CN101255421A - 一种转基因水稻制剂的制备方法和用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种转基因水稻制剂的制备方法和用途，其步骤是：A.水稻特异性启动子及信号肽的获得；B.获得水稻遗传密码子的人GM－CSF基因；C.水稻基因遗传转化和高表达转基因植株的筛选；D.转基因水稻种子的加工。一种转基因水稻种子作为制备治疗或预防白细胞减少症的的药物中的应用。方法简单，成本低廉，安全性能好，疗效好，无副作用。由于重组rhGM－CSF在水稻米粉中储藏，又是人类的主要食物，制成的口服片剂不需要纯化步骤，不含任何人类的病原菌和病毒，安全可靠。利用该片剂具有刺激白细胞增殖，提高体内免疫能力，恢复因癌症的化疗和放疗导致白细胞减少而引起的免疫能力下降的作用。

Description

一种转基因水稻制剂的制备方法和用途

技术领域

本发明属于生物医药领域的基因工程产品，更具体地涉及一种转基因水稻种子的制备方法，利用水稻胚乳特异性表达表到平台，在水稻种子中高效表达人巨噬粒细胞集落刺激因子(rhGM-CSF)，然后将转基因水稻种子直接作为口服剂，对因癌症的化学治疗和放射性治疗引起的白细胞减少症(Leucopenia)、自体和异体骨髓移植以及再生障碍引起贫血和烫伤引起的骨髓功能衰竭和血小板减少、治疗白血病、贫血和癌症时缓解白在血球缺乏等药物中的应用。

背景技术

人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(Granulocyte Macrophage ColonyStimulating Factor，GM-CSF)基因由127个氨基酸组成，是人体内少量分泌的蛋白质，粒细胞巨噬细胞集落刺激因子在人体的T细胞、B细胞、巨噬细胞、肥大细胞、内皮细胞、成纤维细胞中产生，具有多种生物学活性，对中性细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、巨噬细胞等具有促进作用，在体内可促进造血功能和减低血清胆固醇等功能。在临床上主要用于二次性化疗和放疗导致的中性粒细胞减少症、自体和异体骨髓移植以及再生障碍引起贫血和烫伤引起的骨髓功能衰竭和血小板减少。在治疗白血病、贫血和癌症时，用于缓解白血球缺乏现象，提高免疫力具有显著疗效。

人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子主要是针对癌症病人的放射、化学治疗后的辅助治疗，当病人放射、化学治疗后，白细胞急剧下降，抵抗力减弱，注射GM-CSF能很快使白细胞上升，提高免疫能力。通常采用纯化后的人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子用于这些病人的治疗，在国际上只有利用纯化的人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子作为口服液有效地治疗白细胞减少症的报道，但直接利用没有纯化的重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子来提高白细胞产量和恢复白细胞减少症的报道。

癌症是中国第一位的非传染病疾病，患者随着生活水平的提高和环境污染呈相当快的速度增长，在癌症患者的化学或放射性治疗中，为了减轻在化疗和放射疗法导致的白细胞减少而产生的免疫能力降低，重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子总是作为辅助治疗，在最大限度的降低因化疗或放射疗法产生的副作用。由于利用DNA重组技术在细菌和酵母中表达重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子一致存在表达量低的问题，加上需要纯化等步骤，因而在市场上的重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子的价格十分昂贵。此外，目前重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子均采用注射方法，使用时也十分不便。

发明内容

本发明的目的是在于提供了一种转基因水稻制剂的制备方法，其方法简单，成本低廉，安全性能好，疗效好，无副作用等优特点。

本发明的另一个目的是在于提供了一种转基因水稻制剂在制备治疗或预防白细胞减少症的药物中的应用，利用以人类的主要食物稻米为药物表达受体，在胚乳细胞高效表达重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子蛋白，没有任何病原菌污染和副作用，安全可靠，可以直接利用。利用含有重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子蛋白转基因水稻种子，然后利用这些水稻种子制成口服制剂，通过小肠绒毛细胞对小分子蛋白吸收功能，达到刺激体内白细胞的增殖，达到因癌症的化疗和放疗导致白细胞减少而引起的白细胞减少症、自体和异体骨髓移植以及再生障碍引起贫血和烫伤引起的骨髓功能衰竭和血小板减少和治疗白血病、贫血和癌症。该发明针对现有治疗放疗和化疗药物采用注射方法使用不方便的弊病，以基因工程技术在水稻种子表达人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子，改常规注射方式为口服方式，不仅省去了人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子纯化加工等步骤，还可降低药品价格。

为了实现上述目标，本发明采取了以下技术措施：

A、水稻特异性启动子及信号肽的获得。为了获得较强的水稻胚乳特异性表达的启动子和信号肽，根据蛋白组学的研究，发现水稻储藏蛋白的醇溶谷蛋白基因家簇中的一个成员Gt13a基因在水稻胚乳细胞的蛋白质表达量为最高，推导这个基因成员具有较强的启动子活性。为了获得Gt13a启动子和它的信号肽序列，根据基因数据库的Gt13a(Accession No AP003256)的核苷酸序列，通过PCR技术获得水稻胚乳特异性的启动与信号肽。

B、获得水稻遗传密码子优化的人GM-CSF基因。为了使重组蛋白在水稻胚乳获得较高的表达，采用了水稻偏爱的遗传密码子，从美国生物技术信息中心(NCBI)基因库里获得了成熟的GM-CSF基因(GenBank accession No.CAA01491)的氨基酸序列，由DNA分析软件MacVector(英国的Accelrys公司)将GM-CSF基因的氨基酸序列转换成含有优化水稻遗传密码子的核苷酸序列，人工合成了人GM-CSF基因，一种分离的蛋白质，其序列为SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。

C、水稻基因遗传转化和高表达转基因植株的筛选。利用基因枪的转化方法，获得大量的转基因水稻植株。转基因水稻经过4个月的生长和发育后，抽穗开花后，经一个月的时间，形成成熟的转基因水稻种子。其中56株转基因产生正常结实。当T1种子收获后，利用蛋白质检测技术---酶联免疫(ELISA)药盒(美国U-cytech bioscience公司)检测技术，筛选高表达重组GM-CSF的转基因植株。

D、转基因水稻种子的加工：转基因水稻成熟后，按常规方法收割。经谷物砻谷机去壳后形成糙米，然后将糙米碾磨成60-80目的米粉，经装囊机加工成1.5克含1毫克rhGM-CSF的口服胶囊或片剂和含10毫克的rhGM-CSF 15克冲剂/包的口服冲剂。

本发明的主要优点有：

本发明利用基因工程的方法，利用大众食物-水稻稻米作为载体，利用谷物胚乳特异性蛋白表达的技术平台，在水稻胚乳中高效表达rhGM-CSF蛋白，并加以直接利用，不仅简化了重组蛋白的纯化工序，还克服了因表达体系不同而引起的蛋白糖苷化修饰不同，在用作注射液而可能引起的体内免疫反应具有成本低廉，安全可靠，没有任何病原菌污染。

本发明直接利用转基因水稻米粉制成口服制剂，以口服的形式取代使用极不方便的注射法，不仅使用方便、实用性强，具有广阔的应用前景。

附图说明

图1、胚乳特异性表达rhGM-CSF的载体示意图。一个人的GM-CSF基因(GenBank Accession No.CAA02621)采用水稻偏爱密码子人工合成。克隆到一个中间质粒中，中间质粒经内切酶SchI和XhoI后，连接到pOsPMP02(Gt13a-sp-Stuff-Nos)质粒中，产生一个水稻胚乳特异性表达质粒pOsPMP07。

图2、高效表达rhGM-CSF的转基因水稻种子与分子证据。转基因水稻种子用1毫升的蛋白提取液提取，20微升上样在12％聚丙烯酰胺凝胶电泳，通过蛋白质印迹法可检测到hGM-CSF带，后经酶联免疫检测，其表达量每粒种子达到13.65微克。

图3、制成重量为1.5克/片，rhGM-CSF含量为1mg/片的口服片剂样品。

图4、利用转基因水稻粗提物促进CHO细胞生长的效果。当50微升转基因水稻种子的提取物，相当于50微克标准GM-CSF对细胞促进作用。表明转基因水稻种子的提取物具有相同的促进细胞生长的结果。

图5、喂食转基因水稻米粉片剂的小鼠治疗白细胞减少症的效果。当给糖尿病小鼠直接喂养转基因稻米14天后，小鼠的白细胞从1.17×10⁹/升增加到9.37×10⁹/升，而对照组仅仅增加到6.83×10⁹/升，喂养转寄因稻米比对照组了27.33％。，达到显著水准(t＝0.021)。用转基因水稻稻米喂养正常小鼠时，白细胞含量增加了10.54×10⁹/升，比对照组增加了37.07％，达到了极显著水准((t＝0.002)。

具体实施方式

实施例1：克隆水稻胚乳特异性启动子和信号肽

为了获得较强的水稻胚乳特异性表达的启动子和信号肽，根据蛋白组学的研究，发现水稻储藏蛋白的醇溶谷蛋白基因家簇中的一个成员Gt13a基因在水稻胚乳细胞的蛋白质表达量为最高，推导这个基因成员具有较强的启动子活性。为了获得Gt13a启动子和它的信号肽序列，根据基因数据库的Gt13a(GenBankAccession No.AP003256)合成了一对核苷酸引物5’-ccaagcttcaacctgctgagaagaacaactgac-3’和5’-cggtgccggc tagagagccattgcacaagag-3’用于PCR扩增。为了便于基因克隆，在正向引物的5‘端加入了一个HindIII的酶切位点，在反向引物的5’加了一个NaeI的酶切位点。从水稻品种台北309叶片中提取基因组DNA，以DNA为模版，按照标准的PCR程序，利用上述引物扩增出了一个1284碱基的DNA片段(SEQ ID NO：1)，经DNA序列分析，具有明显的启动子结构和GenBank的序列相同。但比Gt1启动子，具有明显的差异，其AT含量明显高于现有的Gt1启动子。

实施例2：合成具有水稻遗传密码子优化的人GM-CSF基因。

从美国生物技术信息中心(NCBI)基因库里获得了成熟的GM-CSF基因(GenBank accession No.CAA01491)的氨基酸序列，由DNA分析软件MacVector(英国的Accelrys公司)将GM-CSF(GenBank accessionNo.CAA01491)基因的氨基酸序列转换成含有优化水稻遗传密码子的核苷酸序列，人工合成了人GM-CSF基因(SEQ ID NO：1)。经密码子优化后的人GM-CSF基因的核苷酸序列改变了25.5％。遗传密码改变了71.1％。在人工合成的GM-CSF基因的两端分别加上了限制性内切酶MylI和XhoI，然后克隆到pUC19载体(美国的ClontechInc公司)，产生了带有重组GM-CSF基因的载体；经限制性内切酶MylI和XhoI消化，在5‘端为产生了一个平齐末端和在3’末端产生了一个粘性末端，同时用NaeI和XhoI消化载体质粒pOsPMP1(专利申请号：200610019285.9)，同时也在5‘端为产生了一个平齐末端和在3’末端产生了一个粘性末端，经琼脂糖凝胶电泳分离，回收GM-CSF基因片段，将重组GM-CSF基因的片断连接到经NaeI和XhoI消化的载体质粒pOsPMP2(专利申请号：200610019285.9)，然后转化大肠杆菌品系DH10B.

实施例3构建水稻特异性表达GM-CSF的载体。

将重组GM-CSF基因的载体；经限制性内切酶MylI和XhoI消化，在5‘端为产生了一个平齐末端和在3’末端产生了一个粘性末端，同时用NaeI和XhoI消化载体质粒pOsPMP1(专利申请号：200610019285.9)，同时也在5‘端为产生了一个平齐末端和在3’末端产生了一个粘性末端，经琼脂糖凝胶电泳分离，回收GM-CSF基因片段，将重组GM-CSF基因的片断连接到经NaeI和XhoI消化的载体质粒pOsPMP2，然后转化大肠杆菌品系DH10B，产生水稻胚乳特异性表达重组GM-CSF基因的载体质粒pOsPMP7(图1和序列1)。pOsPMP1质粒DNA用限制性内切酶MylI和XhoI消化，同时用NaeI和XhoI消化pOsPMP1质粒DNA，将GM-CSF基因片断与经NaeI和XhoI消化的载体质粒pOsPMP1连接，然后转化大肠杆菌品系DH10B，产生表达载体质粒为pOsPMP7。其质粒的限制性内切酶图谱见图1。

实施例4：以基因枪介导的基因转化

水稻品种中花11号的种子，脱去谷壳后，经20％的次氯酸钠，消毒20分钟，经无菌水漂洗3次，每次10分钟，然后放在愈伤组织诱导培养基上经20-30天的诱导，产生愈伤组织。将0.65微克的质粒pOsPMP7和0.65微克具有选择性标记质粒pOsPMP5(专利申请号：200610019285.9)的DNA，与50微升的金粉、250微升的1M氯化钙和50微升的0.1M亚精胺混合后，在室温(20-25℃)下反应30分钟，用酒精洗三次，然后按照Monsanto公司的基因枪的方法，将包裹有pOsPMP7和pOsPMP5两个质粒DNA金粉，共转化到从中华11号产生的愈伤组织；在含有50微克/毫升的Hygromycin B的选择培养基上经45天的筛选，继续生长的愈伤组织为抗Hygromycin B的阳性愈伤组织，Hygromycin B抗性的愈伤组织转移到再生培养基上，在光照下经20天左右的诱导，愈伤组织分化成绿色的小植株，然后将幼小植株转到生根培养基上，经15-20天的诱导，形成完整的植株，最后转到温室或试验田生长发育成成熟的种子。

实施例5：筛选表达GM-CSF高的转基因植株。

转基因水稻经过4个月的生长和发育后，抽穗开花后，经一个月的时间，形成成熟的转基因水稻种子。其中56株转基因产生正常结实。当T1种子收获后，利用蛋白质检测技术---酶联免疫(ELISA)药盒(美国的U-cytech bioscience公司)检测技术，首先，每株转基因取10粒种子，加10毫升的提取缓冲液(50mMTris，pH8.0，50mM NaCl，10mM EDTA)匀浆，再离心机上离心10分钟，上清液用GM-CSF的ELISA定量药盒(美国的Bethyl Laboratory Inc.)进行酶联免疫检测。从102个转基因植株中，其每粒种子的重组GM-CSF的表达水平在0.55-13.65微克之间(图2)。其中最高的一个转基因单株号7-24的T1代继续选择，形成稳定表达GM-CSF的转基因品系。供大面积生产GM-CSF之用。

实施例6：转基因水稻的种植与储藏。

在正常水稻生长季节(湖北通常为4-6月)播种，在种植区的周围留出10米的隔离带，以防止转基因花粉飘逸。按每亩2.5公斤种子，采用稀播育秧方式，在秧龄20-25天左右，按每亩2万株移栽到大田，按正常水稻水肥栽培管理，直至成熟。采用专用收割机械收割；稻谷收割后经晒干至低于14％的水分，在25度下储藏。

实施例7：转基因水稻的糙米加工。

将转基因水稻稻谷经普通砻谷机去壳加工成糙米。

实施例8：加工后的糙米经磨粉机加工成60-80目的米粉。

实施例9：水稻米粉经制片机，压缩成重量为1.5克(含1毫克-GM-CSF/片)(图3)和10毫克GM-CSF的口服冲剂。

实施例10：转基因水稻种子直接用于刺激细胞生长。

选用动物细胞系TF-1，在细培养到贴壁后，将分成100微升含有10％FBS的RPMI培养基中，然后在以下几个处理中加入各种成分，1纳克/毫升商业的rhGM-CSF(细菌生产)，转基因水稻种子提取物含有1纳克/毫升的水稻hGM-CSF，相同蛋白量的非转基因水稻提取物，1纳克/毫升商业的hGM-CSF与非转基因水稻种子提取物混合和蛋白体去缓冲液为阴性对照，在96小时培养后，用Spectra-Max M2仪测定活细胞数目。结果表明转基因水稻种子提取物具有与商业化的GM-CSF具有同样的刺激细胞生长的效果，能促进TF-1细胞生长1.36倍(见图4)。

实施例11：转基因水稻种子直接用于白细胞减少症的治疗或预防。

选用四十只平均体重在25±2g的小鼠。把他们分成四组，每组19只，其中两组连续三天安提中每公斤200毫克环磷酰注射，形成造模的白细胞减少症的小鼠，然后喂养含有1∶1(饲料：水稻米粉)的转基因水稻种子和非转基因水稻种子两周，然后利用Sysmex-KX21三膜型细胞测定仪(Syemex，Kobe，Japan)。测定白细胞含量。结果显示：经过处理，白细胞的含量从6.46×10⁹/升减少到to1.58×10⁹/升，形成了人工造模，在喂养了含有转基因水稻米粉的饲料后，白细胞的含量从1.17×10⁹/升增加到9.37×10⁹/升，而喂养飞转基因水稻米粉的小鼠的白细胞含量只增加从1.97×10⁹/升到6.83×10⁹/升，前者比后者增加了27.33％，二者比较达到显著水准(t-test P＝0.024)，表明直接喂养转GM-CSF基因水稻米粉的具有明显的增加白细胞的效果，与使用纯化的GM-CSF注射的效果相同(见图5)。

SEQUENCE LISTING

<110>武汉禾元生物科技有限公司

<120>一种转基因水稻制剂的制备方法和用途

<130>一种转基因水稻制剂的制备方法和用途

<160>1

<170>PatentIn version 3.4

<210>1

<211>437

<212>DNA

<213>人工合成

<400>1

atgtggctcc agtccctcct cctcctcggc accgtggcct gctccatctc cgccccgggc   60

cgctccccgt ccccgtccac ccagccgtgg gagcacgtga acgccatcca ggaggcccgc  120

cgcctcctca acctctcccg cgacaccgcc gccgagatga acgagaccgt ggaggtgatc  180

tccgagatgt tcgacctcca ggagccgacc tgcctccaga cccgcctgga gctctacaag  240

cagggcctcc gcggctccct caccaagctc aagggcccgc tcaccatgat ggcctcccac  300

tacaagcagc actgcccgcc gaccccggag acctcctgcg ccacccagac catcaccttc  360

gagagcttca aggagaacct caaggacttc ctcctcgtga tcccgttcga ctgctgggag  420

ccggtgcagg agtgact                                                 437

Claims (2)

1、一种转基因水稻制剂的制备方法，其步骤是：

A、水稻特异性启动子及信号肽的获得：水稻储藏蛋白的醇溶谷蛋白基因家簇中的一个成员Gt13a基因在水稻胚乳细胞的蛋白质表达，这个基因成员的启动子活性，为了获得Gt13a启动子和它的信号肽序列，根据基因数据库的Gt13a的核苷酸序列，通过PCR技术获得水稻胚乳特异性的启动与信号肽；

B、获得水稻遗传密码子的人GM-CSF基因：为了使重组蛋白在水稻胚乳获得表达，采用了水稻偏爱的遗传密码子，基因库里获得了成熟的GM-CSF基因的氨基酸序列，由DNA分析软件MacVector将GM-CSF基因的氨基酸序列转换成含有优化水稻遗传密码子的核苷酸序列，人工合成了人GM-CSF基因，其序列为SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列；

C、水稻基因遗传转化和高表达转基因植株的筛选：利用基因枪的或农杆菌转化方法，获得的转基因水稻植株，转基因水稻经过4个月的生长和发育后，抽穗开花后，经一个月的时间，形成成熟的转基因水稻种子，当T1种子收获后，检测和筛选表达重组GM-CSF的转基因植株和产生遗传学稳定的转基因水稻品系；

D、转基因水稻种子的加工：转基因水稻成熟后，收割，经谷物砻谷机去壳后形成糙米，然后将糙米碾磨成60-80目的米粉，经制片机加工成1.5克/片剂或胶囊和15克冲剂/包。

2、权利要求1所述的一种转基因水稻制剂在制备治疗或预防白细胞减少症的药物中的应用。

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