JPH09505467A

JPH09505467A - トランスジェニックフルクタン蓄積作物およびその生産法

Info

Publication number: JPH09505467A
Application number: JP7513914A
Authority: JP
Inventors: ケイミ，ペリー・ジエラード; ハーシー，ハワード・ポール; カー，フイリツプ・エス
Original assignee: イー・アイ・デユポン・ドウ・ヌムール・アンド・カンパニー
Priority date: 1993-11-09
Filing date: 1994-11-07
Publication date: 1997-06-03
Also published as: PL314296A1; BR9408286A; US5908975A; ZA948867B; DK0728213T4; EP0728213B1; DE69433502D1; AU1208795A; PL180543B1; DK0728213T3; HU9601200D0; KR960705938A; IL111573A0; WO1995013389A1; HUT75075A; CA2176109A1; EP0728213B2; EP0728213A1

Abstract

(57)【要約】本発明は細菌のフルクトシルトランスフェラーゼの選択的な発現による、トランスジェニック植物の種子、塊茎または葉のフルクトースポリマーの合成および蓄積法に関する。選択的発現には時期の調整、特に亜細胞位置での組織特異的発現を含む。成功した形質転換体は、樹立した作物に、副産物の損失なく、または植物の成熟、収穫または保存中に分解による収量の損失無く、スクロースを利用してフルクタンを細胞の液胞中に合成および蓄積する。増大したフルクタン生産は、フルクトース甘味料産業にとって有利であり、飼料に使用する穀粒に価値を付加するだろう。

Description

【発明の詳細な説明】トランスジェニックフルクタン蓄積作物およびその生産法発明の分野本発明は細菌フルクトシルトランスフェラーゼ遺伝子の選択的発現による、トランスジェニック植物中のフルクトースポリマーの合成および蓄積法に関する。技術的背景維管植物中に見いだされる主要な保存炭水化物は、スクロース、澱粉およびフルクタン（末端グルコース残基に結合したフルクトースの非−還元性ポリマーである）。多くの作物学的および技術的障害にもかかわらず、作物は主に甘味料産業において使用される特にスクロースまたは澱粉の供給源として、世界中で栽培されている。経済的に成功したスクロース用のテンサイおよびサトウキビの栽培および加工は、限定するわけではないが、制限された栽培地域、労働集約的な収穫実態、スクロースレベルがその頂点に達した時期の収穫のタイミング、組成ならびに輸送および加工の遅れによりもたらされる品質の望ましくない変化、ならびに適切でない、または長期間の保存による収量損失というようなことを含む数々の障害を克服しなければならない(SalunkheおよびDesai、糖類作物の収穫後の技術(Posth arvest Technol.ｏf Sugar Crops)、CRC出版、ボカラトン、フロリダ(1988)； Stout,J.Am.Soc.Sugar Beet Technol.,9:350(1957);Barnes、サトウキビ(The su garcane)、第２版、編集、レオナルドヒルブックス(Leonard Hill Books)、ロンドン(1974))。例えば刈り取りをしたわずか９日後のサトウキビの加工は、酵素的分解によるスクロースの損失のため利益が無い作業である(Alexander,Sugarcane Physiology,Elsvier,Amsterdam,(1973);Gulibea uら、Sugar J.,18:30(1955))。比較的短期の収益性のために、収穫および加工の時期には正確な計画が必要である。極端な気象条件というような予期せぬ遅れは、生成物に重大な損失を生じ得る。テンサイに関する至適な収穫期間もタイミングの問題により複雑である。ラフィノースはビート汁の主な混入物であるが、スクロースの結晶化を妨害し、有益なテンサイ加工にかなりの挑戦を与える。ラフィノースはスクロースレベルが頂点に達すると同時期に劇的に増大し、そしてスクロース分解を防止するために必要な温度で、ビートの保存中に増大し続けることが示された(Finklerら、J．Am．Soc.Sugar Beet Technol.,10:459(1959);Brow n,Anal.Chem,24:384(1952))。続いてスクロースレベルおよびラフィノース量が品質を決定し、それゆえにテンサイ加工の収益を決定するので、スクロース用のテンサイの栽培は複雑である。ほとんどトウモロコシから生産される澱粉に基づく甘味料が、サトウキビおよびテンサイに付随する多くの制限のために、一部開発された。トウモロコシ甘味料もスクロース輸入の依存を緩和するために役立った。供給は歴史的に世界的な不足および不安定な価格変動を受けやすく、多くの政治的な出来事および天然ジアスターゼに左右される。米国におけるスクロース作物の置き換えは著しく急速で、これは恐らく澱粉から甘味料を生産することの本質的な多くの利点によるものであろう。例えば１つはトウモロコシの収穫および保存条件は、テンサイおよびサトウキビのようなスクロース作物に比べてより一層好ましいものである。これにより、利用できる加工能を保持しながら、品質の損失無く、より長期の保存期間が可能になる。サトウキビからのスクロースの利潤の高い生産は、品質の損失を防ぐために、収穫から数日以内で行われる。対照的に、トウモロコシは有意な生産の損失および変化無く、甘味料生産のための澱粉の単離前に、１年間、適切に保存することができる。トウモロコシがサトウキビのような作物に勝る別の利点では、多様な栽培条件に対する適合性である。トウモロコシの使用は、甘味料産業のために作物を栽培できる広大な米国の畑に増大した。さらに、澱粉を基本とした甘味料の最終生成物であるフルクトースは、その相対的な甘みが増すので、主な消費者にはスクロースよりも好まれる。酸性条件下で、フルクトースはスクロースよりも最高で1.8倍甘い。この結果は同じ効果を奏するための使用量が少ないので、消費者にとっては節約となる。フルクトースコーンシロップ産業の商業的成功にもかかわらず、改善の余地がかなりある。グルコースポリマーである澱粉をフルクトースに転換するために克服されるべき技術的障害は、生産コストがかなりかかることである。フルクトースシロップ生産の現在の技術は、本質的に澱粉を個々のグルコース残基に加水分解することから始まる。緩和な酸処理を通して澱粉の加水分解が行われる時の、着色、香および、生成する望ましくないオリゴマーによる低収量を減少させるために、酵素的加水分解により行われている。澱粉の酵素的加水分解は、効率的であるかもしれないが、フルクトースシロップ生産が大規模であるが故に重大な経費的損失を生じる。澱粉が１年間に加水分解される数億ポンドを考慮すると、澱粉のグルコースへの96％の転換は、可能性のある生成物に巨大な損失を生じている。澱粉の不完全な加水分解に損失が最小4％でも、損失しなければ最終生成物として販売される可能性のある数千万ポンドのグルコース量が失われる。この結果、潜在的に毎年数百万ドルの収益が損失となる。全工程の効率は、異性化工程でさらに減少する。グルコースのフルクトースへの酵素的転換は、わずか４２％フルクトースで平衡に到達する。このフルクトースおよびグルコース混合物は、許容できない生成物である。スクロースおよび４２％フルクトース溶液の工業的基準は、甘味の点でスクロース溶液に匹敵しない。結局、４２％溶液をイオン交換クロマトグラフィーによりフルクトースについて濃縮しなければならず、これは生産の全経費を有意に増すことになる。９０％フルクトース溶液をイオン交換カラムから溶出させ、そして４２％溶液の一部と混合し、５５％溶液を得る。この５５％溶液はスクロースに匹敵する均等レベル甘味を有している。フルクトース甘味料について、今日急速に成長している市場は結晶フルクトースである。この生成物は成長している多くの焼成製品および乾燥ミックスに使用されている。結晶フルクトースの生産には、イオン交換カラムから単離された90 ％フルクトースシロップをさらに加工することが必要であり、これはさらに経費がかかる。グルコース混入を除去するために、フルクトースの結晶化前に必要なさらなる加工が可能である。価値ある製品として売れる製品を得るためには、約９７％フルクトース混合物が必要である。グルコースポリマー（澱粉）のフルクトースへの転換は、甘味料産業において多くの利点を有するが、相当の経費もかかる。経費の問題はフルクトースシロップ生産用出発物質をフルクタンに代えることで解決できた。植物貯蔵炭水化物の第三番目の員がフルクタンを保有することは、１５０年間も知られている。フルクタンはβ２−１およびβ２−６結合により連結された個々のフルクトース残基から成る。酵素的または緩和な酸処理のいずれかによる、このポリマーの単純な加水分解で、実質的に純粋なフルクトースが生成する。したがってフルクタンは、現在フルクトースシロップ生産に使用されている糖化、異性化およびイオン交換工程を排除する、澱粉に比べて純度および含量において独特の利点を提供する。単純化された加工により経費が下がり、そしてスクロースに比べて甘味が比較的高いということが、フルクトースが甘味料産業において優れた出発物質であるとの、単に２つの理由である。しかしフルクタン含有作物を栽培することの短所は、スクロースのために栽培される作物に匹敵する。２３の別個の植物の族がフルクタンを蓄積することが明らかにされてきたが(Hendry,New Phytol.,106:201-216(1987);NelsonおよびSpol len,Physiol.Plant,71:512-516(1987))、わずか２種だけが有力な産業用植物と考えられる。キクイモ(ヘリアンサスチュベロスス：Helianthus tuberosus)およびチコリー（チコリウムインチブス:Cichorium intybus)は、伝統的な農産物として生産性があることが知られ、テンサイおよびジャガイモ(Fuchs,Starch 39 :335-43(1987))に匹敵する炭水化物レベルを蓄積する。しかしキクイモおよびチコリーは、季節作物である。フルクタンは地下塊茎に、成長する季節の一時期に蓄えられるだけである。フルクタン合成は塊茎の発生が止めば急速に落ちる。成熟期の塊茎中の分解活性は上昇し、休眠中に高いまま残存する（Fuchs,Starch 3 9:335-43(1987)）。キクイモについては収穫の時期は特に決定的に重要である。望まれるより長い分子量ポリマーは、有力なフルクタンの量が比較的少量蓄積された時に、若い塊茎中でより優勢である。成熟した塊茎は、乾燥重量で最高80％のフルクタンを含有するが、優勢種はより低分子量型である（Haunoldら、J.Plant Physiol.134:218-223 (1989)。すべてのフルクタンが末端グルコース残基を含有するので、開始スクロース分子から始まり、フルクトース残基の数が大きいほど、ポリマーはより純粋である。フルクタンが大きければ大きい程グルコース混入からのフルクトース精製の必要性が少なくなる。１年の短い、しかし重要な期間にフルクタンを徹底的に加工することで、分解の損失を回避することはできるが、これでは加工能力による影響を受けやすい。次に加工能力は特殊化された装置、および短い収穫季節中に独特の根菜作物を加工できる工業的プラントに組み立てるために必要な経費により確実に制限される。フルクタンの商業的収穫のために、キクイモを栽培することの主な不利益は、塊茎の薄く脆い皮である。塊茎の傷は収穫中によく生じるが、呼吸を増大させ、その結果、高い水分損失および保存中のフルクタンの分解の増大を起こす。環境的条件下での保存は、数週間に限られ、経済的な成功を減じるフルクタンの有意な分解前が最高である。あるいは作物を一定温度および湿度に加工するまで維持することができた。これにより生産損失を防ぐが(Dykinsら、Industrial and En gineering Chemistry,25:937-940(1933))、大規模な保存にかかる出費は許されない。畑でのフルクタンの蓄積は、極度に環境の変化に敏感である。渇水および霜にさらされると、蓄積されるフルクタンの品質が劇的に変化する(PraznikおよびBe ck、Agr.Biol.Chem.,51:1593-1599)。伝統的な育種プログラムは、理論的には環境変化による品質の損失が低下した様々なものを生じる可能性がある。しかし、この種類のプログラムは通常、大変時間がかかり、現時点では適切ではなく、そしてフルクタン産業が存続可能であると証明された時にのみ実行されるであろう。フルクタン含有作物の遺伝子工学も、これらの障害を排除することができた。フルクタン生合成遺伝子（１つまたは複数）の過剰発現は、大分子量フルクタン収量、合成の増大、または霜または渇水による品質損失の減少を導くことができる。この方法はまた、特殊化された保存条件の必要性も排除できる可能性がある。そのような遺伝的プログラムは、フルクタン合成、生合成タンパク質の動力学的な生化学を詳細に理解すること、および最終的にはフルクタン合成に関与する遺伝子の調節を理解することにかなり依存する。現在では、この知識が欠如している。すべてのフルクタン蓄積植物についての現在のモデルは、1968年に提案され(EddlemenおよびJefford,New P hytol.67:517-531(1968))、ポリマー合成および保存は２つの別個のタンパク質の連続的作用により達成される、と示唆している。このモデルは少し変更されたが(Wagnerら、Zeitschrigt fur Pflanzenphysiologie 112:359-372,(1983);Freh nerら、1984,New Phytol.116:197-208))、可逆的なフルクトシルトランスフェラーゼ（FTF）活性に関する鍵となる問題を解決するはずであり、そして再度、厳密に検討されている(Housleyら、New Phytol.119:491-97(1991);Cairns,,A.J.Ne w Phytol.120:463-73(1992))。生合成経路に関与する酵素は均一に精製されなかった。それゆえに、フルクタン代謝を完全に理解し、そして次にクローン化された植物遺伝子（１つまたは複数）を使用するトランスジェニック植物中の合成の調節を変え、分解による損失を制御し、そして蓄積されたフルクタンの分子量を増大させるのは、数年先かもしれない。微生物もまた、フルクタンを生産することが知られている。しかし、植物系とは異なり、微生物のフルクタン合成は特徴がよく知られている(Hehre,A dv.in Enzymol.,11:297(1951);Hestrin,細菌(TheBacteria):構造および機能に関する文献(A Treatise on Structure and Function)、アカデミック出版(Academi c Press)、NY,，GunsalasおよびStanier編集、第３巻、第８章(1962)を総説として参照にされたい)。細菌源に由来するFTFsは、フルクトース残基に結合したβ ２−１、β２−6またはβ２−１およびβ２−6の混合物を含む、直鎖または分枝ポリマーの重合を触媒する。フルクタンの鎖は、澱粉およびデキストランと同様に、成長している非還元性フルクトース末端単位のＣ−６水酸基に、１つのフルクトフラノシル残基の段階的付加により成長する。あるいは鎖中の枝はフルクトース残基の付加がＣ−１水酸基で生じた時に生じる。分枝化はポリマーの最高１２％の割合で起こり得る(Hestrin,Ann.N.Y.Acad.Sci.,66:401(1956);Hehre,Meth ods Enzymol.1:178-192(1955);Han,Adv.Appl.Microbiol,35:171-194(1990))。バチルスズブチルス(Bacillus subtilis)において最も徹底的に研究され、多くの種がフルクトース重合活性を有することが確認された(EvansおよびHibbert、A dv.Carbohydr.Chem.,2:253-277(1946);MantsalaおよびPuntala、FEMS Microbio Lett.,13:395-399(1982);KleczowskiおよびWierzchowski、Soil Sci.,49:193(19 40))。細菌タンパク質は均一に精製され(Chambertら、Eur.J.Biochem.41:285-30 0(1974))、そして結晶化された(Berthouら、J.Mol.Biol.,82:111-13(1974))。精製された細菌ＦＴＦ活性の徹底的な研究により、ポリマーは唯一の基質であるスクロースに作用する単一タンパク質により合成される、という知見が導かれた。このフルクトース鎖は、フルクトースが供与体スクロースから受容体フルクタンポリマーに繰り返し転移されることにより成長する。合成はコーファクターまたはプライマーの必要性とは無関係であることが証明された。精製されたタンパク質は同定され、そしていくつかの種に由来する細菌ＦＴＦ遺伝子がクローン化できた(Fouet,A.Arnaud,M. Klier,A.およびRapoport,G.Biochem.Biophys.Res.Commun.119:795-800(1984);Sh iroza,T.およびkuramitsu H.K.,J.Bacteriol.170,810-816(1988);Tang,L.B.,Len stra,R.Borchert,T.V.およびNagarajan,V.Gene 96,89-93(1990))。クローン化遺伝子および部位特異的突然変異誘発法は、結合領域、動力学および中間体タンパク質−糖複合体に関するさらなる情報を提供した(Chambert,R.,およびPetit-Gla tron,M.F.,Biochem.J.,279,35-41(1991))。微生物フルクタンの生合成はよく解明されており、遺伝子工学を通して植物中のフルクタン蓄積の調節を可能にする。クローン化した細菌遺伝子は、フルクタン含有作物種を変えるための好機を与え、または自然には通常見いだされない、トランスジェニック農作物中にフルクタンを蓄積させる好機を与える。しかし唯一の基質としてスクロースを使用するトランスジェニック植物において、成功裏の発現に対する多くの障害の可能性を考慮しなければならない。トランスジェニック植物中でスクロース代謝特性を持つ細菌遺伝子の発現は、高等植物の成長および発生において、スクロースの果たす重要な役割を考慮しなければならない。植物の非光合成組織中で生成する多くの化合物は、スクロースに由来する。スクロース濃度は遺伝子発現を調節することが示され(Visserら、Plant Mol.Biol.,1 7:691-699(1991);Wentzlerら、Plant Mol.Biol.,12:41-50(1989))、そして光合成の速度を調節する役割が実証された(Stittら、Planta,183:40-50(1990);Krapp ら、The Plant J.,3:817-828(1993))。これらの役割は無視できず、またしてはならない。トランスジェニック植物中でスクロース濃度を変化させる能力をもつ遺伝子の無差別な発現は、組織の発生に対して最も必要で、かつ重大な結果を招くことができる重要な代謝物を、非光合成組織から奪うかもしれない。濃度変化は、細胞中のスクロースレベルと関連する遺伝子発現も変化させ、未知の、しかし確実に重大な陰性の結果を導く。高等植物中の特定の構造は、スクロースを転移、集積および濃縮するために存在する。それゆえにスクロースレベルは、植物中で、細胞内オルガネラで、そして種間でかなり変化する。スクロースが、正味の炭素輸出組織（供給源：source ）から正味の炭素輸入組織(深部:sink)へ輸送される炭水化物の主要な状態であるが、多くの植物はスクロースの別な形態（例えばラフィノース）または別の炭水化物と一緒に（例えばマンニトールまたはソルビトール）輸送する。調節シグナルおよび亜細胞発現配列は変化させずに、様々な植物種の群の全域でスクロース代謝酵素を成功裏に発現させることは高度に異なる。発現には、スクロースを輸送し、そして濃縮するために存在する多くの機構、高等植物に存在するスクロースの変更形、および様々な植物組織中でスクロースが果たす重要な役割だけは考慮しなければならない。トランスジェニック植物中の細菌フルクタンの蓄積は、植物フルクタンに優る幾つかの利点を提供する。フルクタンの大きさは、植物と細菌起源に由来するフルクタン間の最も注目すべき差異である。植物ポリマーは、分子あたり平均１０ −３０フルクトース単位の低分子量である。対照的に、細菌フルクタンは最高１０⁶−１０⁸の分子量を有する１００，０００フルクトース残基を越えて含むことができる。本発明の内容においては、フルクタンの大きさが増すと、ポリマーが大きいほど、グルコースに対するフルクトースの比が大きくなり、そして加水分解に続いて混入グルコースを除去するために必要な精製が減るので、利点が大きい。大きさが増すと、より大きな細菌フルクタンはより小さい植物ポリマーよりも水溶性が低くなるので有利でもある。可溶性の差異は組織を加工する時に有利となる。高度に溶解性の細胞物質（スクロース、グルコースおよび他の糖のような）からフルクタンを分離することは、単離されるポリマーがより大きいならば、技術的にはより簡単であろう。大きなフルクタンも、同量のより小さいポリマー中のフルクトースと比較して、内部浸透圧を変化させることなく、細胞中により多くのフルクトースを保存するための好機を提供する。深部組織での浸透圧の変化は炭素を輸送するために重大であるので、この利点はすべての中で最も意味がある。トランスジェニック植物中でのフルクタンの蓄積は、現在のフルクトース甘味料技術に変わる魅力ある選択肢でありうる。特に、トウモロコシでその通りであり、フルクトースポリマーはスクロース作物で得られた利点を変えないだろうし、その代わりにその利点に基づいている。トウモロコシでのフルクタン生産は例えば、グルコースをフルクトースに転換する莫大な費用の削減に加えて、トウモロコシ副産物（油、ミールおよびグルテン飼料）の利用が可能になる。フルクタンを個々のフルクトース残基に加水分解することにより、少なくとも９９％フルクトースからなる生成物を生じる。この高純度生成物は、効率の悪い異性加工程の代替を提供し、そしてイオン交換クロマトグラフィーによるフルクトース濃縮の必要性を排除する。フルクトースの結晶化は９９％（＋）フルクトースから成る材料で開始することにより、単純化する。生産コストを下げることは、甘味料産業において重要であるばかりでなく、入手容易性、純度および競合的な価格に左右される化学的供給原料としてのフルクトースの使用にとっても重要である。現在、フルクトース産業は純度という需要にのみ見合うことができる。米国は最大のフルクトースシロップ生産国であるが、最終的なフルクトースの輸入国でもある。現在消費している食料は、生産しているより多くのフルクトースを消費する。競合的な価格での利用性は、フルクトースを５−ヒドロキシメチル−フルフラル（ＨＭＦ）に容易に脱水し、現在最もよく販売されている抗潰瘍剤であるRanitidineまたはZantac（商標）のような医薬品のための構築単位として使用できるようにする。ＨＭＦはまた、フラン核の特別な光学的効果による光電子工学デバイスに使用することができる可能性に加えて、Kevlar(商標)およびNomex(商標)のようなポリマーの出発材料としても使用できる(Schiweckら、有機原料としての炭水化物(Carbohydrates as Organic R aw Materials)中で、Lichtenthaler編集、ＶＣＨ出版、ＮＹ、第72-82頁(1992)) 。ＨＭＦは炭素環式および複素環式化合物に転換されることができ、もしその純度が生産の増大およびコストの減少と結び付つくことができるだけで、応用化学のほとんど全分野で役割を果たす。飼料中に非常低レベルのフルクタンを添加すると、単胃動物において、幾つかの陽性の代謝的および生理的変化をもたらすことが、最近示された(ハシモトら、米国特許第4、734、402号明細書(1988);ナカムラら、米国特許第4,788,065号明細書(1988);Farnworthら、イヌリンおよびイヌリン含有作物(Inulin and Inul in Containing Crops)、Fuchs編集、エルスビアー、アムステルダム、第385-389 頁(1993))。飼料中のフルクタンの共生効果は、腸内の有益なミクロフローラ群の増大が原因であろう。供給源の実例が減少し、そして飼料効率が上昇することは、飼育動物生産にとって明らかに潜在的な利点を有する。穀粒中のフルクタンの蓄積は、共生として価値だけでなく、飼料を挽いたり、混合するために必要な高価な装置を必要とする事なく、”農場で”使用できるようになるという利点でもある。ＦＴＦでの植物の形質転換では、そうしなければ従来の育種を通して可能ではないが、特別な栽培地域に適合した近交系または精粋系の利点を取り入れる遺伝子導入を生じる。細菌ＦＴＦ遺伝子での形質転換は、トウモロコシの場合において、油、グルテン飼料およびミールのような確立された副産物の損失無く、価値あるポリマー源の継続し得る供給源を生じるだろう。トランスジェニック体もまた、ポリマーを分解する能力をもたない植物中にフルクタンの蓄積という利点を提供する。これは環境的な変化が、キクイモおよびチコリーのような植物中に見られるポリマーの質および量を変化させないことを意味している。トランスジェニック組織は分解に対してあまり配慮せずに保存できる。特殊化されていない容器中での長期の保存は、現在のフルクタン作物からの収穫および単離に付随する経費および技術的必要性を減らす、または排除するだろう。本発明に記載された方法は、フルクトースポリマーならびにグルコースのポリマーの商業的生産規模を可能にするだろう。ＦＴＦは、スクロースを唯一の基質として使用して炭水化物を重合する能力を有するスクラーゼとして知られているタンパク質と同様の群に属する。このタンパク質のスクラーゼ族は、例えばタンパク質は触媒的に単量体で活性であり、コファクターまたはプライマーは合成に必要ではない、というような多くの点で類似する。このタンパク質族は、この群内の驚くべき類似性に基づき、トランスジェニック植物中でキメラＦＴＦが機能するように機能すると予想される。最終生成物は、ＦＴＦにより触媒される時、重合化フルクトースを含むことができるが、グルコースもまた、グルコシルトランスフェラーゼ（ＧＴＦ）として知られているスクラーゼにより重合することができる。ＧＴＦは、供給源ならびに機能においてさまざまであり、したがって触媒されたポリマーも様々である。多くのＧＴＦ（すなわち、オルタナンスクラーゼＧＴＦ−１、ＧＴＦ−ＳおよびＧＴＦ−Ｓ１）(Cote，Carbo.Polym.19:249-252(1992);Giffardら、J．Gen.Micro. ,139:1511-1522(1993))が同定され、各々がわずかに異なるポリマーの形成を触媒する。このポリマーは大きさ、結合の種類または結合のパターンが可変である。澱粉でまさにそのとおりであるように、グルコースポリマーも大きさ、結合の種類または結合のパターンの差異が特性を決定し、これはその商業的使用に影響する。特定のデキストランスクラーゼのようなＧＴＦは、独特の結合を通してグルコースを重合し、澱粉とは大変異なる特性を生じることができる。ＧＴＦは現在、研究および血漿の容積増量剤としての高付加価値のために、グルコースポリマー、デキストランを生成するために使用される。これら別のポリマーの大規模生産は、フルクタンについて記載されたものと大変よく似ているオプションを提供し、それには独特なポリマーの継続可能な供給源の提供、一定の市場でポリマーの生産コストの減少、ならびに経費的に効率的な使用を通して、新たな市場の開拓を含む。国際公開第89/12386号明細書は、トランスジェニックトマト植物中でグルコースおよびフルクトースポリマーの生産法を記載している。この特許出願の開示は、機能を付与することができない細胞質ゾル中の暴露を説明し、さらに形質転換細胞の破壊を生じることを説明している。国際特許出願公開第89/123 86号明細書は、液胞中への挿入を教示していない。本発明は、通常はポリマーが存在しない、そしていったん蓄積したポリマーの質を加水分解または変化させる能力がない植物種であるトランスジェニック植物中で、フルクトースポリマーの合成および蓄積に必要な方法および材料を詳述する。トランスジェニック植物中のフルクトースポリマーの蓄積は、コファクターおよび外部から供給されるプライマーを必要とすることない、スクロースを唯一の基質として使用して、細菌のフルクトシルトランスフェラーゼ（ＦＴＦ）遺伝子の組織特異的および亜細胞性の発現を通して達成された。特別な注意が、特定の細胞中スクロースレベル、ＦＴＦ発現の時期、植物種中の組織特異的発現および発現の亜細胞的場所について払われる。本発明の成功に極めて重要であるこれらの事柄は、これまでに公開されたものには特に記載または考慮されたことはなかった。本発明は組織特異的プロモーター、液胞標的配列、細菌ＦＴＦのコード配列の独特な組み合わせを記載し、そしてＤＮＡ断片をタバコ、ジャガイモおよびトウモロコシ中に転移するための方法を記載する。この結果はフルクトースポリマーの製造および蓄積法であり、これはスクラーゼ族の酵素内のタンパク質により合成される他のポリマーにも応用できる。記載された方法は、テンサイおよびサトウキビのような、有意なスクロース量を蓄積する別の農作物に使用できる。さらにチコリーまたはキクイモのようなフルクタン含有作物は、本発明に記載された方法により改良されることができる。この技術の効果は、甘味料として使用され、ヒトの健康に有益な特性を持つポリマーである独特のポリマー、特にフルクタン(ヒダカおよびヒラヤマ、Biochem.Soc.Trans.,19:561-565(1991))、動物飼料産業における共生物(ハシモトら、米国特許第4,734,402号明細書(1988);ナカムラら、米国特許第4 ,788,065号明細書(1988))をコストを下げて大規模生産する方法であり、そしてこの技術の効果は、そうしなければ経済的に成功しない新しい市場において化学的飼料原料として使用できる(Fuchs,Starke,39:335-342,(1981);Fuchs,Biochem. Soc.Trans.,19:555-560,(1991))。フルクタンの蓄積はトランスジェニック植物の成長、発生または再生能力に有害ではないことが示された。発明の要約本発明は、組換えＤＮＡ構築物がトウモロコシ、ジャガイモおよびタバコから成る群から選択された植物細胞を形質転換し、該植物細胞に悪い影響を及ぼす事なく該植物細胞中の液胞にフルクタンの生成を得ることができるように、レバンスクラーゼ遺伝子をコードする配列に操作可能に連結された液胞標的配列に操作可能に連結された組織特異的プロモーターを含んで成る組換えＤＮＡ構築物に関する。本発明はまた、該植物細胞の液胞中に蓄積するフルクタンを生産するように、上記構築物で形質転換されたトウモロコシ、ジャガイモおよびタバコから成る群から選択された植物に関する。さらに本発明は、上記の植物を栽培し、該植物を収穫し、そして収穫した植物から上記フルクタンを抽出することを含んで成る、フルクトースの製造法に関する。本発明は、さらに組換えＤＮＡ構築物がトウモロコシ、ジャガイモおよびタバコから成る群から選択された植物細胞を形質転換し、該植物細胞に悪い影響を及ぼす事なく該植物細胞中の液胞にデキストランの生成を得ることができるように、デキストラン−スクラーゼ遺伝子をコードする配列に操作可能に連結された液胞標的配列に操作可能に連結された組織特異的プロモーターを含んで成る組換えＤＮＡ構築物に関する。本発明はまた、植物細胞の液胞中に蓄積するデキストランを生産するように、上記構築物で形質転換されたトウモロコシ、ジャガイモおよびタバコから成る群から選択された植物に関する。さらに本発明は、上記記載の植物を栽培し、該植物を収穫し、そして収穫した植物から上記デキストランを抽出することを含んで成る、デキストランの製造法に関する。本発明はさらに、組換えＤＮＡ構築物がトウモロコシ、ジャガイモおよびタバコから成る群から選択された植物細胞を形質転換し、該植物細胞に悪い影響を及ぼす事なく該植物細胞中の液胞にオルタナンの生成を得ることができるように、オルタナンスクラーゼを遺伝子をコードする配列に操作可能に連結された液胞標的配列に操作可能に連結された組織特異的プロモーターを含んで成る組換えＤＮＡ構築物に関する。本発明はまた、植物細胞の液胞中に蓄積するオルタナンを生産するように、上記構築物で形質転換されたトウモロコシ、ジャガイモおよびタバコから成る群から選択された植物に関する。さらに本発明は、上記植物を栽培し、該植物を収穫し、そして収穫した植物から上記オルタナンを抽出することを含んで成る、オルタナンの製造法に関する。定義本開示内容では、多くの用語を使用する。本明細書で使用する場合、“プロモーター”および“プロモーター領域”という用語は、通常構造遺伝子のコーディング配列の５’上流のＤＮＡ配列を言い、これは正しい部位で転写が開始するために必要なＲＮＡポリメラーゼおよび／または他の因子のための認識を提供することにより、コーディング領域の発現を制御する。プロモーター配列は必要であるが、遺伝子の発現を駆動するためにいつも十分なわけではない。“プロモーター断片”とは、プロモーター領域のＤＮＡ配列の画分を構成する。“３’下流領域”（または“３’末端”）とは、ＤＮＡセグメントを含んで成る遺伝子の一部を言い、転写の開始そして遺伝子の構造部分（これはポリアデニレーションシグナルおよびメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）プロセッシングおよび遺伝子発現に影響することができる他の任意の調節シグナルを含む）を駆動する５’配列を排外する。ポリアデニレーションシグナルは通常、もしｍＲＮＡ前駆体であれば３’末端にポリアデニル酸尾の付加を行うのが特徴である。ポリアデニレーションシグナルは、標準形５’−ＡＡＴＡＡ−３’の相同物の存在により、共通して認識されるが、変異体は稀ではない。 “核酸”とは、一本または二本鎖であることができる巨大分子を言い、糖、リン酸およびプリンまたはピリミジンのいずれかを含むモノマー（ヌクレオチド）から成る。高等植物では、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）は遺伝物質であるが、リボ核酸（ＲＮＡ）はＤＮＡからタンパク質への情報の翻訳に関与している。“ヌクレオチド配列”という用語は、ＤＮＡまたはＲＮＡのポリマーを言い、これは一本または二本鎖であることができ、場合によってはＤＮＡまたはＲＮＡポリマー中に取り込まれ得る合成、非−天然または変化したヌクレオチド塩基を含む。 “ＲＮＡ転写物”とは、ＲＮＡポリメラーゼが触媒したＤＮＡ配列の転写から生じる生成物を言う。ＲＮＡ転写物はＤＮＡ配列の完全な相補的コピーであることができ、そして一次転写産物と呼ばれるか、または一次転写産物の転写後プロセッシングに由来するＲＮＡ配列であってもよく、そしてそれを成熟ＲＮＡと呼ぶ。本明細書で使用する“遺伝子”とは、特別なタンパク質をコードするＤＮＡ配列を言う。“天然”遺伝子とは、天然に見いだされるような遺伝子を言う。“キメラ”遺伝子とは、ヘテロロガスな調節および／またはコーディング配列を含んで成る遺伝子を言う。“突然変異”遺伝子とは、天然に通常見いだされるものとは異なるヌクレオチド配列中の変化を有する遺伝子を言う。それらは意図的、または偶発的であってよく、そして活性の変化を生じるが、遺伝子産物を変化させる必要はない。本明細書にて使用する“適当な(suitable)”または“適切な(appropriate)” 調節配列とは、選択した遺伝子産物のためのＤＮＡ配列の（５’）上流、その中、および／または（３’）下流に位置するヌクレオチド配列を言い、その転写および発現は、あるいは細胞のタンパク質生合成装置と関連する可能性がある調節配列により制御される。“調節”または“調節する”とは、遺伝子の転写開始の（５’）上流に主に位置する（しかし排他的ではない）ＤＮＡ配列要素により誘導される、遺伝子発現のモジュレーション(modulation)を言う。調節は刺激に対してすべてするか、または全く反応しなくてもよく、あるいは遺伝子発現レベルに変化を生じてもよい。“構成的発現”とは、それ自体を調節するために必要である刺激以外の変化にかかわらず、連続的な発現を言う。本明細書で使用する“応答性”または“応答する”とは、環境的刺激の適用後の、調節プロモーターまたは遺伝子の発現レベルの変化を言う。 “コーディング配列”という用語は、タンパク質、ポリペプチドまたはその一部をコードする遺伝子の部分を言い、そして転写の開始を駆動する調節配列を除外する。コーディング配列は、細胞中に通常見いだされるものであってよく、あるいは通常は細胞位置に見いだされないものであってもよく、その場合は“ヘテロロガス遺伝子”と呼ばれる。ヘテロロガス遺伝子は、細菌ゲノムまたはエピソーム、真核細胞核またはプラスミドＤＮＡ、ｃＤＮＡまたは化学的に合成されたＤＮＡを含む、当該技術に周知の任意の起源からの全部または一部に由来することができる。構造遺伝子は、非分断コーディング領域を構成することができ、あるいは適当なスプライス連結部により結合した１つ以上のイントロンを含むことができる。構成遺伝子は天然に生じる、または合成の様々な起源に由来するセグメントから成ることができる。 “組換えＤＮＡ構築物”または単に“構築物”とは、任意の起源のプラスミド、ウイルス、または自律的に複製する配列、ファージまたはヌクレオチド配列、直線状または環状の一本鎖または二本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡを言い、その中の多くのヌクレオチド配列は、プロモーター断片および選択した遺伝子産物のＤＮＡ配列を、適当な３’非翻訳配列と一緒に植物細胞に導入することができる独特の構造中に連結または組込まれる。本明細書に使用する“植物”とは、全植物および植物に由来する組織を言う。 “植物に由来する組織”とは、植物の分化した、または未分化の組織を言い、制限するわけではないが、根、苗条、葉、花粉、胚珠、塊茎、種子ならびに完全な細胞、プロトプラスト、胚およびカルス組織のような培養中の様々な状態を含む。植物−由来組織は、in plantaまたはin organ、tissueまたはcell cultureであってよい。“単子葉植物”は種子が唯一の子葉を有する植物、または食料を保存および吸収する胚の器官を言う。 “双子葉植物”とは、種子が２枚の子葉を有する植物を言う。本明細書で使用する“形質転換”とは、それにより細胞、組織または植物が、細胞、組織または植物に転移された核酸分子がコードする特性を獲得することを言う。“転移する” とは、制限するわけではないが、マイクロインジェクション、様々な物理的（例えばエレクトロポレーション）または化学的（例えばポリエチレングリコール、ＰＥＧ）処理で細胞膜を透過することを含む、ＤＮＡを細胞に移す方法を言う。 “操作可能に連結された”とは、融合が正しい読み取り枠を保護または作成するか、あるいは植物組織中に形質転換された時、ＤＮＡ配列の発現の正しい調節を可能にするように、２つ以上のＤＮＡ断片の正しい方向の化学的融合を言う。本明細書で使用する“発現”とは、遺伝子産物の配列をコードする遺伝子から遺伝子産物への転写および／または翻訳を意図する。発現において、遺伝子産物の配列をコードするＤＮＡ鎖は、始めに相補的ＲＮＡ（しばしばｍＲＮＡである）に転写され、そして次にこのようにして転写されたｍＲＮＡは、もし遺伝子産物がタンパク質であるならば、上記遺伝子産物に翻訳される。構成的で、かつ外部的に制御されたプロモーター断片によりさらに増強され、これにより多数のｍＲＮＡコピーおよび大量の選択遺伝子産物を生成する発現を、“過剰生産”と言う。“発現カセット”は、コーディング配列に操作可能に連結されたプロモーター領域を含むＤＮＡ構築物を言い、これは３’末端に操作可能に連結され、一緒にコーディング領域のｍＲＮＡを支配でき、植物組織中にタンパク質産物の合成を生じる。 “翻訳開始コドン”または“開始コドン”とは、タンパク質合成の開始を特定する核酸配列中の３つのヌクレオチド（コドン）単位を言う。 “シグナルペプチド”とは、ポリペプチドのＮ−末端の伸長物(extension)を言い、これはポリペプチドと連結して翻訳され、前駆体タンパク質を生成し、そしてこれは分泌経路中へ入るために必要である。シグナルペプチドは、同種内または非関連種植物のメカニズムにより認識されることができ、分泌経路へのペプチドの方向付けに必要である。このシグナルペプチドは植物の種子、葉、塊茎および他の組織で活性である。“シグナル配列”という用語は、シグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列を言う。“液胞標的シグナル”とは、ポリペプチドのＮ−末端の伸長物(extension)を言い、これはポリペプチドと連結して翻訳され、前駆体タンパク質を生成し、そしてこれは細胞の液胞へ最終的に入るために必要である。液胞標的シグナルは、同種内または非関連種植物のメカニズムにより認識されることができ、細胞の液胞へのペプチドの方向付けに必要である。液胞標的シグナルは植物の種子、葉、塊茎および他の組織で活性である。“液胞標的配列”という用語は、液胞標的シグナルをコードするヌクレオチド配列を言う。“液胞”とは大きさ、機能および内容物が可変である植物細胞の膜結合区分 (compartment)と考えられる。液胞は細胞代謝物を含むことができ、そして細胞中の多くの液胞は１つの細胞から別の細胞で、または１つの組織から隣の組織の細胞で大変異なることができる。 “組織特異的プロモーター”とは、ＲＮＡポリメラーゼおよび／または転写が始まるのに必要な他の因子に関する認識シグナルを提供するＤＮＡ配列を言い、特定の組織内またはその組織の特定の細胞内で、正しくコーディング配列の発現を制御する。組織特異的様式における発現は、個々の組織内のみ、あるいは組織または組織の組み合わせ内の細胞中であってよい。制限するわけではないが、例として、葉中の組織特異的発現のみで植物内の他の組織には無いか、あるいは花弁、胚珠およびオシベ中で植物の他の組織には無い、ということを含むことができる。“遺伝性の”とは、植物が発生して有性的に、または無性的に成熟する能力を言い、完全な、または一部の遺伝的内容を子孫に伝えることができる種子または他の手段を生成することを言う。子孫の遺伝的内容は、親の植物に類似する、または同一の特性または特質を持つ、新しい植物の成長および発生の原因である。 “レバンスクラーゼ”とは、スクロースを唯一の基質として使用して反復フルクトース残基から成る炭水化物ポリマーを合成する性質を有する、数種の生物の任意の１にコードされたタンパク質を言う。反復フルクトース残基は、β２−１結合またはβ２−６結合により、あるいはこのを２つの種類の結合の任意の組み合わせにより結合することができる。このタンパク質はまた、“フルクトシルトランスフェラーゼ（ＦＴＦ）“またはＦＴＦ活性を有するタンパク質としても知られている。反復フルクトース残基のポリマーは、スクロース分子に由来する１つの末端グルコースを含んでもよく、そして少なくとも２つのフルクトース残基を含むことができる。任意の結合の組み合わせおよび任意の数のフルクトース残基を持つ、任意の形の反復フルクトース残基のポリマーを、一般的にフルクタンと呼ぶ。“レバンスクラーゼ遺伝子”とはレバンスクラーゼタンパク質をコードするＤＮＡ配列を言う。 “デキストランスクラーゼ”とは、排他的にα１−６結合またはα１−３結合により、あるいはこのα１−６結合およびα１−３結合の任意の組み合わせのいずれかにより、結合している反復グルコース残基から成る炭水化物ポリマーの重合を触媒する性質を有する、数種の生物の任意の１にコードされたタンパク質を言う。このタンパク質はまた、“グルコシルトランスフェラーゼ（ＧＴＦ）“またはＧＴＦ活性を有するタンパク質としても知られている。このポリマーは、少なくとも２つのグルコース残基を含んでもよく、そして“デキストトラン“と呼ばれる。“デキストランスクラーゼ遺伝子”とはデキストランスクラーゼタンパク質をコードするＤＮＡ配列を言う。別のα１−６結合およびα１−３結合を通して結合しているグルコース残基から成る、真のデキストランとは異なる“炭水化物ポリマー”は“オルタナン”と呼ばれる。オルタナンの合成を生じる反応を触媒する能力を有するタンパク質生成物を“オルタナンスクラーゼ”と呼ぶ。“オルタナンスクラーゼ遺伝子”とはオルタナンスクラーゼタンパク質をコードするＤＮＡ配列を言う。本明細書で使用する“有害な（または悪い）影響”という用語は、フルクタンの蓄積の結果として、植物または植物細胞に対する直接的または間接的な有害効果を言い、それは植物または植物細胞が特定の機能を達成できなくする。制限するわけではないが、そのような機能には細胞および全植物体内での炭水化物の合成および輸送、トランスジェニック植物または組織の再生、植物または植物細胞が成熟するまでの発育、あるいは子孫に所望の特質を伝える能力が含まれる。 ”選択的発現”とは、植物の特別な器官中で、ほとんど排他的な発現を言い、制限するわけではないが、葉、塊茎または種子を含む。この用語はまた、器官の特別な発生段階での発現をも言い、例えば胚発生の初期または後期などである。さらに、“選択的発現“とは、細胞内の特別な亜細胞中の場所（細胞質ゾルまたは液胞）での発現を言うこともできる。 “自然なスクロースレベルよりも高い”という用語は、同種の野生型植物細胞中に見いだされる自然の範囲よりも、増大したスクロース含量を含む細胞を言う。高いスクロース含量は、細胞発生の任意の段階で起こることができ、細胞中の遺伝子（１つまたは複数）の自然な突然変異またはトランスジェニック操作の結果である。増大したスクロースは、細胞内、または特別な亜細胞区分に蓄積できる。制限するわけではないが、自然のスクロース濃度より高いスクロースを含む植物の例には、天然または“デント（dent）”コーンと比較して、標準的な甘さ、または極めて甘い系の胚乳を含む。“デンド”コーンとして知られているメイズ系のスクロース濃度は、受粉から１５−１８日後に最大レベルに達し、そして仁の乾燥重量の最高４−８％を蓄積する。スクロース濃度は、成熟したデント種子の乾燥重量の０．５−１．５％の最終濃度に落ちる。制限するわけではないが、高いスクロース系には標準的なスィートコーン（ｓｕ）および極度に甘い変種（ｓｈ２、ｂｔ２、ｓｕ／ｓｅなど）を含む。標準的な甘さの変種中のスクロース含量は、発生の同時期でデントのレベルの２倍に達する。極度に甘い系は、成熟した同時期でデントコーンと比較して、３−４倍のスクロースレベルを含む。本発明を通じて使用するＤＮＡ組換えの技術は、当業者には周知であり、一般的にManiatisら、モレキュラークローニング（Molecular Clon ing）：アラボラトリーマニュアル（A Laboratory Manual）、コールドスプリングハーバーラボラトリー(Cold Spring Harbor Laboratory)、コールドスプリングハーバー、NY(1982)に記載されている。ＤＮＡの酵素処理使用した制限酵素消化用緩衝液および消化条件は、各特定の酵素の製造元により供給された条件であった。酵素をＤＮＡ１マイクログラムあたり５−１０単位になるように加え、そして反応混合物を適切な最終容量に水で調整した。適切な温度での反応混合物のインキューベーションは、約２時間であった。ＤＮＡのライゲーションは、Maniatisら、モレキュラークローニング；アラボラトリーマニュアル、コールドスプリングハーバーラボラトリー、コールドスプリングハーバー、NY(1982)に記載されているように提案されたベクターおよび挿入物の量で行った。ＤＮＡライゲーションの反応条件は、T4 DNA リガーゼの製造元(ベセスダリサーチラボラトリーズ:Bethesda Research Laboratory、ゲチスバーグ、メリーランド州)により記載された条件であった。ＤＮＡのゲル電気泳動ＤＮＡのアガロースゲル電気泳動は、Tris-ホウ酸-EDTA(TBE)緩衝液(89mM Tri s、89mM ホウ酸(pH8.3)および2.5mM EDTAから成る)使用して0.7％アガロースゲルで行った。電気泳動はレーンあたりのＤＮＡ量に応じて50から150ボルトで、所望の泳動時間で行った。電気泳動後、ゲルを1ug/mlのエチジウムブロミドで染色し、そしてＤＮＡを紫外線トランスイルミネーターで視覚化した。BIO-101から購入したGene Clean kitに添付されている方法および材料を使用して、ＤＮＡをゲルから回収した。プラスミドの単離および精製形質転換したプラスミドを含む大腸菌細胞（HB101凍結コンピテント細胞、ＢＲＬから購入）を、37℃で500mlのLB培地(10gのバクトトリプトン、5gの酵母エキスおよび10gの塩化ナトリウム、100ug/mlのアンピシリンを含有する)中で一晩成長させた。プラスミドの単離および精製法は、プロメガMaxi-Prep DNA精製システムを使用して、製造元による記載に従った。配列表に関する簡単な説明本発明は、本出願の一部である以下の詳細な配列に関する記載により、より完全に理解できる。配列の記載は引用により本明細書に編入された37C.F.R.1.822 の定義に定められるように、アミノ酸について1つの文字コードを含むことができる。配列番号１はバチルスアミロリグイファシエンス（Bacillus amyloliguifac iens ）ＳａｃＢＦＴＦ遺伝子の部分的なヌクレオチド配列である。この３１ｂｐ配列は原核シグナル開裂部位の領域に及ぶ。配列番号１は、ヌクレオチド１３で始まるＤＮＡ制限酵素EcoRVのための配列認識部位を含むように改変している。ＤＮＡの部位-直接的突然変異誘発法に使用するために設計したので、このヌクレオチド配列は独特のEcoRV部位を開裂シグナルの３’側の１コドンに付加する。配列番号２はタバコＳＳＵプロモーター領域の部分的ヌクレオチド配列である。この２１ｂｐヌクレオチドはプロモーター領域中の独特のBglII部位の５’であり、ＰＣＲ法によるプロモーター領域の部分のサブクローニングにおいて、５ ’−３’プライマーとして有用である。配列番号３はタバコＳＳＵプロモーター領域の部分的ヌクレオチド配列である。この配列はＳＳＵプロモーター領域の３’−５’相補鎖であり、ＤＮＡ制限酵素EcoRVおよびNcol(それぞれヌクレオチド７および１２から始まる)のための配列認識部位を含むように改変されている。この３２ｂｐ配列中のNcoＩ部位のＡＴＧコドンは、天然のSSU遺伝子のための開始コドンである。このオリゴヌクレオチド配列は、ＰＣＲ反応で配列番号２として掲げられたプライマーと組み合わせて使用した時、ＳＳＵプロモーターの一部をサブクローニングするために設計する。配列番号４はバチルスアミロリグイファシエンス（Bacillus amyloliguifac iens ）ＳａｃＢＦＴＦ遺伝子の部分的なＤＮＡ配列である。この２１ｂｐヌクレオチド配列は、原核開裂シグナルの３’側の３１ｂｐＳａｃＢ遺伝子に対応し、そしてゲノムＤＮＡ中に組み込まれたＳａｃＢ遺伝子（１つまたは複数）の存在を検出するためのＰＣＲプライマーとして有用である。配列番号５はバチルスアミロリグイファシエンス（Bacillus amyloliguifac iens ）ＳａｃＢＦＴＦ遺伝子の部分的なＤＮＡ配列である。この配列は従来のＳａｃＢＤＮＡ配列の３’−５’相補鎖である。この２３ｂｐ配列のヌクレオチド１から始まるのは、ＤＮＡ制限酵素SalＩのための認識部位である。天然のＳａｃＢ配列はヌクレオチド６から始まる。このオリゴヌクレオチドは配列番号４でのＰＣＲ反応に使用するように設計する。配列番号６はスポラミン遺伝子（sporamin:サツマイモ貯蔵タンパク質）の部分的ＤＮＡ配列である。この１４２ｂｐ配列は、液胞標的シグナルのＮ−末端プレプロ−およびプロ−ペプチドを表す。この配列は開始コドンがヌクレオチド１４で始まるBspHI ＤＮＡ制限酵素部位内に含まれるように改変されている。SpeＩＤＮＡ制限酵素部位はヌクレオチド１からヌクレオチド６にコードされ、そして制限酵素NcoＩおよびXhoＩの認識部位は、それぞれヌクレオチド１３０−１３６および１３７−１４２に位置している。配列番号７はスポラミン遺伝子の部分的ＤＮＡ配列である。この配列は従来のＤＮＡ配列に比較すると３’−５’方向であり、そして配列番号６に完全に相補している。この１４２ｂｐのオリゴヌクレオチドは、配列番号６にアニールするために設計され、スポラミン液胞標的ＤＮＡ配列の合成ＤＮＡカセットを作成し、配列番号６の記載に掲げられている制限酵素認識部位を持つ。この酵素部位はサブクローニングの目的に有用である。配列番号８はサツマイモスポラミン液胞標的ペプチドのアミノ酸配列であり、配列番号６および配列番号７に掲げたオリゴヌクレオチドによりコードされている。プレプロ−ペプチドはアミノ酸１から始まり、そしてアミノ酸２１に続いている。このプロ−ペプチドはアミノ酸２２から３７により表されている。天然または外来タンパク質に操作可能に連結された完全なプレプロ−ペプチドは、そのタンパク質を植物細胞中の液胞に向けるだろう。配列番号９は大麦レクチン遺伝子の部分的なヌクレオチド配列である(Bednara kおよびRaikhel,The Plant Cell,3:1195-1206(1992);Dombrowskiら、The Plant Cell,5:587-596(1993))。この５６ｂｐ配列は、大麦レクチンのＣ−末端液胞標的配列に関するコーディング情報を含む。このＤＮＡ配列は、制限酵素HincIIおよびBglIIについての認識部位が、それぞれヌクレオチド４−９および５１−５６にコードされるように改変されている。配列番号１０は大麦レクチン遺伝子の部分的なヌクレオチド配列である。この配列の５６ヌクレオチドは、配列番号９と完全に相補的であり、２つのアニーリングにより、制限酵素で消化でき、続いて適当な発現ベクター中にサブクローニングできるＤＮＡ断片を作成できるようになっている。配列番号１１は大麦レクチン、Ｃ−末端、液胞標的ペプチドの１５アミノ酸配列である。このアミノ酸配列は、配列番号９および配列番号１０に掲げられたオリゴヌクレオチドによりコードされている。天然または外来タンパク質に操作可能に連結されたこのペプチドは、そのタンパク質がＥＲから植物細胞液胞に区分けする(sorting)ことを支配するだろう。配列番号１２は大麦レクチン遺伝子の部分的なＤＮＡ配列である(BednarakおよびRaikhel,The Plant Cell,3:1195-1206(1992);Dombrowskiら、The Plant Cel l,5:587-596(1993))。この３８ｂｐ配列は、大麦レクチン遺伝子のＮ−末端分泌シグナルを得るためのＰＣＲプライマーとして有用である。このプライマーはシグナル配列の５’末端にアニールし、そしてヌクレオチド７で始まる制限酵素Ec oRIの認識部位を含む。このEcoRI部位はサブクローニング工程に有用である。この配列はまた、ヌクレオチド１４−１９にBspHＩのための認識部位も含む。この部位はヌクレオチド１６−１８に位置する開始コドンで、枠内にＤＮＡ断片をサブクローニングするために有用である。配列番号１３は大麦レクチン遺伝子の部分的なＤＮＡ配列である。この３８ｂｐ配列は、大麦レクチン遺伝子のＮ−末端分泌シグナルのクローニング用のＰＣＲプライマーとして有用である。SalＩおよびNcoＩ制限酵素に関する認識配列は、それぞれヌクレオチド１−６および６−１１にコードされている。このＤＮＡ配列は、大麦レクチンＤＮＡに逆相補であり、配列番号１２に掲げたプライマーでＰＣＲ反応に使用するために設計する。配列番号１２および配列番号１３のプライマーを使用したＰＣＲ反応から回収したＤＮＡ断片は、天然、または操作可能に連結した外来タンパク質を植物細胞の分泌システム中へ向かわせるに十分である。配列番号１４は、ジャガイモ塊茎に特異的なパタチンタンパク質の部分的ＤＮＡ配列である。この２０ｂｐ配列は、開始コドンの５’のプロモーター領域1.0K bに相当する。配列番号１５は、ジャガイモ塊茎に特異的なパタチンタンパク質の部分的ＤＮＡ配列である。この２２ｂｐ配列はパタチンＤＮＡ配列に逆相補であり、配列番号１４に掲げたプライマーとＰＣＲ反応に含まれた時に、塊茎特異的遺伝子発現のための必要な調節配列を含む1.0Kb ＤＮＡ断片が得られる。この配列は、天然の開始コドン（ヌクレオチド１から６）を含むNcoＩ制限酵素のための部位を含む。配列番号１６は高硫黄ゼイン貯蔵タンパク質の部分的ＤＮＡ配列である(キリハラら、Gene,71:359-370(1988))。この２５ｂｐＤＮＡ配列は、ヌクレオチド２０から始まる制限酵素EcoRVの認識部位を含む。配列番号１７は高硫黄ゼイン貯蔵タンパク質の部分的ＤＮＡ配列である。この３０ｂｐ配列は、ヌクレオチド６から１１に位置する制限酵素XbaＩの認識部位を含む。制限部位EcoRVおよびXbaＩを使用して10Kdゼインプロモーター領域の一部およびコーディング配列を含む1.4kb ＤＮＡ断片が単離でき、そして適当なベクター中にサブクローニングできるように、配列番号１６および配列番号１７は一緒に使用するように設計されている。配列番号１８は高硫黄ゼイン貯蔵タンパク質の部分的ＤＮＡ配列である。この３０ｂｐＤＮＡ配列は、10Kdゼイン遺伝子の一部が得られるように、ＰＣＲ反応で使用するように設計されている。配列番号１９は高硫黄ゼイン貯蔵タンパク質の部分的ＤＮＡ配列である。この３２ｂｐのＤＮＡ配列は、ヌクレオチド６から１１に位置するBamHＩ制限酵素認識部位を含む。ゼイン遺伝子の一部を含む1.39KbのＤＮＡ断片が得られるように、配列番号１８および配列番号１９は１組のＰＣＲプライマーとして使用するように設計されている。このＤＮＡ断片は、平滑制限酵素部位およびBamHＩ部位を使用して、適切なベクター中にサブクローン化できる。配列番号２０は高硫黄ゼイン貯蔵タンパク質の部分的ＤＮＡ配列である。このＤＮＡは、１３ｂｐから成り、そして独特のSmaＩ制限酵素認識部位が１０Ｋｄゼイン遺伝子のコーディング領域に付加できるように、アダプターとして設計されている。このSmaＩ制限部位はこのＤＮＡ配列のヌクレオチド５から始まる。配列番号２１は高硫黄ゼイン貯蔵タンパク質の部分的ＤＮＡ配列である。このＤＮＡ配列の１３ｂｐｓは配列番号２０のＤＮＡ配列に一部相補的である。アニールしたこの２つのＤＮＡ配列は、独特のSmaＩ制限酵素認識部位を生成し、サブクローニングの目的に有用である。発明の詳細な説明本発明の主題は、適切な調節および標的配列を含む発現カセットで植物細胞を形質転換する方法を含み、成熟植物の種子または塊茎の液胞中にフラクタンの蓄積を生じる。この発現カセットはプロモーター領域を含む。好適なプロモーター領域は、組織特異的１０ｋＤゼインプロモーターおよび組織特異的パタチンプロモーター領域である。このプロモーター領域は、液胞標的配列およびフルクトースを重合できる酵素から成るキメラタンパク質のコーディング領域に機能的に連結されている。好適な液胞標的シグナルは、サツマイモ貯蔵タンパク質、スポラミンのＮＨ−末端から始まる最初の３０アミノ酸、ならびに大麦レクチンタンパク質を液胞区分に標的させるのに必要なＮ−末端およびＣ−末端配列に由来する。スポラミンまたは大麦レクチン液胞標的配列のいずれかは、タンパク質を小胞（ＥＲ）に向かわせるに十分であり、ＥＲ中で分類し、そしてゴルジ装置を介して液胞に移す。液胞標的配列は枠内でバチルスアミロリグイファシエンス(Bacillus amyloliguefaciens)ＦＴＦタンパク質の成熟コーディング領域と融合する。本発明の主題には、少なくとも１つの特許請求したカセットで形質転換した単子葉または双子葉植物を含み、好適な植物はトウモロコシまたはジャガイモである。植物に由来する種子または塊茎もまた特許請求する。また本発明の主題は、単子葉または双子葉植物中にフラクタンを蓄積する方法を含み、その方法は：（ａ）植物細胞を、液胞標的シグナルおよび適当な５’および３’種子または塊茎特異的転写調節配列に連結したバチルスアミロリグイファシエンス(Bacil lus amyloliguefaciens)ＦＴＦ遺伝子を含む記載されたカセットで植物細胞を形質転換させ；（ｂ）形質転換した植物細胞から、受精能力のある性的に成熟した植物を成長させ；そして（ｃ）これらの組織中に蓄積したフラクタンのために、工程（ｂ）の受精植物から子孫種子または塊茎を選択する、ことを含んで成る。本発明は組織特異的調節配列、液胞標的配列および細菌ＦＴＦコーディング配列を含んで成るキメラ遺伝子の組を記載する。このキメラ遺伝子は、トランスジェニック単子葉または双子葉植物中で発現した時、スクロースを基質として使用して、フルクトースポリマーを合成することができる。正しくFTF遺伝子を発現しているトランスジェニックトウモロコシ植物（ゼアメイズ：Zea mays)またはジャガイモ（ソラヌムツベロサム:Solanum tuberosum)またはタバコ(ニコチアナタバコム:Nicotiana tabacum)は、成熟種子、塊茎または葉中に蓄積するフラクタンの存在により、同種の遺伝的植物からそれら自体を識別することができる。本発明の核酸断片の植物中への転移は、収穫、輸送または保存中に植物デグラトリー(degratory)酵素によるポリマーの損失または変化無く、そして任意の特定種から確立された副産物の損失無く、この有用なポリマーの蓄積を生じるような様式で、タンパク質の発現を支配する。組織特異的調節配列、液胞標的配列および細菌ＦＴＦ遺伝子を含んで成るキメラ遺伝子を含んで成るトランスジェニック作物は、巨大分子量フルクトースポリマーの継続可能な供給源を提供するだろう。フラクタンの蓄積は、部分的には、（１）形質転換作物中のキメラ遺伝子の発現レベルにより測定される。発現レベルは部分的には組織特異的発現シグナル、植物ゲノム中に組み込まれた遺伝子のコピー数および遺伝子組み込みの位置に依存する。（２）フラクタンの蓄積はまた、利用できる基質量にも左右され得る。酵素に利用できる基質量は、種（種内の突然変異体を含む）、発現が起こる組織の種類、発現の亜細胞の位置に依存し、そして特定の植物の発生の段階に依存する。（３）導入されたタンパク質の安定性は、フラクタン蓄積にも影響を及ぼすことができ、そして一部はその適切なプロセッシング、細胞内標的およびその外部環境中で機能する能力に依存する。本発明の主な目的は、適当な組織特異的かつ細胞内局在化（例えば液胞）調節配列で細菌ＦＴＦ遺伝子を導入することを介してトランスジェニックゼアメイズ(Zea mays)種子、ソラヌムツベロサム(Solanum tuberosum)の塊茎、またはニコチアナタバコム(Nicotiana tabacum)の葉中にフラクタンを蓄積するために、光合成の結果として生成され、そして植物細胞の液胞中に保存された、スクロースを利用することである。ビー．アミロリグイファシエンス(B.amyloliguefaciens)ＦＴＦ遺伝子のような炭水化物代謝特性を持つ遺伝子の、トランスジェニック植物中での成功裏の発現には、以下の因子を考慮する必要がある：（１）形質転換する種、（２）発現が起こる特別な組織、（３）発現の時期、（４）および遺伝子発現の亜細胞の位置。これらすべての因子は、有害な効果を生じずに、フラクタンの生産がトランスジェニック細胞中で起こるようにするために、注意深く調整されなければならない。１つの特定のトランスジェニック種の中で、細菌ＦＴＦタンパク質のようなスクロース代謝活性を持つ遺伝子の発現は、別の種で発現した時に同じ所望する効果を生む必要はないだろう。炭水化物プロフィールが種間で異なることは、スクロースに特異的な酵素が様々な種で発現された時に、いつも同じ結果の生じるために十分な基質を利用できるわけではないことを示唆している。基質としてのスクロースの利用性は、種ごとで大きく変化するだけでなく、同種内の突然変異体でも変化する(Lampe,Bot,Gaz.,91:337-380(1931))。ほとんどの植物がスクロースを合成し、そして転流させるが、これは非光合成組織への炭素の移動に関して、すべての植物がこの方法に従うというのではない。例えば、多くの植物はアルジトールを合成し、そして転流させる。マンニトールはセロリー（アピウムグラベオレンズ:Apium graveolens）の葉中で合成され、そして篩部を介して転流し、ここでそれが葉柄中に貯蔵される(Rumphoら、Pla nt Phys.,73:869-873,(1983))。別の例はウリ科であり、ここでラフィノースサッカライドは、主要な輸送糖である（Hendrix,Plant Sci.Lett.,25:1-7,(1982); WebbおよびGorham,Plant Physiol.,39:663-672(1964))。したがって、細菌ＦＴＦにより生産されたフラクタン量は、別に存在する炭水化物レベル、ならびに種間で大きく異なるスクロースレベルにより影響をうけるだろう。深部組織でのスクロース輸送および蓄積の機構も、個々の種で大きく変化する。スクロース加水分解は、発生しているトウモロコシ種子中で輸入機構の必須部分である(Porterら、Plant Phys.,77:524-531,(1985))が、ダイズ種子(Thorne,P lant Phys.,70:953-958,(1982))または小麦内胚乳(Jenner,Aust.J.Plant Phys., 1:319-329,(1974))に輸送するために前以て必要ではないらしい。１つの種の種子中でＦＴＦの発現は、豊富なスクロースを入手できるタンパク質を生じることができるが、他の種の種子中のフラクタン合成は、優勢に存在しているヘキソース糖により妨害されるだろう。植物種が炭水化物プロフィールを蓄積するために果たす別の役割の有用な説明として、トマト果実またはジャガイモ塊茎のような深部組織に見いだされる糖の比較がある。栽培植物化されたトマト果実組織は、３つの別々のインベルターゼ酵素活性により、主にヘキソースを蓄積する。トマト果実の液胞に位置する可溶性酸インベルターゼ、および細胞壁に結合しているインベルターゼは、この組織全体にヘキソースが蓄積される主な原因である。細胞質ゾルのアルカリインベルターゼもトマトで記載された(Yelleら、Plant Phys.,95:1026-1035,(1991))。あるいは、塊茎を発生しているジャガイモの主な深部組織は、インベルターゼ活性を欠いている。スクロースはジャガイモ塊茎インタクト(intact)に輸送されるが、（トマト果実でもそうである）、塊茎中で加水分解はインベルターゼの不可逆的タンパク質阻害物質の発現により最小に維持される(Pressey,Arch.Biochem.Bi ophys.,113:667-674(1966))。塊茎細胞中でのスクロース加水分解は、細胞質ゾルスクロース代謝酵素の低活性によりさらに制限される。このために、多くのスクロースが液胞中に貯蔵され、澱粉合成について代謝されるまで加水分解されないままである(Oparkaら、Planta,182:113-117(1990))。 von Schaewenら(EMBO J.9:3033-3044,(1990))は、構成的な植物プロモーター、ＣａＭＶ３５Ｓプロモーターの支配下での酵母インベルターゼ遺伝子が、タバコ中で形質転換された時、トランスジェニックアラビドプシスサリアナ(Arab idopsis thaliana)中と比較して異なる表現型を生じることを報告した。タバコ中のインベルターゼ発現で使用したカセットも(von Schaewenら、EMBO 9:3033-3 044,(1990))、ジャガイモを形質転換するために使用された。トランスジェニックジャガイモの葉も、以前の例とは異なる反応を示し、恐らくこれはタバコとアラビドプシスで比較される深部能力の差異によるものだろう(Heinekeら、Plant Phys.100:300-308(1992)) 。供給源−深部の関係は、種間で異なることが知られているので、この関係の破壊は、キメラインベルターゼ遺伝子が発現する植物の種に依存する様々な効果を有するだろうと考えることは合理的である。もし植物の種がＦＴＦタンパク質の成功裏の発現に影響するならば、その種内の組織の種類もまた、フラクタンの生産に対してかなりの関連を有し、そして最終的にどのように植物がこのポリマーを蓄積するために応答するか、に対して関連性を有する。植物の成長および発生は、光合成中に二酸化炭素を炭水化物に固定することにより得られるエネルギーに決定的に依存している。高等植物では、葉およびある程度の幹が、光合成の主要部位を表している。対照的に、植物の他の部位（例えば、根、種子または塊茎）は炭水化物合成に有意な貢献をしていないが、むしろ光合成が活性な組織中で大きく二酸化炭素固定に依存している。したがって、正味の輸出物である組織（供給源）から固定化炭素の輸入物である組織（深部）へのエネルギーの流れがある。ほとんどの植物において、フォトアシミレイツ(photoassimilates)を供給源から深部組織に輸送するために、スクロースは好適な炭水化物である。多くの植物において、深部領域へスクロースを輸送することは能動輸送段階が関与する(Daie、Plant Mol.Biol.Rep.,7:106-115(198 9))。この輸送系はスクロースに特異的なので、ヘキソース糖は効率的には移動しないが、篩部の周辺の葉肉細胞により再吸収される(MaynardおよびLucas、Pla nt Phys. ,70:1436-1443(1982))。スクロースの加水分解は炭水化物の植物分布を妨害し、ほとんど輸入エネルギーに依存している組織に、深い陰性の影響を生じる。この深部−供給源の関係は、植物の発生に中心的であるばかりでなく、作物の収量にも決定的な役割を果たす(Turgeon,Ann,Rev.Plant.Physio.Plant Mol.Bio.40:119 -138(1989))。酵母インベルターゼ遺伝子を発現する有害効果の例は、（スクロースの加水分解）トランスジェニック植物中の供給源組織で報告された(Dickinsonら、Plant Physiol 95:420-425(1991);Dingら、The Plant J.,4:179-189(1993);Stittら、P lanta 183:40-50(1990);von Schaewenら、EMBO J.,9:3033-3044(1990))。アポプラスト中での酵母インベルターゼの発現は、深部−供給源の関係を妨害および特徴づけるために独自の好機を提供する。アポプラスト標的配列に融合したインベルターゼ遺伝子の供給源組織中での構成的発現は、ひどい発育阻害を導き、葉中の澱粉、グルコースおよびフルクトース蓄積を増大させ、光合成活性を減少させ、そしてトランスジェニックタバコ(von Schaewenら、EMBO,9:3033-3044(1990)) 、およびトマト(Dickinsonら、Plant Phys．95:420-425(1991))の根の発生を抑制した。ジャガイモでは酵母インベルターゼ遺伝子はスクロースを輸送を破壊し、水のストレスに大変類似した症状を導き、そして最終的に塊茎の収量が有意に減少した(Heinekeら、Plant Phys．100:300-308(1992))。各々の場合で、供給源組織中のスクロース加水分解酵素の発現により植物中の炭素輸送を妨害すると、深部組織の発生が制限されることが示され(Stittら、Planta,183:40-50(1990)) 、また、タバコの葉中のスクロース輸送を妨害すると、その組織中に炭水化物の蓄積が導かれ、これは次に光合成の下方制御を引き起こすことが示された。スクロース代謝タンパク質の発現時期は、植物発生中に起こるスクロースの濃度変化を考慮しなければならない。組織中のスクロースの重要性も時期を変える。例えば、深部の葉中のスクロースの役割は、供給源の葉のスクロースの役割とは全く異なる。成長を支持するために、スクロースは深部の葉で代謝される。しかし、葉が成熟する時、葉は正味のスクロース輸出物となる。葉の維持には重要ではないので、スクロースは液胞に一時的に貯蔵され、そして次に篩管を通って深部領域に輸送される。深部組織もまた発生中にスクロース濃度の変化を受ける。例えばスイートメロン(sweet melon)中のスクロース濃度は、果実が熟した時に変化する。ヘキソース糖は発生の初期に蓄積し、続いて後期にはスクロースレベルが高い(Schafferら、Phytochemistry,26:1883-1887(1987))。対照的に、スクロース含量はエンドウ種子中では発生し続ける中で劇的に減少する(HollおよびVose,Can.J．Plant Sci.,60:1109-1114(1980))。発生しているトウモロコシ胚乳中のスクロース濃度は、受粉後８−１２日に増加し、受粉後２８日には１０倍以上落ちる(Tsaiら、Plant Phys．46:299-306(1970))。ダイズ種子中のスクロース濃度は、ラフィノース糖が開花５３日後に劇的に増加している間、発生中に有意に変化する(Amuti,Phytochemistry,16:529-532,(1977))。発生中に炭水化物プロフィールが上記に掲げた例のように変化することは、変動するスクロールプールを利用するために、所望の組織中および時期に特異的な遺伝子発現用のプロモーター選択の重要性を説明する。インベルターゼまたはＦＴＦタンパク質のような、スクロース代謝酵素発現の亜細胞の位置も、トランスジェニック系に対して劇的な効果を有することができる。細胞質ゾル、液胞またはアポプラスト中の何れかで酵母インベルターゼを発現している植物は、発現の亜細胞位置に関して明らかな表現型の差異を示した。トランスジェニックタバコは、アポプラストに比べて細胞質ゾル中でのインベルターゼの発現に対してより感受性である。この結果はスクロース代謝酵素の細胞質ゾルでの発現が、スクロース合成を妨害することを示唆している(Sonnewaldら、The Plant Journal,1:95-106(1991))。酵母インベルターゼを葉の液胞中に発現するタバコで報告された表現型は、それほど劇的ではなく、葉の液胞中に一時的に貯蔵されたスクロースは細胞質ゾルプールに比べて、代謝的に活性が低いことを示唆している。細胞内の様々な細胞性区分間に分配しているフォトアシミレイトは、植物の成長および発生の中心的決定因子の１つである。トランスジェニック植物中の様々な区分中にスクロース代謝酵素を発現させることにより得られた結果は、植物の成長および発生において、スクロースの区画化およびタンパク質の標的化の重要性を明らかに示している。異なる細胞性区分中のスクロースの多様化した役割を反映することができる表現型の差異は、Sonnewaldらにより言及される(J.Exp.Bo t.,44:293-296(1993))。この研究はまた、細胞質ゾル、アポプラストまたは液胞中のいずれかに、酵母由来のインベルターゼを発現しているトランスジェニック植物に発生する表現型および生化学的差異も示している。この差異はインベルターゼが発現している区分で異なる。タバコ中の細胞質ゾルで発現したインベルターゼは、厚く曲がった葉を生じ、これは恐らく葉の下部よりも上部表面がより急速に広がることによるものであろう。今、液胞またはアポプラストを標的とする同じプロモーターおよび遺伝子は、古い葉のみが漂白され、そして壊死性領域が発生する症状を示した。表現型の差異に加えて、液胞を標的とした若葉は、注目すべき症状を示さず、しかし光合成はわずかに野生型対照よりも高かった。細胞質ゾルを標的としたインベルターゼ植物中の光合成は、対照で見いだされる割合よりも低くなることが測定された。トランスジェニック植物は、細胞壁発現インベルターゼに比べて細胞質ゾルでのインベルターゼに大変感受性である。供給源細胞中の細胞質ゾルインベルターゼは、直接スクロース合成を妨害し、一方アポプラストのインベルターゼはスクロース輸送を妨げる。液胞中のインベルターゼ発現は、最後のスクロース輸送も妨害することができ、そして葉の液胞と細胞質ゾルの間のスクロース交換が大変高いことを示している。植物全体の炭素転流における役割から、スクロースはほとんどの組織および多くの亜細胞性区分で見いだされる。様々な位置でスクロースが果たす役割は、いつも同一ではない。区画化は、輸送前に代謝酵素からスクロースを隔離する役割を果たし、これはスクロースの一時的な保存部位として役立つことができるが、需要は限られているか、またはサトウキビまたはテンサイのような特定の種中の長期保存がある。明らかに、発現の発生的時期を重んじず、そして亜細胞の位置を考慮しない、任意の植物種、植物内の任意の組織中の、細菌ＦＴＦのような形質転換されたスクロース代謝タンパク質の効率に関する一般的な記載は、大ざっぱで不正確である。トマトで実証されたような、構成的プロモーターでの植物全体にわたるスクロース代謝タンパク質の発現(Dickinsonら、Plant Phys.95:420-425(1991))は、特に有害であるかもしれない。トマト中でのフォトアシミレイト輸送の妨害は、葉の歪み、およびひどい成長阻害を引き起こした。この種類の代謝酵素の成功裏の発現は、適切なスクロースプールを入手するために必要な発生的時期を持つ、適切な組織特異的プロモーターにより制御されなければならない。亜細胞を標的とするシグナルも、同理由から重大である。プロモーター、標的シグナルおよび形質転換される種の選択的組み合わせは、すべて相互に作用し、植物に深刻な害を与える事なく、所望する生成物の成功裏の蓄積をもたらす。細菌ＦＴＦのようなヘテロロガスなスクロース代謝酵素の成功裏の発現こそが記載されなければならないが、上記の考察から、そのようなタンパク質の無差別な様式での発現は、所望の植物の生産を得られないであろうことは、極めて明らかである。トマトに転移されたストレプトコッカスムタンス(Streptococcus mutans)由来の細菌ＦＴＦ遺伝子が報告された（国際公開第89/123486号明細書）。この報告で使用された発現カセットは、マンノピンシンターゼプロモーターを含む。アグロバクテリウムツメファシエンス(Agrobacterium tumefaciens)由来のマンノピンシンターゼは、広範な植物中で構成的に発現する(Barkerら、Plant Mol.B iol.2:335-350(1983))。このプロモーターは任意の植物組織または種で、組織特異的に調節されるとは知られていない。この特許出願において、細菌ＦＴＦカセットを含む１９の形質転換植物の中の、１つを除くすべてが組み込みに際して遺伝子の破壊を生じた。これは、短縮化されたＲＮＡ転写物を生じ、そして生きているＦＴＦ活性をもつタンパク質を生成するとは期待されなかった。１つの系は明らかに完全長ＲＮＡを生成していたが、ＦＴＦ活性が与えられていたことを示すデータは無かった。タバコ中の酵母インベルターゼについて示されたように、トランスジェニックトマト植物全体の細胞の細胞質ゾル中のＦＴＦの発現は、組織の成長および発生に有害であるらしい(Sonnewaldら、The Plant J.,1:95-106(1991))。深部組織へのフォトアシミレイトの輸送の妨害が、低レベルの形質転換の成功率の原因かもしれない。活性な発現に対する選択で、この研究で実証された明らかな遺伝子再配列を説明できる。遺伝子の発現が組織に有害な状況では珍しくない点突然変異、またはわずか数塩基の欠失では、明らかに完全長のＲＮＡを生成する形質転換体を導くことができるが、機能的なＦＴＦタンパク質に翻訳されない。トマトのアポプラスト中のＧＴＦの発現も、国際公開第089/12386号明細書で考察された。植物は回収されたが、トランスジェニック組織中のタンパク質活性に関しての報告はなかった。これはトマト細胞のアポプラスト中の炭水化物ポリマー合成の有害な影響によるものであったにちがいない。葉または幹のアポプラスト中の酵母インベルターゼの発現は、トマトおよびタバコで炭素の流れおよび組織発生に破壊的であることが示された(Dickinsonら、Plant Phys.95:420-425( 1991));(von Schaewenら、EMBO J．9:3033-3044(1990))。トマトの供給源組織中のＧＴＦまとはＦＴＦの発現による炭素の流れの破壊による有害な効果の原因に関する論争は、酵母インベルターゼについて報告されたものと変わらなかった。記載されたような様式のスクラーゼ発現が可能であったならば、他の種での発現に関しても同じになるであろうと予想する理由はない。トウモロコシ内胚乳のようなさまざまな組織でスクロース代謝酵素のアポプラスト発現は、この区分での最小量のスクロース含量から効果は少ないと予想できる(Shannon,Plant Phys. ,49:203-206(1972));Shannon,Plant Phys.,49:198-202(1972));FelkerおよびSha nnon,Plant Phys.,65:864 -870(1980))。ジャガイモ塊茎のアポプラスト中でのＦＴＦ発現は、スクロースを得るが、その組織にひどい阻害も生じると予想される。OparkaおよびWright(P lanta,175:520-526(1988))は、スクロースが無傷の塊茎細胞に転流することを示し、そしてスクロースの加水分解のような手段による浸透圧ポテンシャルの変化が重大な効果を有し、スクロースが発生中の塊茎に到達することを妨げることを示した(OparkaおよびPrior,Plant Cell Env.,10:667-675(1987)；OparkaおよびW right)Planta,174:123-126(1988))。天然の細胞がフルクトースポリマーを合成せず、そして発現が実質的にこの組織に破壊的ではない植物細胞に、この種類のポリマーの蓄積を提供するために、発現カセットは特別な細胞で機能する転写および翻訳開始領域；ＦＴＦ遺伝子のコーディング配列を含むべきであり、好ましくは５’または３’末端に正しい読み取り枠中に標的配列を含み、ここで標的配列がＦＴＦタンパク質を細胞の小胞、ゴルジ装置、そして次に液胞へと向かわせ；さらに転写終止領域を含むべきである。ＦＴＦはフルクトースポリメラーゼ活性を持つ酵素を意味することを意図している。好ましくは、細胞外ＦＴＦ、レバンスクラーゼEC 2.4.1.10である。このＦＴＦ遺伝子は微生物起源であってよい。例えば、スクロースのフルクトース残基を重合してレバンを形成するレバンインスクラーゼの遺伝子は、様々な種から得ることができ、それらは制限するわけではないが、アエロバクターレバニカム(Aerobacter levanicum)、(EvansおよびHibbert、Adv.Carbohydr.Chem.2:253- 277(1946));バチルスズブチルス(Bacillus subtilis)、(Dedonder,Methods Enz ymol.,8:500-505(1966));バチルスポリミキサ(Bacillus polymyxa)、(Hestrin ら、 (Biochem.J.,37:450-456(1943))；ストレプトコッカスサリバリウス(Streptoc occus salivarius)、(Fuchsら、Nature,178:921(1956))またはミクロバクテリウムレバニホームス(Microbacterium levaniforms)(Fuchsら、Antonie van Leeuw enhoek 51:333-351(1985))がある。本発明の可能にする好適なＦＴＦコーディング配列はバチルスアミロリグイファシエンス(Bacillus amyloliguifaciens)に由来する(MantsalaおよびPuntala,FEMS Microbiol.Lett.,13:395-399(1982);Tan gら、Gene,96:89-93(1990))。ＦＴＦ遺伝子の起源は、トランスジェニック植物細胞中に大分子量フルクトースポリマーを合成および蓄積するという本発明の目的を達するかぎり、重要ではない。本発明のＦＴＦタンパク質は、ほとんどの植物中に光合成で生じる主要な代謝物であるスクロースを利用する。当業者は、炭水化物ポリマーの触媒に、スクロースを利用できるタンパク質に置換することができる、ということは真実である。スクラーゼとして知られるそのようなタンパク質の群は、制限するわけではないが、レバンスクラーゼ、オルタナンスクラーゼまたは多くのデキストランスクラーゼのなかの１つを含む(Aboら、J.Bact.,173:989-996(1991);Gilmoreら、Infec.and Immun.,58:2452-2458(1990);Cote,Carbo.Poly.19:249-252(1992);G iffardら、J.Gen.Micro.,139:1511-1522(1993))。ＦＴＦと同様な特性を有することから、デキストラン−スクラーゼおよびオルタナンスクラーゼのようなタンパク質は、トランスジェニック植物中で発現した時に同様な様式で行うことが期待される。スクラーゼは、ヘキソース残基の重合を触媒しながら、さらにコファクターを必要とすることなく、スクロースを唯一の基質として使用して、それぞれが単量体として作用する１組の類似するタンパク質と考えることができる。デキストランスクラーゼタンパク質は、α１−３、α１−６またはα１−３およびα１−６結合グルコース残基の組み合わせを含むグルコースポリマーの生成を触媒する。様々な起源のデキストラン−スクラーゼ遺伝子、または同微生物起源の異なるが関連する遺伝子は、ポリマー中の結合の種類および分枝パターンを決定する。グルコース結合の種類および結合のパターンは、ポリマーの特性に直接関連する。例えば、主にα１−３結合グルコース残基から成るポリマーは水に不溶性であり、一方主にα１−６のものは大変可溶性である(Walker Int.Rev．i n Biochem.,16:75-126(1978);Rollaら、Special Supp.to.Chem.Sci.,pp.21-29,D oyleおよびCiardi編集、(1983))。オルタナンは異なるα１−３およびα１−６結合で結合したグルコースから成る独特のデキストランである(ミアサキら、Car bo Res.,84:273-285(1980))。オルタナンは、カロリーゼロの増量剤としての使用に需要が大きい、アラビアゴムに大変似ている固有の低い粘性を有する。高価であること、およびアラビアゴムの供給が少ないことにより、代替物の研究がなされるようになった。競合的な価格で生産されるオルタナンは、アラビアゴムの優れた代替物であり、さらに価格および利用の可能性を見いだすことができる。デキストランは、科学研究用および血漿増量剤のような高付加価値使用のためにのみ、発酵培養により工業的規模で現在生産されている。トランスジェニック植物中での蓄積は、既存の製品の利用性を増大させ、そして価格を下げ、そして低価格はこれら新規ポリマーの新しい市場を開拓することになるだろう。使用は独特な特性によって決定される。グルコース結合パターンおよび分枝の数が澱粉の機能、そして最終的な使用を定める。デキストランおよびオルタナンは澱粉分子中には見いだされない独特なグルコース結合を含み、それゆえに天然または修飾澱粉にはひらかれていない製品に有用となり得る。ＦＴＦ遺伝子または任意のスクラーゼ遺伝子の正しい発現は、異なるプロモーターを含む様々なキメラ発現カセットの使用が必要になるかもしれない。トランスジェニック植物中での外来遺伝子の発現は、十分に確立されている(De Blaere ら、Meth.Enzymol.143:227-291(1987))。本発明の好適な態様は、トウモロコシ、ジャガイモおよびタバコに由来する、それぞれ種子、塊茎および葉中のＦＴＦ遺伝子の発現である。植物からの種子および塊茎を含む組織は、制限するわけではないが、サトウキビ、テンサイ、キクイモ、チコリーおよびキャノーラ(canol a)も、それらがこれ、または関連する炭水化物ポリマー（すなわち、デキストランおよびオルタナン）を蓄積するように形質転換させることができる。ＦＴＦ発現を調節するために必要なプロモーターの供給源として選択される種は、プロモーターが所望の宿主および組織の種類にＦＴＦ遺伝子を発現することにより本発明を達成するための十分な転写活性を有する限り、決定的に重要でない。これらの好適なプロモーターは、種子、塊茎または葉中にタンパク質を特異的に発現させることができるものである。種子に特異的なプロモーターは、制限するわけではないが、種子貯蔵タンパク質のプロモーターである。これらの貯蔵タンパク質は厳しく調節され、種子組織に排他的に発現を生じる。厳しい調節は至適な発現、または特異的な基質プールに対する作用が望まれる時には決定的に重要である。種子貯蔵タンパク質は、段階(stage)特異的に加えて、高度に器官 −特異的である(Higginsら、Ann.Rev.Plant Physiol.,35:191 -221(1984);Goldbergら、Cell,56:149-160(1989);Thompsonら、Bioessays,10:10 8-113(1989))。様々な種子貯蔵タンパク質が発生の様々な段階で発現され得る。現在トランスジェニック双子葉植物中の貯蔵タンパク質の種子−特異的発現について、多くの例がある。これらには、ダイズレクチンの遺伝子(オカムロら、Pro c.Natl.Acad.Sci.USA,83:8240-8244(1986)、エンドウレグミン(Shirsatら、Mo l.Gen.Genet.,215:326(1989)およびナタネ種子ナピン(Radkeら、Theor.Appl.Gen et.,75:685-694(1988))。キメラ遺伝子構築物中のヘテロロガスなコーディング配列に操作可能に連結された種子特異的プロモーターは、トランスジェニック植物中に一時的な、かつ場所的な発現を維持することが示された。例として、トランスジェニック種アラビドプシス(Arabidopsis)およびビー.ナプス(B.napus)の種子中にエンケファリンペプチドを発現するために使用された、アラビドプシスサリナ(Arabidopsis tha lina )2S種子貯蔵タンパク質プロモーターを含む(Vandekerckhoveら、Biotechnol ogy,7:929-932(1989))。ルシフェラーゼ遺伝子を発現する、豆レクチンおよび豆 β−ファセオリンプロモーターは、トランスジェニックタバコ系に形質転換された時、正しく機能することが実証された(Riggsら、Plant Sci.,63:47-57(1989)) 。メイズ中の主な種子貯蔵タンパク質は、ゼインとして知られているアルコール −可溶性ポリペプチドの一族である。それらはＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルで泳動した時に大きさにより識別できる幾つかの別個の種類から成る。遺伝子のゼイン族は、受粉後１２から５０日の間に、メイズ胚乳細胞中の粗面小胞体上で特異的に合成される（Larkinおよび Hurkman、Plant Phys.,62:256-263(1978)。高度に調節された、組織特異的発現および比較的高いＲＮＡ転写レベルは、なぜゼインプロモーターがトランスジェニックトウモロコシ胚乳細胞中でのヘテロロガスな遺伝子発現に魅力的であるのかの理由である。幾つかのゼインタンパク質が同定された(Pedersonら、J.Biol. Chem.,261:6279-6284(1986);DasおよびMessing、Mol.Cell Biol.,7:4490-4497(1 987);Hiffmanら、EMBO,6:3213-3221(1987))。本発明の核酸断片の種子特異的発現に好適なプロモーターは、10kDゼイン種子貯蔵タンパク質からのプロモーターである、キリハラら、Mol.Gen.Genet.,211:477-484(1988);キリハラら、Gene.71 :359-370(1988))。トランスジェニックジャガイモの好適なプロモーターは、ＦＴＦ遺伝子を塊茎で特異的に発現させることができるものである。塊茎特異的プロモーターの例には、制限するわけではないが、顆粒−結合澱粉シンターゼ(Visserら、Plant Mol .Bio.,17:691-699(1991))、澱粉分枝酵素、koβmannら、Mol.Gen.Genet.,230:39 -44(1991))、ならびに貯蔵タンパク質、パタチン（Rocha-Sosaら、EMBO J.8:23- 31(1989)がある。ヘテロロガスなコーディング配列に操作可能に連結された塊茎特異的プロモーターは、トランスジェニック植物中に、それらの一時的かつ場所的な発現を維持することが示された。例として、ＧＵＳマーカー遺伝子の発現を支配するために使用される顆粒−結合澱粉シンターゼプロモーター(Visserら、P lant Mol.Bio.,17:691-699(1991))；van der Steegeら、Plant Mol.Bio.,20:19- 30(1992))、ＣＡＴマーカー遺伝子の発現を支配するために使用されるパタチンプロモーター(Twellら、Plant Mol.Biol.,9:345-375(1987))さらにＧＵＳ遺伝子 (Wenzlerら、Plant Mol.Biol.,12: 41-59(1989))を含む。塊茎特異的遺伝子発現のための特別な使用は、組織および発生に特異的な発現を付与することに関与する調節配列が定められていると言う点で特徴がよく知られている、パタチンプロモーターである(Migneryら、Nuc.Acids Res.,12:7987-8 000(1984);Jeffersonら、Plant Mol.Biol.,14:995-1006(1990);Twellら、Plant Mol.Biol.,9:345-375(1987)。ジャガイモ中での遺伝子発現の支配に特に好適なのは、クラスＩパタチンプロモーターである。このプロモーターは、組織特異的および発生的発現に関して、大変詳細に特性決定された。塊茎のような貯蔵組織中で、スクロースのみを利用するための遺伝子発現の厳しい調節を望むならば、塊茎に発現するクラスＩパタチンプロモーターが特に有用であり、一方クラスII プロモーターも根で発現し、多少望ましい(Pikaardら、Nuc.Acids Res.,15:1979 -1994(1987))。特に好適なのは、クラスＩパタチンプロモーターの短縮変更体であり、転写開始部位の1.0Kb上流を包含する。このパタチンプロモーター断片中に２つの組織特異的要素が同定され、１つは転写開始部位の−４０と−４００ｂｐの間であり、もう１つは−４００と−９５７の間である。これら２つの要素は、ＧＵＳマーカー遺伝子に融合した短縮化パタチンプロモーターを含むキメラ遺伝子の、塊茎特異的発現を付与するのに十分である(Jeffersonら、Plant Mol.Bi ol.,14:995-1006(1990))。転写開始部位の−４０から−９５７ｂｐに由来する断片から成るパタチンプロモーターの短縮化変更体は、カリフラワーモザイクウイルスプロモーター（天然の状態の植物中に発現することが示されたプロモーター）の短縮化変更体に塊茎特異的発現を付与することが示された(Jeffersonら、Pl ant Mol.Biol.,14:995-1006(199 0))。タバコの葉で一般的に発現できるプロモーターが同定された。リブロース−ビス−リン酸カルボキシラーゼ（ＳＳＵ）遺伝子の小さいサブユニットのプロモーターは、１例である(MazurおよびChui、Nuc.Acids Res.,13:2373-2386(1985))。あるいは、タバコ中、主に葉の組織中の発現にはカリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）３５Ｓプロモーターが好ましい。タバコ組織中のＣａＭＶ３５Ｓプロモーターの発現に必要な配列は、報告されている(Odellら、Nature,313:810-8 12,(1985))。ＣａＭＶ３５ＳおよびＳＳＵプロモーターは、天然種に形質転換された時だけでなく、今日までに試験された他のプロモーターよりも多くの植物種にわたって、ヘテロロガスな遺伝子の発現を支配するのに効果的であることが実証された。スクロース合成が起こり、そして植物細胞中の細胞質ゾルで代謝される。スクロースは膨大の数の細胞構造または生成物の生産における、構造−単位(buildin g-block)である。液胞中に沈着するが、これは細胞の全発生の間で断続的であるだけか、またはサトウキビの場合は幾分長期間保存される。液胞スクロースは、代謝的に活性ではなく（これは液胞中では任意の細胞生成物を生産するための代謝物として利用されない）、したがってフラクタン合成の目的のために利用することは、細胞質ゾルのスクロースプールを消耗することによるよりは、はるかに害が少ないだろう。液胞スクロースの使用は、ＦＴＦ遺伝子をトランスジェニック細胞の液胞に標的させることにより達成できる。植物細胞液胞、分泌系の一部分は、アミノ酸、無機イオンおよび代謝中間物質（例えばグルコース、フルクトースおよびスクロース）の蓄積を含む、細胞の成長および発生に致命的な、数多くの機能を行う。多くのこれらの化合物が、タンパク質を基本とした経路または能動輸送により液胞に入る(Mat ile Ann.Rev.Plant Physiol.29:193-213(1978);およびWink，J.Exp.Bot.44:231- 246(1993)を参照にされたい)。液胞用タンパク質は、単純な拡散によっても、またはトノプラストを通る直接的な輸送によっても入らない。液胞特異的タンパク質のためにコードされたＮ−末端シグナルが、初めてタンパク質を粗面小胞体（ＥＲ）に向ける。このシグナルは、ゴルジ装置とＥＲの融合につづいてＥＲ中で開裂され、ここでタンパク質はさらにプロセッシングされる。タンパク質の液胞標的化は、タンパク質のＮまたはＣ−末端のいずれかに位置するアミノ酸の二次配列により決定される(Chrispeels,AnnRev.Plant Phys.およびPlant Mol．Biol. 42:21-53(1991);ChrispeelsおよびRahikael,Cell 68:613-616(1992))。この配列によりタンパク質がゴルジで保存できるようになる。タンパク質を含有するゴルジ−由来小空胞は、トノプラストを検出し、そして融合し、タンパク質を液胞中に沈着させる(Neuhausら、Proc.Natl.Acad.Sci.88:10362-10366(1991);Bednarek およびRaikhel,The Plant Cell,3:1195-1206(1991);Chrispeels,Ann Rev.Plant Phys.およびPlant Mol．Biol.42:21-53(1991))。多くの液胞標的配列が同定され、それらは制限するわけではないが、タバコキチナーゼＡ(Neuhausら、Proc.Natl.Acad.Sci.88:10362-10366(1991))、大麦オルエレイン(aluerain)(Holwerdaら、Plant Cell,4:307-318(1992))、タバコβ-1 -3グルカナーゼ(Melchersら、Plant Mol.Biol.21:583-593(1993))、およびパタチン(Sonnewaldら、The Plant J.,1:95-106(1991))。本発明の好適な液胞標的配列は、サツマイモの根の貯蔵タンパク質に由来するスポラミンおよび大麦レクチン遺伝子である。このスポラミンタンパク質は、Ｎ −末端配列だけを持つプレプロ−ペプチドとして合成される。このＮ−末端配列は、２１アミノ酸シグナルプレ−ペプチド、およびさらにＥＲに入り、そして液胞に分けられる原因である１６アミノ酸のプロ−ペプチドを含む(マツオカおよびナカムラ、Proc.Natl.Acad.Sci.,88:834-838(1991))。大麦レクチン遺伝子は、ＥＲを標的とし、そしてゴルジ中の液胞に分けられるために、それぞれＮおよびＣ−末端に別個のシグナルを含む(BednarekおよびRaikhel、The Plant Cell,3 :1195-1206(1992);Dombrowskiら、Plant Cell,5:587-596(1993))。液胞特異的タンパク質は、ヘテロロガスなトランスジェニック植物中で、正しく液胞を標的することが実証された(Bednarakら、Plant Cell,2:1145-1155(1990 );マツオカおよびナカムラ、Proc.Natl.Acad.Sci.,88:834-838(1991);Holwerda ら、Plant Cell,4:307-318(1992)。タバコ中で液胞特異的大麦レクチンタンパク質の正しい集成、プロセッシングおよび標的化の実証は、単子葉および双子葉での分類機構が大変類似していることを指示している(Wilkinsら、Plant Cell 2:301-313(1992))。さらに、キメラ遺伝子構築物中のヘテロロガスなコーディング配列に、操作可能に融合された液胞特異的遺伝子からの標的配列は、トランスジェニック植物中の液胞特異的発現も維持する。そのような例は、酵母インベルターゼＳｕｃ２遺伝子に融合されたパタチン液胞標的配列を含み、そしてトランスジェニックタバコ細胞の液胞を正しく標的することが確立され(Sonnewaldら、The Plant J.1:95-106(1991))、タバコキチナーゼＡ、または別の実験で、大麦レクチンからのＣ−末端配列のいずれかのＣ−末端液胞標的配列が、キュウリキチナーゼの分泌型と融合された。このキメラキュウリキチナーゼは、両方の実験で正しくタバコ細胞の液胞を標的した(Neuhausら、Proc.Natl.Acad.Sci.,88:10362-10366(1991);BednarekおよびRaikhel、The Plant Cell,3:1195-1206(1991))。ＦＴＦタンパク質に操作的に融合するために選択した液胞標的配列の起源は、これが機能的ＦＴＦタンパク質を好適なトランスジェニック植物細胞の液胞に正しく標的するかぎり、決定的に重要ではない。ＦＴＦコーディング領域の正しい発現に必要かもしれない、ポリアデニレーションシグナルおよび他の調節配列を提供できる任意の３’非−コーディング領域を、本発明を達成するために使用できる。これにはノパリンシンターゼ遺伝子の３’末端領域、３５Ｓまたは１９ＳＣａＭＶ遺伝子のような植物ウイルス遺伝子からの３’末端領域、メイズＣＩ−遺伝子の３’末端領域、または使用する配列がその核酸配列中に、それが操作的に結合したプロモーター／ＦＴＦコーディング領域の組み合わせを正しく発現するために必要な情報を提供するような、任意の起源に由来する３’末端配列を含む。様々な３’非コーディング領域の有用性を教示する多くの例が当該技術に存在する(例えば、Inglebrechtら、Plant Ce ll,1:671-680(1989)を参照にされたい)。この説明および以下の実施例により、当業者はプロモーター、液胞標的配列、ＦＴＦ遺伝子のコーディング配列または３’転写終止領域を除去することにより、そしてそれらを微生物、植物または他の起源に由来する同様なＤＮＡ断片に置き換えることにより、記載されたキメラ構築物を改変し、本発明に記載されたものとは異なる方法およびトランスジェニック植物を得ることができる。本明細書中に記載された方法は、ＦＴＦ活性を持つことが必要ではないが、任意の遺伝子が基質としてスクロースを使用して、オルタナンスクラーゼ、デキストランスクラーゼ、グルコシルトランスフェラーゼまたは任意のスクラーゼを合成する、微生物または植物起源のコーディング領域に応用できる。ＤＮＡ配列を高等植物細胞に導入する（すなわち形質転換する）様々な方法が、当該技術分野で利用できる(欧州特許出願公開第0 295 959A2号および同0 138 341 A1号明細書を参照にされたい)。方法には、アグロバクテリウムエスエスピー.(Agrobacterium ssp.)のＴｉおよびＲｉプラスミドに基づく形質転換ベクターを含む。これは特にこれらベクターのバイナリー型(binary-type)を使用することが有用である。Ｔｉ-由来ベクターは、タバコ、ジャガイモおよびキャノーラのような様々な高等植物を形質転換させる。タバコおよびジャガイモ中に導入するために、本発明のキメラ遺伝子を実施例１に記載するバイナリーベクター中に挿入できる。このベクターはアグロバクテリウムツメファシエンス(Agrobacterium tumefaciens)のバイナリーＴｉプラスミドベクター系(Bevan,Nuc.Acids Res.,12:8711-8720(1984))の一部である。トウモロコシ中に導入するために、本発明のキメラ遺伝子は、高速弾道衝撃および本発明を可能にするのに十分な構築物の核酸構築物または断片で被覆した金属粒子を使用して、形質転換されるだろう(Kleinら、Nature(ロンドン)、327:70(1 987));Klein、米国特許第4,945,050号明細書)。ＤＮＡを植物細胞中に導入することは、組織または亜細胞に特異的な様式でフラクタンポリマーが合成され、そして蓄積されるように、ＤＮＡまたはＤＮＡ断片を転移することにより本発明の目的が行われるかぎり、決定的に重要ではない。トランスジェニック植物の葉、種子または塊茎中のキメラ遺伝子の発現についてアッセイするために、当業者に周知な方法でＦＴＦタンパク質を抽出し、検出そして免疫的に定量する。あるいは葉、種子または塊茎組織を挽きそして極性溶液で抽出し、巨大分子量の多糖（フラクタンを含む）を単離し、そして濃縮して、これを次に加水分解し、続いてケストール特異的染色法と組み合わせて、定量的な酵素的特性決定または定性的なＴＬＣ分析により検出することができる(Wis eら、Anal.Chem.,27:33-36(1955))。実施例本発明は以下の実施例によりさらに明確になり、実施例中、特に言及しないかぎり、すべての部およびパーセントは重量であり、度はセッ氏である。これらの実施例は本発明の好適な態様を指示するものであり、説明の目的にのみ与えられる。上記の考察およびこれらの実施例から、当業者は本発明の本質的特徴を確認することができ、その精神および範囲から逸脱することなく、様々な使用および条件に適合させるために、本発明を変更および修飾することができる。本出願人が本明細書に引用した特許を含み、すべての報告はその全部を参照により編入する。実施例１ＳａｃＢＦＴＦ活性の特性決定バチルス中でのＳａｃＢＦＴＦ遺伝子の発現本発明の細菌ＦＴＦ（ＳａｃＢ）遺伝子は、バチルスアミロリグエファシエンス(Bacillis amyloliguefaciens)のゲノムＤＮＡライブラリーを、ＦＴＦ遺伝子の公開された配列に基づくオリゴヌクレオチドでスクリーニングすることにより得た(Steinmetzら、Mol.Gen.Genet.,20 0:220-228(1985))。このクローニング法はTangら、(Gene,96:89-93(1990));(Nag arajanら、米国特許第#5,162,2070号明細書により記載された。ＦＴＦ遺伝子が単離されたＤＮＡ源は、例えば任意のバチルスアミロリグエファシエンス(B acillis amyloliguefaciens)である。これらの細胞は、アメリカンタイプカルチャーコレクション（ロックビル、メリーランド州）から入手できる。バチルス(Bacillis)ＦＴＦ遺伝子のコーディング配列は、２９アミノ酸原核分泌シグナル開裂部位（８９４ｂｐから始まる）の３’末端に、EcoRV制限酵素認識部位を付加することによりモディファイした。このEcoRV酵素認識部位は、部位特異的突然変異誘発法により、Muta-gene(商標)インビトロ突然変異誘発法キットを使用して付加した(バイオ-ラッド:Bio-Rad、リッチモンド、カリフォルニア州)。このMuta-gene(商標)キットで使用するために合成したオリゴヌクレオチド(EcoR V部位を含む)は、配列番号１に掲げる。EcoRV部位の存在は、制限酵素分析、そして後にＤＮＡシークエンシングにより決定した。生成したプラスミド（モディファイＦＴＦ遺伝子を含む）は、pB311と命名した。このプラスミドpB311は、原核分泌シグナルから別れたＦＴＦ遺伝子の成熟コーディング領域を含むＤＮＡ断片の抽出を可能にするので、後のＤＮＡ操作に有用である。pB311 ＦＴＦ活性の特性決定モディファイＦＴＦ遺伝子の分析は、始めにバチルスズブチルス(Bacillus subtillus )(BE1500株)をpB311プラスミドＤＮＡで形質転換させることにより行った。これは10mlのSPI培地を含有する250mlのフラスコに、バチルスズブチルス(Bacillus subtillus)培養物を660nmの光学密度が0.15で接種することにより行った。フラスコを３７℃で600 nmの光学密度が1.0になるまで3時間インキューベーションした。次に細胞を100m lのSPII培地を加えて希釈し、そして同温度で90分間インキューベーションした。細胞を8000×gで10分間、室温で遠心することにより培地から沈殿させた。細胞を10mlの上清に再懸濁した（10倍濃度）。このように処理した細胞を、1-5μg のプラスミドＤＮＡを含む滅菌試験管に50μlのSPII-EGTAを入れることにより形質転換した。2mlのSPII-EGTAを、上記のように処理した1mlの細胞に加え、そして300μlのこの混合物をプラスミドＤＮＡを含む試験管に加えた。これを37℃でゆるやかに震盪しながら20-30分間インキューベーションした。インキューベーション後、100μlのLB培地を試験管に加え、インキューベーションを同温度でさらに30分間続けた。pB311プラスミドを含む細胞を選択するために、この溶液のアリコート(100μl)を、5μg/mlのクロラムフェニコールを含有するLB寒天プレートにまいた。Ｔベース（１Ｘ） (NH₄)₂SO₄ １ｇ K₂HPO₄ ７ｇ KH₂PO₄ ３ｇ Naクエン酸０.５ｇ MgSO₄ ０.１ｇ dd水５００ｍｌにするＳＰＩ 100mlの1XTベースに次のものを加えた、１ｍｌ５０％グルコース１ｍｌ１０％酵母エキス（デフコ）２ｍｌ１％カザミノ酸１ｍｌ２％ MgSO₄ ＳＰII この培地はＳＰＩと同じであるが、0.5mlの0.1M CaCl₂も含む。ＳＰII−ＥＧＴＡこの培地はＳＰＩと同じであるが、0.2mlの0.1M EGTAも含む。ＬＢ寒天プレート１０ｇトリプトン（デフコ）５ｇ酵母エキス１０ｇ塩化ナトリウム０.７％寒天ｄｄ水で１Ｌ粗細菌タンパク質抽出物の調製プラスミドpB311を含むバチルス(Bacillis)系の粗抽出物は、5μg/mlのクロラムフェニコールおよび2％スクロースを含有する栄養（ＬＢ）培地中、30℃で2ml 培養物を成長させることにより調製した。培地から細胞を8000×gで5分間遠心することにより回収した。可溶性糖は上清1mlをG-25M Sephadexカラム(フォルマシア AB:Pharmacia AB、ウプサラ、スウェーデン)に加え、そして１分間、1500×g で遠心することにより取り出した。分泌タンパク質を含有する溶液を、Centrico n-30（アミコン社：Amicon Co.ベヴァリー、マサチューセッツ州）を製造元の指示に従い使用して10倍容量に濃縮した。ＬＢ培地１０ｇトリプトン（デフコ）５ｇ酵母エキス１０ｇＮａＣｌｄｄ水で１Ｌ粗タンパク質抽出物中のＦＴＦ活性のアッセイＦＴＦ活性は数種の方法で測定し、次の方法を含む：１）ＦＴＦ活性のグルコースオキシダーゼ分析ＦＴＦ活性は、タンパク質抽出物を37℃で30分間、2％スクロースを50mMリン酸カリウム緩衝液(pH6.0)中に含む溶液でインキューベーションすることによりアッセイした。この反応は100℃で10分間加熱することにより停止した。陰性対照は、粗タンパク質抽出物をリン酸緩衝化スクロース溶液を加える前に、100℃ で10分間加熱して提供した。ＦＴＦ活性はこの処理により破壊され、ベースライン、抽出物中の測定すべきグルコース濃度となる。ＦＴＦ活性はスクロースから遊離するグルコースを測定することにより決定した。これはグルコースTrinder （商標）キット(シグマ化学社:Sigma Chemicals CO.、セントルイス、モンタナ州)に記載されているように、停止した反応物をグルコースオキシダーゼおよびペルオキシダーゼと一緒にインキューベーションし、そして生成したキノネイミン(quinoneimine)色素の量を分光光学的分析で測定(340nmでのO.D)し、陰性対照およびグルコース標準と比較することにより行った。グルコースオキシダーゼアッセイを使用した、モディファイＦＴＦタンパク質を含むバチルス(Bacillus)からの粗タンパク質抽出物のアッセイを表１に表す。表１のデータは、プラスミドpB311を含むバチルス(Bacillus)からの粗タンパク質抽出物がスクロースヒドロラーゼ活性を保持していることを実証する。２）ＦＴＦ活性の酵素結合アッセイ粗タンパク質抽出物を37℃で30分間、2％スクロースおよび50mMリン酸カリウム緩衝液(pH6.0)を含む溶液でインキューベーションした。この反応は100℃で10 分間加熱することにより停止した。陰性対照（不活性化タンパク質）は、粗タンパク質抽出物をリン酸緩衝化スクロース溶液を加える前に、100℃で10分間加熱して提供した。この処理は酵素活性を破壊するのに十分であり、そしてＦＴＦ活性とは無関係に、測定すべき溶液中のグルコース（ベースライン）を与えることができる。ＦＴＦ活性は、停止させた反応物をグルコースアッセイミックスと一緒に30℃で20分間インキューベーションして、スクロースから遊離するグルコースを測定することにより測定した。こ反応は沸騰湯浴中に10分間置くことにより停止し、そして活性はNADからNADHへの転換を340nmで測定することにより定量した。活性を陰性対照およびグルコース標準と比較した。さらにＦＴＦ活性に関する情報は、タンパク質抽出物をスクロースと一緒に上記のようにインキューベーションすることにより、スクロースから放出される遊離フルクトースの量を測定することにより得られた。活性は、停止した反応物をヘキソースアッセイミックス含有液中で30℃で20分間インキューベーションし、そして反応を沸騰湯浴中に10分間置くことにより停止して特徴付けた。この反応中のホスホグルコースイソメラーゼが、遊離フルクトースをグルコースに転換し、ＮＡＤＨに転換されるＮＡＤ量が加わる。340nmの分光光度的読み取りは、グルコースおよび遊離フルクトース濃度の両方を表している。グルコースアッセイミックスとインキューベーションしたタンパク質抽出物の分光光度的分析を、ヘキソースアッセイミックスとインキューベーションしたものと比較して、溶液中の遊離フルクトースのレベルが決定できる。グルコースアッセイミックス０.２ＭＨＥＰＥＳ／ＮａＯＨ（ｐＨ８．０）１０ｍＭＭｇＣｌ₂ ２ｍＭＮＡＤ２ｍＭＡＴＰ１０ｍＭＤＴＴ２.５単位／ｍｌヘキソキナーゼ２．５単位／ｍｌグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼヘキソースアッセイミックスグルコースアッセイミックス＋４単位／ホスホグルコースイソメラーゼバチルス(Bacillus)(プラスミドpB311を含むタンパク質抽出物)の酵素結合分析からのデータを表２に掲げる。表２のデータは、EcoRVモディファイＦＴＦタンパク質がスクロース加水分解活性を保持しているというグルコースオキシダーゼアッセイの結果を確証している（上記表１を参照にされたい）。もしスクロースの加水分解が、粗タンパク質抽出物中に存在する唯一の活性であると予想するならば、表２はまたフルクトースが１：１では存在しないことを実証している。重合したフルクトースはホスホグルコースイソメラーゼとヘキソースアッセイミックス中で反応しない。したがって、低レベルの遊離フルクトースは、粗抽出物中のタンパク質だけがグルコースを遊離するスクロースを利用するのではなく、多分重合化によりフルクトースを隔離することも示唆している。３）ＨＰＬＣによるＦＴＦ活性のアッセイＦＴＦ活性の定性分析は、37℃で30分から１時間、2％スクロースおよび50mMリン酸カリウム緩衝液(pH6.0)の溶液中で粗タンパク質抽出物をインキューベーションした後に、生成した巨大分子量の炭水化物ポリマーの存在を確立することにより行った。陰性対照は、粗タンパク質抽出物をリン酸緩衝化スクロース溶液を加える前に、100℃で10分間加熱して提供した。インキューベーション後、生成したフラクタンを高性能陰イオン交換クロマトグラフィーにより、0- 100mM NaOH勾配をDionex PA-100カラムおよびDionex PAD検出器（ディオネックス：Dionex、サニーバーレ、カリフォルニア州）を使用して分析した。反応のクロマトグラフィー的プロフィールは、信頼できるレバン標準を使用して得られたものと比較した（シグマ化学社、セントルイス、モンタナ州）。４）薄層クロマトグラフィーによるフルクトースポリマーのアッセイＦＴＦ活性の定性的分析は、37℃で30分から１時間、2％スクロースおよび50m Mリン酸カリウム緩衝液(pH6.0)を含む溶液中で粗タンパク質抽出物をインキューベーションすることによっても定性した。陰性対照は、粗タンパク質抽出物をリン酸緩衝化スクロース溶液を加える前に、100℃で10分間加熱して提供した。インキューベーション後、5-10μlの反応物を陽性対照と一緒に（すなわち、モンタナ州、セントルイスのシグマ化学社から購入したフルクトース、グルコース、スクロース、澱粉およびチコリーイヌリン）、20cm×20cmのFisher Redi/plate( 商標)(フィッシャーサイエンティフィック：Fisher Scientific、ピッチスバーグ、ペンシルバニア州)上に滴下した。プレートは、4:3:12比の水、n-ブタノールおよび2-プロパノール溶媒を含むＴＬＣチャンバー中で泳動した。溶媒の先端が頂点の1cm以内に到達した時、プレートをチャンバーから取り出し、そして風乾した。次にプレートにケストース特異的染色剤を噴霧し(Wiseら、Anal.Chem.,27:33-36(1995))。染色はｎ−ブタノール飽和水でリン酸を１Ｍに希釈することにより行った。これに3gの尿素を加え、続いて5ml のエチルルコールを加えた。ケストース特異的染色剤は、ＴＬＣプレート上で風乾することができる。フルクトースおよびスクロースからＦＴＦの作用により生成したフルクトースポリマーは、ＴＬＧプレートを5-10分間、100℃に置くことにより視覚化した。このアッセイでグルコースは大変弱いシグナルを生成し、そして澱粉は検出できるシグナルを生成しなかった。フルクトースおよびスクロースシグナルは、溶媒の先端の近くまで移動し、そしてイヌリン標準は原点から有意に移動していないシグナルを生じた。５）アントロン分析によるフラクタンの定量抽出物を80％エタノールですりつぶすことにより処理し、そして70℃で10-15 分間インキューベーションした。エタノール不溶性物質を5分間遠心(13000Xg)して沈殿させた。ペレットを80％エタノール中に再懸濁し、70℃に10-15分間加熱し、そして再度ペレット化した。この工程を３回繰り返し、そして最終的なペレットを水に再懸濁した。この溶液を70℃で10-20分間インキューベーションし、そして5分間、13000Xgで遠心した。取り出した上清をフラクタン濃度測定に使用した。フラクタン濃度は、エタノール不溶性抽出物を濃HClとともに10分間、100℃でインキューベーションすることにより測定した。これを冷却し、そして次にNaOH で中和した。このHCl処理試料を、40℃で20分間、1mlのアントロン溶液に加え、冷却し、そしてフルクトースの量をＡ₆₂₀で分光光度的に既知のフルクトース標準と比較して分析した。アントロンによりアッセイされた分画は、エタノール不溶性であったので、炭水化物のもとの状態は巨大分子量（すなわちフラクタン）と考えられた。分光光度的な読み取りに貢献することができた可溶性炭水化物は、熱80％エタノール中のインキューベーションが関与する工程で除去された。この抽出物は、ＴＬＣ分析による正確な予想を妨害すると思われる可溶性炭水化物が無いと決定された。したがって、記載したようにアントロン分析で、存在するフラクタン量の合理的な予想ができる。アントロン溶液 86mlの濃硫酸を20mlの水に加えた。これに0.15gのアントロン(シグマ化学社、セントルイス、モンタナ州)を加えた。実施例２ニコチアナタバカム中でのＳａｃＦＴＦ遺伝子発現用のキメラ遺伝子構築物ニコチアナタバカム中のＦＴＦの構成的発現ニコチアナタバカム(Nicotiana tabacum)の葉および幹中に、バチルス(Baci llus )ＦＴＦ遺伝子の構成的な、細胞質ゾル発現のために設計されたカセットは、始めにNcoＩ部位をＳＳＵ遺伝子の開始コドンに加え、ＤＮＡ断片をサブクローン化し易くした。これはプラスミドpNtSS23(MazurおよびChui、Nucl.Acids Re s.,13:2373-2386(1985)を、SphＩで消化し、そして大腸菌ＤＮＡポリメラーゼとともに40mM リン酸カリウム、(pH7.5)、6.6mM 塩化マグネシウムおよび1mM 2-メルカプトエタノール中で37℃で10分間インキューベーションすることにより３’ 突出ヌクレオチドを削除することにより行った。NcoＩリンカー(ニューイングランドバイオラボス:New England Biolabs)を連結し、そしてプラスミドをシークエンシングして新たなNcoＩ部位をＡＴＧがもとの開始コドンと同じ位置にあることを確認した。このプラスミドをp338と命名した。プラスミドp338からの1.0KbのHindIII-NcoＩ断片を、dNTPおよびクレノー酵素を使用して標準的手法により埋めて平滑−末端とした。このHindIII−NcoＩ断片の配列は、双子葉植物の幹および葉の光誘導遺伝子発現に必要なＳＳＵ調節配列を含む（MazurおよびChui、Nucl.AcidsRes.,13:2373-2386(1985)）。この断片を、すでにEcoRIで消化され、そして平滑末端化されたpDH51(Pietrzakら、Nucl.Ac ids Res.,14:5857-5868(1986)に連結し、次にSmaＩで消化し、CaMV 35Sプロモーターを置き換えた。このライゲーションミックスを大腸菌(DH5a株)[supE44 del lacU169(phi 80 lacZ del M15)hsdR17 recAl endAl gry196 thil relA]中で形質転換させ、そしてアンピシリン−耐性コロニーを選択した。このコロニーを、単離プラスミドＤＮＡの制限エンドヌクレアーゼ消化分析によりスクリーニングした。生成したプラスミド(pSSUDH51と呼ぶ)中の開始コドンのNcoＩ部位は、再構成され、そしてEcoRV部位も、アプライドバイオシステムズ(Applied Bopsystems) 合成機で合成したオリゴヌクレオチドを使用するＰＣＲ反応により、開始コドンがある枠内に加えられた。プライマーとして使用したオリゴヌクレオチドは配列番号２および配列番号３に掲げる。配列番号３は、サブクローン化工程のために XbaＩ部位も含んでいる。ＰＣＲ反応混合物には、0.1-0.3ngの各プライマー、最高1μgの鋳型ＤＮＡ、4 μlの2.5mM dNTPs、5μlの10X反応緩衝液(800mM Tris(pH9.0)、200mM(NH₄)₂SO₄ 、15mM MgCl₂)、1μl Perfect Match(商標)(ストラタジーン：Stratagene、ラジョラカリフォルニア州)およびH₂O(最終容量40 μl)を含んだ。最初に95℃で5分間変性した後、1μlのTAQ(商標)ポリメラーゼを各反応に加え、そして以下の循環プログラムを行った：95℃で１分間、42℃で2 分間、72℃で3分間を40サイクル。PCRで生成したＤＮＡ断片は、1.2％アガロースゲルで分離し、そしてエチジウムブロミドで視覚化した。単離したPCR断片をBglIIおよびXbaＩで消化し、そしてpSSUDH51に連結し、また同じ制限酵素で消化し、プラスミドpSSU/Pを得た。細菌分泌シグナルを含まないバチルスアミロリグエファシエンス(Bacillus amyloliguefaciens)ＦＴＦ遺伝子のコーディング配列を、EcoRVおよびXbaＩでpB311を消化することによりpSSU/ Pに加えた。成熟ＦＴＦコーディング領域を含む1.3Kb断片を、これもEcoRVおよびXbaＩで消化したpSSU/Pに連結し、プラスミドpSSU−SacBを生成した。365塩基対から始まるこのＳＳＵプロモーターは(BglII部位、MazurおよびChui、Nucl.Ac ids Res.,13:2373-2386(1985)を参照にされたい)、完全なＦＴＦ遺伝子のコーディング領域、およびＣａＭＶ転写終止配列をpSSU-SacBから、BglH−KpnＩで消化し、そしてベクターpZS97に基づくアグロバクテリウムツメファシエンス(Agroba cterium tumefaciens)バイナリ−Tiプラスミドに挿入されたＤＮＡ断片を回収した。バイナリーベクターpZS97またはpZS97Kは、キメラ遺伝子を植物に転移するために使用した。両方のバイナリーベクターpZS97およびpZS97Kは、アグロバクテリウムツメファシエンス(Agrobacterium tumefaciens)のバイナリーTiプラスミドベクター系の一部である(Bevan,Nucle.Acids Res.,12:8711-8720(1984))。このベクターは次のものを含む：（１）キメラ遺伝子ノパリンシンターゼ::ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ(nos::NPTII)を、植物細胞への形質転換マーカーとして(Bevan,Nature 30 4:184-186(1983)]、（２）ＴｉプラスミドのＴ−ＤＮＡの左および右境界［Beva n,Nucl.Acids Res.,12:8711-8720(1984)）、（３）ポリリンカー領域に独特のSa lＩ、BamHＩおよびKpnＩ部位(pSK97K)、または独特のHindIII、BamHＩおよびKpn Ｉ部位(pZS97)を持つ大腸菌lacZα−コンプリメンティングセグメント[Viering ら、Gene 19:259-267(1982))、（４）シュードモナスプラスミドpVS1に由来する細菌の複製起源(イトーら、Plasmid 11:206-220(1984))、および（５）形質転換したアグロバクテリウム(Agrobacterium)用の選択マーカーとして、Ｔｎ５由来の細菌ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子(Bergら、Proc.Natl.Acad. Sci.USA 72:3628-3632(1975))(pZS97K)、または細菌β-ラクタマーゼ遺伝子(pZS 97)。キメラ遺伝子を含むバイナリーベクターを三親交配(Ruvkinら、Nature 289 :85-88(1981)によりアグロバクテリウム(Agrobacterium)LBA4404/pAL4404株(Hoc kemaら、Nature303:179-180(1983))に移し、アンピシリン耐性(pZS97)またはカナマイシン耐性(pZS97K)について選択した。アグロバクテリウムでの感染によるタバコ葉ディスクの形質転換バイナリーベクターを含むアグロバクテリウム(Agrobacterium)の培養物を、タバコの葉のディスクを形質転換させるために使用した(Horschら、Science 227 :1229-1231(19856))。葉は900mlの滅菌水、100mlのChloroxブリーチおよび10ml の10％SDS中で30分間洗浄することにより滅菌した。葉を３回滅菌水中ですすぎ、そしてディスクを1平方cmに切り、そして滅菌パンチで穴を空けた。ディスクは、適当なバイナリーベクターを含むアグロバクテリウム(Agrobacterium)で、葉片を細菌含有ＬＢ培地に沈めることにより接種した。接種したディスクをＣＮ培地に移し、室温で光の下、３日間インキューベーションした。インキューベーションの３日後、葉のディスクを500mg/LのClaforan(セフォタキシム:cefotaxime)および300mg/Lのカナマイシンを含むＣＮ培地に移し、さらに4-6週間インキューベーションした。この時点で、発生した苗条をディスクから切り取り、そして500mg/LのClafora n(セフォタキシム)および300mg/Lのカナマイシンを含む発根(rooting)培地に置く。根はこの培地で２−４週間後に約40−50％の苗条で発生した。この発根苗条を８”ポットの湿潤メトロ−ミックス(metro-mix)に移し、転移した遺伝子の存在をアッセイした。ＣＮ培地スクロースを含む、MurashigeおよびSkoog(MS)最小有機培地の１袋(KCバイオケミカルスまたはGIBCO) １％ＢＡＰ０.１μｇ／Ｌナリジクス酸４ｇ寒天５００ｍｌ水（ｐＨ５.８）発根培地スクロースを含まない、MurashigeおよびSkoog(MS)最小有機培地の１袋(KCバイオケミカルスまたはGIBCO) １０ｇスクロース４ｇ寒天５００ｍｌ水（ｐＨ５.８）pSSU-SacBの発現はタバコの再生を妨げる pSSU-SacBの発現カセットをタバコのゲノムに移すことができる、バイナリーベクター含有アグロバクテリウム(Agrobacterium)の培養物を、同時−培養(co-c ultivation)によりタバコ葉のディスクを接種するために使用した(上記およびHo rschら、Science 227:1229-1231(1985)を暗礁にされたい)。カナマイシンを含有する選択培地中でトランスジェニック植物を再生する試みでは、３つの生存苗条を得ただけであった。苗条を切り取り、そして発根培地に置いたが、根が発生するための十分な時間が経過した後（３−５週間）でも、根は形成されなかった。バイナリーベクターpZS97のみを含有するアグロバクテリウム(Agrobacterium)を接種した対照の葉ディスクは、同数の接種した葉のディスクを使用して、少なくとも１０倍より多くの苗条を生じた。対照苗条は、カナマイシンを含有する発根培地で２−４週間以内に根を形成した。上記pB311由来のＦＴＦ遺伝子断片のサブクローニングに始まり、バイナリーベクターの転移、三親交配およびタバコの葉ディスクでのインキューベーションを通した、この完全な実験は2回目には、S SU-SacB発現カセットを含有する生存タバコ植物を再生するために行われた。２回目の実験は、選択培地でわずか４つの再生タバコ苗条が得られた。カルス培地の培養によりカナマイシン耐性の可能性がある形質転換体の試験上記の４つの再生苗条および陽性対照組織（バイナリーベクターのみで形質転換した）からの滅菌した葉のディスクを、選択用に50μg/mlのカナマイシンを含有するカルス培地に置いた。室温で４−６週間インキューベーションした後に、 NPT-II遺伝子だけを持つカルスが陽性対照の葉のディスクの周りの縁に形成した。上記の実験で得られた４つの苗条から取ったディスクからはカルス組織は形成しなかった。この実験で形成したカルスは、真の形質転換体ではないが、ＣＮ培地中でカナマイシン選択から“逃れた“ものであろう。これら２つの実験から得られた結果は、このプロモーターでのタバコ中のＦＴＦ遺伝子発現は、タバコ植物の成長、発生および再生に著しく有害であることを示している。カルス培地 MurashigeおよびSkoog(MS)最小有機培地の１袋（ＫＣバイオケミカルス）１０ｇスクロース４ｇ寒天水で５００ｍｌｓ（ｐＨ５.８）実施例３タバコ中の細菌ＦＴＦの誘導性発現誘導性ＦＴＦ発現カセットの構築タバコの葉の細胞の細胞質ゾル中で発現した時、ＦＴＦ活性の有害性を理解するための試みは、誘導性の発現カセットを構築することにより可能であった。ｍＲＮＡには転写されず、したがって誘導性されるまで機能的タンパク質に翻訳されないＦＴＦ遺伝子でタバコを形質転換することは、細胞中のＦＴＦ活性による成長および発生の阻害を考慮せずに再生させることを可能にする。つづいてこの遺伝子を、様々なタバコの発達段階に対する効果の分析に使用するために活性化できる。化学的に誘導したＦＴＦ発現カセットの構築細菌の分泌シグナルを含むSacBプロモーターおよびコーディング領域は、制限酵素KpnＩおよびXbaＩで切断することにより、プラスミドpB31 1(Tangら、Gene 96:89-93(1990));Nagarajanら、米国特許第05,162,207号明細書 )から取り出した。このKpnＩ−XbaＩ断片を、同制限酵素で切断したpUC18(ニューイングランドバイオラボズ、ベヴァリー、マサチューセッツ州)に連結した。生成したプラスミドをp3114と呼ぶ。このプラスミドp3114を次にEcoRVおよびHin cIIで消化し、そして成熟ＦＴＦコーディング領域をプロモーターおよび分泌シグナルから1.3KbＤＮＡ断片で取り出した。この1.3Kb断片をBluescript SK(+)クローニングベクター（ストラタジーン、ラジョラ、カリフォルニア州）中に挿入し、EcoRVおよびSmaＩで消化した。BglIIリンカーを、p3114のEcoRV−HincII断片を含有するBluescript SK(+)プラスミドのXhoＩ部位に、翻訳終止シグナルの3 '側約48塩基に加えた。生成したプラスミドをSacB−BglII消化した。2-1.12遺伝子(HersheyおよびStoner、Plant Mol.Biol.17:679-690(1991));Hershey、米国特許出願第07,327,205号明細書)からの503bp BglII／KpnI断片を、同じ制限酵素で消化したプラスミドに連結することにより、転写終止領域をSacB−Bg1Hに連結した。SacB FTF遺伝子の成熟コーディング領域および2-1.12転写終止領域を含む、生成したプラスミドをSacB:2-1と呼ぶ。 2-2.3プロモーター領域(HersheyおよびStoner、Plant Mol.Biol.17:679-690(1 991))、クロロフィルa/b結合タンパク質(Cab)遺伝子からの翻訳リーダー(Dunsmu ir,Nucl.Acids Res.,13:2503-2518(1985))およびノパリンシンターゼ(Nos)遺伝子由来の3'転写終止領域(Depickerら、J Mol.Appl.Genet.,1:561-570(1982))から成る、誘導性発現カセットを構築した。開始コドン(ATG)は、2-1.3プロモーターとCab翻訳リーダーの連結部のNcoI制限酵素部位(NcoIリンカーライゲーションにより付加)内に位置する。この誘導性ベクターをTDS136と呼ぶ。プラスミドTDS136をNcoＩで消化し、そして5'突出部をdNTPおよびクレノー酵素で埋めた。このNcoＩ平滑化プラスミドを、次にBamHＩで消化し、そして2-2.3 プロモーターを含有する1.0Kb断片を単離した。この断片を、BamHＩおよびEcoRV で消化したSacB:2-1に連結した。生成したプラスミド、CIP:SacB:2-1は枠中に開始コドン(ATG)を成熟FTFコーディング配列および2-1 3'領域とともに含んだ。このプラスミドをBamHＩおよびKpnＩで消化し、2.8Kb断片を単離し、そしてバイナリープラスミドpZS97Kに連結した。この機能的にＦＴＦ遺伝子に連結したプロモーターおよび転写終止配列を含むバイナリーベクターは、実施例２に記載した技術を使用して三親交配によりアグロバクテリウム(Agrobacterium)中に置いた。この誘導性発現ベクターを含むバイナリーベクターは、これも実施例２に記載した形質転換法により、タバコ中に導入された。タバコの葉からのＤＮＡ抽出再生したタバコの植物からの葉を、ＤＮＡ抽出物を調製するために使用した。この抽出物をＰＣＲ分析に使用して、タバコ系がCIP:SacB:2-1発現カセットを含んだかどうかを確認した。10cm長の葉から２グラムの葉の組織を、ドライアイス上の液体窒素を含有する乳鉢中に置いた。組織を細かい粉に挽いた。この粉を、滅菌した50mlのポリエチレン遠心管中の10mlの抽出緩衝液(50mM Tris(pH9.0)、1 0mM EDTA、2％ SDS)に50℃で加えた。5ミリグラムのプロティナーゼKを加え、そして混合物を50℃で10分間、時折混合しながらインキューベーションした。溶液を２回、フェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール[25:24:1]で抽出し、そして２回、クロロホルム：イソアミルアルコール[24:1]で抽出した。水性層を0.3M 酢酸ナトリウムとし、そして2.5容量の冷エタノールで沈殿させた。溶液を8000×gで遠心し、核酸を含むペレットを70％エタノールで洗浄し、そして吸引乾燥した。ペレットを10.0mlの水に再懸濁し、等容量の4M LiCl₂と混合し、そして１時間氷上で沈殿させた。次に溶液を12,000×gで25分間、4℃で遠心した。この工程でＲＮＡがペレット化し、そしてＤＮＡは溶液中にある。ＰＣＲ分析に使用する、ＤＮＡを含有する上清を１容量の冷2-プロパノールで沈殿させ、遠心により回収し、70％エタノールで洗浄し、そして水に再懸濁した。成功裏の形質転換は、葉から単離したＤＮＡを鋳型として、ならびに配列番号４および配列番号５に掲げたＰＣＲプライマーを使用して、ＰＣＲ反応（方法は実施例２に記載）により決定した。プライマーは約1.3Kb離れたＦＴＦ遺伝子領域に特異的である。期待される1.3Kb ＰＣＲDNA断片を生成している植物だけを、トランス遺伝子について陽性とした。トランスジェニック植物中のIn2-2プロモーターおよびキメラ遺伝子の誘導 CIP:SacB:In2-1発現ベクターの誘導は、トランスジェニックタバコの葉を切り取り、即座に幹の末端をHoaglandの溶液(KCバイオケミカルズ)(200mg/lのN-(アミノカルボニル)-2-クロロベンゼンスルホンアミド:2-CBSUを含有する)に浸すことにより行った。葉の組織中のＲＮＡの誘導は、1-2時間後に起こり、最大の誘導は最初の処理から24時間後に起こる(HersheyおよびStoner、Plant Mol.Biol., 17:679-690(1991))。対照組織はトランスジェニック葉を、2-CBSUを加えない0.5 XHoagland溶液に浸漬することにより得た。トランスジェニックタバコの葉中の２−ＣＢＳＵ誘導ＦＴＦ発現の分析 6-8時間の誘導後、形質転換した葉は水にしめった(Water-logged)表現型を発生し、そして明らかにしおれた。より長い誘導(12-14時間)で、形質転換した葉は完全に破壊された。6-8時間誘導した形質転換した葉の小さな部分（カミソリで薄くスライスした）を、光学顕微鏡で見ると、細胞の内部構造が破壊されていることが示された。クロロプラストはもはや組織を保持していないが、かわりに通常は液胞が占めている細胞の中央に凝縮していた。対照の葉は(非誘導、CIP:S acB:In2-1発現ベクターを含むタバコ)は、誘導後12-14時間経過しても強固かつ緑色のままだった。トランスジェニック植物組織からのフルクタンの単離 12−14時間誘導した、CIP:SacB:In2-1で形質転換した葉からのフルクタンの単離は、可溶性および不溶性炭水化物を抽出および分離することにより行った。トランスジェニック葉からの組織(200-400mg)を、500μlの80％エタノールでミクロフュージ(microfuge)試験管中でプラスチック製乳棒で挽き、そして80℃で10 分間加熱した。加熱混合物を室温で10000Xgで10-15分間遠心した。上清を捨て、そしてペレットを500μlの80％エタノールに再懸濁し、徹底的に混合し、80℃で 10分間加熱し、そして遠心した。この工程を３回繰り返し、最終的なペレットを 200-400μlの滅菌水に再懸濁した。溶液を徹底的に混合し、そして100℃で10−2 0分間加熱し、そして10000Xgで10分間遠心した。この遠心工程からの上清は、フルクタンを含む巨大分子量の炭水化物を含み、そして本質的に可溶性糖を含まない。上清中のフルクタン検出は、実施例１に記載した任意の方法の１つで行える。この実験でトランスジェニック組織に蓄積したフルクタンの検出は、実施例１に記載した酵素結合アッセイで行った。最終的な上清への濃HClの添加、そして70℃で10分間のインキューベーション、続いてN aOHでの中和は、存在するいかなるフルクタンをもフルクトース残基に完全に加水分解するに十分である。この処理後のフルクトース濃度を、既知のフルクトース標準およびフルクタンを含有しない野生型対照と比較する。 CIP:SacB:In2-1で誘導した葉からの分析結果は、フルクタンに関して陽性であり、処理した上清中の遊離フルクトースレベルは、野生型対照に見いだされるものよりも高かった。この結果はＦＴＦ活性およびフルクタン蓄積が2-CBSUで誘導した葉の破壊をもたらしたことを示している。上記および実施例２に掲げた実験的データは、構成的に発現した細胞質ゾルＦＴＦは通常の細胞機能に有害であることを実証している。誘導した時のみの、CIP:SacB:In2-1カセットを含有するタバコ葉の破壊は、植物細胞の細胞質ゾル中で発現した時、明らかに致命的効果の原因としてこのタンパク質活性と関連している。この証拠は、バチルス(Bacillus)ＦＴＦ遺伝子またはスクロース代謝活性を細胞質ゾルに発現する同様の遺伝子のような活性を持つ酵素は、スクロース合成、スクロースの深部組織への輸送を妨害し、かつ／または細胞中の浸透圧ポテンシャルを変化させることを強く示唆している。このデータに基づき、この結果は植物細胞に対して重大な有害効果であるので、ＦＴＦまたは同様の活性を有するタンパク質を持つ植物の成功裏の形質転換はに、適切な組織特異性、あるいは亜細胞調節シグナルを考慮しなければならない。実施例４植物細胞の液胞中でのバチルス(Bacillus)ＦＴＦ遺伝子の発現葉の細胞の細胞質ゾル中での細菌ＦＴＦ遺伝子の構成的発現は、成功しなかった。これはキクイモおよびチコリーのような植物中で合成されたフルクタンが、貯蔵細胞の液胞中に蓄積するという知見とともに、ＦＴＦを液胞に標的し、その区分中のスクロースを利用することにより、有意な有害効果無く、トランスジェニック植物細胞中にフルクタンの蓄積を導くことを示唆している。化学的誘導性液胞標的ＦＴＦ発現カセットの構築双子葉サツマイモスポラミン液胞標的配列のＦＴＦへの付加報告されたＤＮＡ配列(マツオカら、J.Biol.Chem.,32:19750-19757(1990))に基づいたスポラミン液胞の標的化を、2つの別個のオリゴヌクレオチドとして合成した。オリゴヌクレオチド配列番号６および配列番号７は、操作可能に連結したキメラタンパク質をトランスジェニック植物細胞の液胞へ標的させるのに十分な３７アミノ酸プレプロ−およびプロ−ペプチドに関するコーデング情報を含む。オリゴヌクレオチドによりコードされたこのアミノ酸配列は、配列番号８に掲げる。オリゴヌクレオチド配列番号６および配列番号７も、断片を機能的発現カセット中へサブクローニングするのに有用なSpeＩ、BspHＩ、NcoＩおよびXhoＩについての制限酵素認識部位を有する。スポラミン標的配列をコードするオリゴヌクレオチドは、50mM Tris-HCl(pH7.5)、7mM MgCl、10mM 2-メルカプトエタノール、1pmole 5'-末端および1単位のT4ポリヌクレオチドキナーゼを25μl中に含む反応で、37℃で30分間インキューベーションすることによりリン酸化された。このリン酸化オリゴヌクレオチドを2容量のエタノール中で、10000Xgで20分間遠心することにより沈殿させ、そして水に再懸濁した。再懸濁後、250ngの各オリゴを混合し、100 ℃に5分間加熱し、そして室温で30分間冷却してアニールさせた。アニールしたオリゴヌクレオチドを消化し、そして予め制限酵素SpeＩおよびX hoＩで切断したBluescript SK(+)に連結した。この配列をジ−デオキシチェーンターミネーションシークエンシング法により確認し、そしてマツオカら、J.Biol .Chem.,32:19750-19757(1990)に記載されたものと比較した。スポラミン標的配列を次にBluescript SK(+)クローニングベクターから、BspHＩおよびXhoＩ消化により単離し、そしてTDS-136(予めNcoＩおよびXhoＩで消化した)に連結した。生成したプラスミド136-Sporは、化学的誘導性プロモーター領域（2-2）およびスポラミン液胞標的配列を、標的配列が天然のCIP開始コドンから翻訳されるように機能的に連結して含んた。この136-Sporプラスミドを次にNcoＩで消化し、クレノー酵素で埋めて平滑末端化し、そしてさらにXbaＩで消化した。CI-プロモーターおよび液胞標的配列を含む1.1Kb断片を単離し、そして予めXbaＩおよびEc oRVで消化したSacB:In2-1に連結した。これによりスポラミン液胞標的配列に機能的に結合したＣＩ−プロモーターを含む完全な発現カセットが得られ、これはバチルス(Bacillus)FTF遺伝子およびIn2-1転写終止配列に機能的に連結している。このCIP-Spor-SacBと呼ぶプラスミドを、BamHＩおよびKpnＩで消化した。ＦＴＦ遺伝子ならびに適当な調節および標的配列を、一本のＤＮＡ断片として単離し、そしてバイナリーベクターpZS97K（同じ制限酵素で切断した）に連結した。三親交配およびタバコ中への形質転換による発現カセットのアグロバクテリウム(A grobacterium )中への移動は、実施例２に記載した。形質転換したタバコ系中のCIP-Spor-SacB発現カセットの存在についてのアッセイは、PCR分析により（実施例２）、実施例３に記載したＦＴＦ遺伝子に特異的なプライマー（配列番号４および５）を使用して行った。タバコ中のCIP-Spor-SacB発現カセットの誘導 CIP:Spor:SacBカセットを含むPCR陽性タバコ植物から、完全に伸び成熟した葉および未成熟の8-10cmの葉を、実施例３に記載したように誘導した。CIP:Spor:S acB:In-2カセット（非標的ＦＴＦ、実施例３）の誘導は、大変短い期間にタバコの葉に顕著な害を生じさせた。この実験において、機能的液胞標的配列の付加により、同等の時間で2-CBUにより誘導された葉の表現型に有意な効果があった。タバコの葉に含有されているCIP-Spor-SacB（液胞標的ＦＴＦ）の8−10時間の誘導は、陽性対照（野生型−タバコ）の葉と比較して表現型の差異を示さなかった。液胞表現シグナルを含まない陰性対照（CIP:SacB:In2-1）の葉は、ここでも水に湿ったようになり、萎れ始めた。このCIP-Spor-SacBタバコ系は、最終的に萎れた表現型を示したが、誘導のわずか24−36時間後だった。野生型対照の葉も誘導36時間後にわずかに萎れた表現型を示したが、CIP:SacB:In2-1の葉は茶色であり、乾燥し、そして完全にこの時点で破壊された。誘導した葉の組織からの全細胞性ＲＮＡの単離 12-14時間誘導したCIP-Spor-SacBおよび野生型対照の葉を、2-CBSUを含有する Hoagland溶液またはHoagland単独から取り出し、滅菌水ですすいだ。誘導および非誘導葉からの全ＲＮＡの単離は、グアニジンチオシアネート試薬で行った。グアニジンチオシアネート試薬は、100gの瓶(コダックラボラトリーおよびスペシャリティーケミカルズ;Kodak Laboratory and Speciality Chemica 1s)の内容物を80mlの水に溶解し、そして10.6mlの1M Tris-HCL(pH7.6)および10. 6mlの200mM Na₂EDTAを加え調製した。溶液を瓶の内容物が溶解するまで撹拌し、そして4.24gのラウリルサルコシン酸ナトリウムおよび2.1mlの2-メルカプトエタノールを加えた。溶液の容量を滅菌水で212mlに調整し、そして暗室で使用するまで-4℃に保存した。葉の試料を液体窒素に浸漬することにより、素早く凍結した。いったん冷却し、10-15gの組織を乳鉢に移し、そして細かい粉に挽いた。この粉末化組織を、次に5容量(容量/重量)の氷冷グアニジンチオシアネート試薬、0.5mlのクロロホルム、0.2mlのn-オクタノールおよび2.5mlのバナジルリボヌクレオシド錯体（ベセスダリサーチラボラトリーズ、ゲチスバーグ、メリーランド州）を含んだ150ml のCorex(商標)遠心管ボトルに入れた。組織をさらに最大速度で1分間、ブリンクマンのポリトロン(Brinkman polytron)PT-10/35で挽いた。粗組織抽出物を次に2 7,000Xgで10分間、4℃で遠心した。上清を目盛りつきシリンダーにデカントし、そして各2.5mlの溶液に1gのCsClを加えた。混合物を36,000Xgで10分間、4℃で遠心し、そして生成した上清を、9/16“X3-1/2“ポリアローマー超遠心管中の5.7M CsClの2mlパッドに重層した。段階的勾配を28,000Xgで15-20時間、10℃にてベックマン(Beckman)SW41Tiローターを使用して遠心した。遠心後、管から注意深く排水し、そして両側をきれいに拭いた。ペレットを0.2mlのTES緩衝液(10mM TR IS-HCL(pH7.4)、5mM EDTAおよび1％ SDS)に溶解し、そして15mlの遠心管に移した。ＲＮＡを等容量のクロロホルム:n-ブタノール（４：１）と合わせ、そして簡単にボルテックス混合した。生成した乳液を8,000Xgで、20℃にて5分間遠心した。水性相を新しい15mlの遠心管に移し、そして有機相を等容量のＴＥＳに戻して抽出し、そして前の水性層と一緒にプールした。ＲＮＡは10容量の3.0M 酢酸ナトリウム(pH6.0)および2容量のエタノールを加えた後、少なくとも2時間で、- 20℃にて沈殿した。このＲＮＡを10,000Xgで20分間、4℃で遠心することにより回収した。上清層を注意深く吸引し、そしてＲＮＡを0.5mlの滅菌水中に溶解した。少量のアリコートを水で100倍に希釈し、そしてこの希釈水のＡ₂₆₀を測定してＲＮＡ濃度を決定した。全ＲＮＡのスロットブロット分析ニトロセルロースフィルター（シュライヒャーアンドシュエル：Schleicher a nd Schuell、BA-85）を、水に2回、10分間浸し、続いて1M酢酸アンモニウムに10 分間浸して濡らした。このフィルターをスロットブロット装置（シュライヒャーアンドシュエル、キーン、ニューハンプシャー州）に置いた。未処理の葉および2-CBSUで誘導した葉から、多くの2.5μg RNA試料を、最終容量80μlに滅菌水で希釈した。希釈後、40μlの変性緩衝液(30％ホルムアルデヒド、100mM リン酸ナトリウム(pH6.8)を各試料に加え、そしてすべての試料を65℃で10-20分間インキューベーションし、そして氷スラリー中で5分間、急速に冷却した。冷却後、3 0μlの4M 酢酸アンモニウムを各試料に加え、そして150μlの試料を、10-15mmHg 吸引により、ブロッティングセル中のスロットに加えた。フィルターをブロッティングセルから取り出し、風乾し、そして70℃で2時間、真空中で焼いた。このフィルターを、熱密閉性バッグ中の10mlのプレハイブリダイゼーション緩衝液(5 0％脱イオンホルムアミド、5XSSC、5Xデンハーツ、100μg/ml変性ウシ胸腺DNA、 40mM リン酸ナトリウム(pH6.8) および0.5％ウシ血清アルブミン)で、42℃にて6時間、時折混合しながらインキューベーションした。フィルターをニック−トランスレーションした（ＢＲＬニック−トランスレーションキット中で³²Ｐ標識した）ＦＴＦ遺伝子プローブ（1. 3Kb、EcoRV-XbaＩＤＮＡ断片、プラスミドpB311から単離し、ＦＴＦコーディング領域とのみホモロガス）とハイブリダイズさせた。これはバックからプレハイブリダイゼーション溶液を捨て、そして上記の1.25x10⁷cpmのニック−トランスレーションしたＦＴＦ遺伝子プローブを含む2.5mlのハイブリダイゼーション溶液(50％脱イオンホルムアミド、5XSSC、100μg/ml変性ウシ胸腺DNAおよび40mM リン酸ナトリウム(pH6.8))と交換して行った。ニック−トランスレーションしたＤＮＡは、10分間煮沸し、続いて氷上で急速に冷却することにより変性させた。このフィルターを次に一晩、42℃で時折混合しながらハイブリダイズさせた。翌日バックから取り出したこのフィルターを、室温で２回、10-15分間、ロッキング震盪機で、2XSSC、1mM EDTA、20mM リン酸ナトリウム(pH6.8)、1mM ピロリン酸ナトリウムおよび0.5％SDSで洗浄した。これに続いて、65℃で30分間、0. 1XSSCおよび0.5％ SDSで２回洗浄した。フィルターを簡単に風乾し、ポリスチレン食品用ラップでつつみ、そして一晩、コダック(Kodack)XAR-5フィルムおよびシングルデュポン(DuPont)Lightning Plus 増感スクリーンを使用してオートラジオグラフィーに供した。野生型のタバコは、最高48時間スロットブロットフィルターに暴露したX-線フィルムに何のシグナルも生成しなかった。しかし、22のうちの15のトランスジェニックCIP-Spor-SacB系が、ＦＴＦ遺伝子プローブと特異的にハイブリダイズし、誘導した葉からのＲＮＡを含むレーンのＸ−線フィルムだけに陽性シグナルを生成した。この誘導されたＲＮＡ量は、系によって大きく異なった。単子葉大麦レクチン液胞標的配列の使用を通して、タバコ細胞の液胞へＦＴＦの標的化 CIP-Blec-SacBの構築ＮおよびＣ−末端大麦レクチンＥＲおよび液胞標的配列に機能的に連結したＦＴＦ遺伝子を含む、化学的誘導性調節シグナルに連結した発現カセットは、始めに２つの相補的オリゴヌクレオチド（配列番号９および配列番号１０に掲げる）を合成して構築した。このオリゴヌクレオチド、配列番号９および配列番号１０は、Bednarekらに記載されたように(Plant Cell,2:1145-1155(1990);Dombrowski ら、Plant Cell,5:587-596(1993))、分泌システムに入った標的外来タンパク質をタバコの液胞中に入れるために必要であると実証された公開されたＤＮＡ配列に基づく。このオリゴヌクレオチドをリン酸化し、そして上記のようにアニールした。アニールしたオリゴヌクレオチドをBglIIおよびHincII（オリゴヌクレオチドＤＮＡ配列中に含まれる制限酵素部位）で消化し、そしてプラスミドSacB:I n2-1（予め同制限酵素で消化した）に連結した。これでプラスミドSacB:CTPP:In 2-1を得た。大麦レクチンのＣ−末端液胞標的配列（配列番号９および配列番号１０に含まれる）は、タンパク質が分泌システムに入った時のみ植物細胞の液胞にタンパク質を向けるのに十分である。Ｃ−末端大麦レクチン遺伝子のアミノ酸配列は、配列番号１１に掲げたオリゴヌクレオチドによりコードされている。大麦レクチンタンパク質も、タンパク質を分泌システムに向けるためのＮ−末端シグナルを含んでいる。このＮ−末端分泌シグナルを大麦ＤＮＡからＰＣＲ反応によりクローン化した。大麦レクチン分泌シグナルの各末端を挟む２つのオリゴヌクレオチドプライマーを、合成し、そしてPCR反応に使用した。５’プライマーのヌクレオチド配列を配列番号１２に、そして逆に相補的な３’プライマーのヌクレオチド配列を配列番号１３に掲げる。配列番号１２のオリゴヌクレオチドは、制限酵素EcoRIおよびBspHＩに関する配列認識部位も含んでいる。オリゴヌクレオチドプライマー配列番号１３は、制限酵素NcoＩおよびSalＩについての認識部位に対応する配列を含む。このプライマー（配列番号１２および配列番号１３）は、公開された大麦レクチン遺伝子のＮ−末端分泌（ＥＲ）シグナルに基づく(LernerおよびRaike l,．Plant Phys.，91:124-129(1989))。このオリゴヌクレオチドを大麦ゲノムＤＮＡとアニールし、PCR反応の鋳型として使用して行なった（実施例２に記載した方法による）。約100bpのＤＮＡ断片がPCR反応から回収され、EcoRIおよびSal Ｉで消化し、そしてクローニングベクターBluescript SK(+)（ストラタジーン、ラジョラ、カリフォルニア州）に連結した。生成したクローンをSK-5'BLECと命名した。挿入したＤＮＡ断片をシークエンシングして、ヌクレオチドが大麦５’ ＥＲシグナルについて公開された配列と同一であることを確認した。この５’大麦ＥＲシグナルは、SK-5'BlecをBspHＩおよびSal消化することにより、ＣＩ−プロモーターの開始コドンで操作可能に連結されていた。このPCR断片を、予めNcoＩおよびSalＩ消化したTDS-136に連結し、プラスミド136-BLECを得た。CIP:Blec:SacB：Blec:In2-1は、136-BlecをNcoＩ消化し、そしてクレノー酵素で埋めて平滑化し、続いてＤＮＡを沈殿させ、そして制限酵素XbaＩで消化することにより完成させた。CI-プロモーターを含み、そして５’大麦レクチンＥＲ標的配列に機能的に連結した単離ＤＮＡ断片を、XbaＩおよびEcoRV消化SacB:CTPP:In2-1プラスミドに連結した。タンパク質を細胞の液胞に向けるのに十分である大麦レクチン遺伝子からのシグナルを含む完全な発現カセット、CIP:Blec:SacB：Blec:In2-1を、BamHＩおよびKpn Ｉで消化し、バイナリーベクターpZS97Kに連結し、そして生成したプラスミドを実施例２に記載した三親交配によりアグロバクテリウム(Agrobacterium)中に転移した。バイナリーベクター中に挿入されたCIP-Blec-SacB：Blec:In2-1発現カセットで形質転換したタバコは実施例２に記載された方法によった。発現ベクターを含む陽性のトランスジェニック植物の決定は、すでに記載した方法によった（実施例２に記載したPCR反応、および実施例３に記載した細菌ＦＴＦ遺伝子に特異的なプライマー）。CI-プロモーターの誘導および標的ＦＴＦ遺伝子の発現は、実施例３に記載した誘導法によった。全ＲＮＡ抽出およびＲＮＡスロットブロット分析は、上記方法によった。野生型のタバコは最高48時間、スロットブロットフィルターに暴露したＸ−線フィルムにシグナルを生成しなかった。しかし、31の16のトランスジェニックCI P-Blec-SacB-Blec系はスロットブロット分析で、2-CBSUで誘導した葉だけが上記のように陽性に試験された。誘導されたＲＮＡ量は系により大きく異なった。 CIP-Spor-SacBまたはCIP-Blec-SacB-Blec系（液胞標的ＦＴＦ発現に比べて非標的ＦＴＦ発現）と比較して、CIP-SacB植物で実証された有意な表現型の差異は、単または双子葉植物のいずれかからの液胞標的シグナルが、ＦＴＦタンパク質をタバコ細胞中の液胞に向かわせることができることを示唆している。非標的化ＦＴＦ系の傷害を受けた葉中のフルクタン蓄積は、この、または細胞の細胞質ゾルで類似の活性をもつ酵素の発現が、ひどく破壊的で植物発生を止めてしまうという考察をさらに強める。液胞標的ＦＴＦ遺伝子の構成的発現 35S;Spor:SacB:In2-1発現ベクターの構築 35S CaMVプロモーター領域(Odellら、Nature 313:810-812(1985);Hullら、Vir ology 86:482-493(1987))、クロロフィルａ／ｂ結合タンパク質(Cab)遺伝子由来の翻訳リーダー配列(Dunsumuir,Nuc.Acids Res.,13:2503-2518(1985)、およびノパリンシンターゼ(Nos)遺伝子由来の3'転写終止領域(Depickerら、J.Mol.Appl.G enet.,1:561-570(1982))を含む、葉の発現カセットを構築した。カセットをpMH4 0と命名した。スポラミン液胞標的配列を、上記SK(+)Sporプラスミドから114bpBspHＩ−Nco ＩＤＮＡ断片として単離した。この114bp断片を、すでにNcoＩ消化したpMH40に連結した。スポラミン液胞標的配列を２つの可能な方向で挿入することができたので、幾つかのクローンを配列決定し、そして天然のスポラミンタンパク質に見いだされる５’から３’方向に含むクローンをpMH40:Sporと命名した。プラスミドSacB:In2-1をBamHＩおよびEcoRVで消化し、そしてCaMV 35Sプロモーターを含むＤＮＡ断片に連結し、液胞標的配列と融合し、NcoＩで消化したpMH40：Sporから単離し、クレノー酵素で埋めて平滑化し、そして最後にBamHＩで消化した。この完全な構築物を35S:Spor:SacB:In2-1と呼ぶ。35S:Spor:SacB:In2-1植物発現を含有するＤＮＡ断片を、BamHＩおよびKpnＩで消化して単離し、そしてバイナリーベクターpZS97Kに連結した。このベクターをアグロバクテリウム(Agrobacterium)に転移し、これを次にタバコに転移したものを実施例２に記載した葉のディスク感染を行った。35S:Spor:SacB:In2-1発現カセットを含む植物は、実施例２でも記載されたようなPCR反応で、予想される大きさのＤＮＡ断片を生成することにより同定された。ＦＴＦ遺伝子に特異的なPCRプライマーは、実施例２に記載してある。15の陽性なトランスジェニックタバコ系が土壌に植えられ、成熟するまで栽培された。フルクタンの存在に関する35S:Spor:SacB:In2-1形質転換植物の分析 35S:Spor:SacB:In2-1形質転換植物の葉からの巨大分子量炭水化物ポリマーの単離は、実施例３に記載したエタノール沈殿により行った。エタノール不溶性抽出物を２つの画分に分け、１つを1M塩酸で100℃、10分間加水分解し、続いて1M NaOHで中和した。第２画分を実施例１に記載したＴＬＣ法でアッセイした。野生型の葉は酸処理または未処理抽出物中にシグナルを生成しなかった。このデータは、タバコが内因性フルクタンを蓄積しないことを示している。対照的に試験した４つの中の２つの形質転換植物が、ＴＬＣプレートで原点から移動しない陽性のシグナルを生成し、そのポリマーが大分子量であることを示唆した。陽性植物からの抽出物も、酸処理レーンでフルクトース対照が移動した距離と同じところまで移動した陽性シグナルを生成した。さらにグルコース対照単独または澱粉をスポットしたＴＬＣプレートは、陽性シグナルを生成しなかった。ＨＣｌで処理した、または未処理のチコリーのフルクタンは、トランスジェニックタバコ抽出物の結果と同じであった（すなわち、未処理レーンが原点から移動しないシグナルを生じ、そしてＨＣｌ処理試料がフルクトースと同じ原点からの距離まで移動した）。合わせると、この結果は大分子量炭水化物ポリマーが35 S:Spor:SacB:In2-1形質転換植物のみに蓄積し、そしてこのポリマーは酸処理により遊離するフルクトース残基から成っていた。エタノール不溶性抽出物のアントロン分析上記記載のように得られた35S:Spor:SacB:In2-1形質転換植物からの抽出物を、100℃で濃HClと10分間インキューベーションし、そしてNaOHで中和した。この処理はフルクタンポリマーを個々のフルクトース残基に加水分解するのに十分である。HCl処理試料を、次に実施例１に記載した定量的アントロン分析によりフルクトースについてアッセイした。アントロンによりアッセイされる画分はエタノール不溶性であったので、この炭水化物は大分子量であると測定された。アントロン分析の結果は、この発現ベクターでタバコ中に蓄積するフルクタンの最高レベルは、葉の乾燥重量の約１−２％であることを示す。 35S:Spor:SacB:In2-1形質転換植物の１つを除くすべてが、成熟し、そして種子をつけた。幾つかの発育阻害が見られたが、他の正常な植物中でのフルクタンの存在は、液胞標的ＦＴＦ遺伝子が、トランスジェニック植物中でこの大分子量フルクトースポリマーの合成および蓄積のために許容できる方法であることを実証している。実施例５トランスジェニックジャガイモ中でのＦＴＦの発現ジャガイモ塊茎特異的、細胞質ゾル発現カセットの構築貯蔵タンパク質、パタチンプロモーターを、PCR反応（実施例２に記載した反応）により、配列番号１４および配列番号１５に記載したオリゴヌクレオチドプライマーを使用して単離した。このプライマーは公開されたクラスＩパタチン配列に基づく(Rocha-Sosaら、EMBO J．8:23-31(1989))。配列番号１５は開始コドンに酵素NcoＩの認識配列も含む。 PCR反応から単離した1.0Kb ＤＮＡ断片（ゲノムジャガイモＤＮＡを鋳型として使用した）を、SmaＩ消化クローニングベクターpUC18(ニューイングランドバイオラボス、ベヴァリー、マサチューセッツ州)に連結した。このプラスミドをpPPR001と命名した。ジャガイモ塊茎中の組織特異的発現に十分である、パタチンプロモーター領域を含むプラスミドpPPR001を、HindIIIおよびHicIIで消化した。1.0Kb断片を単離し、そしてHindIIIおよびSmaＩで消化したBluescript SK (+)および(-)(ストラタジーン、ラジョラ、カリフォルニア州)に連結した。プロモーター断片を2つの方向で回収した。ＦＴＦ遺伝子の正しい発現のために適切な方向であると定めたのものをPatBと命名した。このPatBプラスミドをNcoＩで消化し、そして５’突出ヌクレオチドをクレノー酵素で埋めて平滑化した。BamHＩでの第２消化により、完全な開始コドンを持つパタチンプロモーターを含む1.0Kb断片を単離した。この断片をBamHＩおよびE coRV切断SacB:2-1プラスミドに連結し、発現カセットPatB:SacB:2-1を得た。Pat B:SacB:2-1を、BamHＩおよびKpnＩで消化し、2.8Kb断片を単離し、そしてpZS97K に連結し、トランスジェニックジャガイモ塊茎中でＦＴＦ遺伝子を組織特異的に発現できる発現カセットを含むバイナリーベクターを導いた。このバイナリーベクターを実施例２に記載したようにアグロバクテリウム(Agrobacterium)中に転移した。ジャガイモ形質転換バイナリーベクターのジャガイモ中への形質転換は、次のとおりである：NPTI I遺伝子を選択マーカーとして使用して、葉のディスク法をジャガイモの形質転換に使用した。ジャガイモ(カルチバーデジレ：cultivar Desiree)から滅菌した葉のディスクを、バイナリーベクターpZS97K中に挿入された塊茎特異的FTF発現カセットを含有するアグロバクテリウムツメファシエツス(Agrobacterium tum efaciens )LBA4404株と同時培養した。S2培地中、低光下で48時間同時培養した。アグロバクテリウム(Agrobacterium)との同時培養後、葉を1g/Lカルベニシリンを含有するS2培地で洗浄し、乾燥し、そして50mg/Lのカナマイシン含有S3培地上に置いた。高光強度で１週間後、葉のディスクを、50mg/Lのカナマイシンを含有する新しいS3に移した。この培地上で小さなカルスが２週間後に形成し、これを 50mg/Lのカナマイシンを含有するS5培地に移し、さらに2-3週間培養した。この間にさらにカルスが発生し、これを次に50mg/Lのカナマイシンを含有するS7培地に移した。２週間の間に、このカルスはS7培地上に小さい苗条を発生した(約0.5 cmの高さ)。この苗条を切り出し、そして100μg/Lのカナマイシンを含有する発根培地に置いた。このように移した2週間後に、苗条は葉からＤＮＡが抽出できる点まで発達し、そしてPCRによりＦＴＦ遺伝子の存在を分析した（すでに実施例２に記載したように）。PCR反応に使用したプライマーは、ＦＴＦ遺伝子に特異的であった（配列番号４および配列番号５）。陽性の系をさらに分析するために土壌で栽培した。Ｓ２培地３０ｇ／Ｌスクロース０.５ｇ／ＬＭＥＳｐＨ５.５２０ｇ／ＬマンニトールＳ３培地２００ｍｇ／Ｌグルタミン０.５ｇ／Ｌ２−［Ｎ−モルホリノ］エタンスルホン酸（ＭＥＳ）（ｐＨ５. ７）０.５ｇ／Ｌポリビニルピロリドン２０ｇ／Ｌマンニトール２０ｇ／Ｌグルコース４０ｍｇ／Ｌアデニンサルフエート０.５％アガロース１ｍｇ／Ｌトランス−ゼアチン０.１μｇ／Ｌナラジクス酸１ｇ／ＬカルバニシリンＳ５培地２００ｍｇ／Ｌグルタミン０.５ｇ／Ｌ（ＭＥＳ）（ｐＨ５.７）０.５ｇ／Ｌポリビニルピロリドン２０ｇ／Ｌマンニトール２０ｇ／Ｌグルコース４０ｍｇ／Ｌアデニンサルフエート０.５％アガロース１ｍｇ／Ｌトランス−ゼアチン１ｇ／ＬカルバニシリンＳ７培地２００ｍｇ／Ｌグルタミン０.５ｇ／ＬＭＥＳ（ｐＨ５.７）０.５ｇ／Ｌポリビニルピロリドン２０ｇ／Ｌマンニトール２０ｇ／Ｌグルコース４０ｍｇ／Ｌアデニンサルフエート０.５％アガロース１ｍｇ／Ｌトランス−ゼアチン０.０１μｇ／Ｌジベレリン酸１ｇ／Ｌカルバニシリン発根培地２００ｍｇ／Ｌグルタミン０.５ｇ／ＬＭＥＳ（ｐＨ５.７）０.５ｇ／Ｌポリビニルピロリドン２０ｇ／Ｌスクロース２０ｇ／Ｌマンニトール２０ｇ／Ｌグルコース４０ｍｇ／Ｌアデニンサルフエート１５０ｍｇ／ＬＣａＣｌ₂ ０.４％アガロース１ｍｇ／Ｌトランス−ゼアチン１００ｍｇ／Ｌカルバニシリントランスジェニックジャガイモ植物の分析トランスジェニックジャガイモ系および非形質転換、天然の対照を、涼しい低光の成長室条件下(22℃で12時間の日長、そして20℃で12時間の暗室)で、土壌中で成熟し塊茎を形成するまで栽培した。トランスジェニックジャガイモ植物の表現型分析野生型および形質転換陰性対照(バイナリーベクターpZs97Kでのみ形質転換した)と比較した陽性PatB:SacB:2-1は、劇的に異なる表現型を示した。土壌に移した若い植物は対照と同じ大きさであった。しかし、植物が成熟した時、トランスジェニック系は野生型よりもかなり水に湿っていた。発育阻害は様々であるが、トランスジェニック系の中にはひどいものがあった。土壌に植えた約６−８週間後に、野生型および形質転換陰性対照は、同じ植物中で大きさが異なる幾つかの塊茎を発生した。トランスジェニック系の葉は分解し続け、大きな壊死領域を発生した。形質転換した植物の６つのうちの２つには塊茎が発生せず、着色せず、そして残りの系もひどく小さかった。PatB−SacB（非標的ＦＴＦ発現物）の多く、トランスジェニック系は数多くの小さい緑色の塊茎(気生塊茎：aerial tuber として知られている)を、植物の基に形成した。気生塊茎は、真の塊茎ではないが、塊茎への炭素輸送が障害される時、スクロースの出口(outlet)を表す。この状態はすべての対照系に存在しなかった。小さい形質転換した塊茎から植物を再生する試みは失敗した。しかし対照は、予想通り塊茎から植物を生じた。フルクタンの存在に関する気生塊茎の分析小さい緑の気生塊茎をエタノール中で、実施例３の葉の抽出で記載したように挽き、実施例４に記載したようにＨＣｌで処理した、あるいはしなかった。フルクタンのアッセイはＴＬＣによるものだった（実施例１に記載）。野生型および形質転換した陰性対照からの塊茎は、ＴＬＣで検出できるシグナルを生成せず、真のジャガイモ塊茎が内因性のフルクタンを含まず、あるいは蓄積しないことを示していた。PatB−SacB構築物を含有するトランスジェニック系は、いずれもＴＬＣプレートで陽性シグナルを生じなかった。極度な成長阻害、気生塊茎の形成およびフルクタンの欠失は、発生している塊茎細胞の細胞質ゾルでのＦＴＦ遺伝子の発現が、細胞性の発生に有害であることを強く示唆している。この効果は、未成熟塊茎へのスクロース輸送の妨害によるものかもしれない。この実験での塊茎細胞の阻害は、タバコの葉もの細胞の細胞質ゾルで発現したＦＴＦタンパク質により阻害された実施例３で得られた結果に類似している。幾つかの研究(OparkaおよびWright、Planta,175:520-526(1988) およびOparkaおよびWright、Planta,174:123-126(1988))は、浸透圧ポテンシャルが塊茎発生に決定的に重要で、破壊により発生している塊茎にスクロース輸送が妨害れて、塊茎の成長を遅らせる、または阻害することができる、ということを実証した。ここでの結果は、未成熟塊茎細胞の細胞質ゾル中のＦＴＦ活性を介するスクロース輸送の破壊のために阻害された塊茎発生と矛盾しない。液胞標的、塊茎特異的ＦＴＦ遺伝子の構築 PatBプラスミドをNcoＩで消化し、クレノー酵素で埋めて平滑化し、続いてXho Ｉ消化した。スポラミン液胞標的配列を、BspHIおよびXhoIで消化したスポラミン配列(実施例４)を含むBluescript（＋）サブクローニングベクターからの断片の単離後にこのプラスミドに連結した。生成したプラスミドをPatB:Sporと命名した。PatB：Sporを次にNcoＩで消化し、クレノー酵素で埋めて平滑化し、そして第２の制限酵素SpeIで消化した。これにSacB:In2-1から単離した断片を連結した。SpeIおよびEcoRV制限エンドヌクレアーゼで消化した後、1.8Kb断片を単離した。生成したプラスミドをPatB:Sp or:SacB:In2-1と命名した。完全なプラスミド(PatB:Spor:SacB:In2-1)は塊茎特異的プロモーター、ＦＴＦコーディング領域に操作可能に連結した液胞標的シグナル、および転写終止領域を含んだ。これを、BamHＩおよびKpnIで消化し、発現断片を単離し、アグロバクテリウム(Agrobacterium)中に形質転換するために、バイナリーベクターに連結した。(Agrobacterium)中の形質転換も、実施例２に記載した三親交配によった。このベクターによるジャガイモの形質転換は上記方法により行った。陽性に形質転換したジャガイモ系を、実施例２に記載したように実施例３に記載したＦＴＦ特異的プライマーを使用してPCR分析で同定た。野生型ジャガイモ系は、PatB:Spor:SacB:In2-1トランスジェニック系と一緒に、上記条件下で成熟するまで栽培された。PatB:Spor:SacB:In2-1トランスジェニックジャガイモ系のＲＮＡ分析実施例４のタバコ葉のＲＮＡ単離のために記載された方法により、発生している塊茎から、全ＲＮＡを抽出した。単離されたＲＮＡを1％アガロースゲル(3％ホルムアミドを5mM テトラホウ酸ナトリウム、0.18mM EDTA二ナトリウム中に含む)で分離した。分離したＲＮＡは、20XSSCを使用してZetaprobe(商標)膜に移し、適当な³²Ｐ標識ＤＮＡプローブ断片(pB311 EcoRV-XbaI、1.3Kb DNA断片、ＦＴＦコーディング領域とホモロガス)で、45℃でブロットハイブリダイゼーション、2XSSC、0.1％SDSで25℃で3回、次に0.1XSSC、0.1％SDSで55℃で3回洗浄した。形質転換した遺伝子からのＲＮＡ転写物を、12-48時間X-線フィルムに暴露することにより視覚化した。 PatB-Spor-SacB（液胞標的化ＦＴＦ発現物）構築物で形質転換した塊茎のノーザン分析は、pB311プローブとハイブリダイズした時、シグナルを生成した。野生型塊茎またはバイナリーベクターpZS97Kのみを含む塊茎中ではシグナルは見いだされなかった。ＲＮＡ転写物レベルは、トランスジェニック系によって大きく異なった。Spor-SacB遺伝子を発現している塊茎のフルクタン分析葉からの大分子量炭水化物の抽出のために、実施例３に記載したように塊茎をエタノール中で挽いた。抽出物を実施例４に記載したようにＨＣｌで処理し、実施例１に記載したようにＴＬＣにより、フルクタンをアッセイした。野生型塊茎および形質転換した対照系（バイナリーベクターだけを含んでいる）は、ＴＬＣで検出できるシグナルを生成せず、ここでも、ジャガイモ塊茎が内因性のフルクタンを蓄積しないことを示していた。５つのうちの２つのPCR陽性塊茎が、ＴＬＣプレートで視覚化したシグナルを生成し、ＴＬＣでは未処理試料レーンが原点から移動せず、そして酸加水分解試料は、フルクトース対照と同じ距離を原点から移動した。澱粉未処理または酸処理試料は、ＴＬＣプレートで陽性シグナルを生成しなかった。このデータは、トランスジェニック塊茎細胞の液胞中で大分子量フルクタンの合成および蓄積を実証している。液胞標的SacB FTF遺伝子を発現している塊茎中のフルクタンの存在、そして非標的FTFベクターがジャガイモ中で形質転換した時の植物の破壊および塊茎成長阻害は、このスクロース代謝遺伝子の細胞質ゾルの発現が植物細胞に有害であることを明らかに示している。非標的FTF形質転換塊茎とは対照的に、この実験からの塊茎は、土壌で発芽し、そして成熟して塊茎も形成した。実施例６メイズ中での液胞標的ＦＴＦ遺伝子の組織特異的発現プロモーターの配列を含む10KDゼイン遺伝子のヌクレオチド配列は、キリハラら、Gene,71:359-370(1988)に見いだすことができる。本発明で使用するトウモロコシ胚乳特異的発現ベクターの構築は、プロモーター領域およびコーディング配列の一部を含む10kDゼイン遺伝子の５’末端の単離から始まった。これは公開されている配列を使用して、PCR反応に使用するオリゴヌクレオチドを作成することにより行われた。配列番号１６および配列番号１７に記載したオリゴヌクレオチドも、PCR DNA断片をクローニングベクターpTZ18(ファルマシア:Pharmacia 、ニューブルンスウィック、ニュージャージー州)にクローニングする目的のために、制限エンドヌクレアーゼ認識配列を含む。配列番号１６は酵素EcoRVの認識部位を含み、そして配列番号１７はXbaI認識部位を含む。 PCR反応からの1.4Kb ＤＮＡ断片を回収し、そしてEcoRVおよびXbaIで消化し、そして予めSmaIおよびXbaIで消化したpTZ18にサブクローン化した。生成したプラスミドをp10K1と命名し、これは-95-から450のゼインヌクレオチド配列（塩基１として翻訳開始コドンのアデノシンヌクレオチドを使用する）を含んだ(キリハラ、Gene,71:359-370(1988))。オリゴヌクレオチド配列番号１８および配列番号１９を使用する第２のPCR反応は、1.39Kb DNA断片を生成し、これはヌクレオチド１から1395から成っていた。配列番号１９は、エンドヌクレアーゼBamHＩの認識部位を含み、そしてPCR断片をBamHＩで消化し、そしてpTZ18のBamHＩおよびSmaI部位に挿入した。このベクターをp10K3と命名した。プロモーター領域およびコーディング配列を含む完全なゼイン遺伝子を、２つのプラスミド(p10K1およびp10K3)から、夫れ夫れの独特のSpeＩ制限酵素部位の使用を介して再構成した。p10K1をEcoRIおよびSpeIで消化し、そして994bp断片を単離した。この断片を同じ２つの酵素で消化したp10K3に連結し、今ベクターpCC3と命名した完全なゼイン遺伝子を得た。このベクターに、またはこのベクターから断片をサブクローニングし易くするために、制限酵素部位をさらに修飾した。独特のSmaI制限酵素部位を、XbaIでの消化によりコーディング領域(1500bp)の5'末端に加え、そしてオリゴヌクレオチド配列（配列番号２０および配列番号２１に掲げる）を加えた。このオリゴヌクレオチドは標準的なＤＮＡ操作法により合成、リン酸化、アニール、そしてpCC3 に連結された。本発明の10kDゼインプロモーター領域を、プラスミドpCC3から単離した。これはpCC3をEcoRIで消化し、続いてクレノー酵素を使用して埋めて平滑化することにより行われた。このEcoRI平滑化プラスミドを次にSmaIで消化し、そして10kD ゼイン遺伝子のプロモーター領域を含む923bp DNA断片を単離し、そして予めHin cIIで消化したプラスミドBluescript SP(+)（ストラタジーン、ラジョラ、カリフォルニア州）に連結した。生成したプラスミド(SK(+)10 KDと呼ぶ)を、NcoIおよびXhoIで消化した。上記SK-SPorから単離したスポラミン液胞標的配列を含む、BspHＩおよびXhoＩ消化断片を、SK(+)10KDに連結した。生じたNcoI-XhoI消化プラスミドを10kD-Sporと命名した。このプラスミドをNcoIで消化し、クレノー酵素で埋めて平滑化し、続いて制限酵素ＳpeIで二度目の消化を行った。サツマイモスポラミン液胞標的配列に操作可能に連結された、トウモロコシ種子特異的プロモーターを含むＤＮＡ断片を単離し、そして予めSpeIおよびEcoRIVで消化したプラスミドSacB;In2-1に連結し、最終的な発現カセット10kD-Spor;SacB:In2-1を得た。このカセットを、粒子衝撃によりトウモロコシ中への形質転換に直接使用した。細菌ＦＴＦ遺伝子でのメイズの形質転換カルス培養は、受粉後10から12日後の遺伝型A188およびB73の交配に由来する種子から切り取った未成熟胚(約1.5から2.0mm)から開始した。胚を軸−側が下に向き、そしてアガロース−固体化Ｎ６培地と接触するよう置いた。胚を27℃で暗室に維持した。胚柄構造によりかかった前胚様体および胚様体を有する未分化の細胞塊から成る脆い胚形成カルスは、これらの未成熟胚の胚盤から増殖する。第一エクスプラントから単離したこの胚形成カルスを、N6培地で培養し、そして２ −３週間毎にこの培地で継代培養した。粒子衝撃法は、遺伝子をカルス培養細胞に転移するために使用した。Biolisti c(商標)PDS-1000/He(デュポンメディカルプロダクツ:Dupont Medical Products) をこれらの実験に使用した。選択性マーカー遺伝子を含むプラスミドベクターを形質転換に使用した。このプラスミド、pALSLUC(Frommら、Biotechnology,8:833 -839(1990)は、メイズのアセトラクテートデヒドロゲナーゼシンターゼ（ＡＬＳ）遺伝子を含む。このALS cDNAを、その遺伝子によりコードされる酵素がクロロスルフロンに耐性になるように、インビトロで突然変異させた。この変化は、cD NAの1626位のトリプトファンコドンをロイシンコドンに突然変異させることから成る。このＡＬＳ遺伝子はCaMV 35Sプロモーター(Odellら、Nature 313:810-812 (1985))およびアグロバクテリウムツメファシエンス(Agrobactyerium tumefacie ns )のTiプラスミドのT-DNAに由来するノパリンシンターゼ遺伝子の3'領域の制御下にある。プラスミドpALSLUCを金粒子の表面に沈殿させた。このために、5μgのpALSLUC (Tris-EDTA緩衝液中に濃度約1μg/μl)を、水に懸濁した(1mlあたり60mgの金)50 μgの金粒子(平均直径1μm)に加えた。次に塩化カルシウム(2.5 M溶液を50μl) およびスペルミジン(1.0M 溶液を20μl)を、金−DNA懸濁に加え、試験管をボルテックス混合した。次に粒子を10秒間マイクロフュージ(micrpfuge)で遠心し、そして上清を除去した。次に粒子を200μlの無水エタノール中に再懸濁した。粒子を再度遠心し、そして上清を除去した。粒子を次に30μlのエタノールに再懸濁した。5μlのDNA-被覆金粒子を、次に各々のマクロキャリアーディスク上に乗せた。胚形成カルスの小さいクラスター（直径2-3mm）を、直径12cmのペトリ皿に入れたアガロース−固体化Ｎ６培地上に並べた。組織が約6cmの直径を覆った。組織を含むペトリ皿をPDS-1000/Heのチャンバーに置いた。チャンバー中の空気を、711mm Hgの真空になるように吸引した。マクロキャリアーは、衝撃管のHe圧が 1000psiに達した時、破裂する破壊膜を使用して、ヘリウムの衝撃波で加速した。組織をストッピングスクリーンから約8cmの所においた。組織のプレートはDNA -被覆金粒子で衝撃した。衝撃の７日後、組織を50mM のクロルスルフロン、そしてカゼインまたはプロリンが欠けたＮ６培地に移した。組織をこの培地上でゆっくりと成長させ続けた。さらに2週間後、組織をクロルスルフロンを含む新たなN6培地に移した。8週間後、活発に成長しているカルスの直径約1cmの領域を、クロロスルフロン-補充培地を含むプレートの1つで確認した。このカルスは選択培地で継代培養した時、成長し続けた。このカルスのいくつかを、植物再生可能な培地に移した。Ｎ６培地成分リットルあたりの量溶液Ｉ 10.0ml CaCl₂(1M) 1.25ml 溶液III 10.0ml MgSO₄(1M) 0.75ml 溶液V 1.0ml ビタミンストック 1.0ml カゼイン加水分解物 0.1g スクロース 60.0g ミオーイノシトール 0.1g 2,4-D(2mg／mlストック) 0.5ml pHを5.8 6gのアガロースをプレートに加える溶液Ｉ (NH₄)₂SO₄ 23.0g KNO₃ 141.5g KH₂PO₄ 20.0g H₂O 500.0ml 溶液III Na₂EDTA 1.85g FeSO₄・7H₂O 1.35g H₂O 500.0ml 溶液V H₃BO₃ 0.16g MnSO₄・H₂O 0.33g ZnSO₄・7H₂O 0.15g KI 0.08g Na₂MoO₄・2H₂O 0.025g CUSO₄・5H₂O 0.0025g COCl₂・2H₂O 0.0025g H₂O 100.0ml ビタミンストックナイアシン 0.13g チアミン 0.025g ピリドキシン 0.025g パントテン酸カルシウム 0.025g H₂O 100.0ml形質転換したカルスのサザン分析導入されたキメラＦＴＦ遺伝子の検出のために、カルスについてサザン分析を行った。サザン分析は実施例２に記載したように、ＤＮＡ抽出法により、カルス組織からゲノムＤＮＡを単離して行った。ＤＮＡを形質転換したカルス系、または対照として同じ遺伝型であるが形質転換していないものからのカルスから単離した。ゲノムＤＮＡをBglIIで消化した。この消化ＤＮＡをアガロースを通すゲル電気泳動により分画し、そして標準法を使用してナイロン膜に移した。ナイロンブロットは、ニック−トランスレーションしたEcoRV-XbaI DNA断片(プラスミドpB311から単離した)とハイブリダイズさせた。プローブはＦＴＦ遺伝子からのコーディング配列だけを含有する。ＦＴＦ形質転換カルスは、キメラ遺伝子に対応する主要バンドを表した。さらに様々な分子量のバンドが、発現カセットの再配列コピーであると予想された。トランスジェニックメイズ植物のサザン分析成熟したメイズの葉からＤＮＡを、実施例２に記載した抽出法で抽出した。非形質転換陰性対照植物およびトランスジェニック系を、I0KD-Spor:SacB:In2-1発現カセットの存在について、PCR分析により実施例２に記載した方法およびプライマーならびに実施例３に記載したＦＴＦ特異的プライマーを使用してアッセイした。さらに、ゲノムＤＮＡをBglIIで完全に消化し、断片を1.0％アガロースゲルで分離し、ＤＮＡを20XSSCを使用してHybond M膜に移し、そしてブロットをジゴキシゲニン標識ＤＮＡ断片とハイブリダイズさせた。標識ＤＮＡ断片を、制限酵素 EcoRVおよびXbaＩでの消化によりプラスミドpB311から単離した。この断片は細菌ＦＴＦ遺伝子からコーディング配列だけを含んだ。ブロッティング法、プローブ断片のジゴキシゲニン標識、ハイブリダイゼーションおよび洗浄条件、ならびにシグナルの抗体による視覚化は、Genius(商標)ブロッティングキット（USB、クリーブランド、オハイオ州）に記載されていた。トランスジェニック植物のサザンブロッティング分析は、多くの10kD-Spor:SacB:In2-1カセットの完全な挿入コピーおよび再配列コピーを示した。完全なカセットを含むこれらのトランスジェニック系だけが、陽性系であると考えられた。トランスジェニックメイズ種子のフルクタンの存在に関するＴＬＣによる分析 10KD-Spor:SacB:In2-1形質転換系を、温室で栽培し、そして受粉30-35日後または成熟時に、個々の種子をフルクタンの存在についてアッセイした。同じトランスジェニック植物から個々の種子の多くの組を、実施例３に記載した炭水化物抽出法により、80％エタノール中で挽いた。抽出物を実施例５に記載した方法によりＨＣｌで処理し、そして試料を実施例１に記載したようにＴＬＣプレートで分析することによりフルクタンを含有するか測定した。非形質転換対照系は、ＴＬＣでフルクタンについて陽性シグナルを生成せず、トウモロコシが種子中で内因性フルクタンを合成または蓄積しないことを示した。試験した１５のうちの８つのメイズ系が、ＴＬＣによりフルクタンに関して陽性であった。PCRおよびサザン分析により陽性と決定されたトランスジェニック系はすべて陽性のＴＬＣシグナルを生成した。未処理レーンではフルクタンシグナルは原点から有意に移動せず、抽出物がＴＬＣにスポットされる前、酸で加熱処理された時はフルクトース対照と同じ距離まで移動した。このデータは10kD-Spor:SacB:In2-1発現カセットで形質転換されたトウモロコシ種子中でのみ、大分子量フルクトースポリマーがで合成そして蓄積されることを示している。アントロンアッセイによる分析成熟した、乾燥種子を挽いて、そしてエタノール不溶性抽出物を実施例３のように調製した。実施例５に記載したアントロン法によりアッセイした陽性の形質転換系および陰性の対照（野生型トウモロコシ）抽出物を、以下の表３に要約する。表３からのデータは、フルクタンが発現ベクター10Kd-Spor:SacB（液胞標的ＦＴＦ）で形質転換したトウモロコシ種子のエタノール不溶性画分に蓄積することを示し、そしてこれらの系でのフルクタンの蓄積が成熟までの成長を妨害しないことを示している。各々の系からの種子を成熟時に収穫し、乾燥し、そして土壌にまいた。形質転換した植物から得た種子の発芽率は、非形質転換対照系の種子で示されたものと変わらなかった。実施例７細胞質ゾルまたは液胞標的SacB発現カセットを含有するトランスジェニックトウモロコシ系 10kD-SacBの構築 10kD-ゼインプロモーターにより転写的に調節されるバチルスSacB遺伝子を含む発現カセットを、実施例２に記載したようにプラスミドpSSU-SacBを制限酵素S alＩで消化し、続いてクレノー酵素を使用して平滑末端に埋めることにより構築した。NcoＩでの２回目の酵素消化により、アガロースゲル電気泳動による1.3kb断片が単離できた。この1.3kb NcoＩ/SalＩの平滑末端に埋めた断片を、予めNcoＩおよびSmaＩで消化したプラスミドpCC3（実施例３に記載）に連結した。生成した組換えプラスミドを10kD-SacBと命名した。内胚乳細胞の細胞質ゾルでSacB遺伝子の組織および発生特異的発現に十分である完全な発現カセット、10kD-SacB（10kDゼインプロモーター含有）を、実施例６に記載したように粒子衝撃によるトウモロコシの形質転換に直接使用した。10kD-SacB発現カセットを含有するトランスジェニック種子の表現型の特性決定 10kD-SacBカセットを含有するトランスジェニックトウモロコシ系を、温室条件下で栽培し、そして自家受粉させた。10kD-SacBカセットを含有するトランスジェニックトウモロコシ種子は、表現型的に、発生初期においては野生型の種子と容易に区別できなかった(受粉10-15日後)。しかし、成熟した種子は、ひどく縮んだ表現型で、野生型（10kD-SacBカセットを含有しないトランスジェニック種子）とは同じ穂で劇的に異なった。種子の重量差を以下の表４に示す。10kD-SacB発現カセットを含有するトランスジェニック種子の分析フルクタンの存在について分析するトランスジェニックおよび野生型種子は、成熟時(受粉後約45-55日)に集めた。通常のデント(dent)または縮んだ表現型を示すいくつかの種子を、実施例１に記載したＴＬＣ法によりフルクタンについてアッセイした。縮んだ表現型の種子のみが、尿素−リン酸で染色されたＴＬＣプレートで陽性を生じた。この陽性のフルクタンシグナルはＴＬＣプレートで原点から移動せず、高分子量のポリマーを示唆している。デントまたは縮んだ表現型を示す種子中のフルクタンの定量的分析は、実施例５に記載したアントロン法により行った。乾燥重量に基づく種子の重量およびパーセントフルクタンを、表４に掲げる。ＴＬＣ分析および表４のデータは、デント表現型の種子(654#6、7および8)がフルクタンを蓄積せず、ひどく縮んだ表現型（654#１から５）の種子だけがこのポリマーを合成した。このデータから、トウモロコシ胚乳のSacB遺伝子の細胞質ゾル発現は、劇的に胚乳の発生に影響することが明らかである。胚乳の発生は、 10kD-SacBカセットを含む種子中の乾燥物質の蓄積が減少することにより影響を受けるかもしれない。澱粉がフルクタン含有種子中に存在したが（ヨウ素での染色により判断）、種子重量中の１０倍の損失を考慮すると、澱粉の量はかなり少なかった。10kD-SacBカセットを含有する種子の発芽縮んだ表現型を示す15個の種子をメトロ−ミックス土壌中に植えて、温室条件下で発芽させた。３週間の間に、１５のうちの１つだけが発芽した（0.067％の発芽率）。１つの小さい苗条(3.7cm)は、元気がなく、そして2−3日後まで生存しなかった。土壌とは対照的に、スクロースを含有する固体培地(#64培地)で発芽した10個のトランスジェニック種子は、3本の苗条を生じた（30％の発芽率）。３本すべてが、通常に発生し、成熟し、種子をもうけた。 10kD-SacB発芽アッセイの結果は、胚乳組織の細胞質ゾルでのフルクタンの蓄積が、種子の発生を変化させ、おそらく種子中の栄養素（特に炭水化物）の蓄積阻害によることを強く示唆している。この結果はひどい発芽率の減少および種子の生存率であった。６４培地成分リットルあたりの量 SchenkおよびHildebrandt 基本塩(Sigma #S6765) 1.6g NitschおよびNitsch ビタミンストック(Sigma #N0390) 1.0ml スクロース 10.27g10kD-Blec-SacBの構築 10KDゼイン遺伝子プロモーターに操作可能に連結した，ＮおよびＣ−末端大麦レクチンＥＲおよび液胞標的配列ｃ機能的に連結したバチルス SacB遺伝子を含む発現カセットを、始めにＣ−末端、液胞標的配列をプラスミドSacB:In-2に付加して構築し、実施例４に記載したプラスミドSacB:CTPP:In2-1を得た。実施例４に記載した、プラスミドSK-5’BLECに含まれる大麦Ｎ−末端シグナルを、プラスミドpCC3(実施例６に記載)に含まれる10kDゼインプロモーターに連結した。これはSK-5’BLECを酵素BspHIおよびXhoIで消化して行った。この消化により単離した断片をpCC3に連結し、NcoＩおよびXhoIで消化してプラスミドpCC3- BLECを得た。この発現カセットは、pCC3-BLECをNcoＩで消化し、そしてクレノー酵素で平滑末端に埋めることにより完成された。実施例４に記載したようにＤＮＡを沈殿させ、水に再懸濁し、そして再度XbaＩで消化した。5'大麦レクチンＥＲシグナルに機能的に連結した10KDゼインプロモーターを含む断片の単離物を、すでにXbaIおよびEcoRVで消化したプラスミドSacB:CTPP:In2-1に連結した。組織および発生特異的10kDゼインプロモーターを、大麦レクチンからのERおよび液胞分類シグナルに加えて含む完成した発現カセット、10kD-BLEC-SacBは、Sa cBタンパク質を細胞の液胞に向かわせるのに十分である。このカセットは、実施例６に記載したように粒子衝撃によりトウモロコシ中で形質転換させるために直接使用された。トランスジェニックメイズ種子のフルクタンの存在に関するＴＬＣアッセイによる定性的分析 10kD-BLEC-SacB形質転換系を温室で栽培し、そして受粉後30-35日、または成熟時（受粉後45-55日）に、フルクタンの存在について個々の種子をアッセイした。いくつかの再生系からの多くの種子を実施例１に記載したように、ＴＬＣアッセイによりフルクタンの存在についてアッセイした。試験した６つのトウモロコシ系の２つが、ＴＬＣで原点から移動しない陽性シグナルを生じ、フルクトースポリマーが大分子量であることを示唆した。10kD-BLEC-SacBカセットを含むトランスジェニック種子の発芽 10kD-BLEC-SacBカセットを含む種子をメトロ−ミックス土壌中に植えて、温室条件下で発芽させた。植えた35の種子のうち、29が発芽し（83％の発芽率）、成熟するまで発育し、フルクタンを含むR2種子を生成した。発芽率、苗条の生長力または得られた種子に関して、トランスジェニック種子と野生型、デント系との間に差異は観察されなかった。形質転換したトウモロコシ中のフルクタン陽性10kD-BLEC-SacBの定量分析２つの陽性系の１つからの１０個の種子を、実施例５に記載したようにアントロン法でフルクタン濃度に関して個々に試験した。この系からの種子は、SacB遺伝子を分離しているので、予想通り、いくつかはフルクタンを蓄積しない。この実験では、陰性の種子を内部対照として利用する。野生型（デントコーン）からの４つの成熟種子も、陰性対照として含んだ。データを以下の表５に要約する。表５のデータは、10kD-BLEC-SacB発現カセットを含む種子中のフルクタン蓄積が、10kD:Spor:In2-1カセットを含む形質転換トウモロコシ系に見られるレベル( 実施例６の表３に掲げたフルクタンレベル)等しいことを示している。この結果は、SacB遺伝子を内胚乳の液胞に標的することが達成され、そしてタンパク質をトウモロコシ胚乳の液胞に向ける原因であるレセプター（１つまたは複数）が、単子葉および双子葉標的シグナルの両方を認識することを示唆している。この実施例の情報は、トランスジェニックトウモロコシ胚乳の細胞質ゾル中の大分子量フルクタンの蓄積が、その種子の発生に有害であり、発芽および苗条の生長を阻害することを示している。液胞標的シグナル（単子葉または双子葉シグナルのいずれか）のSacBタンパク質への融合は、有害効果を助ける。液胞標的Sa cBタンパク質は、発生、発芽または苗条生長力に影響することなくフルクタンを合成し、そしてまたフルクタンの存在がこの性質を子孫に伝える能力を損なうこともない。実施例８高糖トウモロコシ系で増大したフルクタンの蓄積 “フィールドコーン(field corn)”としても知られている野生型“デント”と比較して、変化した半透明性または仁の形のような種子の様々な物理的特性から、しばしば単離される多くの突然変異体トウモロコシ系が記載されている。“しなびた”仁を生成する幾つかの突然変異体系は、特性決定され、そして低レベルの澱粉を含むことが判明したが、可溶性糖の濃度も増加していた(DoehlertおよびMin Kuo、Plant Cell Physiol.,35:411-418(1994)を参照にされたい)。shrunk en-4(sh4)またはSugary/sugaryエンハンサー(su/se)のような突然変異体系の生化学的な傷はいつも明らかであるわけではない。しかし、突然変異体の対立遺伝子はよく特性決定されており、shrunken-1(sh1)、shrunken-2(sh2)およびbrittl e-2を含む数種の突然変異体について遺伝子がクローン化された(McCartyら、Pro c.Natl.Acad.Sci.(USA)、83:9099-9103(1986)、Bhaveら、The Plant Cell,2:581 -5(1990))。突然変異は澱粉の生化学経路の様々な段階で起こるが、澱粉の蓄積が減少し、そしてスクロースを含む可溶性糖濃度増加はよくある結果である。経路の遮断レベル、そしてそれゆえに可溶性糖の濃度は突然変異体系では変化する。ホモ接合体澱粉突然変異体系中の細菌SacB遺伝子の発現は、沢山利用できる基質プール故に、フルクタン蓄積のレベルが増大する。突然変異体系中のSacB遺伝子の発現は、直接的形質転換または実施例６および７に記載したような、SacB発現カセットを含有するトランスジェニックトウモロコシ系の突然変異系の伝統的な育種を通して達成できる。この実施例においてSacB遺伝子を含む突然変異体トウモロコシ系は、10kD-Spo r:SacB:In2-1発現ベクターを含む“デント”系と、突然変異体sh1、sh2、sh4およびsu/seとの遺伝的交配により生成された。トランスジェニックSacB系はsh1、 sh2、sh4およびsu/se座に野生型の対立遺伝子を含み、それゆえに、元の交配からのＦ１種子は“自己であり(selfed)”、ホモ接合体およびヘテロ接合体突然変異対立遺伝子と一緒にSacB遺伝子を分離しているＦ２種子を生じる。澱粉経路の突然変異体についてのホモ接合体は、しわがよった、または萎んだ表現型により容易に確認できた。萎んだのを分離した個々の仁および正常な表現型を、実施例５に記載したアントロン法により、定量的にフルクタンを分析するために選択した。アントロン分析の結果を以下の表６に掲げる。表６の情報は、様々なトウモロコシ系中のSacB遺伝子発現によりフルクタン蓄積が変化したことを示唆している。突然変異体系4094.1.128は、デント系でのSa cBについて示されたものに類似するレベルでフルクタンを蓄積せず（実施例６および７を参照にされたい）、この系の遺伝的傷がSacB発現にも影響することを示唆している。この証拠については、DoehlertおよびMin Kuo、Plant Cell Physio l.,35:411-418(1994)が考察している。sh4の遺伝的傷は、スクロースレベルの増大を導き、ピリドキサルリン酸代謝に関与すると考えられる。この結果は発生中の仁でのタンパク質合成の一般的な減少である。DoehlertおよびMin Kuoは、sh4 種子中の転写物およびタンパク質レベルも有意に減少することを実証している。ここで記載したsh4トウモロコシ系中のSacB遺伝子はゼインプロモーターにより駆動させられる。この突然変異体中のゼイン発現レベルの減少は、SacBタンパク質レベルの低下を生じ、そしてこの系がデント系に見られるよりもスクロースレベルが高いと報告されたにもかかわらず、なぜ増大したフルクタンが存在しないのかを説明できた。 4092-1.20系は、ホモ接合体およびヘテロ接合体sh2対立遺伝子およびSacB遺伝子を分離している。sh2系のスクロースレベルは、この実施例で試験した突然変異体の中でも最高であると報告されている（DoehlertおよびMi n Kuo、Plant Cell Physiol.,35:411-418(1994)）。表６のデータは、このバックグラウンドでSacB遺伝子は最高レベルのフルクタンを蓄積する。4097-4.26系および4089-4.68系は、ホモ接合体およびヘテ口接合体suおよびsh1対立遺伝子をそれぞれ分離している。それらはまた、SacB遺伝子も分離している。suおよびsh 1系は同様に蓄積するが、野生型内胚乳に比べてスクロースレベルが高い。表６はこれらがSacB遺伝子を含有するデントトウモロコシ系に比べ高レベルのフルクタンを蓄積するが、sh2バックグラウンドに見られるよりも少ないことを示す。突然変異体sh4（上記に説明）を除いて、表６に掲げたSacB遺伝子を含む澱粉突然変異体系からの個々の種子は、澱粉生合成経路で遺伝的遮断を含むトウモロコシ系でフルクタン蓄積が多かったことを示す。遺伝的遮断による細胞質ゾル中のスクロースの増大は、突然変異体系の液胞を平衡化し、フルクタン合成の増大を生じる。液胞標的SacBタンパク質を含む細胞の液胞中のスクロースの増大が、フルクタンレベルの増大をもたらすことができることは明らかであるが、この実施例中のデータはトウモロコシ内胚乳のフルクタンレベルの変化が細胞の細胞質ゾル中のスクロースをを変えることによっても達成できることを示している。スクロースレベルの増大は幾つかの手段（例えば、過剰発現またはスクロース代謝遺伝子のアンチセンス）、またはこの実施例にて澱粉合成が欠失した突然変異体系中のSacB遺伝子の発現により達成できる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩＣ１２Ｒ 1:07） (Ｃ１２Ｎ 9/10 Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者カー，フイリツプ・エスアメリカ合衆国アイオワ州50322―2164 アーバンデイル・グリーンビユウドライブ 4038

Claims

【特許請求の範囲】１．レバンスクラーゼ遺伝子のコーディング配列に操作可能に連結された液胞標的配列に操作可能に連結された、組織特異的プロモーターを含んで成る組換えＤＮＡ構築物であって、該構築物がトウモロコシ、ジャガイモおよびタバコから成る群から選択される植物細胞を形質転換して、該植物細胞の液胞中にフルクタンの生産を得ることができる、上記組換えＤＮＡ構築物。２．上記植物が植物の細胞の液胞中に蓄積するフルクタンを生産するように、請求の範囲第１項に記載の構築物で形質転換されたトウモロコシ、ジャガイモおよびタバコから成る群から選択される植物。３．請求の範囲第２項に記載の植物を栽培し、該植物を収穫し、そして収穫した植物から上記フルクタンを抽出することを含んで成る、フルクトースの生産法。４．デキストランスクラーゼ遺伝子のコーディング配列に操作可能に連結された液胞標的配列に操作可能に連結された、組織特異的プロモーターを含んで成る組換えＤＮＡ構築物であって、該構築物がトウモロコシ、ジャガイモもおよびタバコから成る群から選択される植物細胞を形質転換して、該植物細胞の液胞中にデキストランの生産を得ることができる、上記組換えＤＮＡ構築物。５．上記植物が植物の細胞の液胞中に蓄積するデキストランを生産するように、請求の範囲第４項に記載の構築物で形質転換されたトウモロコシ、ジャガイモおよびタバコから成る群から選択される植物。６．請求の範囲第５項に記載の植物を栽培し、該植物を収穫し、そして収穫した植物から上記デキストランを抽出することを含んで成る、デキストランの生産法。７．オルタナンスクラーゼ遺伝子のコーディング配列に操作可能に連結された液胞標的配列に操作可能に連結された、組織特異的プロモーターを含んで成る組換えＤＮＡ構築物であって、該構築物がトウモロコシ、ジャガイモもおよびタバコから成る群から選択される植物細胞を形質転換して、該植物細胞の液胞中にオルタナンの生産を得ることができる、上記組換えＤＮＡ構築物。８．上記植物が植物の細胞の液胞中に蓄積するオルタナンを生産するように、請求の範囲第７項に記載の構築物で形質転換されたトウモロコシ、ジャガイモおよびタバコから成る群から選択される植物。９．請求の範囲第８項に記載の植物を栽培し、該植物を収穫し、そして収穫した植物から上記オルタナンを抽出することを含んで成る、オルタナンの生産法。１０．組織特異的プロモーターが種子に特異的である、請求の範囲第１項に記載の組換えＤＮＡ構築物。１１．組織特異的プロモーターが塊茎に特異的である、請求の範囲第１項に記載の組換えＤＮＡ構築物。１２．組織特異的プロモーターが種子に特異的である、請求の範囲第４項に記載の組換えＤＮＡ構築物。１３．組織特異的プロモーターが塊茎に特異的である、請求の範囲第４項に記載の組換えＤＮＡ構築物。１４．組織特異的プロモーターが種子に特異的である、請求の範囲第７項に記載の組換えＤＮＡ構築物。１５．組織特異的プロモーターが塊茎に特異的である、請求の範囲第７項に記載の組換えＤＮＡ構築物。１６．植物が種子に蓄積するフルクタンを生産する、請求の範囲第１０項に記載の構築物で形質転換された植物。１７．植物が種子に蓄積するデキストランを生産する、請求の範囲第１２項に記載の構築物で形質転換された植物。１８．植物が種子に蓄積するオルタナンを生産する、請求の範囲第１４項に記載の構築物で形質転換された植物。１９．植物が塊茎に蓄積するフルクタンを生産する、請求の範囲第１１項に記載の構築物で形質転換された植物。２０．植物が塊茎に蓄積するデキストランを生産する、請求の範囲第１３項に記載の構築物で形質転換されたジャガイモ植物。２１．植物が塊茎に蓄積するオルタナンを生産する、請求の範囲第１５項に記載の構築物で形質転換されたジャガイモ植物。２２．天然のスクロースレベルよりも高いスクロースレベルを有する植物細胞中に、レバンスクラーゼ遺伝子のコーディング配列に操作可能に連結された液胞標的配列に操作可能に連結された組織特異的プロモーターを含んで成る組換えＤＮＡ構築物を挿入することを含んで成る、植物中のフルクタンレベルを増加される方法であって、該構築物が植物細胞を形質転換でき、そして形質転換した植物がフルクタンを合成しそして蓄積する、上記方法。２３．請求の範囲第２２項に記載の構築物で形質転換された植物。２４．請求の範囲第２３項の形質転換植物から生産された種子。２５．植物がトウモロコシであり、そして生産された種子はフルクタンレベルが変化しているトウモロコシ種子である、請求の範囲第２２項に記載の方法。２６．レバンスクラーゼ遺伝子の突然変異したコーディング配列に操作可能に連結された、液胞標的配列に操作可能に連結された組織特異的プロモーターを含んで成る組換えＤＮＡ構築物であって、該構築物が植物細胞を形質転換して、該植物細胞の細胞質ゾル中にフルクタンの蓄積を引き起こすことができる、上記組換えＤＮＡ構築物。２７．請求の範囲第２６項に記載の構築物で形質転換されたダイズ植物。