耐冷性植物及びその開発方法 技術分野
本発明は、 耐冷性強化植物及び植物の耐冷性強化法に関する。 背景技術
明
寒冷地における作物栽培では、 早春や晩秋の霜害、 夏期の冷温による冷害、 冬 期の凍害や雪害などの、 低温と関連した田障害が発生しやすい。 そこで、 低温耐性 を強化した様々な作物の開発が従来から積極的に進められている。
低温耐性は、 温度要因の面から耐冷性と耐寒性に大きく分類される。 耐冷性は、 作物が早春〜秋の間に曝露されるプラス温度域の低温 (冷温) に対する耐性であ る。 一般に作物はこの時期の冷温によって生育遅延、 登熟不良、 及び不稔などの 障害を起こしやすい。 従って作物の高度な耐冷性は、 これらの障害による収量の 減少を軽減する上で有利である。 一方、 耐寒性は、 主として越冬性の作物が冬期 に曝露される凍結温度 (o °c以下) に対する耐性である。 耐寒性には、 耐凍性 ( o °c以下での凍結障害を回避する能力) 、 耐雪性 (o °c以下での凍結障害を回 避し、 かつ暗黒下でも長期生存できる能力) などが包含される。 耐寒性を示す作 物は、 凍結温度下でも、 凍結による障害を最小限に抑えて生存可能である。
植物の耐寒性に寄与する物質として、 フルクタンが知られている。 フルクタン は越冬時のエネルギー源であり、 また凍結防止及び乾燥耐性の機能を有する多糖 類である。 パクテリアや植物由来のフルクタン合成酵素遺伝子を植物に導入して、 植物の耐凍性及ぴ耐乾性を向上させる研究が行われており、 たばこ (非特許文献
1 ) 及びペレ二アルライグラス (非特許文献 2 ) では、 耐凍性及び耐乾性が向上 することが報告されている。 秋播コムギのもつ高度な耐寒性に寄与するフルクタ ン合成酵素遺伝子も単離されている (特許文献 1及び非特許文献 3 ) 。
非越冬性作物であるイネの早期栽培及ぴ直播栽培でも、 イネの生育初期におい て 1 0 °Cを下回る低温に遭遇することが多いためしばしば著しい低温障害が発生
し、 イネの枯死につながる (非特許文献 4 ) 。 また穂ばらみ期のイネが夏期の低 温に遭遇した場合、 イネの花粉形成が阻害され不稔となり収量が大きく低下する (非特許文献 5 ) 。 これらの時期における耐冷性を強化したイネの開発は現在精 力的に試みられているものの、 既存の遺伝資源を材料にした育種法では、 耐冷性 の大幅な向上を望むには限界がある。
特許文献 1 特開 2 0 0 0— 3 5 0 5 8 3号公報
非特許文献 1 Konstantinova T. et al., Plant Sci. (2002) 163: p. 157-
164
非特許文献 2 Hisano H. et al. , Plant Sci . (2004) 167: p. 861-868 非特許文献 3 Kawakami A. and Yoshi da M., Biosci . Biotechnol. Biochem. (2002) 66 (11) , p. 2297-2305
非特許文献 4 田島ら、 「低温によるイネの生育阻害の生理的研究」 、 農技 研報、 (1983) 34: p. 69-111
非特許文献 5 Satake T. and Hayase H. , Proc. Crop Sci. Japan (1970) 39: p. 68-473
非特許文献 6 Gar ham D. and Patterson B. D. , Ann. Rev. Plant Physiol. (1982) 33: p. 347-372 発明の開示
本発明は、 プラス温度域の低温ス トレスに対する耐性 (耐冷性) を持つ植物及 び植物における耐冷性の強化法を提供することを目的とする。
本発明者らは、 上記課題を解決するため鋭意検討を重ねた結果、 フルクタン合 成酵素遺伝子である、 スクロース : スクロース 1 ーフノレク トシノレトランスフエ フ' ~~ ( l-Sb T ; sucrose: sucrose 1-fructosyl transferase) iiiKナ、 又はスグ ロース : フルク タ ン 6 —フノレク ト シノレ ト ラ ンス フェ ラーゼ ( 6 - SFT ; sucrose: fructan 6-fructosyltransf erase) 遣 1s子を ¾入したトフンスシェニッ クイネが、 強い耐冷性 (プラス温度域の低温耐性) を示すことを見出し、 その知 見に基づき本発明を完成するに至づた。 フルクタンとは、 主にスグロースにフル クトースが重合した三糖以上の糖の総称であり、 フルクト^ "スのみが重合した多
糖も包含される。
すなわち、 本発明は以下を包含する。
[1] 以下の(a)〜( のうち少なくとも 1つのフルクタン合成酵素遺伝子を含む、 強化された耐冷性を有するトランスジエニックイネ。
(a) 配列番号 1又は 3に示す塩基配列からなる遺伝子;
(b) 配列番号 1又は 3に示す塩基配列からなる DNAとストリンジェントな条件 下でハイブリダイズし、 かつフルクタン合成活性を有するタンパク質をコードす る DNAからなる遺伝子;
(c) 配列番号 2又は 4に示すアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺 伝子;
(d) 配列番号 2又は 4に示すアミノ酸配列において 1若しくは数個のアミノ酸 が欠失、 置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、 かつフルクタン合成活 性を有するタンパク質をコードする遺伝子;
(e) 配列番号 1又は 3に示す塩基配列と 8 5 %以上の同一性を示す塩基配列か らなり、 かつフルクタン合成活性を有するタンパク質をコードする遺伝子;及ぴ
(f) 配列番号 2又は 4に示すアミノ酸配列と 8 5 %以上の同一性を示すアミノ 酸配列からなり、 かつフルクタン合成活性を有するタンパク質をコードする遺伝 子。
このトランスジェニックイネにおいて強化されている耐冷性は、 好ましくは、 幼苗期耐冷性及び Z又は穂ばらみ期耐冷性である。
[2] 以下の(a)〜(f)の少なくとも 1つのフルクタン合成酵素遺伝子をイネ細胞 に導入することを特徴とする、 イネの耐冷性を強化する方法。
(a) 配列番号 1又は 3に示す塩基配列からなる遺伝子;
(b) 配列番号 1又は 3に示す塩基配列からなる DNAとストリンジェントな条件 下でハイブリダィズし、 かつフルクタン合成活性を有するタンパク質をコードす る DNAからなる遺伝子;
(c) 配列番号 2又は 4に示すアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺 伝子;
(d) 配列番号 2又は 4に示すアミノ酸配列において 1若しくは数個のアミノ酸
が欠失、 置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、 かつフルクタン合成活 性を有するタンパク質をコードする遺伝子;
(e) 配列番号 1又は 3に示す塩基配列と 8 5 %以上の同一性を示す塩基配列か らなり、 かつフルクタン合成活性を有するタンパク質をコードする遺伝子;及び
(f) 配列番号 2又は 4に示すアミノ酸配列と 8 5 %以上の同一性を示すアミノ 酸配列からなり、 かつフルクタン合成活性を有するタンパク質をコードする遺伝 子。
この方法で強化される耐冷性は、 幼苗期耐冷性及び/又は穂ばらみ期耐冷性で あることが好ましい。
[3] イネ栽培における冷温障害を軽減するための、 上記 [1]又は [2]に記載のト ランスジヱニックイネの使用。 この使用によれば、 特に、 イネの幼苗期及び/又 は穂ばらみ期に発生する冷温障害を効果的に軽減することができる。
本発明のトランスジエニックイネは、 プラス温度域の低温に対して高い耐性を 示す。 従って本発明のトランスジヱニックイネを用いれば、 夏期の低温による枯 死などの冷害を軽減し、 冷害が生じやすレ、不適地でも十分な生育量及び収量を得 られる栽培が可能になる。 本発明のイネの耐冷性強化法を用いることにより、 既 存のイネ品種に高度の耐冷性を付与することができる。 本明細書は本願の優先権の基礎となる日本国特願 2005- 182251号の明細書およ び または図面に記載される内容を包含する。 図面の簡単な説明
図 1は、 1 - SST遺伝子導入イネから抽出した可溶性糖類の溶出プロファイル [ (B) ] 、 キクイモ塊茎 [ (A) ] 及び原品種ユキヒカリ [ (C) ] からのそれぞれの 抽出物に含まれる可溶性糖類の溶出プロファイル、 並びに溶出プロファイルにピ ークとして現れたフルクタンの構造 [ (D) ] を示した図である。 G : グルコース、 F: フルク トース、 S : スクロース、 1〜5:重合度 3〜 7のフルクタン。
図 2は、 1- SST遺伝子導入イネ及ぴ 6-SFT遺伝子導入イネから抽出した可溶性糖 類の溶出プロファイルの比較図である。
図 3は、 6- SFT遺伝子導入ィネから抽出した可溶性糖類の溶出プ口ファイル、 及ぴ秋播きコムギからの抽出物に含まれるフルクタンの構造を示した図である。 Aは秋播コムギの茎 (開花後 10日) 、 Bは 6- SFT遺伝子導入ユキヒカリの葉を試 料とした。 IK : 1ーケス ト—ス、 B : ビフノレコース、 2 : 1&6, 1 ケス トペン タオース、 4 : 1, 1, 1 & 6 ケス 卜へキサオース、 6 : 1, 1, 1, 1&6 ケス トヘプト ース、 6—ケス トース。 丄、 3_, 5_, : それぞれ異なる重合度の ( 2 →6 ) 結合フルクタン (レバン) である。
図 4は、 1-SST遺伝子導入ィネ及ぴ 6- SFT遺伝子導入ィネにおける、 1-SST遺伝 子及び 6-SFT遺伝子の mRNAレベルの発現量を示した写真である。 116 : 116- 2-1系 統、 122 : 122-1-1系統、 124 : 124- 6-1系統、 129 : 129- 5-1系統、 131 : 131-10-1 系統、 cont : 原品種ユキヒカリ、 S33 : S33-5- 2系統、 S50 : S50- 5-1系統、 S51 : S51- 2-1系統。
図 5は、 1- SST遺伝子導入イネ及び 6- SFT遺伝子導入イネについて、 系統毎の幼 苗期耐冷性を示した図である。
図 6は、 1- SST遺伝子導入イネ及び 6- SFT遺伝子導入イネについて、 系統毎の穂 ばらみ期耐冷性を示した図である。 発明を実施するための最良の形態
以下、 本発明を詳細に説明する。
1 . 本発明のトランスジエニックイネとその作製
丄) トランスジエニックイネ
本発明のトランスジエニックイネは、 遺伝子導入されたフルクタン合成酵素遺 伝子であるスクロース : スクロース 1—フルク トシルトランスフェラーゼ (1 - SST) 遺伝子、 又はスクロース : フルクタン 6—フルク トシルトランスフェラー ゼ (6- SFT) 遺伝子をその細胞内に保持す'る、 形質転換イネである。
本発明のトランスジエニックイネにおいては、 導入された 1 - SST遺伝子又は 6 - SFT遺伝子は、 宿主イネ細胞の染色体に組み込まれていることが好ましいが、 染 色体外に保持されていてもよい。 1-SST遺伝子又は 6-SFT遺伝子がトランスジェニ ックイネの染色体中に組み込まれている場合、 それら導入遺伝子はホモ接合性で
あることがより好ましいが、 ヘテロ接合性であってもよい。 本発明のトランスジ エニックイネは、 それら導入遺伝子を 3コピー以上有していてもよい。
本明細書において用語 「トランスジエニックイネ」 は、 トランスジエニックィ ネの植物体だけでなく、 導入遺伝子を発現しているか又は発現しうる状態で保持 しているイネ細胞、 並びにそのイネ細胞を含むイネ器官 [例えば葉、 花、 茎、 根、 穀実 (種子) 等] 、 イネ組織 [例えば表皮、 師部、 柔組織、 木部、 維管束、 柵状 組織、 海綿状組織等] 、 及びイネ培養細胞 (例えばカルス) なども意味する。 本 発明のトランスジエニックイネには、 遺伝子導入したイネ細胞又はそれを含む力 ルスから再生させた植物体の子孫イネ、 及びその一部も包含される。
2 ) 本発明のフルクタン合成酵素遺伝子とその調製
本発明においてイネに導入されるフルクタン合成酵素遺伝子の 1-SST遺伝子及 ぴ 6-SFT遺伝子は、 植物、 パクテリア、 糸状菌を含む様々な生物起源から単離さ れるものであってよい。 そのような生物起源としては、 越冬性の生物や、 耐寒性
(耐雪性又は耐凍性) を有する生物などが好ましい。 限定するものではないが、 1- SST遺伝子及び 6- SFT遺伝子は、 秋播コムギ (Triticum astivum L. ) から単離 された 1 - SST遺伝子及ぴ 6- SFT遺伝子であることがより好ましい。 さらに、 生物か ら単離された 1- SST遺伝子及び 6- SFT遺伝子だけでなく、 その塩基配列に塩基の置 換ゃ欠失等の変異を含むがなおフルクタン合成酵素をコードしているそれら遺伝 子も、 本発明において用いることができる。
具体的には、 本発明において好適な 1-SST遺伝子としては、 例えば、 秋播コム ギの 1- SST遺伝子である、 配列番号 1に示す塩基配列を含み、 かつ配列番号 2の 了ミノ酸酉 3列を有するスクロース : スクロース 1一フルク トシルトランスフエ ラーゼをコ一ドする遺伝子が挙げられる。 また本発明において好適な 6 - SFT遺伝 子としては、 例えば、 秋播コムギの 6- SFT遺伝子である、 配列番号 3に示す塩基 配列を含み、 配列番号 4のアミノ酸配列を有するスクロース : フルクタン 6— フルク トシルトランスフェラーゼをコ一ドする遺伝子が挙げられる。
さらに、 本発明に係る 1-SST遺伝子又は 6 - SFT遺伝子は、 配列番号 1又は 3に示 す塩基配列を有する DNAとストリンジヱントな条件下でハイブリダイズし、 かつ
フルクタン合成活性を有するタンパク質をコードする DNAからなる遺伝子であつ てもよい。
本発明に係る 1-SST遺伝子又は 6-SFT遺伝子は、 配列番号 2又は 4に示すァミノ 酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子であってもよく、 さらに、 配列番 号 2又は 4に示すアミノ酸配列において 1若しくは数個 (2〜9個、 好ましくは 2〜5個) のアミノ酸が欠失、 置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、 かつフルクタン合成活性を有するタンパク質をコードする遺伝子であってもよい。 あるいは、 本発明の 1-SST遺伝子又は 6- SFT遺伝子は、 配列番号 1又は 3に示す 塩基配列と少なくとも 8 5 %以上、 好ましくは 9 0 %以上の同一性を示す塩基配 列からなり、 かつフルクタン合成活性を有するタンパク質をコードする遺伝子で あってもよい。 本発明の 1- SST遺伝子又は 6-SFT遺伝子はまた、 配列番号 2又は 4 に示すァミノ酸配列と少なくとも 6 0 %以上、 好ましくは 7 0 %以上、 さらに好 ましくは 8 5 %以上の同一性を示すアミノ酸配列からなり、 かつフルクタン合成 活性を有するタンパク質をコードする遺伝子であってもよい。
本発明において 「ス トリンジェントな条件」 とは、 特異的な核酸ハイブリッド が形成される条件を言い、 具体的には、 ナト'リウム塩濃度が 15〜750mM、 好まし くは 50〜750mM、 より好ましくは 300〜750mM、 温度が 2 5〜 7 0 °C、 より好まし くは 5 5〜 6 5 °C、 ホルムアミ ド濃度が 0〜 5 0 %、 より好ましくは 3 5〜4 5 %となる反応条件をいう。 ストリンジェントな条件では、 さらに、 ハイブリダ ィゼーション後のフィルターの洗浄条件を、 ナトリウム塩濃度が 15〜600mM、 好 ましくは 50〜600mM、 より好ましくは 300〜600mM、 温度が 5 0〜 7 0 °C、 好まし くは 5 5〜7 0 ° (:、 より好ましくは 6 0〜6 5 °Cとすることが好適である。
本明細書において 「遺伝子」 は、 DNA又は RNAであり うる。 DNAには少なくとも ゲノム DNA、 cDNAが含まれ、 RNAには、 mRNAなどが含まれる。 本発明の 1- SST遺伝 子及び 6- SFT遺伝子は、 1- SST遺伝子又は 6- SFT遺伝子のオープンリ一ディングフ レーム配列以外に、 非翻訳領域 (UTR) の配列などを含んでもよい。
なお本発明の 1 - SST遺伝子又は 6-SFT遺伝子にコードされる酵素のフルクタン合 成活性は、 1 - SST遺伝子の場合は、 .スクロース : スクロース 1—フルク トシルト ランスフェラーゼ活性であることが好ましく、 6 - SFT遺伝子の場合は、 スクロー
ス : フルクタン 6—フルクトシルトランスフェラーゼ活性であることが好まし い。
本発明の 1 - SST遺伝子及び 6-SFT遺伝子にコードされる酵素 (タンパク質) が有 するフルクタン合成活性は、 スクロース及びフルクタンを基質としてより長鎖の フルクタンを合成する機能である (非特許文献 3 ) 。 具体的には、 フルクタン合 成酵素 1-SSTは、 スクロース 2分子を基質として、 その一方のスクロース由来の フルクトースを他方のスクロースに 2, 1-結合で転移させて 1ーケストース ( 3 糖のフルクタン) を合成する活性を主に持つ。 さらにフルクタン合成酵素 1-SST は、 合成された 1ーケス トースにフルク トースを )3 2, 1 -結合により転移させてよ り長鎖のフルクタンを合成する活性も持ち合わせる。 一方、 フルクタン合成酵素 6 - SFTは、 スクロース 2分子を基質とした場合、 スクロースを分解してダルコ一 スとフルクトースを生成する活性を主に持つとともに、 一方のスクロース由来の フルクトースを他方のスクロースに ]3 2, 1-又は ]3 2, 6 -結合で転移させて、 1—ケ ストース又は 6—ケストースを合成する活性を併せ持つ。 さらに 6 - SFTは、 スク ロースとフルクタンを基質として、 スクロース由来のフルク 卜ースをフルクタン に ]3 2, 6 -結合で転移させ、 より長鎖のフルクタンを合成する活性を持つ。
これらのフルクタン合成酵素のフルクタン合成活性は、 非特許文献 3に記載さ れているようにして、 例えば次のように確認することができる。 まず、 単離した 遺伝子を組換え発現ベクターに組み込み、 その組換え発現ベクターを用いて酵母 を形質転換し、 得られた形質転換体においてその組換えベクターからのタンパク 質の発現を誘導した後、 導入遺伝子由来のタンパク質を精製及び濃縮する。 この 濃縮液を粗酵素液としてスクロース、 又はスクロース及ぴ 1ーケストースを基質 として 10°Cで 2時間反応させ、 DI0NEX社の DX500を用いた高速陰イオン交換クロ マ卜グラフィー (HPAEC ; High Performance Ani on-Exchange Chromatography) 法により、 Carbopac PA- 1カラム (DIONEX社) を用いて分析する。 その結果、 1 -
SST遺伝子を導入した酵母由来の粗酵素液を用いて、 スクロースを基質として分 析を行った場合、 1ーケストースを示すピークが検出されることによって、 その
1-SST遺伝子にコードされた酵素のスクロース :スクロース 1—フルクトシルト ランスフェラーゼ活性を確認できる。
一方、 6- SFT遺伝子を導入した酵母由来の粗酵素液を用いて、 スクロースを基 質として同様の分析を行った場合には、 その分解活性を示すフルクトースとダル コースのピークとともに 1ーケストース及び 6—ケストースのピークが検出され ること、 さらに、 スクロースと 1—ケストースを基質とした場合、 ビフルコース (スクロースを構成するフルク トースに ;3 2, 1-結合及び β 2, 6-結合するフルクト ースを 1つずつ持つ四糖のフルクタン) が検出されることによって、 その 6- SFT 遺伝子にコードされた酵素のスクロース : フルクタン 6—フルク トシルトラン スフエラーゼ活性を確認できる。
以上で説明したような本発明の 1- SST遺伝子及び 6- SFT遺伝子を含む DNA断片は、 当業者であれば、 1- SST遺伝子及び 6-SFT遺伝子の既知配列を利用して、 1- SST遺 伝子及び 6- SFT遺伝子を有する生物から抽出した核酸から常法に従って得ること ができる。
一実施形態としては、 フルクタンを蓄積する植物のフルクタンを蓄積する組織 から常法に基づいて抽出された mRNAから合成した cDNAを鏡型として、 既知のフル クタン合成酵素遺伝子の間で高度に保存された領域に基いて設計したプライマー を利用して PCR増幅することにより、 1-SST又は 6- SFT遺伝子の部分断片を得て、 さらにその断片をプローブとして、 上記 cDNA由来の cDNAライブラリ一をプロット したフィルターとのハイプリダイゼーションを行うことにより、 1-SST又は 6- SFT 遺伝子の全長を含む cDNAクローンを単離することができる。
また別の一実施形態としては、 本発明に係るフルクタン合成酵素遺伝子 1-SST 及び 6- SFTを含む DNA断片は、 フルクタンを蓄積する植物のフルクタンを蓄積する 組織から常法により抽出した mRNAを铸型として、 1 - SST遺伝子又は 6 - SFT遺伝子の 全長を増幅可能なように設計したプライマーを用いた PCR増幅によって、 完全長 cDNAとして取得することができる。
さらに、 得られたフルクタン合成酵素遺伝子 1-SST又は 6-SFTを含む DNA断片に ついては、 部位特異的変異誘発等によって塩基配列を改変することもできる。
DNAに変異を導入するには、 Kunkel法、 Gapped duplex法等の公知の手法又はこれ に準ずる方法を 用することができる。 変異導入は、 例えば部位特異的変異導入 用キッ ト、 例えば Mutan(R)- Super Express Kit ( TAKARA BIO INC. ) や LA PCR™
in vitro Mutagenesis シリーズキット (TAKARA BIO INC. ) などを用いて行うこ ともできる。
好適な例としては、 秋播コムギ由来の 1- SST遺伝子又は 6-SFT遺伝子を含む DNA 断片は、 低温下に曝露した秋播コムギから抽出した mRNAから合成された cDNAを铸 型とし、 オープンリーディングフレームの全長を増幅するように設計された以下 のプライマー対を用いて PCR増幅を行うことにより、 取得することができる。
1- SST遺伝子増幅用プライマー対:
プライマー Pri- 1 (5, - atggattcgtctcgcgtc - 3 [酉己歹 U番号 5」)
プライマー Pri-2 (5 - ctaatcgacgactaccaagtc -3 [目己列番号 6 ] )
6- SFT遺伝子増幅用プライマー対:
フライマー Pri_3 (b -atggggtcacacggcaag-3 [酉己歹幡号 7 ] )
プライマー Pri- 4 (5' -tcattgaacatacgagtgatc-3' fe列番号 8 ] )
この秋播コムギ由来の 1- SST遺伝子又は 6- SFT遺伝子の全長を PCR増幅するため の PCR反応液 (20 μ 1) 組成としては、 例えば、 以下の組成を用いることができる。 表 1: 反応液組成
cDNA lOOng
Pri-1 又は Pri-3 0. 5 μ M
Pri-2 又は Pri - 4 0. 5 μ M
dNTPs 0. 2mM
MgCl2 1. 5mM
EX Tag DNAポリメラーゼ(TAKARA BIO INC. ) 1U
総量 20 μ 1 この PCR増幅の反応条件としては、 94°Cで 1分、 56°Cで 1分、 72°Cで 2分のサイク ルを 1サイクルとしてこれを 30サイクル行う設定を用いることができる。
このような秋播コムギの 1- SST遺伝子又は 6-SFT遺伝子を含む DNA断片の調製に 好適なプライマーや PCR条件などは、 当業者であれば、 他の生物、 例えばォォム ギ、 ペレ二アルライグラスなどにも適宜改変しながら好適に用いることができる。
以上のようにして取得したフルクタン合成酵素遺伝子 1-SST又は 6-SFTを含む DNA断片は、 ベクター中にクローニングしておくことが好都合である。 1-SST遺伝 子又は 6- SFT遺伝子を含む DNA断片は、 植物用過剰発現プロモーターの下流に連結 した状態で組換え発現ベクターに組み込んでもよい。 その場合、 例えば、 1-SST 遺伝子又は 6- SFT遺伝子を含む DNA断片を適当な制限酵素で切断してから、 それを ベクター中の過剰発現プロモーター下流の適当な制限酵素部位にイン · フレーム となるように挿入して連結すればよい。 イネに遺伝子導入するために、 ァグロバ クテリゥム法を用いる場合には、 ァグロパクテリゥム由来のプラスミ ドベクター (例えば PBI101や ρΒΠ21) 若しくはそれをベースとする発現ベクター (例えば PMLH7133) 、 又はバイナリーベクター (pPZP2H-lac) などのァグロパクテリゥム 法に適したベクターに、 フルクタン合成酵素遺伝子 1-SST又は 6- SFTを組み込むこ とが好ましい。 例えば、 ァグロパクテリゥム法で遺伝子導入を行うのに好適なベ クタ一を作製するために、 pMLH7133 (Mitsuhara et al. , 1996) 中の CaMV 35Sプ 口モーターの制御下にある GUS遺伝子を本発明の 1-SST遺伝子又は 6 - SFT遺伝子で 置換することにより、 1-SST又は 6- SFT遺伝子を過剰発現 (高発現) プロモーター である CaMV 35Sプロモーターの制御下に置いてもよい。 作製される組換え発現べ クタ一には、 さらに、 ェンハンサーなどのシスエレメント、 スプライシングシグ ナル、 ポリ A付加シグナル、 選択マーカー、 リボソーム結合配列 (SD配列) など が含まれていてもよい。 なお、 選択マーカーとしては、 例えばアンピシリン耐性 遺伝子、 ネオマイシン耐性遺伝子、 ハイグロマイシン耐性遺伝子等が挙げられる。 なお、 得られたフルクタン合成酵素遺伝子 1 - SST又は 6 - SFTを含む DNA断片につ いては、 塩基配列決定によりその配列を確認することが好ましい。 塩基配列決定 はマキサム-ギルバートの化学修飾法、 ジデォキシヌクレオチド鎖終結法等の公 知手法により行うことができるが、 通常は自動塩基配列決定装置 (例えば Applied Biosystems社製 DNAシークェンサ一 PRISM377XL) を用いて行えばよい。 さらに、 得られた 1 - SST遺伝子又は 6- SFT遺伝子を含む DNA断片について、 上述の 酵母の形質転換法などを用いて、 その遺伝子にコードされたタンパク質のフルク タン合成活性を確認することも好ましい。
本発明において用いる mRNAの調製、 cDNAの作製 (RT-PCR) 、 PCR、 ライブラリ
一の作製、 ベクタ一中へのライゲ一ション、 細胞の形質転換、 DNAの塩基配列決 定、 プライマーの合成、 突然変異誘発、 タンパク質の抽出などの分子生物学的 ' 生化学的実験法は、 通常の実験書の記載に従って行うこともできる。 そのような 実験書と しては、 例えば、 Sambrookらの Molecular Cloning, A laboratory manual, 2001, Eds., Sambrook, J. & Russell, DW. Cold Spring Harbor Laboratory Pressを挙げること力 sでき 。
3 ) イネへのフルクタン合成酵素遺伝子の導入
本発明では、 上記の通り取得したフルクタン合成酵素遺伝子 1- SST又は 6- SFTを イネ (Oryza sativa) に導入することにより、 トランスジエニックイネを作製す ることができる。
宿主植物として用いる好適なイネ (Oryza sativa) の品種としては、 「ユキヒ 力 リ ( Yukihikari ) 」 、 「 日 本晴 ( Nihonbare ) 」 、 「ほ しの ゆめ
( Hoshinoyume ) 」 、 「き ら ら 3 9 7 ( Kirara397 ) 」 、 「ゆき ま る ( Yukimaru ) J 、 「ほの力 2 2 4 ( Honoka224 ) 」 、 「 どん と こ い ( DontoKoi j 」 、 「 コ シ ヒ カ リ ( Koshihikari ) J 、 「ササ ニ シ キ ( Sasanishiki ) 」 、 「ヒ ト メ ボ レ ( Hitomebore ) 」 、 「あきたこまち Akitakomachi ) 」 、 「 は え ぬ き ( Haenuki ) 」 、 「 キ ヌ ヒ カ リ inuhikari ) J 、 「むつほ ま れ Mutsuhomare ) J 、 「 ヒ ノ ヒ カ リ C Hinohikari ) 」 、 「津軽おと め ( Tsugaruotome ) 」 、 「つがるロマン ( Tsugaruroman ) 」 「ゆめあ力 り ( Yumeakari ) 」 、 「 ノヽナェチゼン ( Hanaechizen ) 」 「夢つ し ( Yumetsukushi ) 」 、 「 ノ、 ッ シモ
(Hatsushimo) 」 、 「どまんなか (Domannaka) 」 、 「かけはし (Kakehashi) 」 、 「いわてつこ (Iwatekko) 」 、 「まなむすめ (Manamusume) 」 . 「めんこいな ( Menkoina ) 」 、 「チ ヨ ニ シキ ( Chiyonishiki ) 」 、 「ふ く み ら い (Fukumirai) 」 などが挙げられるが、 これらに限定されない。 これらのイネ品 種は、 例えば独立行政法人農業生物資源研究所ジーンパンク (日本) から入手す ることができる。
好適なさらに別のイネ品種としては、 Wagwag (フィリピン) 、 Originario (ィ
タリア) 、 Padano (イタリア) 、 Vialone Naro (イタリア) 、 Ribe (イタリア) 、 Baldo (イタリア) 、 Roma (イタリア) 、 Bomba (スペイン) 、 Makalioka (コロ ンビア) 、 IR 8 (フイ リ ピン) 、 Taipei 309 (台湾) 、 San You 63 (中国) 、 Liang You (中国) 、 Pei Kyu (中国) 、 King You 725 (中国) 、 II You 63 (中 国) 、 Nan Keng (中国) 、 He Jiang 15 (中国) 、 Ewan 3 (中国) 、 Chu Chung
(韓国) 、 Gyunggi (韓国) 、 Mi lyang 42 (韓国) 、 Milyang 30 (韓国) 、 Suweon 82 (韓国) 、 IRI 265 (韓国) 、 Tep Trang (韓国) なども挙げられる力 これらに限定されない。 これらは、 例えば独立行政法人農業生物資源研究所ジー ンノ ンク (曰本)、 IRRI (International Rice Research Institute, Philippine) 中国水稲研究所などから入手することができる。
1- SST遺伝子又は 6-SFT遺伝子をイネに導入する方法としては、 植物の形質転換 に一般的に用いられる方法、 例えばァグロバタテリゥム法、 パーティクルガン法、 エレク ト口ポレーシヨン法、 ポリエチレングリコーノレ (PEG) 法、 マイクロイン ジェクシヨン法、 プロ トプラスト融合法などを用いることができる。 これらの植 物形質転換法の詳細は、 『島本功、 岡田清孝 監修 「新版 モデル植物の実験 プロトコール 遺伝学的手法からゲノム解析まで」 (2001) 秀潤社』 などの一 般的な教科書の記載や、 Hiei Y. et al. , "Efficient transformation of rice (Oryza sativa L. ) mediated by Agrobacterium and sequence analysis of the boundaries of the T- DNA, Plant J. (1994) 6, 271-282; Hayashimoto, A. et al., " polyethylene glycol- mediated protoplast transformation system for production of fertile transgenic rice plants. " Plant Physiol. (1990) 93, 857- 863等の文献を参照すればよい。
ァグロパクテリゥム法を用いる場合は、 上述のように、 ァグロパクテリゥム法 に適したベクターにフルクタン合成酵素遺伝子 1-SST又は 6- SFTを組み込んで構築 した植物用発現ベクターを、 適当なァグロパクテリゥム、 例えばァグロバタテリ ゥム ·ツメブァシエンス(Agrobacterium tumefaciens)に導入し、 この菌株をィ ネカルスに接種して感染させることにより、 トランスジエニックイネ細胞を含む カルスを得ることができる。
パーティクルガン法、 エレク ト口ポレーシヨン法などを用いる場合には、 1 -
SST遺伝子又は 6- SFT遺伝子は、 その遺伝子全長を含む PCR増幅断片や制限酵素切 断断片などであってもよいし、 ベクター中に組み込まれたものでもよい。 遺伝子 導入に用いる試料としては、 植物体、 イネ器官、 イネ組織自体をそのまま使用し てもよく、 それらの切片を使用してもよく、 プロトプラストを調製して使用して もよレ、 (Christou P, et al. , Biotechnology 9 : 957 (1991) ) 。 このような試 料に対して、 例えばパーティクルガン法では、 遺伝子導入装置 (例えば PDS- 1000 (BIO-RAD社)等) を製造業者の説明書に従って使用して、 フルクタン合成酵 素遺伝子 1- SST又は 6-SFTをまぶした金属粒子を試料に打ち込むことにより、 その 遺伝子をィネ細胞内に導入し、 トランスジェニックイネ細胞を得ることができる。 操作条件は、 通常は 450〜2000psi程度の圧力、 4〜12cm程度の距離で行う。
1-SST遺伝子又は 6-SFT遺伝子を導入したトランスジヱニックイネ細胞は、 例え ば従来知られている植物組織培養法に従って、 そのトランスジエニック細胞又は 該細胞を含むカルスを選択培地で培養し、 生存したカルスを再分化培地 (適当な 濃度の植物ホルモン (オーキシン、 サイトカイニン、 ジベレリン、 アブシジン酸、 エチレン、 ブラシノライ ド等) を含む) で培養することにより、 1-SST遺伝子又 は 6- SFT遺伝子により形質転換されたトランスジェニックイネの植物体を再生す ることができる。
フルクタン合成酵素遺伝子 1-SST又は 6-SFTがイネ細胞中に確実に導入されたか 否かの確認は、 PCR法、 サザンハイブリダイゼーション法、 ノーザンハイブリダ ィゼーシヨン法、 ウェスタンブロット法等を利用して行うことができる。 例えば、 トランスジエニックイネの葉から全 RNAを調製し、 フルクタン合成酵素遺伝子 1-
SST又は 6- SFTに特異的プライマーを設計して PCR増幅を行う。 増幅産物について ァガロースゲル電気泳動、 ポリアクリルアミ ドゲル電気泳動又はキヤピラリー電 気泳動等を行い、 臭化工チジゥム、 SYBR Green液等により染色し、 そして増幅産 物を 1本のパンドとして検出することにより、 1 - SST遺伝子又は 6-SFT遺伝子の導 入を確認することができる。 また、 予め蛍光色素等により標識した 1-SST遺伝子 又は 6- SFT遺伝子特異的プライマーを用いて PCRを行い、 PCR増幅産物を検出する こともできる。 さらに、 マイクロプレート等の固相に PCR増幅産物を結合させ、 蛍光又は酵素反応等により増幅産物を確認する方法も採用することができる。
作製したトランスジエニックイネについて、 導入した 1- SST遺伝子又は 6 SFT遺 伝子が通常条件下 (例えば気温 2 5 °C) で発現されていることを確認することも 好ましい。 例えば、 通常条件下で播種後 1 0日間生育させたトランスジエニック イネについて、 その組織を切り取り、 その試料から常法によって抽出した mRNAに ついて、 1-SST遺伝子又は 6-SFT遺伝子に対する特異的プローブを用いたノーザン ブロッテイング解析を行い、 その遺伝子からの発現を確認すればよい。 1- SST遺 伝子又は 6-SFT遺伝子に対する特異的プローブの設計は、 導入する 1 - SST遺伝子又 は 6- SFT遺伝子の塩基配列に基づいて、 常法によって行うことができる。 あるい はまた、 通常条件下で播種後 1 0〜1 4日間生育させたトランスジェニックイネ について、 その組織を切り取り、 その試料から常法によって抽出した可溶性糖類 について、 HPLC法により Shodex KS802及び KS803カラムを連結したものを用いて 分析するか、 前述の HPAEC法により分析することによりイネ組織内でフルクタン 蓄積が生じていることを確認することもできる。
以上のようにして作製される本発明のフルクタン合成酵素遺伝子 1-SST遺伝子 又は 6- SFT遺伝子が導入されたトランスジヱニックイネは、 イネ細胞内でフルク タンを (好ましくは恒常的に) 生産し、 高度な耐冷性を発揮する。
本発明は、 上述のような強化された耐冷性を有するトランスジヱニックイネの 作製方法、 及び 1-SST遺伝子又は 6-SFT遺伝子を導入することを特徴とするイネの 耐冷性の強化方法にも関する。
なおイネ以外の植物でも、 生育初期や花粉形成期 (イネの穂ばらみ期に相当) の冷温は一般に植物の生育及び子実生産に甚大な被害を引き起こすことが知られ ている (非特許文献 6 ) 。 従って本発明の方法は、 イネ以外の植物、 例えばトウ モロコシ (Zea mays) 、 コムャ (Triticum aestivum L. 、 ォォム = (Hordeum vulgare L. ) 、 ライムギ (Secale cereale) などの他のイネ科植物、 さらにナス 科、 マメ科、 ゥリ科などの耐冷性を有することが期待される任意の植物にも適用 可能であり、 イネと同様に耐冷性が強化された植物を作製できると考えられる。
2 . フルクタン合成酵素遺伝子 1- SST又は 6-SFTを導入したトランスジエニックィ ネの耐冷性
本発明のフルクタン合成酵素遺伝子 1 - SST又は 6-SFTを含むトランスジヱニック イネは、 1-SST遺伝子又は 6- SFT遺伝子が導入されていない原品種 (又は野生型) のイネと比較して、 強化された耐冷性を有する。
イネは夏作物であり、 日本の一期作の場合、 通常は 4月〜 5月頃に種まき (播 種) を行い、 晩夏〜秋に収穫する。 発芽後のイネは、 幼苗期、 分げつ期、 幼穂形 成期、 穂ばらみ期 (花粉形成期) 、 出穂期、 開花期、 登熟期などの各生育時期を 経て結実する。 元来は熱帯性作物であるイネは、 生育中に冷温に遭遇することに より様々な障害を生じ、 収穫量が大幅に減少する (冷害の発生) 。 例えば、 幼苗 期の場合 1 2 °C以下、 穂ばらみ期の場合 1 9 °C以下、 登熟期の場合 1 5 °C以下の 気温条件に遭遇すると、 冷害が発生する可能性が高い。 冷温によって引き起こさ れる具体的な障害は、 イネが冷温に曝露される生育時期によって様々である。 例 えば、 幼苗期 (生育初期) から登熟期までの各期における冷温は生育遅延を引き 起こし、 結果として秋冷により登熟不良のままとなるだけでなく、 いもち病等の 病害発生率も上昇させる。 一方、 穂ばらみ期から開花期にかけての冷温は、 不受 精を引き起こして稔実率を低下させ、 不稔籾や落花を多く生じさせる。 幼苗期、 穂ばらみ期及ぴ開花期の冷温は、 とりわけ深刻な冷害を引き起こしゃすい。 本発明のトランスジエニックイネにおいては、 上記のような各生育時期での冷 温に対する耐性が強化されるが、 とりわけ、 幼苗期耐冷性及び/又は穂ばらみ期 耐冷性の強化が認められる。 幼苗期耐冷性とは、 発芽後の生育初期に当たる幼苗 期に受ける冷温に対する耐性であり、 穂ばらみ期耐冷性とは、 花粉などの生殖細 胞の減数分裂及びそれに続く成熟が起こる時期に当たる穂ばらみ期に受ける冷温 に対する耐性である。 このため、 好ましい実施形態では、 本発明のトランスジヱ ニックィネは幼苗期又は穂ばらみ期の冷温による障害を大きく軽減することがで きる。
本発明において 「耐冷性」 とは、 冷温障害を軽減する能力、 すなわち、 イネが 任意の生育時期に冷温に曝露された場合に、 受ける障害を少なくするか又はその 障害を受けないで生育できるイネの能力を言う。 本発明において 「冷温」 とは、 プラス温度域の低温、 より具体的には日平均気温が 0 °Cを超え 2 0 °C未満 (本明 細書では便宜的に 0 °C〜2 0 °Cとも表記する) となる気温条件を意味するものと
する。 本発明のトランスジヱニックイネの使用によって軽減されうる 「冷温障 害」 は、 冷温に曝露されたイネに生じうるいかなる障害であってもよい。 このよ うな 「冷温障害」 としては、 例えば、 生育遅延、 生育不良、 立枯れ、 分げつ期の 茎数の減少、 幼穂形成遅延、 穎花数減少、 出穂遅延、 開花遅延、 不受精、 開花不 能、 及び登熟不良などの他、 それらの結果として引き起こされる生存率の低下、 稔実率の低下、 収穫量の減少などがあるが、 これらに限定されるものではない。 イネの冷温障害に関する詳細については、 Science of the rice plant physiology Vol. 2 Physiology, pp769- 812, ISBN 4-540- 94051- 1を参照できる。 本発明のトランスジエニックイネにおける耐冷性の強化は、 冷温障害の程度が、 原品種 (又は野生型) のイネと比べて軽減されることによって、 確認することが できる。
本発明は、 本発明のトランスジエニックイネの冷温条件下での栽培における使 用に関する。 本発明はまた、 イネ栽培における冷温障害、 特にイネの幼苗期及び /又は穂ばらみ期に発生する冷温障害を軽減するための本発明のトランスジェ- ックイネの使用にも関する。
以下では、 本発明のトランスジエニックイネの優れた幼苗期耐冷性及び穂ばら み期耐冷性について、 さらに詳細に説明する。
幼苗期耐冷性
イネの幼苗期は、 発芽後から第 4葉期頃までの生育時期である。 栽培方法やそ の年の天候などによって違いはあるが、 日本の一期作ではだいたい 5月中旬〜 6 月初旬に当たる。 幼苗期の冷温による障害としては、 例えば、 枯死とその結果と しての生存率の低下、 生育不良、 生育遅延、 立枯病の発生などが挙げられる。 特 にイネの直播栽培では、 幼苗期のイネの生育の良否がその後の生育に大きな影響 を及ぼすことが知られている。 '
限定するものではないが、 本発明における 「幼苗期耐冷性」 は、 幼苗期におい て日平均気温が好ましくは 0 °Cを超え 1 2 °C以下 (0 °C〜1 2 °C) 、 より好まし くは 0 °Cを超え 5 °C以下 (0 °C〜5 °C) となる冷温に曝露されたイネの生存率に よって、 評価することができる。 この幼苗期耐冷性は、 標準的な耐冷性試験によ つて評価することができるが、 特に以下のような手順で評価することが好ましい。
まず、 イネ種籾を播種し発芽させてから 2 5 °C/ 1 9 °C (昼/夜) [昼 (1 5 時間) を 2 5 °Cとし、 夜 (9時間) を 1 9 °Cとするサイクル] の気温条件下で生 育させ、 続いて播種後 1 0日目の幼苗 (葉齢 2 . 5〜3 . 5、 草丈 1 0 c m前後) を 5 °C (昼夜) の気温条件下に置いて 1 4日間処理し、 さらにそのイネを上記の 2 5 °C/ 1 9 °Cの気温条件下に戻して生育させ、 冷温処理の 7日後の生存率を調 ベる。 これらの気温等の条件以外については、 イネの栽培実験法における通常条 件とする。 生存率は、 冷温処理後の 7日間に新葉展開 (生育再開) した個体を生 存と判断し、 新葉を展開しない、 つまり生育を再開しない個体を枯死と判断して、 生存率 (%) =新葉展開個体数 ÷全供試個体数 X 100として算出する。
幼苗期に冷温処理を施したトランスジエニックイネの上記生存率が、 原品種の イネと比較して高い場合、 そのトランスジエニックイネにおいては幼苗期耐冷性 が強化されたものと判断できる。 本発明のトランスジエニックイネにおいては、 上記に従って算出される生存率が、 原品種のイネと比較して有意に高いことが好 ましい。 本発明のトランスジエニックイネの生存率は、 好ましくは 3 0 %〜 1 0 0 %、 より好ましくは 5 0 %〜 1 0 0 %である。
穂ばらみ期 (花粉形成期) 耐冷性
イネの穂ばらみ期は、 出穂より 1 6日から 1 0日程前の、 花粉の形成及び発達 が起こる時期である。 栽培方法やその年の天候などによって違いはあるが、 日本 の一期作ではだいたい 7月中旬〜 8月初旬に当たる。 穂ばらみ期の冷温による障 害としては、 例えば、 不受精及びそれによる不稔 (稔実率の低下) 、 出穂遅延、 葉鞘褐変病の発生などが挙げられる。 イネにおいて穂ばらみ期はその後の種子形 成に大きな影響を与える時期であり、 この時期の冷温は、 花粉形成を抑制するこ とにより種子形成数を大きく減少させる。
限定するものではないが、 本発明における 「穂ばらみ期耐冷性」 は、 穂ばらみ 期において日平均気温が 0 °Cを超えて 2 0 °C未満、 好ましくは 1 2 °C以上 1 8 °C 以下となる冷温に曝露されたイネの稔実率によって、 評価することができる。 こ の穂ばらみ期耐冷性は、 標準的な耐冷性試験によつて評価することができるが、 特に以下のような手順で評価することが好ましい。
まず、 イネ種籾を播種し発芽させた後、 2 6 °C/ 2 0 °C (昼/夜) [昼 (1 5
時間) を 2 6 °Cとし、 夜 (9時間) を 2 0 °Cとするサイクル] で生育させ、 出穂 期の 1 6日前〜 1 0日前までの生長段階にあるイネ (ユキヒカリの場合、 葉齢 1 0〜1 1、 葉耳間長マイナス 4〜0 c m) を 4日間にわたり 1 2 °C (昼夜) の気 温条件下に置いて生育させて、 その後再び上記の 2 6 °CZ 2 0 °C (昼 Z夜) の気 温条件に戻して生育させ、 出穂 ·開花させて種子を形成させた後、 稔実率を算出 する。 これらの気温等の条件以外については、 イネの栽培実験法における通常条 件とする。 稔実率は、 穂全体の籾の 9 0 %以上が黄化した穂から採取される全部 の籾について、 全轫数 (籾の総数) と、 稔実籾数 (種子 (米) が含まれている籾 の数) を計数して、 稔実率 (%) =稔実籾数 ÷全籾数 X 100として算出する。 上記のように穂ばらみ期に冷温処理を施した本発明のトランスジエニックイネ の上記稔実率、 特に出穂 1 6日前の穂ばらみ期イネに冷温処理を施した場合の稳 実率が、 系統全体として、 原品種のイネと比較して高い場合、 そのトランスジェ ニックイネの穂ばらみ期耐冷性が強化されたものと判断できる。 本発明のトラン スジエニックイネにおいては、 上記に従って算出される稔実率の系統毎の平均値 が、 原品種のイネと比較して有意に高いことが好ましい。 本発明のトランスジェ ニックイネの上記稔実率は、 例えば出穂 1 6日前に冷温処理を施した場合、 好ま しくは 4 0 %〜: L 0 0 %、 より好ましくは 5 0 %〜 8 0 %である。 実施例
以下、 実施例及ぴ図面を参照して本発明を説明するが、 本発明はこれらの実施 例に限定されるものではない。
参考例 1 : フルクタン合成酵素遺伝子の単離
本参考例におけるフルクタン合成酵素遺伝子 1- SST及び 6-SFTの取得は、 非特許 文献 3の記載に従って行った。
1 ) 秋播コムギ系統 PI 173438からの cDNA及び cDNA ライプラリーの調製
9月下旬にバットに播種し、 自然条件下で 1 1月 2 2日まで生育させたコムギ
(Triticum aestivum L. ) 系統 ΡΠ73438のクラウン部分より mRNAを常法により抽 出した。 得られた mRNA 5 / gを用いて cDNA合成キット (STRATAGENE社製) を利用 して cDNAを合成した。 さらに、 合成された cDNAを; L ZAP Expression vector
(STRATAGENE社製)に組み込み、 cDNAライブラリ一を作製した。
2 ) cDNA ライブラリーからの 1-SST遺伝子部分断片及ぴ 6-SFT遺伝子部分断片 の単離
上記の通り合成された cDNAを铸型とし、 以下のフォヮ一ドプライマー及ぴリバ ースプライマーを用いて PCRを行った。
• フォワードプライマー: 5, A-T-G-A-A-T/C-G-A-T/C-C-C-N-A-A-T/C-G-G 3' (配列番号 9 )
' リバースプライマ— : 5' C - C - N-G- T - N- G- C - A/G- T- T - A/G - T- T- A/G-A - A 3' (配列番号 1 0 )
これらのフォヮ一ドプライマ一及びリバースプライマーは、 既知のフルクタン 合成酵素遺伝子の塩基配列 (Genbankァクセッション番号 X83233, AJ006066, Y07838, AF492836, AJ567377, AJ009756, Y09662等) の間で高度に保存された領 域に基づいて設計したものである。 PCRは 5 0 μ ΐの反応系で行った。 EX Taq DNA ポリメラ—ゼ (TAKARA BIO INC. ; 5 units/ μ 1) を 1 μ 1、 1 0 Xポリメラーゼ バッファー (MgCl2を含む) を 5 μ 1、 dNTP液 ( 1 0 mM) 5 μ 1、 上記の各プライ マー (1 2 /ι Μ) を 2 1、 及ぴ上記で合成した cDNA約 1 O ngを混合し、 さらに反 応液全量を蒸留水で 5 0 μ ΐとした。 用いた PCRの反応条件及び反応回数は、 以下 の表 2に示す。
表 2
PCR反応後、 電気泳動により PCR産物の確認を行ったところ、 予測された長さの 核酸断片 (1 5 0 0塩基前後) が増幅されていた。 得られた PCR断片を常法によ
りクローユングし、 複数の陽性クローンを得た。 それら陽性クローンに含まれる
DNA挿入断片 tこ つ レヽて、 DYEnamic ET Terminal Cycle Sequenceing Kit (Amersham Biosciences社製)を用レヽて、 Applied Biosystems社製 DNAシーケンサ 一(PRISM 377XL)により塩基配列を決定し、 さらに上述した既知のフルクタン合 成酵素遺伝子との比較解析を行った。 その結果、 既知のフルクタン合成酵素遺伝 子と 5 0 %以上の塩基配列相同性を有する DNA挿入断片が複数個示された。 これ らの DNA断片は、 コムギのフルクタン合成酵素遺伝子の部分断片と推定された。
3 ) フルクタン合成酵素遺伝子の全長を含む cDNAの単離及ぴその塩基配列の 決定
上記 1 ) で得られた cDNAライブラリーについて、 上記のフルクタン合成酵素遺 伝子の部分断片をアイソト一プで標識したプローブを利用して、 常法によりハイ プリダイゼーションアツセィを行った。 得られた陽性クローンに含まれる DNA挿 入断片について、 DYEnamic ET Terminal Cycle Sequenceing Kit (Amersham Biosciences社製)を用いて、 Applied Biosystems社製 DNAシーケンサー(PRISM 377XL)により、 塩基配列を決定した。 決定された塩基配列の解析から、 1 9 8 9 塩基からなり、 6 6 2アミノ酸からなるアミノ酸配列をコードし、 かつペレユア ルライグラス 1 - SST遺伝子(Genbankァクセッション番号 AJ297369)と 72% (ァミノ 酸配列ベース) の相同性を有する塩基配列 (配列番号 1 ) を含む DNA断片が揷入 されたクローンが見出された。 同様に、 1 8 5 1塩基からなり、 6 1 6アミノ酸 からなるアミノ酸配列をコードし、 かつォォムギの 6- SFT遺伝子(Genbankァクセ ッション番号 X83233)と 9 3 % (アミノ酸配列ベース) の相同性を有する塩基配 列 (配列番号 3 ) を含む DNA断片が揷入されたクローンが見出された。 このこと から、 これらの DNA揷入断片は、 それぞれ異なるコムギ · フルクタン合成酵素遺 伝子を含む cDNAと考えられた。
4 ) 単離したコムギフルクタン合成酵素遺伝子にコードされるタンパク質の 機能解析
上記 3 ) で得られた 2種類のコムギ ' フルクタン合成酵素遺伝子全長をそれぞ
れ含む陽性クローンから、 各オープンリーディングフレーム (配列番号 1又は 3 の塩基配列) を含む DNA断片を調製し、 それを発現ベクター pPICZ a B (Invitrogen社製、 EasySelect Pichia Express ion Kit) にクロー-ングし、 '吊' 法に従いエレク トロポレーション法により酵母 (ピキア ·パストリス [Pichia pastori s] ) にベクターを組み込んだ。 ここで利用した発現ベクター pPICZ α Bは、 酵母用液体培地中のメタノールに特異的に反応して当該べクタ一にクローユング した遺伝子の発現を誘導する A0X1プロモーター配列、 及ぴ酵母内で発現した組み 換えタンパクを酵母外つまり培地中に分泌する為に必要となる αファクターと呼 ばれる分泌因子の配列を含む。
上記の各 DNA断片を組み込んだ発現ベクター pPICZ α Βで形質転換された酵母を、 メタノールを炭素源とした液体培地中で 4日間培養してから、 その培養液を分離 し限外濾過型フィルタ一により約 2 0倍に濃縮した。 その濃縮液を粗酵素液とし て、 基質となるスクロース又は 1—ケストースと混ぜ、 4 °Cで 8時間反応させた。 そして HPAEC法によって反応生成物を分析することにより、 培養液に含まれる組 み換えタンパク質の酵素活性について解析した。 その結果、 配列番号 1の塩基配 列を含む DNA断片を組み込んだ発現ベクターを導入した酵母の培養液では、 スク ロースを唯一の基質として与えた場合、 1—ケス トース (スクロースに 2,丄—結 合でフルク トースが 1つ転移された 3糖) の合成活性が検出されたが、 一方、 1 ーケストースを唯一の基質として反応させた場合には、 4糖である 1, 1-ニストー スの合成活性が 3糖合成活性に比べ著しく低いレベルで検出された。 従ってこの
DNA断片は、 スクロース : スクロース 1—フルク トシルトランスフェラーゼ活性 を持つ酵素をコードすることが示されたことから、 すなわちその DNA断片に含ま れる遺伝子がコムギ 1- SST遺伝子であることが明らかになった。
また配列番号 3の塩基配列を含む DNA断片を組み込んだ発現ベクターを導入し た酵母の培養液では、 スクロースを唯一の基質として与えた場合、 1ーケス ト一 スを合成する活性、 6—ケストース (スクロースに j8 2, 6-結合でフルクトースが
1つ転移された 3糖) 及び 4糖以上のフルクタンの合成活性が検出されたが、 一 方、 1—ケストースを唯一の基質として反応させた場合には、 4糖以上のフルク タン合成活性がほとんど検出されなかった。 したがつてこの DNA断片は、 スクロ
ース : フルクタン 6—フルク トシルトランスフェラーゼ活性を持つ酵素をコー ドすることが示されたことから、 すなわちその DNA断片に含まれる遺伝子がコム ギ 6- SFT遺伝子であることが明らかになった。
以上のようにして、 コムギ 1- SST遺伝子 (配列番号 1 ) 及ぴ 6- SFT遺伝子 (配列 番号 3 ) の単離が確認された。 実施例 1 : フルクタン合成酵素遺伝子 1-SST及ぴ 6 - SFTの導入によるイネの形質 転換及びィネ植物体の再生
以下のようにして、 参考例 1で単離されたフルクタン合成酵素遺伝子 1- SST及 ぴ 6-SFTを、 Ti系ベクターである pMLH7133 ( Mitsuhara I. et al. , (1996) Eff icient promoter cassettes for enhanced expression of foreign genes in dicotyledonous and monocotyledonous plant. Plant し eil Physiol. 37 : 49一 59) 中の CaMV 35Sプロモーターの下流に、 センス鎖方向で導入した。
まず、 完全長フルクタン合成酵素遺伝子 1- SST cDNAを、 参考例 1で得られた 1 -
SST cDNA 含 有 ク ロ ー ン を 錶 型 と し 、 プ ラ イ マ ー 5,- tt gatccattatggattcgtctcgcgtc -3' (下線部は BamHI部位;配列番号 1 1 ) 及び プフィマーり 一 aagagctcctaatcgacgactaccaagtc —3 、 ή"線咅! ^ま Sacl¾位;酉己歹 (J 番号 1 2 ) を用いた PCR増幅により調製した。 また完全長フルクタン合成酵素遺 伝子 6 - SFT cDNAを、 参考例 1で得られた 6 - SFT cDNA含有クローンを铸型とし、 プ ライマー 5 - ctggatccaagatggggtcacacggcaag —3 ( fefP feBamHlf |5ΐΐί.: 歹 U番 号 1 3 ) 及びプライマー 5' - ccgagctctcattgaacatacgagtgatc - 3, (下線部は
Sacl部位;配列番号 1 4 ) を用いた PCR増幅により得た。 これらの増幅断片をそ れぞれ BamHI及び Saclで処理し、 BamHI-SacI断片を調製した。 調製した 1- SST遺伝 子含有 BamHI- Sacl断片又は 6- SFT遺伝子含有 BamHI- Sacl断片を、 BamHI及び Saclを 用いて切断した PMLH7133ベクターに、 センス鎖方向でライゲーシヨンした。 得ら れた核酸構築物を、 既報のプロ トコール (Hiei Y. , Ohta S. , Komari Τ., kumashiro T. (1994) Efficient transformation of rice (Oryza sativa L. ) mediated by Agrobacterium and sequence analysis of the boundaries of the
T - DNA. Plant J. 6 : 271 - 282) に従って、 ァグロパクテリゥム法により、 イネ
(Oryza sativa L. cv, Yukihikari ; 「ユキヒカリ」 ) のカルスに導入した。 形 質転換力ルスを選抜するため、 遺伝子導入したカルスを MSRE培地に移植してハイ グロマイシン耐性について選択した。 選抜されたカルスはさらに再分化培地
(N6SE) に移植し、 明所で再分化させた。 次に、 再分化個体を検定培地 (MSHF) に置床し、 ハイグロマイシン耐性について検定した。 同培地上で発根し、 正常に 生育した個体を馴化させ、 ポットに移植することにより、 イネ植物体へと再生さ せた。 再生された植物体 (T。世代) については、 自家受粉によって次世代までの 交配を行った。 以上の実験に使用した培地の組成は以下の通りである。 表 3: MSRE培地 (pH5. 8)
MS無機塩
MSビタミン
30g/l ショ糖
30g/l ソノレビト一ル
2mg/l カザミノ酸
lmg/1 NAA
2mg/l BAP
250mg/l 力ノレべ二シリン
50mg/l ノヽィグロマイシン
4g/l ゲルライ ト 表 4: N6SE培地 (pH5. 8)
N6無機塩
N6ビタミン
30g/l ショ糖
2mg/l 2, 4-D
2g/l ゲルライ ト
500mg/l 力ノレべニシリン
50mg/l ハイグロマイシン
表 5: MSHF培地 (pH5. 8)
MS無機塩
MSビタミン
30g/l ショ糖
50mg/l ノ、ィグロマイシン
8g ¾^ 次いで、 得られた T。世代、 T\世代及び T2世代の植物体からシュートを切り取り、 常法によりそのシュートからゲノム DNAを抽出し、 それを铸型として、 ベクター PMLH7333のプロモーター領域に含まれるダイズファゼオリン遺伝子の第 1イント ロン配歹 IJに特異的なプライマー (5,- ggtaagtaattgctactggtatcacttg - 3' ;配列 番 号 1 5 ) 、 及 ぴ 1- SST cDNA に 特 異 的 な プ ラ イ マ ー ( 5' - ggagcccgacggggtgtactg -3' ;配列番号 1 6 ) 又は 6- SFT cDNAに特異的なプライ マー (5,- ctcaacggcggaggcgtt -3' ;配列番号 1 7 ) を用いて PCRスクリーニン グを行い、 ホモ接合系統を選抜した。 これにより、 フルクタン合成酵素遺伝子 1 - SSTをホモ接合で有するイネ系統として、 116- 2-1系統、 122-1- 1系統、 124- 6-1系 統、 129- 5-1系統、 131- 10- 1系統が得られた。 またフルクタン合成酵素遺伝子 6- SFTをホモ接合で有するイネ系統として、 S33- 5- 2系統、 S50-5- 1系統、 S51- 2- 1系 統が得られた。 実施例 2 : フルクタン合成酵素遺伝子を導入したトランスジヱニックイネの発現 解析
実施例 1で得られた、 フルクタン合成酵素遺伝子がホモ接合性のトランスジェ ニック系統イネ (T2世代;原品種は 「ユキヒカリ」 ) について、 以下の通り、 CaMV 35Sプロモーターの制御下でフルクタン合成酵素遺伝子を過剰発現させた際 の組織内フルクタン蓄積量及びフルクタン合成酵素遺伝子発現の解析を行った。
1 ) フルクタン蓄積量及び蓄積フルクタンの解析
実施例 1で得られたすべての系統のフルクタン合成酵素遺伝子 1-SST導入イネ
植物体、 及ぴフルクタン合成酵素遺伝子 6-SFT導入イネ植物体、 並びにコント口 ールとしてフルクタン合成酵素遺伝子遺伝子を導入していないイネ植物体 (原品 種の 「ユキヒカリ」 ) から得られた葉組織 1 gを細かく裁断し、 1 0 m lの熱水 (内部標準として lmg/mlのプロピレングリコールを含む) 中で 1時間煮沸し、 抽 出液を 0. 45 μ ηιのフィルターで濾過した。 濾過液の各種糖含量は RI検出を用いた HPLCで測定した。 カラムは Shodex KS802と KS803 (いずれも Showa Denko ΚΚ·, Tokyo, Japan) を連結したものを用い、 カラム温度 50°C、 移動相を水として 0. 8ml/minで分離し、 フルク トース含量、 グルコース含量、 スクロース含量、 フ ルクタン含量に分け測定した。 この測定により、 フルクタン合成酵素遺伝子を導 入していないイネでは、 フルクタンが検出されなかったが、 一方、 フルクタン合 成酵素遺伝子導入イネでは、 1- SST導入系統と 6 - SFT導入系統の両方でフルクタン の蓄積が検出された。
蓄積されたフルクタンの構造は、 DI0NEX社の DX500を用いた HPAEC ( High Performance Anion - Exchange Chromatography) 法による測疋 禾 lj用し へた。 この測定では、 カラムは Carbopac PA1 (DI0NEX社製) を使用し、 検出器は、 Pulsed Amperometric Detector ED40 (DI0NEX社製) を用いた。 カラム温度は室 温とし、 150mM水酸化ナトリゥムを溶離液とした。 上記濾過液中の成分を酢酸ナ トリウムの濃度勾配(25mM〜500mM、 40分)を用いて溶出し、 その流速は lml/minと した。
フルクタン合成酵素遺伝子 1-SST導入ィネ由来の試料についてこの測定で得ら れた溶出プロファイルを、 コントロールである原品種ユキヒカリ由来の試料、 及 びキクイモ塊茎由来の試料を用いて同じ測定により得られた溶出プロファイルと 比較した。 この結果を図 1に示す。
キクイモは、 スクロースに jS 2, 1 -結合でフルクトースが重合したフルクタンを 塊茎に蓄積することが知られている (Shiomi, N., New Phytologist (1993) vol. 123, p263-270) 。 図 1の溶出プロファイル(A)には、 キクイモ塊茎に蓄積さ れた重合度の異なるフルクタンを表す複数のピークが示されている。 そして 1 -
SST遺伝子導入イネ由来の試料では、 それらのピークと対応するように、 1ーケ ス トース (スクロースを構成するフルク トースに他のフルク トースが j3 2, 1-結合
で転移した 3糖フルクタン) 、 及び、 1—ケストースにさらなるフルクトースが β 2, 1-結合で転移した重合度 4〜 7のフルクタンが蓄積していることが示された (図 1 (B) ) 。 一方、 コントロールである原品種ユキヒカリのイネについては、 スクロースのピークは検出されたが、 各重合度のフルクタンに対応するピークは 検出されなかった。 従って 1-SST遺伝子導入イネでは、 2, 1 -結合フルク トース を含有するフルクタンを生成できる 1 - SST酵素が蓄積されることが確認できた。 さらに、 1-SST遺伝子導入イネ、 6 - SFT遺伝子導入イネ、 及びコントロールであ る原品種ユキヒカリ由来の試料について上記測定でそれぞれ得られた溶出プロフ アイルを比較した。 この結果を図 2に示す。 図 2に示される通り、 6-SFT遺伝子 導入ィネ由来の試料では、 1- SST遺伝子導入ィネとは異なる可溶性糖類のピーク が検出された。 このことから、 6 - SFT遺伝子導入イネでは、 1 - SST遺伝子導入イネ とは異なる糖類が蓄積していることが示された。
続いて、 6- SFT遺伝子導入イネ由来の試料の溶出プロファイルを、 6- SFT遺伝子 の単離源である秋播コムギ (開花後 1 0日目) の茎から上記と同様にして抽出し た試料について同じ測定によって得られた溶出プロファイルと比較した。 この結 果を図 3に示す。 なお秋播コムギが生成するフルクタンは、 /3 2,6-結合フルク ト ースを有するフルクタンを多く含むことが知られている。 図 3の上段の溶出プロ ファイルには、 秋播コムギの茎に蓄積される i3 2, 6-結合を有する各種重合度のフ ルクタンを表す複数のピークが示されている。 6- SFT遺伝子導入イネ由来の試料 では、 それらのピークと対応するように、 スクロースを構成するフルクトースに 他のフルクトースが /3 2,6-結合で転移したフルクタン (図 3 (C)の 6 K:、 丄、 3_, 5_ 1) 、 及び 1ーケストース (3糖; 図 3 (C)の 1 K) を構成するフルク トー スのうちグルコースに結合したフルク トースに j8 2, 6 -結合で他のフルク トースが 転移したフルクタン (図 3 (C)の B、 2、 4、 6 ) のピークが検出された。 従つ て、 6- SFT遺伝子導入イネでは、 ]3 2,6 -結合フルク トースを含有するフルクタン を生成できる 6 - SFTが蓄積されることが確認できた。
2 ) ノーザンプロット解析
実施例 1で得られた 1-SST遺伝子導入イネ植物体、 及び 6-SFT遺伝子導入イネ植
物体における 1-SST遺伝子及び 6- SFT遺伝子の発現について、 以下のようにノーザ ンブロット解析を行った。
まず、 本解析で 1- SST mRNAを検出するためのプローブは、 参考例 1で得られた 完全長 1 - SST cDNAを含むベク ターを錶型と して、 プライマー 5,_ gccaacgcgttcccgtggagc - 3, 、 目 id グ U 番 号 1 8 ) 及 び 5 _ atcgacgactaccaagtcatcatctgtgt -3, (配列番号 1 9 ) と EX Taqポジメラーゼ (TAKARA BIO IN )を用いた PCR増幅によって作製した。 また 6- SFT mRNAを検出す るためのプローブは、 参考例 1で得られた完全長 6-SFT cDNAを含むベクターを鎌 型として、 プライマー 5,- gcgggcgggttcccgtggagcaa _3, (配列番号 2 0 ) 及び 5' - ttgaacatacgagtgatcgtccatattggag -3' (配歹リ番号 2 1 ) と EX Taqポジメラ ーゼ (TAKARA BIO IN )を用いた PCR増幅によって作製した。 これらの増幅断片 は、 ゲル精製した後、 それぞれランダムへキサマープライミング法 (BcaBest™ Labeling Kit ; TAKARA BIO INC. ) を用いて32 P- dCTP標識したものを、 プローブ として用いた。
1-SST遣伝子導入ィネ (116-2- 1系統、 122- 1-1系統、 124- 6-1系統、 129- 5-1系 統、 131- 10- 1系統) 、 6- SFT遺伝子導入イネ (S33-5- 2系統、 S50-5- 1系統、 S51 - 2-1系統) 、 及びコントロールである原品種ユキヒカリから、 播種後人工気象下 2 5 °C/ 1 9 °Cく昼/夜 >で生育させて 1 0日目の幼植物体の地上部から常法によ り RNAを抽出した。
調製した全 RNAは、 1. 2%ァガロースゲルで電気泳動した後、 ナイロンフィルタ 一に転写した。 このフィルターをハイブリダィゼーシヨンバッファー (50%ホル ムアミ ド、 5 X SSPE、 5 Xデンハルト液、 0. 5% SDS、 0. 2mg/mlサケ精子精製 DNA) 中で 1時間かけてプレハイブリダィゼーシヨンに供し、 次いで上記で作製したプ ローブを添加して、 42°Cで: ^時間以上ハイプリダイズさせた。 このフィルターに ついて、 2 X SSC、 0. 1% SDS中、 15分間、 室温での洗浄を 2回行い、 さらに 0. 2 X SSC、 0. 1% SDS中、 65°Cで 30分間の洗浄を 2回行った。 洗浄したフィルターを X 線フィルムに暴露し、 可視化した。
以上のノーザンプロット解析の結果を図 4に示す。 図 4に示される通り、 いず れの 1- SST遺伝子導入イネ系統でも、 1-SSTの遺伝子レベルの発現を確認すること
ができた。 同様に、 いずれの 6- SFT遺伝子導入イネ系統においても、 6- SFTの遺伝 子レベルの発現を確認することができた。 コントロールである原品種ユキヒカリ については、 1- SST遺伝子及び 6-SFT遺伝子のどちらについても発現は全く検出さ れなかった。 実施例 3 : フルクタン合成酵素遺伝子を導入したトランスジエニックイネの幼 苗期耐冷性
4系統の 1- SST遺伝子導入イネ (116- 2-1系統、 122- 1-1系統、 124- 6-1系統、 129- 5-1系統) 及び 3系統の 6- SFT遺伝子導入イネ (S33-5- 2系統、 S50- 5- 1系統、 S51-2-1系統) 及び原品種 「ユキヒカリ」 を播種し、 人工気象下で気温 2 5 °CZ 1 9 °C (昼/夜) [昼 (1 5時間) を 2 5 °Cとし、 夜 (9時間) を 1 9 °Cとする サイクル] の環境下で生育させた。
播種後 1 0日目のイネ幼苗 (各系統につき 2 0個体ずつ 2反復を実験に用い た) を気温 5 °C (昼夜) で 1 4日間低温処理し、 その後上記の気温 2 5 °〇 1 9 °C (昼/夜) の条件に戻して、 低温処理の 1 4日後の生存率を調べた。
その結果、 1- SST遺伝子導入イネ系統の生存率は、 116- 2-1系統が 53. 7%、 122- 1 - 1系統が 75. 8%、 124- 6-1系統が 52. 1%、 129- 5-1系統が 88. 1%であり、 6- SFT遺 伝子導入イネ系統の生存率は、 S33-5-2系統が 88. 4%、 S50- 5- 1系統が 41. 2%、 S51-2-1系統が 32. 3%であった (図 5 ) 。 原品種 「ユキヒカリ」 の生存率は 9. 3% であった (図 5 ) 。 このように、 1- SST遺伝子又は 6-SFT遺伝子を導入したトラン スジエニックイネは、 幼苗期に曝露される冷温に対して高い耐性を有することが 示された。 実施例 4 : フルクタン合成酵素遺伝子を導入したトランスジエニックイネの穂 ばらみ期耐冷性
1-SST遺伝子導入イネ系統 122- 1-1、 6- SFT遺伝子導入イネ系統 (S33- 5- 2、 S50-
5-1 ) 及び原品種 「ユキヒカリ」 を播種後、 人工気象下で気温 2 6 °Cノ 2 0 °C
(昼 夜) [昼 (1 5時間) を 2 6 °Cとし、 夜 (9時間) を 2 0 °Cとするサイク ル] の環境下で生育させた出穂期の 1 6日前〜 1 0日前までの生長段階まで生育
したイネを、 4日間にわたり気温 1 2 °C (昼夜) で低温処理し、 次いで再び上記 の気温 2 6 °CZ 2 0 °C (昼/夜) の環境に戻して生育させ、 出穂 ·開花させて種 子を形成させた。 本実験では、 円形 20粒播きのポットに播種して生育させた 1系 統当たり合計 100個体の成熟イネを用い、 その各穂について出穂した日を記録付 けしておいた上で、 後日、 低温処理した日が出穂日の何日前に当たるか (低温処 理時の出穂前日数) を逆算した。 そして、 各穂について上述した計算式に従って 稔実率を算出し、 さらに系統毎の平均値を算出した。 図 6には、 その結果をダラ フにまとめた。
また、 低温処理時の出穂前日数が 1 0日から 1 6日であったそれらの各穂の稔 実率から、 算術平均により系統毎の平均稔実率を算出した。 それぞれの系統の平 均稔実率は、 122- 1-1系統が 61. 0 °/。、 S33-5- 2系統が 39. 8 %、 S50- 5- 2系統が 43. 0° /。であった。 原品種 「ユキヒカリ」 の平均稔実率は 32. 5%であった。
このように、 1 - SST遺伝子又は 6- SFT遺伝子を導入したトランスジエニックイネ は、 穂ばらみ期に曝露される冷温に対して高い耐性を有することが示された。 既に詳述した通り、 イネにおいては穂ばらみ期に冷温に曝されることが稔実率 低下に最も大きく影響する。 本実施例では、 稔実率に影響を及ぼすその最も危険 な時期における冷温曝露の影響レベルを調べるために、 ィネ穂ばらみ期に相当す る出穂の 1 6日前〜 1 0日前の時期に冷温処理を行った。 図 6に示されている通 り、 1- SST遺伝子又は 6-SFT遺伝子を導入した本発明のトランスジヱニックイネは、 穂ばらみ期に冷温処理した場合でさえ、 原品種と比べて高い稔実率を示した。 す なわち本発明のトランスジエニックイネは、 最も危険な穂ばらみ期でさえ、 冷温 下での栽培が可能であることが示された。 またこのように、 穂ばらみ期の冷温処 理に基づいて算出される平均稔実率は、 本発明のトランスジエニックイネの冷温 抵抗性を検定する上で好適な指標として使用できると考えられた。 産業上の利用可能性
本発明のフルクタン合成酵素遺伝子を導入したトランスジエニックイネは、 そ の栽培期間において冷温となりやすい地域でも冷温障害が軽減されるようなイネ の栽培法を可能にするために用いることができる。 また本発明のイネの耐冷性強
化法は、 既存のイネについて冷温条件下での高収量の栽培を可能にする目的で、 そのイネに高度な耐冷性を付与するために用いることができる。 本明細書で引用した全ての刊行物、 特許および特許出願をそのまま参考として 本明細書にとり入れるものとする。 配列表フリーテキスト
配列番号 5〜 2 1の配列は、 プライマーである。