CN1288248C - 烟草生物质的用途 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种发酵生产乙醇的方法，包括提供低烟碱重组烟草植物或其部分，将植物或其部分置于发酵容器中发酵足够长的时间以从中生产乙醇；然后从发酵容器中收集乙醇。本发明还公开了一种维持动物对象的方法，包括给动物体饲以低烟碱重组烟草植物或其部分。本发明还公开了一种从植物生物质中生产蛋白级分的方法，包括提供低烟碱重组烟草植物或其部分，随后从低烟碱重组烟草植物或其部分中收集蛋白级分。
Description
发明领域
本发明提供了将低烟碱烟草用作(除了其他用途外)蛋白，纤维，乙醇和动物饲料来源的方法。
发明背景
烟草植物可被有效地用以获得大量生物质。这些生物质可以通过在田地里将烟草种子简单而紧密地直接种植在一起来生产。由于烟草在割除后再生旺盛，因此种植烟草的田地可以在烟草植物长至18至24英寸的高度时即进行收割(传统烟草植物一般在大约4英尺时收割)，稠密的新生植物即会替代被刈除的植物。如果植物在每一个收割季节按这样的方式被收割3至4次，那么每英亩即可生出大约100吨的烟草生物质。在脱去80％至90％的水分后，正如大部分植物包含的，保留的干燥固体重量大约为10-20吨。除了能高效生产生物质以外，烟草还是一种具有非常多用途的植物。与谷类，如小麦和玉米不同的是，烟草不缺乏必需氨基酸。烟草是一种基本无过敏原的蛋白来源，所述蛋白含有对人类和大部分家畜非常重要的全部20种氨基酸，而且含有高比例的可消化糖和淀粉。烟草还是一种高级食用纤维源，反刍动物对其有比羊茅(fescue hay)更好的消化能力。烟草的纤维容量要比苜蓿和麦麸高很多。通过种植烟草生物质，优质农田可转向种植其他农植物：这对耕地有限的国家或地区具有重要的意义。
因此，提供一种以多产、有效和无毒的方式利用这一植物的新方法具有重要价值。
发明概述
本发明基于如下认识：低烟碱重组烟草能很好地适用于多种替代用途，包括但不限于：(a)作为给家畜及类似动物的草料农作物；(b)作为动物的饲料或饲料成分；(c)作为蛋白来源；(d)作为添加至动物饲料和食品中的纤维来源；(e)作为乙醇发酵生产中的底物；(f)作为通过“分子农业(molecular farming)”技术生产的重组或转基因蛋白来源；(g)为完成两个或两个以上前述用途的基于单一植物，或批量或大批量植物的联合步骤。
通常，用于实施本发明的低烟碱重组烟草植物包含并表达至少编码烟草中烟碱生物合成所需酶的一个片段的异源DNA，该烟草植物与未转化的对照植物相比，表现为减低的酶水平和减低的烟碱含量。在一个优选实施例中，该烟草植物与未转化的对照植物相比，更进一步表现为还原糖水平的增加。
本发明的第一个方面为一种生产乙醇的方法，包括：提供上述低烟碱重组烟草植物；将该植物置于发酵容器中发酵足够长的时间以从中生产乙醇；随后从发酵容器中收集乙醇。术语“植物”包括其物理和化学部分，比如植物各部分以及植物提取物，水解产物等。
在上面所述生产乙醇的方法中，其还包含在所述发酵步骤之前或之后从所述植物或植物部分中收集蛋白级分的步骤。
本发明的第二个方面为一种维持动物对象的方法，包括：饲以动物体上述低烟碱重组烟草。饲养可以采用任何适用的方式，如饲以动物体包含烟草的饲料农作物；饲以动物烟叶；饲以动物包含烟草的青贮饲料；和/或饲以动物包含烟草的食品，可任意地与至少一种附加营养剂联合使用。
本发明的第三个方面为一种食品，其包括低烟碱重组烟草植物。该食品可被制成任何适用形式，如青贮饲料或与至少一种附加营养剂联合使用的烟草植物。该食品可包括叶子(即，来自植物的可辨别的叶子或叶子碎片或植物碎片)或其他从植物中分离的级分。
本发明的第四个方面为一种从植物生物质中生产蛋白级分的方法(举例来说，级分I蛋白和/或级分II蛋白)，包括如下步骤：提供上述低烟碱重组烟草植物，然后从重组烟草植物中收集蛋白级分。
本发明的更进一步的方面包括将上述低烟碱重组烟草植物用作分子农业的用途。
本发明的前述和其他目标及方面将在如下表述中给出更详细的解释。
优选实施例详述
用于本方法的植物为烟草属植物，或烟草，包括但不限于普通烟草(Ntabacum)，黄花烟草(Nrustica)，心叶烟草(Nglutinosa)。此处涉及的“烟草”意指和包括烟草属的任意植物，种类，或杂合体。任何品系或种类的烟草都是可用的。优选的是已经表现为低烟碱含量的品系，如Nic1/Nic2双突变体。该植物通过下面更为详述的转基因方法进行修饰以减低其烟碱含量。
如本文所使用的，涉及的“低烟碱”意指包含少于生产转基因植物的非转基因亲本(或无修饰的对照)植物中烟碱含量一半，优选少于25％，更优选少于20％或少于10％烟碱含量的重组(或转基因)烟草。与相应非修饰对照植物相比，可以在本发明所用的转基因植物中保留至少1％或5％级别的低水平的烟碱残余量。
需要特别指出的是，纳入本文作为参考的全部美国专利均为整体引用。
A.低烟碱烟草植物
用来实施本发明的低烟碱烟草植物一般地为包含并表达异源核酸的重组烟草植物，所述异源核酸的表达可以减量调节植物中的酶，如：喹啉酸转磷酸核糖基酶(quinolate phosphoribosyl transferase)(QPRTase)，腐胺甲基转移酶(PMTase)，精氨酸脱羧酶，鸟氨酸脱羧酶，S-腺苷甲硫氨酸合成酶，NADH脱氢酶，或磷酸核糖邻氨基苯甲酸异构酶，从而可以减少植物中烟碱的生成。适用的植物已被公开于M.Conkling等的PCT申请WO98/56923(1998年12月17日公布)和M.Timko的PCT申请WO00/67558(2000年11月16日公布)中，这一公开的内容纳入本文作为参考。一般的，异源核酸包括编码待减量调节的酶的核酸的至少一个片段，该片段以有义或反义方向存在。
优选地，低烟碱烟草还包括减低的(例如，至少90％，95％或99％重量百分比，或更高)烟草特异的亚硝胺水平，这一减低是与没有相应烟碱减少的植物中所含量相比较而言的。
本发明的一个实施例中利用了与非转化对照植物相比具有减低的喹啉酸转磷酸核糖基酶(QPRTase)表达水平的低烟碱重组植物，所述重组植物包含重组植物细胞，该细胞包含外源DNA构建体，该DNA构建体包含，从5’至3’方向，在所述植物细胞中可操作的启动子和编码喹啉酸转磷酸核糖基酶mRNA的至少一个片段的异源DNA，所述异源DNA可操作性地与所述启动子联合，且所述异源DNA可以是有义或反义方向；所述植物与非转化对照植物相比表现为喹啉酸转磷酸核糖基酶(QPRTase)表达水平的减低和烟碱含量的减低。
本发明的另一个实施例可以用与非转化对照植物相比具有减低的腐胺N-甲基转移酶(PMTase)表达水平的低烟碱重组植物，所述重组植物包含重组植物细胞，该细胞包含外源DNA构建体，该DNA构建体包含，从5’至3’方向，在所述植物细胞中可操作的启动子和编码植物PMT mRNA的至少一个片段的异源DNA，所述异源DNA可操作性地与所述启动子联合，且所述异源DNA可以是有义或反义方向的；所述植物与非转化对照植物相比表现为PMT表达水平的减低和烟碱含量的减低。其他实施例同样可以用上面列举的其他酶用上述相似的方法来实施。
前述核酸构建体可包括上游(5’端)和/或下游(3’端)的绝缘子元件，举例来说，正如Thompson等的美国专利6,100,448和6,037,525中指出的那样。另外，前述构建体可包括上游和/或下游的基质(或支架)结合区域，举例来说，正如Thompson等的美国专利5,773,695和5,773,689中指出的那样。
虽然本文所述植物通常被描述为含有一个能减量调节烟碱合成途径中单个酶的单个重组核酸，但很清楚，本发明所使用的植物也可含有多种能减量调节烟碱合成途径中多个酶(例如，PMTase和QPRTase)的重组核酸。所述包含单个重组核酸的植物因此也包括那些含有多个重组核酸的。
因此，本发明的另一个实施例中使用同时包含与非转化对照植物相比减少的QPRTase和减少的PMTase的低烟碱重组植物，所述重组植物包含重组植物细胞，该细胞包含：(i)第一外源DNA构建体，该DNA构建体包含，从5’至3’方向，在所述植物细胞中可操作的启动子和编码植物喹啉酸转磷酸核糖基酶mRNA的至少一个片段的异源DNA，所述异源DNA可操作性地与所述启动子联合，(ii)第二外源DNA构建体，该DNA构建体包含，从5’至3’方向，在所述植物细胞中可操作的启动子和编码植物PMT mRNA的至少一个片段的异源DNA，所述异源DNA可操作性地与所述启动子联合，且所述异源性DNA可以是有义或反义方向的；所述植物与非转化对照植物相比表现为PMT表达水平的减低和烟碱含量的减低。在所述有义和反义减量调节的情况下，其他技术如核酶或干预性互补mRNA也是可以使用的。
可用于实施本发明的核酸序列实例包括，但不限于，编码烟草喹啉酸转磷酸核糖基酶基因的DNA(NtQPT1)，其为已知的(参见，如，Conkling等的PCT申请WO98/5556923；和编码烟草腐胺N-甲基转移酶的DNA如PMT1，PMT2，PMT3和PMT4)，编码烟草精氨酸脱羧酶的DNA如ADC1和ADC2，编码烟草鸟氨酸脱羧酶(ODC)的DNA，编码烟草S-腺苷甲硫氨酸合成酶(SAMS)的DNA，编码烟草NADH脱氢酶的DNA，编码烟草磷酸核糖邻氨基苯甲酸异构酶的DNA(其为已知的并被描述于M.Timko等的PCT申请WO00/67558中)。
编码表达上述具有期望酶活性的蛋白的其他DNA序列与上述DNA，或与其他编码上述酶蛋白的DNA序列的杂交条件可以用常规方法予以确定。例如，所述序列的杂交可以在低严格条件或甚至严格条件(如，在编码上述蛋白的DNA的标准原位杂交试验中，杂交条件以洗涤条件表示为0.3M NaCl，0.03M柠檬酸钠，0.1％SDS，温度为60℃或甚至是70℃。参见J.Sambrook等，Molecular Cloning，A LaboratoryManual(第2版.1989)(冷泉港实验室))下进行。通常，此类序列与前述序列或编码前述蛋白的DNA序列相比，有至少65％的相似性，75％的相似性，80％的相似性，85％的相似性，90％的相似性，或甚至95％的相似性，或更高的相似性。(可以通过利用两个比对以获得最大匹配程度的序列来确定序列相似性，匹配的两序列的任一个中的缺口在做最佳匹配时均被考虑在内。优选的缺口长度为10或小于10，更优选的缺口长度为5或小于5，而更优选的缺口长度为2或小于2)。
本发明方法所使用的异源序列可经选择以便生成与编码酶序列的完整信息，或其部分互补的RNA产物。序列可互补于天然信使RNA的任何连续序列，即，其可以与内源mRNA序列互补于接近5’端或加帽位点，加帽位点的下游，在加帽位点与起始密码子之间，并且可以覆盖全部或部分非编码区，跨过非编码区和编码区，互补于全部或部分编码区，互补于编码区的3’端，或互补于mRNA的3’非翻译区。适用的反义序列可以为从约12，14或15至约15，25或35个核苷酸，至少约为50个核苷酸，至少约为75个核苷酸，至少约为100个核苷酸，至少约为125个核苷酸，至少约为150个核苷酸，至少约为200个核苷酸或更多个核苷酸。另外，序列可在其3’或5’端延伸或缩短(例如，增加1至4或8个额外的核酸残基)。反义产物可互补于天然存在的靶RNA的编码或非编码(或两者)部分。特定的反义序列和反义序列的长度将会根据需要的抑制程度，反义序列的稳定性等而变化。本领域普通技术人员在本领域现有技术以及本文提供的信息中可以得到选择适当的酶反义序列的提示。
如上述，本发明还能使用实施了有义共抑制烟碱生成的植物来实施。用于实施本发明的有义DNAs，当其在植物细胞中表达时，具有适用于能抑制所述植物酶在植物细胞中天然表达的长度。该有义DNAs可以基本上是完整基因组或编码酶的互补DNA，或其片段，所述片段的典型长度为至少15个核苷酸。本领域普通技术人员可以在现有技术中获得确定抑制细胞中天然基因表达的有义DNA长度的方法。本发明还可用包含编码由反义序列和有义序列互补组成的双链RNAs的DNAs的植物进行实施，该序列表达时能够抑制或使包含该序列的内源基因沉默。适用的互补区域可为至少约20至25个核苷酸，且可被至少约5个核苷酸分开。
本发明的另一个实施例中，用包含编码RNA酶分子(即，核酶)的DNA片段的DNA构建体转化烟草属植物细胞，所述RNA酶分子针对(即，剪切)编码所述植物酶的DNA的mRNA转录本。核酶包含底物结合区域，该区域与靶mRNA的可接近区域相结合，还含有催化RNA的剪切，阻止翻译和蛋白生成的结构域。该结合结构域可包括与靶mRNA序列互补的反义序列；该催化基序可为锤头基序或其他基序，如发卡基序。RNA靶的核酶剪切位点可通过扫描寻找靶分子的核酶剪切位点(如，GUA，GUU或GUC序列)来作初始识别。一经识别，与包含剪切位点的靶基因区域相应的15，20，30或更多个核苷酸的短RNA序列可被评估以确定预期的结构特征。候选靶标的适用性同样可以通过使用本领域公知的核糖核酸酶保护实验来检测其与互补寡核苷酸杂交的可实现性从而得到评价。编码核酶分子的DNA可根据公知技术来获得。参见，例如，T.Cech等的美国专利4,987,071；Donson等的美国专利5,589,367；Torrence等的美国专利5,583,032；Joyce的美国专利5,580,967；Wagner等的美国专利5,591,601和美国专利5,622,854。在植物细胞中生成所述核酶分子和中断酶蛋白生成以减低酶活性的方式基本上与生成反义RNA分子的方式相同：也即是说，通过中断mRNA在生成酶的细胞中的翻译来实现。本文中所用术语“核酶”指含有RNA的核酸，其具有酶的功能，(如核糖核酸内切酶)，而且可以与“核酶分子”相互替换。
本发明另一个实施例中，减量调节烟碱生成可以通过采用干预性互补mRNA以实现抑制mRNA翻译的方法来实施，所述干预性互补mRNA如美国专利5,272,065中的记载。
为了生产与未转化对照烟草植物相比具有低酶水平的烟草植物(并由此减低烟碱含量)，可以在烟草细胞中转入含有部分酶核酸序列，全长酶核酸序列(有义或反义方向)，适当的可操作性连接的调节序列或编码上述核酶的序列的外源转录单位。合适的调节序列包括在转化的植物中可操作的转录起始序列(“启动子”)，和聚腺苷酸化/转录终止序列。如限制性酶切作图，DNA印迹杂交，和核苷酸序列分析的标准技术被用于确定具有反义方向的并与调节序列可操作性连接的酶序列的克隆。随即用成功转化的细胞生成烟草植物。最优选的，所用的反义序列与内源序列互补，但是，外源或内源序列的较小变异是可以容忍的。优选的，反义DNA序列具有充分的序列相似性，其能够在下述严格条件下与欲调节的细胞中的外源序列相结合。对本领域普通技术而言，生产重组烟草植物的特定技术可以从现有技术中获得，且被详细记载于前面提及的M.Conkling等的PCT申请WO98/56923(1998年12月17日公布)和M.Timko的PCT申请WO00/67558(2000年11月16日公布)中。
B.烟叶作为动物饲料或食品添加剂
本发明的第二个方面为一种维持动物对象的方法，包括：饲以动物体前述低烟碱重组烟草(包括植物和植物部分两者)。可饲以依照本发明的植物(或下述食品)的动物包括哺乳动物(包括反刍动物)，如奶牛，绵羊和猪，还有家禽如鸡和火鸡，鱼和其他。
在一个实施例中，被用作食物，或用于生产食品的植物或植物部分包含前述升高的还原糖水平。
饲养可以采用任何适用的方式，如饲以动物体包含烟草的饲料农作物；饲以动物烟叶；饲以动物包含烟草的青贮饲料；和/或饲以动物包含烟草的食品，并与至少一种附加营养剂联合使用。
本发明的食品包含低烟碱重组烟草植物。该植物可以任何形式包含于食品中，如叶子或切碎的叶子，植物部分(例如，含有还原糖的提取物)，等等。该食品可含有任意适用量的重组植物(或植物部分)例如，从1％，5％或10％至90％，95％或99％的重量百分比(或更大重量比)，余量则包含另外的营养剂或添加剂。该食品可采用任何适用形式，如青贮饲料或烟草植物，其与至少一种附加营养剂联合使用。该食品可包括叶子(即，来自植物的可辨别的叶子或叶子碎片或植物碎片)或其他从植物分离的级分。如有需要，该食品也可被干燥或冻干。当作为饲料农作物时，烟草植物可以简单地通过来自田地里种植的，或干燥的或部分干燥的和捆扎留用的茎秆来喂饲动物，也可选择性地用其他级分处理(参见，例如，Glabe的美国专利4,034,117)，或储藏和至少部分发酵并用于青贮饲料(参见，例如，Glabe等的美国专利4,015,018)。
按照本发明的用作动物食物或用于食品生产的烟草植物可用遗传工程使之含有并表达编码肌醇六磷酸酶的异源核酸，从而使其与无修饰的植物相比，含有提高的肌醇六磷酸酶水平，如S.Austin-Phillips等的美国专利5,900,525中描述的那样(WARF)。
可以与所述植物或植物部分联合使用以生产本发明的食品的其他营养剂或添加剂可包括糖，脂肪，脂类和/或蛋白。用于生产根据本发明的动物饲料的糖源包括，如，谷物，燕麦，大麦，高粱，或其组合。这些谷类优选地磨为粗粉以用于动物饲料。增补性蛋白源包括，例如，大豆粗粉，鱼粗粉，血粗粉，家禽副产品(磨碎的家禽下水)，肉粗粉，羽毛溶解产物(参见，例如，Shin的美国专利4,908,220)以及其组合。动物饲料包含来自全部蛋白源(来自烟草植物及其他)的约13％至约25％重量比的蛋白。植物或植物部分可为单一蛋白源，或如上被增补的。如有需要，饲料中可包含少量的其他营养剂，如维生素，矿物质，抗生素和其他物质或组合物。这些成分可用任何适用步骤混合在一起，并可被制成任何适用的形式，如食物小球。如有需要，烟草可进行转基因修饰以生成所述的附加营养剂。
C.使用烟草的乙醇发酵
从植物材料中生产乙醇或其他物质如丙酮的发酵方法是本领域熟知的。参见，例如，C.Weizmann，Production of Acetone and Alcoholby Bacteriological Processes，美国专利1,315,585(1919)。所需产品可从某些成分，如生物质中的糖，生物质中的纤维素和半纤维素，或二者，中制备。一般来说，糖和淀粉要比纤维素和半纤维素容易发酵。发酵方法可以用很多方法中的任何一种进行实施，下面将举出其中的一些实施方式。认识到发酵可以通过使用未处理的植物材料或植物材料中的多种成分(例如，糖和纤维素级分)来实施，因此当其他成分如蛋白级分从植物材料中分离出以作为其他目的(如下述分离级分I和/或级分II蛋白)时，后者就是优选的。而且，生物质可经预处理以使之适用于特殊的发酵过程，这要依赖于所采用的发酵方法(例如，用酶消化纤维素以制备可溶性糖)。
可用于实施本发明的一个发酵方法的特定实施例已经披露于Jeffries的美国专利4,663,284中，该专利提供了用木糖代谢酵母与D-木糖一起发酵以生产乙醇的方法，在所述发酵方法期间于发酵介质中加入微量葡萄糖。
Gong的美国专利4,511,656提供了一种用酵母突变体发酵D-木糖而直接从D-木糖中生产乙醇的方法。该方法进一步提供了通过酵母发酵D-葡萄糖和D-木糖，从而直接和同时地从纤维素和半纤维素混合物中获得乙醇的方法。
Gong的美国专利4,490,468中提供了一种针对木糖预先异构化得到的木酮糖的厌氧发酵方法。
Gong的美国专利4,368,268中提供了一种从木酮糖中生产乙醇的方法。该方法包括木糖异构化为木酮糖和将木酮糖发酵为乙醇。本质上，该方法是用需氧或厌氧酵母菌突变体，对半纤维素水解产物中的木糖单独或与其他糖一齐发酵。
Wu的美国专利4,840,903提供了一种从植物生物质中生产乙醇的方法。该方法包括从生物质中产生底物，该底物包括纤维素和半纤维素的水解产物。一种拟青霉真菌同时具有将纤维二糖和木糖发酵为乙醇的能力(例如，拟青霉菌种NF1)，该真菌被选用并被分离，然后将其接种于底物上。接种的溶液在利于细胞存活和利于水解产物转化为乙醇的条件下进行发酵，然后从发酵液中回收乙醇。
D.Spindler等的美国专利5,100,791公开了一种从植物生物质中生产乙醇的方法。该方法包括从生物质中产生底物，该底物包含纤维素和半纤维素的水解产物。一种卡斯酒香酵母(Brettanomycescustersii)(CBS 5512)同时具有发酵纤维二糖和葡萄糖为乙醇的能力，该真菌被选用并被分离。然后将其接种于底物上。接种的底物在利于细胞存活和转化水解产物为乙醇的条件下进行发酵。
M.Lastick等的美国专利5,372,939公开了一种从木糖和纤维素混合物中生产乙醇的方法，且在预定条件下用酶将上述这些碳水化合物转化为可发酵的糖。在存在粟酒裂殖糖酵母(Schizosaccharomycespombe)ATCC编号：2476的情况下，同时用纤维素酶转化纤维素为葡萄糖和用木糖异构酶将木糖转化为木酮糖来完成该方法。该酶方法可以允许在同一个发酵过程中用酵母将这些可发酵糖类，葡萄糖和木酮糖转化为乙醇。
前述为可用于实施本发明的发酵方法的说明性描述，但并不是限制性的。很多本领域普通技术人员熟知的其他方法也可用于实施所述的发酵。而且，虽然所述发酵主要是指乙醇生成，但其他溶剂如丙酮也可以用所述发酵方法制得。
D.从烟叶中分离级分I和级分II蛋白
如S.Wildman和P.Kwanyuen(Leaf Porteins Inc.)的美国专利4,347,324和4,268,632中所描述的，特定植物(包括烟草)的多汁叶片，由10％-20％的固型物以及剩余量的水组成。固型物部分由水溶性成分和水不溶性成分组成，对大多数而言，后者为叶片的纤维性结构物质。
水溶性成分可分为两类。一类包括分子量相对较低的化合物。另一类几乎全部是分子量约为30,000道尔顿或更大分子量的蛋白。该类蛋白可分为两部分。一部分包含分子量从大约30,000道尔顿至100,000道尔顿的蛋白混合物。这些蛋白有时被称为“级分2蛋白”。剩余的部分包含分子量约为550,000道尔顿的单一蛋白，其有时被称为“级分1蛋白”。
级分1蛋白是一种与光合作用有关的酶，且已作为核酮糖-1，5二磷酸羧化酶，羧基歧化酶，核酮糖-1，5二磷酸羧化酶，和核酮糖-1，5二磷酸羧化酶-加氧酶而为本领域所熟知。级分1蛋白可以占叶子总蛋白含量的多至25％，占叶子固型物的多至10％。
提纯的级分1蛋白为无嗅，无味，无色，且具有高营养价值。考虑到这些特性，且因为其可获得高纯化状态，级分1蛋白被认为具有作为动物和人的食品添加剂的潜在用途。用于人时，该添加剂可以是高蛋白或其他特定饮食的成分。例如，其已经被建议作为需透析的肾脏病人的食物补充品。
分离级分1蛋白的多种方法是本领域所熟知的。S.Wildman和P.Kwanyuen的美国专利4,347,324和4,268,632中已经描述了分离级分1蛋白的三个基本方法。这三种基本方法都是从将叶子，或植物的叶和茎，浆液化开始，然后从浆液中榨出绿汁。对该包含细碎微粒状绿色物质的绿汁进行澄化处理，如，用过滤或离心的方法进行处理，以便从液体中分离出细碎微粒状固体物质。最终的液体呈褐色。
第一种方法包括，浓缩级分1蛋白，同时用分子过滤的方法将其从褐液中较低分子量的化合物中部分分离出来。通过使用筛孔能够通过较小分子但不能滤过级分1蛋白的分子筛，褐液在压力下过筛，从而使小分子通过筛孔。包含级分1蛋白的溶液随即被浓缩约10倍，然后进行透析处理，以除去溶液中其他小分子。透析过程中使用火棉胶型透析袋。透析袋的筛孔不能通过级分1蛋白但允许小分子通过透析袋进入水中。在透析过程中，级分1蛋白晶体形成。
第二种方法包括，将获自叶子的褐液通过Sephadex层析柱。Sephadex G-25或G-50均可用于该分离过程。选择其内部可以渗透进小分子的合适珠子，从而将大分子排除在外。因此，大分子仅存在于紧密压紧的Sephadex珠子间隙的液体中。该间隙被称为“空体积”。为获得有效的分离，褐液体积不能超过约25％的全部珠子体积。珠子首先用缓冲液平衡，随后包含同样缓冲液的一定量的褐液加于Sephadex柱上。褐液用缓冲溶液经过柱子而进行洗脱。当液体自上而下流经柱子时，由于小分子渗透进珠子内部，因此小分子的通过即被阻滞。另一方面，级分1大分子以较快的速率通过由珠子间隙形成的迷路而流经柱子后，呈现为澄清褐色溶液。但是，洗脱会造成溶液至少2倍的稀释。除去小分子会改变级分1蛋白分子周围的环境，从而引发级分1分子结晶。
第三种方法包含将上述褐液通过Sephadex-G25柱。如果级分1蛋白未发生结晶，象处理烟草以外所有植物提取物那样，则加入硫酸铵直至溶液处于30％-50％的饱和状态。这使得无定型物质沉淀，再用离心方法将其回收。分离后，沉淀重溶于较之沉淀前体积小的缓冲液中，然后加入8％的聚乙二醇。该混合物被置于一开口盘中，该盘与另一含有硅胶的开口盘毗邻，所述两盘置于一密闭容器中。水分逐渐从蛋白溶液中蒸发而被硅胶吸收。在该过程中，级分1晶体增长。
Wildman和Kwanyuen的美国专利4,268,632中公开了一种分离级分1蛋白的方法，包括如下步骤：将叶子浆液化，在低于导致蛋白变性的温度下加热浆液中的液体部分，随后在能使级分1蛋白，即核酮糖-1，5二磷酸羧化酶，结晶的温度下冷却液体部分。Wildman和Kwanyuen的美国专利4,347,324中公开了一种针对前述方法的改进方法，该改进方法中将原先认为很重要的加热步骤去除。在该改进方法中，采用调整来自叶子的浆液的液体部分的pH值的方法来获取晶体形式的核酮糖-1，5二磷酸羧化酶，pH值在如下范围内调整：从约6的pH值至大于能使蛋白变性并沉淀为无定型物质的pH值，即大于等电点(出现于大约pH5.0)的pH值。在分离出不溶的物质后，静置所述液体，优选的在低于环境温度下冷却，从而使得级分1蛋白结晶。
D.Bourque(University Patents，Inc.)的美国专利4,400,471中公开了一种从光合作用生物中结晶级分I蛋白的方法，所述方法包括：从植物中分离并纯化蛋白；在适用溶剂中混合蛋白，于预定pH下制得蛋白溶液；将沉淀液与蛋白溶液混合，所述沉淀液具有低于蛋白溶液的pH值，其范围为4.8至7.2，从而使混合溶液的pH处在6.6至7.0的范围内；然后从混合溶液中除去部分溶剂，从而使蛋白发生结晶。
S.Johal的美国专利4,400,471中公开了一种从植物材料如烟叶中制备核酮糖-1，5二磷酸羧化酶(RuBisCO)的方法，所述方法包括如下步骤：在水溶液中粉碎植物材料而制成悬液；分馏悬液以从植物材料渣滓中释放RuBisCO至溶液中；在溶液中加入足够量的聚乙二醇(PEG)从而使RuBisCO晶体选择性形成，所述晶体中含有杂质；从溶液中分离晶体；于水中重溶晶体；将重溶的晶体通过阴离子交换树脂床；洗涤交换柱以去除未结合物质；将含有预定浓度二价金属离子的单一溶液在足以选择性从树脂上洗脱出RuBisCO的浓度下通过交换柱。同样参见S.Johal的美国专利4,588,691。
级分II蛋白可以在分离级分I蛋白的期间从分离级分I蛋白后残留的可溶的蛋白中分离出来，或使用从上述关于分离级分I蛋白的描述中可以显而易见得到的其他技术。
E.分子农业
如M.Conkling等的PCT申请WO98/56923中的描述，低烟碱生成水平的，或无烟碱生成的烟草植物，被认为可作为表达有商业价值的产品如药物，化妆品成分，或食品添加剂的转基因受体。分子农业适用的技术被描述于，除其他文献外，Goodman等(Calgene)的美国专利6,096,547；5,629,175和5,550,038中。烟草作为将编码所需产品基因转入的受体植物是很有吸引力的，因为烟草易进行基因工程操作，而且每英亩能够产出非常多的生物质；因此，具有减少的烟碱生成源的烟草植物将会具有生产转基因产物的更多的可用资源。用生产所需产品的转基因转化烟草的方法是本领域所熟知的；任何适用的技术都可以用于本发明的低烟碱烟草植物。
可以通过转基因编码并在上述烟草植物(包括描述于PCT申请WO00/67558中的烟草)中表达的所需产品例子包括，但不限于，哺乳动物的，特别是人类的，蛋白和肽，如白介素-1(IL-1)，IL-2，IL-3，IL-4，IL-5，IL-6，IL-7，IL-8，IL-9，IL-10，IL-11，IL-12和其他淋巴因子，促红细胞生成素或EPO，干扰素如α，β和γ干扰素，生长因子如G-CSF，GM-CSF，和M-CSF，血液因子如因子I至XII，特别是凝血因子VIII和IX，组织型纤溶酶原激活因子或tPA，胰岛素样生长因子，表皮生长因子，血小板衍生生长因子，转化生长因子-α，β等，生长激素，胰岛素，胶原蛋白型纤溶酶原激活因子，组织相容性抗原，受体，受体拮抗剂，抗体，单链抗体，酶，神经多肽，抗原，疫苗，肽激素，降钙素，人生长激素，和肌醇六磷酸酶，还有抗微生物肽或蛋白如，protegrins，爪蟾抗菌肽，杀菌肽，尾孢菌素，蜂毒素，indolicidins，defensions，β-防御素，cryptdins，clavainins，植物防御素，nicin，bactenecins等。
与涉及烟碱合成通路中的酶的构建体相似的，被插入烟草植物中的编码前述蛋白和肽的构建体可包括上述构建体上游(5’方向)和/或下游(3’方向)的绝缘子元件，例如，参见Thompson等的美国专利6,100,448和6,037,525中的记载，或可包含前述构建体上游和/或下游的基质(或支架)结合区域，例如，参见Thompson等的美国专利5,773,695和5,773,689中的记载。
转基因蛋白或肽可用任何适用技术从重组植物中收集，一般包括压碎或磨碎植物或植物部分，如叶子，用适用溶剂提取蛋白或肽，然后用纯化技术如层析法分离蛋白或肽，方法的选择要依赖于需要分离的蛋白或肽的特性。S.Garger等(Biosource Technologies Inc.)的美国专利6,037,456中公开了一种从植物中获取可溶性蛋白或肽的方法，所述方法包括如下步骤：(a)将植物均质化以制备绿色汁液匀浆；(b)调整绿色汁液匀浆的pH值低于或等于约5.2(例如，从约4.0至5.2)；(c)加热绿色汁液匀浆至最少约45℃(例如，在约45-50℃之间)；(d)离心绿色汁液匀浆以获取上清(并且随后可选择地将上清经过一个或一个以上超滤步骤的处理)；和(e)从上清中纯化蛋白或肽(例如，采用层析法，基于亲和的纯化方法或盐析法)。适用的蛋白例子包括，但不限于，由上述转基因编码的蛋白。应当清楚的是，某些蛋白或肽并不需要从植物或植物部分中分离出来，当该蛋白或肽作为饲料成分与植物包含在一起时。
下述非限制性实施例对本发明作更进一步的描述。
实施例1
与亲本系比较的Vector Burley 21-41的烟碱和还原糖水平
低烟碱的烟草品种，Vector Burley 21-41，是用二元农杆菌载体pYTY32转化Burley 21 LA种而制得的，其描述于按照专利合作条约公布的国际申请WO98/56923中。Burley 21 LA种是与Burley 21相比烟碱水平充分减低的Burley 21的一个品种，(即，Burley 21 LA的烟碱水平为Burley21的8％，参见Legg等，(1971)Can.J.Genet.Cytol.13：287-91；Legg等，(1969)J.Hered.60：213-17)。Vector Burley 21-41与其亲本系，Burley 21 LA，是非常相似的。通常Vector Burley 21-41与Burley 21 LA在除生物碱含量(例如，烟碱和去甲烟碱)和还原糖含量以外的其他全部测评特性上都是相似的。Vector Burley 21-41可凭借其明显减少的烟碱，去甲烟碱和总生物碱含量与其亲本系Burley 21 LA相区分。如下显示，Vector Burley 21-41中总生物碱浓度减低至接近其亲本系Burley 21LA 10％的水平。Vector Burley 21-41与其亲本系Burley 21 LA相比，烟碱和去甲烟碱的浓度分别低于大约6.7％和32％。因此，VectorBurley 21-41的烟碱浓度相当于Burley 21烟碱水平的0.54％。如下面表1所示，出乎意料地发现Vector Burley 21-41与Burley 21 LA相比，还含有更高的(+87％)还原糖水平(约为10.29％对5.51％)。因而，发现Vector Burley 21-41中含有高于其亲本大约90％的还原糖，这使得该植物更适用于本发明所述的用途，特别是生产乙醇的发酵方法中。
表1：Vector Burley 21-41与Burley 21 LA间的比较
| Vector Burley21-41 | 处理启动子对照 | Burley 21 LA | |
| 从移植到开花的天数(天)开花时高度(cm)产量(kg/ha)％烟碱(×102)％去甲烟碱(×102) | 57.1±3.6*118.6±20.1*890.3±70.7*1.44±0.66**0.4±0.1** | 56.7±3.4*112.1±21.4*780±68.5*19.12±8.99*1.56±0.22* | 57.6±3.4*110.8±19.5*809.2±71.2*21.54±9.34*1.27±0.52* |
| ％总生物碱％总氮％还原糖 | 0.23±0.07**2.52±0.78*10.29±0.89** | 2.07±0.93*2.96±0.42*5.87±2.04* | 2.31±0.94*2.64±0.91*5.51±2.40* |
数据来自中央农作物研究站(克莱顿，NC.)的2000农田试验。使用去顶的植物进行化学分析。重复15次/每次10株植物。数据分析使用T检验。
*＝无显著性差异，**＝1％水平的显著性。
前述数据可作为本发明的例证，但并不应理解为对本发明的限制。本发明被限定为如下权利要求，及包含在其内的权利要求相等物。
Claims (11)
1.一种发酵生产乙醇的方法，该方法包括以下步骤：
提供低烟碱重组烟草植物或其部分；
将所述植物或其部分置于发酵容器中，以足以从中生产乙醇的时间进行发酵；然后
从所述发酵容器中收集所述乙醇。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述低烟碱重组烟草植物与生成所述重组植物的亲本植物相比，表现为低烟碱。
3.根据权利要求2所述的方法，其中所述低烟碱重组烟草植物或植物部分包含并表达能在所述重组植物中减量调节烟碱生产的异源核酸。
4.根据权利要求1所述的方法，其中所述低烟碱重组烟草植物或植物部分与生成所述重组植物的亲本植物相比，包含增高的还原糖量。
5.根据权利要求1所述的方法，其中所述低烟碱重组烟草植物或植物部分包含并表达编码烟草中烟碱生物合成所需酶的至少一个片段的异源DNA，所述重组植物与未转化对照植物相比，表现为所述酶水平降低，烟碱含量降低和还原糖增高。
6.根据权利要求5所述的方法，其中所述酶选自喹啉酸转磷酸核糖基酶，腐胺N-甲基转移酶，精氨酸脱羧酶，鸟氨酸脱羧酶，S-腺苷甲硫氨酸合成酶，NADH脱氢酶，和磷酸核糖邻氨基苯甲酸异构酶。
7.根据权利要求1所述的方法，其中所述低烟碱重组烟草植物或植物部分与未转化对照植物相比，喹啉酸转磷酸核糖基酶的表达水平降低，所述重组植物包含重组植物细胞，所述细胞包含：
外源DNA构建体，该DNA构建体包含，从5’至3’方向，在所述植物细胞中可操作的启动子和编码植物喹啉酸转磷酸核糖基酶mRNA的至少一个片段的异源DNA，所述异源DNA可操作性地与所述启动子联合，且所述异源DNA可以是有义或反义方向的；
所述重组植物与非转化对照植物相比表现为喹啉酸转磷酸核糖基酶表达水平的减低和烟碱含量的减低。
8.根据权利要求1所述的方法，其中所述低烟碱重组烟草植物或植物部分与未转化对照植物相比，腐胺N-甲基转移酶的表达水平降低，所述重组植物包含重组植物细胞，所述细胞包含：
外源DNA构建体，该DNA构建体包含，从5’至3’方向，在所述植物细胞中可操作的启动子和编码植物腐胺N-甲基转移酶mRNA的至少一个片段的异源DNA，所述异源DNA可操作性地与所述启动子联合，且所述异源DNA可以是有义或反义方向的；
所述重组植物与非转化对照植物相比表现为腐胺N-甲基转移酶表达水平的减低和烟碱含量的减低。
9.根据权利要求1所述的方法，其中所述植物或植物部分包含纤维素。
10.根据权利要求1所述的方法，其中所述植物或植物部分包含还原糖。
11.根据权利要求1所述的方法，更进一步包含在所述发酵步骤之前或之后从所述植物或植物部分中收集蛋白级分的步骤。
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