KR100980433B1

KR100980433B1 - 내냉성 식물 및 그의 개발방법

Info

Publication number: KR100980433B1
Application number: KR1020077029997A
Authority: KR
Inventors: 미도리 요시다; 아키라 카와카미; 유타카 사토
Original assignee: 도꾸리쯔 교세이호징 노우교 · 쇼쿠힝 산교 기쥬쯔 소고 겡뀨 기꼬우
Priority date: 2005-06-22
Filing date: 2006-06-21
Publication date: 2010-09-07
Also published as: JP4714894B2; WO2006137574A1; EP1914308A4; AU2006260065B2; AU2006260065A1; EP1914308A1; JP2007000050A; KR20080012990A

Abstract

프럭탄 합성 효소 유전자를 포함하는 강화된 내냉성을 갖는 트랜스제닉 벼, 상기 유전자를 벼 세포에 도입하는 것에 의한 벼의 내냉성 강화법, 및 벼 재배에서 냉온 장해를 경감하기 위한 상기 트랜스제닉 벼의 용도.

내냉성 식물, 프럭탄 합성효소, 트랜스제닉 벼

Description

내냉성 식물 및 그의 개발방법{Cold-hardy plant and method for development of the same}

본 발명은 내냉성(耐冷性) 강화 식물 및 식물의 내냉성 강화법에 관한 것이다.

한랭지에서 작물 재배에서는 이른 봄이나 만추의 상해(霜害), 하절기의 냉온에 의한 냉해, 동절기의 동해나 설해 등의 저온과 관련된 장해가 발생하기 쉽다. 그래서 저온내성을 강화시킨 여러가지 작물의 개발이 종래부터 적극적으로 진행되고 있다.

저온 내성은 온도 요인의 면에서 내냉성과 내한성으로 크게 분류된다. 내냉성은 작물이 이른 봄 내지 가을 사이에 노출되는 플러스 온도역의 저온(냉온)에 대한 내성이다. 일반적으로 작물은 이 시기의 냉온에 의해 생육 지연, 등숙(登熟) 불량, 불임 등의 장해를 유발하기 쉽다. 따라서, 작물의 고도의 내냉성은 이들의 장해에 의한 수확량의 감소를 경감하므로 유리하다. 한편, 내한성은 주로 월동성의 작물이 동절기에 노출되는 동결온도(0℃ 이하)에 대한 내성이다. 내한성에는 내동성(0℃ 이하에서의 동결장해를 회피하는 능력), 내설성(0℃ 이하에서의 동결장해를 회피하고, 또 암흑하에서도 장기 생존할 수 있는 능력) 등이 포함된다. 내한성을 나타내는 작물은 동결온도하에서도 동결에 의한 장해를 최소한으로 억제하여 생존가능할 수 있다.

식물의 내한성에 기여하는 물질로서는 프럭탄(fructan)이 알려져 있다. 프럭탄은 월동시의 에너지원이고 또 동결방지 및 건조내성 기능을 갖는 다당류이다. 박테리아 및 식물유래의 프럭탄 합성 효소 유전자를 동물에 도입하여, 식물의 내동성 및 내건조성을 향상시키는 연구가 알려져 있고, 담배(비특허문헌 1) 및 페레니얼 라이그래스(비특허문헌 2)에서는 내동성 및 내건조성이 향상되는 것이 보고되어 있다. 가을 파종 밀이 가진 고도의 내한성에 기여하는 프럭탄 합성효소 유전자도 단리되어 있다(특허문헌 1 및 비특허문헌 3).

비월동성 작물인 벼의 조기재배 및 직파 재배에서도 벼의 생육 초기에서 10℃를 하회하는 저온에 조우하는 것이 많기 때문에 가끔 현저한 저온 장해가 발생하여 벼의 고사로 이어진다(비특허문헌 4). 또한 이삭이 패는 시기의 벼가 하절기의 저온에 조우한 경우, 벼의 화분형성이 저해되어 불임으로 되어 수확량이 크게 저하된다(비특허문헌 5). 이들 시기에서 내냉성을 강화한 벼의 개발은 현재 정력적으로 시도되고 있지만, 기존의 유전자원을 재료로 한 육종법으로는 내냉성의 대폭적인 향상을 바라기에는 한계가 있다.

특허문헌 1: 특개 2000-350583호 공보

비특허문헌 1: Konstantinova T. et al., Plant Sci. (2002) 163: p.157-164

비특허문헌 2: Hisano H. et al., Plant Sci. (2004) 167: p.861-868

비특허문헌 3: Kawakami A. and Yoshida M., Biosci. Biotechnol. Biochem. (2002) 66(11), p. 2297-2305

비특허문헌 4: 다시마(田島) 등, "저온에 의한 벼의 생육 저해의 생리적 연구", 농기연보, (1983) 34: p. 69-111

비특허문헌 5: Satake T. and Hayase H., Proc. Crop Sci. Japan (1970) 39: p.468-473

비특허문헌 6: Garham D. and Patterson B.D., Ann. Rev. Plant Physiol. (1982) 33: p.347-372.

발명의 개시

본 발명은 플러스 온도역의 저온 스트레스에 대한 내성(내냉성)을 갖는 식물 및 식물에서 내냉성의 강화법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명자들은 상기 과제를 해결하기 위하여 예의 검토를 거듭한 결과, 프럭탄 합성효소 유전자인 수크로오스: 수크로오스 1-프럭토실트랜스퍼라아제(1-SST; sucrose:sucrose 1-fructosyltransferase) 유전자, 또는 수크로오스: 프럭탄 6-프럭토실트랜스퍼라아제 (sucrose: fructan 6-fructosyltransferase) 유전자를 도입한 트랜스제닉(transgenic) 벼가 강한 내냉성(플러스 온도역의 저온 내성)을 나타내는 것을 발견하고, 이 발견을 기초로 하여 본 발명을 완성하기에 이르렀다. 프럭탄이라는 것은 주로 수크로오스에 프럭토오스가 중합된 삼당 이상의 당의 총칭이며, 프럭토오스만이 중합된 다당도 포함된다.

즉, 본 발명은 다음을 포함한다.

[1] 이하의 (a) ~ (f)중 적어도 1개의 프럭탄 합성효소 유전자를 포함하는, 강화된 내냉성을 갖는 트랜스제닉 벼.

(a) 서열번호 1 또는 3에 개시하는 염기서열을 포함하는 유전자;

(b) 서열번호 1 또는 3에 나타내는 염기서열을 포함하는 DNA와 스트린젠트(stringent) 조건하에서 하이브리다이즈(hybridize)하고 또 프럭탄 합성 활성을 갖는 단백질을 암호화하는 DNA를 포함하는 유전자;

(c) 서열번호 2 또는 4에 나타내는 아미노산 서열을 포함하는 단백질을 암호화하는 유전자;

(d) 서열번호 2 또는 4에 나타내는 아미노산 서열에서 1 또는 수 개의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가된 아미노산 서열을 포함하고 또 프럭탄 합성 활성을 갖는 단백질을 암호화하는 유전자;

(e) 서열번호 1 또는 3에 나타내는 염기서열과 85% 이상의 동일성을 나타내는 염기서열을 포함하고, 또 프럭탄 합성 활성을 갖는 단백질을 암호화하는 유전자; 및

(f) 서열번호 2 또는 4에 나타내는 아미노산 서열과 85% 이상의 동일성을 나타내는 염기서열을 포함하고, 또 프럭탄 합성 활성을 갖는 단백질을 암호화하는 유전자.

이 트랜스제닉 벼에서 강화되어 있는 내냉성은 바람직하게는 유묘기(幼苗期) 내냉성 및/또는 이삭 패는 시기 내냉성이다.

[2] 이하의 (a) ~ (f)중 적어도 1개의 프럭탄 합성 효소 유전자를 벼 세포에 도입하는 것을 특징으로 하는 벼의 내냉성을 강화하는 방법:

이 방법으로 강화되는 내냉성은 유묘기 내냉성 및/또는 이삭 패는 시기 내냉성인 것이 바람직하다.

[3] 벼 재배에서 냉온 장해를 경감하기 위하여 상기 [1] 또는 [2]에 기재한 트랜스제닉 벼의 용도. 이 용도에 의하면, 특히 벼의 유묘기 및/또는 이삭 패는 시기에 발생하는 냉온 장해를 효과적으로 경감할 수 있다.

본 발명의 트랜스제닉 벼는 플러스 온도역의 저온에 대해서 높은 내성을 나타낸다. 따라서 본 발명의 트랜스제닉 벼를 사용하면 하절기의 저온에 의한 고사 등의 냉해를 경감하고, 냉해가 생기기 쉬운 부적절한 땅에서도 충분한 생육량 및 수확량을 얻을 수 있는 재배가 가능하게 된다. 본 발명의 벼의 내냉성 강화법을 이용하는 것에 의하여 기존의 벼 품종에 고도의 내냉성을 부여할 수 있다.

본 명세서는 본원의 우선권의 기초로 되는 일본국 특허 출원 2005-182251호의 명세서 및/또는 도면에 기재된 내용을 포함한다.

발명을 실시하기 위한 최선의 형태

이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.

1. 본 발명의 트랜스제닉 벼와 그의 작제

1) 트랜스제닉 벼

본 발명의 트랜스제닉 벼는 유전자 도입된 프럭탄 합성효소 유전자인 수크로오스:수크로오스 1-프럭토실 트랜스퍼라아제 (1-SST) 유전자, 또는 수크로오스:프럭탄 6-프럭토실트랜스퍼라아제(6-SFT) 유전자를 그의 세포내에 유지하는 형질전환 벼이다.

본 발명의 트랜스제닉 벼에 있어서, 도입된 1-SST 유전자 또는 6-SFT 유전자는 숙주 벼 세포의 염색체에 조립되어 있는 것이 바람직하지만, 염색체 외에 유지되어 있어도 좋다. 1-SST 유전자 또는 6-SFT 유전자가 트랜스제닉 벼의 염색체 중에 조립되어 있는 경우, 이들 도입유전자는 호모접합성인 것이 바람직하지만, 헤테로 접합성이어도 좋다. 본 발명의 트랜스제닉 벼는 이들 도입 유전자를 3 커피 이상 갖고 있어도 좋다.

본 명세서에 있어서 용어 "트랜스제닉 벼"는 트랜스제닉 벼의 식물체 뿐만 아니라 도입 유전자를 발현하든지 또는 발현할 수 있는 상태로 유지되어 있는 세포 및 그의 벼 세포를 포함하는 벼 기관 "예컨대 잎, 꽃, 줄기, 뿌리, 열매(종자) 등", 벼 조직 "예컨대 표피, 사부(師部), 유조직, 본부(本部), 유관속, 책상 조직, 해면상 조직 등", 및 벼 배양세포 (예컨대 캘러스) 등도 의미한다. 본 발명의 트랜스제닉 벼에는 유전자 도입된 벼 세포 또는 그것을 포함하는 캘러스로부터 재생시킨 식물체의 자손 벼, 및 그의 일부도 포함된다.

2) 본 발명의 프럭탄 합성효소 유전자와 그의 제조

본 발명에서 벼에 도입되는 프럭탄 합성효소 유전자의 1-SST 유전자 및 6-SFT 유전자는 식물, 박테리아, 사상균을 포함하는 각종 생물 기원으로부터 단리되는 것이어도 좋다. 그와 같은 생물 기원으로서는 월동성의 생물이나 내한성 (내설성 또는 내동성)을 갖는 생물 등이 바람직하다. 한정하는 것은 아니지만, 1-SST 유전자 및 6-SFT 유전자는 가을 파종 밀(Triticum astivum L.)로부터 단리된 1-SST 유전자 및 6-SFT 유전자인 것이 보다 바람직하다. 또한 생물로부터 단리된 1-SST 유전자 및 6-SFT 유전자뿐만 아니라 그의 염기 서열에 염기 치환이나 결실 등의 변이를 포함하지만 프럭탄 합성효소를 암호화하고 있는 이들 유전자도 본 발명에서 사용할 수 있다.

구체적으로는, 본 발명에서 적합한 1-SST 유전자로서는 예컨대 가을 파종 밀의 1-SST 유전자인 서열번호 1에 나타내는 염기 서열을 포함하고, 또 서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는 수크로오스:수크로오스 1-프럭토실트랜스퍼라아제를 암호화하는 유전자를 들 수 있다. 또한 본 발명에서 적합한 6-SFT 유전자로서는, 예컨대 가을 파종 밀의 6-SFT 유전자인 서열번호 3에 나타내는 염기서열을 포함하고, 서열번호 4의 아미노산 서열을 갖는 수크로오스: 프럭탄 6-프럭토실트랜스퍼라아제를 암호화하는 유전자를 들 수 있다.

또한 본 발명에 관한 1-SST 유전자 또는 6-SFT 유전자는 서열번호 1 또는 3에 나타내는 염기 서열을 갖는 DNA와 스트린젠트 조건하에서 하이브리다이즈되고 또 프럭탄 합성 활성을 갖는 단백질을 암호화하는 DNA를 포함하는 유전자이어도 좋다.

본 발명에 관한 1-SST 유전자 또는 6-SFT 유전자는 서열번호 2 또는 4에 나타내는 아미노산 서열을 포함하는 단백질을 암호화하는 유전자이어도 좋고, 또 서열번호 2 또는 4에 나타내는 아미노산 서열에 있어서 1 또는 수 개(2~9개, 바람직하게는 2 ~ 5개)의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가된 아미노산 서열을 포함하고, 또 프럭탄 합성 활성을 갖는 단백질을 암호화하는 유전자이어도 좋다.

또는 본 발명의 1-SST 유전자 또는 6-SFT 유전자는 서열번호 1 또는 3에 나타내는 염기서열과 적어도 85% 이상, 바람직하게는 90% 이상의 동일성을 나타내는 염기 서열을 포함하고, 또 프럭탄 합성 활성을 갖는 단백질을 암호화하는 유전자이어도 좋다. 본 발명의 1-SST 유전자 또는 6-SFT 유전자는 또한 서열번호 2 또는 4에 나타내는 아미노산 서열과 적어도 60% 이상, 바람직하게는 70% 이상, 더욱 바람직하게는 85% 이상의 동일성을 나타내는 아미노산 서열을 포함하고, 또 프럭탄 합성 활성을 갖는 단백질을 암호화하는 유전자이어도 좋다.

본 발명에서, "스트린젠트 조건"이라는 것은 특이적인 핵산 하이브리드가 형성되는 조건을 말하며, 구체적으로는 나트륨 염 농도가 15~750 mM, 바람직하게는 50~750 mM, 더욱 바람직하게는 300~750 mM, 온도가 25~70℃, 보다 바람직하게는 55~65℃, 포름아미드 농도가 0~50%, 보다 바람직하게는 35~45%로 되는 반응 조건을 말한다. 스트린젠트 조건에서는 또한 하이브리다이제이션 후의 필터의 세정 조건을 나트륨 염 농도가 15~600 mM, 바람직하게는 50~600 mM, 더욱 바람직하게는 300~600mM, 온도가 50~70℃, 바람직하게는 55~70℃, 더욱 바람직하게는 60~65℃로 하는 것이 적합하다.

본 명세서에서 "유전자"라는 것은 DNA 또는 RNA일 수 있다. DNA에는 적어도 게놈 DNA, cDNA 가 포함되고, RNA에는 mRNA가 포함된다. 본 발명의 1-SST 유전자 및 6-SFT 유전자는 1-SST 유전자 또는 6-SFT 유전자의 오픈 리딩 프레임(open reading frame) 서열 이외에, 비번역 영역(UTR)의 서열 등을 포함하여도 좋다.

1-SST 유전자 또는 6-SFT 유전자로 암호화되는 효소의 프럭탄 합성 활성은 1-SST 유전자의 경우는 수크로오스:수크로오스 1-프럭토실트랜스퍼라아제 활성인 것이 바람직하고, 6-SFT 유전자인 경우는 수크로오스: 프럭탄 6-프럭토실트랜스퍼라아제 활성인 것이 바람직하다.

본 발명의 1-SST 유전자 또는 6-SFT 유전자로 암호화되는 효소(단백질)가 갖는 프럭탄 합성 활성은 수크로오스 및 프럭탄을 기질로 하여 보다 장쇄의 프럭탄을 합성하는 기능이다(비특허문헌 3). 구체적으로는, 프럭탄 합성효소 1-SST는 수크로오스 2분자를 기질로서 하고, 그 한쪽 수크로오스 유래의 프럭토오스를 다른 한쪽의 수크로오스에 β 2,1-결합으로 전이시켜 1-케스토스(3당의 프럭탄)을 합성하는 활성을 주로 갖는다. 또한 프럭탄 합성효소 1-SST는 합성된 1-케스토스에 프럭토오스를 β 2,1-결합에 의해 전이시키는 것에 의해 장쇄의 프럭탄을 합성하는 활성도 갖는다. 한편, 프럭탄 합성 효소 6-SFT는 수크로오스 2분자를 기질로 한 경우, 수크로오스를 분해하여 글루코오스와 프럭토오스를 생성하는 활성을 주로 갖는 것과 함께, 한쪽의 수크로오스 유래의 프럭토오스를 다른 한쪽의 수크로오스에 β 2,1- 또는 β 2,6-결합으로 전이시켜 1-케스토오스 또는 6-케스토오스를 합성하는 활성을 함께 갖는다. 또한 6-SFT는 수크로오스와 프럭탄을 기질로 하여 수크로오스 유래의 프럭토오스를 프럭탄에 β 2,6-결합으로 전이시켜 보다 장쇄의 프럭탄을 합성하는 활성을 갖는다.

이들 프럭탄 합성 효소의 프럭탄 합성 활성은 비특허문헌 3에 기재되어 있는 바와 같이, 예컨대 다음과 같이 확인할 수 있다. 먼저, 단리한 유전자를 재조합 발현 벡터에 조립하고, 그의 재조합 발현 벡터를 이용하여 효모를 형질전환시켜 얻어진 형질전환체에서 그의 재조합 벡터로부터 단백질의 발현을 유도한 후, 도입 유전자 유래의 단백질을 정제 및 농축한다. 이 농축액을 조효소액으로 하여 수크로오스, 또는 수크로오스 및 1-케스토오스를 기질로 하여 10℃에서 2시간 반응시켜 DIONEX사의 DX500을 사용한 고속 음이온 교환 크로마토그래피(HPAEC; High Performance Anion-Exchange Chromatography)법에 의해 Carbopac PA-1 칼럼 (DIONEX 사 제조)을 사용하여 분석한다. 그 결과 1-SST 유전자를 도입한 효모 유래의 조효소액을 사용하여 수크로오스를 기질로 하여 분석을 실시한 경우, 1-케스토오스를 나타내는 피이크가 검출되는 것에 의해 그의 1-SST 유전자로 암호화된 효소의 수크로오스:수크로오스 1-프럭토실트랜스퍼라아제 활성을 확인할 수 있다.

한편, 6-SFT 유전자를 도입한 효모유래의 조효소액을 사용하여 수크로오스를 기질로 하여 동일한 분석을 실시한 경우에는, 그의 분해 활성을 나타내는 프럭토오스와 글루코오스의 피이크 모두에 1-케스토오스 및 6-케스토오스의 피이크가 검출되는 점, 또한 수크로오스와 1-케스토오스를 기질로 한 경우, 비프럭코오스 (수크로오스를 구성하는 프럭토오스에 β 2,1-결합 및 β 2,6-결합하는 프럭토오스를 1개씩 갖는 4당 프럭탄)이 검출되는 것에 의해 그의 6-SFT 유전자로 암호화된 효소의 수크로오스: 프럭탄 6-프럭토실트랜스퍼라아제 활성을 확인할 수 있다.

이상에서 설명한 바와 같은 본 발명의 1-SST 유전자 또는 6-SFT 유전자를 포함하는 DNA 단편은 당업자라면 1-SST 유전자 및 6-SFT 유전자의 이미 알려진 서열을 이용하여 11-SST 유전자 및 6-SFT 유전자를 갖는 생물로부터 추출한 핵산으로부터 통상의 방법에 따라 얻을 수 있다.

일 실시예로서, 프럭탄을 축적하는 식물의 프럭탄을 축적하는 조직으로부터 통상의 방법에 따라 추출된 mRNA로부터 합성한 cDNA를 주형으로 하여 기지의 프럭탄 합성효소 유전자 사이에서 고도로 보존된 영역을 기초로 하여 설계한 플라이머를 이용하여 PCR 증폭하는 것에 의해, 1-SST 유전자 또는 6-SFT 유전자의 부분 단편을 얻고, 이 단편을 프로브로 하여 상기 cDNA 유래의 cDNA 라이브러리를 블롯한 필터와의 하이브리다이제이션을 실시하는 것에 의해 1-SST 유전자 또는 6-SFT 유전자의 전체 길이를 포함하는 cDNA 클론을 단리할 수 있다.

또한 다른 일실시예로서, 본 발명에 관한 프럭탄 합성효소 유전자 1-SST 유전자 및 6-SFT 유전자를 포함하는 DNA 단편은 프럭탄을 축적하는 식물의 프럭탄을 축적하는 조직으로부터 통상의 방법에 따라 추출한 mRNA를 주형으로 하여 1-SST 유전자 또는 6-SFT 유전자의 전체 길이를 증폭가능하도록 설계한 프라이머를 사용한 PCR 증폭에 의해 완전한 전체 길이 cDNA로서 취득할 수 있다.

또한 얻어진 프럭탄 합성효소 유전자 1-SST 유전자 또는 6-SFT 유전자를 포함하는 DNA 단편에 관해서는 부위 특이적 변이 유발 등에 의해 염기 서열을 개변할 수 있다. DNA에 변이를 도입하기 위해서는 Kunkel 법, Gapped duplex 법 등의 공지의 수법 또는 이들에 준하는 방법을 채용할 수 있다. 변이 도입은 예컨대 부위 특이적 변이 도입용 키트, 예컨대 Mutan^(R)-Super Express Kit (KAKARA BIO INC.) 및 LA PCR^TM in vitro Mutagenesis 시린지 키트 (KAKARA BIO INC.) 등을 이용하여 실시할 수 있다.

적합한 예로서는 가을 파종 밀 유래의 1-SST 유전자 또는 6-SFT 유전자를 포함하는 DNA 단편은 저온하에서 노출된 가을파종 밀로부터 추출한 mRNA로부터 합성한 cDNA를 주형으로 하고, 오픈 리딩 프레임의 전체 길이를 증폭하도록 설계된 이하의 프라이머 쌍을 이용하여 PCR 증폭을 실시하는 것에 의해 취득할 수 있다.

1-SST 유전자 증폭용 프라이머 쌍:

6-SFT 유전자 증폭용 프라이머 쌍:

이 가을 파종 밀 유래의 1-SST 유전자 또는 6-SFT 유전자의 전체 길이를 PCR 증폭하기 위한 PCR 반응액(20 ㎕) 조성으로서는 예컨대 이하의 조성을 사용할 수 있다.

이 PCR 증폭의 반응 조건으로서는 94℃에서 1분, 56℃에서 1분, 72℃에서 2분의 주기를 1주기로 하여 이것을 30 주기 실시하는 설정을 이용할 수 있다.

이와 같은 가을 파종 밀의 1-SST 유전자 또는 6-SFT 유전자를 포함하는 DNA 단편의 제조에 적합한 프라이머나 PCR 조건 등은 당업자라면 다른 생물, 예컨대 보리, 페레니얼 라이그래스 등에 적절히 개변하면서 적절하게 이용할 수 있다.

이상과 같이 하여 취득한 프럭탄 합성 효소 유전자 1-SST 유전자 또는 6-SFT 유전자를 포함하는 DNA 단편은 벡터 중에 클로닝하여 두는 것이 가장 적합하다. 1-SST 유전자 또는 6-SFT 유전자를 포함하는 DNA 단편은 식물용 과발현 프로모터의 하류에 연결한 상태로 재조합 발현 벡터에 조립하여도 좋다. 이 경우, 예컨대, 1-SST 유전자 또는 6-SFT 유전자를 포함하는 DNA 단편을 적절한 제한효소로 절단하여, 이것을 벡터 중의 과발현 프로모터 하류의 적절한 제한효소 부위에 인. 프레임으로 되도록 삽입하여 연결하면 좋다. 벼에 유전자 도입하기 위하여 아그로박테륨법을 이용하는 경우에는, 아그로박테륨 유래의 플라스미드 벡터(예컨대 pBI101 및 pBI121) 또는 이것을 베이스로 하는 발현 벡터(예컨대 pMLH7133), 또는 바이너리 벡터(pPZP2H-1ac) 등의 아그로박테륨법에 적합한 벡터에, 프럭탄 합성 효소 유전자 1-SST 유전자 또는 6-SFT 유전자를 조립하는 것이 바람직하다. 예컨대 아그로박테륨법으로 유전자 도입을 실시할 때 가장 적합한 벡터를 제작하기 위하여, pMLH7133 (Mitsuhara et al., 1996) 중의 CaMV 35S 프로모터의 제어하에 있는 GUS 유전자를 본 발명의 1-SST 유전자 또는 6-SFT 유전자로 치환하는 것에 의해 1-SST 유전자 또는 6-SFT 유전자를 과발현 (고발현) 프로모터인 CaMV 35S 프로모터의 제어하에 두어도 좋다. 제조된 재조합 발현 벡터는 또한 엔헨서 등의 시스엘리먼트, 스플라이싱 시그널, 폴리A 부가 시그널, 선택 마커, 리포좀 결합 서열(SD 서열) 등이 포함되어도 좋다. 선택 마커로서는 예컨대 암피실린 내성 유전자, 에오마이신 내성 유전자, 하이그로마이신 내성 유전자 등을 들 수 있다.

또한 얻어진 프럭탄 합성효소 유전자 1-SST 또는 6-SFT를 포함하는 DNA 단편에 관해서는 염기 서열 결정법에 의해 그 서열을 확인하는 것이 바람직하다. 염기서열결정은 막삼- 길버트의 화학수식법, 디데옥시뉴클레오티드 사슬 종결법 등의 공지 수법에 의해 실시할 수 있지만, 통상은 자동염기서열 결정장치(예컨대 Applied Biosystems사 제조, DNA 시켄서 PRISM377XL)을 이용하여 실시하면 좋다. 또한 얻어진 1-SST 유전자 또는 6-SFT 유전자를 포함하는 DNA 단편에 관하여 상술한 효모의 형질전환법 등을 이용하여 그 유전자로 암호화된 단백질의 프럭탄 합성 활성을 확인하는 것도 바람직하다.

본 발명에서 사용되는 mRNA의 제조, cDNA의 제조(RT-PCR), PCR, 라이브러리 의 제조, 벡터 중으로의 라이게이션(ligation), 세포의 형질전환, DNA의 염기서열결정, 프라이머의 합성, 돌연변이 유발, 단백질의 추출 등의 분자생물학적.생화학적 실험법은 통상의 실험서의 기재에 따라서 실시할 수 있다. 이와 같은 실험서로서는 예컨대 Sambrook 등의 Molecular Cloning, A laboratory manual, 2001, Eds, Sambrook, J. & Russell, DW. Cold Spring Harbor Laboratory Press 를 들 수 있다.

3) 벼로의 프럭탄 합성 효소 유전자의 도입

본 발명에서는 상기와 같이 취득한 프럭탄 합성효소 유전자 1-SST 또는 6-SFT를 벼(Oryza sativa)에 도입하는 것에 의해 트랜스제닉 벼를 제작할 수 있다.

숙주 식물로서 사용되는 적합한 벼(Oryza sativa)의 품종으로서는 유키히카리(Yukihikari), 일본청(Nihonbare), 호시노유메(Hoshinoyume), 키라라397 (Kirara397), 유키마루(Yukimaru), 호노카224(Honoka224), 돈토코이(Dontokoi), 코시히카리(Koshihikari), 사사니시키(Sasnishiki), 히토메보레(Hitomebore), 아키타코마치(Akitakomachi), 하에누키(Haenuki), 키누히카리(Kinuhikari), 무쯔호마레(Mutsuhomare), 히노히카리(Hinohikari), 쓰가루오토메(Tsugaruotome), 쓰가루로만(Tsugaruroman), 유메아카리(Yumeakari), 하나에치젠(Hanaechizen), 유메쓰쿠시(Yumestukushi), 하쓰시모(Hatshushimo), 돈만나카(Domannaka), 카케하시(Kakehashi), 이와텟코(Iwatekko), 마나무수메(Manamusume), 멘코이나(Menkoina), 치요니시키(Chiyonishiki), 후쿠미라이(Fukumirai) 등을 들 수 있지만, 이들에 한정되지 않는다. 이들의 벼 품종은 예컨대 독립행정법인 농업생물자원연구소 진뱅크(일본)로부터 입수할 수 있다.

적합한 다른 벼 품종으로서는 Wagwag (필리핀), Originario (이탈리아), Padano(이탈리아), Vialone Naro (이탈리아), Ribe (이탈리아), Baldo (이탈리아), Roma (이탈리아), Bomba (스페인), Makalioka (컬럼비아), IR 8(필리핀), Taipei 309 (대만), San You 63 (중국), Liang You (중국), Pei Kyu (중국), King You 725 (중국), II You 63 (중국), Nan Keng (중국), He Jiang 15 (중국), Ewan 3 (중국), Chu Chung (한국), Gyunggi (한국), Milyang 42 (한국), Milyang 30 (한국), Suweon 82 (한국), IRI 265 (한국), Tep Trang (한국) 등도 들 수 있지만, 이들에 한정되지 않는다. 이들은 예컨대 독립행정법인 농업생물자원연구소 진뱅크(일본), IRRI (International Rice Research Institute, Philipine), 중국 수도(水稻)연구소 등으로부터 입수할 수 있다.

1-SST 유전자 또는 6-SFT 유전자를 벼에 도입하는 방법으로서는 식물의 형질전환에 일반적으로 이용되는 방법, 예컨대 아그로박테륨법, 파티클 건(particle gun)법, 엘렉트로포레이션(electroporation)법, 폴리에틸렌글리콜(PEG)법, 마이크로인젝션법, 프로토플라스트 융합법 등을 이용할 수 있다. 이들 식물형질전환법의 상세한 내용은 『도본공(島本功), 岡田淸孝 감수 "신판 모델 식물의 실험 프로토콜 유전학적 수법으로부터 게놈 해석까지" (2001) 수윤사』 등의 일반적인 교과서의 기재나 Hiei Y. et al., "Efficient transformation of rice (Oryza sativa L.) mediated by Argobacterium and sequence analysis of the boundaries of the T-DNA." Plant J. (1994) 6, 271-282; Hayashimoto, A. et al., "A polyethylene glycol-mediated protoplast transformation system for production of fertile transgenic rice plants." Plant Physiol. (1990) 93, 857-863 등의 문헌을 참조하면 좋다.

아그로박테륨법을 이용하는 경우는 상술한 바와 같이, 아그로박테륨법에 적용한 벡터에 프럭탄 합성 효소 유전자 1-SST 또는 6-SFT를 조립하여 구축한 식물용 발현 벡터를 적당한 아그로박테륨, 예컨대 아그로박테륨.튜메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens)에 도입하고, 이 균주를 벼 캘러스에 접종하여 감염시키는 것에 의해 트랜스제닉 벼 세포를 포함하는 캘러스를 얻을 수 있다.

파티클건법, 엘렉트로포레이션법 등을 이용하는 경우에는 1-SST 유전자 또는 6-SFT 유전자는 그 유전자 전체 길이를 포함하는 PCR 증폭 단편이나 제한효소 절단단편 등이어도 좋으며, 벡터 중에 조립된 것이면 좋다. 유전자 도입에 이용되는 시료로서는 식물체, 벼 기관, 벼 조직 자체를 그대로 사용하면 좋고, 이들의 단편을 사용하여도 좋고, 프로토플라스트를 제조하여 사용하여도 좋다(Christou P, et al., Biotehcnology 9: 957 (1991)). 이와 같은 시료에 대하여 예컨대 파티클건법에서는 유전자 도입 장치(예컨대 PDS-1000 (BIO-RAD 사)등)을 제조업자의 설명서에 따라서 사용하여 프럭탄 합성효소 유전자 1-SST 또는 6-SFT를 바른 금속입자를 시료에 넣는 것에 의해 그 유전자를 벼 세포내로 도입하여 트랜스제닉 벼 세포를 얻을 수 있다. 조작 조건은 통상은 450~2000 psi 정도의 압력, 4~12 cm 정도의 거리에서 실시한다.

1-SST 유전자 또는 6-SFT 유전자를 도입한 트랜스제닉 벼 세포는 예컨대 종래 공지되어 있는 식물 조직 배양법에 따라서 그 트랜스제닉 세포 또는 상기 세포를 포함하는 캘러스를 선택배지에서 배양하고 생존한 캘러스를 재분화 배지(적당한 농도의 식물 호르몬 (오옥신, 사이노카이닌, 지베렐린, 아부시딘산, 에틸렌, 부라시노라이드 등)을 포함한다)에서 배양하는 것에 의해 1-SST 유전자 또는 6-SFT 유전자에 의해 형질전환된 트랜스제닉 벼의 식물체를 재생할 수 있다.

프럭탄 합성효소 유전자 1-SST 또는 6-SFT가 벼 세포 중에 확실하게 도입되었는지 여부의 확인은 PCR법, 사던 하이브리다이제이션법, 노던 하이브리다이제이션법, 웨스턴 블럿법 등을 이용하여 실시할 수 있다. 예컨대 트랜스제닉 벼의 잎으로부터 전체 RNA를 제조하고, 프럭탄 합성효소 유전자 1-SST 또는 6-SFT에 특이적 프라이머를 설계하여 PCR 증폭을 실시한다. 증폭 산물에 관하여 아가로오스 겔 전기영동, 폴리아크릴아미드겔 전기영동 또는 캐필러리 전기영동법 등을 실시하여 브롬화 에디듐, SYBR Green 액 등에 의해 염색하고 그리고 증폭산물을 1개의 밴드로서 검출하는 것에 의해 1-SST 유전자 또는 6-SFT 유전자의 도입을 확인할 수 있다. 또한 미리 형광색소 등에 의해 표시한 1-SST 유전자 또는 6-SFT 유전자 특이적 프라이머를 사용하여 PCR을 실시하여 PCR 증폭산물을 검출할 수 있다. 또한 마이크로플레이트 등의 고상에 PCR 증폭 산물을 결합시켜 형광 또는 효소 반응 등에 의해 증폭 산물을 인식하는 방법도 채용할 수 있다.

작제한 트랜스제닉 벼에 관하여 도입한 1-SST 유전자 또는 6-SFT 유전자가 통상 조건하 (예컨대 기온 25℃)에서 발현되어 있는 것을 확인하는 것도 바람직하다. 예컨대 통상 조건하에서 파종 후 10일간 생육시킨 트랜스제닉 벼에 관하여 그의 조직을 절취하고 그 시료로부터 통상의 방법에 의해 추출한 mRNA에 관하여 1-SST 유전자 또는 6-SFT 유전자에 대한 특이적 프로브를 사용한 노던 블로팅 해석을 실시하고 그 유전자로부터의 발현을 확인하면 좋다. 1-SST 유전자 또는 6-SFT 유전자에 대한 특이적 프로브의 설계는 도입하는 1-SST 유전자 또는 6-SFT 유전자의 염기 서열에 기초하여 통상의 방법에 의해 실시할 수 있다. 또는 통상 조건하에서 파종 후 10 내지 14일간 생육시킨 트랜스제닉 벼에 관하여, 그의 조직을 절취하고 그 시료로부터 통상의 방법에 의해 추출한 가용성 당류에 관하여 HPLC법에 의해 Shodex KS802 및 KS803 칼럼을 연결한 것을 사용하여 분석하든가 전술한 HPAEC 법에 의해 분석하는 것에 의해 벼 조직 내에서 프럭탄 축적이 생겨 있는 것을 확인할 수 있다.

이상과 같이 하여 작제된 본 발명의 프럭탄 합성 효소 유전자 1-SST 유전자 또는 6-SFT 유전자가 도입된 트랜스제닉 벼는 벼 세포 내에서 프럭탄을 (바람직하게는 항상적으로) 생산하고 고도의 내냉성을 발휘한다.

본 발명은 상술한 바와 같이 강화된 내냉성을 갖는 트랜스제닉 벼의 제작 방법, 및 1-SST 유전자 또는 6-SFT 유전자를 도입하는 것을 특징으로 하는 벼의 내냉성의 강화방법에도 관한 것이다.

또한 벼 이외의 식물에서도 생육 초기나 화분 형성기(벼의 이삭패는 시기에 상당)의 냉온은 일반적으로 식물의 생육 및 자실생산에 거대한 피해를 유발하는 것이 알려져 있다(비특허문헌 6). 따라서 본 발명의 방법은 벼 이외의 식물, 예컨대 옥수수(Zea mays), 밀 (Triticum aestivum L.), 보리(Hordeum vulgare L.), 호밀(Secale cereale) 등의 다른 벼과 식물, 또한 가지과, 콩과, 박과 등의 내냉성을 가질 것이 기대되는 임의의 식물에도 적용가능하며 벼와 동일하게 내냉성이 강화된 식물을 제작할 수 있는 것으로 고려된다.

2. 프럭탄 합성효소 유전자 1- SST 또는 6- SFT 를 도입한 트랜스제닉 벼의 내냉성

본 발명의 프럭탄 합성효소 유전자 1-SST 또는 6-SFT를 포함하는 트랜스제닉 벼는 1-SST 유전자 또는 6-SFT 유전자가 도입되어 있지 않은 원품종(또는 야생형)의 벼와 비교하여 강화된 내냉성을 갖는다.

벼는 여름작물이고, 일본의 일모작의 경우, 통상은 4월 내지 5월경에 파종을 실시하여, 늦은 여름 내지 가을에 수확한다. 발아 후의 벼는 유묘기, 분얼기, 유수(幼穗) 형성기, 이삭패기는 시기(화분형성기), 출수기, 개화기, 등숙기 등의 각 생육 시기를 거쳐 결실된다. 원래는 열대성 작물인 벼는 생육 중에 냉온에 조우하는 것에 의해 다양한 장해가 생기고, 수확량이 대폭적으로 감소된다(냉해의 발생). 예컨대, 유묘기의 경우 12℃ 이하, 이삭 패는 시기의 경우 19℃ 이하, 등숙기의 경우 15℃ 이하의 기온 조건에 조우하면, 냉해가 발생할 가능성이 높다. 냉온에 의해 유발되는 구체적인 장해는 벼가 냉온에 폭로되는 생육 시기에 따라 다양하다. 예컨대, 유묘기(생육 초기)로부터 등숙기 까지의 각 시기에서 냉온은 생육 지연을 유발하고, 결과로서 추랭(秋冷)에 의해 등숙불량으로 될 뿐만 아니라 도열병 등의 병해 발생율도 상승시킨다. 한편, 이삭 패는 시기로부터 개화기에 걸친 냉온은 불수정을 유발하여 임실율(稔實率)을 저하시키고, 불임 화분이나 낙화를 다수 발생시킨다. 유묘기, 이삭 패는 시기 및 개화기의 냉온은 특히 심각한 냉해를 유발하기 쉽다.

본 발명의 트랜스제닉 벼에 있어서는 상기와 같은 각 생육 시기에서 냉온에 대한 내성이 강화되지만, 특히 유묘기 내냉성 및/또는 이삭패는 시기 내냉성의 강화가 확인된다. 유묘기 내냉성이란 발아 후의 생육 초기에 상당하는 유묘기에 받는 저온에 대한 내성이고, 이삭 패는 시기 내냉성이란 화분 등의 생식 세포의 감수분열 및 그에 이어지는 성숙이 일어나는 시기에 상당하는 이삭패는 시기에 받는 냉온에 대한 내성이다. 이 때문에 바람직한 실시형태에서는 본 발명의 트랜스제닉 벼는 유묘기 또는 이삭패는 시기의 냉온에 의한 장해를 크게 경감할 수 있다.

본 발명에서 내냉성이란 냉온 장해를 경감하는 능력, 즉, 벼가 임의의 생육 시기에 냉온에 폭로된 경우에 받는 장해를 적게 하든가 또는 그의 장해를 받지 않고 생육할 수 있는 벼의 능력을 말한다. 본 발명에서 "냉온"이란 플러스 온도역의 저온, 보다 구체적으로는 일평균 기온이 0℃를 초과하고 20℃ 미만(본 명세서에서는 편의적으로 0℃~20℃로도 표기한다)으로 되는 기온 조건을 의미하는 것으로 한다. 본 발명의 트랜스제닉 벼의 사용에 의해 경감될 수 있는 "냉온 장해"는 냉온에 폭로된 벼에 생길 수 있는 어떠한 장해이어도 좋다. 이와 같은 "냉온 장해"로서는 예컨대 생육 지연, 생육 불량, 입고(立姑), 분얼기의 줄기 수의 감소, 어린 이삭 형성 지연, 이삭꽃(영화) 수 감소, 출수 지연, 개화 지연, 불수정, 개화불능, 및 등숙불량 등의 여러가지의 결과로서 유발되는 생존율의 저하, 임실율의 저하, 수확량의 감소 등이 있지만, 이들에 한정되는 것은 아니다. 벼의 냉온 장해에 관한 상세한 것에 관해서는 Science of the rice plant physiology Vol. 2 Physiology, pp769-812, ISBN 4-540-94051-1을 참조할 수 있다.

본 발명의 트랜스제닉 벼에서 내냉성의 강화는 냉온 장해의 정도가 원품종(또는 야생형)의 벼와 비교하여 경감되는 것에 의해 확인할 수 있다.

본 발명은 본 발명의 트랜스제닉 벼의 냉온조건하에서의 재배에 따른 용도에 관한 것이다. 본 발명은 또한 벼 재배에서 냉온 장해, 특히 벼의 유묘기 및/또는 이삭패는 시기에 발생하는 저온 장해를 경감하기 위한 본 발명의 트랜스제닉 벼의 사용에도 관한 것이다.

이하에서는 본 발명의 트랜스제닉 벼의 우수한 유묘기 내냉성 및 이삭패는 시기 내냉성에 관하여 보다 상세하게 설명한다.

유묘기 내냉성

벼의 유묘기는 발아후로부터 제4엽기 정도까지의 생육 시기이다. 재배방법이나 그해의 기후에 등에 따라서 다름이 있지만, 일본의 일모작에서는 대개 5월 중순 내지 6월 초순에 상당한다. 유묘기의 냉온에 의한 장해로서는 예컨대 고사와 그의 결과로서의 생존율의 저하, 생육불량, 생육 지연, 입고병의 발생 등을 들 수 있다. 특히 벼의 직파 재배에서는 유묘기의 벼의 생육의 좋고 나쁨이 그후의 생육에 큰 영향을 미치는 것이 알려져 있다.

한정되는 것은 아니지만, 본 발명에서 "유묘기 내냉성"은 유묘기에서 일평균 기온이 바람직하게는 0℃를 초과하고 12℃ 이하(0℃ ~ 12℃), 보다 바람직하게는 0℃를 초과하고 5℃ 이하(0℃~5℃)로 되는 냉온에 폭로된 벼의 생존율에 따라서 평가할 수 있다. 이 유묘기 내냉성은 표준적인 내냉성 시험에 의해 평가할 수 있지만, 특히 이하와 같은 수순으로 평가하는 것이 바람직하다.

먼저, 벼 종자를 파종하여 발아시켜서 25℃/19℃ (낮/밤) [낮 (15시간)을 25℃로 하고, 밤(9시간)을 19℃로 하는 주기]의 기온 조건하에서 생육시키고, 이어 파종 후 10일째의 유묘(어린 묘종)(엽령 2.5~3.5, 묘종 길이 10 cm 전후)를 5℃(낮밤)의 기온조건하에 놓고 14일간 처리하고, 그 벼를 상기의 25℃/19℃의 기온 조건하로 되돌려 생육시키고, 냉온 처리의 7일 후의 생존율을 조사한다. 이들의 기온 등의 조건 이외에 관해서는 벼의 재배 실험법에서 통상 조건으로 한다. 생존율은 냉온 처리후의 7일 사이에 새로운 잎 전개(생육 재개)한 개체를 생존으로 판단하고, 새로운 잎을 전개하지 않은, 요컨대 생육을 재개하지 않은 개체를 고사로 판단하여 생존율(%) = 새로운 잎 전개 개체 수 ÷ 시험에 사용한 전체 개체수 x 100으로 산출한다.

유묘기에 냉온 처리를 실시한 트랜스제닉 벼의 상기 생존율이 원품종의 벼와 비교하여 높은 경우, 그의 트랜스제닉 벼에서는 유묘기 내냉성이 강화된 것으로 판단할 수 있다. 본 발명의 트랜스제닉 벼에 있어서는 상기에 따라서 산출되는 생존율이 원품종의 벼와 비교하여 유의하게 높은 것이 바람직하다. 본 발명의 트랜스제닉 벼의 생존율은 바람직하게는 30% 내지 100%, 보다 바람직하게는 50% 내지 100%이다.

이삭패는 시기(화분형성기) 내냉성

벼의 이삭패는 시기는 출수로부터 16일 내지 10일 정도 전의, 화분의 형성 및 발달이 일어나는 시기이다. 재배방법과 그해의 기후 등에 따라서 다른 경우도 있지만, 일본의 일모작에서는 대부분 7월 중순 내지 8월 초순에 상당한다. 이삭패는 시기의 냉온에 의한 장해로서는 예컨대 불수정 및 그에 의한 불임(임실율의 저하), 출수 지연, 엽초갈변병의 발생을 들 수 있다. 벼에서 이삭패는 시기는 그 후의 종자 형성에 큰 형향을 주는 시기이고, 이 시기의 냉온은 화분형성을 억제하는 것에 의해 종자 형성 수를 크게 감소시킨다.

한정되는 것은 아니지만, 본 발명에서 "이삭패는 시기 내냉성"은 이삭패는 시기에서 일평균 기온이 0℃를 초과하고 20℃ 미만, 바람직하게는 12℃ 이상 18℃ 이하로 되는 냉온에 폭로된 벼의 임실율에 의해 평가할 수 있다. 이 이삭패는 시기 내냉성은 표준적인 내냉성 시험에 의해 평가될 수 있지만, 특히 이하와 같은 수순으로 평가하는 것이 바람직하다.

먼저, 벼 종자를 파종하여 발아시킨 후 26℃/20℃ (낮/밤) [낮 (15시간)을 26℃로 하고, 밤(9시간)을 20℃로 하는 주기]에서 생육시키고, 출수기의 16일전 ~ 10일전까지의 생장 단계에 있는 벼(유키히카리의 경우, 엽령 10 내지 11, 엽이간 길이 마이너스 4~0 cm)를 4일간에 걸쳐 12℃ (낮밤)의 기온조건하에 두고 생육시키고, 그후 다시 상기 26℃/20℃ (낮/밤)의 기온 조건으로 되돌려 생육시키며, 출수.개화시켜서 종자를 형성시킨 후, 임실율을 산출한다. 이들의 기온 등의 조건 이외에 관해서는 나락의 재배실험법에서 통상 조건으로 한다. 임실율은 이삭 전체의 나락의 90% 이상이 황화된 이삭으로부터 채취되는 전체의 나락에 관하여 전체 나락 수(나락의 총수)와 임실 나락수 (종자(벼)가 포함되어 있는 나락의 수)를 계수하여 임실율(%) = 임실 나락 수 ÷ 전체 나락 수 x 100 으로 산출한다.

상기와 같이 이삭패는 시기에 냉온 처리를 실시한 본 발명의 트랜스제닉 벼의 상기 임실율, 특히 출수 16일전의 이삭 패는 시기 벼에 냉온 처리를 실시한 경우의 임실율이 계통 전체로서 원품종의 벼와 비교하여 높은 경우, 그의 트랜스제닉 벼의 이삭 패는 시기 내냉성이 강화된 것으로 판단할 수 있다. 본 발명의 트랜스제닉 벼에서 상기에 따라서 산출되는 임실율의 계통 마다의 평균치가 원품종의 벼와 비교하여 유의하게 높은 것이 바람직하다. 본 발명의 트랜스제닉 벼의 상기 임실율은 예컨대 출수 16일전에 냉온 처리를 실시한 경우 바람직하게는 40% 내지 100%, 보다 바람직하게는 50% 내지 80% 이다.

도 1은 1-SST 유전자 도입 벼로부터 추출한 가용성 당류의 용출 프로파일[(B)], 돼지감자 괴경[(A)] 및 원 품종 유키히카리[(C)]로부터의 각각의 추출물 에 포함되는 가용성 당류의 용출 프로파일, 및 용출 프로파일에 피이크로서 나타난 프럭탄의 구조[(D)]를 나타낸 도면이다. G: 글루코오스, F: 프럭토오스, S: 수크로오스, 1~5: 중합도 3 ~7의 프럭탄.

도 2는 1-SST 유전자 도입 벼 및 6-SFT 유전자 도입 벼로부터 추출한 가용성 당류의 용출 프로파일의 비교도이다.

도 3은 6-SFT 유전자 도입 벼로부터 추출한 가용성 당류의 용출 프로파일, 및 가을 파종 밀로부터의 추출물에 포함되는 프럭탄의 구조를 도시한 도이다. A는 가을 파종 밀의 줄기(개화후 10일), B는 6-SFT 유전자 도입 유키히카리의 잎을 시료로 하였다. 1K: 1-케스토오스, B: 비프럭코오스, 2: 1&6, 1 케스토펜타오스, 4: 1,1,1 & 6 케스토헥사오스, 6: 1,1,1,1 & 6 케스토헵토오스, 6K: 6-케스토오스. 1,3,5,7: 각각 상이한 중합도의 β (2→6) 결합 프럭탄 (레반) 이다.

도 4는 1-SST 유전자 도입 벼 및 6-SFT 유전자 도입 벼에서 1-SST 유전자 및 6-SFT 유전자의 mRNA 레벨의 발현량을 도시한 사진이다. I16:I16-2-1 계통, I22: I22-1-1 계통, I24: I24-6-1 계통, I29: I29-5-1 계통, I31: I31-10-1 계통, cont: 원품종 유키히카리, S33: S33-5-2 계통, S50: S50-5-1 계통, S51: S51-2-1 계통.

도 5는 1-SST 유전자 도입 벼 및 6-SFT 유전자 도입 벼에 관하여 계통 마다의 유묘기 내냉성을 나타낸 도이다.

도 6은 1-SST 유전자 도입 벼 및 6-SFT 유전자 도입 벼에 관하여 계통 마다의 이삭 패는 시기 내냉성을 나타낸 도이다.

이하 실시예 및 도면을 참조하여 본 발명을 설명하지만, 본 발명은 이들의 실시예에 한정되는 것은 아니다.

참고예 1: 프럭탄 합성 효소 유전자의 단리

본 참고예에서 프럭탄 합성 효소 유전자 1-SST 및 6-SFT의 취득은 비특허문헌 3의 기재에 따라서 실시하였다.

1) 가을파종 밀 계통 PI 173438로부터의 cDNA 라이브러리의 제조

9월 하순에 뱃트에 파종하고, 자연 조건하에서 11월 22일까지 생육시켰던 밀 (Triticum aestivum L.) 계통 PI173438의 크라운 부분으로부터 mRNA를 통상의 방법으로 추출하였다. 수득한 mRNA 5 ㎍을 사용하여 cDNA 합성 키트(STRATAGENE사 제조)를 이용하여 cDNA를 합성하였다. 이어, 합성된 cDNA를 λZAP Expression vector (STRATAGENE 사 제조)에 조립하고, cDNA 라이브러리를 제작하였다.

2) cDNA 라이브러리로부터의 1- SST 유전자 부분 단편 및 6- SFT 유전자 부분 단편의 단리

상기와 같이 합성한 cDNA를 주형으로 하여 이하의 포워드 프라이머 및 리버스 프라이머를 사용하여 PCR을 실시하였다.

포워드 프라이머:

리버스 프라이머:

이들의 포워드 프라이머 및 리버스 프라이머는 기존의 프럭탄 합성효소 유전자의 염기서열 (Genbank 수탁번호 X83233, AJ006066, Y07838, AF492836, AJ567377, AJ009756, Y09662 등) 사이에서 고도로 보존된 영역을 기본으로 하여 설계한 것이다. PCR은 50㎕의 반응계로 실시하였다. EX Taq DNA 폴리머라제 (TAKARA BIO INC.; 5 유닛/㎕)를 1㎕, 10 x 폴리머라제 버퍼 (MgCl₂ 를 포함한다)를 5 ㎕, dNT액 (10 mM) 5 ㎕, 상술한 각 프라이머 (12μM)을 2 ㎕, 및 상기에서 합성한 cDNA 약 10 ng을 혼합하고, 또한 반응액 전량을 증류수로 50 ㎕로 하였다. 사용한 PCR의 반응 조건 및 반응 회수는 이하의 표 2에 나타낸다.

반응 스텝	반응 온도	반응 시간	주기 수
변성	94℃	1분간	1회
변성	94℃	1분간	30회
어닐링	50℃	1분간
신장 반응	72℃	2분간
신장 반응	72℃	2분간	1회

PCR 반응 후, 전기영동에 의해 PCR 산물의 확인을 실시해보니, 예측된 신장의 핵산 단편(1500 염기 전후)이 증폭되어 있었다. 얻어진 PCR 단편을 통상의 방법으로 클로닝하고, 복수의 양성 클론을 얻었다. 이들 양성 클론을 포함하는 DNA 삽입 단편에 관하여 DYEnamic ET Terminal Cycle Sequencing Kit (Amersham Biosciences사 제조)를 사용하여 Applied Biosystems 사 제조의 DNA 시켄서 (PRISM 377XL)에 의해 염기 서열을 결정하고, 상술한 기지의 프럭탄 합성 효소 유전자와의 비교 해석을 실시하였다. 그 결과, 기지의 프럭탄 합성 효소 유전자와 50% 이상의 염기 서열 상동성을 갖는 DNA 삽입 단편이 복수개 나타났다. 이들의 DNA 단편은 밀의 프럭탄 합성효소 유전자의 부분 단편으로 추정되었다.

3) 프럭탄 합성효소 유전자의 전체 길이를 포함하는 cDNA 의 단리 및 그의 염기 서열의 결정

상기 1)에서 얻은 cDNA 라이브러리에 관하여 상기 프럭탄 합성 효소 유전자의 부분 단편을 아이소토프로 표지한 프로브를 이용하여, 통상의 방법으로 하이브리다이제이션 에세이를 실시하였다. 얻어진 양성 클론에 포함되는 DNA 삽입 단편에 관하여 DYEnamic ET Terminal Cycle Sequencing Kit (Amersham Biosciences사 제조)를 사용하여 Applied Biosystems사 제조 DNA 시켄서 (PRISM 377XL)에 의해 염기 서열을 결정하였다. 결정된 염기 서열의 해석으로부터, 1989 염기를 포함하고 662 아미노산을 포함하는 아미노산 서열을 코드하고, 또 페레니얼 라이그래스 1-SST 유전자 (Genbank 수탁번호 AJ297369)와 72% (아미노산 서열 베이스)의 상동성을 갖는 염기 서열(서열번호 1)을 포함하는 DNA 단편이 삽입된 클론이 밝혀졌다. 동일하게, 1851 염기를 포함하고, 616 아미노산을 포함하는 아미노산 서열을 코드하고, 또 밀의 6-SFT 유전자(Genbank 수탁번호 X83233)와 93% (아미노산 서열 베이스)의 상동성을 갖는 염기 서열(서열번호 3)을 포함하는 DNA 단편이 삽입된 클론이 발견되었다. 이로부터, 이들 DNA 삽입 단편은 각각 상이한 밀. 프럭탄 합성효소 유전자를 포함하는 cDNA로 생각되었다.

4) 단리한 밀 프럭탄 합성 효소 유전자에 의해 코드되는 단백질의 기능해석

상기 3)에서 얻은 2 종류의 밀 프럭탄 합성효소 유전자 전체 길이를 각각 포함하는 양성 클론으로부터, 각 오픈 리딩 프레임 (서열번호 1 또는 서열번호 3의 염기서열)을 포함하는 DNA 단편을 제조하고, 각각을 발현 벡터 pPICZαB(Invitrogen사 제조, EasySelect Pichia Expression Kit)에 클로닝하고, 통상의 방법에 따라서 엘렉트로포레이션법에 의해 효모(피치아 파스토리스 (Pichia pastoris)에 벡터를 조립하였다. 여기서 이용한 발현 벡터 pPICZαB는 효모용 액체 배지 중의 메탄올에 특이적으로 반응하여 당해 벡터에 클로닝된 유전자의 발현을 유도하는 AOX1 프로모터 서열, 및 효모 내에서 발현한 재조합 단백질을 효모 외, 요컨대 배지 중으로 분비하기 위해 필요로 하는 α 팩터로 불리는 분비 인자의 서열을 포함한다.

상기 각 DNA 단편을 조립한 발현 벡터 pPICZαB로 형질전환된 효모를, 메탄올을 탄소원으로 한 액체 배지 중에서 4일간 배양한 다음 그의 배양액을 분리하여 한외여과형 필터에 의해 약 20배로 농축하였다. 그 농축액을 조효소액으로 하여 기질로 되는 수크로오스 또는 1-케토오스와 혼합하고 4℃에서 8시간 반응시켰다. 그리고 HPAEC법에 의해 반응 생성물을 분석하는 것에 의해 배양액에 포함되는 재조합 단백질의 효소 활성에 관하여 해석하였다. 그 결과 서열번호 1의 염기서열을 포함하는 DNA 단편을 조립한 발현 벡터를 도입한 효모의 배양액에서는 수크로오스를 단일한 기질로서 부여한 경우, 1-케토오스 (수크로오스에 β 2,1- 결합으로 프럭토오스가 1개 전이된 3당)의 합성 활성이 검출되었지만, 한편, 1-케토오스를 유일한 기질로 하여 반응시킨 경우에는 4당인 1,1-니스토오스의 합성 활성이 3당 합성 활성에 비하여 현저하게 낮은 수준으로 검출되었다. 따라서 이 DNA 단편은 수크로오스: 수크로오스 1-프럭토시르랜스퍼라아제 활성을 가진 효소를 코드하는 것으로 보여지므로, 즉 그 DNA 단편에 포함되는 유전자가 밀 1-SST 유전자인 것이 명확하게 되었다.

또한 서열번호 3의 염기서열을 포함하는 DNA 단편을 조립한 발현 벡터를 도입한 효모의 배양액에서는 수크로오스를 유일한 기질로서 부여한 경우, 1-케토오스를 합성하는 활성, 6-케토오스(수크로오스에 β 2,6- 결합으로 프럭토오스가 1개 전이된 3당) 및 4당 이상의 프럭탄의 합성 활성이 검출되었지만, 한편, 1-케토오스를 유일한 기질로서 반응시킨 경우에는 4당 이상의 프럭탄 합성 활성이 전혀 검출되지 않았다. 따라서 이 DNA 단편은 수크로오스: 프럭탄 6-프럭토실트랜스퍼라아제 활성을 가진 효소를 코드하는 것으로 보여지므로, 즉 그 DNA 단편에 포함되는 유전자가 밀 6-SST 유전자인 것이 명확하게 되었다.

이상과 같이 하여 밀 1-SST 유전자 (서열번호 1) 및 6-SFT 유전자 (서열번호 3)의 단리가 확인되었다.

실시예 1: 프럭탄 합성 효소 유전자 1- SST 및 6- SFT 도입에 의한 벼의 형질전환 및 벼 식물체의 재생

이상과 같이 하여, 참고예 1에서 단리한 프럭탄 합성효소 유전자 1-SST 및 6-SFT를, Ti 계 벡터인 pMLH7133 (Mitsuhara I. et al.,(1996) Efficient promoter cassettes for enhacned expression of foreign genes in dicotyledonous and monoctyledonous plant. Plant Cell Physiol. 37: 49-59) 중의 CaMV 35 S-프로모터의 하류에 센스쇄 방향으로 도입하였다.

먼저, 전체 길이 프럭탄 합성효소 유전자 1-SST cDNA를 참고예 1에서 얻은 1-SST cDNA 함유 클론을 주형으로 하고, 프라이머 5'-

(밑줄은 BamHI 부위; 서열번호 11) 및 프라이머 5'-

(밑줄은 SacI 부위; 서열번호 12)를 사용한 PCR 증폭에 의해 제조하였다. 또한 전체 길이 프럭탄 합성효소 유전자 6-SFT cDNA를, 참고예 1에서 얻은 6-SFT cDNA 함유 클론을 주형으로 하고, 프라이머 5'-

(밑줄은 BamHI 부위; 서열번호 13) 및 프라이머 5'-

(밑줄은 SacI 부위; 서열번호 14)를 사용하여 PCR 증폭에 의해 얻었다. 이들의 증폭 단편을 각각 BamHI 및 SacI으로 처리하여, BamHI-SacI 단편을 준비하였다. 제조한 1-SST 유전자 함유 BamHI-SacI 단편 또는 6-SFT 유전자 함유 BamHI-SacI 단편을 BamHI 및 SacI을 사용하여 절단한 PMLH7133 벡터에 센스쇄 방향으로 결찰시켰다. 얻어진 핵산 구축물을 기존에 알려진 프로토콜(Hieli Y., Ohta S., Komari T., Kumashiro T. (1994) Efficient transformation of rice (Oryza sativa L.) meidated by Agrobacterium and sequence analyssis of the boudnaries of the T-DNA. Plant J. 6: 271-282)에 따라서 아그로벡테륨법에 의해 벼(Oryza sativa L. cv. Yukihikari; "유키히카리")의 캘러스에 도입하였다. 형질전환 캘러스를 선발하기 위하여, 유전자 도입한 캘러스를 MSRE 배지에 이식하여 하이그로마이신 내성에 관하여 선택하였다. 선택된 캘러스는 재분화 배지(N6SE)에 이식하여 밝은 곳에서 재분화시켰다. 이어, 재분화 개체를 검정배지(MSHF)에 놓고 하이그로마이신 내성에 관하여 검정하였다. 동일 배지 상에서 발근하고, 정상적으로 생육한 개체를 순화시켜 포트에 이식하는 것에 의해 벼 식물체로 재생시켰다. 재생된 식물체(T₀ 세대)에 관해서는 자가 수분에 의해 T₂ 세대까지의 교배를 실시하였다. 이상의 실험에 사용한 배지의 조성은 이하와 같다.

표 3: MSRE 배지 ( pH 5.8)

MS 무기염

MS 비타민

30 g/l 수크로오스

30 g/l 소르비톨

2mg/l 카자미노산

1 mg/l NAA

2 mg/l BAP

250 mg/l 카르베니실린

50 mg/l 하이그로마이신

4 g/l 겔라이트

표 4: N6SE 배지 ( pH 5.8)

N6 무기염

N6 비타민

30 g/l 수크로오스

2 mg/l 2,4-D

2 g/l 겔라이트

500 mg/l 카르베니실린

50 mg /l 하이그로마이신

표5: MSHF 배지 ( pH 5.8)

MS 무기염

MS 비타민

30 g/l 수크로오스

50 mg/l 하이그로마이신

8 g 한천

이어서, 얻어진 T₀ 세대, T₁ 세대 및 T₂ 세대의 식물체로부터 슈트(shoot)를 절취하고, 통상의 방법에 의해 슈트로부터 게놈 DNA를 추출하며, 이것을 주형으로 하여 벡터 pMLH7333의 프로모터 영역에 포함되는 다이즈파제올린 유전자의 제1 인트론서열에 특이적인 프라이머 (5'-

; 서열번호 15) 및 1-SST cDNA에 특이적인 프라이머 (5'-

; 서열번호 16) 또는 6-SFT cDNA에 특이적인 프라이머 (5'-

; 서열번호 17)를 사용하여 PCR 스크리닝을 실시하여 호모 접합계통을 선택하였다. 이것에 의해 프럭탄 합성효소 유전자 1-SST를 호모 접합으로 갖는 벼 계통으로 하여, I16-2-1 계통, I22-1-1 계통, I24-6-1 계통, I29-5-1 계통, I31-10-1 계통을 얻었다. 또한 프럭탄 합성 효소 유전자 6-SFT 를 호모 접합으로 갖는 벼 계통으로 하여 S33-5-2 계통, S50-5-1 계통, S51-2-1 계통을 얻었다.

실시예 2 : 프럭탄 합성효소 유전자를 도입한 트랜스제닉 벼의 발현 핵석

실시예 1에서 얻은 프럭탄 합성효소 유전자가 호모 접합성인 트랜스제닉 계통 벼(T₂ 세대; 원품종은 "유키히카리")에 관하여 이하와 같이 CaMV 35S 프로모터의 제어하에서 프럭탄 합성효소 유전자를 과량 발현시킨 경우의 조직 내의 프럭탄 축적량 및 프럭탄 합성효소 유전자 발현의 해석을 실시하였다.

1) 프럭탄 축적량 및 축적 프럭탄의 해석

실시예 1에서 얻은 전체의 계통 프럭탄 합성효소 유전자 1-SST 도입 벼 식물체, 및 프럭탄 합성효소 유전자 S-SFT 도입 벼 식물체, 및 대조용으로서 프럭탄 합성효소 유전자를 도입하지 않은 벼 식물체(원품종 "유키히카리")로부터 얻은 잎 조직 1g을 잘게 재단하고 10 ml의 열수(내부 표준으로서 1 mg/ml의 프로필렌글리콜을 포함) 중에서 1시간 끓이고 추출액을 0.45 ㎛의 필터로 여과하였다. 여과액의 각종 당 함량은 RI 검출을 사용한 HPLC로 측정하였다. 칼럼은 Shodex KS802와 KS803 (어느 것이든 Showa Denko KK., Tokyo, Japan)을 연결한 것을 사용하고, 칼럼 온도 50℃, 이동상을 물로 하여 0.8 ml/분으로 분리하고, 프럭토오스 함량, 글루코오스 함량, 수크로오스 함량, 프럭탄 함량으로 나누어서 측정하였다. 이 측정에 의해 프럭탄 합성효소 유전자를 도입하지 않은 벼에서는 프럭탄이 검출되지 않았지만, 한편 프럭탄 합성효소 유전자를 도입한 벼에서는 1-SST 도입 계통과 6-SFT 도입 계통의 양방에서 프럭탄의 축적이 검출되었다.

축적된 프럭탄의 구조는 DIONEX사의 DX500을 사용한 HPAEC (High Performance Anion-Exchange Chromatography)법에 의한 측정을 이용하여 조사하였다. 이 측정에서는 칼럼은 Carbopac PA1 (DIONEX사 제조)를 사용하고, 검출기는 Pulsed Amperometric Detector ED40 (DIONEX사 제조)를 사용하였다. 칼럼 온도는 실온으로 하고 150 mM 수산화나트륨을 용리액으로 하였다. 상기 여과액 중의 성분을 아세트산 나트륨의 농도 구배 (25 mM~500mM, 40분)를 사용하여 검출하고, 그 유속은 1 ml/분으로 하였다.

프럭탄 합성효소 유전자 1-SST 도입 벼 유래의 시료에 관하여 이 측정으로 얻은 용출 프로파일을 대조용인 원품종 유키히카리 유래의 시료 및 돼지감자 괴경 유래의 시료를 사용하여 동일한 특정에 의해 얻은 용출 프로파일과 비교하였다. 이 결과를 도 1에 나타낸다.

돼지감자는 수크로오스에 β 2,1-결합으로 프럭토오스가 중합된 프럭탄을 괴경에 축적하는 것이 알려져 있다(Shiomi, N., New Phytologist (1993) vol. 13, p263-270). 도 1의 용출 프로파일(A)에는 돼지감자 괴경에 축적된 중합도가 상이한 프럭탄을 나타내는 복수의 피이크가 나타나 있다. 1-SST 유전자 도입 벼 유래의시료에서는 이들의 피이크와 대응하도록 1-케토오스 (수크로오스를 구성하는 프럭토오스 이외의 프럭토오스가 β 2,1-결합으로 전이된 3종의 프럭탄), 및 1-케토오스에 프럭토오스가 β 2,1-결합으로 전이된 중합도 4-7의 프럭탄이 축적되어 있는 것이 나타났다(도 1(C)). 한편, 대조용인 원품종 유리히카리의 벼에 관해서는 수크로오스의 피이크는 검출되었지만, 각 중합도의 프럭탄에 대응하는 피이크는 검출되지 않았다. 따라서 1-SST 유전자 도입 벼에서는 β 2,1-결합 프럭토오스를 함유하는 프럭탄을 생성할 수 있는 1-SST 효소가 축적되는 것이 확인되었다.

또한 1-SST 유전자 도입 벼, 6-SFT 유전자 도입 벼, 및 대조용인 원품종 유키히카리 유래의 시료에 관하여 상기 측정으로 각각 수득한 용출 프로파일을 비교하였다. 이 결과를 도 2에 도시한다. 도 2에 도시한 바와 같이, 6-SFT 유전자 도입 벼 유래의 시료에서는 1-SST 유전자 도입 벼 유래와는 상이한 가용성 당류의 피이크가 검출되었다. 이것으로부터 6-SFT 유전자 도입 벼에서는 1-SST 유전자 도입 벼와는 상이한 당류가 축적되어 있는 것이 밝혀졌다.

이어서 6-SFT 유전자 도입 벼 유래의 시료의 용출 프로파일을 6-SFT 유전자 단리원인 가을 파종 밀(개화후 10일째)의 줄기로부터 상기와 동일하게 하여 추출한 시료에 관하여 동일 측정에 의해 얻은 용출 프로파일과 비교하였다. 이 결과를 도 3에 나타낸다. 가을 파종 밀이 생성되는 프럭탄은 β 2,6-결합 프럭토오스를 갖는 프럭탄을 다수 포함하는 것이 알려져 있다. 도 3의 상단의 용추 프로파일에는 가을 파종 밀의 줄기에 축적되는 β 2,6-결합을 갖는 각종 중합도의 프럭탄을 나타내는 복수의 피이크가 도시되어 있다. 6-SFT 유전자 도입 벼 유래의 시료에서는 이들 피이크와 대응하도록 수크로오스를 구성하는 프럭토오스에 다른 프럭토오스가 β 2,6-결합으로 전이된 프럭탄(도 3(C))의 6K, 1, 3, 5, 7) 및1-케토오스 (3당; 도 3(C)의 1K)를 구성하는 프럭토오스 중 글루코오스에 결합한 프럭토오스에 β 2,6-결합으로 다른 프럭토오스가 전이된 프럭탄(도 3(C)의 B, 2, 4, 6)의 피이크가 검출되었다. 따라서 6-SFT 유전자 도입 벼에서는 β 2,6-결합 프럭토오스를 함유하는 프럭탄을 생성할 수 있는 6-SFT가 축적되는 것이 확인되었다.

2) 노던 블럿 해석

실시예 1에서 얻은 1-SST 유전자 도입 벼 식물체 및 6-SFT 유전자 도입 벼 식물체에서 1-SST 유전자 및 6-SFT 유전자의 발현에 대하여 이하와 같이 노던 블럿 해석을 실시하였다.

먼저, 본 해석에서 1-SST mRNA를 검출하기 위한 프로브는 참고예 1에서 얻은 전체 길이 1-SST cDNA를 포함하는 벡터를 주형으로 하고, 프라이머 5'-

(서열번호 18) 및 5-'

(서열번호 19)와 EX Taq 폴리머라제 (TAKARA BIO INC.)를 사용한 PCR 증폭에 의해 제작하였다. 또한 6-SFT mRNA를 검출하기 위한 프로브는 참고예 1에서 수득한 전체 길이 6-SFT mRNA를 포함하는 벡터를 주형으로 하고, 프라미어 5'-

(서열번호 20) 및 5'-

(서열번호 21)과 EX Taq 폴리머라제 (TAKARA BIO INC.)를 사용한 PCR 증폭에 의해 제작하였다. 이들 증폭 단편은 겔 정제한 후, 각각 랜덤 헥사머 프라이밍법(BcaBest^TM Labeling Kit; TAKARA BIO INC.)을 사용하여 ³²P-dCTP 표지한 것을 프로브로 하여 사용하였다.

1-SST 유전자 도입 벼 (I16-2-1 계통, I22-1-1 계통, I24-6-1 계통, I29-5-1 계통, I31-10-1 계통), 6-SFT 유전자 도입 벼(S33-5-2 계통, S50-5-1 계통, S51-2-1 계통), 및 대조용인 원품종 유키히카리로부터 파종후 인공 기상 하 25℃/19℃ <낮/밤>으로 생육시켜 10일째의 어린 식물체의 지상부로부터 통상의 방법으로 RNA를 추출하였다.

제작한 전체 RNA는 1.2% 아가로오스 겔에서 전기영동한 후 나일론 필터로 전사하였다. 이 필터를 하이브리다이제이션 완충액 (50% 포름아미드, 5xSSPE, 5x 덴하르트액, 0.5% SDS, 0.2mg/ml 연어 정자 정제 DNA) 중에서 1시간에 걸쳐 예비 하이브리다이제이션시키고, 이어 상기에서 제작한 프로브를 첨가하여 42℃에서 12시간 이상 하이브리다이즈시켰다. 이 필터에 관하여 2 x SSC, 0.1% SDS중 15분간 실온에서 세정을 2회 실시하고 또한 0.2 x SSC, 0.1% SDS중 65℃에서 30분간 세정을 2회 실시하였다. 세정한 후 필터를 X선 필름에 노출시키고 가시화하였다.

이상의 노던 블럿 해석 결과를 도 4에 도시한다. 도 4에 도시한 바와 같이 어떤 1-SST 유전자 도입 벼 계통에서도 1-SST 유전자 레벨의 발현을 확인할 수 있었다. 동일하게 6-SFT 유전자 도입 벼 계통에 있어서도 6-SFT 유전자 레벨의 발현을 확인할 수 있었다. 대조용인 원품종 유키히카리에 관해서는 1-SST 유전자 및 6-SFT 유전자의 어느 것에 대해서도 발현은 전혀 검출되지 않았다.

실시예 3: 프럭탄 합성효소 유전자를 도입한 트랜스제닉 벼의 유묘기 내냉성

4 계통의 1-SST 유전자 도입 벼(I16-2-1 계통, I22-2-1 계통, I24-6-1 계통, I29-5-1 계통) 및 3 계통의 6-SFT 유전자 도입 벼(S33-5-2 계통, S50-5-1 계통, S51-2-1 계통) 및 원품종 "유키히카리"를 파종하고 인공 기상 하에서 기온 25℃/19℃ <낮/밤>으로 "낮(15시간)"을 25℃로 하고, 밤(9시간)을 19℃로 하는 주기의 환경하에서 생육시켰다.

파종후 10일째의 벼 유묘(각 계통당 20개체 씩 2반복을 실험에 사용하였다)를 기온 5℃ (낮밤)에서 14일간 저온 처리하고 그 후 상기 기온 25℃/19℃ (낮/밤)의 조건으로 되돌리고 저온 처리의 14일 후의 생존율을 조사하였다.

그 결과, 1-SST 유전자 도입 벼 계통의 생존율은 I16-2-1 계통이 53.7%, I22-2-1 계통이 75.8%, I24-6-1 계통이 52.1%, I29-5-1 계통이 88.1% 이고, 6-SFT 유전자 도입 벼의 생존율은 S33-5-2 계통이 88.4%, S50-5-1 계통이 41.2%, S51-2-1 계통이 32.3% 이었다 (도 5). 원품종 "유키히카리"의 생존율은 9.3%이었다(도 5). 이와 같이, 1-SST 유전자 또는 6-SFT 유전자를 도입한 트랜스제닉 벼는 유묘기에 노출되는 냉온에 대하여 높은 내성을 갖는 것이 나타났다.

실시예 4: 프럭탄 합성효소 유전자를 도입한 트랜스제닉 벼의 이삭패는 시기 내냉성

1-SST 유전자 도입 벼 계통 I22-2-1, 6-SFT 유전자 도입 벼 계통(S33-5-2, S50-5-1) 및 원품종 "유키히카리"를 파종하고 인공 기상 하에서 기온 26℃/20℃ <낮/밤>으로 "낮(15시간)"을 26℃로 하고, 밤(9시간)을 20℃로 하는 주기의 환경하에서 생육시킨 출수기의 16일전 ~ 10일전 까지의 생장 단계까지 생육시킨 벼를 4일간에 걸쳐 기온 12℃ (낮밤)에서 저온 처리하고, 이어서 다시 상기 기온 26℃/20℃ (낮/밤)의 환경으로 되돌려 생육시키고, 출수, 개화시켜 종자를 형성시켰다. 본 실험에서는 원형 20알 파종용 포트에 파종하여 생육시킨 1계통 당 합계 100개체의 성숙 벼를 사용하고 각 이삭에 대하여 출수한 날을 기록하여 놓고 후일 저온 처리한 날이 출수일의 몇 일 전에 해당하는가 (저온 처리시의 출수전 일수)를 역산하였다. 그리고 각 이삭에 대하여 상술한 계산식에 따라서 임실율을 산출하고, 계통 마다의 평균치를 산출하였다. 도 6에는 그 결과를 그패프로 정리하였다.

또한 저온 처리시의 출수전 일수가 10일로부터 16일인 이들의 각 이삭의 임실율로부터 산술평균으로부터 계통 마다의 평균 임실율을 산출하였다. 각각 계통의 평균 영실율은 I22-1-1 계통이 61.0%, S33-5-2 계통이 39.8%, S50-5-2 계통이 43.0%이었다. 원품종 "유키히카리"의 평균 임실율은 32.5% 이었다.

이와 같이, 1-SST 유전자 또는 6-SFT 유전자를 도입한 트랜스제닉 벼는 이삭 패는 시기에 노출되는 냉온에 대하여 높은 내성을 갖는 것이 나타났다.

이미 상술한 바와 같이, 벼에서는 이삭패는 시기에 냉온에 폭로되는 것이 임실율 저하에 가장 크게 영향을 준다. 본 실시예에서는 임실율에 영향을 미치는 가장 위험한 시기에서 냉온 폭로의 영향 레벨을 조사하기 위하여 벼 이삭패는 시기에 상당하는 출수의 16일전 내지 10일전의 시기에 냉온 처리를 실시하였다. 도 6에 도시한 바와 같이 1-SST 유전자 또는 6-SFT 유전자를 도입한 본 발명의 트랜스제닉 벼는 이삭패는 시기에 냉온 처리한 경우에도 원품종과 비교하여 높은 임실율을 나타내었다. 즉, 본 발명의 트랜스제닉 벼는 가장 위험한 이삭패는 시기에서조차 냉온 하에서 재배가 가능한 것으로 밝혀졌다. 또 이와 같이 이삭패는 시기의 냉온 처리에 기초하여 산출되는 평균 임실율은 본 발명의 트랜스제닉 벼의 냉온 저항성을 검정할 뿐만 아니라 적합한 지표로서 사용될 수 있는 것으로 생각된다.

본 발명의 프럭탄 합성효소 유전자를 도입한 트랜스제닉 벼는 그의 재배 기간에서 냉온으로 되기 쉬운 지역에서도 냉온 장해가 경감되도록 벼의 재배법을 가능하게 하기 위하여 사용될 수 있다. 또 본 발명의 벼의 내냉성 강화법은 기존의 벼에 관하여 냉온 조건하에서의 고수율의 재배를 가능하게 할 목적으로 그 벼에 고도의 내냉성을 부여하기 위하여 사용될 수 있다.

본 명세서에서 인용한 모든 간행물, 특허 및 특허출원을 그대로 참고로 하여 본 명세서에 도입할 수 있다.

서열 표 프리텍스트

서열번호 5 내지 21의 서열은 프라이머이다.

SEQUENCE LISTING <110> National Agriculture and Food Research Organization <120> CHILLING TOLERANT PLANTS AND METHOD FOR PRODUCING THE SAME <130> PH-2830-PCT <150> JP 2005-182251 <151> 2005-06-22 <160> 21 <170> PatentIn Ver. 2.1 <210> 1 <211> 1989 <212> DNA <213> Triticum aestivum L. <220> <223> Inventor: Yoshida, Midori; Kawakami, Akira; Sato, Yutaka <220> <221> CDS <222> (1)..(1989) <400> 1 atg gat tcg tct cgc gtc ata ctc atc ccc ggc acg ccg ccg ctg ccg 48 Met Asp Ser Ser Arg Val Ile Leu Ile Pro Gly Thr Pro Pro Leu Pro 1 5 10 15 tac gcc tac gag cag ctg ccg tcc tcc tcc gcg gac gcc aag ggc atc 96 Tyr Ala Tyr Glu Gln Leu Pro Ser Ser Ser Ala Asp Ala Lys Gly Ile 20 25 30 gag gag gag cgg gcc ggc ggc ggt ggc ctg agg tgg cgc gcg tgc gcc 144 Glu Glu Glu Arg Ala Gly Gly Gly Gly Leu Arg Trp Arg Ala Cys Ala 35 40 45 gcc gtg ctg gcc gcc tcg gcc gtg gtg gcg ctc gtc gtc gcc gcc gcg 192 Ala Val Leu Ala Ala Ser Ala Val Val Ala Leu Val Val Ala Ala Ala 50 55 60 gtc ttc ggg gcc agc ggg gcg ggc tgg gac gcg gtg gcc gcc tcc gtg 240 Val Phe Gly Ala Ser Gly Ala Gly Trp Asp Ala Val Ala Ala Ser Val 65 70 75 80 ccg gcg acc ccg gcg acg gag ttc ccg agg agc agg ggc aag gag cac 288 Pro Ala Thr Pro Ala Thr Glu Phe Pro Arg Ser Arg Gly Lys Glu His 85 90 95 ggc gtg tcg gag aag acg tcg ggg gcc tac tcc gcc aac gcg ttc ccg 336 Gly Val Ser Glu Lys Thr Ser Gly Ala Tyr Ser Ala Asn Ala Phe Pro 100 105 110 tgg agc aac gcc atg ctg cag tgg cag cgc acc ggc tac cat ttc cag 384 Trp Ser Asn Ala Met Leu Gln Trp Gln Arg Thr Gly Tyr His Phe Gln 115 120 125 ccg gac aag tac tac cag aac gat ccc aac ggt ccg gtt tac tat ggc 432 Pro Asp Lys Tyr Tyr Gln Asn Asp Pro Asn Gly Pro Val Tyr Tyr Gly 130 135 140 gga tgg tac cac ttc ttc tac cag tac aac ccg tcg ggc tcc gtg tgg 480 Gly Trp Tyr His Phe Phe Tyr Gln Tyr Asn Pro Ser Gly Ser Val Trp 145 150 155 160 gag ccc caa atc gtg tgg ggc cac gcc gtg tcc aag gac ctc att cac 528 Glu Pro Gln Ile Val Trp Gly His Ala Val Ser Lys Asp Leu Ile His 165 170 175 tgg cgc cac ctc ccg ccg gcc ttg gtg ccc gac cag tgg tac gac atc 576 Trp Arg His Leu Pro Pro Ala Leu Val Pro Asp Gln Trp Tyr Asp Ile 180 185 190 aag ggc gtc ctc acc ggc tcc atc acc gtg ctc ccc gac ggc aag gtc 624 Lys Gly Val Leu Thr Gly Ser Ile Thr Val Leu Pro Asp Gly Lys Val 195 200 205 atc ctc ctc tac acg ggg aac acc gag acc ttt gcg cag gtg acc tgc 672 Ile Leu Leu Tyr Thr Gly Asn Thr Glu Thr Phe Ala Gln Val Thr Cys 210 215 220 ctc gcg gag ccc gcc gac ccg agc gat ccc ctc ctc cgc gag tgg gtc 720 Leu Ala Glu Pro Ala Asp Pro Ser Asp Pro Leu Leu Arg Glu Trp Val 225 230 235 240 aag cac ccc gcc aac ccc gtc gtg ttc ccg ccc ccc ggc atc ggc atg 768 Lys His Pro Ala Asn Pro Val Val Phe Pro Pro Pro Gly Ile Gly Met 245 250 255 aag gac ttc cgc gac ccc acc acc gcg tgg ttc gac gag tcc gac ggc 816 Lys Asp Phe Arg Asp Pro Thr Thr Ala Trp Phe Asp Glu Ser Asp Gly 260 265 270 acg tgg cgc acc atc atc ggc tcc aag aac gac tcg gac cac tcc ggc 864 Thr Trp Arg Thr Ile Ile Gly Ser Lys Asn Asp Ser Asp His Ser Gly 275 280 285 atc gtc ttc tcc tac aag acc aag gac ttc ctc agc tac gag ctg atg 912 Ile Val Phe Ser Tyr Lys Thr Lys Asp Phe Leu Ser Tyr Glu Leu Met 290 295 300 ccg ggg tac atg tac cgc ggc ccc aag ggc acc ggc gag tac gag tgc 960 Pro Gly Tyr Met Tyr Arg Gly Pro Lys Gly Thr Gly Glu Tyr Glu Cys 305 310 315 320 atc gac ctc tac gcc gtc ggc ggg ggc cgc aag gcc agc gac atg tac 1008 Ile Asp Leu Tyr Ala Val Gly Gly Gly Arg Lys Ala Ser Asp Met Tyr 325 330 335 aac tcg acg gcc gag gac gtg ctg tac gtg ctc aag gag agc agc gac 1056 Asn Ser Thr Ala Glu Asp Val Leu Tyr Val Leu Lys Glu Ser Ser Asp 340 345 350 gac gac cgg cac gac tgg tac tcg ctg ggc cgg ttc gac gcc gcc gcc 1104 Asp Asp Arg His Asp Trp Tyr Ser Leu Gly Arg Phe Asp Ala Ala Ala 355 360 365 aac aag tgg acg ccg atc gac gag gag ctg gag ctc ggc gtc ggg ctg 1152 Asn Lys Trp Thr Pro Ile Asp Glu Glu Leu Glu Leu Gly Val Gly Leu 370 375 380 cgg tac gac tgg ggc aag tac tac gcg tcc aag tcc ttc tac gac ccc 1200 Arg Tyr Asp Trp Gly Lys Tyr Tyr Ala Ser Lys Ser Phe Tyr Asp Pro 385 390 395 400 gtg aag aag cgg cgc gtc gtg tgg gcg tac gtc ggc gag acc gac tcg 1248 Val Lys Lys Arg Arg Val Val Trp Ala Tyr Val Gly Glu Thr Asp Ser 405 410 415 gag cgc gcc gac atc acc aag ggg tgg gcc aac ctc cag tcg att ccg 1296 Glu Arg Ala Asp Ile Thr Lys Gly Trp Ala Asn Leu Gln Ser Ile Pro 420 425 430 agg aca gtg gag ctt gac gag aag acc cgg acg aac ctc gtc caa tgg 1344 Arg Thr Val Glu Leu Asp Glu Lys Thr Arg Thr Asn Leu Val Gln Trp 435 440 445 cct gtg gag gag ctc gat gcc ctc cgc atc aac acc acc gat ctc agc 1392 Pro Val Glu Glu Leu Asp Ala Leu Arg Ile Asn Thr Thr Asp Leu Ser 450 455 460 ggc atc acc gtc ggc gcc ggc tcc gtt gcc ttc ctc ccc ctc cat cag 1440 Gly Ile Thr Val Gly Ala Gly Ser Val Ala Phe Leu Pro Leu His Gln 465 470 475 480 acc gct cag ctc gac atc gag gca acc ttc cgc atc gat gcc tcc gcc 1488 Thr Ala Gln Leu Asp Ile Glu Ala Thr Phe Arg Ile Asp Ala Ser Ala 485 490 495 att gag gcc ctc aac gag gcc gat gtt agc tac aac tgc acc acc agc 1536 Ile Glu Ala Leu Asn Glu Ala Asp Val Ser Tyr Asn Cys Thr Thr Ser 500 505 510 agc ggg gct gcc acc cgc ggc gcg ctt ggc ccc ttc ggc ctc ctt gtc 1584 Ser Gly Ala Ala Thr Arg Gly Ala Leu Gly Pro Phe Gly Leu Leu Val 515 520 525 ctc gcc aac cgc gcc ctg acc gaa cag acg gga gtg tac ttc tat gtg 1632 Leu Ala Asn Arg Ala Leu Thr Glu Gln Thr Gly Val Tyr Phe Tyr Val 530 535 540 tcc aag ggc ctc gac ggt ggt ctt cgg act cac ttc tgc cac gac gag 1680 Ser Lys Gly Leu Asp Gly Gly Leu Arg Thr His Phe Cys His Asp Glu 545 550 555 560 ttg cgc tcg tcg cat gct agt gac gtg gtg aag cgg gtg gtg ggt agc 1728 Leu Arg Ser Ser His Ala Ser Asp Val Val Lys Arg Val Val Gly Ser 565 570 575 acg gtg cca gtg ctc gac ggc gaa gat ttt tcc gtt agg gtg ctc gtg 1776 Thr Val Pro Val Leu Asp Gly Glu Asp Phe Ser Val Arg Val Leu Val 580 585 590 gac cac tcc att gtg cag agc ttc gcg atg ggc ggg agg ttg aca gca 1824 Asp His Ser Ile Val Gln Ser Phe Ala Met Gly Gly Arg Leu Thr Ala 595 600 605 acg tcg agg gcg tac ccg acc gag gcc atc tac gcg gca gcg ggg gtc 1872 Thr Ser Arg Ala Tyr Pro Thr Glu Ala Ile Tyr Ala Ala Ala Gly Val 610 615 620 tac atg ttc aac aac gcc acc ggc act agc gtc acc gcc gag aag ctt 1920 Tyr Met Phe Asn Asn Ala Thr Gly Thr Ser Val Thr Ala Glu Lys Leu 625 630 635 640 gtc gtg cat gat atg gac tcg tcg tac aac cat ata tac aca gat gat 1968 Val Val His Asp Met Asp Ser Ser Tyr Asn His Ile Tyr Thr Asp Asp 645 650 655 gac ttg gta gtc gtc gat tag 1989 Asp Leu Val Val Val Asp 660 <210> 2 <211> 662 <212> PRT <213> Triticum aestivum L. <400> 2 Met Asp Ser Ser Arg Val Ile Leu Ile Pro Gly Thr Pro Pro Leu Pro 1 5 10 15 Tyr Ala Tyr Glu Gln Leu Pro Ser Ser Ser Ala Asp Ala Lys Gly Ile 20 25 30 Glu Glu Glu Arg Ala Gly Gly Gly Gly Leu Arg Trp Arg Ala Cys Ala 35 40 45 Ala Val Leu Ala Ala Ser Ala Val Val Ala Leu Val Val Ala Ala Ala 50 55 60 Val Phe Gly Ala Ser Gly Ala Gly Trp Asp Ala Val Ala Ala Ser Val 65 70 75 80 Pro Ala Thr Pro Ala Thr Glu Phe Pro Arg Ser Arg Gly Lys Glu His 85 90 95 Gly Val Ser Glu Lys Thr Ser Gly Ala Tyr Ser Ala Asn Ala Phe Pro 100 105 110 Trp Ser Asn Ala Met Leu Gln Trp Gln Arg Thr Gly Tyr His Phe Gln 115 120 125 Pro Asp Lys Tyr Tyr Gln Asn Asp Pro Asn Gly Pro Val Tyr Tyr Gly 130 135 140 Gly Trp Tyr His Phe Phe Tyr Gln Tyr Asn Pro Ser Gly Ser Val Trp 145 150 155 160 Glu Pro Gln Ile Val Trp Gly His Ala Val Ser Lys Asp Leu Ile His 165 170 175 Trp Arg His Leu Pro Pro Ala Leu Val Pro Asp Gln Trp Tyr Asp Ile 180 185 190 Lys Gly Val Leu Thr Gly Ser Ile Thr Val Leu Pro Asp Gly Lys Val 195 200 205 Ile Leu Leu Tyr Thr Gly Asn Thr Glu Thr Phe Ala Gln Val Thr Cys 210 215 220 Leu Ala Glu Pro Ala Asp Pro Ser Asp Pro Leu Leu Arg Glu Trp Val 225 230 235 240 Lys His Pro Ala Asn Pro Val Val Phe Pro Pro Pro Gly Ile Gly Met 245 250 255 Lys Asp Phe Arg Asp Pro Thr Thr Ala Trp Phe Asp Glu Ser Asp Gly 260 265 270 Thr Trp Arg Thr Ile Ile Gly Ser Lys Asn Asp Ser Asp His Ser Gly 275 280 285 Ile Val Phe Ser Tyr Lys Thr Lys Asp Phe Leu Ser Tyr Glu Leu Met 290 295 300 Pro Gly Tyr Met Tyr Arg Gly Pro Lys Gly Thr Gly Glu Tyr Glu Cys 305 310 315 320 Ile Asp Leu Tyr Ala Val Gly Gly Gly Arg Lys Ala Ser Asp Met Tyr 325 330 335 Asn Ser Thr Ala Glu Asp Val Leu Tyr Val Leu Lys Glu Ser Ser Asp 340 345 350 Asp Asp Arg His Asp Trp Tyr Ser Leu Gly Arg Phe Asp Ala Ala Ala 355 360 365 Asn Lys Trp Thr Pro Ile Asp Glu Glu Leu Glu Leu Gly Val Gly Leu 370 375 380 Arg Tyr Asp Trp Gly Lys Tyr Tyr Ala Ser Lys Ser Phe Tyr Asp Pro 385 390 395 400 Val Lys Lys Arg Arg Val Val Trp Ala Tyr Val Gly Glu Thr Asp Ser 405 410 415 Glu Arg Ala Asp Ile Thr Lys Gly Trp Ala Asn Leu Gln Ser Ile Pro 420 425 430 Arg Thr Val Glu Leu Asp Glu Lys Thr Arg Thr Asn Leu Val Gln Trp 435 440 445 Pro Val Glu Glu Leu Asp Ala Leu Arg Ile Asn Thr Thr Asp Leu Ser 450 455 460 Gly Ile Thr Val Gly Ala Gly Ser Val Ala Phe Leu Pro Leu His Gln 465 470 475 480 Thr Ala Gln Leu Asp Ile Glu Ala Thr Phe Arg Ile Asp Ala Ser Ala 485 490 495 Ile Glu Ala Leu Asn Glu Ala Asp Val Ser Tyr Asn Cys Thr Thr Ser 500 505 510 Ser Gly Ala Ala Thr Arg Gly Ala Leu Gly Pro Phe Gly Leu Leu Val 515 520 525 Leu Ala Asn Arg Ala Leu Thr Glu Gln Thr Gly Val Tyr Phe Tyr Val 530 535 540 Ser Lys Gly Leu Asp Gly Gly Leu Arg Thr His Phe Cys His Asp Glu 545 550 555 560 Leu Arg Ser Ser His Ala Ser Asp Val Val Lys Arg Val Val Gly Ser 565 570 575 Thr Val Pro Val Leu Asp Gly Glu Asp Phe Ser Val Arg Val Leu Val 580 585 590 Asp His Ser Ile Val Gln Ser Phe Ala Met Gly Gly Arg Leu Thr Ala 595 600 605 Thr Ser Arg Ala Tyr Pro Thr Glu Ala Ile Tyr Ala Ala Ala Gly Val 610 615 620 Tyr Met Phe Asn Asn Ala Thr Gly Thr Ser Val Thr Ala Glu Lys Leu 625 630 635 640 Val Val His Asp Met Asp Ser Ser Tyr Asn His Ile Tyr Thr Asp Asp 645 650 655 Asp Leu Val Val Val Asp 660 <210> 3 <211> 1851 <212> DNA <213> Triticum aestivum L. <220> <221> CDS <222> (1)..(1851) <400> 3 atg ggg tca cac ggc aag cca ccg cta ccg tac gcg tac aag cca ctg 48 Met Gly Ser His Gly Lys Pro Pro Leu Pro Tyr Ala Tyr Lys Pro Leu 1 5 10 15 ccc tcc gac gcc gac ggc gag cgg gcc ggc tgc acg agg tgg cgc gtg 96 Pro Ser Asp Ala Asp Gly Glu Arg Ala Gly Cys Thr Arg Trp Arg Val 20 25 30 tgc gcc gtc gcg ctg acg gcc tcg gcc atg gtg gtg gtg gtg gtc ggc 144 Cys Ala Val Ala Leu Thr Ala Ser Ala Met Val Val Val Val Val Gly 35 40 45 gcc acg ctc ctg gca ggg ttc cgg gtg gac cag gcc gtc gac gag gag 192 Ala Thr Leu Leu Ala Gly Phe Arg Val Asp Gln Ala Val Asp Glu Glu 50 55 60 gcg gcg ggc ggg ttc ccg tgg agc aac gag atg ctg cag tgg cag cgc 240 Ala Ala Gly Gly Phe Pro Trp Ser Asn Glu Met Leu Gln Trp Gln Arg 65 70 75 80 agt ggc tac cat ttc cag acg gcc aag aac tac atg agc gat ccc aac 288 Ser Gly Tyr His Phe Gln Thr Ala Lys Asn Tyr Met Ser Asp Pro Asn 85 90 95 ggt ctg atg tac tac cgt gga tgg tac cac atg ttc ttc cag tac aac 336 Gly Leu Met Tyr Tyr Arg Gly Trp Tyr His Met Phe Phe Gln Tyr Asn 100 105 110 ccg gtg ggc acc gac tgg gac gac ggc atg gag tgg ggc cac gcc gtg 384 Pro Val Gly Thr Asp Trp Asp Asp Gly Met Glu Trp Gly His Ala Val 115 120 125 tcc cgg aac ctc gtc caa tgg cgc acc ctc cct att gcc atg gtg gcc 432 Ser Arg Asn Leu Val Gln Trp Arg Thr Leu Pro Ile Ala Met Val Ala 130 135 140 gac cag tgg tac gac atc ctc ggg gtt cta tcg ggc tct atg acc gtg 480 Asp Gln Trp Tyr Asp Ile Leu Gly Val Leu Ser Gly Ser Met Thr Val 145 150 155 160 cta ccc aat ggc acg gtc atc atg atc tac acg ggg gcc acc aac gcc 528 Leu Pro Asn Gly Thr Val Ile Met Ile Tyr Thr Gly Ala Thr Asn Ala 165 170 175 tcc gcc gtt gag gtc cag tgc atc gcc act ccc gcc gac cct acc gac 576 Ser Ala Val Glu Val Gln Cys Ile Ala Thr Pro Ala Asp Pro Thr Asp 180 185 190 ccc ctc ctc cgc cgc tgg acc aag cac ccc gcc aac ccc gtc atc tgg 624 Pro Leu Leu Arg Arg Trp Thr Lys His Pro Ala Asn Pro Val Ile Trp 195 200 205 tcg ccg ccg ggg gtc ggc acc aag gat ttc cga gac ccg atg acc gct 672 Ser Pro Pro Gly Val Gly Thr Lys Asp Phe Arg Asp Pro Met Thr Ala 210 215 220 tgg tac gat gaa tct gat gac aca tgg cgc acc ctg ctc ggg tcc aag 720 Trp Tyr Asp Glu Ser Asp Asp Thr Trp Arg Thr Leu Leu Gly Ser Lys 225 230 235 240 gac gac aac aac ggc cac cac gat ggc atc gcc atg atg tac aag acc 768 Asp Asp Asn Asn Gly His His Asp Gly Ile Ala Met Met Tyr Lys Thr 245 250 255 aag gac ttc ctt aac tac gag ctc atc ccg ggc atc ttg cat cgg gtc 816 Lys Asp Phe Leu Asn Tyr Glu Leu Ile Pro Gly Ile Leu His Arg Val 260 265 270 gag cgc acc ggc gag tgg gag tgc atc gac ttc tac cct gtc ggt cgc 864 Glu Arg Thr Gly Glu Trp Glu Cys Ile Asp Phe Tyr Pro Val Gly Arg 275 280 285 cgc acc agc gac aac tca tcg gag atg ttg cac gtg ttg aag gcg agc 912 Arg Thr Ser Asp Asn Ser Ser Glu Met Leu His Val Leu Lys Ala Ser 290 295 300 atg gac gac gaa cgg cat gac tac tac tcg cta ggc acg tac gac tct 960 Met Asp Asp Glu Arg His Asp Tyr Tyr Ser Leu Gly Thr Tyr Asp Ser 305 310 315 320 gcg gca aac agg tgg acg ccg atc gac ccg gag ctc gac ttg ggg atc 1008 Ala Ala Asn Arg Trp Thr Pro Ile Asp Pro Glu Leu Asp Leu Gly Ile 325 330 335 ggg ttg aga tac gac tgg ggt aag ttc tac gcg tcc acc tcg ttc tat 1056 Gly Leu Arg Tyr Asp Trp Gly Lys Phe Tyr Ala Ser Thr Ser Phe Tyr 340 345 350 gat ccg gcg aag aag cga cgc gtg ctg atg ggg tac gtc ggc gag gtc 1104 Asp Pro Ala Lys Lys Arg Arg Val Leu Met Gly Tyr Val Gly Glu Val 355 360 365 gac tcc aag cgg gct gat gtg gtg aag gga tgg gcc tca att cag tca 1152 Asp Ser Lys Arg Ala Asp Val Val Lys Gly Trp Ala Ser Ile Gln Ser 370 375 380 gtt cca agg aca att gct ctc gac gag aag acc cgg acg aac ctc ctc 1200 Val Pro Arg Thr Ile Ala Leu Asp Glu Lys Thr Arg Thr Asn Leu Leu 385 390 395 400 ctc tgg ccc gtg gag gag att gag acc ctc cgc ctc aac gcc acc gaa 1248 Leu Trp Pro Val Glu Glu Ile Glu Thr Leu Arg Leu Asn Ala Thr Glu 405 410 415 ctc agc gac gtc acc ctt aac acc ggc tcc gtc atc cat atc ccg ctc 1296 Leu Ser Asp Val Thr Leu Asn Thr Gly Ser Val Ile His Ile Pro Leu 420 425 430 cgc caa ggc act cag ctc gac atc gag gcc act ttc cac ctt gat gct 1344 Arg Gln Gly Thr Gln Leu Asp Ile Glu Ala Thr Phe His Leu Asp Ala 435 440 445 tct gcc gtc gct gcc ctc aat gag gcc gat gtg ggc tac aac tgc agc 1392 Ser Ala Val Ala Ala Leu Asn Glu Ala Asp Val Gly Tyr Asn Cys Ser 450 455 460 agc agc ggc ggt gct gtt aac cgc ggc gcg cta ggc ccc ttc ggc ctc 1440 Ser Ser Gly Gly Ala Val Asn Arg Gly Ala Leu Gly Pro Phe Gly Leu 465 470 475 480 ctc gtc ctc gct gcc ggt gac cgc cgt ggc gag caa acg gcg gtg tac 1488 Leu Val Leu Ala Ala Gly Asp Arg Arg Gly Glu Gln Thr Ala Val Tyr 485 490 495 ttc tac gtg tcc agg ggg ctc gac gga ggc ctc cat acc agc ttc tgc 1536 Phe Tyr Val Ser Arg Gly Leu Asp Gly Gly Leu His Thr Ser Phe Cys 500 505 510 caa gac gag tta cgg tcg tca cgg gcc aag gac gtg acg aag cga gtg 1584 Gln Asp Glu Leu Arg Ser Ser Arg Ala Lys Asp Val Thr Lys Arg Val 515 520 525 att ggg agc acg gtg ccg gtg ctc gac ggc gag gct ttc tcg atg agg 1632 Ile Gly Ser Thr Val Pro Val Leu Asp Gly Glu Ala Phe Ser Met Arg 530 535 540 gtg ctc gtg gac cac tcc atc gtg cag ggc ttc gcg atg ggc ggg agg 1680 Val Leu Val Asp His Ser Ile Val Gln Gly Phe Ala Met Gly Gly Arg 545 550 555 560 acc acg atg acg tca cgg gtg tac ccg atg gag gcc tat cag gag gca 1728 Thr Thr Met Thr Ser Arg Val Tyr Pro Met Glu Ala Tyr Gln Glu Ala 565 570 575 aaa gtg tac ttg ttc aac aat gcc acc ggt gcc agc gtc acg gcg gaa 1776 Lys Val Tyr Leu Phe Asn Asn Ala Thr Gly Ala Ser Val Thr Ala Glu 580 585 590 agg ctc gtc gtg cac gag atg gac tca gcg cac aac cag ctc tcc aat 1824 Arg Leu Val Val His Glu Met Asp Ser Ala His Asn Gln Leu Ser Asn 595 600 605 atg gac gat cac tcg tat gtt caa tag 1851 Met Asp Asp His Ser Tyr Val Gln 610 615 <210> 4 <211> 616 <212> PRT <213> Triticum aestivum L. <400> 4 Met Gly Ser His Gly Lys Pro Pro Leu Pro Tyr Ala Tyr Lys Pro Leu 1 5 10 15 Pro Ser Asp Ala Asp Gly Glu Arg Ala Gly Cys Thr Arg Trp Arg Val 20 25 30 Cys Ala Val Ala Leu Thr Ala Ser Ala Met Val Val Val Val Val Gly 35 40 45 Ala Thr Leu Leu Ala Gly Phe Arg Val Asp Gln Ala Val Asp Glu Glu 50 55 60 Ala Ala Gly Gly Phe Pro Trp Ser Asn Glu Met Leu Gln Trp Gln Arg 65 70 75 80 Ser Gly Tyr His Phe Gln Thr Ala Lys Asn Tyr Met Ser Asp Pro Asn 85 90 95 Gly Leu Met Tyr Tyr Arg Gly Trp Tyr His Met Phe Phe Gln Tyr Asn 100 105 110 Pro Val Gly Thr Asp Trp Asp Asp Gly Met Glu Trp Gly His Ala Val 115 120 125 Ser Arg Asn Leu Val Gln Trp Arg Thr Leu Pro Ile Ala Met Val Ala 130 135 140 Asp Gln Trp Tyr Asp Ile Leu Gly Val Leu Ser Gly Ser Met Thr Val 145 150 155 160 Leu Pro Asn Gly Thr Val Ile Met Ile Tyr Thr Gly Ala Thr Asn Ala 165 170 175 Ser Ala Val Glu Val Gln Cys Ile Ala Thr Pro Ala Asp Pro Thr Asp 180 185 190 Pro Leu Leu Arg Arg Trp Thr Lys His Pro Ala Asn Pro Val Ile Trp 195 200 205 Ser Pro Pro Gly Val Gly Thr Lys Asp Phe Arg Asp Pro Met Thr Ala 210 215 220 Trp Tyr Asp Glu Ser Asp Asp Thr Trp Arg Thr Leu Leu Gly Ser Lys 225 230 235 240 Asp Asp Asn Asn Gly His His Asp Gly Ile Ala Met Met Tyr Lys Thr 245 250 255 Lys Asp Phe Leu Asn Tyr Glu Leu Ile Pro Gly Ile Leu His Arg Val 260 265 270 Glu Arg Thr Gly Glu Trp Glu Cys Ile Asp Phe Tyr Pro Val Gly Arg 275 280 285 Arg Thr Ser Asp Asn Ser Ser Glu Met Leu His Val Leu Lys Ala Ser 290 295 300 Met Asp Asp Glu Arg His Asp Tyr Tyr Ser Leu Gly Thr Tyr Asp Ser 305 310 315 320 Ala Ala Asn Arg Trp Thr Pro Ile Asp Pro Glu Leu Asp Leu Gly Ile 325 330 335 Gly Leu Arg Tyr Asp Trp Gly Lys Phe Tyr Ala 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Met Gly Gly Arg 545 550 555 560 Thr Thr Met Thr Ser Arg Val Tyr Pro Met Glu Ala Tyr Gln Glu Ala 565 570 575 Lys Val Tyr Leu Phe Asn Asn Ala Thr Gly Ala Ser Val Thr Ala Glu 580 585 590 Arg Leu Val Val His Glu Met Asp Ser Ala His Asn Gln Leu Ser Asn 595 600 605 Met Asp Asp His Ser Tyr Val Gln 610 615 <210> 5 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 5 atggattcgt ctcgcgtc 18 <210> 6 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 6 ctaatcgacg actaccaagt c 21 <210> 7 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 7 atggggtcac acggcaag 18 <210> 8 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 8 tcattgaaca tacgagtgat c 21 <210> 9 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer <220> <221> modified base 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Claims

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이하의 (a) 내지 (b)중 적어도 1개의 프럭탄 합성 효소 유전자를 벼 세포에 도입하는 것을 특징으로 하는 벼의 내냉성을 강화하는 방법:

(a) 서열번호 1 또는 3에 나타낸 염기서열을 갖는 유전자;

(b) 서열번호 2 또는 4에 나타낸 아미노산 서열을 갖는 단백질을 암호화하는 유전자.
제 3항에 있어서, 내냉성이 유묘기 내냉성 및 이삭 패는 시기 내냉성인 방법.
벼 재배에서 냉온 장해를 경감하기 위하여, 이하의 (a) 내지 (b)중 적어도 1개의 프럭탄 합성 효소 유전자를 포함하는, 강화된 내냉성을 갖는 트랜스제닉 벼를 사용하는 방법:

(a) 서열번호 1 또는 3에 나타낸 염기서열을 갖는 유전자;

(b) 서열번호 2 또는 4에 나타낸 아미노산 서열을 갖는 단백질을 암호화하는 유전자.
제 5항에 있어서, 냉온 장해가 벼의 유묘기 및 이삭 패는 시기에 발생하는 냉온 장해인 트랜스제닉 벼를 사용하는 방법.