xi) SEKOS APRAŠYMAS : SEQ ID NO:3:
ATGTTTAGAG CTATTCCTTT CACTGCTACA TTGGTGGTGA AAATGTCAGC AATAGCCACC AAACCACCAG CACACCCAAC TTATGATTTA GATGCTGGGA ATTTAGGAGA TGTGACTTGT GATGCTCATT TTCTAGCAAA GGAAGACGGG ATATTCGCGG AAGTTGATCC TTCATTAAAG GT7CATAAAG GCTTGAAATT TGGCAAAGTA GAGAGGGTiG TTCTCAATTT TATGCAAA2A ATGGCAGATG CTGCACACCC TGCTTACATC CGTTTGGTGG ATAAATGGGC GGTATTGATC
GTGCATCC~I ATGCMTTAC AGCTCCAAGG AAGAATACAA GAGTGGAGTC ATTAGAGGTG AAGGAAGTTA TG.AAACTTGC ACTCTCTGAA AAGGCGACAA TTCCTŪTGA 7ATGGAATCC ATCATAGCAG GAATTGCACT TGCTGAGATG GTGGAGTGGT ATGTAAATGA 7GGCGATAAA CAAGGAAACG CTTACAACAT T3TTATAGCT ATGAGTGGAA TAGCTACACT AACTAAGG.AA TTGGAGACTA GGAAAACTGC TCCTGGAKA GGTGGGGGGA AGAATCACAG AATGGGCTIA
120
180
240
300
360'
420
480
540
600
TTTGA7A7GG TAATGATAAA AGACAATCAC ATATCTGCTG CTGGAGGTGT CGGCAAAGCT 660 CTAAAATCTG TGGATCAGTA TTTGGAGCAA AATAAACT7C AAATAGGGGT TGAGGTTGAA 720 ACCAGGACAA TIGAAGAAGT ACGTGAGGTT CTAGACTATG CATCTCAAAC AAAGACTTCG 780 TTGACTAGGA TAATGCTGGA CAATATGGTT GTTCCATTAT CTAACGGAGA TATTGATGTA 840 TCCATGCTTA AGGAGGCTGT AGAATTGATC AATGGGAGGT TTGATACGGA GGCTTCAGGA 900 AATGTTACCC HGAAACAGT ACACAAGAH GGACAAACTG GTGTTACCTA CATTTCTAGT 360 GGTGCCCTGA CGCATTCCGT GAAAGCACTT GACATTTCCC TGMGATCGA TACAGAGCTC 1020 GCCCTTGAAG TTGG.AAGGCG TACAAAACGA GCA 1053

Claims (44)

1. Izoliuota DNR molekulė, turinti seką. parinktą iš grupės, susidedančios iš:
(a) sekos SEQ ID NO:1;
(b) DNR sekų. kurios koduoja fermentą, turintį seką SEQ ID
NO:2;
(c) DNR sekų. kurios hibridizuojasi su izoliuota DNR iš fa) arba iš (b), ankščiau paminėtų, ir kurios koduoja fosforibozilo chinolato transferazės fermentą: ir (d) DNR sekų. kurios skiriasi nuo DNR (a), (b) arba (c), anksčiau paminėtų, dėl genetinio kodo degeneracijos.
2. DNR konstrukcija, besiskirianti tuo. kad turi ekspresijos kasetę, kai konstrukcija kryptimi nuo 5'iki 3’ turi promotorių, veikiantį augalo ląstelėje, ir DNR molekulę . pagal 1 punktą, išdėstytą pasroviui nuo minėto promotoriaus. ir funkcionaliai sujungtą su juo.
3. DNR konstrukcija pagal 2 punktą, besiskirianti tuo. kad minėta DNR molekulė yra antisensinėje orientacijoje.
4. DNR konstrukcija besiskirianti tuo. kad kryptimi nuo 5' iki 3' turi promotorių, veikiantį augalo ląstelėje, ir DNR pagal 1 punktą, koduojančią augalo fosforibozilo chinolato transferazę. kai minėta DNR yra funkcionaliai sujungta su minėtu promotoriumi.
5. DNR konstrukcija besiskirianti tuo. kad kryptimi nuo 5‘ iki 3‘ turi promotorių, veikiantį augalo ląstelėje ir DNR pagal 1 punktą, koduojančią augalo fosforibozilo chinolato transferazę. kai minėta DNR yra antisensinėje orientacijoje ir funkcionaliai sujungta su minėtu promotoriumi.
6. DNR konstrukcija pagal 2. 3. 4 arba 5 punktą, besiskirianti tuo. kad jos promotorius yra struktūriškai aktyvus augalo ląstelėse.
7. DNR konstrukcija pagal 2. 3, 4 arba 5 punktą, besiskirianti tuo, kad jos promotorius yra selektyviai aktyvus augalo šaknų audinio ląstelėse.
8. DNR konstrukcija pagal 2.3,4 arba 5 punktą, besiskirianti tuo. kad jos promotorius yra selektyviai aktyvus augalo šaknų žievės audinio ląstelėse.
9. DNR konstrukcija pagal 2. 3, 4 arba 5 punktą, besiskirianti tuo. kad minėta konstrukcija toliau turi plazmidę.
10. DNR konstrukcija pagal 2. 3, 4 arba 5 punktą, besiskirianti tuo. kad yra pernešama augalo transformacijos vektoriaus.
11. DNR konstrukcija pagal 2, 3. 4 arba 5 punktą, besiskirianti tuo. kad yra pernešama augalo transformacijos vektoriaus, kuris yra Agrobcicterium tumefciciens vektorius.
12. Augalo ląstelė, besiskirianti tuo . kad turi DNR konstrukciją pagal
2. 3. 4 arba 5 punktą.
13. Transgeninis augalas, besiskiriantis tuo. kad turi augalo ląstelių pagal 12 punktą.
14. Peptidas, turintis seką SEQ ID NO:2.
15. Peptidas, koduojamas DNR sekos, parinktos iš grupės, susidedančios iš:
(a) sekos SEQ ID NO: 1:
(b) DNR sekų. kurios hibridizuojasi su izoliuota DNR iš (a), ankščiau paminėtos, ir kurios koduoja fosforibozilo chinolato transferazės fermentą: ir (c) DNR sekų, kurios skiriasi nuo DNR iš (a), arba iš (b), anksčiau paminėtų, dėl genetinio kodo degeneracijos.
16. Transgeninio augalo ląstelės, turinčios sumažintą fosforibozilo chinolato transferazės (QPRtazės) ekspresiją, gamybos būdas besiskiriantis tuo. kad minėtas būdas apima:
augalo ląstelės, kuri žinoma kaip ekspresuojanti fosforibozilo chinolato transferazę. sukūrimą:
egzogeninės DNR konstrukcijos, kuri kryptimi nuo 5' iki 3' turi promotorių, veikiantį augalo ląstelėje, ir DNR pagal 1 punktą, apimančią dalį sekos, koduojančios fosforibozilo chinolato transferazės mRNR. kai minėta DNR funkcionaliai sujungta su minėtu promotoriumi. sukūrimą: ir minėtos augalo ląstelės transformavimą minėta DNR konstrukcija, norint gauti transformuotas ląsteles, kai minėta augalo ląstelė, turi sumažintą QPRtazės ekspresiją, palyginus su netransformuota ląstele.
17. Būdas pagal 16 punktą, besisiskiriantis tuo. kad minėta DNR. apimanti dalį sekos, koduojančios fosforibozilo chinolato transferazės mRNR. yra antisensinėje orientacijoje.
18. Būdas pagal 16 punktą, besiskiriantis tuo. kad minėta DNR. apimanti dalį sekos, koduojančios fosforibozilo chinolato transferazės mRNR. yra sensinėje orientacijoje.
19. Budas pagal 16 punktą, besiskiriantis tuo. kad minėta augalo ląstelė yra Nicoticma tabacum.
20. Būdas pagal 16 punktą, besiskiriantis tuo. kad dar apima augalo iš minėtos transformuotos augalo ląstelės regeneravimą.
21. Būdas pagal 16 punktą, besiskiriantis tuo. kad minėtas promotorius yra struktūriškai aktyvus.
22. Būdas pagal 16 punktą, besiskiriantis tuo. kad minėtas promotorius yra selektyviai aktyvus augalo šaknų audinio ląstelėse.
23. Būdas pagal 16 punktą, besiskiriantis tuo, kad minėtas promotorius yra selektyviai aktyvus augalo šaknų žievės audinio ląstelėse.
24. Būdas pagal 16 punktą, besiskiriantis tuo. kad minėta transformavimo.....
pakopa yra atliekama bombarduojant minėtą augalo ląstelę mikrodalelėmis.“ pernešančiomis minėtą DNR konstrukciją.
25. Būdas pagal 16 punktą, besiskiriantis tuo. kad minėta transformavimo pakopa yra atliekama infekuojant minėtą augalo ląstelę Agrobacterium tumefaciens. turinčia Ti plazmidę. pernešančią minėtą DNR konstrukciją.
26. Transgeninio tabako sėklų gamybos būdas, besiskiriantis tuo. kad sėklas surenka iš transgeninio tabako augalo, gauto būdu pagal 19 punktą.
27. Būdas pagal 16 punktą besiskiriantis tuo. kad jame minėta egzogenine DNR seka yra komplementari (papildančioji) minėtai fosforibozilo chinolato transferazės informacinei RNR (QPRT mRNR). ekspresuotai minėtos augalo ląstelės regione, parinktame iš:
(a) 5'- netransliuotos sekos minėtos QPRT mRNR:
(b) 3'- netransliuotos sekos minėtos QPRT mRNR: ir (c) transliuoto regiono minėtos QPRT mRNR.
28. Būdas pagal 16 punktą, besiskiriantis tuo. kad jame minėta egzogeninė DNR seka yra komplementari (papildančioji) mažiausiai 15 nukleotidų minėtos fosforibozilo chinolato transferazės informacinės RNR. ekspresuotos minėtoje augalo ląstelėje.
29. Būdas pagal 16 punktą, besiskiriantis tuo, kad jame minėta egzogeninė DNR seka yra komplementari (papildančioji) mažiausiai 200 nukleotidų minėtos fosforibozilo chinolato transferazės informacinės RNR. ekspresuotos minėtoje augalo ląstelėje.
30. Būdas pagal 16 punktą, besiskiriantis tuo. kad jame minėta egzogeninė DNR seka apima fosforibozilo chinolato transferazę. koduojančią seką. parinktą iš DNR sekų. aprašytų 1 punkte.
3 1. Transgeninis augalas iš rūšių Nicoticmci. besiskiriantis tuo. kad turi sumažintą fosforibozilo chinolato transferazės (QPRtazėsj ekspresiją, lyginant su netransformuotu kontroliniu augalu, kai minėtas transgeninis augalas apima transgenines augalo ląsteles, turinčias:
egzogeninės DNR konstrukciją, kryptimi nuo 5' iki 3' apimančią promotorių, veikiantį minėtoje ląstelėje, ir DNR. turinčią segmentą DNR sekos pagal 1 punktą, koduojančios augalo fosforibozilo chinolato transferazės mRNR. kai minėta DNR funkcionaliai sujungta su minėtu promotoriumi:
ir minėtas augalas parodo sumažintą QPRtazės ekspresiją, palyginus su netransformuotu kontroliniu ausalu.
32. Transgeninis augalas pagal 31 punktą, besiskiriantis tuo. kad jame minėtas segmentas DNR. apimančios segmentą DNR sekos, koduojančios fosforibozilo chinolato transferazės mRNR. yra antisensinėje orientacijoje.
33. Transgeninis augalas pagal 31 punktą, b e s i s k i r i a n t'i s tuo. kad jame minėtas segmentas DNR. apimančios segmentą DNR sekos, koduojančios fosforibozilo chinolato transferazės mRNR. yra sensinėje orientacijoje.
34. Transgeninis augalas iš rūšių Nicoticmci. besiskiriantis tuo. kad turi sumažintą fosforibozilo chinolato transferazės (QPRtazės) ekspresiją, lyginant su netransformuotu kontroliniu augalu, kur minėtas transgeninis augalas yra palikuonis augalo pagal 31 punktą.
35. Sėklos, besiskiriančios tuo, kad yra iš transgeninio augalo rūšių Nicotianci. turinčio sumažintą fosforibozilo chinolato transferazės (QPRtazės)‘ ekspresiją, proporcingą netransformuotam kontroliniam augalui, kur minėtas“ transgeninis augalas yra augalas pagal 31 punktą arba jo palikuonis.
36. Derlius, besiskiriantis tuo. kad apima daugybę augalų pagal 31 punktą, pasodintų kartu agrokultūriniame lauke.
37. fosforibozilo chinolato transferazės geno ekspresijos sumažinimo būdas augalo ląstelėje, besiskiriantis tuo. kad minėtas būdas apima:
auginimą augalo ląstelės, transformuotos taip. kad turėtų egzogeninę DNR pagal 1 punktą, kur minėtos DNR transkribuota vija yra komplementari (papildančioji) fosforibozilo chinolato transferazės mRNR. endogeninei minėtai ląstelei, kai minėtos papildančiosios vijos transkripcija sumažina minėto fosforibozilo chinolato geno ekspresiją.
38. Tabako ausalo, turinčio sumažintus nikotino lveius minėto tabako auealo lapuose, gamybos būdas, besiskiriantis tuo, kad minėtas būdas apima:
auginimą tabako augalo arba anksčiau minėtų palikuonių augalų, kur minėtas augalas turi ląsteles, apimančias DNR konstrukciją, turinčią transkripcini iniciacijos regioną, funkcionuojantį minėtame augale ir egzogeninę DNR seką pagal 1 punktą, funkcionaliai sujungtą su minėtu transkripciniu iniciacijos regionu, kur transkribuota minėtos DNR sekos vija yra komplementari (papildančioji) endogeninei fosforibozilo chinolato transferazės informacinei RNR minėtose ląstelėse.
39. Transgeninės augalo ląstelės, turinčios padidintą fosforibozilo chinolato transferazės (QPRtazės) ekspresiją, gamybos būdas, besiskiriantis tuo, kad minėtas būdas apima:
gavimą augalo ląstelės, ekspresuojančios fosforibozilo chinolato transferazę:
gavimą egzogeninės DNR konstrukcijos, kai konstrukcija kryptimi nuo 5' iki 3' apima promotorių, veikiantį augalo ląstelėje, ir DNR seką pagal 1 punktą, koduojančią fosforibozilo chinolato transferazę. kai minėta DNR seka yra funkcionaliai sujungta su minėtu promotoriumi: ir transformavimą minėtos augalo ląstelės minėta DNR konstrukcija, gaunant transformuotas ląsteles, kai minėta augalo ląstelė turi padidintą QPRtazės ekspresiją, lyginant su netransformuota ląstele.
40. Transgeninis augalas iš rūšių Nicotiana, besiskiriantis tuo. kad turi padidintą fosforibozilo chinolato transferazės (QPRtazės) ekspresiją, lyginant su netransformuotu kontroliniu augalu, kai minėtas transgeninis augalas apima transgenines augalo ląsteles, turinčias:
egzogeninės DNR konstrukciją kryptimi nuo 5’ iki 3' apimančią promotorių, veikiantį minėtoje ląstelėje, ir DNR seką pagal 1 punktą, koduojančią augalo fosforibozilo chinolato transferazę. kai minėta DNR funkcionaliai sujungta su minėtu promotoriumi:
kai minėtas augalas parodo padidintą QPRtazės ekspresiją, lyginant su netransformuotu kontroliniu augalu.
41. Transgeninis augalas iš rūšių Nicoticinci. besiskiriantis tuo. kad turi padidintą fosforibozilo chinolato transferazės (QPRtazės) ekspresiją, lyginant su netransformuotu kontroliniu augalu, kur minėtas transgeninis augalas yra palikuonis augalo pagal 40 punktą.
42. Fosforibozilo chinolato transferazės geno ekspresijos padidinimo būdas augalo ląstelėje, besiskiriantis tuo, kad minėtas būdas apima:
auginimą augalo ląstelės, transformuotos taip, kad turėtų egzogeninę DNR pagal 1 punktą, kurioje minėta egzogeninė DNR koduoja fosforibozilo chinolato transferazę.
43. Būdas pagal 42 punktą besiskiriantis tuo. kad jame minėta.; transformuota augalo ląstelė yra gaunama būdu. apimančiu:
genomo konstrukcijos integravimą į pagrindinio augalo ląstelę, transkripcijos kryptyje turinčią promotorių, funkcionuojantį minėtoje augalo ląstelėje, DNR seką. koduojančią fosforibozilo chinolato transferazę. funkcionuojančią minėtoje ląstelėje, kai minėta DNR seka funkcionaliai sujungta su minėtu promotoriumi. ir transkripcijos nutraukimo regioną, fonkciuonuojantį minėtoje ląstelėje, kai transformuota augalo ląstelė yra gaunama.
44. Tabako augalo, turinčio padidintus nikotino lygius minėto tabako augalo lapuose, gamybos būdas, besiskiriantis tuo. kad minėtas būdas apima:
auginimą tabako augalo arba anksčiau minėtų palikuonių, kur minėtas augalas turi ląsteles, apimančias DNR konstrukciją, turinčią transkripcinį iniciacijos regioną, funkcionuojantį minėtame augale ir egzogeninę DNR seką pagal 1 punktą, funkcionaliai sujungtą su transkripcijos iniciacijos regionu, kai minėta DNR seka koduoja fosforibozilo chinolato transferazę, funkcionuojančią minėtose ląstelėse.
LT99-142A 1997-06-12 1999-12-10 Fosforibozilo chinolato transferazės ekspresijos reguliavimas LT4706B (lt)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US4947197P 1997-06-12 1997-06-12

Publications (2)

Publication Number Publication Date
LT99142A LT99142A (lt) 2000-06-26
LT4706B true LT4706B (lt) 2000-09-25

Family

ID=21960004

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
LT99-142A LT4706B (lt) 1997-06-12 1999-12-10 Fosforibozilo chinolato transferazės ekspresijos reguliavimas

Country Status (38)

Country Link
US (9) US6586661B1 (lt)
EP (3) EP1457562B1 (lt)
JP (4) JP4095678B2 (lt)
KR (1) KR100365969B1 (lt)
CN (2) CN1304576C (lt)
AP (1) AP1169A (lt)
AT (1) ATE262039T1 (lt)
AU (1) AU748514B2 (lt)
BG (1) BG64319B1 (lt)
BR (1) BRPI9810870B1 (lt)
CA (2) CA2287776C (lt)
CU (1) CU23174A3 (lt)
CZ (1) CZ297379B6 (lt)
DE (2) DE991766T1 (lt)
DK (1) DK0991766T3 (lt)
EA (2) EA004652B1 (lt)
EE (1) EE04595B1 (lt)
ES (1) ES2154624T3 (lt)
GE (1) GEP20032871B (lt)
GR (1) GR20010300003T1 (lt)
HK (3) HK1027379A1 (lt)
HU (1) HU225888B1 (lt)
ID (1) ID29311A (lt)
IL (3) IL132184A0 (lt)
LT (1) LT4706B (lt)
LV (1) LV12507B (lt)
NO (1) NO324872B1 (lt)
NZ (1) NZ500963A (lt)
OA (1) OA11219A (lt)
PL (1) PL201266B1 (lt)
PT (1) PT991766E (lt)
RO (1) RO121968B1 (lt)
RS (1) RS49677B (lt)
SI (1) SI20215B (lt)
SK (1) SK161899A3 (lt)
TR (1) TR199902728T2 (lt)
UA (1) UA72187C2 (lt)
WO (1) WO1998056923A1 (lt)

Families Citing this family (51)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7885697B2 (en) 2004-07-13 2011-02-08 Dexcom, Inc. Transcutaneous analyte sensor
US6586661B1 (en) * 1997-06-12 2003-07-01 North Carolina State University Regulation of quinolate phosphoribosyl transferase expression by transformation with a tobacco quinolate phosphoribosyl transferase nucleic acid
US20100251425A9 (en) * 1998-05-15 2010-09-30 University Of Central Florida Expression of human interferon in transgenic chloroplasts
DE19926216A1 (de) * 1999-06-09 2001-02-22 Metallgesellschaft Ag Verfahren zur Herstellung von Bariumsulfat, Bariumsulfat und Verwendung des Bariumsulfats
EP1313868B1 (en) * 2000-08-30 2006-07-19 North Carolina State University Transgenic plants containing molecular decoys that alter protein content therein
EP1368467B1 (en) * 2000-11-07 2007-04-25 North Carolina State University Putrescine-n-methyltransferase promoter
DE10055870A1 (de) 2000-11-10 2002-05-29 Degussa Neue für das nadC-Gen kodierende Nukleotidsequenzen
US20020197688A1 (en) * 2001-06-06 2002-12-26 Joseph Pandolfino Tobacco biomass utilization
NZ530238A (en) * 2001-06-08 2004-08-27 Vector Tobacco Ltd Modifying nicotine and nitrosamine levels in tobacco
US20060157072A1 (en) * 2001-06-08 2006-07-20 Anthony Albino Method of reducing the harmful effects of orally or transdermally delivered nicotine
WO2005103296A2 (en) * 2004-03-30 2005-11-03 Vector Tobacco, Ltd. Global gene expression analysis of human bronchial epithelial cells exposed to cigarette smoke, smoke condensates, or components thereof
US6730832B1 (en) 2001-09-10 2004-05-04 Luis Mayan Dominguez High threonine producing lines of Nicotiana tobacum and methods for producing
AU2002340407A1 (en) * 2001-11-09 2003-05-26 Vector Tobacco Inc. Method and composition for mentholation of charcoal filtered cigarettes
ATE341952T1 (de) * 2001-12-19 2006-11-15 Vector Tobacco Ltd Verfahren und zusammensetzung zur mentholanreicherung von zigaretten
WO2003053176A2 (en) * 2001-12-19 2003-07-03 Vector Tobacco Inc. Method and compositions for imparting cooling effect to tobacco products
JP2005522201A (ja) * 2002-04-09 2005-07-28 ベクター、タバコ、リミテッド ニコチンおよびニトロソアミンを減少させたタバコ
EP1675454A4 (en) * 2003-08-19 2007-03-21 22Nd Century Ltd Llc TOBACCO PRODUCTS WITH REDUCED EXPOSURE
US7920906B2 (en) 2005-03-10 2011-04-05 Dexcom, Inc. System and methods for processing analyte sensor data for sensor calibration
WO2005041151A2 (en) * 2003-10-02 2005-05-06 Vector Tobacco Ltd. Tobacco product labeling system
US9247900B2 (en) 2004-07-13 2016-02-02 Dexcom, Inc. Analyte sensor
US7538071B2 (en) 2003-11-21 2009-05-26 Carl Berger Methods of reducing the nicotine content of tobacco plants and tobacco plants obtained thereby
US8792955B2 (en) 2004-05-03 2014-07-29 Dexcom, Inc. Transcutaneous analyte sensor
AU2012203977B2 (en) * 2005-02-28 2015-01-29 22Nd Century Limited, Llc Reducing levels of nicotinic alkaloids in plants
KR101581039B1 (ko) 2005-02-28 2016-01-05 22엔디 센츄리 리미티드, 엘엘씨 식물의 니코틴 알칼로이드 수준의 감소
AU2006247739A1 (en) 2005-05-11 2006-11-23 Vector Tobacco Inc. Reduced risk tobacco products and methods of making same
FR2889003A1 (fr) * 2005-07-22 2007-01-26 St Microelectronics Sa Adaptation automatique d'une source video a un recepteur
WO2008020333A2 (en) 2006-06-19 2008-02-21 National Research Council Of Canada Nucleic acid encoding n-methylputrescine oxidase and uses thereof
PL2792750T3 (pl) 2006-09-13 2020-02-28 22Nd Century Limited, Llc Zwiększanie poziomów alkaloidów nikotynowych
US9551003B2 (en) 2006-09-13 2017-01-24 22Nd Century Limited, Llc Increasing levels of nicotinic alkaloids in plants
US9102948B2 (en) 2006-11-17 2015-08-11 22Nd Century Limited, Llc Regulating alkaloids
US9106606B1 (en) 2007-02-05 2015-08-11 F5 Networks, Inc. Method, intermediate device and computer program code for maintaining persistency
CA3114078A1 (en) * 2007-05-25 2009-05-22 22Nd Century Limited, Llc Nucleic acid sequences encoding transcription factors regulating alkaloid biosynthesis and their use in modifying plant metabolism
US20100206317A1 (en) * 2007-09-28 2010-08-19 Vector Tobacco, Inc. Reduced risk tobacco products and use thereof
EP2231861B1 (en) 2007-12-13 2014-10-29 Philip Morris Products S.A. Transgenic plants modified for reduced cadmium transport, derivative products, and related methods
US9493776B2 (en) 2009-11-19 2016-11-15 National University Corporation Okayama University System for increasing gene expression and vector comprising the system
CN102781494B (zh) 2009-12-11 2015-04-01 泰尔茂比司特公司 具有防护提取端口和光学控制的血液分离系统
EP2537929B1 (en) 2010-02-17 2017-04-12 Japan Tobacco, Inc. Plant component regulation factor, and use thereof
US9862923B2 (en) 2010-03-26 2018-01-09 Philip Morris Usa Inc. Cultured tobacco cells as a matrix for consumable products
EP2565265A1 (en) 2011-09-02 2013-03-06 Philip Morris Products S.A. Isopropylmalate synthase from Nicotiana tabacum and methods and uses thereof
US8716571B2 (en) 2011-09-21 2014-05-06 Reynolds Technologies, Inc. Tobacco having reduced amounts of amino acids and methods for producing such lines
US9137958B2 (en) 2012-02-08 2015-09-22 Reynolds Technologies, Inc. Tobacco having altered amounts of environmental contaminants
US10563215B2 (en) * 2012-12-21 2020-02-18 Philip Morris Products S.A. Tobacco specific nitrosamine reduction in plants
CN103173488B (zh) * 2013-03-14 2014-09-03 浙江省农业科学院 新的融合标签进行水稻转基因快速筛选的方法
US10375910B2 (en) 2013-03-15 2019-08-13 Altria Client Services Llc Development of tobacco varieties with no or significantly reduced anatabine content
US20180291388A1 (en) * 2015-05-05 2018-10-11 North Carolina State University Methods and compositions for reducing the tobacco specific nitrosamine nnk in tobacco
CN116250483B (zh) 2015-06-26 2024-01-30 奥驰亚客户服务公司 用于生产烟草植物的组合物和方法以及具有改变的生物碱含量的制品
EP3480314A1 (en) 2017-11-03 2019-05-08 Philip Morris Products S.A. Regulation of alkaloid content
US20200035118A1 (en) 2018-07-27 2020-01-30 Joseph Pandolfino Methods and products to facilitate smokers switching to a tobacco heating product or e-cigarettes
US10897925B2 (en) 2018-07-27 2021-01-26 Joseph Pandolfino Articles and formulations for smoking products and vaporizers
US20230399651A1 (en) * 2019-10-10 2023-12-14 Altria Client Services Llc Compositions and Methods Based on QPT Engineering for Producing Tobacco Plants and Products Having Altered Alkaloid Levels
CN113528537A (zh) * 2021-08-11 2021-10-22 云南省烟草农业科学研究院 一种降低烟叶烟碱含量的NtQPT2基因突变体及其应用

Family Cites Families (178)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US299541A (en) 1884-06-03 heae-n
US38123A (en) * 1863-04-07 Improvement in harvesters
US254285A (en) 1882-02-28 David w
US819751A (en) * 1905-01-04 1906-05-08 Giuseppe Gianoli Process of charging silk.
US2479526A (en) 1940-12-11 1949-08-16 Wurton Machine Company Apparatus for curing green tobacco
US2728803A (en) * 1951-12-28 1955-12-27 Standard Oil Co Separation of ethylbenzene from other c8 aromatic hydrocarbons by extraction with hf-bf3
US2728603A (en) 1954-12-13 1955-12-27 James H Stagg Lawn and garden sprinkler
DE1917552U (de) 1964-01-31 1965-06-10 Fritz Tautenhahn Flaechig-ornamentales gitterwerk.
US3693631A (en) 1971-04-28 1972-09-26 Reynolds Leasing Corp Tobacco expansion process
US3840025A (en) 1972-08-14 1974-10-08 Industrial Nucleonics Corp Tobacco moisture control system and method
US3905123A (en) 1973-10-15 1975-09-16 Industrial Nucleonics Corp Method and apparatus for controlling a tobacco dryer
US4319587A (en) 1975-06-09 1982-03-16 Irving S. Moser Smoking article
DE7522272U (de) 1975-07-12 1977-06-02 Deutsche Benkert Gmbh & Co Kg, 4690 Herne Poroeses mundstueckbelagpapier
US4192323A (en) 1977-09-21 1980-03-11 Gas-Fired Products, Inc. Apparatus and method for automatically controlling curing conditions in a tobacco curing barn
US4557280A (en) 1978-06-15 1985-12-10 Brown & Williamson Tobacco Corporation Process for reduction of nitrate and nicotine content of tobacco by microbial treatment
US4243056A (en) 1979-01-12 1981-01-06 Philip Morris Incorporated Method for uniform incorporation of additives into tobacco
FR2478958A1 (fr) 1980-04-01 1981-10-02 Decoufle Dispositif d'alimentation en encre des appareils d'imprimerie pour machines a confectionner les cigarettes
US4499911A (en) 1980-12-09 1985-02-19 Johnson William H Energy efficient curing and drying system
GB2092149B (en) * 1981-02-03 1985-01-03 Searle & Co Imidazoline hydrazone and hydrazine derivatives production thereof and use in medicine
US4459355A (en) 1982-07-12 1984-07-10 International Paper Company Method for transforming plant cells
US4762785A (en) 1982-08-12 1988-08-09 Calgene, Inc. Novel method and compositions for introducting alien DNA in vivo
NL8203963A (nl) 1982-10-14 1984-05-01 Naarden International Nv Werkwijze voor het aromatiseren van droog plantaardig materiaal.
EP0320500B1 (en) 1983-01-13 2004-11-17 Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. Non-oncogenic ti plasmid vector system and recombinant DNA molecules for the introduction of expressible genes into plant cell genomes
US6051757A (en) 1983-01-14 2000-04-18 Washington University Regeneration of plants containing genetically engineered T-DNA
US5034322A (en) 1983-01-17 1991-07-23 Monsanto Company Chimeric genes suitable for expression in plant cells
EP0131623B2 (en) 1983-01-17 1999-07-28 Monsanto Company Chimeric genes suitable for expression in plant cells
AU559562B2 (en) 1983-01-17 1987-03-12 Monsanto Company Genetically transformed plants
US6174724B1 (en) 1983-01-17 2001-01-16 Monsanto Company Chimeric genes suitable for expression in plant cells
WO1984002919A1 (en) 1983-01-17 1984-08-02 Monsanto Co Plasmids for transforming plant cells
US5352605A (en) 1983-01-17 1994-10-04 Monsanto Company Chimeric genes for transforming plant cells using viral promoters
NL8300698A (nl) 1983-02-24 1984-09-17 Univ Leiden Werkwijze voor het inbouwen van vreemd dna in het genoom van tweezaadlobbige planten; agrobacterium tumefaciens bacterien en werkwijze voor het produceren daarvan; planten en plantecellen met gewijzigde genetische eigenschappen; werkwijze voor het bereiden van chemische en/of farmaceutische produkten.
NL8300699A (nl) 1983-02-24 1984-09-17 Univ Leiden Werkwijze voor het inbouwen van vreemd dna in het genoom van tweezaadlobbige planten; werkwijze voor het produceren van agrobacterium tumefaciens bacterien; stabiele cointegraat plasmiden; planten en plantecellen met gewijzigde genetische eigenschappen; werkwijze voor het bereiden van chemische en/of farmaceutische produkten.
US4751348A (en) 1983-07-16 1988-06-14 Cold Spring Harbor Laboratory Nicotiana plants with both altered polyamine levels and flower structures and method for obtaining these plants
US4766855A (en) * 1983-07-20 1988-08-30 Cummins Engine Co., Inc. Plasma jet ignition apparatus
EP0140308B2 (en) 1983-10-20 2001-10-17 The Research Foundation Of State University Of New York Regulation of gene expression by employing translational inhibition utilizing mRNA interfering complementary RNA
US5272065A (en) 1983-10-20 1993-12-21 Research Foundation Of State University Of New York Regulation of gene expression by employing translational inhibition of MRNA utilizing interfering complementary MRNA
US5190931A (en) 1983-10-20 1993-03-02 The Research Foundation Of State University Of New York Regulation of gene expression by employing translational inhibition of MRNA utilizing interfering complementary MRNA
US5208149A (en) 1983-10-20 1993-05-04 The Research Foundation Of State University Of New York Nucleic acid constructs containing stable stem and loop structures
US4885248A (en) 1984-02-15 1989-12-05 Lubrizol Genetics, Inc. Transfer vector
US4771002A (en) 1984-02-24 1988-09-13 Lubrizol Genetics, Inc. Transcription in plants and bacteria
US5149645A (en) 1984-06-04 1992-09-22 Rijksuniversiteit Leiden Process for introducing foreign DNA into the genome of plants
NL8401780A (nl) 1984-06-04 1986-01-02 Rijksuniversiteit Leiden En Pr Werkwijze voor het inbouwen van vreemd dna in het genoom van planten.
US4945050A (en) 1984-11-13 1990-07-31 Cornell Research Foundation, Inc. Method for transporting substances into living cells and tissues and apparatus therefor
US5100792A (en) 1984-11-13 1992-03-31 Cornell Research Foundation, Inc. Method for transporting substances into living cells and tissues
US5036006A (en) 1984-11-13 1991-07-30 Cornell Research Foundation, Inc. Method for transporting substances into living cells and tissues and apparatus therefor
DE3587548T2 (de) 1984-12-28 1993-12-23 Bayer Ag Rekombinante DNA, die in pflanzliche Zellen eingebracht werden kann.
US5753475A (en) 1985-01-17 1998-05-19 Calgene, Inc. Methods and compositions for regulated transcription and expression of heterologous genes
US6281410B1 (en) 1986-07-31 2001-08-28 Calgene Llc Methods and compositions for regulated transcription and expression of heterologous genes
US4943674A (en) 1987-05-26 1990-07-24 Calgene, Inc. Fruit specific transcriptional factors
US6617496B1 (en) 1985-10-16 2003-09-09 Monsanto Company Effecting virus resistance in plants through the use of negative strand RNAs
NL8502948A (nl) 1985-10-29 1987-05-18 Rijksuniversiteit Leiden En Pr Werkwijze voor het inbouwen van "vreemd dna" in het genoom van dicotyle planten.
US4795855A (en) 1985-11-14 1989-01-03 Joanne Fillatti Transformation and foreign gene expression with woody species
GB8529851D0 (en) 1985-12-04 1986-01-15 Rothmans Of Pall Mall Linear layered cigarette
US5107065A (en) 1986-03-28 1992-04-21 Calgene, Inc. Anti-sense regulation of gene expression in plant cells
IL81737A (en) 1986-03-28 1992-11-15 Calgene Inc Regulation of gene expression in plant cells
US5453566A (en) 1986-03-28 1995-09-26 Calgene, Inc. Antisense regulation of gene expression in plant/cells
US4700725A (en) 1986-04-17 1987-10-20 Philip Morris Incorporated Adjustable filter cigarette
US4699158A (en) 1986-04-17 1987-10-13 Philip Morris Incorporated Adjustable filter cigarette with tactile indicator
DE3661587D1 (en) 1986-04-23 1989-02-09 Reynolds Tobacco Gmbh Process for treating tobacco and similar organic materials
US4766911A (en) 1986-06-23 1988-08-30 R. J. Reynolds Tobacco Company Method for tracing smoking articles
US4962028A (en) 1986-07-09 1990-10-09 Dna Plant Technology Corporation Plant promotors
US5229292A (en) 1986-07-28 1993-07-20 Stine Seed Farm, Inc. Biological control of insects using pseudomonas strains transformed with bacillus thuringiensis insect toxingene
EP0265556A1 (en) 1986-10-31 1988-05-04 Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. Stable binary agrobacterium vectors and their use
US5268463A (en) 1986-11-11 1993-12-07 Jefferson Richard A Plant promoter α-glucuronidase gene construct
US5015580A (en) 1987-07-29 1991-05-14 Agracetus Particle-mediated transformation of soybean plants and lines
US4835162A (en) 1987-02-12 1989-05-30 Abood Leo G Agonists and antagonists to nicotine as smoking deterents
US4966916A (en) 1987-02-12 1990-10-30 Abood Leo G Agonists and antagonists to nicotine as smoking deterrents
US5356799A (en) 1988-02-03 1994-10-18 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Antisense gene systems of pollination control for hybrid seed production
US5922602A (en) 1988-02-26 1999-07-13 Biosource Technologies, Inc. Cytoplasmic inhibition of gene expression
US5179022A (en) 1988-02-29 1993-01-12 E. I. Du Pont De Nemours & Co. Biolistic apparatus for delivering substances into cells and tissues in a non-lethal manner
US4954442A (en) 1988-08-31 1990-09-04 Purdue Research Foundation Opine enhancement of vir gene induction
US5023179A (en) 1988-11-14 1991-06-11 Eric Lam Promoter enhancer element for gene expression in plant roots
GB8827592D0 (en) 1988-11-25 1988-12-29 Taniguchi T Improvements in & relating to regulation of expression
US4990607A (en) 1989-03-14 1991-02-05 The Rockefeller University Alteration of gene expression in plants
US5223419A (en) 1989-03-14 1993-06-29 The Rockefeller University Alteration of gene expression in plants
US5034323A (en) 1989-03-30 1991-07-23 Dna Plant Technology Corporation Genetic engineering of novel plant phenotypes
US5231020A (en) 1989-03-30 1993-07-27 Dna Plant Technology Corporation Genetic engineering of novel plant phenotypes
GB8916213D0 (en) 1989-07-14 1989-08-31 Ici Plc Dna constructs,cells and plants derived therefrom
US5776502A (en) 1989-07-18 1998-07-07 Oncogene Science, Inc. Methods of transcriptionally modulating gene expression
US5665543A (en) 1989-07-18 1997-09-09 Oncogene Science, Inc. Method of discovering chemicals capable of functioning as gene expression modulators
US5580722A (en) 1989-07-18 1996-12-03 Oncogene Science, Inc. Methods of determining chemicals that modulate transcriptionally expression of genes associated with cardiovascular disease
DE69034061D1 (de) 1989-07-18 2003-05-28 Osi Pharm Inc Methode der veränderung der expression von genen bei der transkription und zum nachweis von chemischen substanzen, die wie modulatoren der genexpression wirken
US6203976B1 (en) 1989-07-18 2001-03-20 Osi Pharmaceuticals, Inc. Methods of preparing compositions comprising chemicals capable of transcriptional modulation
US5501967A (en) 1989-07-26 1996-03-26 Mogen International, N.V./Rijksuniversiteit Te Leiden Process for the site-directed integration of DNA into the genome of plants
US5097025A (en) 1989-08-01 1992-03-17 The Rockefeller University Plant promoters
US5062434A (en) 1989-09-22 1991-11-05 Brown & Williamson Tobacco Corporation Cigarette paper
GB8923716D0 (en) 1989-10-20 1989-12-06 Ici Plc Dna,constructs,cells and plants derived therefrom
US5177308A (en) 1989-11-29 1993-01-05 Agracetus Insecticidal toxins in plants
DE59009881D1 (de) 1989-12-19 1995-12-21 Ciba Geigy Ag Verfahren und Vorrichtung zur genetischen Transformation von Zellen.
JPH0673478B2 (ja) * 1990-01-11 1994-09-21 旭化成工業株式会社 Ｌ―カルニチンの高感度測定法および測定用組成物
CA2036935A1 (en) 1990-02-26 1991-08-27 Paul Christou Plant transformation process with early identification of germ line transformation events
US5109876A (en) 1990-04-19 1992-05-05 R. J. Reynolds Tobacco Company Cigarette paper and cigarette incorporating same
US5204253A (en) 1990-05-29 1993-04-20 E. I. Du Pont De Nemours And Company Method and apparatus for introducing biological substances into living cells
US5932782A (en) 1990-11-14 1999-08-03 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Plant transformation method using agrobacterium species adhered to microprojectiles
US5668295A (en) 1990-11-14 1997-09-16 Philip Morris Incorporated Protein involved in nicotine synthesis, DNA encoding, and use of sense and antisense DNAs corresponding thereto to affect nicotine content in transgenic tobacco cells and plants
US5260205A (en) 1990-11-14 1993-11-09 Philip Morris Incorporated Method of purifying putrescine N-methyltransferase from tobacco plant extract with a polyamine
US5035252A (en) 1990-12-14 1991-07-30 Mondre Steven J Nicotine-containing dental floss
US5459252A (en) 1991-01-31 1995-10-17 North Carolina State University Root specific gene promoter
JPH04265569A (ja) * 1991-02-19 1992-09-21 Canon Inc 音声信号記録装置及び再生装置
WO1992018522A1 (en) 1991-04-18 1992-10-29 The Salk Institute For Biological Studies Oligodeoxynucleotides and oligonucleotides useful as decoys for proteins which selectively bind to defined dna sequences
GB9109063D0 (en) 1991-04-26 1991-06-12 Ici Plc Modification of lignin synthesis in plants
AU655839B2 (en) 1991-06-27 1995-01-12 Genelabs Technologies, Inc. Screening assay for the detection of DNA-binding molecules
US5994629A (en) 1991-08-28 1999-11-30 Novartis Ag Positive selection
GB9304200D0 (en) 1993-03-02 1993-04-21 Sandoz Ltd Improvements in or relating to organic compounds
WO1993005646A1 (en) * 1991-09-13 1993-04-01 Technology Management Services, S.A. Reduction of nicotine levels in tobacco
ES2157217T3 (es) 1992-02-26 2001-08-16 Zeneca Mogen B V Cepas de agrobacterium capaces de recombinacion especifica para el sitio.
US5780051A (en) 1992-04-02 1998-07-14 Dynagen, Inc. Methods and articles of manufacture for nicotine cessation and monitoring nicotine use
EP0633940B1 (en) 1992-04-02 2002-12-04 SemBioSys Genetics Inc. Oil-body protein cis-elements as regulatory signals
US5626152A (en) 1992-08-26 1997-05-06 Molins Plc Cigarette making machine
US5469871A (en) 1992-09-17 1995-11-28 R. J. Reynolds Tobacco Company Cigarette and method of making same
BR9307547A (pt) 1992-11-27 1999-06-01 Voxel Processo e aparelho para fabricar um holograma
WO1994012015A1 (en) 1992-11-30 1994-06-09 Chua Nam Hai Expression motifs that confer tissue- and developmental-specific expression in plants
IL108367A0 (en) 1993-01-27 1994-04-12 Hektoen Inst For Medical Resea Antisense polynzcleotide inhibition of human growth factor-sensitive cancer cells
AU684785B2 (en) 1993-05-13 1998-01-08 Plant Genetic Systems N.V. Marker gene
WO1994028142A1 (en) * 1993-06-01 1994-12-08 Philip Morris Products Inc. Putrescine n-methyltransferase, recombinant dna molecules encoding putrescine n-methyltransferase, and transgenic tobacco plants with decreased alkaloid content
US5540242A (en) 1993-07-07 1996-07-30 Brown & Williamson Tobacco Corporation Cigarette paper having reduced sidestream properties
US5377697A (en) 1993-08-27 1995-01-03 Hoechst Celanese Corporation Cigarette filter test apparatus and associated method for measuring filter hot collapse and tobacco consumption
US5810020A (en) 1993-09-07 1998-09-22 Osmotek, Inc. Process for removing nitrogen-containing anions and tobacco-specific nitrosamines from tobacco products
ATE362527T1 (de) 1993-12-08 2007-06-15 Japan Tobacco Inc Verfahren zur transformation von pflanzen und ein vektor dafür
US5394894A (en) 1994-02-22 1995-03-07 Zade; Ismail Y. Method and apparatus for elimination of smoking
ES2081257B1 (es) 1994-05-12 1996-07-16 Sagrera Jorge Martinez Instalacion y procedimiento para el curado de tabaco.
US5858774A (en) 1994-05-12 1999-01-12 The Research Foundation Of State University Of New York Antisense DNA constructs for expression of hybrid MRNAs driven by inducible, tissue-specific promoters
JP3235934B2 (ja) 1994-08-04 2001-12-04 三菱レイヨン株式会社 ロドコッカス属細菌由来カナマイシン耐性遺伝子
IT1275697B1 (it) * 1994-12-20 1997-10-17 Olmo Giancarlo Dell Metodo per stampare direttamente su carta microincisioni di ologrammi,chinogrammi,reticoli di diffrazione o microincisioni
EP0817856A1 (en) 1995-03-22 1998-01-14 Novo Nordisk A/S Introduction of dna into bacillus strains by conjugation
CN1216990C (zh) 1995-03-30 2005-08-31 宝生物工程株式会社 植物启动子及使用所说的启动子用于基因表达的方法
ATE357922T1 (de) 1995-05-12 2007-04-15 Anges Mg Inc Heilung und vorbeugung von durch nf-kappab verursachten erkrankungen
US5837876A (en) * 1995-07-28 1998-11-17 North Carolina State University Root cortex specific gene promoter
GB9517263D0 (en) 1995-08-23 1995-10-25 Cancer Res Campaign Tech Expression systems
US6051409A (en) 1995-09-25 2000-04-18 Novartis Finance Corporation Method for achieving integration of exogenous DNA delivered by non-biological means to plant cells
US6198827B1 (en) * 1995-12-26 2001-03-06 Rocktron Corporation 5-2-5 Matrix system
US5693512A (en) 1996-03-01 1997-12-02 The Ohio State Research Foundation Method for transforming plant tissue by sonication
US5851804A (en) 1996-05-06 1998-12-22 Apollon, Inc. Chimeric kanamycin resistance gene
US5713376A (en) 1996-05-13 1998-02-03 Berger; Carl Non-addictive tobacco products
US6022863A (en) 1996-05-21 2000-02-08 Yale University Regulation of gene expression
US5834236A (en) 1996-06-27 1998-11-10 The Salk Institute For Biological Studies AATT repeat transcription enhancer element
US5845647A (en) * 1996-06-28 1998-12-08 Regent Court Technologies Tobacco and related products
USRE38123E1 (en) * 1996-06-28 2003-05-27 Regent Court Technologies, Llc. Tobacco products having reduced nitrosamine content
US5803081A (en) 1996-06-28 1998-09-08 Regent Court Technologies Tobacco and related products
US6135121A (en) * 1996-06-28 2000-10-24 Regent Court Technologies Tobacco products having reduced nitrosamine content
US5830318A (en) 1996-10-25 1998-11-03 Schweitzer-Mauduit International, Inc. High opacity tipping paper
US5929306A (en) 1996-11-15 1999-07-27 University Of Kentucky Research Foundation KYRT1, a disarmed version of a highly tumorigenic Agrobacterium tumefaciens strain identified as Chry5
US6202649B1 (en) * 1996-12-02 2001-03-20 Regent Court Technologies Method of treating tobacco to reduce nitrosamine content, and products produced thereby
US6166032A (en) 1997-02-07 2000-12-26 Synapse Pharmaceuticals International, Inc. Method for controlling tobacco use and alleviating withdrawal symptoms due to cessation of tobacco use
ES1036967Y (es) * 1997-04-15 1998-05-01 Techpack Espana S L Cazoleta perfeccionada para estuche de lapiz de labios.
US6163521A (en) * 1997-04-16 2000-12-19 Matsushita Electric Industrial Co., Ltd. Disk having read-only and read-write areas
US6020989A (en) * 1997-05-14 2000-02-01 Affinity Co., Ltd. Laminated bodies and windows using them
US6586661B1 (en) * 1997-06-12 2003-07-01 North Carolina State University Regulation of quinolate phosphoribosyl transferase expression by transformation with a tobacco quinolate phosphoribosyl transferase nucleic acid
US6020969A (en) * 1997-07-11 2000-02-01 Philip Morris Incorporated Cigarette making machine including band inspection
CA2248622A1 (en) 1997-09-23 1999-03-23 Joe Celeste Biolistic apparatus for delivering substances into cells and tissues
CN1155410C (zh) * 1997-10-03 2004-06-30 卡里药品公司 治疗尼古丁成瘾的含有尼古丁受体拮抗剂和抗抑郁药或抗焦虑药的组合物
US6077992A (en) * 1997-10-24 2000-06-20 E. I. Du Pont De Nemours And Company Binary viral expression system in plants
US6060310A (en) 1997-11-24 2000-05-09 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Transcription factor decoy and tumor growth inhibitor
US6153811A (en) * 1997-12-22 2000-11-28 Dekalb Genetics Corporation Method for reduction of transgene copy number
US6265538B1 (en) * 1998-02-27 2001-07-24 The Regents Of The University Of California Inhibitor of the inflammatory response induced by the TNFA and IL-1
JP3444191B2 (ja) * 1998-03-31 2003-09-08 日本製紙株式会社 フェニルプロパノイド生合成経路を制御する転写因子
PT1068311E (pt) 1998-04-08 2011-07-20 Commw Scient Ind Res Org Processos e meios de obter fenótipos modificados
US6136799A (en) 1998-04-08 2000-10-24 Abbott Laboratories Cosolvent formulations
US5938017A (en) * 1998-05-04 1999-08-17 Wik; Dennis O. Article for assisting persons to quit smoking and method for same
CA2334186A1 (en) * 1998-06-05 1999-12-09 Regent Court Technologies Monoamine oxidase (mao) inhibitors and uses thereof
US6271031B1 (en) 1998-08-12 2001-08-07 E.I. Du Pont De Nemours And Company Quinolinate metabolism enzymes
AU764100B2 (en) * 1998-10-01 2003-08-07 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Method of plant transformation
DE19847767A1 (de) * 1998-10-16 2000-04-20 Decoufle Sarl Anordnung zum Zuführen von fließfähiger Druckfarbe zu einem Druckwerk für einen Zigarettenpapierstreifen
AU4991500A (en) 1999-05-06 2000-11-21 Michael Timko Regulation of gene expression in tobacco for manipulation of plant growth and secondary metabolism
US6314964B1 (en) * 1999-09-15 2001-11-13 Schweitzer-Mauduit International, Inc. Cigarette paper containing carbon fibers for improved ash characteristics
AU1803601A (en) 1999-11-29 2001-06-04 Midwest Oilseeds, Inc. Methods and compositions for the introduction of molecules into cells
WO2001051630A1 (en) 2000-01-07 2001-07-19 Baylor University Antisense compositions and methods
AU2001245793A1 (en) 2000-03-16 2001-09-24 Cold Spring Harbor Laboratory Methods and compositions for rna interference
WO2001077350A2 (en) 2000-04-07 2001-10-18 Large Scale Biology Corporation Compositions and methods for inhibiting gene expression
EP1313868B1 (en) 2000-08-30 2006-07-19 North Carolina State University Transgenic plants containing molecular decoys that alter protein content therein
EP1368467B1 (en) 2000-11-07 2007-04-25 North Carolina State University Putrescine-n-methyltransferase promoter
US20020197688A1 (en) 2001-06-06 2002-12-26 Joseph Pandolfino Tobacco biomass utilization
US20060157072A1 (en) * 2001-06-08 2006-07-20 Anthony Albino Method of reducing the harmful effects of orally or transdermally delivered nicotine
NZ530238A (en) * 2001-06-08 2004-08-27 Vector Tobacco Ltd Modifying nicotine and nitrosamine levels in tobacco
US6557560B2 (en) * 2001-06-18 2003-05-06 Ctc Canada Inc. Cigarette making machine
KR101581039B1 (ko) 2005-02-28 2016-01-05 22엔디 센츄리 리미티드, 엘엘씨 식물의 니코틴 알칼로이드 수준의 감소
WO2008020333A2 (en) 2006-06-19 2008-02-21 National Research Council Of Canada Nucleic acid encoding n-methylputrescine oxidase and uses thereof
BRPI0717355B1 (pt) 2006-10-13 2018-01-16 North Carolina State University Método para obtenção de uma planta transgênica de nicotina, método para obtenção de uma semente; construto de ácido nucléico recombinante; método de redução da conversão de nicotina em nornicotina em uma planta de nicotina

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
TSO: "Physiology and Biochemistry of Tabaco plants", pages: 233 - 234
WAGNER R ET AL.: "Regulation in Tabacco Callus of enzyme Activities of the Nicotine Pathway", PLANTA, 1986, pages 402 - 407

Also Published As

Publication number Publication date
US20030140366A1 (en) 2003-07-24
AP9901680A0 (en) 1999-12-31
US7795509B2 (en) 2010-09-14
CN1618972A (zh) 2005-05-25
YU64899A (sh) 2004-12-31
JP4459271B2 (ja) 2010-04-28
AU748514B2 (en) 2002-06-06
DE69822463T2 (de) 2005-01-20
EP0991766B1 (en) 2004-03-17
ATE262039T1 (de) 2004-04-15
CN100482799C (zh) 2009-04-29
IL192232A0 (en) 2008-12-29
JP2001522250A (ja) 2001-11-13
HK1065066A1 (en) 2005-02-08
IL132184A0 (en) 2001-03-19
GEP20032871B (en) 2003-01-27
US7304220B2 (en) 2007-12-04
JP2009112316A (ja) 2009-05-28
NO996169D0 (no) 1999-12-13
GR20010300003T1 (en) 2001-06-29
US20040168211A1 (en) 2004-08-26
SI20215A (sl) 2000-10-31
BR9810870A (pt) 2000-11-14
PL337442A1 (en) 2000-08-14
EP1457562A1 (en) 2004-09-15
BRPI9810870B1 (pt) 2021-06-01
ES2154624T3 (es) 2004-11-01
EE9900575A (et) 2000-08-15
US20060191036A1 (en) 2006-08-24
SI20215B (sl) 2007-04-30
HK1069411A1 (en) 2005-05-20
SK161899A3 (en) 2000-06-12
AU7829198A (en) 1998-12-30
CA2287776C (en) 2012-04-03
CN1304576C (zh) 2007-03-14
EP0991766A1 (en) 2000-04-12
BG64319B1 (bg) 2004-09-30
US20060191035A1 (en) 2006-08-24
HK1027379A1 (en) 2001-01-12
ID29311A (id) 2001-08-16
US20020108151A1 (en) 2002-08-08
EE04595B1 (et) 2006-02-15
EA009898B1 (ru) 2008-04-28
TR199902728T2 (xx) 2000-09-21
BG103886A (en) 2000-07-31
AP1169A (en) 2003-06-30
LV12507B (en) 2000-11-20
CA2287776A1 (en) 1998-12-17
JP2004290201A (ja) 2004-10-21
EA004652B1 (ru) 2004-06-24
IL132184A (en) 2010-11-30
CU23174A3 (es) 2006-09-22
DE69822463D1 (de) 2004-04-22
EP1457563B1 (en) 2012-08-08
LT99142A (lt) 2000-06-26
CN1257542A (zh) 2000-06-21
NO324872B1 (no) 2007-12-17
KR100365969B1 (ko) 2002-12-26
EA200000007A1 (ru) 2000-06-26
US7605308B2 (en) 2009-10-20
HUP0003767A2 (hu) 2001-02-28
KR20010013663A (ko) 2001-02-26
US6586661B1 (en) 2003-07-01
NZ500963A (en) 2001-09-28
PT991766E (pt) 2004-08-31
RO121968B1 (ro) 2008-09-30
WO1998056923A1 (en) 1998-12-17
US7645925B2 (en) 2010-01-12
ES2154624T1 (es) 2001-04-16
CZ297379B6 (cs) 2006-11-15
US7425670B2 (en) 2008-09-16
EP1457563A1 (en) 2004-09-15
OA11219A (en) 2003-07-17
CZ367799A3 (cs) 2000-04-12
UA72187C2 (uk) 2005-02-15
JP4288206B2 (ja) 2009-07-01
NO996169L (no) 1999-12-13
HU225888B1 (en) 2007-11-28
US20060200872A1 (en) 2006-09-07
EA200400186A1 (ru) 2004-08-26
US20070011774A1 (en) 2007-01-11
DE991766T1 (de) 2002-04-04
HUP0003767A3 (en) 2002-10-28
PL201266B1 (pl) 2009-03-31
US7408098B2 (en) 2008-08-05
JP2008131950A (ja) 2008-06-12
RS49677B (sr) 2007-11-15
DK0991766T3 (da) 2004-07-12
CA2484366A1 (en) 1998-12-17
EP1457562B1 (en) 2012-08-08
US6423520B1 (en) 2002-07-23
JP4095678B2 (ja) 2008-06-04
LV12507A (en) 2000-06-20

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CA2287776C (en) Regulation of quinolate phosphoribosyl transferase expression
AU2002300895B2 (en) Regulation of quinolate phosphoribosyl transferase expression
AU2004203879B2 (en) Regulation of quinolate phosphoribosyl transferase expression
MXPA99011625A (en) Regulation of quinolate phosphoribosyl transferase expression

Legal Events

Date Code Title Description
MM9A Lapsed patents

Effective date: 20080610