CN1738903A - 用植物表达的重组蛋白免疫鱼类 - Google Patents

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Abstract

产生了表达氨基酸序列的植物，当给鱼施用时所述氨基酸序列产生抗原性或免疫反应。在一个实施方案中，氨基酸序列为来自IPNV的抗原，其中所述IPNV为引发鱼病害的生物体。可将植物组织喂饲鱼，或将植物组织与其他物质混合并喂饲鱼，或提取植物组织并施与鱼。

Description

用植物表达的重组蛋白免疫鱼类
发明领域
本发明涉及在转基因植物中表达鱼疾病抗原，并涉及其用作疫苗的用途。
发明背景
在过去十几年中，转基因植物已被成功用于表达多种有用蛋白。例如，在植物中生产蛋白酶已得以实现(见美国专利第6,087,558号)；同时还有在植物中生产抑肽酶(美国专利第5,824,870号)；以及亲和素(美国专利第5,767,379号)。已在植物中成功生产的蛋白包括多种哺乳动物细菌和病毒病原体抗原，例如病毒疫苗(美国专利第6,136,320号)、传染性肠胃炎和肝炎疫苗(美国专利第5,914,123号和第6,034,298号)。这些专利以及在此引用的所有文献均作为参考文献列入此处。
许多由此得到的多肽在小鼠(Mason等.(1998)Vaccine 16：1336-1343；Wigdorovitz等.(1999)Virology155：347-353)和人(Kapusta等.(1999)FASEB J.13：1796-1799)中诱导出与原始病原体相当的免疫原性反应。经口递送后，这些食用疫苗具有免疫原性，且能够诱导保护。用基本饮食添加表达重组大肠杆菌(Escherichia coli)热敏感性肠毒素B亚基(LtB)的玉米饲喂小鼠达到良好的剂量依赖性IgG和IgA应答(Streatfield等，“基于植物的疫苗-独特优势”，Vaccine(2001)19：2742-2748)。一些最早研发的食用疫苗技术包括利用转基因马铃薯表达肝炎、TGEV和诺沃克病毒(Norwalk virus)抗原以及其它多种病毒抗原。(参见，例如Thanavala等(1995)，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.92：3358-3361；美国专利第6,136,320号；美国专利第6,034,298号；美国专利第5,914,123号；美国专利第5,612,487号；以及美国专利第5,484,719号；Mason等(1996)Proc.Natl.Acad.Sci.93：5335-5340；“口蹄疫VP1蛋白”(Wigdorovitz等(1999)Virology 255：347-353)。
利用转基因植物生产疫苗与传统的疫苗生产方法相比，具有多种潜在的好处。第一，通常构建的转基因植物仅仅表达病原体或毒素的一个小的抗原性部分，这排除了抗原对整个机体产生感染或内在毒性的可能性，并降低了可能的副作用。第二，已知的人或动物病原体不能感染植物，因此可不考虑病毒或朊病毒污染的问题。第三，在转基因作物中生产免疫原依赖于既定的技术来播种、收获、储存、运输和加工植物，这些技术与通常用于粮食作物的技术相同，这使转基因植物成为大规模疫苗生产的一种非常经济的方法。第四，在植物的天然蛋白贮藏区室中表达免疫原使其稳定性最佳，对冷藏的需要减少到最小，并且使运输和贮存成本较低。第五，通过在单一疫苗中混合多种转基因植物株系的种子，使制备多成分疫苗成为可能。第六，当免疫原在通常食用的粮食作物如谷物中表达时，直接经口施用是可能的，这导致食用疫苗的产生。
以经口疫苗递送作初次免疫和加强免疫是目前水产业最受欢迎的方法，因为该方法适于大量免疫所有大小的鱼；与注射递送相比，对鱼的压力小，其中所述注射需要触摸鱼；而且因为该方法诱导黏膜免疫。然而，经口递送的成本效益已成为使该方法工业化的一个主要障碍，尤其对于较大的鱼来说。据报道，经口抗原递送的效果受限于鱼的消化系统对抗原的破坏和吸收。
发明人发现转基因植物能够提供一种理想的体系用于经济生产经口接种鱼的抗原。
发明简述
根据本发明的一方面，提供了植物来源的重组氨基酸序列用于生产预防或治疗鱼疾病的药物的用途，其中当给鱼施用该氨基酸序列时，在鱼中产生抗原性或免疫原性反应。优选该重组氨基酸序列是能够引发鱼疾病或病理的生物体的抗原。
根据本发明的一方面，用核苷酸序列转化植物，该核苷酸序列编码的氨基酸序列当给鱼施用时，在鱼中产生抗原性或免疫原性反应。
根据本发明的进一方面，该氨基酸序列的表达优选定向于植物的种子。
另一方面，本发明提供了植物细胞表达来源的氨基酸序列，其中所述氨基酸序列对于引起鱼疾病或病理的生物体是内源的。
另一方面，本发明提供了适于经口递送至鱼的组合物，其包含植物来源的重组氨基酸序列，特别是这样的植物来源重组氨基酸序列，该序列是引起鱼疾病或病理的生物体的抗原。
又一方面，本发明提供了免疫鱼抵抗疾病的方法，其包括给鱼施用包含植物来源的重组氨基酸序列的组合物，其中所述氨基酸序列是能够引起鱼疾病或病理的生物体的抗原。
附图简述
图1显示大麦α淀粉酶序列融合于编码成熟亲和素蛋白的序列(SEQID NO：1)。
图2为pPHI5158质粒图谱。
图3显示玉米优化的pat序列(SEQ ID NO：2)。
图4为PGN7101质粒图谱。
图5A为玉米密码子优化的LtB核苷酸序列(SEQ ID NO：3)。
图5B为BAASS：LtB核苷酸序列(SEQ ID NO：4)。
图6为IPNV VP2核苷酸序列(SEQ ID NO：5)。
图7为BAASS：VP2核苷酸序列(SEQ ID NO：6)。
图8为IPNV VP3核苷酸序列(SEQ ID NO：7)。
图9为BAASS：VP3核苷酸序列(SEQ ID NO：8)。
图10为PGN9084质粒图谱。
图11为PGN9111质粒图谱。
图12为在种子中表达的VP2和VP3蛋白的Western印迹，种子由NVA产生。
图13为在种子中表达的VP2和VP3蛋白的Western印迹，种子由NVB产生。
图14为显示接种后0周(第一个柱)和8周(第2个柱)时鱼平均重量的图。同时显示了标准误细线。
图15为显示大西洋鲑鱼在注射或饲喂玉米表达的重组亲和素(A)或LtB(B)后8周，由ELISA测得的平均抗体反应图。细线代表平均标准误。每组取样的动物数量(N)已示出。
对优选实施例的详细说明
这里使用的术语“鱼”是指长须鲸、甲壳水生动物和其它水生动物。长须鲸包括所有脊椎鱼，该脊椎鱼可以是硬骨鱼或软骨鱼。接受本发明疫苗的主要候选长须鲸种类为鲑科鱼，包括鲑鱼和鳟鱼种，特别是银大马哈鱼(Oncorhynchus kisutch)、河鱒(Salvelinus fontinalis)、褐鱒(Salmotrutta)、大鳞鲑鱼(Oncorhynchus tshawytscha)、樱鲑(Oncorhyncusmasou)、细鳞大麻哈鱼(Oncorhynchus gorbuscha)、虹鱒(Oncorhynchusmykiss)、北极嘉鱼(Salvelinus alpinus)和大西洋鲑鱼(salerno salar)。然而，其它易感传染病的任何鱼也可受益，例如观赏鱼种类、锦鲤、金鱼、鲤鱼、鲶鱼、鲱鱼、海鲤、鲈鱼、梭子鱼、大比目鱼、黑线鳕、罗非鱼、大菱鲆、狼鱼等。
甲壳水生动物的例子包括但不限于蛤、龙虾、虾、螃蟹和牡蛎。其它养殖的水生动物包括但不限于鳗鱼、鱿鱼和章鱼。
“植物来源”的重组氨基酸序列是通过遗传工程在转基因植物中表达的氨基酸序列，该序列不是这种植物的内源序列。
本发明的氨基酸序列给鱼施用时，在鱼中产生抗原性或免疫原性反应。
已经给鱼施用了引发鱼病害的生物体抗原以及编码这类抗原的核苷酸序列，鱼所受的处理方式有注射、浸泡、喷洒、在鱼食中直接添加疫苗、或基因转移至鱼的细胞中。例如，美国专利第6,462,027号描述了一种用分离的、不传染的多核苷酸接触水生动物的方法，其中所述多核苷酸编码免疫原。美国专利第6,180,614号描述了通过转染方式将DNA质粒导入鱼，该质粒编码基于抗原的疫苗。其启动子能够在鱼中引导表达。该专利说明书指出细菌表达的重组蛋白能形成包涵体，这样蛋白的回收量就比较低或者没有。该说明书进一步指出诱导免疫应答可能需要抗原蛋白的正确糖基化和折叠，关于这点，他们说在除动物细胞以外的细胞中可能无法达到。但是，本发明的发明者却发现在植物中生产正确加工的抗原性氨基酸序列是可能的，该抗原性氨基酸序列给鱼施用后可引发抗原性或免疫原性反应。
许多在鱼中产生抗原性或免疫原性反应的氨基酸序列(也称作“抗原”)的编码序列已经以及正在测序，这是因为人们对应用这些基因来生产疫苗有极大的兴趣。虽然以下列出了特定的实施例来说明本发明应用某些抗原的原理，但本发明并不局限于任何具体的抗原。相反，可以应用在鱼中产生抗原性或免疫原性反应的任何氨基酸序列。在一个优选的实施方案中，使用了一种引发鱼病害的生物体抗原。这种抗原用于诱导或加强免疫，编码这种抗原的相应的核苷酸序列在本发明中是有用的。在这些已分离序列的大量例子中的几个例子包括在美国专利第6,471,964号中描述的编码传染性鲑鱼贫血症病毒(ISAV)结构蛋白-1的cDNA，以及在如下文献中讨论的序列：Tucker等(2000)“用基因枪导入报告基因和组织病理学方法评价用于牙鲆Paralichthys olivaceus鱼苗的DNA疫苗的可能性”Vaccine 19(7-8)：801-809；Corbeil等(1999)“使用DNA疫苗评价红鳟鱼Oncorhynchusmykiss中传染性造血组织坏死病毒(IHNV)N、P、M、NV、G蛋白的保护性免疫原性”Dis.Aquat.Organ 39(1)：29-26；Nusbaum等(2002)“用斑点叉尾鲴疱疹病毒(IHV-1)的早期和晚期转录本对斑点叉尾鲴进行DNA接种所诱导的保护免疫性”Vet Immunol.Immunopathol 84(3-4)：151-168；Clark等(1992)“Ichtyophthirius multifiliis的寄生性纤毛虫表面抗原基因的发育表达”Proc.Natl.Acad.Sci..89(14)：6363-6367；以及Sato等(2000)“在养殖鲱鱼苗中表达YAV蛋白和接种疫苗预防病毒性腹水”Biosci.Biotechnol.Biochem.64(7)：1494-1497。
本发明的方法可应用的病原体种类的例子包括，且不局限于病毒性出血性败血症病毒(VHSV)、传染性胰脏坏死病毒(IPNV)、传染性造血组织坏死病毒(IHNV)、鲑鱼胰腺病痛毒(SPDV)、引发鲤春病毒血症的病毒、草鱼出血病病毒、野田病毒科病毒例如神经坏死病毒或黄带拟鲹神经坏死病毒、传染性鲑鱼贫血病毒(ISAV)、Aeromonis salmonicida、鲑肾杆菌Renibacterium salmonainarum)、耶尔森菌属的种(Yersinia spp.)、巴斯德菌属的种(Pasteurella spp.)(包括海
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发光菌(Photobacteriumdamselae))、弧菌属的种(Vibrio spp.)(包括V.anguillarum和V.ordalii)、爱德华菌属的种(Edwardsiella spp.)(包括鲇鱼爱德华杆菌(E.ictaluri)和迟钝爱德华杆菌(E.tarda))、Piscirickettsia salmonis(鲑鱼立克次氏体败血病的原因)、虹彩病毒、心肌病综合征病毒、Taura综合征病毒、斑节对虾病毒、虾苗黄头症病毒、虾苗白点病病毒和链球菌属的种(Streptococcispp.)。
能在本发明中应用的产生鱼病害的已知抗原的其它例子包括：IPNVVP2和VP3蛋白、IHNV G蛋白、VHSV G蛋白、野田病毒外壳蛋白、WO 01/10469中公开的ISAV抗原、WO 99/58639中公开的SPDV抗原、WO 01/68865中公开的P.salmons抗原和在WO 01/09340中公开的白点病毒抗原。许多鱼病原体抗原的核苷酸和氨基酸序列已知，并能通过Genbank数据库和其它来源获得。
本发明的氨基酸序列或抗原是“引发鱼病害的生物体”的氨基酸序列或抗原，是鱼病原的氨基酸序列或抗原(或其衍生物)，其通过重组DNA技术在植物细胞中表达，如下所述。实施本发明应用的“抗原”可以是全长的抗原性蛋白，该蛋白来源于病毒、细菌、真茵、寄生虫、原生动物等，在鱼中引发疾病；或者也可构建上述蛋白的免疫原性部分、片段或衍生物。氨基酸序列的“衍生物”是在氨基酸序列水平上或三维水平上(即与参照序列具有大致相同的形状和构型的分子)与参照序列相关的序列。衍生物包括同源序列、突变体、模拟物、模拟表位、类似物、单体形式和功能等同物，这些衍生物是直接从生物体获得或合成产生的，能够在鱼中诱导抗原性或免疫原性反应。具体而言可以是由氨基酸替换(用天然或合成的氨基酸)、缺失、倒位、插入和添加得到的衍生物。
该抗原，不论是氨基酸序列还是蛋白，都是“目的抗原”。“目的基因”是指核苷酸序列，该序列编码目的抗原或选择标记的多肽或蛋白。通过优化用于植物的密码子，目的基因可被优化用于植物转录和翻译(见下述讨论)。
一般而言，构建上述重组基因可用的方法任选地包括多种增强表达的修饰，具体细节可各异。然而，常规采用的方法包括PCR扩增，或设计合成重叠且互补的人工合成寡核苷酸，上述寡核苷酸退火连接在一起，从而产生具有方便克隆的限制性位点的基因。对于分子生物学家来说，所用方法是标准方法，Sambrook等，分子克隆，实验手册，冷泉港实验室出版社，第二版(1989)。
一旦某基因被遗传工程操作以包含特定性状，例如包含特定目的定位序列后，即将该基因用标准方法置于表达载体中。选择适当的表达载体取决于将表达载体导入宿主细胞的方法。一个典型的表达载体包含：编码细菌复制起点的原核DNA元件和抗生素抗性基因，它们使表达载体能够在细菌宿主中生长和筛选；用于插入外源DNA序列的克隆位点，其中所述外源DNA序列在本文中将编码目的抗原；控制外源基因的转录起始的真核DNA元件，例如启动子；以及控制转录本加工的DNA元件，例如转录终止/多聚腺苷酸化序列。表达载体也可包含该载体最终整合至植物染色体所需要的序列。
在一个优选实施方案中，表达载体还含有编码选择标记的基因，该基因功能性连接于控制转录起始的启动子。“功能性连接”理解为目的基因(在这里是编码选择标记的基因)在启动子下游，以正确的方向和正确的阅读框排列，这样mRNA正确转录和翻译，从而产生目的多肽或蛋白。关于植物表达载体和报告基因的概括描述，参见Gruber等(1993)“植物转化载体”，见： 植物分子生物学和生物技术方法，CRC出版社，89-119页。在一个实施方案中，选择标记基因是编码草铵膦(glufosinate)抗性的DNA，在另一个实施方案中，是在CaMV 35S启动子控制下的膦丝菌素乙酰转移酶(“pat”)或玉米密码子优化的pat基因。该基因赋予对双丙氨膦的抗性(Gordon-Kamm(1990)The Plant Cell 2：603；Uchimiya等(1993)Bio/Technology 11：835；以及Anzai等(1989)Mol.Gen.Gen.219：492)。
“启动子”是指足以引导转录的最小序列。在本发明中也包括启动子元件，这些元件足以使依赖于启动子的基因表达成为可控制的细胞类型特异表达、组织特异表达、或受外界信号或试剂诱导地表达；这些元件可以位于基因的5’或3’区。虽然可以用目的结构基因的内源启动子来对基因进行转录调控，但是启动子通常是一段外源调控序列。用于控制抗原性蛋白和选择基因表达的启动子元件分别可以是植物相容的任一启动子。启动子可以是植物基因启动子，例如：泛素启动子(欧洲专利申请号0342926)；核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶小亚基(ssRUBISCO)启动子(Coruzzi等，EMBOJ.，3：1671，1984；Broglie等，Science，224：838，1984)；或根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)诱导癌的质粒启动子，例如胭脂碱合成酶和章鱼碱合成酶启动子(在根癌农杆菌诱导癌的质粒上，且具有植物活性)；或病毒启动子，例如花椰菜花叶病毒(CaMV)19S和35S启动子(Brisson等，Nature，310：511，1984；Odell等，Nature，313：810，1985)、玄参花叶病毒35S启动子(Gowda等，J.Cell Biochem.，13D：301，1989)或TMV外壳蛋白启动子(Takamatsu等，EMBO J.6：307，1987。也可参见Kay等(1987)“CaMV 35S启动子序列加倍形成植物基因的强增强子。”Science 236：199-1302和欧洲专利申请EP-A-342 926。或者可以使用植物启动子，例如甘露碱合成酶启动子(Velten等，EMBO J.，3：2723，1984)；热休克启动子，例如大豆hspl 7.5-E或hspl 7.3-B(Gurley等，Mol.Cell.Biol.，6：559，1986；Severin等，Plant Mol.Biol.，15：827，1990)；或乙醇诱导的启动子(Caddick等，Nature Biotech.，16：177，1998)。见国际专利申请号WO 91/19806，可找到适于在本发明中应用的阐述植物启动子的综述。在本发明的一个实施方案中，编码氨基酸的DNA在PGNpr6启动子的转录控制下(WO01/94394)。这是一个泛素样启动子。
在一个优选实施方案中，提供了组织特异的启动子来将DNA转录优选地定位于种子。一个这样的启动子是球蛋白启动子。这是玉米球蛋白-1基因启动子，由Belanger F.C.和Kriz A.L.描述(1991)“玉米球蛋白-1基因的等位基因多态性分子基础”Genetics 129：863-972。该启动子也可在Genbank数据库中以登录号L22344找到。另一个例子是菜豆蛋白启动子。见Bustos等(1989)“利用在法国菜豆B-菜豆蛋白基因上游发现的一段A/T丰富的顺式作用序列调节转基因烟草中B-葡糖苷酸酶的表达”The PlantCell(1)：839-853。
表达载体也可任选地包含位于启动子和目的基因之间的信号序列。信号序列是这样的核苷酸序列，也可能是其对应的氨基酸序列，细胞用该信号序列来引导目的蛋白或多肽在真核细胞内或真核细胞外的特定位置翻译和定位。植物信号序列的一个例子是大麦α-淀粉酶分泌信号(Rogers，(1985)J.Biol Chem 260，3731-3738)。许多信号序列是本领域已知的。参见，例如Becker等(1992)，Plant Mol.Biol.20：49；Close，P.S.，(1993)硕士学位论文，爱荷华州立大学；Knox，C.(1987)等，“大麦两个分化的α-淀粉酶基因的结构和组织”，Plant Mol.Biol.9：3-17；Lerner等(1989)PlantPhysiol.91：124-129；Fontes等(1991)，Plant Cell 3：483-496；Matsuoka等(1991)，Proc.Natl.Acad.Sci.88：834；Gould等(1989)，J.Cell.Biol.108：1657；Creissen等(1991)，Plant J.2：129；Kalderon等(1984)“一小段氨基酸序列能进行特异核定位”Cell 39：499-509；以及Steifel等(1990)“一个玉米细胞壁羟脯氨酸丰富的糖蛋白基因在叶和根维管束分化早期的表达”Plant Cell 2：785-793。
在一个实施方案中，植物的选择标记和目的基因可功能性连接于同一个启动子。在另一个实施方案中，植物的选择标记和目的基因可功能性连接于不同的启动子。而在第三和第四实施方案中，表达载体可包含两个或多个目的基因，这些基因可连接于相同或不同的启动子。
显然，对于本领域的技术人员来说，构建体的启动子、选择标记、信号序列和其它组分都可有许多变化。
根据本发明，生产了这样的转基因植物，其所包含的含有上述元件的DNA分子被整合至其基因组中，这样植物能表达目的基因，从而产生目的抗原。转基因植物可适为常规栽培用作动物饲料的物种，例如玉米(Zeamays)、卡诺拉油菜(canola)(欧洲油菜(Brassica napus)、芜菁(Brassicarapa ssp.))、苜蓿(Medicago sativa)、水稻(Oryza sativa)、黑麦(Secalecereale)、高梁(Sorghum bicolor、Sorghum vulgare)、向日葵(Helianthusannuus)、小麦(Triticum aestivum)、大豆(Glycine max)、马铃薯(Solanumtuberosum)、番茄(Lycopersicon esculentum)和豌豆(Lathyrus spp.)。或者，转基因植物可以是通常不食用的物种，例如烟草(Nicotiana tabacum)、棉花(Gossypium hirsutum)、茶(Camellia sinensis)、亚麻(Linum)、剑麻(龙舌兰属(Agave spp.)、万年兰属(Furcraea spp.))、松树、冷杉和雪松。为产生这样的转基因植物，可将包含基因的表达载体导入原生质体、完整组织如未成熟胚和分生组织、愈伤组织或分离的细胞中。优选地，将表达载体导入完整组织中。培养植物组织的普通方法可以是，例如Miki等(1993)“外源DNA导入植物的步骤”，见： 植物分子生物学和生物技术方法，Glick等主编，CRC出版社，67-68页，以及Phillips等(1988)“细胞/组织培养和离体操作”，见： 玉米和玉米改良第三版，Sprague等主编，美国农学学会，345-387页所提供的方法。在DNA分子中掺入选择标记可以筛选转化体。
对于本领域的技术人员来说，将表达载体导入植物组织可用的方法多种多样，取决于所选的植物。转化多种植物的方法已为人们所熟知，文献中均有描述。见，例如Miki等，见上；Klein等(1992)Bio/Technology 10：26；和Weisinger等(1988)Ann.Rev.Genet.22：421-477。例如，DNA构建体可以导入植物细胞的基因组DNA，应用的技术可以是，例如微轰击粒子介导传递(Klein等(1987)Nature 327：70-73)；电穿孔(Fromm等(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.82：5824)；聚乙二醇(PEG)沉淀(Paszkowski等(1984)Embo.J.3：2717-272)；直接基因转移(WO 85/01856和EP-A-275 069)；离体原生质体转化(美国专利第4,684,61l号)以及显微注射植物细胞原生质体或胚性愈伤组织(Crossway，(1985)Mol.Gen.Genetics 202：179-185)。植物组织与根癌农杆菌共培养是另一种选择，此时DNA构建体被置于一个双元载体系统中(Ishida等(1996)“根癌农杆菌介导的玉米(Zea mays L.)高效转化”，Nature Biotechnology 14：745-750)。当植物细胞被细菌感染时，根癌农杆菌宿主的致毒功能将引导构建体插入植物细胞DNA。见，例如Horsch等(1984)Science 233：496-498和Fraley等(1983)Proc.Natl.Acad.Sci.80：4803。
转化卡诺拉油菜的标准方法由Moloney等描述(1989)“利用农杆菌载体高效转化欧洲油菜”，Plant Cell Reports 8：238-242。玉米转化由Fromm等(1990)Bio/Technology 8：833和Gordon-Kamm等描述，见上。农杆菌主要应用于双子叶植物，但某些单子叶植物例如玉米也可用农杆菌转化。见，例如，美国专利第5,550,318号。水稻转化见Hiei等(1994)“农杆菌介导的水稻(Oryza sativs L.)高效转化和T-DNA边界的序列分析”The PlantJournal 6(2)：271-282，Christou等(1992)Trends in Biotechnology 10：239和Lee等(1991)Proc.Nat.Acad.Sci.USA 88：6349。小麦可用与转化玉米或水稻类似的技术转化。高梁转化见Casas等(1997)“微轰击粒子轰击未成熟花序得到的转基因高梁植株”，In vitro cellular and developmentalbiology，Plant.33：92-100和Wan等(1994)Plant Physiology.104：37。大豆转化在许多出版物中均有描述，包括美国专利第5,015,580号。
在一个优选方法中，基本按照前述Ishida的农杆菌转化方法和在美国专利5,591,616中描述的方法，做了一些变化，发明人发现这些变化能够提高所获得的转化体数量。Ishida的方法使用了玉米A188变种，该变种在培养中产生类型I愈伤组织。在一个优选实施方案中，使用了HiII玉米品系，该品系在培养中起始类型II胚性愈伤组织。虽然Ishida建议当使用bar或pat基因筛选时用膦丝菌素筛选，另一个优选实施方案使用双丙氨膦代替。总的来说，正如在‘616专利中列出的，以及在下述更详细概括的，脱分化通过在脱分化诱导培养基上培养植物外植体不少于7天而获得，将正在脱分化和脱分化后的组织与含有目的基因的农杆菌接触。培养的组织可以是例如愈伤组织、不定胚样组织和悬浮细胞。在本优选实施方案中，农杆菌悬浮液的细胞群体为106～1011个细胞/mL，将其与组织接触3～10分钟，或将组织与农杆菌一起连续培养不少于7天。农杆菌可以包含质粒pTOK162，在该质粒的T区边界序列之间带有目的基因，或目的基因在含有另一质粒的农杆菌中存在。毒性区可来源于Ti质粒或Ri质粒的毒性区。在Ishida操作方法中所用的细菌株系为LBA4404，该菌株含有40kb超双元质粒，该质粒包含源于超毒性A281菌株的三个Vir基因座。该质粒具有四环素抗性。克隆载体与该超双元质粒共整合。因为该克隆载体具有大肠杆菌特异复制起点，而没有农杆菌复制起点，它如果不与超双元质粒共整合，则在农杆菌中不能存活。因为LBA4404菌株不是高毒性的，在没有超双元质粒的条件下应用有限，发明人在另外一个实施方案中已发现EHA101菌株是优选的。它是源于超毒性A281菌株的一个卸甲辅助菌株。来源于LBA4404亲本的共整合超双元/克隆载体被分离得到并电穿孔转化至EHA101，筛选壮观霉素抗性。该质粒被分离以确认所得EHA101包含该质粒。EHA101包含带有卡那霉素抗性的卸甲pTi质粒。Hood E E，Helmer G L，Fraley R T，Chilton M D(1986)“根癌农杆菌A281的超毒性由pTiBo542的位于T-DNA外的区域编码”J Bacteriol 168：1291-1301。
此外，所述的Ishida操作方法提供：在平板上新鲜培养农杆菌、将细菌从平板上刮下、重悬于如在‘616专利中所述的共培养培养基中，与玉米胚一起培养。该培养基包含4.3g MS盐、0.5mg烟酸、0.5mg维生素B6氢氯化物、1.0ml维生素B1氢氯化物、酪蛋白水解物、1.5mg 2，4-D、68.5g蔗糖和36g葡萄糖，pH为5.8。在一个更优选的方法中，细菌在1mL培养基中生长过夜，次日转化时再接种至10mL新鲜培养基中。细菌生长至对数期，在密度不超过OD600＝0.5时收获，优选范围为0.2～0.5。然后将细菌离心去除培养基，在共培养培养基中重悬。因为使用的是HiII，所以使用了HiII优选的培养基。该培养基由Armstrong，C.I.和Green C.E.(1985)进行了非常详细的描述“建立和保持松散的胚性玉米愈伤组织及涉及L-脯氨酸”Planta 154：207-214。重悬培养基与上述相同。所有其它HiII培养基如Armstrong等所述。结果是植物细胞重新分化和再生为植株。重新分化有时指脱分化，但前面一术语更加精确的描述了这样一个过程：细胞开始于具有一种形式和特性，将其置于使其丧失特性的培养基上，然后开始“重新编程”来具有一个新的特性。这样盾片细胞变成了胚性愈伤组织。
优选选择氨基酸序列的最高表达量，这有助于确定在转化的植物细胞、转基因植物中和组织特异性表达的表达水平。一种这样的方法是检测目的抗原的表达占总可溶性蛋白的百分比。一种标准的分析方法是Bradford分析，该方法对于本领域的技术人员是熟知的(Bradford，M.(1976)Anal.Biochem.72：248)。也应该检测重组氨基酸序列的生化活性，并将其与野生型标准株相比。
目的基因的表达水平可通过目的基因在转基因植物染色体上的稳定维持而增强。使用连锁基因，即除草剂抗性基因在物理距离上靠近目的基因，将可以在转基因植物群体中保持选择压力，且可以保持那些转基因植物不丢失目的基因。
用根据本发明的转基因植物可以以工业产量生产氨基酸序列。这样，上述的筛选和繁殖技术产生大量用常规方式收获的转基因植物。表达重组氨基酸序列的植物种子可用于工业加工，或可以提取氨基酸序列。当使用种子本身时，例如，可以将种子磨成面粉，然后用于工业加工。可通过已知方法完成生物材料提取。任何生产系统的下游加工是指经过产品合成后的所有单位操作，在本例中是在转基因种子中生产蛋白(Kusnadi等(1997)Biotechnology and bioengineering.56：473-484)。种子的加工为将整个种子磨成细粉或者将其分成几部分，以及将胚与外壳和胚乳分离。如果使用胚，通常用己烷提取液对胚进行脱脂，并将残留的压碎胚磨成粗粉或细粉。在一些例子中，直接使用胚或者提取氨基酸序列(见，例如WO 98/39461)。通常提取液制成特定pH的液体缓冲液，以增强重组氨基酸序列提取，并减少天然种子蛋白的提取。随后可进行后续的氨基酸序列浓缩或提纯。
在又一个实施方案中，一旦转化已经发生，可以用植物育种将基因导入其它植物。这可由任何本领域已知的植物育种方法达到，例如将上述转基因植物与另一植物异花授粉，从后续子代中筛选表达该氨基酸序列的植物。在此使用的植物育种方法对于本领域的技术人员是熟知的。植物育种方法的讨论参见Poehlman(1987) 大田作物育种，AVI Publication Co.，Westport Conn.。许多在本方法中有用的粮食作物均通过利用植物授粉方法的技术育种。自花授粉植物是指一朵花的花粉转移至同一朵花或同株植物的另一朵花。异花授粉植物是指花粉来源于不同植株的花。例如，芸苔属植物通常自交不育，只能通过异花授粉，除非通过发现突变体或通过遗传干涉而获得自交亲和。自花授粉物种，例如水稻、燕麦、小麦、大麦、豌豆、菜豆、大豆、烟草和棉花，它们的雄性和雌性植株在解剖学上是雌雄同株的。在自然授粉过程中，一朵花的雄性生殖器官给同一朵花的雌性生殖器官授粉。玉米(Zea mays L.)可以通过自花授粉和异花授粉两种技术育种。玉米在同一植株上有位于雄穗的雄花和位于耳穗的雌花。它可以自花或异花授粉。
授粉可以通过任何方法，包括但不限于人工、风或昆虫授粉，或雄性可育与雄性不育植株的机械接触。对于大多数植物物种来说，大规模生产杂交种子优选利用风或种子授粉。可以对授粉过程进行更严格的控制，通过使用多种方法使一个植物群雄性不育，而另一个成为雄性可育花粉的供体。这可以通过人工去雄、细胞质雄性不育、或通过多种熟练育种者所熟知的方法控制雄性不育。更为复杂的雄性不育体系的例子包括下述：Brar等，美国专利第4,654,465号和第4,727,219号以及Albertsen等，美国专利第5,859,341号和第6,013,859号。
可以使用回交方法将基因导入植物。该方法已使用了几十年来将性状导入植物。描述该方法的一个例子以及其它植物育种方法学已为人们熟知，且能在参考文献中找到，例如 植物育种方法学，Neal Jensen主编，JohnWiley & Sons，Inc.(1988)。在一个典型的回交方法中，原始的目的变种(轮回亲本)与携带预转移的单个目的基因的第二变种(非轮回亲本)杂交。然后将这次杂交所得的子代再次与轮回亲本杂交，该过程反复重复，直至获得一个植株，其中轮回亲本的基本所有目的形态和生理特征都在该转换的植株上再现，此外还有非轮回亲本的单个转移基因。
将植物来源的重组氨基酸序列施用给鱼的优选方法是经口服，任选地可将重组氨基酸序列与常规饲料混合。其它施用方法包括浸泡、腹膜内注射和肌内注射。
转基因植物组织可以直接给鱼喂饲，或与其它物质混合后给鱼喂饲，或提取出来后给鱼施用。
疫苗的经口递送形式包含重组氨基酸序列与一种或多种赋形剂以及任选地与一种或多种营养成分的任一组合。此处应用的赋形剂可包括二氧化硅、粘合剂、乳剂、表面活性物质、脂肪酸、脂肪、油等以及任何其它制备组合物所必需的添加剂。
典型的鱼饲料可包含多种营养源，例如可代谢的能源(碳水化合物)、蛋白源、脂肪源、以及任选地纤维、维生素和矿物质。饲料的准确组分取决于所涉及鱼的类型，特别是该鱼是否食肉。工业规模生产的饲料可以方便地以模压或挤压的饲料丸的形式提供。植物来源的重组氨基酸序列可以掺入饲料，取代一种更普通的蛋白源(例如鱼粉、血粉、玉米麸、大豆粉等)。或者可以将植物来源的重组氨基酸序列粘附于预制的鱼饲料表面。
植物来源的重组氨基酸序列可被肠溶包衣用于经口递送。肠溶包衣保护疫苗免受蛋白酶和胃中相对较低的pH值的影响。这使疫苗能够达到后肠和淋巴组织，这使疫苗对鱼的保护最为有效。肠溶包衣一般包含不受酸性pH影响但当通过肠内较高pH环境时溶解的聚合体包衣。
在一个优选实施方案中，该植物来源的重组氨基酸序列以转基因植物材料例如植物种子、叶片、果实、茎、块茎等形式，投喂给鱼，优选转基因植物材料不与任何其它饲料混合。在另一个实施方案中，在喂鱼前，该植物来源的重组氨基酸序列与预制的鱼饲料直接进行物理(可逆地)混合。
为避免不必要的提取步骤，优选将植物来源的重组氨基酸序列以未提纯(天然)形式投喂给鱼。这表示不对该来源植物的食用部分进行特殊处理或加工来提取或浓缩重组氨基酸序列。
疫苗的有效剂量可根据受试对象的大小和物种、以及施用的方式而变化。最佳剂量可通过兽医或水产专家的反复试验而确定。疫苗每单位剂量可包含范围约1～1000μg，优选范围约10～200μg，更优选范围约50～100μg的重组氨基酸序列。
本发明的疫苗可以预防或治疗为目的给鱼施用。该疫苗能够诱导长期保护，预防目标传染病。“长期”保护对鱼来说是指接种后长于7天的保护性免疫应答，更优选为长于20天，最优选长于70天的保护性免疫应答。
实施例1
亲和素转化植物以及表达水平的检测
在植物中表达亲和素的质粒的构建
亲和素转化玉米的质粒构建如美国专利第5,767,379号所述，作为参考文献列入此处。鸡卵白亲和素cDNA由Gope ML.等(1987)报道，Nuc.Acids Res.15：3595-3606。利用优选的玉米密码子使用表(GCG，编汇者Mike Cherry，斯坦福大学)，将氨基酸序列反向翻译成核苷酸序列。依据该计算机产生的合成序列，设计了重叠、互补、具有相容限制性位点末端的寡核苷酸，然后寡核苷酸退火连接产生玉米的优化基因。所用序列在′379专利中列出，作为参考文献列入此处。同样，用玉米优选的密码子合成了(使用重叠且互补的核苷酸)大麦α-淀粉酶信号序列(Rogers，(1985)J.Biol Chem 260，3731-3738)。这两个基因片段的相容限制性位点被连接在一起，大麦α-淀粉酶信号序列在亲和素基因的5’端，并以正确的阅读框排列，这样在翻译时使用正确的密码子以产生目的抗原。得到的大麦α-淀粉酶信号序列/亲和素(见图1(SEQ ID NO：1)作为BamHI/EcoRI片段被克隆进pGEM3Zf+载体，该载体是Promega公司的产品(Madison，WI)，以产生质粒pPHI5142。包含大麦α-淀粉酶信号序列/亲和素区的BamHI/HpaI片段被分离，克隆至一个以pBlueScript SK+(Stratagene，LaJolla，CA)为骨架的衍生质粒。在这个质粒中，信号序列/亲和素基因片段以正确的方向插入到玉米泛素5’区和马铃薯蛋白酶抑制剂II(PinII)转录终止子区域之间(An等，(1989年1月)Plant Cell 1：115-122)，玉米泛素5’区包括玉米泛素启动子(UBI1ZM)、第一外显子和第一内含子。所得质粒为pPHI5168(图2)。与该质粒共转化的是pPHI610质粒，pPHI610包含源于吸水链霉菌(Streptomyces hygroscopicus)的bar基因(见上文及White J.(1990)Nucleic Acids Res 18：1062)，其中bar基因连接于双35S启动子(例如Friz，S.E。J.Cell Sci 98：545-550)、pPHI610还包含玉米醇脱氢酶基因的内含子(Callis J.等，Genes and Development 1：1183-1200)和PinII终止子(An G.等(1989)Plant Cell 1：115-122)。这些构建体和所用步骤在上述′379专利中进行了充分描述。注意′379专利描述的实验中，使用了bar基因，而在此描述的其它实验中则使用了玉米的优化pat基因。图3列出了玉米的优化pat基因序列(SEQ ID NO：2)。
转化和组织培养以生产表达亲和素的植物
将“HiII”玉米植物单一未成熟胚来源的已建立的愈伤组织系(Armstrong CL，Green CE，Phillips RL(1991)Maize Gen.Coop.Newsletter，65：92-93)用氨能粒子加速装置PDS1000(Bio-Rad，Hercules，CA)进行粒子轰击介导的转化。HiII是研究中常用的玉米品系，原因是它易于转化。根据Tomes等操作步骤(Tomes DT，Ross MC，Songstad DD(1995)植物细胞组织和器官培养：基本方法.Springer-Verlag，Berlin，Heidelberg.第197-213页)，呈现出松散的II型胚性形态的组织在与等摩尔数的亲和素基因(pPHI5168)和bar筛选标记基因(PHP610)共转化前过710m筛。根据Register等的方法(Register J.C.-III等(1994)，Plant Mol.Biol.25：951-961)，表达bar基因的转化体在双丙氨膦(3mgl-1)的存在下筛选。用ELISA筛选所选出的克隆来鉴定同时表达亲和素基因的共转化体。由表达亲和素的克隆再生许多植株(T0代)，转移至温室，用于分析叶组织中亲和素的表达。T1代种子通过异型杂交得到，杂交以T0代植株作母本，未转化近交系(PHN46；见美国专利第5,567,861号)作父本。
用ELISA检测玉米中的亲和素
下列步骤用于检测种子中亲和素的表达。将种子磨成粉，用含有0.05％Tween-20的10mM PBS pH7.0(PBST)提取。总蛋白用Bradford微量滴定分析法定量(Bradford，M.M.1976.一种利用蛋白染料结合原理定量微克级蛋白的快速而敏感的方法，Anal.Biochem.72：248-254)。ELISA是一种典型的三明治类型，其中微量滴定平板用兔抗亲和素抗体包被，亲和素在4℃结合过夜，平板与山羊抗亲和素抗体(Vector Labs，Burlingame，CA)反应，然后用抗山羊碱性磷酸酶结合物(Jackson Immunoresearch，WestGrove，PA)反应。碱性磷酸酶用对硝基苯磷酸盐检测，用SpectroMax platereader(Molecular Devices，Sunnyvale，CA)在405nm处读数。
实施例2
LtB转化植物与表达检测
LtB序列及其导入植物在美国专利第6,194,560号中描述，其序列和方法在本实验中使用，并作为参考文献列入此处。这里所用载体与′560专利中所述的载体在某些方面不同。这里用的是PGN7101，如图4所示。合成了人源的大肠杆菌株系的LtB基因(Leong等(1985)人源和猪源的大肠杆菌不耐热毒素B亚单位顺反子的核苷酸序列比较，Infect Immun.Apr；48(1)：73-7)，并优化了用于玉米的密码子使用，见图5A(SEQ ID NO：3)。跨越该基因的寡核苷酸退火连接，产物用聚合酶链式反应(PCR)扩增。利用PCR的方法，将编码大麦α-淀粉酶分泌信号(BAASS)的寡核苷酸序列加到LtB的N末端，得到的整个BAASS：LtB序列片段插入到载体骨架中，得到质粒PGN5431。该BAASS：LtB序列如图5B所示(SEQ ID NO：4)。使用限制性酶NcoI和HpaI将BAASS：LtB序列从PGN5431上切掉，然后连接到PGN2774载体的相应限制性位点，得到中间载体PGN7020。在该中间载体中，BAASS：LtB位于命名为PGNpr1(野生型玉米聚合泛素-1)的泛素调节体系玉米组成型启动子和非翻译前导序列的3′，并位于马铃薯蛋白酶抑制剂II转录终止子(PinII)的5′端。使用限制性酶NheI和NotI将该BAASS：LtB表达盒(启动子、前导序列、BAASS：LtB和Pin II序列)从PGN7020上切下，连接到植物转化载体PGN3770的相应位点。最终的BAASS：LtB转化载体命名为PGN7101，包含根癌农杆菌Ti质粒来源的右边界和左边界序列、以及绿色产色链霉菌(Streptomyces viridichromogenes)的pat基因，该pat基因赋予草铵膦抗性。
实施例3
IPNV转化植物与表达检测
传染性胰脏坏死病毒(IPNV)感染软体动物、甲壳动物和多种鱼类，特别是鲑鱼。IPNV感染可对鲑鱼养殖具有破坏性影响，因为鱼在鱼苗或三龄鲑阶段死亡，以及存活种群的生长减低。已有多种尝试来产生预防该病毒的有效疫苗。到目前为止，只有注射的灭活病毒能够起到保护作用，而这种疫苗价格昂贵不适于实用。该病毒的主要结构和免疫原性蛋白VP2和VP3利用上述方法在玉米中得以表达。
VP2和VP3的核苷酸序列最初分别从质粒pUK-NVP2和pUK-NVP3获得。这两个质粒的蛋白序列来源于一种与N1菌株亲缘关系接近的挪威IPNV菌株。在该基因序列的5′和3′端进行了一些核苷酸修饰来优化玉米的密码子使用。
用聚合酶链式反应(PCR)，在pUK-NVP2的VP2序列的5’端退火一段pUK-NVP2上VP2基因所没有的、编码5′VP2序列并具有进行了核苷酸变化以优化密码子的寡核苷酸序列。利用PCR的方法，在pUK-NVP2的VP2序列的3’端加上一段这样的寡核苷酸序列和马铃薯蛋白酶抑制剂II转录终止子序列(PinII)(An等，Plant Cell(1989)1：115-122)，其中所述寡核苷酸序列编码在VP2的3’端优化密码子的核苷酸变化。这两个PCR片段同利用限制性酶SacII和BbsI从pUK-NVP2上切下的内部VP2片段连接在一起，得到质粒PGNK5676，该质粒包含完整的VP2核苷酸序列(SEQ IDNO：5)，如图6所示。利用PCR在恢复的VP2基因的N末端加入编码大麦α-淀粉酶分泌信号(BAASS)的寡核苷酸序列。PCR得到的片段被置于载体骨架中，得到质粒PGNK5443，该质粒含有BAASS：VP2核苷酸序列(SEQ ID NO：6)，如图7所示。
利用PCR，在pUK-NVP3的VP3序列的5’端和3’端均退火这样的寡核苷酸，这些寡核苷酸编码进行了玉米密码子优化的核苷酸变化。PCR片段插入载体骨架得到质粒PGNK5581，该质粒含有部分优化的VP3序列(SEQ ID NO：7)，如图8所示。利用PCR的方法，将一段编码BAASS的寡核苷酸序列加到VP3的N末端。该PCR片段插入载体骨架，得到质粒PGNK5330，该质粒含有BAASS：VP3序列(SEQ ID NO：8)，如图9所示。
构建了两个独立的植物转化载体，每个载体都含有VP2和VP3基因。第一个构建体包含BAASS：VP2和BAASS：VP3序列，每一序列都在独立的表达盒上，所述表达盒包含玉米种子的优化启动子(命名为PGNpr2)以及PinII终止子。用限制性酶NcoI和PacI将BAASS：VP2序列从PGNK5443上切下。该片段与用HindIII和NcoI切下的PGNpr2片段一起连接到PGN9004植物转化载体的HindIII和PacI酶切位点，该载体包含PinII终止子、根癌农杆菌Ti质粒来源的右边界和左边界序列、以及绿色产色链霉菌的pat基因，其中pat基因赋予草铵膦抗性。该质粒命名为PGNK5461。按相似的方法，用NcoI和PacI将BAASS：VP3序列从PGNK5330上切下。该片段与HindIII/NcoI PGNpr2片段一起连接到PGN9004的HindIII和PacI位点，得到质粒PGNK5335。利用限制性酶AscI和PacI将BAASS：VP2表达盒从PGNK5461上切下，其中所述表达盒含有PGNpr2启动子、BAASS、VP2和PinII终止子。利用限制性酶HindIII和MluI将BAASS：VP3表达盒从PGNK5335上切下，其中所述表达盒含有PGNpr2启动子、BAASS、VP3和PinII终止子。这两个片段连接到PGN9004的HindIII和PacI限制性位点，得到最终的植物转化载体，该载体包含BAASS：VP2和BAASS：VP3表达盒。这个构建体命名为PGN9084(图10)，其设计为蛋白质被转运到细胞壁，主要在种子中积累。然后根据改良的Ishia方法进行植物转化，如上所述。转化PGN9084得到的植株命名为NVA。
第二个植物转化载体同样包含VP2和VP3，VP2和VP3在各自独立的表达盒中处于PGNpr2启动子和PinII终止子的控制下，但没有大麦α-淀粉酶分泌信号(BAASS)。用限制性酶BbsI和BstBI将VP2序列的5’部分直至BstBI限制性位点(包含此位点)从PGNK5573上切下。该片段和HindIII/NcoI PGNpr2片段连接至PGNK5461的HindIII和BstBI位点，得到质粒PGNK5676，该质粒含有VP2表达盒。用限制性酶NcoI和PacI将VP3序列从PGNK5581上切下。该片段和HindIII/NcoI PGNpr2片段连接至PGN9004的HindIII和PacI位点，得到含有VP3表达盒的质粒PGNK5681。用限制性酶AscI和PacI将VP2表达盒从PGNK5676上切下。用HindIII和MluI酶将VP3表达盒从PGNK5681上切下。这两个片段连接到PGN9004的HindIII和PacI酶切位点，得到最终的植物转化载体，包含VP2和VP3表达盒。这个构建体命名为PGN9111(图11)，其设计为蛋白质被转运到胞质，主要在种子中积累。转化PGN9111得到的植株命名为NVB。
使用抗IPNV全病毒的多克隆抗体进行Western印迹分析表明，VP2和VP3蛋白在NVA和NVB种子中均表达。在Western印迹膜上，NVA种子中表达的VP2和VP3蛋白比在IPNV全病毒中发现的相应天然蛋白略大(图12)。第一泳道为蛋白分子量标记，第2-4泳道是IPNV全病毒的纯化物，第5泳道是玉米种子提取物对照，阴性对照，第6-11泳道是不同NVA种子的提取物，第12泳道是IPNV全病毒的未纯化物。(注释，全病毒的纯化处理在点样孔上部产生弥散。)
因为VP2和VP3蛋白由BAASS靶向NVA种子的细胞壁，所以预计这些蛋白将被糖基化。不愿受限于理论，这两种蛋白的大小均增加可能表明蛋白在植物体内进行了糖基化。在Western印迹中，NVB种子中表达的VP2和VP3蛋白与IPNV全病毒标准株相比，均为预期大小(图13)。第一泳道为蛋白分子量标记，第2泳道是NVA种子提取物，第3-9泳道是不同NVB种子的提取物，第10-12泳道是IPNV全病毒未纯化物，上样量逐一增加。
因为这些蛋白在植物细胞的胞质中表达，预想没有蛋白修饰发生。
VP2和VP3在NVA种子中的表达量用Western印迹来估测。种子提取物的VP2和VP3蛋白条带的强度由点密度测量方法测量，然后与全病毒已知量的条带比较。使用这种方法计算得到，VP2在NVA T2代种子中的表达为0.1％TSP(总可溶性蛋白)，而VP3在NVA T2代种子中的表达为0.3％TSP。VP2在NVB种子中的表达水平用ELISA方法测定。ELISA是一种典型的三明治类型，其中微量滴定平板用绵羊抗IPNV全病毒抗血清包被，植物提取物中的IPNV蛋白在4℃结合过夜，平板与AS1小鼠抗VP2单克隆抗体反应，然后与连接有碱性磷酸酶的绵羊抗小鼠IgG反应。碱性磷酸酶用对硝基苯磷酸二钠盐(pNpp)检测，用光吸收酶标仪在405nm处读数。使用这种方法，VP2在NVB T1代种子中的表达定量为在最高的单个种子中0.17％TSP。
实施例4
亲和素和LtB饲喂研究
为在鱼中评价这项新技术，设计本实验来确定口服含有玉米表达的重组标记蛋白的食物是否能在鲑鱼中诱导体液免疫应答。每天给大西洋鲑鱼饲喂约占体重2％的食物，用含有两种剂量的未经纯化的玉米表达LtB(占食物的5％或10％)或鸡卵白亲和素(占食物的10％或20％)的食物饲喂5天、12天常规食物和5天处理的食物。同时也用纯化的LtB和亲和素对鱼进行腹膜内注射，作为阳性对照。
检测了鱼的生长、重组蛋白在鱼粪中的持续性和体液免疫应答。比较了不同LtB剂量及不同亲和素剂量下鱼的抗体应答，以前已表明LtB能够在小鼠中生产强烈的抗体应答，而亲和素在小鼠中是一个较弱的抗原。
每条大西洋鲑鱼重约20g。共有11个处理组，包括多个阴性和阳性对照组(表1)。A和B阳性对照组，每组由10条鱼组成，以油为佐剂进行腹膜内注射。A组每条鱼接受4μg LtB蛋白的单次注射，B组每条鱼接受20μg亲和素的单次注射，上述两种蛋白均为从玉米表达系统中纯化的重组蛋白。其余9组各包含35条鱼，C组至G组为阴性对照。C组接受商业鱼食丸。D组接受包含5％非转基因玉米胚的鱼食丸。E组接受10％非转基因玉米胚的鱼食丸。F组接受含10％非转基因玉米粉的鱼粉丸。G组接受含20％非转基因玉米粉的鱼食丸。在实验组中，H组接受含5％LtB转基因玉米胚的鱼食丸，而I组接受含10％LtB玉米胚的鱼食丸。J组接受含10％转基因亲和素玉米粉的鱼食丸，而K组接受含20％亲和素玉米粉的鱼食丸。
表1
组 疫苗 鱼的数量  所需玉米重量(g)   总蛋白量(mg)   10天的饲料(g)
A 注射Lt-B阳性对照     10     0   0.040*   40
B 注射亲和素阳性对照 10 0 0.20* 40
C 阴性对照1(常规饲料) 35 0 0 140
D 阴性对照25％常规玉米胚粉 35 0 0 140
E 阴性对照310％常规玉米胚粉 35 0 0 140
F 阴性对照410％常规玉米粉 35 14 0 140
G 阴性对照520％常规玉米粉 35 28 0 140
H 5％重组LtB玉米胚粉 35 7 2.1 140
I 10％重组LtB玉米胚粉 35 14 4.2 140
J 10％亲和素玉米粉     35     14   20.61   140
K 20％亲和素玉米粉     35     28   41.22   140
*每条鱼腹膜内(ip)注射0.1mL PBS，PBS中含有以油为佐剂的4μg纯化的重组Lt-B(A组)，或20μg亲和素(B组)。
鱼在10℃下培养。饲喂后2、4、7、14和21天，从9个限定饮食的实验组C-K，各处死5条鱼用ELISA法检测重组蛋白在鱼粪中的持续性。在8周时，全部11个组，每组处死10条鱼称重，用ELISA法测定血清中的特异抗体。
ELISA检测鱼粪中的标记蛋白：
ELISA是一种典型的三明治类型，其中微量滴定平板用兔抗亲和素或抗LtB的抗体4℃包被过夜。鱼粪样品用PBST稀释，加入孔中，平板在4℃培养过夜以使亲和素或LtB蛋白结合。平板与山羊抗亲和素抗体(Vector Labs，Burlingame，CA)或小鼠生物素化LtB抗体反应，然后与抗山羊碱性磷酸酶结合物(Jackson Immunoresearch，West Grove，PA)或ExtraAvidin-碱性磷酸酶(Sigma-Aldrich Canada Ltd.，Oakdale，ON)反应。碱性磷酸酶用对硝基苯磷酸盐(Pierce，分销商MJS Biolynx Inc.，Brockville，ON，Canada)检测，用平板读数仪(BioTek Instruments Inc.，Vermont)在405nm处读数。
ELISA检测鱼血清中的抗亲和素和抗LtB的特异抗体：
用三明治式ELISA法检测鱼血清中的特异抗体。平板加样孔用纯化的LtB或纯化的玉米表达的亲和素4℃包被过夜，加入鱼血清的PBST-1％BSA两倍稀释液，然后将平板在17℃培养过夜，使鱼抗体结合。向平板中加入一级抗体即抗大西洋鲑鱼单克隆抗体Ig(Cedarlane Laboratories Ltd.，ON，Canada)、然后加入碱性磷酸酶标记的抗小鼠Ig二级抗体(Cedarlane)，上述抗体均在PBST-1％BSA中稀释。加入对硝基苯磷酸盐底物(Pierce)后，用微量滴定板读数仪(BioTek Instruments)在405nm处读吸光度。在稀释终点计算抗体效价。
在饲料中加入表达两种标记蛋白的玉米粉不影响鱼的生长，如图14所示。在鱼粪中，两种标记蛋白在延长的一段时间内，至少在停止饲喂处理饲料后的21天可检测到，如表2所示。
                      表2饲喂后的天数
 组   2   4   7   14   21
 5％LtB   5/5   4/4   5/5   4/5   NS
 10％LtB   5/5   4/4   3/4   3/4   2/2
 10％亲和素   5/5   5/5   4/5   5/5   4/4
 20％亲和素   3/3   4/4   5/5   4/4   4/4
经口施用标记蛋白诱导体液免疫应答。在接种后8周，只有阴性对照组的鱼没有可检测到的特异血清抗体应答。饲喂未纯化的玉米表达标记蛋白的鱼所产生的抗体应答与注射以油为佐剂的纯蛋白的鱼一样强，如图15所示。
实施例5
IPNV饲喂研究
在本实施例中，将进行所述饲喂含有传染性胰脏坏死病病毒VP2和VP3蛋白的玉米的方法，预期在动物的粪便和器官中会有病毒蛋白存在并产生了免疫反应。当鱼在接受毒力病毒的攻击后，预期经口施用玉米表达的IPNV蛋白会产生保护。
鱼将被分成7组，加标记用以识别。阳性对照组A由注射诱导免受IPNV的保护性商业疫苗的鱼组成，而阴性对照组B将被饲喂商业饲料丸。其余的组用含有或不含表达的IPNV蛋白的玉米胚饲料饲喂5天，用常规饲料饲喂12天，用含有玉米胚的饲料饲喂5天，如表3所列。玉米胚加入饲料中的百分比(玉米g/饲料g)为10％和20％。
组  鱼的数量 处理
A  55 腹膜内注射商业疫苗
B  55 常规食物
C  85 非转基因玉米胚以20％混合至饲料
D  85 加入NVA玉米胚10％
E  85 加入NVA玉米胚20％
F  85 加入NVB玉米胚10％
G  85 加入NVB玉米胚20％
接种疫苗后4周，所有的鱼将在咸水中驯化几天，然后在流动的咸水中培养，周围温度为9-12℃。转移到咸水后在5周，鱼将与IPNV共生进行攻击试验。首次用作实验的鱼将被注射活的IPNV，然后加入到含有已接种的鱼的水槽中。将对每日的死亡率监测五周。以周为单位，从接种后1周到5周和攻击试验进行时，将组C至组G每组取5条鱼处死，取鱼的粪便和器官检测IPNV蛋白的持续性和分布。在攻击试验中处死的鱼，包括组A和组B的5条鱼，将同样被采血，用ELISA法检测血清中的抗体。

Claims (28)

1、植物来源的重组氨基酸序列在生产用于治疗性或预防性治疗鱼的药物中的用途，其中当给鱼施用时，该重组氨基酸序列产生抗原性或免疫原性反应。
2、如权利要求1所述的用途，其中所述氨基酸序列是在鱼中引发疾病或病理的生物体的抗原。
3、如权利要求1或2所述的用途，其中药物用于经口施与鱼。
4、如权利要求3所述的用途，其中将药物制剂为用于经口递送给鱼。
5、如权利要求4所述的用途，其中所述药物为食用饲料丸形式。
6、如前述权利要求任意一项中所述的用途，其中所述药物包含转基因植物材料。
7、如前述权利要求任意一项中所述的用途，其中所述重组氨基酸序列是IPNV的VP2或VP3蛋白、或其任一具有免疫原性的部分。
8、如权利要求7所述的用途，其中所述重组氨基酸序列由掺入任一SEQ ID No.5、6、7或8的DNA序列编码。
9、如前述权利要求任意一项中所述的用途，其中所述鱼是鲑科鱼。
10、如前述权利要求任意一项中所述的用途，其中所述重组氨基酸序列来源于玉米(Zea mays)。
11、一种鱼饲料，其包含植物来源的重组氨基酸序列。
12、如权利要求11所述的饲料，其中所述重组氨基酸序列是引发鱼疾病或病理的生物体的抗原。
13、如权利要求11或12所述的饲料，其中所述重组氨基酸序列包含于植物组织中，任选地包含于种子组织中。
14、如权利要求12或13所述的饲料，其中所述重组氨基酸序列是IPNV的VP2或VP3蛋白、或其任一具有免疫原性的部分。
15、如权利要求11-14任一项所述的饲料，该饲料还包含至少一种营养物或赋形剂。
16、制备鱼用口服疫苗制剂的方法，该方法包括：将植物来源的重组氨基酸序列或包含所述氨基酸序列的转基因植物材料与一种或多种赋形剂和任选地与一种或多种营养物混合。
17、包含编码氨基酸序列的核苷酸序列的植物细胞，当给鱼施用时其中所述氨基酸序列产生抗原性或免疫原性反应。
18、如权利要求17所述的植物细胞，其中所述氨基酸序列是引发鱼疾病或病理的生物体的抗原。
19、经人工设计以表达编码氨基酸序列的核苷酸序列的转基因植物或转基因植物材料，当给鱼施使用时其中所述氨基酸序列产生抗原性或免疫原性反应。
20、权利要求19所述的转基因植物的种子。
21、免疫鱼而使其抗病的方法，其包括给鱼施用包含植物来源的重组氨基酸序列的组合物，其中所述氨基酸序列是引起鱼疾病或病理的生物体的抗原。
22、如权利要求21所述的方法，其中组合物经口施与鱼。
23、一种饲喂鱼的方法，其包括给鱼饲喂包含编码氨基酸序列的核苷酸序列的植物或来自所述植物的植物材料，当给鱼施用时，其中所述氨基酸序列在所述鱼中产生抗原性或免疫原性反应。
24、如权利要求23所述的方法，其中所述氨基酸序列是引起鱼疾病或病理的生物体的抗原。
25、给鱼施用抗原性或免疫原性氨基酸序列的方法，该方法包括：用编码所述氨基酸序列的核苷酸序列转化植物，给鱼施用该氨基酸序列，从而在所述鱼中产生抗原性或免疫原性反应。
26、如权利要求25所述的方法，其中所述氨基酸序列是引发鱼疾病或病理的生物体的抗原。
27、如权利要求25或26所述的方法，其中所述氨基酸序列经口施与鱼。
28、通过在植物细胞中表达而获得的氨基酸序列，其中所述氨基酸序列对引发鱼疾病或病理的生物体而言是内源的。
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