JP2006034128A - イネ由来デンプン合成酵素SSIIaを発現させたシアノバクテリアの形質転換体、これを用いたSSIIaの機能解析法、並びに同形質転換体によって生産される多糖 - Google Patents
イネ由来デンプン合成酵素SSIIaを発現させたシアノバクテリアの形質転換体、これを用いたSSIIaの機能解析法、並びに同形質転換体によって生産される多糖 Download PDFInfo
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Abstract
【解決手段】 前駆体型SSIIa発現用のプラスミド、および、成熟型SSIIa発現用のプラスミドをそれぞれ構築して、シアノバクテリアのグリコーゲン合成酵素欠損株の形質転換を行った。そして、形質転換株における貯蔵多糖の構造を解析したところ、前駆体型、成熟型いずれのSSIIaを発現させた場合にも、グルコース重合機能が失われた形質転換株においてグルカン糖鎖が検出された。このことから、シアノバクテリアに導入された前駆体型および成熟型のSSIIaは、宿主内において糖鎖合成の機能を発揮していることが明らかになった。
【選択図】 なし
Description
(1)ADPグルコースピロホスホリラ−ゼ(ADPglucose pyrophosphorylase(AGPase))
(2)水溶性デンプン合成酵素(Starch synthase(SS))
(3)デンプン枝作り酵素(Starch branching enzyme(BE))
(4)デンプン枝切り酵素(Starch debranching enzyme(DBE))
である。
A) シアノバクテリアにイネ由来デンプン合成酵素SSIIaをコードする遺伝子を導入したシアノバクテリアの形質転換体。
B) イネ由来デンプン合成酵素SSIIaをコードする遺伝子が、前駆体型デンプン合成酵素SSIIaをコードする遺伝子である上記A)記載の形質転換体。
C) 配列番号1に示される塩基配列が挿入されたプラスミドを使用してシアノバクテリアの形質転換を行い、これにより、前駆体型デンプン合成酵素SSIIaをコードする遺伝子を導入した上記B)記載の形質転換体。
D) 配列番号1に示される塩基配列が挿入されたプラスミドは、配列番号7に示される塩基配列からなるフォワードプライマーおよび配列番号9に示される塩基配列からなるリバースプライマーを使用したPCRによってSSIIa遺伝子の前半部分を増幅し、この増幅された遺伝子前半部分を前記リバースプライマー中の制限酵素BglII切断部位を利用して遺伝子後半部分と連結して得られた遺伝子配列をプラスミドに挿入することにより調製されたものである、上記C)記載の形質転換体。
E) イネ由来デンプン合成酵素SSIIaをコードする遺伝子が、成熟型デンプン合成酵素SSIIaをコードする遺伝子である上記A)記載の形質転換体。
F) 配列番号4に示される塩基配列が挿入されたプラスミドを使用してシアノバクテリアの形質転換を行い、これにより、成熟型デンプン合成酵素SSIIaをコードする遺伝子を導入した上記E)記載の形質転換体。
G) 配列番号4に示される塩基配列が挿入されたプラスミドは、配列番号8に示される塩基配列からなるフォワードプライマーおよび配列番号9に示される塩基配列からなるリバースプライマーを使用したPCRによってSSIIa遺伝子の前半部分を増幅し、この増幅された遺伝子前半部分を前記リバースプライマー中の制限酵素BglII切断部位を利用して遺伝子後半部分と連結して得られた遺伝子配列をプラスミドに挿入することにより調製されたものである、上記F)記載の形質転換体。
H) シアノバクテリアが、シネココッカス(Synechococcus)属のシアノバクテリアである上記A)〜G)のいずれか1項に記載の形質転換体。
I) シアノバクテリアが、シネココッカスPCC7942(Synechococcus sp. PCC 7942)株である上記H)記載の形質転換体。
J) シアノバクテリアが、内在性のグリコーゲン合成酵素(GS)をコードする遺伝子の欠損株である上記H)又はI)記載の形質転換体。
K) シアノバクテリアにイネ由来デンプン合成酵素SSIIaをコードする遺伝子を導入して、当該シアノバクテリアから抽出した貯蔵多糖を解析することによりデンプン合成酵素SSIIaの機能を解析する方法。
L) 前駆体型デンプン合成酵素SSIIaをコードする遺伝子を導入したシアノバクテリア、および、成熟型デンプン合成酵素SSIIaをコードする遺伝子を導入したシアノバクテリアを作製し、両者から抽出した貯蔵多糖を解析し比較することによりデンプン合成酵素SSIIaの機能を解析する方法。
M) 貯蔵多糖の解析が、貯蔵多糖を枝切り処理して得られたグルカン鎖の鎖長分布解析である、上記K)又はL)記載のデンプン合成酵素SSIIaの機能解析法。
N) キャピラリー電気泳動により鎖長分布解析を行うことを特徴とする、上記M)記載のデンプン合成酵素SSIIaの機能解析法。
O) 上記A)〜J)のいずれかに記載の形質転換体により生産された多糖。
本発明に係るシアノバクテリアの形質転換体には、イネ由来デンプン合成酵素SSIIaをコードする遺伝子が導入される。本明細書において、「デンプン合成酵素SSIIa」とは、デンプン合成酵素(スターチシンターゼ)SSII群に属するアイソザイムの1つを意味する。配列番号1には、インディカ品種由来SSIIaのcDNA配列を含む塩基配列が示される。配列番号2に示すように、同塩基配列中、13−2445番目が前駆体型SSIIaをコードする領域に相当する。
イネ・インディカ品種IR36由来のSSIIa cDNA配列を含むプラスミドを出発材料として用いた。このプラスミド中には、配列番号2に示されるSSIIa遺伝子のコード領域2,433残基、およびその上流20残基と下流16残基が含まれる。このプラスミドDNAを鋳型としてPCRを行い、SSIIa遺伝子の前半部分を増幅した。
フォワードプライマー1:5’- AAGGAGGCGA CCATGTCGTC GGCCGTC -3’(配列番号7)
フォワードプライマー2:5’- AAGGAGGTGC GCATGGCGGA TGATGGGGAG AAC -3’(配列番号8)
リバースプライマー:5’- GAAGATCTAG TCGCCTTTGG -3’(配列番号9)
以上に述べた組換えプラスミドを使用して、Golden et al.(1987)の方法に準じSynechococcus sp. PCC 7942株の形質転換を行い、イネSSIIa遺伝子をシアノバクテリア細胞内に導入した。具体的には、液体培地により対数増殖期まで生育した培養液50mlを遠心し、沈殿に集めた細胞を少量(500μl)の液体培地に懸濁した後、DNA溶液1μlを加え、遮光して30℃、20時間振盪を行った。この処理の後、細胞懸濁液をアンピシリン2μg/mlを含む寒天培地上にひろげ、30℃、連続光照射下、形質転換コロニーが現れるまで培養を行った。アンピシリン耐性を指標として、外来遺伝子を含む形質転換株を選抜した。形質転換株の宿主として、内在のグリコーゲン合成酵素を欠損した株(ΔGS)を用いた。この欠損株においては、シアノバクテリアにおけるデンプンに相当するグリコーゲンの蓄積がほとんど起こらない。内在遺伝子欠損株を宿主として用いたのは、外来遺伝子の導入による機能相補の効果をより明確に検討するためである。
外来遺伝子を含む形質転換株を選抜後、アンピシリン20μg/mlを含む50mlの液体培地で形質転換株を培養し、得られた細胞からアルコール抽出により貯蔵多糖を調製した。そして、市販のイソアミラーゼによって枝切り処理を行った後、キャピラリー電気泳動にかけてグルカン鎖の鎖長分布を調べた。
配列番号2:シアノバクテリアにおいて発現する前駆体型イネデンプン合成酵素(SSIIa_pre)の遺伝子配列およびアミノ酸配列
配列番号3:シアノバクテリアにおいて発現する前駆体型イネデンプン合成酵素(SSIIa_pre)のアミノ酸配列
配列番号4:シアノバクテリアにおいて発現する成熟型イネデンプン合成酵素(SSIIa_mat)遺伝子の配列
配列番号5:シアノバクテリアにおいて発現する成熟型イネデンプン合成酵素(SSIIa_mat)の遺伝子配列およびアミノ酸配列
配列番号6:シアノバクテリアにおいて発現する成熟型イネデンプン合成酵素(SSIIa_mat)のアミノ酸配列
配列番号7:前駆体型イネデンプン合成酵素SSIIa遺伝子前半部増幅用のフォワードプライマー
配列番号8:成熟型イネデンプン合成酵素SSIIa遺伝子前半部増幅用のフォワードプライマー
配列番号9:前駆体型(および成熟型)イネデンプン合成酵素SSIIa遺伝子前半部増幅用のリバースプライマー
Claims (15)
- シアノバクテリアにイネ由来デンプン合成酵素SSIIaをコードする遺伝子を導入したシアノバクテリアの形質転換体。
- イネ由来デンプン合成酵素SSIIaをコードする遺伝子が、前駆体型デンプン合成酵素SSIIaをコードする遺伝子である請求項1記載の形質転換体。
- 配列番号1に示される塩基配列が挿入されたプラスミドを使用してシアノバクテリアの形質転換を行い、これにより、前駆体型デンプン合成酵素SSIIaをコードする遺伝子を導入した請求項2記載の形質転換体。
- 配列番号1に示される塩基配列が挿入されたプラスミドは、配列番号7に示される塩基配列からなるフォワードプライマーおよび配列番号9に示される塩基配列からなるリバースプライマーを使用したPCRによってSSIIa遺伝子の前半部分を増幅し、この増幅された遺伝子前半部分を前記リバースプライマー中の制限酵素BglII切断部位を利用して遺伝子後半部分と連結して得られた遺伝子配列をプラスミドに挿入することにより調製されたものである、請求項3記載の形質転換体。
- イネ由来デンプン合成酵素SSIIaをコードする遺伝子が、成熟型デンプン合成酵素SSIIaをコードする遺伝子である請求項1記載の形質転換体。
- 配列番号4に示される塩基配列が挿入されたプラスミドを使用してシアノバクテリアの形質転換を行い、これにより、成熟型デンプン合成酵素SSIIaをコードする遺伝子を導入した請求項5記載の形質転換体。
- 配列番号4に示される塩基配列が挿入されたプラスミドは、配列番号8に示される塩基配列からなるフォワードプライマーおよび配列番号9に示される塩基配列からなるリバースプライマーを使用したPCRによってSSIIa遺伝子の前半部分を増幅し、この増幅された遺伝子前半部分を前記リバースプライマー中の制限酵素BglII切断部位を利用して遺伝子後半部分と連結して得られた遺伝子配列をプラスミドに挿入することにより調製されたものである、請求項6記載の形質転換体。
- シアノバクテリアが、シネココッカス(Synechococcus)属のシアノバクテリアである請求項1〜7のいずれか1項に記載の形質転換体。
- シアノバクテリアが、シネココッカスPCC7942(Synechococcus sp. PCC 7942)株である請求項8記載の形質転換体。
- シアノバクテリアが、内在性のグリコーゲン合成酵素(GS)をコードする遺伝子の欠損株である請求項8又は9記載の形質転換体。
- シアノバクテリアにイネ由来デンプン合成酵素SSIIaをコードする遺伝子を導入して、当該シアノバクテリアから抽出した貯蔵多糖を解析することによりデンプン合成酵素SSIIaの機能を解析する方法。
- 前駆体型デンプン合成酵素SSIIaをコードする遺伝子を導入したシアノバクテリア、および、成熟型デンプン合成酵素SSIIaをコードする遺伝子を導入したシアノバクテリアを作製し、両者から抽出した貯蔵多糖を解析し比較することによりデンプン合成酵素SSIIaの機能を解析する方法。
- 貯蔵多糖の解析が、貯蔵多糖を枝切り処理して得られたグルカン鎖の鎖長分布解析である、請求項11又は12記載のデンプン合成酵素SSIIaの機能解析法。
- キャピラリー電気泳動により鎖長分布解析を行うことを特徴とする、請求項13記載のデンプン合成酵素SSIIaの機能解析法。
- 請求項1〜10のいずれか1項に記載の形質転換体により生産された多糖。
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