CN102154258A - 加速植物生长及增加纤维素量和/或产量的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种加速植物生长及增加纤维素量和/或产量的方法，属于生物工程领域。它包括将一段能够改变纤维素前体水平的DNA序列导入植物体。所述的纤维素前体是尿苷二磷酸葡萄糖。所述的DNA序列编码一种负责尿苷二磷酸葡萄糖合成的酶，首选的是编码UDPG焦磷酸化酶的序列，可源于包括其他植物种类、细菌或酵母菌在内的任何生物，首选的是木醋杆菌。尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因的表达能够改变植物组织或细胞中的纤维素前体水平，进而加快植物的生长、增加纤维素量和或产量。

Description

加速植物生长及增加纤维素量和/或产量的方法

技术领域

本发明属于生物工程领域，具体涉及一种加速植物生长及增加纤维素量和/或产量的方法。

背景技术

纤维素是细胞壁的主要功能和组成成分之一。Taylor(Taylor NG，Howells RM，Huttly AK，Vickers K，Turner SR.2003.Interactions among three distinct CesA proteins essential for cellulose synthesis.Proc Natl Acad Sci USA 100，1450-1455)等和梁海泳等(梁海泳，夏秀英，高晓蓉，苏乔.2007.反义4CL与UGPase双价基因在烟草中的转化及表达分析.植物学通报24(4)：459-464)的研究结果均表明，纤维素含量与细胞壁厚度正相关。窦永秀(窦永秀.2008.水稻结实期抗倒性评价及倒伏对产量与品质影响的研究.扬州：扬州大学.)的研究表明，纤维素含量多少对茎秆抗倒性有较大影响。尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶(UDP-glucose pyrophosphorylase，UGPase)可催化形成尿苷二磷酸-D-葡萄糖(uridine diphosphate D-glucose，UDPG)，UDPG可作为葡萄糖基供体参与纤维素的合成代谢。

增加单株产量是所有植物育种工作的主要目标。对于纤维生产作物，产物的经济价值直接与纤维素纤维的数量、位置和长度有关。有人认为纤维的含量和产量受光合作用产生产生的底物量或糖量的限制。然而，大量的研究表明，光合作用产生的碳水化合物虽然是植物生长和生存的关键因素，但不是纤维素合成的主要限制性因素。因此，存在一种增加纤维产量的重大可能性，通过使纤维素高的细胞中的现有光合产物沉积。蔗糖是植物光合作用产生的糖类的主要转移形式，转移到沉积组织转换成淀粉或纤维素等其他化合物。

事实上，尽管植物光合产物的数量并不是纤维素含量的主要限制因素，但光合速率在植物的整体生长中起着重要的作用。此外，植物光合作用的一个控制因素是光合产物淀粉、蔗糖和己糖等对光合作用的反馈抑制。Goldschmidt和Huber(Goldchmidt，E.E.and S.C.Huber.1992.Regulation of Photosynthesis by End-Product Accumulation in Leaves of Plants Stroing Starch，Sucrose and Hexose Sugars.Plant Physiol.99：1443-1448)对环剥作物叶片的影响进行了测试，结果表明，淀粉和其他光合产物的增加确实抑制了光合产率。这些以及其他的研究结果(Sonnewald，U.and L.Willmitzer.1992.Molecular approaches to sink-source interactions.Plant Physiol.99：1267-1270)表明，光合速率和最基本的植物生长可能与光合产物从叶片运离的速率或叶片生物合成的降解率直接相关。光合产物的降解主要发生在生长旺盛的组织或细胞(分生或幼嫩组织)，或者是光合产物被用作贮藏或组成成分的组织(库器官)。因此，改变碳水化合物转运至这些库器官的速率(改变碳分配)将不仅会从整体上促进植物的生长(去除光合作用抑制因子)，也会增加贮藏量(淀粉)和组分量(纤维素)。

在马铃薯的相关研究中，已经有了改变碳分配带来效益的突出例子。通过增加块茎中葡萄糖腺苷二磷酸的合成和积累，使淀粉合成量增加进而显著增加干物质的含量。事实上，这样导致了块茎的产量增加25％。块茎葡萄糖腺苷二磷酸的增加是通过基因工程手段，将被马铃薯块茎特有启动子控制的细菌腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因转化马铃薯的结果(Shewmaker，C.K.and D.M.Stalker.1992.Modifying starch biosynthesis with transgenes in potatoes.Plant Physiol.100：1083-1086)。

中国申请专利号CN200410061171.1(尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶在水稻中的应用)中的主权利要求是一种尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因在水稻中的应用。该专利的权利要求仅限于通过调控一种水稻尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因的表达提高水稻的产量和控制水稻的育性。中国申请专利号CN200810231477(一种泡桐尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因及其应用)中公开了一种泡桐尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因及其应用，其主权利要求是一种泡桐尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶编码蛋白。该专利的权利要求仅限于一种泡桐尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶编码蛋白及其在建立纤维素含量高或低的新植物种质材料方面的应用。两项专利的尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因也只是都来源于植物。

如同葡萄糖腺苷二磷酸是淀粉合成的前体一样，核苷酸糖UDP-葡萄糖(UDPG)，是细菌和高等植物纤维素合成的高能底物(Delmer，D.P.1987.Cellulose biosynthesis.Ann.Rev.Plant Physiol.38：259-290；Delmer，D.P.and Y.Amor.1995Cellulose Biosynthesis.Plant Cell 7：987-1000)。一些编码尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶(该酶负责UDPG的合成)的细菌基因已经被分离到(Ross，P.，R.Mayer，M.Benziman.1991.Cellulose biosynthesis and function in bacteria.Microbiol.Rev.55：35-58)。已经由Betlach (Betlach M.R.，D.H.Doherty，R.W.Vanderslice.1987 Process for the synthesis of sugar nucleotides using recombinant DNA methods.International Patent WO 87/05937)申请的专利，其权利要求是通过插入野油菜黄单胞菌的尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因，增加了黄原胶和其它细菌多聚糖的合成。该专利的权利要求仅限于增加原核生物中多聚糖的生物合成。

发明内容

本发明是针对现有技术中存在的不足，提供一种加速植物生长及增加纤维素量和/或产量的方法。

技术方案：一种增加植物生长及增加纤维素量和/或产量的方法，它包括将一段编码尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶的DNA序列导入植物体，该序列的表达通过改变植物组织或细胞中纤维素前体的水平来加速植物的生长和/或增加产量。所述的纤维素前体是尿苷二磷酸葡萄糖。

本发明通过碳水化合物的简单扩散实现了再分配，像葡萄糖从叶细胞等光合细胞到植物体的其它细胞。这种转移解除了由于光合细胞中光合产物的过量积累而对光合作用产生的抑制作用，因而，允许植物继续通过光合作用产生更多的单糖。换句话说，当光合作用在没有抑制的情况下继续进行时，会产生更多的单糖，这在原来是不可能的。这些单糖通过淀粉和纤维素等聚合物的形式为植物的生长构建支撑物。

上述植物主要是指云杉或小麦。所述的DNA序列包含源于木醋杆菌的尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因。

一种改变植物纤维素量的方法，该方法包括将一段编码尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶的DNA序列导入该植物并表达，其特征在于，上述序列的表达改变植物组织或细胞中的纤维素前体水平，进而改变该植物的纤维素量。

所述的前体是尿苷二磷酸葡萄糖。

一种改变植物纤维素产量的方法，该方法包括将一段编码尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶的DNA序列导入植物，该序列两端带有转录起始和终止信号并连接上使表达发生的DNA序列，该序列的表达改变植物组织或细胞的纤维素量。

所述的使表达发生的DNA序列是指导尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因主要在植物茎或木质部细胞中表达的启动子。

所述的使表达发生的DNA序列是一种从一个或多个CaMV 35S和来自西芹的4CL基因构成的一组基因中选出的启动子。

上述植物主要是指云杉或小麦。

一种DNA表达载体，该载体包含一段编码细菌尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶的DNA序列，序列两端带有转录起始和终止信号并连接上使植物中表达发生的DNA序列。

一种经过基因改良的种子，该种子包含编码尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶的外源DNA序列，上述序列的表达使上述种子长成的植株的组织或细胞中的纤维素前体水平改变。

本发明的产品包括但不限于核糖核酸(“RNA”)分子，与纤维素生物合成有关的酶以及调节这些酶表达的蛋白质。

本发明通过将能够编码改变纤维素前体水平产物的DNA序列导入植物体，为增加植物的生长速率和产量提供了可能。上述DNA序列导入植物体并表达的结果是有益的，也使植物体中的碳可随意地选择性分配。

下文对该发明的首选形式进行了描述，上述DNA序列在主要负责纤维素合成的细胞中选择性地表达。通过创造糖类在纤维素合成细胞中的沉积，使过量的光合产物转移到这些细胞，按照默认路径合成纤维素，从而增加植物体纤维素的含量。例如，在树木中，当蔗糖和己糖等光合产物从树叶中转移到树干中时，这些化合物对光合作用的抑制作用就被解除。这对林业有巨大的作用，因为无论是收获木材还是纤维，产品都是纤维素。但是，增加纤维素的好处并不只限于林业，因为有许多其他的纤维作物，包括剑麻、棉花和大麻等。

本发明的一方面体现在，插入的DNA序列的编码产物是一种酶，如从由尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶(“UDPG-PPase”)、蔗糖合成酶、纤维素合成酶或蔗糖合成酶的任何衍生物构成的一组酶中，选出的碳水化合物修饰酶，该酶负责植物体中尿苷二磷酸葡萄糖的合成。目前的应用并不限于此处披露的这些具体的酶，因为这些酶仅是作为首选的酶样品。此处这些酶需要满足的是，它们在某种程度上可能影响植物体纤维素的前体水平。这些酶可以来自包括其他植物种类、细菌或酵母菌在内的生物。

虽然因为下述原因细菌酶类是首选的，但是编码酶类的DNA序列可能来自许多其他的生物体是可以理解的。选择“首选”酶类的主要标准是产物与前体或底物相比，具有较高的Km值，从而表明反应偏向生成产物的方向。

UDPG焦磷酸化酶是最优的酶类，特别是当编码该酶类的DNA序列主要来自细菌的时候。细菌UDPG焦磷酸化酶的动力学数据(与以UTP、葡萄糖-1-磷酸和PPi为底物相比，UDPG焦磷酸化酶对UDPG具有较高的Km值)，缺乏信号序列，并且其基因不同于植物相应基因而不被UDPG的积累所抑制，使细菌UDPG焦磷酸化酶基因成为增加植物体UDPG水平的一个极好的目标基因。另外，细菌基因是广泛使用的基因，并且不太可能导致对受体UDPG焦磷酸化酶基因的共抑制。细菌基因可选自许多普遍使用的属，但首选的是醋杆菌属，更具体的是从木醋杆菌属和黄单胞杆菌属选出的种类。

另一方面体现在，导入植物体中的DNA序列可以编码控制、反馈调节或其他影响植物纤维素合成的蛋白质，或者是它们的衍生物(包括木质素修饰蛋白及其调控蛋白在内)。

更进一步体现在，导入植物体的DNA序列转录成具有调节功能的RNA分子。例如，这些RNA分子可以影响酶合成、纤维素合成或通过改变前体或合成木质素间接改变纤维素的合成。

DNA序列导入植物细胞之前进一步描述如下，添加的DNA序列或基因(术语“DNA序列”和“基因”以下可替换使用)编码具有纤维素调节作用的产物，准备用于DNA重组体或连接到载体上。事先将添加的基因通过已知的提取技术从供体(如细菌、酵母菌或其他种类植物)中提取出，或从贮藏处，如ATCC得到。一般的提取过程包括源细胞的溶解，通过酚/氯仿进行抽提，最后将释放的DNA用酒精沉淀析出回收。

然后，上述基因或DNA序列通过，如聚合酶链式反应(“PCR”)进行扩增，接着克隆到所需的重组体或载体。上述基因扩增基于使用引物和诱导剂(有时也称为酶催化剂)的PCR。Cetus公司的两项专利——美国专利第4800159号和加拿大专利第1237685号，以及美国专利第4965188号和4682202号对PCR过程都有详述，本发明参考了这些资料。

本发明所用术语“引物”是一段寡核苷酸序列，无论是自然纯化酶切产生的还是人工合成的引物，在核苷酸、诱导剂以及适宜的pH和温度条件下，都起DNA合成起始点的作用，引导合成引物延伸产物即与扩增DNA的互补序列。引物是最好的扩增效率最高的单链核苷酸但也可以是双链的。如果是双链的，在延伸产物以前首先将其两条链分开。引物最好是寡脱氧核苷酸。引物的确切长度可因用于扩增的具体DNA序列或“模板”而不同。一般来说，引物的大小必须取得一个平衡。必须足够大以利于特异性地结合到模板上，也就是说，要与模板有足够大的同源区域以便其他与引物有一定同源度的无关DNA(与扩增DNA序列无关)不会有显著程度的扩增。另一方面，引物过大不易于操作，在时间和成本上也是不允许的。在本发明范围内，使用长度为10-50个核苷酸的引物，对大部分预期的DNA序列可达到这种平衡。不过，确定引物的适宜长度完全在这一领域技术人员的平均技术水平范围内。另外，虽然PCR是呈指数扩增DNA产物的高效过程，且扩增量与循环数相关，但其它已知的DNA扩增技术也可以在本发明的范围内使用。

转化植物受体的适宜重组体或载体是该领域所熟知的，包括有质粒、粘粒噬、菌体衍生物、噬粒和表达载体。通常喜欢使用的载体会包括有一个在一或多种植物中起作用的复制起始位点，多个适当的限制酶切点和适于植物细胞的标记性基因。首选的转化载体取决于特定的受体，不过仍包括Bluescript载体、pBI(农杆菌二元载体)和pUC衍生载体。其它对评价植物体mRNA和蛋白质表达有用的载体包括pMAL和pGEM载体。

为了使导入植物体中的DNA序列表达，可能需要改变对该DNA起调节和/或控制作用的序列。具体来说，可能需要将添加的基因(目的基因)连接上影响表达的DNA序列，如一个或多个启动子，并且可能需要在其两端加上转录起始和终止信号。特别是，可能要改变起始密码子并加上合适的植物启动子和终止子序列。或者，可以提供改进的翻译共有性序列。但是，可以理解的是无须对本发明范围内预期的每一个DNA序列都进行这些修改。这些修改技术性是该领域平均技能水平的技术员都能做的。

一些启动子可以连接到目的DNA序列上，最有效的类型在不同植物受体间是不同的。在首选的种类中，启动子特异地表达于植物体维管束细胞或产纤维素细胞。例如，在树木中，木质部特异启动子包括但不限于来自西芹的4-香豆酸辅酶A连接酶(“4CL”)启动子，是首选的直接在木材形成组织中表达的启动子。在烟草中，花椰菜花叶病毒(“CaMV”)是合适的启动子。在其它种类的植物中4CL和CaMv 35S启动子也可以使用。

为保持术语的一致性，已进行调节和/或控制序列修改，将要进行转化的DNA序列在下文中被称为“基因盒”或“DNA序列盒”。通过一些既定的方法用上述DNA序列盒转化植物受体。一般来说，对于烟草等大多数植物，广泛使用的农杆菌介导法是适用的。植物转化的通用技术可以在下列两篇参考文献中找到：Svab Z.P.Hajdukiewicz and P.Maliga.1995.Generation of Transgenic Tobacco Plants by Agrobacterium Transformation(通过农杆菌介导法产生的转基因烟草植株).pp.61-77；(eds.P.Maliga，D.F.Klessig，A.R.Cashmore，W.Gruissem and J.E.Varner)Methods in Plant Molecular Biology(植物分子生物学方法)，Cold Spring Harbor Laboratory Press，New York and Horsch，R.B.，J.E.Fry，N.L.Hoffman，D.Eichholtz，S.G.Rogers and R.T.Fraley.1985.A Simple and General Method for Transferring Genes into Plants(一种简单通用的植物基因转化法).Science 227：1229-1231。对树木的首选形式，特别是对针叶树种，如云杉，可将基因枪法与胚胎培养相结合。

基因枪法在参考文献Ellis et al.1993.Stable Transformation of Picea glauca by Particle Acceleration.Bio/Technology.vol.11 pp.84-89中有更详细的叙述，在短时间内将胚胎培养中的植物受体置于转化DNA序列或DNA序列盒的喷射或轰击下。一般，这是通过惰性气体(如氦)驱动涂有一层转化DNA序列的金粉微粒实现的。或者，可以将标记基因连接到DNA序列上，如抗生素抗性基因，以便于进一步的选择性再生培养。例如，将DNA序列连接上卡那霉素抗性基因，转化培养之后，筛选出具有卡那霉素抗性的再生植株。

转化之后，植物组织放置在含有抗生素的培养基上，表达抗性基因的转化细胞在其上能够生长；非转化细胞被抗生素延缓生长和/或致死。按照这种方式，一旦植株通过形成芽或者通过成熟胚的生长和萌发(用体细胞胚胎发生的情况下)而再生，产生的就只有能够表达导入基因的植株(本发明导入的DNA序列携带有抗生素抗性基因)。

种子(包括源于体细胞胚的人工种子)和此处所描述的经过转化、再生过程产生的后继植株提高了生长速率和产量，是转化能够改变植物体纤维素前体水平DNA序列的结果。例如，如果转化的DNA序列包括UDPG焦磷酸化酶基因，葡萄糖(一种光合产物)在植物细胞中转化为UDP-葡萄糖(纤维素合成的高能底物)。由于这些细胞相对于光合细胞含有较少量的葡萄糖，葡萄糖通过简单扩散转运至这些细胞。这种碳转移减轻了过量光合产物对光合作用的抑制作用，从而使光合效率和糖产量更高。在首选形式中，当DNA序列通过特异启动子在维管束和产纤维素细胞中特定表达时，随之而来的优势，不仅有以上所述的碳再分配，而且使允许提高纤维素产量的细胞中供给了更多的UDP-葡萄糖。

本发明的方法有两个主要特点。首先，对于所有植物，无论其是不是产纤维植物(树木、麻、棉等)，通过使运离光合细胞的碳在植物体中进行非特异性再分配，使植物拥有更快的生长速率和更高的产量。这就允许光合作用能够继续无抑制地产生更多的单糖，用于植物体的“建造”和贮藏。因此，提高了植物的生长速率，增加了植物的生长量和产量。其次，对于产纤维植物，导入植物体的DNA序列能够特定地在个别类型细胞中表达，以便如期望地增加纤维素的细胞特异性沉积。对于林木来说，这必将增加木材产量和纤维产量，尤其是当该基因连接上仅在木材形成组织中表达的启动子时。而对大麻、剑麻等其它非林业产纤维植物来说，预计纤维产量也会增加。除了针对木材形成组织外，在植物的其他部分，像棉籽周围的棉纤维，也实现了纤维素量的增加。

增加纤维素合成的具体应用包括各种不同用途和生长习性的诸多作物。在林业方面，受遗传变异控制的生理生化过程影响着木材产量。这就导致了增加产量的理论限制因素在于能量供应的基本限制(Farnum，P.，R.Timmis，J.K.Kulp.1983.Biotechnology of forest yield.Science 219：694-702)。尽管存在这种限制，树木生长增加的50-300％是取决于树的品种和生长环境。显然，提高能量捕获、辐射能转化和改变植物体的碳分配是使树木得到改良的可能方面。通过本发明概述中的方法提高纤维素含量可以取得这样的成果。另外，纤维素含量的增加对提高植物的抗性(如抗倒性)也有重要的意义。

附图说明

图1表示基因表达盒的组成包括UDPG焦磷酸化酶基因和CaMV启动子，克隆表达载体pUC包括基因表达盒和转化载体pBI121，pAX6包括基因表达盒和优先启动子；

图2表示木醋杆菌的核苷酸和氨基酸序列，一系列pBI二元载体的克隆基因盒序列SEQ ID Nos.8，9，10和11；

图3表示木质部UDPG焦磷酸化酶基因特定转化载体的构成；

图4表示含有CaMV 35S启动子和GUS基因的植物二元表达载体pCAMBIA1301；

图5表示烟草中UDPG焦磷酸化酶活性的测定；

图6是抗UDPG焦磷酸化酶亲和纯化血清的滴度图；

图7表示使用抗UDPG焦磷酸化酶抗体对UDPG焦磷酸化酶进行的免疫印迹分析；

图8是转基因烟草纤维素分析的条形图。

具体实施方式

概述：

用木醋杆菌(Ax)UDPG焦磷酸化酶超表达基因的重组体转化烟草，结果转化植株与非转化植株相比，干重、溶质含量和纤维素含量均增加。Ax UDPG焦磷酸化酶基因的特异性抗体通过给兔注射大肠杆菌过量产生的一种融合蛋白而制得。使用这种抗体检测转基因烟草表达的UDPG焦磷酸化酶已经得到证实。基于卡那霉素抗性分离到的基因盒在T₁群体的大多数中都以某种方式和一个单一的插入位点并存。云杉中4CL-GUS和4CL-UDPG焦磷酸化酶两种重组体转化的初步实验，以及小麦pAx6和pCAMBIA1301两种重组体转化的初步实验就都得到了许多推定的转化系。这些转化系正在进行GUS筛选和进一步的卡那霉素筛选。

实施例1

制备DNA重组体

原菌(木醋杆菌)含有UDPG焦磷酸化酶基因(UDPG-PPase)，从ATCC(23768)得到。UDPG焦磷酸化酶基因经PCR扩增之后又进行了克隆。PCR引物的设计考虑了以下因素：

添加适合克隆到各种载体的限制性内切酶酶切位点。

起始密码子由缬氨酸变异为蛋氨酸。

变异其中的Eco RI位点，去除后不改变氨基酸序列。

在基因的5’术端添加非编码的DNA片段以提高翻译效率。

结果，5’术端的引物A为：

(MVKPLKKAVL)(SEQ ID NO：2)

taGGATCCgtcgaccATGGTCAAGccccttaaaaaagccgtattgc(SEQ ID NO：1)

而原UDPG焦磷酸化酶基因的5’末端为：

ttgaggtaaatattaGTGATTAAgccccttaaaaaagccgtattgccggttg→(SEQ ID NO：3)

VIKPLKKAVLP(SEQ ID NO：4)

原UDPG焦磷酸化酶基因的3’末端为：

ggtgccggaagatcacttgtacttcgtcaggaattcacgcacgccggg(SEQ ID NO：5)

终止密码子*SNVCAP(SEQ ID NO：6)

而3’末端的引物B为：

ggtgccTCTAGAtcACTTGTacttcgtcagGACTTCacgcacgccggg(SEQ ID NO：7)

终止密码子*SN*VCAP(SEQ ID NO：6)

目的基因扩增成功，DNA测序证实扩增的片段就是目的UDPG焦磷酸化酶基因。扩增出的木醋杆菌UDPG焦磷酸化酶基因与已公布的序列几乎完全相同。对完整DNA序列进行了分析，以发现潜在的内含子和外显子剪接位点。有几个特性都被认为是找到了可能引起mRNA剪接的内含子。这些特性包括DNA序列中的非随机密码子，优先使用的某些密码子，GC含量，已知序列密码子中嘌呤和嘧啶的相对位置，剪接位点之间区域的外显子数，以及外显子末尾的上下游。分析表明，植物组织中mMRA剪接的可能性较低。

将扩增的UDPG焦磷酸化酶序列克隆到BlueScript载体上，并用于构建基因盒。通过连接带有CaMV 35S启动子的UDPG焦磷酸化酶基因构建基因盒。制作的pUC克隆载体含有UDPG焦磷酸化酶基因，该基因带有合适的酶切位点，以便将该“基因盒”放置于含有木质部优先的或其它启动子的各种转化载体。基因盒和载体如图1所示。

含有木醋杆菌UDPG焦磷酸化酶基因的几个载体已经成为不同目的基因盒的来源，如下：对于烟草转化：

pBIAx——农杆菌二元载体，带有连接CaMV 35S启动子的Ax基因

pBI4CLAx——农杆菌二元载体，带有连接木质部优先表达的西芹4CL启动子的Ax基因对于云杉转化：

pBI4CLAX——pUC-衍生载体，含有连接4CL启动子的Ax基因

p4CLGUS——pUC-衍生载体，含有连接西芹4CL启动子的GUS基因，该启动子用于评估启动子的木质部特异性

对于小麦转化：

pAx6——pUC-衍生载体，含有连接CaMV 35S启动子的Ax基因

pCAMBIA1301——植物二元表达载体，含有连接CaMV 35S启动子的GUS基因对于评估转化mRNA和蛋白质的表达：

pMAL——大肠杆菌蛋白质表达载体，用于生产抗体

pGem——mRNA转录载体，用于原位杂交

pBI二元载体通过将UDPG焦磷酸化酶基因连接插入农杆菌转化用的pBI121构建成。由此产生的二元载体包含UDPG焦磷酸化酶基因和CaMV 35S启动子的转录融合。pBI系列二元载体的克隆基因盒的一致性通过DNA测序得到了证实(图2)。西芹的4-香豆酸辅酶A连接酶(4CL)启动子已被确定是木质部优先启动子，并且4CL启动子在转基因烟草木质部的表达是高度特异的。4CL启动子被修改连接上了UDPG焦磷酸化酶基因。该结构随后插入到二元载体中，该载体含有连接着UDPG焦磷酸化酶基因的4CL启动子。载体详图见图3。

大肠杆菌表达载体

为提高下一步分析转化植株用的抗体量而构建了一种表达载体。该表达载体以UDPG焦磷酸化酶读码框和麦芽糖结合域(MBP)的连接为基础。该质粒载体为大肠杆菌中UDPG焦磷酸化酶蛋白的表达和纯化提供一种方法，并且是一种市售载体，允许接着使用麦芽糖柱纯化分离得到原UDPG焦磷酸化酶蛋白。

实施例2

烟草转化及UDPG焦磷酸化酶表达的特征

转化

二元载体pBLAX6含有AxUDPG焦磷酸化酶基因，转化到农杆菌菌株EHA 105中，用来感染烟草c.v.xanthii的叶盘。超过42株独立T₀转化植株再生，并将个别植株从组织培养室转移到生长室生产种子。UDPG焦磷酸化酶基因在T₀烟草植株的稳定转化已被使用内在引物的PCR扩增首次证明(见以前的报告)。进一步进行了Southern杂交分析。超过42株独立转化植株(T₀)在无菌MS培养基和土壤中扎根、生长。收获得到24株T₀植株的种子，然后用于产生T₁植株。T₁植株在含有卡那霉素(150mg/ml)的培养基上发芽后种植在土壤中。具有卡那霉素抗性的T₁植株按照预先的分离模式分离得到。结果表明，UDPG焦磷酸酶基因已成功整合到烟草基因组。通过测量伴随着耦合酶将6-磷酸葡萄糖转换为6-磷酸葡萄糖酸脂形成的NADPH，对UDPG焦磷酸化酶基因的表达活性进行了体内和体外检测。为了检测UDPG焦磷酸化酶的活性，从温室烟草叶片取样，在液氮中用PVPP/石英研磨成粉。用镁/甘氨酸—甘氨酸缓冲液提取酶，然后加入到检测缓冲液。在30℃340nm处监测NADH的形成显示，在线性反应速率消失之前是不断进行的。酶检测表明UDPG焦磷酸化酶的活性在携带有UDPG焦磷酸化酶基因的转基因烟草中显著高于限制植株(图2)。注意，在图4中活性是指特异性活性(units/mg蛋白)，标准是纯商业酶制剂。

表1

^aSignificant at p＝0.05

T₀植株在6周内的高度增长数据都在表1中。在指数生长阶段，转化植株显著高于限制植株(P＝0.05)。

T₁代分离分析

T₀植株的种子收获后用于产生T₁代。T₀种子的发芽率变化范围是52-93％，平均为73％。产生T₁代的种子在含有100或150μg/ml的卡那霉素培养基上发芽，分离卡那霉素抗性苗并记分。Pearson卡方检验显示，由于分离比例大约为3∶1，因此大部分转基因烟草含有在单一位点(可能是单一拷贝)插入的基因(表2)。生长中的T₁苗对卡那霉素的抗性得分不是直线增加的。在水-琼脂上，发芽率非常低，此外，非转化的限制种子和转化的种子有相似的发芽率。相反，使用1/2MS培养基，在卡那霉素存在的情况下所有种子的发芽率都高，包括限制种子。对包括根系生长、子叶颜色、种子活力、幼苗大小和出现的初生叶在内的几个参数进行了评估。目前唯一可靠的、重复好的测定幼苗卡那霉素抗性的方法是，在含有150μg/ml卡那霉素的1/2MS培养基上发芽3周，对基于初生叶出现或不出现的抗性记分。

表2

实施例3

蛋白质表达分析

蛋白质的生产和抗原纯化

蛋白质表达载体pMALAX用于过量生产UDPG焦磷酸化酶-麦芽糖结合蛋白(MBP)，在用异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导之后融入大肠杆菌。在胍和脲的缓冲液中得到粗蛋白提取物。使用直链淀粉树脂亲和层析柱，对UDPG焦磷酸酶-MBP融合蛋白进行亲和层析纯化，用10mM麦芽糖将纯化蛋白从柱中洗脱。使用SDS-PAGE和兔抗体证明纯化的融合蛋白是一纯片段。

抗体生产

用纯化的UDPG焦磷酸化酶-MBP融合蛋白免疫兔之后，通过恩茨探针生物技术(Enz-Probe Biotechnology，Burnaby，B.C.)生产抗UDPG焦磷酸化酶抗体。通过存在过量麦芽糖结合蛋白(取代与融合蛋白该部分反应的抗体)的亲和层析，由免疫的兔血清制备UDPG焦磷酸酶特异性抗体。在Western免疫印迹实验中，用纯化的抗体检测蛋白质表达。

转基因烟草蛋白质分析

蛋白质杂交是按照Sambrook et al.(Sambrook J.，E.F.Fritsch and T₁ Maniatis.1989.Molecular Cloning.2nd Ed.Cold Spring Harbour Laboratory Press：18.pp.3-86)的做法执行，亲和纯化的抗体按1∶500稀释后使用。使用从细菌和从转化的植株提取的UDPG焦磷酸酶蛋白进行Western免疫印迹杂交，都提高了抗体对纯化蛋白的杂交反应。Western免疫印迹杂交显示，抗体结合到了30KDa和90KDa的肽上，分别对应于带有和不带有MBP融合蛋白的UDPG焦磷酸酶肽。通过在修改的繁殖缓冲液中用Xa因子消化，去除掉融合蛋白的MBP部分。根据抗UDPG焦磷酸酶抗体对转基因烟草植株中30KDa肽的识别，推断，UDPG焦磷酸酶基因在这些植株中表达。在非转化的植株中从未检测到抗体结合到类似分子量的肽上。虽然图6中并不明显(UDPG焦磷酸酶蛋白和其抗体的Western免疫印迹杂交)，但是抗UDPG焦磷酸酶抗体和烟草蛋白质电泳图中的其它几个条带有杂交反应。尽管为了进一步纯化抗体和增加其特异性，做了大量的实验，但是背景依然存在。事实上，由于该背景的存在，使从个别转化植株最终检测到UDPG焦磷酸酶蛋白变得困难。不过，使用Xa因子裂解融合蛋白，为获得与UDPG焦磷酸酶蛋白更高亲和性的抗体提供了一种方法。

实施例4

转基因烟草纤维素分析

纤维素是烟草中最重要的多糖之一，是与UDPG焦磷酸酶直接相关的产物。对T₀植株的完整植株和开花成熟植株的茎，都进行了纤维素分析。在索氏抽提器中使用共沸的乙醇-苯(1∶2w/w)抽提出大约20g(f.w.)植物组织.提取后，把溶液弄干，分析可溶性物质。然后，将提取的植物组织研磨，彻底混合，制成同质样品。将1g这种样品在醋酸弱酸溶液中用亚氯酸钠脱木素，并将木质素通过逐步过滤滤除。样品中的全部多糖用于形成综纤维素。用24％氢氧化钾溶液处理去除半纤维素，纯α-纤维素是用烧结坩埚过滤回收得到的一种白色物质。5株限制植株和5株T₀转化(处理)植株的总生物量和纤维素分析表明，含有UDPG焦磷酸酶基因的转基因植株有更高的干重、溶质含量，最重要的是有更高的α-纤维素含量(图7)。综纤维素的检测无显著差异。

实施例5

蛋白质表达和抗体制备

抗UDPG焦磷酸酶兔血清，是在用大肠杆菌产生的UDPG焦磷酸酶蛋白免疫兔后，收集得到的。用酶标记的蛋白质检测总抗体。在血清中使用ELISA检测抗体对纯化蛋白的滴度为32000；工作ELISA稀释1/500使用。UDPG焦磷酸酶特异性抗体，通过有过量麦芽糖结合域蛋白存在的亲和纯化制备，该结合域蛋白可取代与融合蛋白MBP部分反应的抗体。亲和纯化的抗UDPG焦磷酸酶血清滴度如图5所示。请注意从亲和层析住洗脱得到的组分2和3。滴度稀释度为1/1，1/500，1/2000，1/8000，1/32000，1/128000，1/512000，1/2048000，对比预先免疫血清(滴度系列分别为2到9)。纯化的抗体已经确定了与UDPG焦磷酸酶具有相同分子量的Western免疫印迹条带。

实施例6

云杉4CL-UDPG的稳定转化

UDPG焦磷酸酶基因导入云杉

利用基因枪法，用pBI4CLAX和pUC4CLGUS转化云杉体细胞胚的工作已经着手。用这些重组体对超过1500个内地云杉和200个锡特卡(Sitka)云杉体细胞胚进行了轰击。内地云杉的体细胞胚来自四种不同的基因型，经历了几个不同的生长发育阶段。基因枪轰击之后，在将体细胞胚放置于含有5mg/ml卡那霉素的筛选培养基之前，需要恢复两周。每三个周将体细胞胚转移到新鲜卡那霉素培养基上一次，转移三次，然后在无卡那霉素培养基上另外放置三周。T₀代，有超过4％的用pUC4CLGUS和pBI4CLAX轰击的体细胞胚，在含有卡那霉素的培养基上形成了愈伤组织。每次转移时都对愈伤组织情况进行评定，胚性愈伤组织为浅黄色，结构致密的颗粒状愈伤组织。

使用以X-Gluc为反应底物的组织化学检测法检测由pUC4CLGUS重组体轰击的胚得到的胚性愈伤组织GUS基因的活性，确定了22个内地云杉和1个锡特卡转化胚系。这些胚系的GUS染色惊人的强烈。超过20个由pBI4CLAX轰击的胚得到的胚系能够在含有卡那霉素的培养基上生长。

实施例7

UDPG焦磷酸酶基因导入小麦

利用基因枪法，用pAx6和pCAMBIA1301对河南大面积推广的小麦品种的1686个胚性愈伤组织(源于幼胚)和模式小麦品种Bobwhite的264个胚性愈伤组织(源于幼胚)进行了轰击。河南大面积推广品种的胚性愈伤组织来自四种不同的基因型，经历了几个不同的发育阶段。基因枪轰击之前，胚性愈伤组织在高渗培养基(愈伤组织诱导培养基加0.4M甘露醇)上预培养了4～6小时；轰击之后，继续在高渗培养基上培养16小时。然后，在放置于含有4mg/ml卡那霉素的筛选培养基之前，需要将胚性愈伤组织转入诱导培养基中恢复一周。每两个周将愈伤组织转移到新鲜卡那霉素培养基上一次，转移三次，然后在无卡那霉素培养基上另外培养两周。每次转移都要考察愈伤情况，小麦胚性愈伤组织的特点有：淡黄色，表面光滑，质地松脆，呈结构致密的颗粒状等。T₀代，有超过3.5％的用pAx6和pCAMBIA1301轰击的胚性愈伤组织，在含有卡那霉素的培养基上形成了胚性愈伤组织(抗性胚性愈伤组织)。

使用以X-Gluc为反应底物的组织化学检测法，检测由pCAMBIA1301重组体轰击胚性愈伤组织得到的抗性胚性愈伤组织GUS基因的活性，确定了河南大面积推广的小麦品种有24个转化胚系，而Bobwhite品种有2个转化胚系。这些胚系的GUS染色惊人的强烈。22个由pAx6轰击的胚得到的胚系能够在含有卡那霉素的培养基上生长。

Claims (10)

1.一种加速植物生长及增加纤维素量和/或产量的方法，其特征在于，它包括将一段编码尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶的DNA序列导入植物体，该序列的表达通过改变植物组织或细胞中纤维素前体的水平来加速植物的生长和/或增加产量。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的纤维素前体是尿苷二磷酸葡萄糖。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的植物是云杉或小麦。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的DNA序列包含源于木醋杆菌的尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因。

5.一种改变植物纤维素量的方法，该方法包括将一段编码尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶的DNA序列导入该植物并表达，其特征在于，上述序列的表达改变植物组织或细胞中的纤维素前体水平，进而改变该植物的纤维素量。

6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述的前体是尿苷二磷酸葡萄糖。

7.一种改变植物纤维素产量的方法，其特征在于，该方法包括将一段编码尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶的DNA序列导入植物，该序列两端带有转录起始和终止信号并连接上使表达发生的DNA序列，该序列的表达改变植物组织或细胞的纤维素量。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述的使表达发生的DNA序列是指导尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因主要在植物茎或木质部细胞中表达的启动子。

9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述的使表达发生的DNA序列是一种从一个或多个CaMV 35S和来自西芹的4CL基因构成的一组基因中选出的启动子。

10.一种DNA表达载体，其特征在于，该载体包含一段编码细菌尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶的DNA序列，序列两端带有转录起始和终止信号并连接上使植物中表达发生的DNA序列。

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