CN1726282B - 合成终粘度增加的淀粉的植物细胞及植物 - Google Patents

合成终粘度增加的淀粉的植物细胞及植物 Download PDF

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Abstract

本发明涉及经遗传修饰的植物细胞，与未被遗传修饰的野生型植物的相应植物细胞相比，所述遗传修饰导致植物细胞中内源性存在的一种或多种SSIII蛋白、一种或多种BEI蛋白和一种或多种BEII蛋白的活性降低。本发明的其它方面涉及含有所述植物细胞的植物、产生这些植物细胞和植物的方法以及可获取自它们的淀粉。

Description

合成终粘度增加的淀粉的植物细胞及植物
技术领域
本发明涉及经遗传修饰的植物细胞和植物，与未被遗传修饰的野生型植物的相应植物细胞相比，所述的遗传修饰导致SSIII蛋白和BEI蛋白及BEII蛋白的活性降低。此外，本发明涉及产生这类植物细胞和植物的手段和方法。所述植物细胞和植物合成改性的淀粉(modified starch)，其特征在于：它的直链淀粉含量至少为30％；与来自未经遗传修饰的相应野生型植物的淀粉相比，其磷酸含量增加；在RVA分析中它的终粘度高于现有技术产生的淀粉；而且/或者具有改变的侧链分布；而且/或者在质构分析仪中具有提高了的凝胶强度；以及/或者具有改变的颗粒形态和/或改变的平均粒度。本发明因此还涉及本发明的植物细胞和植物合成的淀粉，以及产生这种淀粉的方法。
背景技术
鉴于目前植物成分作为可再生的原材料的重要性逐步提高，生物工程研究的一个任务是试图按加工工业的需求改进这些植物原材料。为了使可再生的原材料能用于尽可能多的应用领域内，另外还必需获得各种各样的物质。
多糖淀粉是一种化学均一单位——葡萄糖分子——的多聚体。不过，它采取了不同形式分子的高度复杂的混合物形式，这些分子的聚合程度和葡萄糖链分支的出现都有所不同。因此淀粉是不均一的原材料。在化学上可以区分两种不同的淀粉成分：直链淀粉和支链淀粉。在诸如玉米、小麦或马铃薯等用于淀粉生产的典型植物中，直链淀粉约占合成的淀粉的20-30％，支链淀粉约占70-80％。长期以来直链淀粉被认为是由α-1，4糖苷键连接的α-D-葡萄糖单体组成的线性多聚体。然而，更多新近的研究证实了α-1，6-糖苷分支点的存在(约0.1％)(Hizukuri和Takagi，Carbohydr.Res.134，(1984)，1-10；Takeda等，Carbohydr.Res.132，(1984)，83-92)。
有多种方法可用来测定直链淀粉的含量。这些方法中的一些基于直链淀粉的碘结合能力，这一能力可以通过电势测定法(Banks&Greenwood，in W.Banks & C.T.Greenwood，淀粉及其组成(Starch and its components)(pp.51-66)，Edinburgh，爱丁堡大学出版社)、电流分析法(Larson等，分析化学(Analytical Chemistry)25(5)，(1953)，802-804)或分光光度法(Morrison & Laignelet，J.Cereal Sc.1(1983)，9-20)测定。还可通过DSC(差示扫描量热法)检测方式从量热学上测定直链淀粉的含量(Kugimiya & Donovan，Journal of Food Science 46，(1981)，765-770；Sievert & Holm，Starch/Starke 45(4)，(1993)，136-139)。而且可以使用天然淀粉或去分支淀粉的SEC(大小排阻层析)层析测定直链淀粉的含量。此方法被特别推荐用于测定经遗传改性的淀粉中直链淀粉的含量(Gerard等，Carbohydrate Polymers 44，(2001)，19-27)。
与直链淀粉相反，支链淀粉显示出较高程度的分支且具有由于额外的α-1，6-糖苷键的出现而造成的约4％的分支点。支链淀粉是具有不同分支模式的葡萄糖链的复杂混合物。直链淀粉和支链淀粉之间的另一重要差异是它们的分子量。直链淀粉分子量为5×105-106Da(取决于淀粉的来源)，而支链淀粉的分子量在107至108Da之间。可以基于它们的分子量和它们不同的理化特性来区分这两种大分子，最简单显现差异的方式是通过它们不同的碘结合特性。
除了直链淀粉/支链淀粉比率和磷酸含量外，淀粉的功能特性还在很大程度上受到分子量、侧链分布模式、离子含量、脂质和蛋白质含量、平均粒度和颗粒形态等因素的影响。在本文中可以提及的重要功能特性是溶解度、凝沉行为、持水性、成膜性、粘度、糊化特性、冻融稳定性、酸稳定性、凝胶强度等等。粒度还可能对于多种应用而言是重要的。
本领域技术人员常常采取不同的方法来确定糊化特性，这些特性之一是终粘度。随所用方法的不同，同一淀粉样品的绝对值和相对值(特别是绝对值)可能有所不同。用于分析糊化特性的一种快速有效的方法是RVA分析。依赖于RVA分析中参数和温度分布的不同选择，可以从同一样品中得到不同的RVA谱。应当提及的是，某些情况下，测定糊化特性时在下文所提及的现有技术中使用了不同的谱。
Kossmann和Lloyd(2000，关于植物学的重要综述(Critical Reviews inPlant Sciences)19(3)，171-126)对其中参与淀粉生物合成的酶有所减少的不同植物种类进行了综述。
迄今为止，文献中已报道了SSIII蛋白活性降低(Abel等，1996，ThePlant Journal 10(6)，9891-991；Lloyd等，1999，Biochemical Journal338，515-521)或BEI蛋白活性降低(Kossmann等，1991，Mol Gen Genet230，39-44；Safford等，1998，Carbohydrate Polymers 35，155-168)或BEII蛋白的活性降低(Jobling等，1999，The Plant Journal 18)或BEI和BEII蛋白活性降低(Schwall等，2000，Nature Biotechnology 18，551-554；WO96/34968)或BEI和SSIII蛋白的活性降低(WO00/08184)的植物。
与相应的野生型植物相比，在SSIII蛋白活性降低的植物中观察到支链淀粉侧链相对的从较长的链向较短的链迁移(Lloyd等，1999，BiochemicalJournal 338，515-521)，磷酸含量高70％，直链淀粉含量没有变化(Abel等，1996，The Plant Journal 10(6)，9891-991)以及RVA分析中的终粘度降低(Abel，1995，柏林Freie大学博士论文(PhD Thesis at the FreieUniversity Berlin))。所述植物还在WO 00/08184中有所描述，与未转化的野生型植物相比，从这些植物分离的淀粉中，磷酸含量增加了197％，直链淀粉含量增加了123％，而RVA分析中的终粘度则下降到野生型的76％。此外，在所述淀粉中凝胶强度下降到野生型的84％。
用Morrison&Laignelet(1983，J.Cereal Sc.1，9-20)的方法进行的分光光度分析显示，在BEI和BEII蛋白活性都降低的植物中，直链淀粉含量最高可达89.14％(相当于野生型的344％)，淀粉磷酸含量最高达分离自相应野生型植物的淀粉的磷酸含量的522％。RVA分析显示这些淀粉中的终粘度值增加到最高达237％。此外，分离自这些植物的淀粉颗粒中改变的颗粒形态具有如下特征，即在显微镜下用偏振光进行观察时可见所述颗粒中央有巨大的沟。
因此，本领域技术人员熟悉这样一类植物细胞和植物及其合成的淀粉，该淀粉与未经遗传修饰的野生型植物相比，直链淀粉含量和磷酸含量提高，但RVA分析中终粘度的提高最大不超过256％。迄今为止在RVA分析中还未得到更高的终粘度。但是，这是合乎需要的，因为在将淀粉用作如增稠剂、胶凝剂或粘合剂时需要使用较少的淀粉固体来达到期望效果。这可以例如减少人和动物食品、保健产品和化妆品中添加剂的量。还可能在将所述淀粉用于胶水中时应用较少量的淀粉，从而降低如纸、纸板和绝缘板的成本。
发明内容
本发明因此基于提供植物细胞、植物和来自适宜植物细胞或植物的淀粉的目的，所述的淀粉中直链淀粉和磷酸的含量增加，在RVA分析中终粘度至少增加270％，且/或糊化淀粉的凝胶强度提高，且/或具有改变的颗粒形态。
通过提供本专利申请中所详述的实施方案达到了此目的。
因此，本发明的第一方面涉及经遗传修饰的植物细胞，与未被遗传修饰的野生型植物的相应植物细胞相比，所述的遗传修饰导致植物细胞中内源性存在的一种或多种SSIII蛋白、一种或多种BEI蛋白和一种或多种BEII蛋白的活性降低。
在此文中，遗传修饰可以是导致与未被遗传修饰的野生型植物的相应植物细胞相比，植物细胞中内源性存在的一种或多种SSIII蛋白、一种或多种BEI蛋白和一种或多种BEII蛋白的活性降低的任何遗传修饰。
为了达到本发明的目的，遗传修饰可以包括，例如，通过一个或多个基因的诱变，产生符合本发明的植物细胞。采用何种突变并不重要，只要它导致SSIII蛋白和/或BEI蛋白和/或BEII蛋白活性降低即可。就本发明而言，术语“诱变”应理解为意味着任何类型的突变，诸如缺失、点突变(核苷酸置换)、插入、倒位、基因转变或染色体易位。
在本文中，可以通过使用化学试剂或高能辐射(例如X射线、中子、γ射线、UV辐射)产生突变。已有文献描述了可用于产生化学诱发突变的试剂以及通过所述诱变剂作用而产生的突变，例如，Ehrenberg和Husain，1981，(Mutation Research 86，1-113)；Muller，1972(BiologischesZentralblatt 91(1)，31-48)。描述用γ射线、甲基磺酸乙酯(EMS)、N-甲基-N-亚硝基脲或叠氮化钠(NaN3)产生稻突变体的文献有，例如，Jauhar和Siddiq(1999，Indian Journal of Genetics，59(1)，23-28)、Rao(1977，Cytologica 42，443-450)、Gupta和Sharma(1990，Oryza27，217-219)和Satoh与Omura(1981，Japanese Journal of Breeding 31(3)，316-326)。Arora等人(1992，Anals of Biology 8(1)，65-69)描述了利用NaN3或马来酰肼产生小麦突变体。Scarascia-Mugnozza等人(1993，Mutation Breeding Review 10，1-28)提供了用不同类型的高能辐射和化学试剂产生小麦突变体的综述。Svec等人(1998，Cereal ResearchCommunications 26(4)，391-396)描述了利用N-乙基-N-亚硝基脲产生黑小麦突变体。Shashidhara等人(1990，Journal of MaharashtraAgricultural Universities 15(1)，20-23)描述了利用MMS和γ辐射生产粟突变体。
已有关于主要通过无性繁殖的植物的突变体的制备报道，例如，产生改性淀粉的马铃薯(Hovenkamp-Hermelink等，1987，Theoretical andApplied Genetics 75，217-221)和产油量提高/油质量改进的薄荷(Dwivedi等，2000，Journal of Medicinal and Aromatic Plant Sciences 22，460-463)。所有这些方法原则上都适于产生符合本发明的植物细胞及它们所产生的淀粉。
可借助本领域技术人员已知方法来鉴定相关基因中，尤其是编码BEI蛋白和/或BEII蛋白和/或SSIII蛋白的基因中的突变。尤其可以应用基于如下的分析方法：与探针杂交(DNA印迹，Southern blot)、聚合酶链式反应扩增(PCR)、所述基因组序列的测序和搜索单核苷酸置换。例如，借助杂交模式鉴定突变的一种方法是限制性片段长度多态性(RFLP)的搜索(Nam等，1989，The Plant Cell 1，699-705：Leister和Dean，1993，The Plant Journal 4(4)，745-750)。基于PCR的方法的例子是扩增的片段长度多态性(AFLP)分析(Castiglioni等，1998，Genetics 149，2039-2056；Meksem等，2001，Molecular Genetics and Genomics 265，207-214；Meyer等，1998，Molecular and General Genetics 259，150-160)。借助限制性内切酶切割的扩增片段(切割扩增多态序列，CAPS)也可用于鉴定突变(Konieczny和Ausubel，1993，The Plant Journal 4，403-410；Jarvis等，1994，Plant Molecular Biology 24，685-687；Bachem等，1996，The Plant Journal 9(5)，745-753)。还有文献描述了鉴定SNPs的方法，其中，如Qi等人(2001，Nucleic Acids Research 29(22)，e116)、Drenkard等人(2000，Plant Physiology 124，1483-1492)和Cho等人(1999，NatureGenetics 23，203-207)的文章。特别合适的方法是允许在短时间内分析大量植物内特定基因中的突变的方法。这样的方法，称为TILLING(基因组中的定向诱导局部损害)，已被McCallum等人描述(2000，PlantPhysiology 123，439-442)。
所有这些方法原则上都适用于本发明的目的。
Hoogkamp等人(2000，Potato Research 43，179-189)已分离了所含淀粉中无直链淀粉的稳定的马铃薯突变体。这些植物不再合成颗粒结合淀粉合酶(granule-bound starch synthase)(GBSS I)的活性酶。将这些植物进行又一次诱变后，可以选择淀粉生物合成所涉及基因中还具有另外突变的那些植物。由此可能产生合成具有改良特性的淀粉的植物。利用合适的方法，还可以鉴定和分离产生本发明淀粉的本发明植物细胞。
此外，借助于同源转座子(即天然存在于所述植物细胞中的转座子)也可产生本发明的植物细胞。此方法的详述见下文。
所有上述方法原则上都适于产生符合本发明的植物细胞以及它们所合成的改性淀粉。因此本发明还涉及产生遗传修饰的植物细胞的方法，所述植物细胞合成改性的淀粉，该淀粉的特征在于它的直链淀粉含量至少为30％，与来自未经遗传修饰的相应野生型植物细胞的淀粉相比，它的磷酸含量增加且RVA分析中的终粘度提高。
本发明的另一方面涉及产生能合成改性的淀粉的植物细胞的方法，包括植物细胞的遗传修饰，与未被遗传修饰的野生型植物的相应植物细胞相比，所述的遗传修饰导致植物细胞中内源性存在的一种或多种SSIII蛋白、一种或多种BEI蛋白和一种或多种BEII蛋白的活性降低。
本发明的另一方面涉及产生遗传修饰的植物的方法，所述植物合成改性的淀粉，其中
a)如上所述产生植物细胞；
b)从(或利用)依照a)所产生的植物细胞再生植物；和
c)如果合适，从依照步骤b)所产生的植物中产生其它的植物。
就本发明而言，术语“遗传修饰”意味着植物细胞的遗传信息被改变了。
在本文中，与未被遗传修饰的野生型植物的相应植物细胞相比，在本发明的植物细胞中观察到植物细胞中内源性存在的一种或多种SSIII蛋白、一种或多种BEI蛋白和一种或多种BEII蛋白的活性降低。
可同时或以连续的步骤进行用于产生符合本发明的植物细胞的遗传修饰。在此文中，每种遗传修饰可导致一种或多种SSIII蛋白和/或一种或多种BEI蛋白和/或一种或多种BEII蛋白的活性降低。起始材料可以是野生型植物或野生型植物细胞，其中并未进行事先的遗传修饰来使一种或多种SSIII蛋白和/或一种或多种BEI蛋白和/或一种或多种BEII蛋白的活性降低；或者起始材料可以是遗传修饰的植物细胞或植物，其中已通过遗传修饰操作了一种或多种SSIII蛋白和/或一种或多种BEI蛋白和/或一种或多种BEII蛋白的活性。如果将这样的遗传修饰植物(植物细胞)作为起始材料，随后进行的遗传修饰优选只涉及在每种情况下活性尚未被降低的一种或多种蛋白质(SSIII、BEI或BEII)的活性。
例如，与未被遗传修饰的野生型植物的植物细胞相比，在本发明的遗传修饰的植物细胞中观察到植物细胞中内源性存在的一种或多种SSIII基因和一种或多种BEI基因和一种或多种BEII基因的表达降低以及/或者在每种情况下植物细胞中存在的一种或多种上述蛋白质的活性降低。
就本发明的目的而言，术语“活性的降低”指编码SSIII、BEI和/或BEII蛋白的内源性基因的表达降低，和/或细胞中SSIII、BEI和/或BEII蛋白量的减少以及/或者细胞中SSIII、BEI和/或BEII蛋白的酶活性的降低。
可通过例如RNA印迹分析或RT-PCR检测编码SSIII、BEI或BEII蛋白的转录物的量来测定表达的减少。在此上下文中，减少优选指与未被遗传修饰的相应细胞相比，转录物的量减少至少50％，尤其是至少70％，优选至少85％和特别优选至少95％。
可通过例如蛋白质印迹分析、ELISA(酶联免疫吸附测定)或RIA(放射免疫测定)之类的免疫学方法测定导致所述植物细胞中SSIII、BEI或BEII蛋白活性降低的这些蛋白质量的减少。在此上下文中，减少优选指与未被遗传修饰的相应细胞相比，SSIII、BEI和/或BEII蛋白的量减少至少50％，尤其是至少70％，优选至少85％和特别优选至少95％。
就本发明而言，SSIII蛋白应理解为意指一类可溶性淀粉合酶(ADP-葡萄糖-1，4-α-D-葡聚糖-4-α-D-葡糖基转移酶；EC 2.4.1.21)。可溶性淀粉合酶催化糖基化反应，其中底物ADP-葡萄糖的葡萄糖残基随α-1，4-键的形成被转移至α-1，4-连接的葡聚糖链(ADP葡萄糖+{(1，4)-α-D-葡糖基}(N)<＝>ADP+{(1，4)-α-D-葡糖基}(N+1))。
SSIII蛋白描述于，例如，Marshall等(The Plant Cell 8；(1996)；1121-1135)、Li等(2000，Plant Physiology 123，613-624)、Abel等(The Plant Journal 10(6)；(1996)；981-991)和WO 0066745中。SSIII蛋白的结构常常显示出一系列的结构域。在N末端，SSIII蛋白具有用于转运入质体的信号肽。向着C末端方向，依次是N末端区域、SSIII特异区和催化结构域(Li等，2000，Plant Physiology 123，613-624)。基于一级序列比对(http://hits.isb-sib.ch/cgi-bin/PFSCAN)的进一步分析揭示，马铃薯SSIII蛋白具有所谓的碳水化合物结合域(carbohydrate binding domain)(CBM)。此结构域(Pfam motiv cbm 25)包括Seq ID No.2中显示的马铃薯SSIII蛋白序列的第377至437位氨基酸。就本发明而言，SSIII蛋白由此应理解为意指其序列与Seq ID No.3中所示序列至少具有50％同一性的淀粉合酶，优选同一性至少为60％，尤其优选至少为70％，更优选至少为80％，尤其是至少为90％。
术语“同源性”或“同一性”应理解为意指以百分比表示的与其它蛋白质一致的氨基酸(相同)数目。优选借助计算机软件将Seq.ID No.3与其它蛋白质进行比较来测定同一性。如果相互比较的序列长度有所不同，则以短序列与较长序列共有的氨基酸数目来确定同一性百分率，从而确定同一性。可以常规地通过例如ClustaIW等公众可获得的已知计算机程序确定同一性(Thompson等，Nucleic Acids Research 22(1994)，4673-4680)。ClustaIW可通过Julie Thompson(ThompsonEMBL-Heidelberg.DE)和Toby Gibson(GibsonEMBL-Heidelberg.DE)，欧洲分子生物学实验室，Meyerhofstrasse 1，D69117 Heidelberg，Germany公开获得。ClustaIW也可从各网页上下载，其中有IGBMC(Institut de Genetique et de BiologieMoleculaire et  Cellulaire，B.P.163，67404 IIIkirch Cedex，France；ftp://ftp-igbmc.u-strasbg.fr/pub/)和EBI(ftp://ftp.ebi.ac.uk/pub/software/)及EBI网页的所有镜像(欧洲生物信息研究所，Wellcome Trust GenomeCampus，Hinxton，Cambridge CB10 1SD，UK)。
如果利用ClustaIW计算机版本1.8来确定如本申请中的参照蛋白质和其它蛋白质之间的同一性，则设以下参数：KTUPLE＝1，TOPDIAG＝5，WINDOW＝5，PAIRGAP＝3，GAPOPEN＝10，GAPEXTEND＝0.05，GAPDIST＝8，MAXDIV＝40，MATRIX＝GONNET，ENDGAPS(OFF)，NOPGAP，NOHGAP。
发现相似序列的一个可能方案是进行序列数据库搜索。在此，键入一个或多个序列作为所谓的待查序列(query)。然后用计算机统计程序将此待查序列与所选定的数据库中存在的序列进行比较。这样的数据库查询(blast搜索)是本领域技术人员所已知的且可以在不同供应商处进行。例如，若在NCBI(National Center for Biotechnology Information，http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)上进行所述的数据库查询，应采用针对相应的比较查询而设定的标准设置。对于蛋白质序列对比(blastp)而言，这些设置是：Limit entrez＝not activated；Filter＝low complexity activated；Expect value＝10；word size ＝3；Matrix＝BLOSUM62；Gap costs：Existence＝11，Extension＝1。除了其它参数外，所述查询的结果还有待查序列与数据库中找到的相似序列之间的同一性程度。
因此，就本发明而言，SSIII蛋白应理解为意指淀粉合酶，当利用至少一种上述方法测定该淀粉合酶与Seq ID No.3中所示序列的同一性时，其具有至少50％同一性，优选至少为60％，尤其优选至少为70％，更优选至少为80％和特别是至少为90％的同一性。
就本发明的目的而言，术语SSIII基因应理解为意指编码SSIII蛋白的核酸分子(DNA、cDNA、RNA)，优选来自马铃薯。已有文献描述了各种植物物种中编码SSIII蛋白的核酸分子，例如，马铃薯(Abel等，The PlantJournal 10(6)；(1996)；981-991)、小麦(WO 00/66745，Li等人，2000，Plant Physiology 123，613-624；GenBank录入号AF258608；GenBank录入号AF258609)、玉米(Gao等，1998，Plant Cell 10(3)，399-412；GenBank录入号AF023159)、豇豆(vignia)(GenBank录入号AJ225088)、稻(GenBank录入号AY100469；GenBank录入号AF43291)和拟南芥(Arabidopsis)(GenBank录入号AC007296)。
就本发明的目的而言，术语“分支酶”或“BE蛋白质”(α-1，4-葡聚糖：α-1，4-葡聚糖-6-糖基转移酶，E.C.2.4.1.18)应理解为指催化转糖基化反应的蛋白质，其中α-1，4-葡聚糖供体的α-1，4-键被水解，在此过程中释放的α-1，4-葡聚糖链被转移至α-1，4-葡聚糖受体链上，在那它们被转变成α-1，6键。
就本发明的目的而言，术语“BEI蛋白”应理解为意指同种型I分支酶(分支酶＝BE)。BEI蛋白优选来自马铃薯植物。在此上下文中，术语同种型是以Smith-White和Preiss提出的命名法为基础的(Smith-White和Preiss，Plant Mol Biol.Rep.12，(1994)，67-71，Larsson等，Plant MolBiol.37，(1998)，505-511)。这一命名法假设在氨基酸水平上与玉米BEI蛋白(GenBank录入号D11081；Baba等，Biochem.Biophys.Res.Commun.181(1)，(1991)，87-94；Kim等，Gene 216，(1998)，233-243)的同源性(同一性)程度比与玉米BEII蛋白(GenBank录入号AF072725、U65948)的同源性程度高的所有酶都被称为同种型I分支酶，缩写为BEI蛋白。
就本发明的目的而言，术语“BEII蛋白”应理解为意指同种型II分支酶(分支酶＝BE)。此酶优选来源于马铃薯植物。就本发明而言，在氨基酸水平上与玉米BEII蛋白(GenBank录入号AF072725、U65948)的同源性(同一性)程度比与玉米BEI蛋白(GenBank录入号D11081、AF072724)的同源性程度高的所有酶都被称为BEII蛋白。
就本发明的目的而言，术语“BEI基因”应理解为意指编码“BEI蛋白”，优选来自马铃薯植物的BEI蛋白的核酸分子(cDNA、DNA)。许多植物中的这类核酸分子已被描述，例如玉米(GenBank录入号D11081、AF072724)、稻(GenBank录入号D11082)、豌豆(GenBank录入号X80010)和马铃薯。来自马铃薯的许多形式的BEI基因或BEI蛋白已有所描述，例如：Khoshnoodi等，Eur.J.Biochem.242(1)，148-155(1996)，GenBank录入号Y 08786和Kossmann等，Mol.Gen.Genet.230，(1991)，39-44)。在马铃薯植物中，BEI基因主要表达于块茎中，而在叶子中只有很微弱程度的表达(Larsson等，Plant Mol.Biol.37，(1998)，505-511)。
就本发明的目的而言，术语“BEII基因”应理解为意指编码“BEII蛋白”，优选来自马铃薯植物的BEII蛋白的核酸分子(cDNA、DNA)。文献中已描述了许多植物中的此类核酸分子，例如马铃薯(GenBank录入号AJ000004、AJ011888、AJ011889、AJ011885、AJ011890、EMBL GenBankA58164)、玉米(AF072725，U65948)、大麦(AF064561)、稻(D16201)和小麦(AF286319)。在马铃薯植物中，BEII基因主要表达于块茎中，而在叶子中很微弱程度地表达(Larsson等，Plant Mol.Biol.37，(1998)，505-511)。
在此上下文中，术语“转基因”应理解为意指本发明植物细胞的遗传信息由于一种或数种外源核酸分子被引入细胞而偏离未被遗传修饰的相应植物细胞。
在本发明进一步的实施方案中，本发明转基因植物细胞的遗传修饰在于引入一种或多种外源核酸分子，所述外源核酸分子的存在和/或表达导致SSIII和BEI和BEII蛋白的活性与未被遗传修饰的野生型植物的相应植物细胞相比有所下降。特别地，术语“遗传操作”应理解为意指将已诱变的同源核酸分子和/或异源核酸分子和/或外源核酸分子引入植物细胞，其中所述这些分子的引入导致SSIII蛋白和/或BEI蛋白和/或BEII蛋白的活性降低。
就本发明的目的而言，术语“外源核酸分子”或“外源核酸分子的”应理解为意指，该分子非天然存在于所述植物细胞中，或该分子不以此特殊的空间排列天然存在于该植物细胞中，或该分子定位于该植物细胞基因组中非天然出现该分子的位点。外源核酸分子优选是由多种元件组成的重组分子，所述元件的组合或特殊的空间排列不天然存在于植物细胞中。
用于遗传修饰的外源核酸分子可采取杂种核酸构建体或多个分离的核酸构建体的形式，尤其是所谓的单、双重和三重构建体。因此，外源核酸分子可以是，例如，所谓的“三重构建体”，该构建体应理解为意指用于植物转化的单一载体，它不仅含有抑制一种或多种内源SSIII基因表达的遗传信息，还含有抑制一种或多种BEI基因表达和抑制一种或多种BEII基因表达的遗传信息，或者它的存在或表达将导致一种或多种SSIII、BEI和BEII蛋白质活性的降低。
在进一步的实施方案中，外源核酸分子可以是所谓的“双重构建体”，它应理解为意指用于植物转化的载体，该载体含有用于抑制三种靶基因(SSIII、BEI、BEII基因)中两种的表达的遗传信息或该载体的存在或表达将导致三种靶蛋白(SSIII、BEI、BEIII蛋白)中两种的活性降低。在本发明的此实施方案中，在含有抑制第三种靶基因的相关遗传信息的独立外源核酸分子的帮助下，第三种靶基因的表达被抑制和/或第三种靶蛋白的活性被降低。
在本发明的另一实施方案中，并不是将三重构建体引入植物细胞的基因组中，而是将多个不同的外源核酸分子引入其中，这些外源核酸分子之一是，例如，作为导致一种或多种内源SSIII基因表达降低的共抑制构建体的DNA分子，而别的外源核酸分子是，例如，编码导致一种或多种内源BEI和/或BEII基因表达降低的反义RNA的DNA分子。不过，在构建外源核酸分子时，如果可以导致编码一种或多种SSIII、BEI及BEII蛋白质的内源基因表达同时降低或导致一种或多种SIII、BEI及BEII蛋白质的活性同时降低，在原则上反义、共抑制、核酶和双链RNA构建体或体内诱变的任何组合也是适用的。
外源核酸分子可以同时(“共转染”)或一个接一个，即在不同时间接连(“超转化”)引入植物细胞的基因组中。
外源核酸分子也可引入同一物种的不同植物个体中。这可以产生一种靶蛋白或两种靶蛋白(BEI、BEII、SSIII)活性降低的植物。随后的杂交可以产生所有三种靶蛋白的活性均降低的植物。
代替野生型植物细胞或植物，可将已显示出一种或多种靶蛋白(BEI、BEII、SSIII)活性降低的突变体进一步用于引入外源核酸分子或用于产生本发明植物细胞或植物。所述突变体可以为自发产生的突变体形式或是通过特殊诱变剂的应用而产生的突变体的形式。上文中已对产生所述突变体的可能方案进行了进一步的描述。
可以通过插入诱变产生或制备本发明的植物细胞和它们的淀粉(综述文章：Thorneycroft等，2001，Journal of experimental Botany 52(361)，1593-1601)。插入诱变应理解为意指，尤其是，将转座子或转移DNA(T-DNA)插入编码BEI蛋白和/或BEII蛋白和/或SSIII蛋白的基因中，从而降低所述细胞中所述蛋白质的活性。
转座子可以是天然存在于细胞中的转座子(内源转座子)或非天然存在于所述细胞中而是通过诸如转化所述细胞等重组方法引入该细胞的转座子(异源转座子)。通过转座子方式改变基因表达是本领域技术人员已知的。在植物生物工程学中利用内源和异源转座子作为工具的综述可参阅Ramachandran和Sundaresan的文章(2001，Plant Physiology andBiochemistry 39，234-252)。鉴定其中特异基因已通过转座子插入诱变而失活的突变体的可能方案参阅Maes等人的综述(1999，Trends in PlantScience 4(3)，90-96)。Hirochika(2001，Current Opinion in Plant Biology4，118-122)描述了借助内源转座子产生稻突变体。借助于内源性逆转录转座子对玉米基因的鉴定示于，例如，Hanley等人的文章(2000，The PlantJournal 22(4)，557-566)。Kumar和Hirochika描述了利用逆转录转座子产生突变体的可能方案和鉴定突变体的方法(2001，Trends in PlantScience 6(3)，127-134)。异源转座子在双子叶植物和单子叶植物不同物种中的活性已有描述，例如，稻(Greco等，2001，Plant Physiology 125，1175-1177；Liu等，1999，Molecular and General Genetics 262，413-420；Hiroyuki等，1999，The Plant Journal 19(5)，605-613；Jeon和Gynheung，2001，Plant Science 161，211-219)、大麦(2000，Koprek等，The PlantJournal 24(2)，253-263)、拟南芥(Arabidopsis thaliana)(Aarts等，1993，Nature 363，715-717，Schmidt and Willmitzer，1989，Molecular andGeneral Genetics 220，17-24；Altmann等，1992，Theoretical and AppliedGentics 84，371-383；Tissier等，1999，The Plant Cell 11，1841-1852)、西红柿(Belzile和Yoder，1992，The Plant Journal 2(2)，173-179)和马铃薯(Frey等，1989，Molecular and General Genetics 217，172-177；Knapp等，1988，Molecular and General Genetics 213，285-290)。
原则上，可以借助同源和异源转座子产生或制备本发明的植物细胞和植物以及它们所产生的淀粉，利用同源转座子还包括已天然存在于植物基因组中的那些转座子。
T-DNA插入诱变是以来自农杆菌的Ti质粒的某些区段(T-DNA)能整合入植物细胞基因组这一事实为基础的。整合入植物染色体的位点不是固定的，而是可能发生于任何位置处。如果T-DNA整合入染色体中赋予基因功能的区段，这就可能导致基因表达的改变并因此还导致所述基因编码的蛋白质活性改变。具体而言，T-DNA整合入蛋白质编码区常常意味着在所述细胞中不再合成活性形式的所述蛋白质或根本不再合成该蛋白质。利用T-DNA的插入来产生突变体的描述有，例如，用于拟南芥的(Krysan等，1999，The Plant Cell 11，2283-2290；Atipiroz-Leehan和Feldmann，1997，Trends in genetics 13(4)，152-156；Parinov和Sundaresan，2000，Current Opinion in Biotechnology 11，157-161)和用于稻的(Jeon和An，2001，Plant Science 161，211-219；Jeon等，2000，The Plant Journal 22(6)，561-570)。鉴定借助于T-DNA插入诱变产生的突变体的方法尤其描述于：Young等(2001，Plant Physiology 125，513-518)、Parinov等(1999，The Plant Cell 11，2263-2270)、Thorneycroft等(2001，Journal of Experimental Botany 52，1593-1601)和McKinney等(1995，The Plant Journal 8(4)，613-622)。
原则上，T-DNA诱变适于产生本发明的植物细胞和生产它们所产生的淀粉。
在本发明的另一实施方案中，一种或多种外源核酸分子的存在和/或表达引起了编码SSIII蛋白、BEI蛋白和BEII蛋白的内源基因表达的抑制。
可用本领域技术人员所熟悉的各种方法产生本发明的植物细胞，例如，造成编码SSIII、BEI或BEII蛋白的内源基因表达受抑制的那些方法。它们包括，例如，表达相应的反义RNA或双链RNA构建体；提供造成共抑制效果的分子或载体；表达特异切割编码SSIII、BEI或BEII蛋白的转录物的适当构建的核酶；或者“体内诱变”。此外，还可以通过同时表达待抑制的特异靶基因(优选SSHI和/或BEI和/或BEII基因)的有义和反义RNA分子来降低植物细胞中SSIII和/或BEI和/或BEII的活性。本领域技术人员对于这些方法是熟知的。
此外，已知在植物中产生启动子序列的双链RNA分子可以反式导致该启动子同源拷贝的甲基化和转录失活(Mette等，EMBO J.19，(2000)，5194-5201)。
降低蛋白质活性的其它方法参阅下文。
所有这些方法基于将一种或多种外源核酸分子引入植物细胞基因组中。
为了通过反义或共抑制技术抑制基因表达，可以在细胞中使用，例如，含有编码SSIII和/或BEI和/或BEII蛋白的所有序列的DNA分子，包括可能存在的任何侧翼序列；或使用只含有部分编码序列的DNA分子，但是该部分序列必须长到足以造成反义效果或共抑制作用。合适的序列通常具有不小于15bp的最小长度，优选100-500bp的长度，为了达到有效的反义抑制作用或共抑制效果，特别可以使用超过500bp的长度的序列。
对于反义或共抑制方法合适的另一可能方案是：使用与编码SSIII、BEI或BEII蛋白且内源性存在于植物细胞中的内源序列具有高度同源性的DNA序列。最小同源程度应超过约65％。优选使用同源水平至少为90％，尤其是95-100％的序列。
使用内含子，即，编码SSIII、BEI和/或BEII蛋白的基因的非编码区也可以达到反义或共抑制效果。
利用内含子序列抑制编码淀粉生物合成蛋白质的基因的表达，描述于国际专利申请WO97/04112、WO97/04113、WO98/37213、WO98/37214。
本领域技术人员熟知实现反义和共抑制效果的方法。共抑制方法描述于，例如，Jorgensen(Trends Biotechnol.8(1990)，340-344)、Niebel等(Curr.Top.Microbiol.Immunol.197(1995)，91-103)、Flavell等(Curr.Top.Microbiol.Immunol.197(1995)，43-46)、Palaqui和Vaucheret(Plant.Mol.Biol.29(1995)，149-159)、Vaucheret等(Mol.Gen.Genet.248(1995)，311-317)、de Borne等(Mol.Gen.Genet.243(1994)，613-621)。
本领域技术人员还知道表达核酶来降低细胞中特定的酶活性，该方法描述于，例如，EP-B1 0321201。植物细胞中核酶的表达已描述于，例如，Feyter等的文章(Mol.Gen.Genet.250(1996)，329-338)。
此外，还可通过“体内诱变”造成植物细胞中SSIII和/或BEI和/或BEII活性的降低，其中通过转化细胞的方式将RNA-DNA寡核苷酸杂种(“chimeroplast”)引入细胞(Kipp，P.B.等，第五届植物分子生物学国际会议展板报告，1997年9月21日-27日，新加坡；R.A.Dixon和C.J.Arntzen，有关“转基因植物中的代谢工程”的会议报告，Keystone SymposiaCopper Mountain，CO，美国，TIBTECH 15，(1997)，441-447；国际专利申请WO 9515972；Kren等，Hepatology 25，(1997)，1462-1468；Cole-Strauss等，Science 273，(1996)，1386-1389；Beetham等，1999，PNAS 96，8774-8778)。
RNA-DNA寡核苷酸中DNA组分的部分与内源SSIII、BEI和/或BEII基因的核酸序列同源，但与内源SSIII、BEI和/或BEII基因的核酸序列相比含有突变或含有同源区域所环绕的异源区域。
由于RNA-DNA寡核苷酸中的同源区与内源核酸分子的碱基配对，随后进行同源重组，RNA-DNA寡核苷酸的DNA组分中所含的突变或异源区可被转移入植物细胞基因组中。这导致一种或多种SSIII、BEI和/或BEII蛋白活性的降低。
此外，也可能通过同时表达待抑制的特异靶基因的有义和反义RNA分子造成植物细胞中SSIII和/或BEI和/或BEII活性的降低，所述的待抑制的特定靶基因优选SSIII和/或BEI和/或BEII基因。
还可通过使用例如，含相应靶基因或部分靶基因的“反向重复”的嵌合构建体来达到此目的。嵌合构建体编码所述靶基因的有义和反义RNA分子。有义和反义RNA在植物内作为一个RNA分子同时合成，有义和反义RNA可以通过一个间隔区相互分开并形成双链RNA分子。
已证实在植物基因组中引入反向重复DNA构建体是抑制相应于此反向重复DNA构建体的基因的非常有效的方法(Waterhouse等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95，(1998)，13959-13964；Wang和Waterhouse，PlantMol.Biol.43，(2000)，67-82；Singh等，Biochemical Society Transactions第28卷第6部分(2000)，925-927；Liu等，Biochemical Society Transactions第28卷第6部分(2000)，927-929；Smith等，Nature 407，(2000)，319-320；国际专利申请WO99/53050 A1)。靶基因的有义和反义序列还可通过相同或不同的启动子彼此独立的表达(Nap，J-P等，第6届植物分子生物学国际会议，Quebec，2000年6月18日至24日；展板S7-27，会议S7)。
因此也可通过产生SSIII和/或BEI和/或BEII基因的双链RNA分子使植物细胞中的SSIII和/或BEI和/或BEII活性降低。为此目的，优选将SSIII和/或BEI和/或BEII基因或cDNA的反向重复DNA分子引入植物基因组中，待转录的DNA分子(SSIII、BEI或BEII基因或cDNA，或这些基因或cDNA的片段)处于控制所述DNA分子表达的启动子的调控下。
此外，在植物中形成启动子DNA分子的双链RNA分子，也被已知可反式导致这些启动子的同源拷贝的甲基化和转录失活，下文中称这些启动子为靶启动子(Mette等，EMBO J.19，(2000)，5194-5201)。
由此，通过靶启动子的失活，可以减少天然处于此靶启动子控制下的特异靶基因(例如SSIII、BEI或BEII基因)的表达。
这意味着含待抑制基因(靶基因)的靶启动子的DNA分子在这种情况下——不同于植物中启动子的原初功能——不被用作基因或cDNA表达的调控元件，而是用作可转录的DNA分子本身。
为了在植物中产生双链靶启动子RNA分子(其中它们可以以RNA发卡分子的形式存在)，优选使用含靶启动子DNA分子的反向重复的构建体，靶启动子DNA分子处于控制所述靶启动子DNA分子基因表达的启动子的控制之下。这些构建体随后被引入植物基因组中。所述靶启动子DNA分子的反向重复的表达导致在植物中形成双链靶启动子RNA分子(Mette等，EMBO J.19，(2000)，5194-5210)。靶启动子可因此被失活。
因此也可通过产生SSIII和/或BEI和/或BEII基因启动子序列的双链RNA分子使植物细胞中的SSIII和/或BEI和/或BEII活性降低。为此目的，优选将SSIII和/或BEI和/或BEII启动子的启动子DNA分子的反向重复引入植物基因组中，待转录的靶启动子DNA分子(SSIII、BEI和/或BEII启动子)处于控制所述靶启动子DNA分子表达的启动子的控制下。
本领域技术人员另外还知道通过表达一种或多种SSIII、BEI和/或BEII蛋白质的非功能性衍生物(尤其是反式显性突变体(trans-dominantmutant))和/或通过表达所述蛋白质的拮抗物/抑制物来操作一种或多种SSIII、BEI和/或BEII蛋白的活性。
所述蛋白质的拮抗物/抑制物包括，例如抗体、抗体片段或具有相似结合特性的分子。例如，在遗传修饰的烟草植物中应用胞质scFv抗体调控光敏色素A蛋白的活性(Owen，Bio/Technology 10(1992)，790-4；综述：Franken，E，Teuschel，U.和Hain，R.，Current Opinion in Biotechnology8，(1997)，411-416；Whitelam，Trends Plant Sci.1(1996)，268-272)。
对于降低靶基因活性的核酸表达，有用的启动子是，例如，花椰菜花叶病毒35S RNA的启动子和玉米泛素启动子(用于组成型表达)，patatin基因启动子B33(Rocha-Sosa等，EMBO J.8(1989)，23-29)，马铃薯金属羧肽酶抑制剂基因的MCPI启动子(匈牙利专利申请HU9801674)或马铃薯GBSSI启动子(国际专利申请WO 92/11376)(用于在马铃薯中块茎特异表达)，或者确保只在光合活性组织中表达的启动子，例如ST-LS1启动子(Stockhaus等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84(1987)，7943-7947；Stockhaus等，EMBO J.8(1989)，2445-2451)、Ca/b启动子(参阅，例如，US 5656496、US 5639952、Bansal等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA89，(1992)，3654-3658)和Rubisco SSU启动子(参阅，例如，US 5034322、US 4962028)，或者，用于胚乳特异性表达的谷蛋白启动子(Leisy等，PlantMol.Biol.14，(1990)，41-50；Zheng等，Plant J.4(1993)，357-366；Yoshihara等，FEBS Lett.383，(1996)，213-218)、Shrunken-1启动子(Werr等，EMBO J.4，(1985)，1373-1380)、小麦HMG启动子、USP启动子、菜豆蛋白启动子或来自玉米的玉米醇溶蛋白基因启动子(Pedersen等，Cell 29，(1982)，1015-1026；Quatroccio等，Plant Mol.Biol.15(1990)，81-93)。
外源核酸分子在贮存淀粉的那些植物器官中表达是特别有利的。这些器官的实例是马铃薯的块茎或玉米、小麦或稻植物的种子或胚乳。这是为何优选使用在这些器官中表达的启动子的原因。
不过，还可以使用只在由外部因素所决定的时间点被激活的启动子(参阅，例如，WO 93/07279)。在此上下文中可能特别有意义的启动子是热休克蛋白的启动子，它可以进行简单的诱导。其它可以的启动子是种子特异性启动子，诸如，蚕豆USP启动子，它确保在蚕豆和其它植物中的种子特异性表达(Fiedler等，Plant Mol.Biol.22，(1993)，669-679；Baumlein等，Mol.Gen.Genet.225，(1991)，459-467)。此外还可应用果实特异性启动子，诸如WO91/01373中所述的那些启动子。
另一可能存在的元件是终止序列，它用于转录的正确终止和在转录物上添加poly-A尾，poly-A尾被认为具有稳定转录物的功能。这样的元件描述于文献(例如，Gielen等，EMBO J.8(1989)，23-29)并可按需要进行替代。
本发明的转基因植物细胞合成改性的淀粉，与野生型植物中合成的淀粉相比，所述改性淀粉的理化特性，尤其是直链淀粉含量和直链淀粉/支链淀粉比率、磷酸含量、粘性、凝胶强度、粒度和/或颗粒形态发生改变，从而更适应于特定用途。
因此本发明还涉及本发明的遗传修饰植物细胞，尤其是转基因植物细胞，其合成改性的淀粉。
令人惊讶的是，已发现在本发明的植物细胞中淀粉的组成发生改变，即，与相应野生型植物的植物细胞的淀粉相比，改性淀粉中直链淀粉含量至少为30％且磷酸含量增加且RVA分析中的终粘度提高，从而使这种淀粉更适于特定的用途。
本发明的淀粉尤其具有尽管直链淀粉含量增加，但仍然能够在标准条件下完全糊化的优势。与直链淀粉含量增加的其它淀粉相比较，这显著提高了本发明淀粉的加工性能。因此温度提高或压力增大不是本发明的淀粉糊化所必需的。这就是为何在分解这些淀粉时无需使用诸如蒸汽加压锅、挤压机或压热器等特殊设备的原因。本发明的淀粉的另一优势是，当用热轧机(hot rollers)进行加工时，它们可以以悬浮液的形式应用于这种机器上。其它直链淀粉含量增加的淀粉在进行此类加工时，即使有，也只是有限程度地糊化，且不能以糊或膜形式应用于所述轧机中。
本发明的淀粉特别适用于所添加物质的增稠能力、糊化特性或粘合特性尤为重要的所有应用中。因此，本发明的淀粉尤其适用于生产食品，诸如烘焙品、速熟食品、牛奶冻(blancmange)、汤、糖果、巧克力、冰激凌、用于鱼或肉的糊、冷冻甜食或挤压成形的点心。此外，本发明的淀粉适用于生产胶水，用于纺织品加工中，作为建筑材料添加剂，用于动物营养领域，作为化妆品的添加剂，以及用于造纸业中。
分离自本发明的植物细胞的淀粉特别适用于生产预糊化的淀粉。预糊化淀粉是主要通过湿热处理而产生的物理改性淀粉。与天然淀粉相反的是，它们与冷水形成分散体/糊或凝胶，这取决于所用的预糊化淀粉的浓度并随生产预糊化淀粉的淀粉类型而变。由于这些特性，预糊化淀粉在食品工业和此外的许多工业领域内具有一系列可能的实用性。利用又称为冷溶胀淀粉的预糊化淀粉替代天然淀粉常常具有可以简化和缩短生产过程的好处。
例如，速食甜食和速食牛奶冻的生产需要可以在混入冷的液体诸如水或牛奶等后在短时间内形成结实的凝胶(就象例如需要煮沸的牛奶冻一样)的预糊化淀粉。用小麦淀粉、马铃薯淀粉或玉米淀粉制备的商业预糊化淀粉不能满足这些要求。对于目前可以商品获得的预糊化淀粉，为了获得上述特性，需要在预糊化淀粉中加入诸如明胶、藻酸盐、角叉藻聚糖和/或无机盐等添加剂。而例如，在利用分离自本发明植物细胞的本发明淀粉生产预糊化淀粉后，则无需添加所谓的助剂。
本发明还涉及含有颗粒形态改变的改性淀粉的本发明植物细胞。
就本发明的目的而言，术语“颗粒形态”意指天然淀粉颗粒的大小和表面结构。淀粉以颗粒形式的晶体结构贮存于诸如植物的块茎、根、胚或胚乳之类的植物贮藏器官中。在淀粉从植物细胞中分离后仍保持这些颗粒结构的淀粉颗粒被称为天然淀粉(native starch)。本发明的天然淀粉的平均粒度(用下述方法测定)明显低于分离自野生型植物的天然淀粉。在扫描电镜照片中(见图4和5)明显可见本发明的天然淀粉颗粒具有令人惊讶的多孔的粗糙表面。相反，分离自野生型植物的天然淀粉颗粒的表面结构主要是平滑的且无可辨别的孔。
由于以较小颗粒存在并且有带孔的粗糙表面，从而导致了在相同体积时，本发明的淀粉颗粒的表面积比分离自野生型植物的淀粉颗粒的表面积大许多。本发明的淀粉因此特别适于用作如调味剂、药理学活性物质、益生素、益生微生物、酶或着色剂的载体。这些淀粉也特别适用于凝固物质和用于造纸。
本发明淀粉的另一可能的应用是用于原材料的钻探领域。在钻探原油时，必须应用助剂和/或润滑剂以避免钻头或钻柱过热。由于其特殊的糊化特性，本发明的淀粉由此还特别适用于这一领域。
本发明还涉及含有改性的淀粉的本发明植物细胞，与来自未经遗传修饰的野生型植物的相应植物细胞的淀粉相比，所述的改性淀粉中直链淀粉的含量至少为30％，且磷酸含量增加，在RVA分析中的终粘度提高。
在本发明中，用下文针对马铃薯淀粉进一步描述的Hovenkamp-Hermelink等人的方法(Potato Research 31，(1988)，241-246)测定直链淀粉的含量。此方法还可用于从其它植物物种中分离的淀粉。分离淀粉的方法是本领域技术人员所已知的。
就本发明的目的而言，淀粉的“磷酸含量“指以淀粉磷酸单酯的形式共价结合的磷酸含量。
就本发明而言，术语“增加的磷酸含量”指，与来自相应野生型植物的植物细胞的淀粉相比，本发明植物细胞所合成的淀粉中共价结合的磷酸的总磷酸含量和/或C-6位置处的磷酸含量增加，优选至少增加270％，更优选至少增加300％，尤其优选至少增加350％。
就本发明的目的而言，“C6位置处的磷酸含量”应理解为指与淀粉的葡萄糖单体的碳原子位置“6”键合的磷酸基团的含量。原则上，淀粉中葡萄糖单元的C2、C3和C6位置在体内都可以被磷酸化。就本发明而言，可利用可见酶学试验(visual-enzymatic test)(Nielsen等，Plant Physiol.Los，105，(1994)，111-117)(见下文)测定葡萄糖-6-磷酸，从而测定C6位置的磷酸含量(＝C6-P含量)。
就本发明而言，术语淀粉的“总磷酸含量”指以淀粉磷酸单酯的形式与葡萄糖单元的C2、C3和C6位置共价结合的磷酸的含量。依照本发明，诸如磷脂等磷酸化的非葡聚糖的含量不在术语“总磷酸含量”中。因此磷酸化的非葡聚糖必须在测定总磷酸含量前定量去除。将磷酸化非葡聚糖(例如磷脂)与淀粉分离的方法是本领域技术人员已知的。测定总磷酸含量的方法是本领域技术人员已知的且描述于下文。
在本发明的另一实施方案中，本发明植物细胞合成了在淀粉葡萄糖单体的C6位置磷酸含量为每mg淀粉40-120nmol，尤其是60-110nmol，优选为80-100nmol C6-P的淀粉。
进行RVA分析的方案在下文有进一步的描述。尤其必须提及，马铃薯淀粉的RVA分析常常用8％的淀粉悬浮液(w/w)进行操作。与设备“RVAsuper3”一起提供的文件(说明书，Newport Scientific Pty Ltd.，Investment Support Group，Warried NSW 2102，澳大利亚)推荐使用大约含10％淀粉的悬浮液来分析马铃薯淀粉。
令人惊讶的是，已发现对于来自本发明的马铃薯植物的淀粉，不可能使用8％的淀粉悬浮液(在25ml水中有2g淀粉)来进行分析，因为终粘度达到的值超出了仪器的量程。这就是为何用仅6％的淀粉悬浮液(在25ml水中有1.5g淀粉)置换8％的淀粉悬浮液进行RVA分析的原因。就本发明而言，“RVA分析中终粘度增加”因此应理解为指，与未经遗传修饰的野生型植物相比，终粘度提高至少150％，尤其是至少200％，尤其是至少250％。在本文中，终粘度的增加与6％的淀粉悬浮液相关。
此外，本发明马铃薯淀粉理解为指在用6％的淀粉含量进行的RVA分析中终粘度至少为300RVU、尤其是400RVU、特别是500RVU的马铃薯淀粉。RVU值的测定将在下文详细讨论。
在另一优选的实施方案中，本发明涉及合成改性的淀粉的本发明植物细胞，所述改性淀粉在水中糊化后形成的凝胶与未被遗传修饰的相应野生型植物细胞的淀粉形成的凝胶相比，其凝胶强度提高。
就本发明的目的而言，术语“提高的凝胶强度”应理解为指，与来自未经遗传修饰的相应野生型植物细胞的淀粉的凝胶强度相比，凝胶强度优选提高至少300％，尤其是至少500％，更优选至少700％，特别优选至少800％，最高不超过2000％或不超过1500％。
就本发明而言，在下文所述条件下用质构分析仪(Texture Analyser)测定凝胶强度。
为了制备淀粉凝胶，必须首先通过在水悬浮液中持续搅拌加热破坏天然淀粉的晶体结构。通过快速粘度分析仪(Rapid Visco Analyser)(Newport Scientific Pty Ltd.，Investment Support Group，WarriewodNSW 2102，澳大利亚)进行此项工作。正如上文已提及的，当淀粉来自马铃薯植物时，用仅6％的淀粉悬浮液代替8％的淀粉悬浮液，因为8％悬浮液的终粘度超出了仪器的测量范围。为了测定凝胶强度，将于快速粘度分析仪中糊化的淀粉悬浮液贮存一定的时间，然后用质构分析仪进行分析。因此，在测定凝胶强度时，8％的糊化淀粉悬浮液也被6％的糊化淀粉悬浮液所替代。
在本发明的另一实施方案中，本发明植物细胞中合成的改性淀粉与相应野生型植物的淀粉的区别不仅在于直链淀粉的含量增加和磷酸含量增加及RVA分析中终粘度的提高，还在于改变的侧链分布。
在另一实施方案中，本发明由此涉及合成改性的淀粉的本发明植物细胞，所述的改性淀粉的特征在于改变的侧链分布。在本发明的一个实施方案中，术语“改变的侧链分布”应理解指与来自野生型植物的支链淀粉中DP为6至11的短侧链的量相比，DP(＝聚合度)为6至11的短侧链的量减少至少10％，优选至少15％，特别是至少30％和尤其优选至少50％，以及/或与来自野生型植物的支链淀粉中DP为16至22的短侧链的量相比，DP为6至22的短侧链的含量增加至少5％，优选至少10％，特别是至少15％和尤其优选至少30％。
通过测定在所有侧链的总和中特定短侧链的百分数来确定短侧链的量。通过测定HPLC层析谱中代表DP6-26的聚合度的峰下总面积来确定所有侧链的总和。通过测定HPLC层析谱中代表某一特殊侧链的峰下的面积占总面积的比率来确定该侧链占所有侧链总和的百分率。可用于确定峰面积的程序有，例如，来自美国Dionex的Chromelion 6.20。
在本发明另外的实施方案中，合成于本发明植物细胞中的改性的淀粉与来自相应野生型植物的淀粉相比，其区别不仅在于直链淀粉含量增加和磷酸含量增加及RVA分析中的终粘度提高，还在于改变的“DP12至18的侧链分布”和/或改变的“DP19至24的侧链分布”和/或改变的“DP25至30的侧链分布”和/或改变的“DP37至42的侧链分布”和/或改变的“DP62至123的侧链分布”。
就本发明而言，术语改变的“DP12至18的侧链分布”应理解为指，与来自野生型植物的DP为12至18的支链淀粉侧链的量相比，DP为12至18的支链淀粉侧链的量降低至少25％，优选至少35％，尤其优选至少45％和特别优选至少55％。
就本发明而言，术语改变的“DP19至24的侧链分布”应理解为指，与来自野生型植物的DP为19至24的支链淀粉侧链的量相比，DP为19至24的支链淀粉侧链的量降低至少10％，优选降低至少20％，尤其优选降低至少30％。
就本发明而言，术语改变的“DP25至30的侧链分布”应理解为指，与来自野生型植物的DP为25至30的支链淀粉侧链的量相比，DP为25至30的支链淀粉侧链的量降低至少5％。
就本发明而言，术语改变的“DP37至42的侧链分布”应理解为指，与来自野生型植物的DP为37至42的支链淀粉侧链的量相比，DP为37至42的支链淀粉侧链的量增加至少5％，优选至少10％，尤其优选至少15％。
就本发明而言，术语改变的“DP62至123的侧链分布”应理解为指，与来自野生型植物的DP为62至123的支链淀粉侧链的量相比，DP为62至123的支链淀粉侧链的量增加至少20％，优选至少35％，尤其优选至少50％。
通过测定GPC层析谱中一组特定侧链占所有侧链总和的百分率来确定侧链的分布。为此目的，将GPC层析谱曲线下的总面积划分成各个区段，每一个代表不同长度的一组侧链。所选区段包括具有以下聚合度(DP＝一条侧链中葡萄糖单体的数目)的侧链：DP≤11、DP12-18、DP19-24、DP25-30、DP31-36、DP37-42、DP43-48、DP49-55、DP56-61和DP62-123。为了将洗脱体积与分子量联系起来，用葡聚糖标准品(Fluka，产品编号31430)校准所用的GPC柱。所用的葡聚糖、它们的相关分子量和洗脱体积示于图9。利用产生的校准曲线图，洗脱图按分子量分布显示。为了测定各个侧链的分子量，设定葡萄糖的分子量为162。在GPC层析谱曲线下的总面积被设为100％，基于占总面积的百分率来计算各个区段面积的百分率。
在另一特别优选的实施方案中，与野生型植物支链淀粉中DP大于123的侧链的量相比，在来自本发明植物细胞或本发明植物的本发明淀粉中支链淀粉显示出DP大于123的支链淀粉侧链的量增加。
本发明的植物细胞可用于整株植物的再生。
可通过本发明的转基因植物细胞的再生获得的植物同样也是本发明的主题。
本发明的植物细胞可属于任何植物物种，即，属于单子叶植物和双子叶植物。它们优选是农业上有用的植物，即，为了营养或技术(尤其是工业的目的)所种植的植物的植物细胞。本发明优选涉及形成纤维的植物(例如亚麻、大麻、棉)、贮油植物(例如油籽油菜(oilseed rape)、向日葵、大豆)、贮糖植物(例如甜菜、甘蔗、糖粟(sugar millet))和贮存蛋白质的植物(例如豆类)。
在另一优选的实施方案中，本发明涉及饲料植物，特别是青饲草和饲草(紫苜蓿、三叶草等等)和蔬菜植物(例如西红柿、莴苣、菊苣)。
在另一优选的实施方案中，本发明涉及来自淀粉贮存植物(例如，小麦、大麦、燕麦、黑麦、马铃薯、玉米、稻、豌豆、木薯)的植物细胞，尤其优选来自马铃薯的植物细胞。
有多种技术可用于将DNA引入植物宿主细胞中。这些技术包括通过T-DNA转化植物细胞(利用根癌农杆菌或发根农杆菌作为转化剂)、原生质体的融合、注射、DNA的电穿孔、通过生物轰击方法引入DNA以及其它的可能方案。
已对农杆菌介导的植物细胞转化的应用进行了深入的研究并充分描述于：EP 120516；Hoekema，二元植物载体系统(The Binary Plant VectorSystem)Offsetdrukkerij Kanters B.V.，Alblasserdam(1985)，第五章；Fraley等，Crit.Rev.Plant Sci.4，1-46和An等，EMBO J.4，(1985)，277-287。至于马铃薯的转化，参阅，例如，Rocha-Sosa等，EMBO J.8，(1989)，29-33)。
利用载体基于农杆菌的转化来转化单子叶植物已有描述(Chan等，Plant Mol.Biol.22，(1993)，491-506；Hiei等，Plant J.6，(1994)271-282；Deng等，Science in China 33，(1990)，28-34；Wilmink等，Plant Ceu Reports 11，(1992)，76-80；May等，Bio/Technology 13，(1995)，486-492；Conner和Domisse，Int.J.Plant Sci.153(1992)，550-555；Ritchie等，Transgenic Res.2，(1993)，252-265)。转化单子叶植物的备选体系是通过生物轰击方式进行转化(Wan和Lemaux，Plant Physiol.104，(1994)，37-48；Vasil等，Bio/Technology 11(1993)，1553-1558；Ritala等，Plant Mol.Biol.24，(1994)，317-325；Spencer等，Theor.Appl.Genet.79，(1990)，625-631)、原生质体转化、部分透化细胞的电穿孔、通过玻璃纤维方式引入DNA。尤其是玉米的转化在文献中已有反复的描述(参阅，例如，WO 95/06128、EP0513849、EP0465875、EP0292435；Fromm等，Biotechnology 8，(1990)，833-844；Gordon-Kamm等，Plant Cell2，(1990)，603-618；Koziel等，Biotechnology 11(1993)，194-200；Moroc等，Theor.Appl.Genet.80，(1990)，721-726)。
也已有对其它谷类物种的成功转化的描述，例如大麦(Wan和Lemaux，见上文；Ritala等，见上文；Krens等，Nature 296，(1982)，72-74)和小麦(Nehra等，Plant J.5，(1994)，285-297)。所有上述方法都适用于本发明的目的。
在植物细胞中具活性的任何启动子通常都适用于表达外源核酸分子。可以选择启动子，以便它可以在本发明植物中组成性表达，或在植物发育中特定的时间点或由外部因素决定的时间点，只在特定组织中表达。对于植物，启动子可以是同源或异源的。
在本发明另一实施方案中，为了降低一种或多种SSIII蛋白和/或BEI蛋白和/或BEII蛋白的活性，至少一种反义RNA被表达于植物细胞中。
本发明因此还涉及本发明植物细胞，其中所述外源核酸分子选自：
a)编码至少一种反义RNA的DNA分子，所述反义RNA造成编码SSIII蛋白和/或BEI蛋白和/或BEII蛋白的至少一种内源基因的表达减少；
b)通过共抑制作用导致编码SSIII蛋白和/或BEI蛋白和/或BEII蛋白的至少一种内源基因表达减少的DNA分子；
c)编码至少一种核酶的DNA，所述核酶特异切割编码SSIII蛋白和/或BEI蛋白和/或BEII蛋白的至少一种内源基因的转录物；和
d)通过体内诱变方式引入的核酸分子，所述核酸分子在编码SSIII蛋白和/或BEI蛋白和/或BEII蛋白的至少一种内源基因中导致突变或外源序列插入，该突变或插入造成编码SSIII蛋白和/或BEI蛋白和/或BEII蛋白的至少一种基因的表达减少，或合成无活性的SSIII和/或BEI和/或BEII蛋白。
e)同时编码至少一种反义RNA和至少一种有义RNA的DNA分子，其中所述反义RNA和所述有义RNA形成导致编码SSIII蛋白和/或BEI蛋白和/或BEII蛋白的至少一种内源基因表达降低的双链RNA分子；
f)含转座子的DNA分子，其中转座子序列的整合在编码SSIII蛋白和/或BEI蛋白和/或BEII蛋白的至少一种内源基因中导致突变或插入，所述突变或插入造成编码SSIII蛋白和/或BEI蛋白和/或BEH蛋白的至少一种基因表达降低或导致无活性SSIII和/或BEI和/或BEII蛋白合成；以及
g)T-DNA分子，其中，该分子通过插入编码SSIII蛋白和/或BEI蛋白和/或BEII蛋白的至少一种内源基因中，导致编码SSIII蛋白和/或BEI蛋白和/或BEII蛋白的至少一种内源基因表达降低，或导致无活性的SSIII和/或BEI和/或BEII蛋白合成。
另一方面，本发明涉及本发明植物的任何种类的繁殖材料。
本发明的另一方面涉及利用本文所述核酸分子产生本发明的植物细胞和植物。
本发明的又一方面涉及含有至少一种上述核酸分子的组合物，其中此至少一种核酸分子在引入植物细胞中后导致内源性存在于植物细胞中的至少一种SSIII蛋白和内源性存在于植物细胞中的至少一种BEII蛋白减少，以及优选地还导致内源性存在于植物细胞中的至少一种BEI蛋白减少。所述组合物可以包含一种或多种核酸构建体(参阅上文)。
本发明的另一方面涉及利用本发明组合物产生本发明的植物细胞和植物，还涉及含有本发明的组合物的宿主细胞，尤其是植物细胞。
而本发明另外的方面涉及植物细胞转化体系，其包括至少一种核酸分子和至少一种植物细胞，其中所述至少一种核酸分子导致在各种情况下内源性存在于植物细胞中的至少一种SSIII、BEI和BEII蛋白的活性降低，除非由于所述植物细胞中已有的遗传修饰，所述蛋白质的活性已被降低。就本发明的目的而言，“转化体系”由此涉及至少一种待转化的植物细胞和至少一种用于转化的上述核酸分子的组合。植物细胞转化领域内的本领域技术人员所熟悉的且是转化过程中所需要的其它组分，包括缓冲液等，可存在于本发明的转化体系中。
附图描述
图1：
马铃薯植物淀粉的粘度特性的图示。使用快速粘度分析仪(NewportScientific Pty Ltd.，Investment Support Group，Warriwod NSW 2102，澳大利亚)进行分析。分析进行的条件描述于“一般方法”一章中的RVA分析法1。测试淀粉分离自野生型植物(WT)、SSIII蛋白和BEI蛋白活性降低的植物(038VL008和038VL107)的块茎或分离自SSIII蛋白和BEI蛋白和BEII蛋白活性降低的植物(110CF003和108CF041)。通过描述于“实施例”、“马铃薯淀粉的提取方法”的方法分离淀粉。
图2：
马铃薯植物淀粉的粘度特性的图示。使用快速粘度分析仪(NewportScientific Pty Ltd.，Investment Support Group，Warriewod NSW 2102，澳大利亚)进行分析。分析进行的条件描述于“一般方法”一章中的RVA分析法2。测试淀粉分离自野生型植物(WT)、SSIII蛋白和BEI蛋白活性降低的植物(038VL008和038VL107)或SSIII蛋白和BEI蛋白和BEII蛋白活性降低的植物(110CF003和108CF041)的块茎。通过描述于“实施例”、“马铃薯淀粉的提取方法”的方法分离淀粉。
图3：
马铃薯植物淀粉的粘度特性的图示。使用快速粘度分析仪(NewportScientific Pty Ltd.，Investmet Support Group，Warriewod NSW 2102，Australia)。分析所进行的条件描述于“一般方法”一章的RVA分析法3。测试淀粉分离自野生型植物(WT)、具有降低的SSIII蛋白质和BEI蛋白质活性的植物(038VL008和038VL107)或具有降低的SSIII蛋白质和BEI蛋白质及BEII蛋白质活性的植物(110CF003和108CF041)的块茎，通过描述于“实施例”、“马铃薯淀粉的提取方法”的方法分离淀粉。
图4：
分离自野生型植物的马铃薯淀粉颗粒的扫描电镜显微照片。
图5：
分离自具有降低的SSIII蛋白质和BEI蛋白质及BEII蛋白质活性的植物(110CF003)的马铃薯淀粉颗粒的扫描电镜显微照片。
图6：
载体pGSV71-α-BEII-basta的示意图，该载体用于再转化已观察到SSIII蛋白质和BEI蛋白质活性降低的植物。
(RB：T-DNA左边界，LB：T-DNA右边界；CaMV35：花椰菜花叶病毒35S启动子；NOS：根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)胭脂碱合酶基因的聚腺苷酸化序列；OCS：根癌农杆菌章鱼碱合酶基因的聚腺苷酸化序列；B33：马铃薯patatin基因的启动子；BEII：马铃薯BEII基因的编码序列；bar：编码吸水链霉菌(Streptomyces hygroscopicus)膦丝菌素乙酰转移酶的序列)。
图7：
载体pB33-α-BE-α-SSIII-Kan的示意图，该载体用于产生具有降低的SSIII蛋白质和BEI蛋白质活性的转基因植物(RB：T-DNA左边界，LB：T-DNA右边界；nos5′：根癌农杆菌胭脂碱合酶基因的启动子；nptII：编码新霉素磷酸转移酶活性的基因；nos3：根癌农杆菌胭脂碱合酶基因的聚腺苷酸化序列；OCS：根癌农杆菌章鱼碱合酶基因的聚腺苷酸化序列；B33：马铃薯Patatin基因的启动子；BE：马铃薯BEI基因的编码序列；SSIII：马铃薯SSIII基因的编码序列)。
图8：
此图显示来自038VL008、108CF041和野生型株系的淀粉的支链淀粉的完整洗脱图。如此图所示，与背景038VL008和/或相应的野生型相比，108CF041系中较大侧链的数量明显更高。
图9：
具有相应葡聚糖标准的校准曲线和表格
图10：
此图显示来自038VL008、108CF041和野生型株系的淀粉的支链淀粉的完整洗脱图。与图8相反，该x轴不表示洗脱体积，而表示分子量。借助于图9校准图表，图8的洗脱图被显示为分子量分布的函数。
图11：
此图表示与来自野生型植物的支链淀粉的侧链分布相比，来自038VL008系植物的支链淀粉的侧链分布。
图12：
此图表示与来自野生型植物的支链淀粉的侧链分布相比，来自108CF041系植物的支链淀粉的侧链分布。
序列说明
Seq ID 1：
马铃薯(Solanum tuberosum)淀粉合酶SSIII的核酸序列，其中指出编码相应SSIII蛋白质的序列。
Seq ID 2：
马铃薯SSIII蛋白质的氨基酸序列。
Seq ID 3：
马铃薯(Solanum tuberosum)SSIII蛋白质Pfam cbm25结合域的氨基酸序列。
Seq ID 4：
马铃薯(Solanum tuberosum)分支酶BEI的核酸编码序列。
Seq ID 5：
马铃薯(Solanum tuberosum)分支酶BEI的氨基酸序列。
Seq ID 6：
马铃薯(Solanum tuberosum)分支酶BEII的核酸编码序列。
Seq ID 7：
马铃薯(Solanum tuberosum)分支酶BEII的氨基酸序列。
Seq ID 8：
PCR扩增的马铃薯(Solanum tuberosum)分支酶BEII核酸序列。
一般方法
以下方法被用于实施例中：
淀粉分析
a)直链淀粉含量以及直链淀粉/支链淀粉比例的测定
通过标准方法从马铃薯植物中分离淀粉，并通过Hovenkamp-Hermelink等人(Potato Research 31，(1988)，241-246)描述的方法测定直链淀粉含量和直链淀粉∶支链淀粉比例。
b)磷酸含量测定
在淀粉中，葡萄糖单元的C2、C3和C6位置可以被磷酸化。为了测定淀粉的C6-P含量，于95℃在500μl 0.7M HCl中水解50mg淀粉4h。然后以15500g对样品离心10分钟，并移走上清液。将7μl上清液与193μl咪唑缓冲液(100mM咪唑，pH 7.4；5mM MgCl2、1mM EDTA和0.4mMNAD)混合。在光度计中于340nm进行测量。在确立基础吸收之后，加入两单位葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(来自肠膜明串珠菌(Leuconostocmesenteroides)，Boehringer Mannheim)起始酶反应。吸收的改变与淀粉G-6-P含量的浓度直接成比例。
通过Ames(Methods in Enzymology VIII，(1966)，115-118)的方法直接测定磷酸总含量。
用30μl硝酸镁乙醇溶液处理约50mg淀粉并在马弗炉中于500℃灰化3小时。用300μl 0.5M的盐酸处理残余物并在60℃孵育30分钟。随后将一份等分试样补到300μl 0.5M的盐酸并加到100μl 10％的抗坏血酸和600μl 0.42％的钼酸铵(于2M硫酸中)的混合物中，并在45℃孵育20分钟。
之后以一个磷酸校准系列为标准，于820nm进行光度测定。
c)凝胶强度测定(质构分析仪)
在RVA仪中，于25ml水悬浮液中糊化1.5g淀粉(DM)(温度程序：见条目d：“通过Rapid Visco Analyser(RVA)测定粘度特性”)并随后在密封的容器中于室温保藏24小时。将样品固定于来自Stable Micro Systems(Surrey，UK)的Texture Analyser TA-XT2的探头(具有平坦表面的圆形活塞)下并使用以下参数测定凝胶强度：
-测试速度    0.5mm/s
-穿入深度    7mm
-接触表面    113mm2
-压力        2g
d)通过Rapid Visco Analyser(RVA)测定粘度特性
标准方法
将2g淀粉(DM)吸收进25ml H2O(VE-型水，导电性至少15百万欧姆)中，并用于在Rapid Visco Analyser(Newport Scientific Pty Ltd.，Investmet Support Group，Warriewod NSW 2102，Australia)中分析。按照制造商的说明操作仪器。根据制造商的操作手册(将此作为参考整合进说明书)，以RVU表示粘度值。为了确定淀粉水溶液的粘度，首先在50℃对淀粉悬浮液加热1分钟(步骤1)，然后以每分钟12℃的速率从50℃加热到95℃(步骤2)。然后将温度在95℃保持2.5分钟(步骤3)。随后以每分钟12℃的速率从95℃将溶液冷却到50℃(步骤4)。在整个过程中测定粘度。
特别是在这些情况下，即当应用2.0g(DM)淀粉于25ml H2O(VE-型水，导电性至少15mega ohm)中而RVA的测量范围的界限不足时，则只在25ml H2O(VE-型水，导电性至少15mega ohm)中吸收进1.5g淀粉(DM)。
为了与现有技术相比较，在某些情况下还使用了修改的温度曲线。以下温度曲线被使用：
RVA分析法1：
为了测定6％淀粉水溶液的粘度，首先以960rpm对淀粉悬浮液搅拌10秒钟，并随后以160rpm的搅拌速度在50℃加热，最初为1分钟(步骤1)。然后以每分钟12℃的加热速率将温度从50℃升高到95℃(步骤2)。将温度在95℃保持2.5分钟(步骤3)并随后以每分钟12℃从95℃冷却到50℃(步骤4)。在最后的步骤中(步骤5)，将50℃的温度保持两分钟。
程序结束之后，移走搅拌器并盖住烧杯。24小时之后即可获得用于质构分析的糊化淀粉。
RVA分析法2：
为了测定6％淀粉水溶液的粘度，首先以960rpm对淀粉悬浮液搅拌10秒钟，并随后以160rpm的搅拌速度在50℃加热，最初为两分钟(步骤1)。然后以每分钟1.5℃的加热速率将温度从50℃升高到95℃(步骤2)。将温度在95℃保持15分钟(步骤3)并随后以每分钟1.5℃从95℃冷却到50℃(步骤4)。在最后的步骤中(步骤5)，将50℃的温度保持15分钟。
程序结束之后，移走搅拌器并盖住烧杯。24小时之后即可获得用于质构分析的糊化淀粉。
RVA分析法3：
为了测定10％淀粉水溶液的粘度，首先以960rpm对淀粉悬浮液搅拌10秒钟，并随后以160rpm的搅拌速度在50℃加热，最初为两分钟(步骤1)。然后以每分钟1.5℃的加热速率将温度从50℃升高到95℃(步骤2)。将温度在95℃保持15分钟(步骤3)并随后以每分钟1.5℃从95℃冷却到50℃(步骤4)。在最后的步骤中(步骤5)，将50℃的温度保持15分钟。该RVA分析谱相应于使用于WO9634968的谱。
程序结束之后，移走搅拌器并盖住烧杯。24小时之后即可获得用于质构分析的糊化的淀粉。
该RVA分析谱包括用于比较不同的测量和物质的参数。在本发明的上下文中，以下术语按如下理解：
1.最大粘度(RVA Max)
最大粘度被理解为以RVU测量的、在温度曲线的步骤2或3获得的最大粘度值。
2.最小粘度(RVA Min)
最小粘度被理解为以RVU测量的、于最大粘度之后在温度曲线中观察到的最小粘度值。通常，这发生在温度曲线的步骤3。
3.终粘度(RVA Fin)
终粘度被理解为以RVU测量的、在测量结束时观察到的粘度值。
4.回拨(Setback)(RVA Set)
所谓“回拨”通过将曲线中最大粘度之后产生的最小值减去终粘度值而计算。
5.糊化温度(RVA T)
糊化温度被理解为温度曲线中的时间点，在此时间点，粘度首次在短时间内剧烈增加。
e)通过离子交换层析分析支链淀粉的侧链分布
为了分离直链淀粉和支链淀粉，于50ml反应容器内，使用12ml 90％(v/v)的DMSO水溶液溶解200mg淀粉。加入3倍体积的乙醇后，于室温(RT)以约1800g离心10分钟分离沉淀。然后用30ml乙醇洗涤沉淀，干燥并于75℃溶解于40ml 1％(w/v)的NaCl溶液。溶液冷却到30℃以后，缓慢加入约90mg麝香草酚，并在30℃对此溶液孵育至少60h。然后以2000g(RT)对溶液离心30分钟。之后用3倍体积的乙醇处理上清液，并通过2000g(RT)离心5分钟分离沉淀出的支链淀粉。然后用乙醇洗涤沉淀(支链淀粉)并用丙酮干燥。通过向沉淀加入DMSO，获得1％的溶液，200μl的此溶液被345μl的水、10μl的0.5M醋酸钠(pH 3.5)和5μl的异淀粉酶(1∶10稀释，Megazyme)处理，并于37℃孵育约16小时。随后通过0.2μm的滤器过滤此消化物1∶5的水稀释液，并通过离子层析(HPAEC-PAD，Dionex)分析100μl的此滤液。使用PA-100柱(具有适当的前置柱)进行分离，而使用电流测定法进行检测。洗脱条件如下：
溶液A-0.15M NaOH
溶液B-1M醋酸钠于0.15M NaOH中
  t(分钟)   溶液A(％)   溶液B(％)
  5   0   100
  35   30   70
  45   32   68
  60   100   0
  70   100   0
  72   0   100
  80   0   100
  终止
表1：在HPEAC-PAD Dionex分析中，用于支链淀粉侧链分析的洗脱缓冲液在不同时间的组成。在所述时间之间，洗脱缓冲液的组成总是以线性变化。
短侧链在所有侧链的总和中的相对量的测定是经由特定侧链在所有侧链总和中的百分数的测定来进行。所有侧链的总和是通过测定HPLC层析谱中表示DP6到26聚合度的峰之下的总面积来确定的。
特定侧链在所有侧链的总和中的百分数是经由测定HPLC层析谱中表示该侧链的峰下面积与总面积的比例来确定的。来自Dionex，USA的程序Chromelion 6.20版本6.20被用于测定峰面积。
f)粒度的测定
通过标准方法从马铃薯块茎提取淀粉(见实施例)。
然后利用软件V.2.3，使用来自Retsch GmbH，Germany的“LumosedFS1”型光电沉降仪(photosedimentometer)进行粒度测定。软件设置如下：
物质数据：    校准NO.0
              密度[kg/m3]1500
沉降液体      类型  水
              粘度[Pa s]     0.001
              密度[kg/m3]    1000
              添加物         -
              记录           5分钟
              截断[μm]      250
              通过[％]       100
              测量范围       4.34-117.39μm
              校准           N
              温度           20℃
在水溶液中测定粒度分布，按照制造商的说明，基于如文献H.Pitsch，
Figure G038A6525319960504D000371
[粒度测定]；LABO-1988/3 Fachzeitschrift furLabortechnik，Darmstadt进行测定。
g)扫描电镜显微照片(SEM)
为了研究淀粉样品的表面，使用导电粘合剂将淀粉样品撒于样品固定器表面。为了避免电荷，最后用4nm的Pt涂层喷镀样品固定器。使用场致发射扫描电子显微镜JSM 6330 F(JeoI)以5kV的加速电压研究淀粉样品。
h)SSIII、BEI和BEII蛋白质的活性测定
这些测定如实施例中详细描述的进行。
实施例
表达载体ME5/6的产生
pGSV71是质粒pGSV7的衍生物，pGSV7质粒来自中间载体pGSV1。pGSV1是pGSC1700的衍生物，pGSC1700的构建已由Cornelissen和Vanderwiele(Nucleic Acid Research 17，(1989)，19-25)描述。通过缺失羧苄青霉素抗性基因和缺失pTiB6S3质粒TL-DNA区的T-DNA序列，从pGSC1700获得pGSV1。
pGSV7含有质粒pBR322(Bolivar等人，Gene 2，(1977)，95-113)的复制起点和假单胞菌(Pseudomonas)质粒pVS1(Itoh等人，Plasmid 11，(1984)，206)的复制起点。pGSV7还含有来自肺炎克氏杆菌(Klebsiella pneumoniae)转座子Tn1331的选择性标记基因aadA，该基因赋予抗生素(壮观霉素和链霉素)抗性(Tolmasky，Plasmid 24(3)，(1990)，218-226；Tolmasky和Crosa，Plasmid 29(1)，(1993)，31-40)。
通过在pGSV7边界区之间克隆嵌合bar基因，获得pGSV71质粒。嵌合bar基因含有用于起始转录的花椰菜花叶病毒启动子序列(Odell等人，Nature 313，(1985)，180)、吸水链霉菌bar基因(Thompson等人，Embo J.6，(1987)，2519-2523)和用于转录终止及聚腺苷酸化的pTiT37T-DNA胭脂碱(nopalin)合酶基因的3’-非翻译区。bar基因赋予对草铵膦(glufosinate-ammonium)除草剂的耐受性。
T-DNA在198-222位置含有来自质粒pTiB6S3(Gielen等人，EMBO J.3，(1984)，835-846)的TL-DNA的右边界序列。多接头序列位于核苷酸223-249之间。核苷酸250-1634含有花椰菜花叶病毒p35S3启动子区(Odell等人，见上文)。吸水链霉菌膦丝菌素抗性基因(bar)(Thompson等人1987，见上文)的编码序列被安排在核苷酸1635-2186之间。bar野生型基因5’端的两个终止密码子被密码子ATG和GAC置换。多接头序列位于核苷酸2187-2205之间。来自pTiT37质粒(Depicker等人，J.Mol.Appl.Genet.1，(1982)，561-573)T-DNA的胭脂碱合酶基因非翻译3’端(3’nos)的260bp TaqI片段位于核苷酸2206和2465之间。核苷酸2466-2519含有多接头序列。pTiB6S3 TL-DNA(Gielen等人，EMBO J.3，(1984)，835-846)的左边界序列位于核苷酸2520-2544之间。
然后使用PstI酶切割载体pGSV71并平端化。然后以EcoRI-HindIII片段的形式从载体pB33-Kan上切下B33启动子和ocs盒，平端化并插入进已经被PstI切割并平端化的pGSV71载体。产生的载体作为起始载体用于ME5/6的构建：含有EcoRI、PacI、SpeI、SrfI、SpeI、NotI、PacI和EcoRI切割位点的寡核苷酸被引入进位于B33启动子和ocs元件之间的ME4/6载体的PstI切割位点，复制此PstI切割位点。产生的表达载体被命名为ME5/6。
载体pSK-Pac说明：
pSK-Pac是pSK-Bluescript(Stratagene，USA)的衍生物，其中在多克隆位点(MCS)的两侧分别引入了一个PacI切割位点。
具有降低的BEI、SSIII和BEII基因表达的转基因马铃薯植物的产生
为了产生BEI、SSIII和BEII蛋白质活性降低的转基因植物，第一步产生了具有降低的BEI和SSIII蛋白质活性的转基因植物。为此，如Rocha-Sosa等人(EMBO J.8，(1989)，23-29)的描述，借助于农杆菌将质粒pB33-αBEI-αSSIII-Kan的T-DNA转移进马铃薯植物。
为了构建质粒pB33-αBEI-αSSIII-Kan(见图7)，在第一步中构建了表达载体pBin33-Kan。为此，马铃薯patatin基因B33(Rocha-Sosa等人，1989，见上文)的启动子以DraI片段(核苷酸-1512-+14)的形式被连接进SstI-切割并借助T4DNA聚合酶平端化末端的载体pUC19(GenbankAcc.No.M77789)。由此产生质粒pUC19-B33。使用EcoRI和SmaI，从这一质粒上切下B33启动子，并连接进适当切割的载体pBinAR。由此产生植物表达载体pBin33-Kan。质粒pBinAR是载体质粒pBin19(Bevan，Nucl.Acid Research 12，(1984)，8711-8721)的衍生物，由Hofgen和Willmitzer(Plant Sci.66，(1990)，221-230)构建。然后平端化含有编码马铃薯BEI酶(Kossmann等人，1991，Mol.& Gen.Genetics 230(1-2)：39-44)的部分cDNA的1631bp HindII片段并以相对于B33启动子(马铃薯patatin基因B33的启动子；Rocha-Sosa等人，1989)的反义方向引入进之前被SmaI切割的载体pBin33。使用BamHI切开产生的质粒。将含有编码马铃薯SSIII酶(Abel等人，1996，上述引文)的部分cDNA的1363bp BamHI片段再次以相对于B33启动子的反义方向引入进切割位点。
转化之后，鉴定在其块茎中观察到BEI和SSIII蛋白质活性明显降低的转基因马铃薯植物的不同株系。从该转化中产生的植物被命名为038VL。
为了通过非变性凝胶电泳检测可溶淀粉合酶(SSIII)活性，在50mMTris-HCl(pH 7.6)、2mM DTT、2.5mM EDTA、10％甘油和0.4mM PMSF中消化马铃薯块茎的组织样品。在MiniProtean II室(BioRAD)中进行电泳。厚度为1.5mm的凝胶的单体浓度总计达7.5％(w/v)，并以25mM Tris-甘氨酸(pH 8.4)作为凝胶和电泳缓冲液。对于每块凝胶，使用等量的蛋白质提取物，以10mA分离2小时。
随后在50mM Tricine-NaOH(pH 8.5)、25mM醋酸钾、2mM EDTA、2mM DTT、1mM ADP-葡萄糖、0.1％(w/v)支链淀粉和0.5M柠檬酸钠中孵育活性凝胶。形成的葡聚糖被Lugol氏溶液染色。
同样借助于非变性凝胶电泳检测BEI活性：
为了从植物中分离蛋白质，使用杵和研钵在液氮中粉碎样品材料，将材料吸收进抽提缓冲液(50mM柠檬酸钠，pH 6.5；1mM EDTA、4mMDTT)，离心(10分钟，14000g，4℃)，然后直接用于根据Bradford方法的蛋白质浓度测量。然后用4x加样缓冲液(20％甘油、125mM TrisHCl，pH 6.8)处理5到20μg全蛋白提取物(按需要)并应用于BE活性凝胶。电泳缓冲液(RB)组成如下：RB＝每一升水中30.2g Tris碱、pH 8.0、144g甘氨酸。
凝胶电泳结束后，每块凝胶在25ml“磷酸化酶缓冲液”(25ml 1M柠檬酸钠(pH 7.0)、0.47g葡萄糖-1-磷酸、12.5mg AMP、2.5mg来自兔的磷酸化酶a/b)中，于37℃孵育过夜。使用Lugol氏溶液染色凝胶。
更深入的分析表明从BEI和SSIII蛋白质都有所降低的038VL008和038VL107系分离的淀粉表现出所有研究的独立转化体中最高的磷酸含量。
随后用如Rocha-Sosa等人(EMBO J.8，(1989)，23-29)描述的pGSV71-αBEII-basta质粒转化这些株系的植物。
通过用DNA片段筛选块茎特异的马铃薯cDNA文库，从而构建pGSV71-αBEII-basta质粒，所述DNA片段扩增自以块茎总RNA为模板，根据标准方法的RT-PCR(引物：5′-gggggtgttggctttgacta和5′-cccttctcctcctaatccca；Stratagene ProSTARTM HF Single-Tube RT-PCR系统)。如此，分离出约1250bp的DNA片段(SEQ ID No.8)，然后以EcoRV-SmaI片段的形式亚克隆进克隆载体pSK-Pac(见上文)的EcoRV切割位点，并随后以PacI片段的形式，以相对于启动子的反义方向连接进表达载体ME5/6。由此产生质粒pGSV71-αBEII-basta(见图6)。
从用质粒pGSV71-αBEII-basta转化获得的被称为108CF和110CF的植物中得到独立转化体的块茎组织样品，并测定了它们的直链淀粉含量(见方法)。来自其块茎具有最高直链淀粉含量的独立株系的淀粉被用于淀粉特性的进一步分析。为了证明在这些植物中，不仅BEI和SSIII蛋白质的活性有所降低，而且BEII蛋白质的活性也有所降低，借助于非变性凝胶电泳进行了另一分析。除了非变性聚丙烯酰胺凝胶含有0.5％的麦芽糖糊精(Beba，用于新生儿的15％浓度的麦芽糖糊精溶液，Nestle)及上述组成外，按照上文已经进行的分析BEI活性降低的相同方法进行分析。加入糊精使凝胶在“磷酸化酶缓冲液”(25ml 1M柠檬酸钠(pH 7.0)、0.47g葡萄糖-1-磷酸、12.5mg AMP、2.5mg来自兔的磷酸化酶a/b)中于37℃过夜孵育，并用Lugol氏溶液染色后，能够显现出BEI和BEII蛋白质的不同活性。
马铃薯淀粉提取方法
在可商业获得的榨汁机(Multipress automatic MP80，Braun)中加工一个株系的所有块茎(4到5kg)。将含有淀粉的果汁收集于含有200ml自来水和一满匙二亚硫酸钠(sodium disulphite)(约3-4克)的10升桶中(桶高度：桶直径的比例＝约1.1)。随后用自来水将此桶填满。在允许淀粉沉降两小时之后，滗去上清液，将淀粉重悬浮于10升的自来水中并倾倒在网孔大小为125μm的筛上。两小时后(淀粉已经再次沉降于桶的底部)，再次滗去水性上清液。再重复这一洗涤步骤3次，以便将淀粉总共5次重悬浮于新鲜自来水中。之后，在37℃将淀粉干燥至12-17％的含水量并使用杵和研钵均化。至时，淀粉可用于分析。
实施例2
分析来自BEI、SSIII和BEII基因表达降低的植物的淀粉
从马铃薯块茎中分离来自描述于实施例1的转化体108CF和110CF的不同独立株系的淀粉。随后分析此淀粉的理化性质。改性的淀粉的特征结果示于表2(Tab.2)，作为选择的一些植物系的例子。通过上文描述的方法进行分析。
以下表2、3和4概括基于来自野生型植物的淀粉的RVA分析结果：
RVA分析法1
  RVAMax(％)   RVAMin(％)   RVA Fin(％)   RVASet(％)   RVA T(％)   凝胶强度
  cv.Desiree 100 100 100 100 100 100
  038VL008   158.7   69.8   72.0   79.5   73.0   55.4
  108CF041   59.6   89.9   227.5   693.7   150.2   532.3
  038VL107   151.1   94.3   94.0   93.0   82.2   52.2
  110CF003   106.4   158.6   265.0   625.7   151.5   737.1
表2：从野生型植物(cv.Desiree)、具有降低的SSIII和BEI蛋白质活性的植物(038VL008、038VL107)，以及具有降低的SSIII、BEI和BEII蛋白质活性的植物(108CF041、110CF003)中分离的淀粉的RVA分析参数，所述参数以基于野生型淀粉数据的百分数表示。RVA分析如分析法1中所描述的进行。
RVA分析法2
  RVAMax(％)   RVAMin(％)   RVA Fin(％)   RVASet(％)   RVA T(％)   凝胶强度
  cv.Desiree 100 100 100 100 100 100
  038VL008   167.1   40.4   52.6   77.6   54.2   63.0
  108CF041   44.5   82.5   187.5   402.7   137.4   412.2
  038VL107   152.0   76.1   81.9   93.8   76.9   51.7
  110CF003   92.4   172.2   n.d.   n.d.   139.0   795.0
表3：从野生型植物(cv.Desiree)、具有降低的SSIII和BEI蛋白质活性的植物(038VL008、038VL107)，以及具有降低的SSIII、BEI和BEII蛋白质活性的植物(108CF041、110CF003)中分离的淀粉的RVA分析参数，所述参数以基于野生型淀粉数据的百分数表示。RVA分析如分析法2中所描述的进行。
RVA分析法3
  RVAMax(％)   RVAMin(％)   RVA Fin(％)   RVASet(％)   RVA T(％)   凝胶强度
  cv.Desiree 100 100 100 100 100 100
  038VL008   n.d.   50.2   76.5   127.8   77.0   100.5
  108CF041   74.7   291.0   n.d.   205.7   236.0   630.3
  038VL107   n.d.   84.5   86.4   90.1   102.3   58.1
  110CF003   89.8   259.7   n.d.   n.d.   196.6   663.9
表4：从野生型植物(cv.Desiree)、具有降低的SSIII和BEI蛋白质活性的植物(038VL008、038VL107)，以及具有降低的SSIII、BEI和BEII蛋白质活性的植物(108CF041、110CF003)中分离的淀粉的RVA分析参数，所述参数以基于野生型淀粉数据的百分数表示。RVA分析如分析法3中所描述的进行。
以下表5、6和7概括RVA分析的结果。数据不参照野生型，而是实际的测量：
RVA分析法1(也见图1)
  RVA Max(RVU)   RVA Min(RVU)   RVA Fin(RVU)   RVA Set(RVU)   RVA T(RVU)   凝胶强度
  cv.Desiree 255.05 162.33 210.25 47.92 4.6 25.1
  038VL008   404.83   113.25   151.33   38.08   3.36   13.9
  108CF041   152.08   145.92   478.33   332.42   6.91   133.6
  038VL107   385.5   153   197.58   44.58   3.78   13.1
  110CF003   271.5   257.42   557.25   299.83   6.97   185
表5：从野生型植物(cv.Desiree)、具有降低的SSIII和BEI蛋白质活性的植物(038VL008、038VL107)，以及具有降低的SSIII、BEI和BEII蛋白质活性的植物(108CF041、110CF003)中分离的淀粉的RVA分析参数，所述参数以RVU表示。RVA分析如分析法1中所描述的进行。
RVA分析法2(也见图2)
  RVAMax(RVU)   RVAMin(RVU)   RVAFin(RVU)   RVASet(RVU)   RVA T(RVU)   凝胶强度
  cv.Desiree   212.17   113.75   169.25   55.5   28.78   23.8
  038VL008   354.58   45.92   89   43.08   15.61   15
  108CF041   94.33   93.83   317.33   223.5   39.53   98.1
  038VL107   322.58   86.58   138.67   52.08   22.13   12.3
  110CF003   196.08   195.92   n.d.   n.d.   39.99   189.2
表6：从野生型植物(cv.Desiree)、具有降低的SSIII和BEI蛋白质活性的植物(038VL008、038VL107)，以及具有降低的SSIII、BEI和BEII蛋白质活性的植物(108CF041、110CF003)中分离的淀粉的RVA分析参数，所述参数以RVU表示。RVA分析如分析法2中所描述的进行。
RVA分析法3(也见图3)
  RVA Max(RVU)   RVA Min(RVU)   RVA Fin(RVU)   RVA Set(RVU)   RVA T(RVU)   凝胶强度
  Desiree   819.67   207.67   314.25   106.58   16.88   56.5
  038VL008   n.d.   104.17   240.33   136.17   12.99   56.8
  108CF041   612.33   604.25   823.5   219.25   39.83   356.1
  038VL107   n.d.   175.42   271.5   96.08   17.27   32.8
  110CF003   736.08   539.42   n.d.   n.d.   33.18   375.1
表7：从野生型植物(cv.Desiree)、具有降低的SSIII和BEI蛋白质活性的植物(038VL008、038VL107)，以及具有降低的SSIII、BEI和BEII蛋白质活性的植物(108CF041、110CF003)中分离的淀粉的RVA分析参数，所述参数以RVU表示。RVA分析如分析法3中所描述的进行。
磷酸和直链淀粉分析的概括：
No. 基因型   C6中的磷酸(％) 总磷酸(％) 直链淀粉(％)   直链淀粉(％WT)
  1   cv.Desiree   100   100   22   100
  2   038VL008   346.4   255.2   19.4   85.8
  3   108CF041   557.3   427.6   36.8   162.8
  4   038VL107   225.5   182.8   19.7   87.2
  5   110CF003   446.4   348.3   34.6   153.1
表8：从野生型植物(cv.Desiree)、具有降低的SSIII和BEI蛋白质活性的植物(038VL008、038VL107)以及具有降低的SSIII、BEI和BEII蛋白质活性的植物(108CF041、110CF003)中分离的淀粉的磷酸和直链淀粉含量。以基于来自野生型植物的淀粉的百分数表示葡萄糖单体C6位置的磷酸含量和淀粉中总的磷酸含量；以直链淀粉占淀粉总量的百分数，或者以基于野生型植物淀粉中直链淀粉含量的百分数表示直链淀粉含量。
支链淀粉的侧链分布分析如上文描述的进行。下表是对各个峰面积贡献的概括：
  葡萄糖单元 cv.Desiree 038VL 008 108CF 041 038VL 107 110CF 003
  dp 6   1.52   4.16   1.88   2.39   0.86
  dp 7   1.4   1.4   0.63   1.42   0.59
  dp 8   1.23   0.77   0.33   0.99   0.38
  dp 9   2.05   1.42   0.74   1.79   0.75
  dp 10   3.55   2.8   1.74   3.33   1.77
  dp 11   5.16   4.41   2.92   4.96   3.46
  dp 12   6.25   5.77   4.47   6.22   5.17
  dp 13   6.71   6.7   5.63   6.87   6.35
  dp 14   6.75   7.06   6.35   6.99   7.38
  dp 15   6.48   6.76   6.62   6.65   7.63
  dp 16   6.07   5.99   6.34   6.11   7.13
  dp 17   5.6   5.21   5.81   5.49   6.3
  dp 18   5.28   4.78   5.87   5.11   5.98
  dp 19   4.99   4.74   6.17   4.94   5.91
  dp 20   4.76   4.65   6.07   4.78   5.64
  dp 21   4.5   4.46   5.65   4.5   5.26
  dp 22   4.16   4.12   5.07   4.2   4.7
  dp 23   3.77   3.68   4.59   3.78   4.19
  dp 24   3.44   3.36   4.24   3.42   3.75
  dp 25   3.08   3.09   3.86   3.07   3.49
  dp 26   2.73   2.8   3.36   2.77   3.03
  dp 27   2.39   2.58   2.95   2.37   2.65
  dp 28   2.07   2.26   2.39   2.01   2.1
  dp 29   1.67   1.87   1.87   1.71   1.69
  dp 30   1.38   1.58   1.54   1.35   1.3
  dp 31   1.07   1.28   1.02   1.04   0.87
  dp 32   0.79   0.96   0.7   0.75   0.6
  dp 33   0.57   0.69   0.6   0.51   0.51
  dp 34   0.36   0.43   0.39   0.32   0.34
  dp 35   0.22   0.22   0.19   0.17   0.2
  总计   100   100   99.99   100.01   99.98
表9：该表概括了野生型植物(cv.Desiree)、038VL008和038VL107植物(具有降低的SSIII蛋白质和BEI蛋白质活性的马铃薯植物)以及选择的108CF和110CF转化体株系(具有降低的SSIII、BEI和BEII蛋白质活性的马铃薯植物)的HPAEC层析谱中各单个峰面积对总峰面积的贡献。各单个侧链中葡萄糖单体的数量表示为dp。
峰链长度是对HPAEC层析谱中峰下总面积贡献最大的两条链长度的平均值(以DP表示)，就脱支链的支链淀粉而言，野生型植物为DP＝13，就038VL植物而言同样为DP＝13，就108CF和110CF植物而言平均为15。
如果将转基因植物的峰链长度与野生型植物支链淀粉的峰链长度相比较，以下的值得自峰链长度的比值(PCL比值)：
038VL的PCL比值＝13/13＝1
108/110CF的PCL比值＝15/13＝1.15
另外，使用扫描电子显微镜(SEM)分析了淀粉颗粒的形态。
看起来108/110CF植物淀粉颗粒的表面布满或呈现出小孔的形成。
此外，使用来自Retsch GmbH，Germany的“Lumosed”型光电沉降仪测定粒度。
测定了未处理淀粉样品的平均粒度(表3)。
平均粒度[μm]
  样品   平均粒度
  cv.Desiree   29.7
  038VL008   21.5
  108CF041   20.8
  038VL107   22.9
  110CF003   20.7
表10：从野生型植物(cv.Desiree)、具有降低的SSIII和BEI蛋白质活性的植物(038VL008、038VL107)，以及具有降低的SSIII、BEI和BEII蛋白质活性的植物(108CF041、110CF003)中分离的淀粉的粒度平均值。
实施例3
通过凝胶渗透层析分析支链淀粉的侧链分布
为了分离直链淀粉和支链淀粉，在恒定搅拌下将100mg淀粉溶解于6ml 90％浓度(v/v)的DMSO。加入3倍体积的乙醇后，通过室温下以1800g离心10分钟分离沉淀。随后用30ml乙醇洗涤沉淀，干燥并溶解于60℃的10ml 1％浓度(w/v)的NaCl溶液。溶液冷却到30℃以后，缓慢加入约50mg麝香草酚，并在30℃将此溶液孵育2-3天。然后在室温以2000g对溶液离心30分钟。用3倍体积的乙醇处理上清液，并通过在室温以2000g离心5分钟分离沉淀出的支链淀粉。用10ml 70％浓度(v/v)的乙醇洗涤沉淀(支链淀粉)，在室温以2000g离心10分钟，然后用丙酮干燥。
随后将10mg支链淀粉在70℃于250μl 90％浓度(v/v)的DMSO中搅拌10分钟。向溶液加入375μl 80℃的水，直到完全溶解。
200μl的此溶液用300μl 16.6mM醋酸钠溶液(pH 3.5)和2μl异淀粉酶(0.24μ/μl，Megazyme，Sydney，Australia)处理，并在37℃将混合物孵育15小时。
随后通过0.2μm的滤器过滤此水性异淀粉酶反应混合物1∶4的DMSO(含90mM硝酸钠)稀释液，并层析分析24μl的滤液。用串联连接的两个柱进行分离，第一个是Gram PSS3000(Polymer Standards Service，具有适当的前置柱)，之后是Gram PSS100。通过折射指数探测器(RI 71，Shodex)检测。柱子用含有90mM硝酸钠的DMSO平衡。用含有90mM硝酸钠的DMSO以0.7ml/分钟的流速进行为期1小时的洗脱。
为了将洗脱体积与分子量相联系，使用葡聚糖标准对使用的柱进行校准，使用的葡聚糖、它们的分子量和洗脱体积示于图9。使用获得的校准图，以分子量分布显示洗脱图(图10)。
使用来自Polymer Standards Service GmbH，Mainz，Germany的Wingpc Version 6程序进一步评估获得的层析谱。
GPC层析谱线下的总面积被分成各区段，每一区段表示不同长度的侧链组。选择的区段含有具以下聚合度的葡聚糖链(DP＝在一条侧链中葡聚糖单体的数目)：DP≤11、DP12-18、DP19-24、DP25-30、DP31-36、DP37-42、DP43-48、DP49-55、DP56-61和DP62-123。为了测定各侧链的分子量，假定葡萄糖的分子量为162。然后将GPC层析谱线下的总面积设定为100％，基于占总面积的百分数计算出各区段面积的百分数。从此分析中获得的结果显示于表11。
  野生型   08CF041c
  DP≥11   100％   40％
  DP12-18   100％   50％
  DP19-24   100％   69％
  DP25-30   100％   91％
  DP31-36   100％   111％
  DP37-42   100％   116％
  DP43-48   100％   110％
  DP49-55   100％   107％
  DP56-61   100％   109％
  DP62-123   100％   157％
表11：从野生型植物(cv.Desiree)和具有降低的SSIII、BEI和BEII蛋白质活性的植物(108CF041)中分离的支链淀粉的侧链分布DP 12至18、DP 19至24、DP 25至30、DP 31至36、DP 37至42、DP 43至48、DP 49至55、DP 56至61及DP 62至123。百分数表示基于从野生型植物分离的支链淀粉，各侧链分布的改变。
Figure IYZ000004153036700011
Figure IYZ000004153036700021
Figure IYZ000004153036700031
Figure IYZ000004153036700051
Figure IYZ000004153036700061
Figure IYZ000004153036700071
Figure IYZ000004153036700081
Figure IYZ000004153036700131
Figure IYZ000004153036700171
Figure IYZ000004153036700201

Claims (5)

1.制备合成改性淀粉的遗传修饰的双子叶植物的方法，其中该改性的淀粉在水中以6％悬浮液糊化后形成的凝胶的凝胶强度与提取自未经遗传修饰的野生型植物的相应植物细胞的淀粉的凝胶强度相比增加至少300％，所述方法包括
a)引入第一、第二和第三外源核酸分子至双子叶植物细胞中，
其中，(1)所述第一外源核酸分子是：
i)编码至少一种反义RNA的DNA分子，所述反义RNA造成编码SSIII蛋白的至少一种内源基因的表达减少；
ii)通过共抑制作用导致编码SSIII蛋白的至少一种内源基因表达减少的DNA分子；或
iii)同时编码至少一种反义RNA和至少一种有义RNA的DNA分子，其中所述反义RNA和所述有义RNA形成导致编码SSIII蛋白的至少一种内源基因表达降低的双链RNA分子，
(2)所述第二外源核酸分子是：
i)编码至少一种反义RNA的DNA分子，所述反义RNA造成编码BEI蛋白的至少一种内源基因的表达减少；
ii)通过共抑制作用导致编码BEI蛋白的至少一种内源基因表达减少的DNA分子；或
iii)同时编码至少一种反义RNA和至少一种有义RNA的DNA分子，其中所述反义RNA和所述有义RNA形成导致编码BEI蛋白的至少一种内源基因表达降低的双链RNA分子，
(3)所述第三外源核酸分子是：
i)编码至少一种反义RNA的DNA分子，所述反义RNA造成编码BEII蛋白的至少一种内源基因的表达减少；
ii)通过共抑制作用导致编码BEII蛋白的至少一种内源基因表达减少的DNA分子；或
iii)同时编码至少一种反义RNA和至少一种有义RNA的DNA分子，其中所述反义RNA和所述有义RNA形成导致编码BEII蛋白的至少一种内源基因表达降低的双链RNA分子，
b)利用或从根据a)产生的植物细胞再生植物；和
c)从根据步骤b)产生的植物生成其它的植物。
2.从根据权利要求1的方法获得的植物细胞或植物获得的淀粉。
3.根据权利要求2的淀粉，其是马铃薯淀粉。
4.制备根据权利要求2或3的淀粉的方法，其包括从根据权利要求1的方法获得的植物或从该植物的淀粉储藏部分或从该植物的植物细胞提取淀粉。
5.植物淀粉的改性方法，包括使用根据权利要求1的方法产生植物，和从该植物或其淀粉储藏部分获得淀粉。
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