CN102851288A - 烟碱生物合成pmt1基因启动子及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及烟碱生物合成PMT1基因启动子及其应用。该烟碱生物合成PMT1基因启动子从N.sylvestris基因组序列中提取得到，具有SEQIDNO.1所示的核苷酸序列。烟碱PMT1基因启动子区域产生基础水平的转录，调控区域能够对不同的环境条件作出应答，对烟碱合成基因的表达水平做出相应的调节（根据需要进行上调或下调），进而对生产出高品质的烟碱提取原料有着重要的现实意义。

Description

烟碱生物合成 PMT1 基因启动子及其应用

技术领域

本发明涉及生物基因工程技术领域，具体涉及一种烟碱生物合成PMT1基因启动子及其应用。

背景技术

烟碱(Nicotin)，又称尼古丁，化学名称为1-甲基-2-(2-吡啶基)吡咯烷，分子式为C₁₀H₄N₂，是一种天然存在于烟草中的生物碱，是烟草中特有的。烟碱能够对人产生一定的生理刺激作用，是使烟草具有商品价值的主要因素。随着烟碱的生物活性越来越受到人们的重视，其应用也越来越广泛，对它们的开发已经逐渐深入到食品、保健、医药和日用用化工等多个领域，应用前景非常广阔。如烟草替代品生产需要大量的烟碱：目前对烟草依赖的治疗方法包括药物治疗、心理治疗、针灸和中药治疗等，经美国FDA批准的治疗方案和药物主要有：烟碱替代疗法如烟碱贴剂、口胶、鼻喷雾剂和吸入剂等，采用nAChR抑制剂药物治疗，如安非他酮和注射剂如酒石酸瓦伦尼克林，还有美卡拉、去甲替林、可乐定和抗焦虑药等，这些烟碱替代物的生产需要大量提取烟碱作为原料；另外，烟碱还广泛应用于环保农药的开发以及特种疾患药物的生产：烟碱系列农药属植物杀虫剂，因其具有蒸薰、胃毒、触杀功能及迅速降解无残留等特点广泛用于粮食、油料、蔬菜、水果、牧草等农作物的杀虫剂，是生产绿色食品的理想的高效杀虫剂和生物性农药，它还广泛应用在医药工业上，是研制治疗心血管、皮肤病、蛇毒等疾患药物的特种原料。还可用其所制得的柠檬酸烟碱应用于高级香烟的品种改良剂组分等，而且随着烟草工业、精细化工、制药、有机合成、国防、农药等的迅速发展。市场对烟碱的需求与日俱增，特别是高纯烟碱的需求更大。

烟碱分子包含一个吡咯烷环和吡啶环，而吡啶环是由NAD途径合成的，吡咯烷环是由基本氨基酸经过中间产物腐胺形成的。参与烟碱生物合成的蛋白包括鸟氨酸脱羧酶(ornithine decarboxylase，ODC)，喹啉酸合成酶(quinolinate synthase，QS)，天冬氨酸氧化酶(aspartate oxidase，AO)，喹啉酸磷酸核糖基转移酶(quinolinate phospho-ribosyltransferase，QPT)，腐胺 N-甲基转移酶(putrescine N-methytransferase，PMT) (Katoh et al., 2005; Cane et al., 2005)，二胺氧化酶(diamine oxidase，DAO)，编码这些蛋白的基因都可以在N. sylvestris中找到。其中腐胺 N-甲基转移酶由三个基因编码(PMT1, PMT2, PMT3) (Shoji et al., 2000)。如果要通过编码这些酶类的基因来调控烟碱的合成，则首先应当找到其对应的启动子。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种可对烟碱生物合成起调控作用的PMT1基因启动子及其嵌合基因。

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：

一种烟碱生物合成PMT1基因启动子，其核苷酸序列为：

（1）SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列；或

（2）SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列经重复、缺失、替换或移位等常规技术手段改造而形成的具有同等功能的核苷酸序列。

扩增上述PMT1基因启动子的引物对，具有SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列。

一种嵌合基因，其中包含上述烟碱生物合成PMT1基因启动子以及与之可操作连接的、编码目的基因的序列。

一种植物转化载体，其中包含上所述嵌合基因。

一种转基因植物细胞，其中包含上述嵌合基因。

一种转基因植物组织，其中包含上述嵌合基因。

上述烟碱生物合成PMT1基因启动子或上述嵌合基因在调控烟碱生物合成中的应用。

本发明具有积极有益的效果：

1.找到并提取出了烟碱生物合成PMT1基因启动子；

2.烟碱PMT1基因启动子区域产生基础水平的转录，调控区域能够对不同的环境条件作出应答，对烟碱合成基因的表达水平做出相应的调节（根据需要进行上调或下调），进而对烟草种植生产出适量烟碱含量的烟叶以及生产出高品质的烟碱提取原料有着重要的现实意义。

附图说明

图1为PCR扩增烟碱基因启动子电泳图，其中左图以N.tabacum 基因组DNA为模板，右图以N.sylvestris 基因组DNA为模板；

图2为PMT1，QPT,AO, QS等基因启动子中含有的保守的转录结合位点框架图；通过使用Genomatix公司的FrameWorker软件分析单个的转录结合位点构建的框架图；转录结合位点的的组织(包括DNA链的特异性，相对顺序)都是保守的；不同基因启动子中转录结合位点的距离变化非常小；不同颜色代表不同转录因子的结合位点；单线上面的符合代表转录结合位点位于有义链, 而单线下面的符合代表转录结合位点位于反义链；

图3为PMT1，QPT,AO, QS等基因启动子中发现的转录因子示意模式图；该模式图由Genomatix公司的Fast软件分析得到；模式图中变化距离反应了三个基因启动子序列中不同的转录因子结合位点之间的距离。

具体实施方式

以下结合具体实施例进一步阐述本发明。下述实施例中所涉及的试验方法或分析方法，如无特别说明，均为常规方法，所用试剂如无特别说明，均为市售。

实施例1 烟碱合成基因的分离、鉴定

烟碱合成基因PMT1, PMT2 和 PMT3,ODC,DAO,AO, QS, QPT启动子序列均从N. sylvestris基因组序列中提取得到，这些基因在基因组中的位置如下表1所示。其中烟碱合成基因PMT1启动子序列的如SEQ ID NO.1所示。

表1 各启动子在N. sylvestris基因组中的位置

根据N. sylvestris基因组中提取的烟碱合成基因ODC, QS, AO, QPT, DAO, PMT1, PMT2 和 PMT3的启动子序列，设计引物（如表2所示）从N. tabacum基因组中扩增启动子序列,克隆至修饰过的pET-43.1a载体中,进行测序,其中>NT-PMT1的序列如SEQ ID NO.4所示。上述序列与N. sylvestris烟草扩增出来的启动子序列比对非常保守,并且启动子上面的调控元件一致，因而证明它们之间调控机制相同。

表2 PCR扩增N. tabacum K326 和 N.sylvestris烟草基因组中ODC, AO, QS, QPT, PMT1, PMT2和PMT3启动子所用的引物

AO-F	TACTTCCAATCCATGaagttactgtgttctagatt
		AO-R	TATCCACCTTTACTGtcaATTACCTTAAAGTAGCAA
PMT1-F	TACTTCCAATCCATGattttttattaaatactatc
		PMT1-R	TATCCACCTTTACTGtcaGATATGACTTCCATTTTC
PMT2-F	TACTTCCAATCCATGctcatacggattttagacag
		PMT2-R	TATCCACCTTTACTGtcaGTAGAGCCATTTGTGTT
PMT3-F	TACTTCCAATCCATGaaatactatctggtgacaag
		PMT3-R	TATCCACCTTTACTGtcaAATGGCACCATTCTTGAA
QPT-F	TACTTCCAATCCATGactcctagttgttgttata
		QPT-R	TATCCACCTTTACTGtcaTTATAAGTGAGAGTTAA
ODC-F	TACTTCCAATCCATGagtgaaattacaagtacaag
		ODC-R	TATCCACCTTTACTGtcaAAGGAAGAAAAGAGAGAGGTAA
QS-F1	TACTTCCAATCCATGttctacaaaaggtccatttc
		QS-R1	TATCCACCTTTACTGtcaTTTTTCGGGTGAGGACGAAA
DAO-F	TACTTCCAATCCATGcgctaattttaaattaaa
		DAO-R	TATCCACCTTTACTGtcaTTGTGAGTACTGCTTAGCT

PCR反应体系：PCR反应液包含10 pmol引物，50 ng 基因组DNA，0.2 mM dNTP, 10% DMSO和 Hot Start DNA聚合酶KOD(Novagen), PCR反应条件为95ºC，预变性5 min，95ºC, 变性1 min，50ºC退火1 min, 68ºC 延伸1min，35个循环, 最后68ºC再延伸10 min。采用QIAquick PCR purification kit (Qiagen)，试剂盒纯化PCR 产物，使用In-Fusion HD EcoDry Cloning Kit (Clontech)试剂盒将纯化后的PCR产物克隆至修饰过的 pET-43.1a (pLEICS-01)，然后测序分析。

实施例2 烟碱合成基因的功能

分析了参与烟碱合成的八个基因调控机制：烟碱分子包含一个吡咯烷环和吡啶环，而吡啶环是由NAD途径合成的，吡咯烷环是由基本氨基酸经过中间产物腐胺形成的。吡啶环是由AO，QS，QPT等催化合成。其中，天冬氨酸氧化酶(aspartate oxidase，AO)催化甘油和天冬氨酸形成吡啶-2，3-二羧酸。喹啉酸合成酶(quinolinate synthase，QS)催化吡啶-2，3-二羧酸形成喹啉酸。喹啉酸磷酸核糖基转移酶(quinolinate phospho-ribosyltransferase，QPT)催化喹啉酸通过吡啶核苷酸循环产生烟酸。烟碱中N-甲基吡咯烷环生物合成的主要路线则是依次由鸟氨酸脱羧酶(ornithine decarboxylase，ODC)催化鸟氨酸形成腐胺，之后由腐胺N-甲基转移酶(putrescine N-methytransferase，PMT)催化生成N-甲基腐胺，接着由二胺氧化酶(diamine oxidase，DAO)催化生成N-甲基-吡咯烷盐。烟碱最终的合成是烟酸脱羧与吡咯环结合而完成的。其中，QPT是烟碱生物合成过程中的吡啶部分所需用的烟酸的主要调节酶，是烟碱生物合成的一个重要控制点。而PMT是吡咯烷环合成途径中限制作用最大的酶。PMT和QPT是烟碱的2个中间体生物合成中的最大速度限制酶，该途径中的其他酶在某些情况下具有调节作用。而这些酶的表达量则由其启动子调控元件通过结合不同的转录因子所调控。

在其中N. tabacum中的两个转录结合位点(TFBS)G-box和GGC-motif介导了PMT1a对于茉莉酸甲酯的应答。G-box和GGC-motif分别位于tss位点的上游95bp和55bp(Xu and Timko, 2004)。使用这两个位点的信息以及它们的距离和相对方向定义了一个FastM模型(Klingenhoff et al., 1999)来表述这种调节方式（图3）。

发明人提取了烟碱合成基因的启动子序列，并用FastM模型分析比较了TFBS的发生类型。PMT1, PMT2,和PMT3的启动子序列符合该模型。两个元件的距离和相对方向与N. tabacum中的保守性一致。N. sylvestris中的GCC-motif距离假想的转录起始位点在54-60bp之间，也是可以与N. tabacum中比对上的。其它烟碱基因合成基因的启动子序列不含有TFBS基序。

茉莉酸应答反应是由MYC2转录因子介导的(Chini et al., 2007)。因此使用FrameWorker分析了8个启动子序列的TFBS所含有的MYC2结合位点(Döhr et al. 2005, Cohen et al., 2006)。对于AO,QS和QPT的启动子序列，可以鉴定出6个不同的TFBS，表明这些基因包含一个共同的调节方式(图2)。除了TFBS的组织(包括距离，相对方向)是高度保守之外，每对启动子的相似性<50%。因此我们检测到框架并不是由于核苷酸序列的高度保守，而是在转录因子水平上的保守。

保守的基序包涵转录子家族MYCL, DOFF, GTBX, L1BX, OCSE, 和 GBOX的结合位点。除了MYCL和GBOX之外，OCSE家族的转录因子也参与到防御应答和植物激素的信号(水杨酸)传导过程中(Chen et al., 1996)。转录因子之间的相互作用以前也在别的基因中发现过，如GBOX-DOFF (Norre et al., 2002), OCSE-DOFF (Chen et al., 1996), GTBX-MYCL (Simpson et al., 2003)。

实施例3 烟碱合成相关基因的表达

烟碱是在烟草的根部合成的，然后转运至叶片和其它地上部分(Cane et al., Shoji et al.)。基因表达结果表明所有烟碱合成的基因都存在于N. sylvestris的根部，而在茎、叶或者花中不表达或者低表达(表3)。

表3 烟碱合成基因的表达

Gene	root	leaf	flower	stem
					PMT1	1.12893	0.00007	0.00366	0.00064
PMT2	0.00102	0.00000	0.00000	0.00000
					PMT3	0.06579	0.00000	0.00092	0.00000
QPT	1.18142	0.34834	0.28289	0.24329
					QS	1.08342	0.21988	0.11682	0.11265
AO	0.00200	0.00000	0.00000	0.00000
					ODC	0.09851	0.01137	0.03978	0.02068
DAO	0.28119	0.00000	0.01128	0.00092

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进（如对本发明基因序列进行的修饰等），这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

SEQUENCE LISTING

<110> 河南农业大学

<120> 烟碱生物合成PMT1基因启动子及其应用

<130> /

<160> 4

<170> PatentIn version 3.2

<210> 1

<211> 601

<212> DNA

<213> N.sylvestris

<400> 1

attttttatt aaatactatc tggtgacaag cattcgtttg cttccgttga ttacgttgat 60

tttgggatct actctatacc aaccgaagcc gttgtccttg atcttcgctt tcatttaatt 120

catcttccgt ctgcctccga tttcacaagt catgcaccca ttcaattatt taatggaaac 180

caattttacc ccgtcaaata ctttacttgg atataaacaa ttttgcccga ggagtaaaca 240

gatgcgaaga aagaaagcag acgattaaag aaatttttaa aaaaggagag agaaatgaac 300

acacacatgt actaataaaa ttagggtact actttactaa taattggaca gagactaaat 360

tcatatttta gttccaaaat gtctcgggca gtccaaccat gcacgttgta atgatttttt 420

aactctatta tatcgagttg cgccctccac tcctcggtgt ccaaattgta tataaatgca 480

tatgtgtcta ttgggagtgt acatcaagct ttcataaagt acaaatcgta atacttgttg 540

aaacataata ctttctcttc tccaatttgt ttagtttaat tttgaaaatg gaagtcatat 600

c 601

<210> 2

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 2

tacttccaat ccatgatttt ttattaaata ctatc 35

<210> 3

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 3

tatccacctt tactgtcaga tatgacttcc attttc 36

<210> 4

<211> 621

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 4

attttttatt aaatactatc tggtgacaag cattcgtttg cttccgttga ttacgttgat 60

tttgggatct actctatacc aaccgaagcc gttgtccttg atcttcgctt tcatttaatt 120

catcttccgt ctgcctccga tttcacaagt catgcaccca ttcaattatt taatggaaac 180

caattttacc ctatacaaat ggtacatcat tcgtcaaata ctttacttgg atataaacaa 240

ttttgcccga ggagtaaaca gatgcgaaga aagaaagcag acgattaaag aaatttttaa 300

aaaaggagag agaaatgaac acacacatgt actaataaaa ttagggtact actttactaa 360

taattggaca gagactaaat tcatatttta gttccaaaat gtctcgggca gtccaaccat 420

gcacgttgta atgatttttt aactctatta tatcgagttg cgccctccac tcctcggtgt 480

ccaaattgta tataaatgca tatgtgtcta ttgggagtgt acatcaagct ttcataaagt 540

acaaatcgta atacttgttg aaacataata ctttctcttc tccaatttgt ttagtttaat 600

tttgaaaatg gaagtcatat c 621

Claims (7)

1.一种烟碱生物合成PMT1基因启动子，其核苷酸序列为：

（1）SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列；或

（2）SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列经重复、缺失、替换或移位改造修饰而成的具有同等功能的核苷酸序列。

2.扩增权利要求1所述PMT1基因启动子的引物对，其特征在于，具有SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列。

3.一种嵌合基因，其中包含权利要求1所述烟碱生物合成PMT1基因启动子以及与之可操作连接的、编码目的基因的序列。

4.一种植物转化载体，其中包含权利要求3所述的嵌合基因。

5.一种转基因植物细胞，其中包含权利要求3所述的嵌合基因。

6.一种转基因植物组织，其中包含权利要求3所述的嵌合基因。

7.权利要求1所述烟碱生物合成PMT1基因启动子或权利要求3所述嵌合基因在调控烟碱生物合成中的应用。

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