JP2000350583A - 低温発現型フルクタン代謝酵素遺伝子 - Google Patents
低温発現型フルクタン代謝酵素遺伝子Info
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Abstract
(57)【要約】 （修正有）
【課題】 植物の耐寒性を向上させることを目的とし
て、低温下で酵素機能を有するフルクタン代謝酵素遺伝
子およびその単離方法を提供する。また、虫歯予防効果
・腸内ビフィズス菌増殖作用など人間の健康に有用な機
能性オリゴ糖の生産に有用なフルクタン合成酵素遺伝子
を提供する。 【解決手段】アミノ酸配列をコードする塩基配列からな
る小麦スクロース：フルクタン ６−フルクトシルトラ
ンスフェラーゼ遺伝子、およびアミノ酸配列をコードす
る塩基配列からなる小麦インベルターゼ遺伝子が単離さ
れる。 【効果】 本発明における上記２種の遺伝子を植物体に
導入することによって、植物に対し耐寒性を付与するこ
とになり、高い耐寒性を有する植物品種を提供すること
ができる。また、虫歯予防効果・腸内ビフィズス菌増殖
作用など人間の健康に有用なフルクトオリゴ糖の生産に
対しても、フルクタン合成酵素遺伝子として有効に適用
される。
て、低温下で酵素機能を有するフルクタン代謝酵素遺伝
子およびその単離方法を提供する。また、虫歯予防効果
・腸内ビフィズス菌増殖作用など人間の健康に有用な機
能性オリゴ糖の生産に有用なフルクタン合成酵素遺伝子
を提供する。 【解決手段】アミノ酸配列をコードする塩基配列からな
る小麦スクロース：フルクタン ６−フルクトシルトラ
ンスフェラーゼ遺伝子、およびアミノ酸配列をコードす
る塩基配列からなる小麦インベルターゼ遺伝子が単離さ
れる。 【効果】 本発明における上記２種の遺伝子を植物体に
導入することによって、植物に対し耐寒性を付与するこ
とになり、高い耐寒性を有する植物品種を提供すること
ができる。また、虫歯予防効果・腸内ビフィズス菌増殖
作用など人間の健康に有用なフルクトオリゴ糖の生産に
対しても、フルクタン合成酵素遺伝子として有効に適用
される。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、植物の耐寒性（耐
凍性＜マイナス気温下で長期間生存可能となる能力＞お
よび耐雪性＜０℃暗黒下である積雪下で長期間生存可能
となる能力＞などからなる）を高め、さらに人間の健康
上極めて有用なフルクトオリゴ糖として働くフルクタン
の代謝に関わる酵素を有する遺伝子に関し、詳しくは、
高度の耐寒性を有する秋播小麦（ＰＩ１７３４３８）由
来の新規スクロース：フルクタン６−フルクトシルトラ
ンスフエラーゼ（sucrose : fructan6-fructosyltran
sferase）遺伝子および、同秋播小麦（ＰＩ１７３４３
８）由来の新規インベルターゼ（invertase）遺伝子を
提供するものである。
凍性＜マイナス気温下で長期間生存可能となる能力＞お
よび耐雪性＜０℃暗黒下である積雪下で長期間生存可能
となる能力＞などからなる）を高め、さらに人間の健康
上極めて有用なフルクトオリゴ糖として働くフルクタン
の代謝に関わる酵素を有する遺伝子に関し、詳しくは、
高度の耐寒性を有する秋播小麦（ＰＩ１７３４３８）由
来の新規スクロース：フルクタン６−フルクトシルトラ
ンスフエラーゼ（sucrose : fructan6-fructosyltran
sferase）遺伝子および、同秋播小麦（ＰＩ１７３４３
８）由来の新規インベルターゼ（invertase）遺伝子を
提供するものである。
【０００２】
【従来の技術】越冬作物のうち麦類およびイネ科牧草
は、秋期から冬季にかけての気温の低下に伴う低温順化
（以下、ハードニングと称する）過程において低温発現
型のフルクタン代謝酵素が発現することで、冬期のエネ
ルギ一源として多糖類のフルク夕ンを液胞内に蓄積す
る。厳寒地帯の越冬作物は主に長期積雪地帯で栽培され
るため、フルクタン蓄積量の多い品種ほど越冬性がある
ことが知られている。
は、秋期から冬季にかけての気温の低下に伴う低温順化
（以下、ハードニングと称する）過程において低温発現
型のフルクタン代謝酵素が発現することで、冬期のエネ
ルギ一源として多糖類のフルク夕ンを液胞内に蓄積す
る。厳寒地帯の越冬作物は主に長期積雪地帯で栽培され
るため、フルクタン蓄積量の多い品種ほど越冬性がある
ことが知られている。
【０００３】フルクタンは越冬時のエネルギ一源として
働くだけでなく、凍結防止や浸透圧調整物質として植物
の耐凍性や乾燥耐性においても主要な役割を果たしてい
る。
働くだけでなく、凍結防止や浸透圧調整物質として植物
の耐凍性や乾燥耐性においても主要な役割を果たしてい
る。
【０００４】小麦においては高度耐凍性、耐雪性を有す
る品種の開発が北方圏諸国で行われているが、従来の交
雑技術にもとづいた育種方法では、既存の品種を越える
能力を持つ植物の取得は困難である。そこで最近では、
生物工学的手段による品種の改良が求められてきてい
る。
る品種の開発が北方圏諸国で行われているが、従来の交
雑技術にもとづいた育種方法では、既存の品種を越える
能力を持つ植物の取得は困難である。そこで最近では、
生物工学的手段による品種の改良が求められてきてい
る。
【０００５】また、フルクトオリゴ糖は、虫歯予防効果
・腸内ビフィズス菌増殖作用など人間の健康に有用な機
能性オリゴ糖であり、フルクタン合成遺伝子はフルクト
オリゴ糖生産の工業的利用においても注目されている。
・腸内ビフィズス菌増殖作用など人間の健康に有用な機
能性オリゴ糖であり、フルクタン合成遺伝子はフルクト
オリゴ糖生産の工業的利用においても注目されている。
【０００６】なお、フルクタン合成に関する酵素につ
き、その反応の段階と結合様式によって幾つかの種類と
そのアイソザイムが存在している。詳しくは、スクロー
ス：フルクタン６−フルクトシルトランスフェラーゼ
は、主にスクロースから３糖と４糖のフルクタンの合成
に作用し、インベルターゼは、スク口−ス（２糖）の分
解を行う酵素として作用する。また、フルクタン合成能
を持つ植物のインベルタ−ゼは、高濃度スクロース下に
おいて３糖を合成する機能を持っている。
き、その反応の段階と結合様式によって幾つかの種類と
そのアイソザイムが存在している。詳しくは、スクロー
ス：フルクタン６−フルクトシルトランスフェラーゼ
は、主にスクロースから３糖と４糖のフルクタンの合成
に作用し、インベルターゼは、スク口−ス（２糖）の分
解を行う酵素として作用する。また、フルクタン合成能
を持つ植物のインベルタ−ゼは、高濃度スクロース下に
おいて３糖を合成する機能を持っている。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】しかしながら、これま
でスクロース：フルクタン ６−フルクトシルトランス
フェラーゼに関してはオオムギから、インベルターゼに
関しては他の幾つかの植物から遺伝子が報告されている
が、これらは何れも常温発現条件下で単離されたもので
あるため、低温で発現して酵素としての機能を果たす遺
伝子ではない。そのため、従来のスクロース：フルクタ
ン ６−フルクトシルトランスフェラーゼ遺伝子および
インベルターゼ遺伝子を利用しても、植物の耐寒性を向
上させることが困難と考えられる。
でスクロース：フルクタン ６−フルクトシルトランス
フェラーゼに関してはオオムギから、インベルターゼに
関しては他の幾つかの植物から遺伝子が報告されている
が、これらは何れも常温発現条件下で単離されたもので
あるため、低温で発現して酵素としての機能を果たす遺
伝子ではない。そのため、従来のスクロース：フルクタ
ン ６−フルクトシルトランスフェラーゼ遺伝子および
インベルターゼ遺伝子を利用しても、植物の耐寒性を向
上させることが困難と考えられる。
【０００８】そこで本発明は、秋期から冬季にかけての
気温低下に伴うハードニング中に発現するフルクタン代
謝酵素遺伝子を単離するため、十分にハードニングを施
した秋播小麦系統ＰＩ１７３４３８（高度耐寒性系統）
から当該遺伝子を単離し提供することを目的とする。
気温低下に伴うハードニング中に発現するフルクタン代
謝酵素遺伝子を単離するため、十分にハードニングを施
した秋播小麦系統ＰＩ１７３４３８（高度耐寒性系統）
から当該遺伝子を単離し提供することを目的とする。
【０００９】また本発明は、虫歯予防効果・腸内ビフィ
ズス菌増殖作用など人間の健康に有用な機能性多糖の生
産に有用となる小麦由来のフルクタン合成遺伝子を提供
することを目的とする。
ズス菌増殖作用など人間の健康に有用な機能性多糖の生
産に有用となる小麦由来のフルクタン合成遺伝子を提供
することを目的とする。
【００１０】さらに本発明は、低温環境下で酵素として
の機能を果たす上記遺伝子の単離方法を提供することを
目的とする。
の機能を果たす上記遺伝子の単離方法を提供することを
目的とする。
【００１１】
【課題を解決するための手段】上記した目的を達成する
ために本発明は、図１に示す配列番号１記載のアミノ酸
配列を有することを特徴とする小麦スクロース：フルク
タン ６−フルクトシルトランスフェラーゼ遺伝子であ
る。
ために本発明は、図１に示す配列番号１記載のアミノ酸
配列を有することを特徴とする小麦スクロース：フルク
タン ６−フルクトシルトランスフェラーゼ遺伝子であ
る。
【００１２】図１に示す配列番号１記載のアミノ酸配列
を有する上記小麦スクロース：フルクタン ６−フルク
トシルトランスフェラーゼ遺伝子は、１８４８塩基、６
１６アミノ酸からなるタンパクを有し、大麦由来の同遺
伝子と９３％（アミノ酸配列レベル）の相同性を持つも
のである。
を有する上記小麦スクロース：フルクタン ６−フルク
トシルトランスフェラーゼ遺伝子は、１８４８塩基、６
１６アミノ酸からなるタンパクを有し、大麦由来の同遺
伝子と９３％（アミノ酸配列レベル）の相同性を持つも
のである。
【００１３】また、図１に示す配列番号１記載のアミノ
酸配列を有する上記小麦スクロース：フルクタン ６−
フルクトシルトランスフェラーゼ遺伝子は、低温環境下
で酵素機能を有し、植物体に導入されることによって、
植物に耐寒性を与えるものである。
酸配列を有する上記小麦スクロース：フルクタン ６−
フルクトシルトランスフェラーゼ遺伝子は、低温環境下
で酵素機能を有し、植物体に導入されることによって、
植物に耐寒性を与えるものである。
【００１４】さらに、図１に示す配列番号１記載のアミ
ノ酸配列を有する上記小麦スクロース：フルクタン ６
−フルクトシルトランスフェラーゼ遺伝子は、人間の健
康上有用なフルクトオリゴ糖を合成する機能を持つもの
である。
ノ酸配列を有する上記小麦スクロース：フルクタン ６
−フルクトシルトランスフェラーゼ遺伝子は、人間の健
康上有用なフルクトオリゴ糖を合成する機能を持つもの
である。
【００１５】また、上記した目的を達成するために本発
明は、図２に示す配列番号２記載のアミノ酸配列を有す
ることを特徴とする小麦インベルターゼ遺伝子である。
明は、図２に示す配列番号２記載のアミノ酸配列を有す
ることを特徴とする小麦インベルターゼ遺伝子である。
【００１６】図２に示す配列番号２記載のアミノ酸配列
を有する上記小麦インベルターゼ遺伝子は、１９８６塩
基、６６２アミノ酸からなるタンパク、サトウキビ由来
の同遺伝子と５５％（アミノ酸配列レベル）の相同性を
持つものである。
を有する上記小麦インベルターゼ遺伝子は、１９８６塩
基、６６２アミノ酸からなるタンパク、サトウキビ由来
の同遺伝子と５５％（アミノ酸配列レベル）の相同性を
持つものである。
【００１７】また、図２に示す配列番号２記載のアミノ
酸配列を有する上記小麦インベルターゼ遺伝子は、低温
環境下で酵素機能を有し、植物体に導入されることによ
って、植物に耐寒性を与えるものである。
酸配列を有する上記小麦インベルターゼ遺伝子は、低温
環境下で酵素機能を有し、植物体に導入されることによ
って、植物に耐寒性を与えるものである。
【００１８】さらに、図２に示す配列番号２記載のアミ
ノ酸配列を有する上記小麦インベルターゼ遺伝子は、人
間の健康上有用なフルクトオリゴ糖を合成する機能を持
つものである。
ノ酸配列を有する上記小麦インベルターゼ遺伝子は、人
間の健康上有用なフルクトオリゴ糖を合成する機能を持
つものである。
【００１９】さらに本発明は、低温発現型フルクタン代
謝酵素を有する遺伝子の単離方法であって、ハードニン
グ（低温順化）による耐寒性の向上に関与する低温発現
型フルクタン代謝酵素遺伝子を単離することを目的とし
て、充分にハードニングを施した秋播小麦系統ＰＩ１７
３４３８（高度耐雪性を有する）からｍＲＮＡを抽出す
ることと、上記ｍＲＮＡをもとにｃＤＮＡおよびｃＤＮ
Ａライブラリーを作製することと、ＥＭＢＬ／Ｇｅｎｅ
ｂａｎｋ／ＤＤＢＪＤＮＡデータバンクによって公開さ
れている数種の植物由来のスクロース：フルクタン６−
フルクトシルトランスフェラーゼ遺伝子およびインベル
ターゼ遺伝子において高度に保存されている塩基配列部
分を参考にして、該２種類の遺伝子の特異的プライマー
を設計することと、設計された該２種類の遺伝子の特異
的プライマーを用いて、上記のｃＤＮＡを鋳型にＰＣＲ
（ポリメラーゼ・チェーン・リアクション）反応を行う
ことによって、該２種類の遺伝子の断片を増幅し増幅断
片を得ることと、上記の増幅断片をプローブとして、上
記のｃＤＮＡライブラリーをハイブリダイゼーションア
ッセイによりスクリ−ニングすることで、遺伝子の全長
を含むクローンを単離することと、を特徴とする。
謝酵素を有する遺伝子の単離方法であって、ハードニン
グ（低温順化）による耐寒性の向上に関与する低温発現
型フルクタン代謝酵素遺伝子を単離することを目的とし
て、充分にハードニングを施した秋播小麦系統ＰＩ１７
３４３８（高度耐雪性を有する）からｍＲＮＡを抽出す
ることと、上記ｍＲＮＡをもとにｃＤＮＡおよびｃＤＮ
Ａライブラリーを作製することと、ＥＭＢＬ／Ｇｅｎｅ
ｂａｎｋ／ＤＤＢＪＤＮＡデータバンクによって公開さ
れている数種の植物由来のスクロース：フルクタン６−
フルクトシルトランスフェラーゼ遺伝子およびインベル
ターゼ遺伝子において高度に保存されている塩基配列部
分を参考にして、該２種類の遺伝子の特異的プライマー
を設計することと、設計された該２種類の遺伝子の特異
的プライマーを用いて、上記のｃＤＮＡを鋳型にＰＣＲ
（ポリメラーゼ・チェーン・リアクション）反応を行う
ことによって、該２種類の遺伝子の断片を増幅し増幅断
片を得ることと、上記の増幅断片をプローブとして、上
記のｃＤＮＡライブラリーをハイブリダイゼーションア
ッセイによりスクリ−ニングすることで、遺伝子の全長
を含むクローンを単離することと、を特徴とする。
【００２０】上記２種類の遺伝子の特異的プライマーの
うち、一方は、以下の塩基配列 （Forward）：５‘Ａ−Ｔ−Ｇ−Ａ−Ａ−Ｔ／Ｃ−Ｇ−
Ａ−Ｔ／Ｃ−Ｃ−Ｃ−Ｎ−Ａ−Ａ−Ｔ／Ｃ−Ｇ−Ｇ
（配列番号３） を有し、他方は、以下の塩基配列 （Reverse）： ５‘Ｃ−Ｃ−Ｎ−Ｇ−Ｔ−Ｎ−Ｇ−Ｃ−
Ａ／Ｇ−Ｔ−Ｔ−Ａ／Ｇ−Ｔ−Ｔ−Ａ／Ｇ−Ａ−Ａ
（配列番号４） を有する。
うち、一方は、以下の塩基配列 （Forward）：５‘Ａ−Ｔ−Ｇ−Ａ−Ａ−Ｔ／Ｃ−Ｇ−
Ａ−Ｔ／Ｃ−Ｃ−Ｃ−Ｎ−Ａ−Ａ−Ｔ／Ｃ−Ｇ−Ｇ
（配列番号３） を有し、他方は、以下の塩基配列 （Reverse）： ５‘Ｃ−Ｃ−Ｎ−Ｇ−Ｔ−Ｎ−Ｇ−Ｃ−
Ａ／Ｇ−Ｔ−Ｔ−Ａ／Ｇ−Ｔ−Ｔ−Ａ／Ｇ−Ａ−Ａ
（配列番号４） を有する。
【００２１】すなわち、本発明のフルクタン代謝酵素遺
伝子は、低温発現型フルクタン代謝酵素遺伝子である。
これら低温発現型フルクタン代謝酵素遺伝子を単離する
方法としては、具体的には下記のようなプロセスによっ
て行われている。
伝子は、低温発現型フルクタン代謝酵素遺伝子である。
これら低温発現型フルクタン代謝酵素遺伝子を単離する
方法としては、具体的には下記のようなプロセスによっ
て行われている。
【００２２】詳しくは、札幌市の自然条件下で１１月２
２日までハードニング（低温順化）させた秋播小麦ＰＩ
１７３４３８（高度耐雪性を有する）からｍＲＮＡを抽
出する。そして、該ｍＲＮＡをもとにｃＤＮＡおよびｃ
ＤＮＡライブラリーを作製する。
２日までハードニング（低温順化）させた秋播小麦ＰＩ
１７３４３８（高度耐雪性を有する）からｍＲＮＡを抽
出する。そして、該ｍＲＮＡをもとにｃＤＮＡおよびｃ
ＤＮＡライブラリーを作製する。
【００２３】次いで、ＥＭＢＬ／Ｇｅｎｅｂａｎｋ／Ｄ
ＤＢＪＤＮＡデータバンクにおいて公開されている数種
の植物由来の、スクロース：フルクタン ６−フルクト
シルトランスフェラーゼ遺伝子およびインベルターゼ遺
伝子の塩基配列を詳細に解析し、すべての遺伝子におい
て高度に保存されている塩基配列部分を参考にして、ス
クロース：フルクタン ６−フルクトシルトランスフェ
ラーゼ遺伝子およびインベルターゼ遺伝子を同時に増幅
可能とする１組（該２種類遺伝子）の特異的プライマー
を設計する。
ＤＢＪＤＮＡデータバンクにおいて公開されている数種
の植物由来の、スクロース：フルクタン ６−フルクト
シルトランスフェラーゼ遺伝子およびインベルターゼ遺
伝子の塩基配列を詳細に解析し、すべての遺伝子におい
て高度に保存されている塩基配列部分を参考にして、ス
クロース：フルクタン ６−フルクトシルトランスフェ
ラーゼ遺伝子およびインベルターゼ遺伝子を同時に増幅
可能とする１組（該２種類遺伝子）の特異的プライマー
を設計する。
【００２４】設計された該１組（２種類遺伝子）の特異
的プライマーを用いて、上記のｃＤＮＡを鋳型にＰＣＲ
（ポリメラーゼ・チェーン・リアクション）反応を行っ
て、スクロース：フルクタン ６−フルクトシルトラン
スフェラーゼ遺伝子およびインベルターゼ遺伝子の予想
された断片（両酵素遺伝子の断片とも１５００塩基前
後）を増幅し、増幅部分の断片を得る。
的プライマーを用いて、上記のｃＤＮＡを鋳型にＰＣＲ
（ポリメラーゼ・チェーン・リアクション）反応を行っ
て、スクロース：フルクタン ６−フルクトシルトラン
スフェラーゼ遺伝子およびインベルターゼ遺伝子の予想
された断片（両酵素遺伝子の断片とも１５００塩基前
後）を増幅し、増幅部分の断片を得る。
【００２５】それぞれの増幅断片をプローブとして、上
記のｃＤＮＡライブラリーをハイブリダイゼーションア
ッセイによりスクリ−ニングすることで、遺伝子の全長
を含むクローンを単離する。単離したクローンの塩基配
列を解析し、小麦では新規のスクロース：フルクタン
６−フルクトシルトランスフェラーゼ遺伝子およびイン
ベルターゼ遺伝子であることを決定する。
記のｃＤＮＡライブラリーをハイブリダイゼーションア
ッセイによりスクリ−ニングすることで、遺伝子の全長
を含むクローンを単離する。単離したクローンの塩基配
列を解析し、小麦では新規のスクロース：フルクタン
６−フルクトシルトランスフェラーゼ遺伝子およびイン
ベルターゼ遺伝子であることを決定する。
【００２６】
【実施例】１）耐雪性秋播き小麦系統ＰＩ１７３４３８
からのｃＤＮＡ及びｃＤＮＡライブラリーの調製 ９月下旬にバットに播種し、自然条件下で１１月２２日
までハードニングさせた秋播小麦（Triticum astivum
L.）ＰＩ１７３４３８（高度耐雪性を有する）のクラウ
ン部分よりｍＲＮＡを常法により抽出した。得られたｍ
ＲＮＡ ５μｇを用いてｃＤＮＡ合成キット（STRATAGE
NE社製）を利用してｃＤＮＡを合成した。ｃＤＮＡの両
端末にアダプターを接続後、λ ZAP Expression vector
（STRATAGENE社製）に組み込み、約6x106pfuのｃＤＮＡ
ライブラリーを作製した。
からのｃＤＮＡ及びｃＤＮＡライブラリーの調製 ９月下旬にバットに播種し、自然条件下で１１月２２日
までハードニングさせた秋播小麦（Triticum astivum
L.）ＰＩ１７３４３８（高度耐雪性を有する）のクラウ
ン部分よりｍＲＮＡを常法により抽出した。得られたｍ
ＲＮＡ ５μｇを用いてｃＤＮＡ合成キット（STRATAGE
NE社製）を利用してｃＤＮＡを合成した。ｃＤＮＡの両
端末にアダプターを接続後、λ ZAP Expression vector
（STRATAGENE社製）に組み込み、約6x106pfuのｃＤＮＡ
ライブラリーを作製した。
【００２７】２） 上記２種の遺伝子のプライマーを用
いて上記ｃＤＮＡを鋳型に行われるＰＣＲ反応 既知（ＥＭＢＬ／Ｇｅｎｅｂａｎｋ／ＤＤＢＪＤＮＡデ
ータバンクにおいて公開されている）のスクロース：フ
ルクタン ６−フルクトシルトランスフェラーゼ遺伝子
およびインベルターゼ遺伝子の塩基配列中でともに高度
に保存された領域に基づいてそれぞれ合成された、 （Forward）：５‘Ａ−Ｔ−Ｇ−Ａ−Ａ−Ｔ／Ｃ−Ｇ−
Ａ−Ｔ／Ｃ−Ｃ−Ｃ−Ｎ−Ａ−Ａ−Ｔ／Ｃ−Ｇ−Ｇ
（配列番号３） という塩基配列を有する特異的プライマーと、 （Reverse）： ５‘Ｃ−Ｃ−Ｎ−Ｇ−Ｔ−Ｎ−Ｇ−Ｃ−
Ａ／Ｇ−Ｔ−Ｔ−Ａ／Ｇ−Ｔ−Ｔ−Ａ／Ｇ−Ａ−Ａ
（配列番号４） という塩基配列を有する特異的プライマーと、からなる
１組（上記２種類の遺伝子）の特異的プライマーを用い
て、上記により合成されたｃＤＮＡを鋳型にＰＣＲ反応
を行った。
いて上記ｃＤＮＡを鋳型に行われるＰＣＲ反応 既知（ＥＭＢＬ／Ｇｅｎｅｂａｎｋ／ＤＤＢＪＤＮＡデ
ータバンクにおいて公開されている）のスクロース：フ
ルクタン ６−フルクトシルトランスフェラーゼ遺伝子
およびインベルターゼ遺伝子の塩基配列中でともに高度
に保存された領域に基づいてそれぞれ合成された、 （Forward）：５‘Ａ−Ｔ−Ｇ−Ａ−Ａ−Ｔ／Ｃ−Ｇ−
Ａ−Ｔ／Ｃ−Ｃ−Ｃ−Ｎ−Ａ−Ａ−Ｔ／Ｃ−Ｇ−Ｇ
（配列番号３） という塩基配列を有する特異的プライマーと、 （Reverse）： ５‘Ｃ−Ｃ−Ｎ−Ｇ−Ｔ−Ｎ−Ｇ−Ｃ−
Ａ／Ｇ−Ｔ−Ｔ−Ａ／Ｇ−Ｔ−Ｔ−Ａ／Ｇ−Ａ−Ａ
（配列番号４） という塩基配列を有する特異的プライマーと、からなる
１組（上記２種類の遺伝子）の特異的プライマーを用い
て、上記により合成されたｃＤＮＡを鋳型にＰＣＲ反応
を行った。
【００２８】上記ＰＣＲ反応は、５０μl の反応系で
行われた。日本ジーン社製TaqＤＮＡポリメラーゼ（５
units/μl）を１μl、１０×ポリメラーゼバッファー
（MgCl2を含む）を５μl、ｄＮＴＰ液（１０ｍＭ）を５
μl、上記の各プライマー（１２μＭ）を２μl、および
上記で合成したｃＤＮＡを約１０ｎｇ加えて、反応液全
量を蒸留水で５０μlとした。ＰＣＲの反応条件および
反応回数は、以下の表１に示す。
行われた。日本ジーン社製TaqＤＮＡポリメラーゼ（５
units/μl）を１μl、１０×ポリメラーゼバッファー
（MgCl2を含む）を５μl、ｄＮＴＰ液（１０ｍＭ）を５
μl、上記の各プライマー（１２μＭ）を２μl、および
上記で合成したｃＤＮＡを約１０ｎｇ加えて、反応液全
量を蒸留水で５０μlとした。ＰＣＲの反応条件および
反応回数は、以下の表１に示す。
【００２９】
【表１】
【００３０】上記ＰＣＲ反応の結果、配列番号３の塩基
配列および配列番号４の塩基配列を有する１組（上記２
種類の遺伝子）のプライマーから、既知のスクロース：
フルクタン６−フルクトシルトランスフェラーゼ遺伝子
およびインベルターゼ遺伝子から予測された長さの断片
（両遺伝子とも１５００塩基前後）が増幅された。それ
ぞれを単離精製後、常法に基づき市販の自動ＤＮＡシー
ケンサー（ＡＢＩ社製、モデル３７３Ｓ）を利用し、そ
れぞれの増幅断片の塩基配列を決定することで、新規の
スクロース：フルクタン６−フルクトシルトランスフェ
ラーゼ遺伝子およびインベルターゼ遺伝子の部分断片が
単離されたことが確認された。
配列および配列番号４の塩基配列を有する１組（上記２
種類の遺伝子）のプライマーから、既知のスクロース：
フルクタン６−フルクトシルトランスフェラーゼ遺伝子
およびインベルターゼ遺伝子から予測された長さの断片
（両遺伝子とも１５００塩基前後）が増幅された。それ
ぞれを単離精製後、常法に基づき市販の自動ＤＮＡシー
ケンサー（ＡＢＩ社製、モデル３７３Ｓ）を利用し、そ
れぞれの増幅断片の塩基配列を決定することで、新規の
スクロース：フルクタン６−フルクトシルトランスフェ
ラーゼ遺伝子およびインベルターゼ遺伝子の部分断片が
単離されたことが確認された。
【００３１】３）本発明のスクロース：フルクタン６−
フルクトシルトランスフェラーゼ遺伝子およびインベル
ターゼ遺伝子を有するｃＤＮＡクローンの単離・塩基配
列の決定 上記により得られたｃＤＮＡライブラリーのうちおよそ
１０万クローンをプロットしたフィルターを利用し、上
記により得られた新規スクロース：フルクタン６−フル
クトシルトランスフェラーゼ遺伝子およびインベルター
ゼ遺伝子の部分断片をラジオアイソトープで標識したプ
ローブを利用してハイブリダイゼーシヨンアッセイを行
った。
フルクトシルトランスフェラーゼ遺伝子およびインベル
ターゼ遺伝子を有するｃＤＮＡクローンの単離・塩基配
列の決定 上記により得られたｃＤＮＡライブラリーのうちおよそ
１０万クローンをプロットしたフィルターを利用し、上
記により得られた新規スクロース：フルクタン６−フル
クトシルトランスフェラーゼ遺伝子およびインベルター
ゼ遺伝子の部分断片をラジオアイソトープで標識したプ
ローブを利用してハイブリダイゼーシヨンアッセイを行
った。
【００３２】ハイブリダイゼーション反応は、５０％ホ
ルムアミド、５×ＳＳＰＥ液、５×デンハルト液、０・
５％ＳＤＳ液、０．２ｍｇ／ｍｌのサケ精子ＤＮＡを加
え、４２℃の条件下で１６時間にわたって行われた。
ルムアミド、５×ＳＳＰＥ液、５×デンハルト液、０・
５％ＳＤＳ液、０．２ｍｇ／ｍｌのサケ精子ＤＮＡを加
え、４２℃の条件下で１６時間にわたって行われた。
【００３３】その後、上記フィルターに対して、２×Ｓ
ＳＣ液および０．１％ＳＤＳ液を用いて６５℃の条件下
で１０分間を必要とする洗浄を２度にわたり実施した。
次いで、０．１×ＳＳＣ液および０．１％ＳＤＳ液を用
いて６５℃の条件下で１５分間を必要とする洗浄を２度
にわたり行った。洗浄されたフィルターとＸ線フィルム
を利用し、ラジオアイソトーブで標識したプローブと結
合した陽性クローンをスクリーニングした。
ＳＣ液および０．１％ＳＤＳ液を用いて６５℃の条件下
で１０分間を必要とする洗浄を２度にわたり実施した。
次いで、０．１×ＳＳＣ液および０．１％ＳＤＳ液を用
いて６５℃の条件下で１５分間を必要とする洗浄を２度
にわたり行った。洗浄されたフィルターとＸ線フィルム
を利用し、ラジオアイソトーブで標識したプローブと結
合した陽性クローンをスクリーニングした。
【００３４】このように得られた約３５個の陽性クロー
ンについてそれぞれ、ＡＢＩ社製ＤＮＡシーケンサーを
用いて塩基配列を決定した。得られた候補クローンの塩
基配列の解析から、図１に示す配列番号１記載のアミノ
酸配列を有する新規スクロース：フルクタン６−フルク
トシルトランスフェラーゼ遺伝子、および図２に示す配
列番号２記載のアミノ酸配列を有する新規インベルター
ゼ遺伝子がそれぞれ単離されたことが判った。
ンについてそれぞれ、ＡＢＩ社製ＤＮＡシーケンサーを
用いて塩基配列を決定した。得られた候補クローンの塩
基配列の解析から、図１に示す配列番号１記載のアミノ
酸配列を有する新規スクロース：フルクタン６−フルク
トシルトランスフェラーゼ遺伝子、および図２に示す配
列番号２記載のアミノ酸配列を有する新規インベルター
ゼ遺伝子がそれぞれ単離されたことが判った。
【００３５】具体的には、単離されたのは、１８４８塩
基、６１６アミノ酸からなるタンパクを有し、大麦のス
クロース：フルクタン６−フルクトシルトランスフェラ
ーゼ遺伝子と９３％（アミノ酸配列レベル）の相同性を
持つ小麦の新規なスクロース：フルクタン ６−フルク
トシルトランスフェラーゼ遺伝子（図１に示す配列番号
１記載のアミノ酸配列を有する）、及び１９８６塩基、
６６２アミノ酸からなるタンパクを有し、サトウキビの
インベルターゼ遺伝子と５５％（アミノ酸配列レベル）
の相同性を持つ小麦の新規なインベルターゼ遺伝子（図
２に示す配列番号２記載のアミノ酸配列を有する）であ
る。
基、６１６アミノ酸からなるタンパクを有し、大麦のス
クロース：フルクタン６−フルクトシルトランスフェラ
ーゼ遺伝子と９３％（アミノ酸配列レベル）の相同性を
持つ小麦の新規なスクロース：フルクタン ６−フルク
トシルトランスフェラーゼ遺伝子（図１に示す配列番号
１記載のアミノ酸配列を有する）、及び１９８６塩基、
６６２アミノ酸からなるタンパクを有し、サトウキビの
インベルターゼ遺伝子と５５％（アミノ酸配列レベル）
の相同性を持つ小麦の新規なインベルターゼ遺伝子（図
２に示す配列番号２記載のアミノ酸配列を有する）であ
る。
【００３６】
【発明の効果】本発明によれば、既知のスクロース：フ
ルクタン ６−フルクトシルトランスフェラーゼ遺伝子
とアミノ酸配列の異なる小麦由来の新規スクロース：フ
ルクタン ６−フルクトシルトランスフェラーゼ遺伝子
と、既知のインベルターゼ遺伝子とアミノ酸配列の異な
る小麦由来の新規インベルターゼ遺伝子が提供される。
ルクタン ６−フルクトシルトランスフェラーゼ遺伝子
とアミノ酸配列の異なる小麦由来の新規スクロース：フ
ルクタン ６−フルクトシルトランスフェラーゼ遺伝子
と、既知のインベルターゼ遺伝子とアミノ酸配列の異な
る小麦由来の新規インベルターゼ遺伝子が提供される。
【００３７】本発明における新規スクロース：フルクタ
ン ６−フルクトシルトランスフェラーゼ遺伝子及び新
規インベルターゼ遺伝子は、低温環境でフルクタン代謝
能を有することから、本発明のスクロース：フルクタン
６−フルクトシルトランスフェラーゼ遺伝子またはイン
ベルターゼ遺伝子を植物体に導入することによって、植
物の耐寒性を向上させることとなり、高度耐寒性を有す
る植物品種を提供することができる。
ン ６−フルクトシルトランスフェラーゼ遺伝子及び新
規インベルターゼ遺伝子は、低温環境でフルクタン代謝
能を有することから、本発明のスクロース：フルクタン
６−フルクトシルトランスフェラーゼ遺伝子またはイン
ベルターゼ遺伝子を植物体に導入することによって、植
物の耐寒性を向上させることとなり、高度耐寒性を有す
る植物品種を提供することができる。
【００３８】また、本発明における新規スクロース：フ
ルクタン ６−フルクトシルトランスフェラーゼ遺伝子
及び新規インベルターゼ遺伝子は、フルクトオリゴ糖の
合成能を有することから、虫歯予防効果・腸内ビフィズ
ス菌増殖作用など人間の健康に有用な機能性オリゴ糖の
生産に対しても、有用なフルクタン合成酵素遺伝子とし
て有効に適用される。
ルクタン ６−フルクトシルトランスフェラーゼ遺伝子
及び新規インベルターゼ遺伝子は、フルクトオリゴ糖の
合成能を有することから、虫歯予防効果・腸内ビフィズ
ス菌増殖作用など人間の健康に有用な機能性オリゴ糖の
生産に対しても、有用なフルクタン合成酵素遺伝子とし
て有効に適用される。
【図１】配列番号１記載のアミノ酸配列を示す図であ
る。
る。
【図２】配列番号２記載のアミノ酸配列を示す図であ
る。
る。
─────────────────────────────────────────────────────
【手続補正書】
【提出日】平成１２年２月１４日（２０００．２．１
４）
４）
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正内容】
【書類名】 明細書
【発明の名称】 低温発現型フルクタン代謝酵素遺伝
子
子
【特許請求の範囲】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、植物の耐寒性（耐
凍性＜マイナス気温下で長期間生存可能となる能力＞お
よび耐雪性＜０℃暗黒下である積雪下で長期間生存可能
となる能力＞などからなる）を高め、さらに人間の健康
上極めて有用なフルクトオリゴ糖として働くフルクタン
の代謝に関わる酵素を有する遺伝子に関し、詳しくは、
高度の耐寒性を有する秋播小麦（ＰＩ１７３４３８）由
来の新規スクロース：フルクタン６−フルクトシルトラ
ンスフエラーゼ（ｓｕｃｒｏｓｅ ： ｆｒｕｃｔａｎ
６−ｆｒｕｃｔｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）遺伝
子および、同秋播小麦（ＰＩ１７３４３８）由来の新規
インベルターゼ（ｉｎｖｅｒｔａｓｅ）遺伝子を提供す
るものである。
凍性＜マイナス気温下で長期間生存可能となる能力＞お
よび耐雪性＜０℃暗黒下である積雪下で長期間生存可能
となる能力＞などからなる）を高め、さらに人間の健康
上極めて有用なフルクトオリゴ糖として働くフルクタン
の代謝に関わる酵素を有する遺伝子に関し、詳しくは、
高度の耐寒性を有する秋播小麦（ＰＩ１７３４３８）由
来の新規スクロース：フルクタン６−フルクトシルトラ
ンスフエラーゼ（ｓｕｃｒｏｓｅ ： ｆｒｕｃｔａｎ
６−ｆｒｕｃｔｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）遺伝
子および、同秋播小麦（ＰＩ１７３４３８）由来の新規
インベルターゼ（ｉｎｖｅｒｔａｓｅ）遺伝子を提供す
るものである。
【０００２】
【従来の技術】越冬作物のうち麦類およびイネ科牧草
は、秋期から冬季にかけての気温の低下に伴う低温順化
（以下、ハードニングと称する）過程において低温発現
型のフルクタン代謝酵素が発現することで、冬期のエネ
ルギー源として多糖類のフルクタンを液胞内に蓄積す
る。厳寒地帯の越冬作物は主に長期積雪地帯で栽培され
るため、フルクタン蓄積量の多い品種ほど越冬性がある
ことが知られている。
は、秋期から冬季にかけての気温の低下に伴う低温順化
（以下、ハードニングと称する）過程において低温発現
型のフルクタン代謝酵素が発現することで、冬期のエネ
ルギー源として多糖類のフルクタンを液胞内に蓄積す
る。厳寒地帯の越冬作物は主に長期積雪地帯で栽培され
るため、フルクタン蓄積量の多い品種ほど越冬性がある
ことが知られている。
【０００３】フルクタンは越冬時のエネルギー源として
働くだけでなく、凍結防止や浸透圧調整物質として植物
の耐凍性や乾燥耐性においても主要な役割を果たしてい
る。
働くだけでなく、凍結防止や浸透圧調整物質として植物
の耐凍性や乾燥耐性においても主要な役割を果たしてい
る。
【０００４】小麦においては高度耐凍性、耐雪性を有す
る品種の開発が北方圏諸国で行われているが、従来の交
雑技術にもとづいた育種方法では、既存の品種を越える
能力を持つ植物の取得は困難である。そこで最近では、
生物工学的手段による品種の改良が求められてきてい
る。
る品種の開発が北方圏諸国で行われているが、従来の交
雑技術にもとづいた育種方法では、既存の品種を越える
能力を持つ植物の取得は困難である。そこで最近では、
生物工学的手段による品種の改良が求められてきてい
る。
【０００５】また、フルクトオリゴ糖は、虫歯予防効果
・腸内ビフィズス菌増殖作用など人間の健康に有用な機
能性オリゴ糖であり、フルクタン合成遺伝子はフルクト
オリゴ糖生産の工業的利用においても注目されている。
・腸内ビフィズス菌増殖作用など人間の健康に有用な機
能性オリゴ糖であり、フルクタン合成遺伝子はフルクト
オリゴ糖生産の工業的利用においても注目されている。
【０００６】なお、フルクタン合成に関する酵素につ
き、その反応の段階と結合様式によって幾つかの種類と
そのアイソザイムが存在している。詳しくは、スクロー
ス：フルクタン６−フルクトシルトランスフェラーゼ
は、主にスクロースから３糖と４糖のフルクタンの合成
に作用し、インベルターゼは、スク口−ス（２糖）の分
解を行う酵素として作用する。また、フルクタン合成能
を持つ植物のインベルターゼは、高濃度スクロース下に
おいて３糖を合成する機能を持っている。
き、その反応の段階と結合様式によって幾つかの種類と
そのアイソザイムが存在している。詳しくは、スクロー
ス：フルクタン６−フルクトシルトランスフェラーゼ
は、主にスクロースから３糖と４糖のフルクタンの合成
に作用し、インベルターゼは、スク口−ス（２糖）の分
解を行う酵素として作用する。また、フルクタン合成能
を持つ植物のインベルターゼは、高濃度スクロース下に
おいて３糖を合成する機能を持っている。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】しかしながら、これま
でスクロース：フルクタン ６−フルクトシルトランス
フェラーゼに関してはオオムギから、インベルターゼに
関しては他の幾つかの植物から遺伝子が報告されている
が、これらは何れも常温発現条件下で単離されたもので
あるため、低温で発現して酵素としての機能を果たす遺
伝子ではない。そのため、従来のスクロース：フルクタ
ン ６−フルクトシルトランスフェラーゼ遺伝子および
インベルターゼ遺伝子を利用しても、植物の耐寒性を向
上させることが困難と考えられる。
でスクロース：フルクタン ６−フルクトシルトランス
フェラーゼに関してはオオムギから、インベルターゼに
関しては他の幾つかの植物から遺伝子が報告されている
が、これらは何れも常温発現条件下で単離されたもので
あるため、低温で発現して酵素としての機能を果たす遺
伝子ではない。そのため、従来のスクロース：フルクタ
ン ６−フルクトシルトランスフェラーゼ遺伝子および
インベルターゼ遺伝子を利用しても、植物の耐寒性を向
上させることが困難と考えられる。
【０００８】そこで本発明は、秋期から冬季にかけての
気温低下に伴うハードニング中に発現するフルクタン代
謝酵素遺伝子を単離するため、十分にハードニングを施
した秋播小麦系統ＰＩ１７３４３８（高度耐寒性系統）
から当該遺伝子を単離し提供することを目的とする。
気温低下に伴うハードニング中に発現するフルクタン代
謝酵素遺伝子を単離するため、十分にハードニングを施
した秋播小麦系統ＰＩ１７３４３８（高度耐寒性系統）
から当該遺伝子を単離し提供することを目的とする。
【０００９】また本発明は、虫歯予防効果・腸内ビフィ
ズス菌増殖作用など人間の健康に有用な機能性多糖の生
産に有用となる小麦由来のフルクタン合成遺伝子を提供
することを目的とする。
ズス菌増殖作用など人間の健康に有用な機能性多糖の生
産に有用となる小麦由来のフルクタン合成遺伝子を提供
することを目的とする。
【００１０】さらに本発明は、低温環境下で酵素として
の機能を果たす上記遺伝子の単離方法を提供することを
目的とする。
の機能を果たす上記遺伝子の単離方法を提供することを
目的とする。
【００１１】
【課題を解決するための手段】上記した目的を達成する
ために本発明は、図１に示す配列番号１記載のアミノ酸
配列をコードする塩基配列からなることを特徴とする小
麦スクロース：フルクタン ６−フルクトシルトランス
フェラーゼ遺伝子である。
ために本発明は、図１に示す配列番号１記載のアミノ酸
配列をコードする塩基配列からなることを特徴とする小
麦スクロース：フルクタン ６−フルクトシルトランス
フェラーゼ遺伝子である。
【００１２】図１に示す配列番号１記載のアミノ酸配列
をコードする塩基配列からなる上記小麦スクロース：フ
ルクタン ６−フルクトシルトランスフェラーゼ遺伝子
は、１８４８塩基、６１６アミノ酸からなるタンパクを
有し、大麦由来の同遺伝子と９３％（アミノ酸配列レベ
ル）の相同性を持つものである。
をコードする塩基配列からなる上記小麦スクロース：フ
ルクタン ６−フルクトシルトランスフェラーゼ遺伝子
は、１８４８塩基、６１６アミノ酸からなるタンパクを
有し、大麦由来の同遺伝子と９３％（アミノ酸配列レベ
ル）の相同性を持つものである。
【００１３】また、図１に示す配列番号１記載のアミノ
酸配列をコードする塩基配列からなる上記小麦スクロー
ス：フルクタン ６−フルクトシルトランスフェラーゼ
遺伝子は、低温環境下で酵素機能を有し、植物体に導入
されることによって、植物に耐寒性を与えるものであ
る。
酸配列をコードする塩基配列からなる上記小麦スクロー
ス：フルクタン ６−フルクトシルトランスフェラーゼ
遺伝子は、低温環境下で酵素機能を有し、植物体に導入
されることによって、植物に耐寒性を与えるものであ
る。
【００１４】さらに、図１に示す配列番号１記載のアミ
ノ酸配列をコードする塩基配列からなる上記小麦スクロ
ース：フルクタン ６−フルクトシルトランスフェラー
ゼ遺伝子は、人間の健康上有用なフルクトオリゴ糖を合
成する機能を持つものである。
ノ酸配列をコードする塩基配列からなる上記小麦スクロ
ース：フルクタン ６−フルクトシルトランスフェラー
ゼ遺伝子は、人間の健康上有用なフルクトオリゴ糖を合
成する機能を持つものである。
【００１５】また、上記した目的を達成するために本発
明は、図２に示す配列番号２記載のアミノ酸配列をコー
ドする塩基配列からなることを特徴とする小麦インベル
ターゼ遺伝子である。
明は、図２に示す配列番号２記載のアミノ酸配列をコー
ドする塩基配列からなることを特徴とする小麦インベル
ターゼ遺伝子である。
【００１６】図２に示す配列番号２記載のアミノ酸配列
をコードする塩基配列からなる上記小麦インベルターゼ
遺伝子は、１９８６塩基、６６２アミノ酸からなるタン
パク、サトウキビ由来の同遺伝子と５５％（アミノ酸配
列レベル）の相同性を持つものである。
をコードする塩基配列からなる上記小麦インベルターゼ
遺伝子は、１９８６塩基、６６２アミノ酸からなるタン
パク、サトウキビ由来の同遺伝子と５５％（アミノ酸配
列レベル）の相同性を持つものである。
【００１７】また、図２に示す配列番号２記載のアミノ
酸配列をコードする塩基配列からなる上記小麦インベル
ターゼ遺伝子は、低温環境下で酵素機能を有し、植物体
に導入されることによって、植物に耐寒性を与えるもの
である。
酸配列をコードする塩基配列からなる上記小麦インベル
ターゼ遺伝子は、低温環境下で酵素機能を有し、植物体
に導入されることによって、植物に耐寒性を与えるもの
である。
【００１８】さらに、図２に示す配列番号２記載のアミ
ノ酸配列をコードする塩基配列からなる上記小麦インベ
ルターゼ遺伝子は、人間の健康上有用なフルクトオリゴ
糖を合成する機能を持つものである。
ノ酸配列をコードする塩基配列からなる上記小麦インベ
ルターゼ遺伝子は、人間の健康上有用なフルクトオリゴ
糖を合成する機能を持つものである。
【００１９】さらに本発明は、低温発現型フルクタン代
謝酵素を有する遺伝子の単離方法であって、ハードニン
グ（低温順化）による耐寒性の向上に関与する低温発現
型フルクタン代謝酵素遺伝子を単離することを目的とし
て、充分にハードニングを施した秋播小麦系統ＰＩ１７
３４３８（高度耐雪性を有する）からｍＲＮＡを抽出す
ることと、上記ｍＲＮＡをもとにｃＤＮＡおよびｃＤＮ
Ａライブラリーを作製することと、ＥＭＢＬ／Ｇｅｎｅ
ｂａｎｋ／ＤＤＢＪＤＮＡデータバンクによって公開さ
れている数種の植物由来のスクロース：フルクタン６−
フルクトシルトランスフェラーゼ遺伝子およびインベル
ターゼ遺伝子において高度に保存されている塩基配列部
分を参考にして、該２種類の遺伝子の特異的プライマー
を設計することと、設計された該２種類の遺伝子の特異
的プライマーを用いて、上記のｃＤＮＡを鋳型にＰＣＲ
（ポリメラーゼ・チェーン・リアクション）反応を行う
ことによって、該２種類の遺伝子の断片を増幅し増幅断
片を得ることと、上記の増幅断片をプローブとして、上
記のｃＤＮＡライブラリーをハイブリダイゼーションア
ッセイによりスクリ−ニングすることで、遺伝子の全長
を含むクローンを単離することと、を特徴とする。
謝酵素を有する遺伝子の単離方法であって、ハードニン
グ（低温順化）による耐寒性の向上に関与する低温発現
型フルクタン代謝酵素遺伝子を単離することを目的とし
て、充分にハードニングを施した秋播小麦系統ＰＩ１７
３４３８（高度耐雪性を有する）からｍＲＮＡを抽出す
ることと、上記ｍＲＮＡをもとにｃＤＮＡおよびｃＤＮ
Ａライブラリーを作製することと、ＥＭＢＬ／Ｇｅｎｅ
ｂａｎｋ／ＤＤＢＪＤＮＡデータバンクによって公開さ
れている数種の植物由来のスクロース：フルクタン６−
フルクトシルトランスフェラーゼ遺伝子およびインベル
ターゼ遺伝子において高度に保存されている塩基配列部
分を参考にして、該２種類の遺伝子の特異的プライマー
を設計することと、設計された該２種類の遺伝子の特異
的プライマーを用いて、上記のｃＤＮＡを鋳型にＰＣＲ
（ポリメラーゼ・チェーン・リアクション）反応を行う
ことによって、該２種類の遺伝子の断片を増幅し増幅断
片を得ることと、上記の増幅断片をプローブとして、上
記のｃＤＮＡライブラリーをハイブリダイゼーションア
ッセイによりスクリ−ニングすることで、遺伝子の全長
を含むクローンを単離することと、を特徴とする。
【００２０】上記２種類の遺伝子の特異的プライマーの
うち、一方は、以下の塩基配列 （Ｆｏｒｗａｒｄ）：５‘Ａ−Ｔ−Ｇ−Ａ−Ａ−Ｔ／Ｃ
−Ｇ−Ａ−Ｔ／Ｃ−Ｃ−Ｃ−Ｎ−Ａ−Ａ−Ｔ／Ｃ−Ｇ−
Ｇ （配列番号３） を有し、他方は、以下の塩基配列 （Ｒｅｖｅｒｓｅ）：５‘Ｃ−Ｃ−Ｎ−Ｇ−Ｔ−Ｎ−Ｇ
−Ｃ−Ａ／Ｇ−Ｔ−Ｔ−Ａ／Ｇ−Ｔ−Ｔ−Ａ／Ｇ−Ａ−
Ａ （配列番号４） を有する。
うち、一方は、以下の塩基配列 （Ｆｏｒｗａｒｄ）：５‘Ａ−Ｔ−Ｇ−Ａ−Ａ−Ｔ／Ｃ
−Ｇ−Ａ−Ｔ／Ｃ−Ｃ−Ｃ−Ｎ−Ａ−Ａ−Ｔ／Ｃ−Ｇ−
Ｇ （配列番号３） を有し、他方は、以下の塩基配列 （Ｒｅｖｅｒｓｅ）：５‘Ｃ−Ｃ−Ｎ−Ｇ−Ｔ−Ｎ−Ｇ
−Ｃ−Ａ／Ｇ−Ｔ−Ｔ−Ａ／Ｇ−Ｔ−Ｔ−Ａ／Ｇ−Ａ−
Ａ （配列番号４） を有する。
【００２１】すなわち、本発明のフルクタン代謝酵素遺
伝子は、低温発現型フルクタン代謝酵素遺伝子である。
これら低温発現型フルクタン代謝酵素遺伝子を単離する
方法としては、具体的には下記のようなプロセスによっ
て行われている。
伝子は、低温発現型フルクタン代謝酵素遺伝子である。
これら低温発現型フルクタン代謝酵素遺伝子を単離する
方法としては、具体的には下記のようなプロセスによっ
て行われている。
【００２２】詳しくは、札幌市の自然条件下で１１月２
２日までハードニング（低温順化）させた秋播小麦ＰＩ
１７３４３８（高度耐雪性を有する）からｍＲＮＡを抽
出する。そして、該ｍＲＮＡをもとにｃＤＮＡおよびｃ
ＤＮＡライブラリーを作製する。
２日までハードニング（低温順化）させた秋播小麦ＰＩ
１７３４３８（高度耐雪性を有する）からｍＲＮＡを抽
出する。そして、該ｍＲＮＡをもとにｃＤＮＡおよびｃ
ＤＮＡライブラリーを作製する。
【００２３】次いで、ＥＭＢＬ／Ｇｅｎｅｂａｎｋ／Ｄ
ＤＢＪＤＮＡデータバンクにおいて公開されている数種
の植物由来の、スクロース：フルクタン ６−フルクト
シルトランスフェラーゼ遺伝子およびインベルターゼ遺
伝子の塩基配列を詳細に解析し、すべての遺伝子におい
て高度に保存されている塩基配列部分を参考にして、ス
クロース：フルクタン ６−フルクトシルトランスフェ
ラーゼ遺伝子およびインベルターゼ遺伝子を同時に増幅
可能とする１組（該２種類遺伝子）の特異的プライマー
を設計する。
ＤＢＪＤＮＡデータバンクにおいて公開されている数種
の植物由来の、スクロース：フルクタン ６−フルクト
シルトランスフェラーゼ遺伝子およびインベルターゼ遺
伝子の塩基配列を詳細に解析し、すべての遺伝子におい
て高度に保存されている塩基配列部分を参考にして、ス
クロース：フルクタン ６−フルクトシルトランスフェ
ラーゼ遺伝子およびインベルターゼ遺伝子を同時に増幅
可能とする１組（該２種類遺伝子）の特異的プライマー
を設計する。
【００２４】設計された該１組（２種類遺伝子）の特異
的プライマーを用いて、上記のｃＤＮＡを鋳型にＰＣＲ
（ポリメラーゼ・チェーン・リアクション）反応を行っ
て、スクロース：フルクタン ６−フルクトシルトラン
スフェラーゼ遺伝子およびインベルターゼ遺伝子の予想
された断片（両酵素遺伝子の断片とも１５００塩基前
後）を増幅し、増幅部分の断片を得る。
的プライマーを用いて、上記のｃＤＮＡを鋳型にＰＣＲ
（ポリメラーゼ・チェーン・リアクション）反応を行っ
て、スクロース：フルクタン ６−フルクトシルトラン
スフェラーゼ遺伝子およびインベルターゼ遺伝子の予想
された断片（両酵素遺伝子の断片とも１５００塩基前
後）を増幅し、増幅部分の断片を得る。
【００２５】それぞれの増幅断片をプローブとして、上
記のｃＤＮＡライブラリーをハイブリダイゼーションア
ッセイによりスクリ−ニングすることで、遺伝子の全長
を含むクローンを単離する。単離したクローンの塩基配
列を解析し、小麦では新規のスクロース：フルクタン
６−フルクトシルトランスフェラーゼ遺伝子およびイン
ベルターゼ遺伝子であることを決定する。
記のｃＤＮＡライブラリーをハイブリダイゼーションア
ッセイによりスクリ−ニングすることで、遺伝子の全長
を含むクローンを単離する。単離したクローンの塩基配
列を解析し、小麦では新規のスクロース：フルクタン
６−フルクトシルトランスフェラーゼ遺伝子およびイン
ベルターゼ遺伝子であることを決定する。
【００２６】
【実施例】１）耐雪性秋播き小麦系統ＰＩ１７３４３８
からのｃＤＮＡ及びｃＤＮＡライブラリーの調製 ９月下旬にバットに播種し、自然条件下で１１月２２日
までハードニングさせた秋播小麦（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ
ａｓｔｉｖｕｍ Ｌ．）ＰＩ１７３４３８（高度耐雪性
を有する）のクラウン部分よりｍＲＮＡを常法により抽
出した。得られたｍＲＮＡ ５μｇを用いてｃＤＮＡ合
成キット（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製）を利用してｃＤ
ＮＡを合成した。ｃＤＮＡの両端末にアダプターを接続
後、λＺＡＰ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｖｅｃｔｏｒ
（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製）に組み込み、約６ｘ１０
６ｐｆｕのｃＤＮＡライブラリーを作製した。
からのｃＤＮＡ及びｃＤＮＡライブラリーの調製 ９月下旬にバットに播種し、自然条件下で１１月２２日
までハードニングさせた秋播小麦（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ
ａｓｔｉｖｕｍ Ｌ．）ＰＩ１７３４３８（高度耐雪性
を有する）のクラウン部分よりｍＲＮＡを常法により抽
出した。得られたｍＲＮＡ ５μｇを用いてｃＤＮＡ合
成キット（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製）を利用してｃＤ
ＮＡを合成した。ｃＤＮＡの両端末にアダプターを接続
後、λＺＡＰ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｖｅｃｔｏｒ
（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製）に組み込み、約６ｘ１０
６ｐｆｕのｃＤＮＡライブラリーを作製した。
【００２７】２）上記２種の遺伝子のプライマーを用い
て上記ｃＤＮＡを鋳型に行われるＰＣＲ反応 既知（ＥＭＢＬ／Ｇｅｎｅｂａｎｋ／ＤＤＢＪＤＮＡデ
ータバンクにおいて公開されている）のスクロース：フ
ルクタン ６−フルクトシルトランスフェラーゼ遺伝子
およびインベルターゼ遺伝子の塩基配列中でともに高度
に保存された領域に基づいてそれぞれ合成された、 （Ｆｏｒｗａｒｄ）：５‘Ａ−Ｔ−Ｇ−Ａ−Ａ−Ｔ／Ｃ
−Ｇ−Ａ−Ｔ／Ｃ−Ｃ−Ｃ−Ｎ−Ａ−Ａ−Ｔ／Ｃ−Ｇ−
Ｇ （配列番号３） という塩基配列を有する特異的プライマーと、 （Ｒｅｖｅｒｓｅ）：５‘Ｃ−Ｃ−Ｎ−Ｇ−Ｔ−Ｎ−Ｇ
−Ｃ−Ａ／Ｇ−Ｔ−Ｔ−Ａ／Ｇ−Ｔ−Ｔ−Ａ／Ｇ−Ａ−
Ａ （配列番号４） という塩基配列を有する特異的プライマーと、からなる
１組（上記２種類の遺伝子）の特異的プライマーを用い
て、上記により合成されたｃＤＮＡを鋳型にＰＣＲ反応
を行った。
て上記ｃＤＮＡを鋳型に行われるＰＣＲ反応 既知（ＥＭＢＬ／Ｇｅｎｅｂａｎｋ／ＤＤＢＪＤＮＡデ
ータバンクにおいて公開されている）のスクロース：フ
ルクタン ６−フルクトシルトランスフェラーゼ遺伝子
およびインベルターゼ遺伝子の塩基配列中でともに高度
に保存された領域に基づいてそれぞれ合成された、 （Ｆｏｒｗａｒｄ）：５‘Ａ−Ｔ−Ｇ−Ａ−Ａ−Ｔ／Ｃ
−Ｇ−Ａ−Ｔ／Ｃ−Ｃ−Ｃ−Ｎ−Ａ−Ａ−Ｔ／Ｃ−Ｇ−
Ｇ （配列番号３） という塩基配列を有する特異的プライマーと、 （Ｒｅｖｅｒｓｅ）：５‘Ｃ−Ｃ−Ｎ−Ｇ−Ｔ−Ｎ−Ｇ
−Ｃ−Ａ／Ｇ−Ｔ−Ｔ−Ａ／Ｇ−Ｔ−Ｔ−Ａ／Ｇ−Ａ−
Ａ （配列番号４） という塩基配列を有する特異的プライマーと、からなる
１組（上記２種類の遺伝子）の特異的プライマーを用い
て、上記により合成されたｃＤＮＡを鋳型にＰＣＲ反応
を行った。
【００２８】上記ＰＣＲ反応は、５０μｌ の反応系で
行われた。日本ジーン社製ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ
（５ｕｎｉｔｓ／μｌ）を１μｌ、１０×ポリメラーゼ
バッファー（ＭｇＣｌ２を含む）を５μｌ、ｄＮＴＰ液
（１０ｍＭ）を５μｌ、上記の各プライマー（１２μ
Ｍ）を２μｌ、および上記で合成したｃＤＮＡを約１０
ｎｇ加えて、反応液全量を蒸留水で５０μｌとした。Ｐ
ＣＲの反応条件および反応回数は、以下の表１に示す。
行われた。日本ジーン社製ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ
（５ｕｎｉｔｓ／μｌ）を１μｌ、１０×ポリメラーゼ
バッファー（ＭｇＣｌ２を含む）を５μｌ、ｄＮＴＰ液
（１０ｍＭ）を５μｌ、上記の各プライマー（１２μ
Ｍ）を２μｌ、および上記で合成したｃＤＮＡを約１０
ｎｇ加えて、反応液全量を蒸留水で５０μｌとした。Ｐ
ＣＲの反応条件および反応回数は、以下の表１に示す。
【００２９】
【表１】 （表１において、「変性」は、ＤＮＡの二本鎖をそれぞ
れの一本鎖に変える反応を意味し、「伸張反応」は、Ｄ
ＮＡ断片の増幅反応を意味し、「３０回」は、変性とニ
ーリングと伸張反応とを含むサイクルを３０回にわたり
繰り返すことを意味している）
れの一本鎖に変える反応を意味し、「伸張反応」は、Ｄ
ＮＡ断片の増幅反応を意味し、「３０回」は、変性とニ
ーリングと伸張反応とを含むサイクルを３０回にわたり
繰り返すことを意味している）
【００３０】上記ＰＣＲ反応の結果、配列番号３の塩基
配列および配列番号４の塩基配列を有する１組（上記２
種類の遺伝子）のプライマーから、既知のスクロース：
フルクタン６−フルクトシルトランスフェラーゼ遺伝子
およびインベルターゼ遺伝子から予測された長さの断片
（両遺伝子とも１５００塩基前後）が増幅された。それ
ぞれを単離精製後、常法に基づき市販の自動ＤＮＡシー
ケンサー（ＡＢＩ社製、モデル３７３Ｓ）を利用し、そ
れぞれの増幅断片の塩基配列を決定することで、新規の
スクロース：フルクタン６−フルクトシルトランスフェ
ラーゼ遺伝子およびインベルターゼ遺伝子の部分断片が
単離されたことが確認された。
配列および配列番号４の塩基配列を有する１組（上記２
種類の遺伝子）のプライマーから、既知のスクロース：
フルクタン６−フルクトシルトランスフェラーゼ遺伝子
およびインベルターゼ遺伝子から予測された長さの断片
（両遺伝子とも１５００塩基前後）が増幅された。それ
ぞれを単離精製後、常法に基づき市販の自動ＤＮＡシー
ケンサー（ＡＢＩ社製、モデル３７３Ｓ）を利用し、そ
れぞれの増幅断片の塩基配列を決定することで、新規の
スクロース：フルクタン６−フルクトシルトランスフェ
ラーゼ遺伝子およびインベルターゼ遺伝子の部分断片が
単離されたことが確認された。
【００３１】３）本発明のスクロース：フルクタン６−
フルクトシルトランスフェラーゼ遺伝子およびインベル
ターゼ遺伝子を有するｃＤＮＡクローンの単離・塩基配
列の決定 上記により得られたｃＤＮＡライブラリーのうちおよそ
１０万クローンをプロットしたフィルターを利用し、上
記により得られた新規スクロース：フルクタン６−フル
クトシルトランスフェラーゼ遺伝子およびインベルター
ゼ遺伝子の部分断片をラジオアイソトープで標識したプ
ローブを利用してハイブリダイゼーシヨンアッセイを行
った。
フルクトシルトランスフェラーゼ遺伝子およびインベル
ターゼ遺伝子を有するｃＤＮＡクローンの単離・塩基配
列の決定 上記により得られたｃＤＮＡライブラリーのうちおよそ
１０万クローンをプロットしたフィルターを利用し、上
記により得られた新規スクロース：フルクタン６−フル
クトシルトランスフェラーゼ遺伝子およびインベルター
ゼ遺伝子の部分断片をラジオアイソトープで標識したプ
ローブを利用してハイブリダイゼーシヨンアッセイを行
った。
【００３２】ハイブリダイゼーション反応は、５０％ホ
ルムアミド、５×ＳＳＰＥ液、５×デンハルト液、０・
５％ＳＤＳ液、０．２ｍｇ／ｍｌのサケ精子ＤＮＡを加
え、４２℃の条件下で１６時間にわたって行われた。
ルムアミド、５×ＳＳＰＥ液、５×デンハルト液、０・
５％ＳＤＳ液、０．２ｍｇ／ｍｌのサケ精子ＤＮＡを加
え、４２℃の条件下で１６時間にわたって行われた。
【００３３】その後、上記フィルターに対して、２×Ｓ
ＳＣ液および０．１％ＳＤＳ液を用いて６５℃の条件下
で１０分間を必要とする洗浄を２度にわたり実施した。
次いで、０．１×ＳＳＣ液および０．１％ＳＤＳ液を用
いて６５℃の条件下で１５分間を必要とする洗浄を２度
にわたり行った。洗浄されたフィルターとＸ線フィルム
を利用し、ラジオアイソトーブで標識したプローブと結
合した陽性クローンをスクリーニングした。
ＳＣ液および０．１％ＳＤＳ液を用いて６５℃の条件下
で１０分間を必要とする洗浄を２度にわたり実施した。
次いで、０．１×ＳＳＣ液および０．１％ＳＤＳ液を用
いて６５℃の条件下で１５分間を必要とする洗浄を２度
にわたり行った。洗浄されたフィルターとＸ線フィルム
を利用し、ラジオアイソトーブで標識したプローブと結
合した陽性クローンをスクリーニングした。
【００３４】このように得られた約３５個の陽性クロー
ンについてそれぞれ、ＡＢＩ社製ＤＮＡシーケンサーを
用いて塩基配列を決定した。得られた候補クローンの塩
基配列の解析から、図１に示す配列番号１記載のアミノ
酸配列をコードする塩基配列からなる新規スクロース：
フルクタン６−フルクトシルトランスフェラーゼ遺伝
子、および図２に示す配列番号２記載のアミノ酸配列を
コードする塩基配列からなる新規インベルターゼ遺伝子
がそれぞれ単離されたことが判った。
ンについてそれぞれ、ＡＢＩ社製ＤＮＡシーケンサーを
用いて塩基配列を決定した。得られた候補クローンの塩
基配列の解析から、図１に示す配列番号１記載のアミノ
酸配列をコードする塩基配列からなる新規スクロース：
フルクタン６−フルクトシルトランスフェラーゼ遺伝
子、および図２に示す配列番号２記載のアミノ酸配列を
コードする塩基配列からなる新規インベルターゼ遺伝子
がそれぞれ単離されたことが判った。
【００３５】具体的には、単離されたのは、１８４８塩
基、６１６アミノ酸からなるタンパクを有し、大麦のス
クロース：フルクタン６−フルクトシルトランスフェラ
ーゼ遺伝子と９３％（アミノ酸配列レベル）の相同性を
持つ小麦の新規なスクロース：フルクタン ６−フルク
トシルトランスフェラーゼ遺伝子（図１に示す配列番号
１記載のアミノ酸配列をコードする塩基配列からな
る）、及び１９８６塩基、６６２アミノ酸からなるタン
パクを有し、サトウキビのインベルターゼ遺伝子と５５
％（アミノ酸配列レベル）の相同性を持つ小麦の新規な
インベルターゼ遺伝子（図２に示す配列番号２記載のア
ミノ酸配列をコードする塩基配列からなる）である。
基、６１６アミノ酸からなるタンパクを有し、大麦のス
クロース：フルクタン６−フルクトシルトランスフェラ
ーゼ遺伝子と９３％（アミノ酸配列レベル）の相同性を
持つ小麦の新規なスクロース：フルクタン ６−フルク
トシルトランスフェラーゼ遺伝子（図１に示す配列番号
１記載のアミノ酸配列をコードする塩基配列からな
る）、及び１９８６塩基、６６２アミノ酸からなるタン
パクを有し、サトウキビのインベルターゼ遺伝子と５５
％（アミノ酸配列レベル）の相同性を持つ小麦の新規な
インベルターゼ遺伝子（図２に示す配列番号２記載のア
ミノ酸配列をコードする塩基配列からなる）である。
【００３６】このように得られた遺伝子の酵素活性を確
認するために、これら遺伝子を組み込んだ酵母の培養液
を利用して、下記のような条件で酵素反応を行った。 〈酵素反応〉 ２０ｍＭクエン酸・リン酸緩衝液 ｐＨ５．５ 最終基質濃度 ５０ｍＭ スクロース 反応条件 ４℃、１７時間
認するために、これら遺伝子を組み込んだ酵母の培養液
を利用して、下記のような条件で酵素反応を行った。 〈酵素反応〉 ２０ｍＭクエン酸・リン酸緩衝液 ｐＨ５．５ 最終基質濃度 ５０ｍＭ スクロース 反応条件 ４℃、１７時間
【００３７】その結果、新規なスクロース：フルクタン
６−フルクトシルトランスフェラーゼ遺伝子を組み込
んだ酵母の培養液中には、２糖であるスクロースを基質
として３糖のケストトリオースおよび４糖のケストテト
ラオースを合成する合成能があることが判った。また、
新規なインベルターゼ遺伝子を組み込んだ酵母の培養液
中には、２糖であるスクロースを基質として３糖のケス
トトリオースを合成する合成能および、スクロースをグ
ルコースとフルクトースに分解する分解能があることが
判った。
６−フルクトシルトランスフェラーゼ遺伝子を組み込
んだ酵母の培養液中には、２糖であるスクロースを基質
として３糖のケストトリオースおよび４糖のケストテト
ラオースを合成する合成能があることが判った。また、
新規なインベルターゼ遺伝子を組み込んだ酵母の培養液
中には、２糖であるスクロースを基質として３糖のケス
トトリオースを合成する合成能および、スクロースをグ
ルコースとフルクトースに分解する分解能があることが
判った。
【００３８】また、上記のように得られた遺伝子の塩基
配列は、以下の通りである。
配列は、以下の通りである。
【００３９】
【発明の効果】本発明によれば、既知のスクロース：フ
ルクタン ６−フルクトシルトランスフェラーゼ遺伝子
とアミノ酸配列の異なる小麦由来の新規スクロース：フ
ルクタン ６−フルクトシルトランスフェラーゼ遺伝子
と、既知のインベルターゼ遺伝子とアミノ酸配列の異な
る小麦由来の新規インベルターゼ遺伝子が提供される。
ルクタン ６−フルクトシルトランスフェラーゼ遺伝子
とアミノ酸配列の異なる小麦由来の新規スクロース：フ
ルクタン ６−フルクトシルトランスフェラーゼ遺伝子
と、既知のインベルターゼ遺伝子とアミノ酸配列の異な
る小麦由来の新規インベルターゼ遺伝子が提供される。
【００４０】本発明における新規スクロース：フルクタ
ン ６−フルクトシルトランスフェラーゼ遺伝子及び新
規インベルターゼ遺伝子は、低温環境でフルクタン代謝
能を有することから、本発明のスクロース：フルクタン
６−フルクトシルトランスフェラーゼ遺伝子またはイン
ベルターゼ遺伝子を植物体に導入することによって、植
物の耐寒性を向上させることとなり、高度耐寒性を有す
る植物品種を提供することができる。
ン ６−フルクトシルトランスフェラーゼ遺伝子及び新
規インベルターゼ遺伝子は、低温環境でフルクタン代謝
能を有することから、本発明のスクロース：フルクタン
６−フルクトシルトランスフェラーゼ遺伝子またはイン
ベルターゼ遺伝子を植物体に導入することによって、植
物の耐寒性を向上させることとなり、高度耐寒性を有す
る植物品種を提供することができる。
【００４１】また、本発明における新規スクロース：フ
ルクタン ６−フルクトシルトランスフェラーゼ遺伝子
及び新規インベルターゼ遺伝子は、フルクトオリゴ糖の
合成能を有することから、虫歯予防効果・腸内ビフィズ
ス菌増殖作用など人間の健康に有用な機能性オリゴ糖の
生産に対しても、有用なフルクタン合成酵素遺伝子とし
て有効に適用される。
ルクタン ６−フルクトシルトランスフェラーゼ遺伝子
及び新規インベルターゼ遺伝子は、フルクトオリゴ糖の
合成能を有することから、虫歯予防効果・腸内ビフィズ
ス菌増殖作用など人間の健康に有用な機能性オリゴ糖の
生産に対しても、有用なフルクタン合成酵素遺伝子とし
て有効に適用される。
【図面の簡単な説明】
【図１】配列番号１記載のアミノ酸配列を示す図であ
る。
る。
【図２】配列番号２記載のアミノ酸配列を示す図であ
る。
る。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 1/02 Ａ６１Ｋ 31/00 ６０１Ｂ 1/14 ６０１Ｊ Ａ６１Ｋ 31/715 31/715 (72)発明者 寺見 文宏 北海道札幌市豊平区羊ケ丘１番地 農試宿 舎１号棟304号 Ｆターム(参考） 2B030 AA02 AB03 AD04 AD08 CA06 CB03 4B024 AA01 AA03 AA05 AA08 BA10 BA12 CA04 CA09 CA20 HA13 HA14 4B050 CC01 DD13 LL01 LL02 LL05 4B063 QA13 QQ04 QQ26 QQ35 QQ44 QR08 QR32 QR40 QR42 QR56 QR62 QR75 QR79 QS25 QS34 QS38 QX01 4C086 AA03 EA20 ZA67 ZA73 ZC19
Claims (10)
- 【請求項１】 図１に示す配列番号１記載のアミノ酸配
列を有することを特徴とする小麦スクロース：フルクタ
ン ６−フルクトシルトランスフェラーゼ遺伝子。 - 【請求項２】 上記小麦スクロース：フルクタン ６−
フルクトシルトランスフェラーゼ遺伝子は、１８４８塩
基、６１６アミノ酸からなるタンパクを有し、大麦由来
の同遺伝子と９３％（アミノ酸配列レベル）の相同性を
持つことを特徴とする請求項１記載の小麦スクロース：
フルクタン ６−フルクトシルトランスフェラーゼ遺伝
子。 - 【請求項３】 上記小麦スクロース：フルクタン ６−
フルクトシルトランスフェラーゼ遺伝子は、低温環境下
で酵素機能を有し、植物体に導入されることによって、
植物に耐寒性を与えることを特徴とする請求項１記載の
小麦スクロース：フルクタン ６−フルクトシルトラン
スフェラーゼ遺伝子。 - 【請求項４】 上記小麦スクロース：フルクタン ６−
フルクトシルトランスフェラーゼ遺伝子は、人間の健康
上有用なフルクトオリゴ糖を合成する機能を持つことを
特徴とする請求項１記載の小麦スクロース：フルクタン
６−フルクトシルトランスフェラーゼ遺伝子。 - 【請求項５】 図２に示す配列番号２記載のアミノ酸配
列を有することを特徴とする小麦インベルターゼ遺伝
子。 - 【請求項６】 上記小麦インベルターゼ遺伝子は、１９
８６塩基、６６２アミノ酸からなるタンパクを有し、サ
トウキビ由来の同遺伝子と５５％（アミノ酸配列レベ
ル）の相同性を持つことを特徴とする請求項５記載のイ
ンベルターゼ遺伝子。 - 【請求項７】 上記小麦インベルターゼ遺伝子は、低温
環境下で酵素機能を有し、植物体に導入されることによ
って、植物に耐寒性を与えることを特徴とする請求項５
記載の小麦インベルターゼ遺伝子。 - 【請求項８】 上記小麦インベルターゼ遺伝子は、人間
の健康上有用なフルクトオリゴ糖を合成する機能を持つ
ことを特徴とする請求項５記載の小麦インベルターゼ遺
伝子。 - 【請求項９】低温発現型フルクタン代謝酵素を有する遺
伝子の単離方法であって、 ハードニング（低温順化）による病害抵抗性の向上に関
与する低温発現型フルクタン代謝酵素遺伝子を単離する
ことを目的として、充分にハードニングを施した秋播小
麦ＰＩ１７３４３８（高度耐雪性を有する）からｍＲＮ
Ａを抽出することと、 上記ｍＲＮＡをもとにｃＤＮＡおよびｃＤＮＡライブラ
リーを作製することと、 ＥＭＢＬ／Ｇｅｎｅｂａｎｋ／ＤＤＢＪＤＮＡデータバ
ンクによって公開されている数種の植物由来のスクロー
ス：フルクタン６−フルクトシルトランスフエラーゼ遺
伝子およびインベルターゼ遺伝子において高度に保存さ
れている塩基配列部分を参考にして、該２種類の遺伝子
の特異的プライマーを設計することと、 設計された該２種類の遺伝子の特異的プライマーを用い
て、上記のｃＤＮＡを鋳型にＰＣＲ（ポリメラーゼ・チ
ェーン・リアクション）反応を行うことによって、該２
種類の遺伝子の断片を増幅し増幅断片を得ることと、 上記の増幅断片をプローブとして、上記のｃＤＮＡライ
ブラリーをハイブリダイゼーションアッセイによりスク
リ−ニングすることで、遺伝子の全長を含むクローンを
単離することと、 を特徴とする、低温発現型フルクタン代謝酵素を有する
遺伝子の単離方法。 - 【請求項１０】 上記２種類の遺伝子の特異的プライマ
ーのうち、 一方は、以下の塩基配列 （Forward）：５‘Ａ−Ｔ−Ｇ−Ａ−Ａ−Ｔ／Ｃ−Ｇ−
Ａ−Ｔ／Ｃ−Ｃ−Ｃ−Ｎ−Ａ−Ａ−Ｔ／Ｃ−Ｇ−Ｇ
（配列番号３） を有し、他方は、以下の塩基配列 （Reverse）： ５‘Ｃ−Ｃ−Ｎ−Ｇ−Ｔ−Ｎ−Ｇ−Ｃ−
Ａ／Ｇ−Ｔ−Ｔ−Ａ／Ｇ−Ｔ−Ｔ−Ａ／Ｇ−Ａ−Ａ
（配列番号４） を有することを特徴とする請求項９記載の、低温発現型
フルクタン代謝酵素を有する遺伝子の単離方法。
Priority Applications (7)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP11081695A JP2000350583A (ja) | 1999-03-25 | 1999-03-25 | 低温発現型フルクタン代謝酵素遺伝子 |
| CA002301354A CA2301354C (en) | 1999-03-25 | 2000-03-23 | Low temperature expression cdnas encoding fructan synthesizing enzymes and method of isolating the same |
| GB0007243A GB2350363B (en) | 1999-03-25 | 2000-03-24 | Low temperature expression cDNAs encoding fructan synthesizing enzymes and method of isolating the same |
| US09/534,228 US6780623B1 (en) | 1999-03-25 | 2000-03-24 | Low temperature expression cDNAs encoding fructan synthesizing enzymes and method of isolating the same |
| DE10014639A DE10014639B4 (de) | 1999-03-25 | 2000-03-24 | cDNSen mit einer Kodierung von Enzymen zur Fructan-Synthese mit einer Niedertemperatur-Expression sowie Verfahren zu deren Isolierung |
| AU22586/00A AU734917C (en) | 1999-03-25 | 2000-03-24 | Low temperature expression cDNAs encoding fructan synthesizing enzymes and method of isolating the same |
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