CN114423862A - 寡糖的产生 - Google Patents

Abstract

本公开涉及用于使用蔗糖:蔗糖1‑果糖基转移酶(1‑SST)、果聚糖:果聚糖1‑果糖基转移酶(1‑FFT)和/或蔗糖:果聚糖‑6‑果糖基转移酶(6‑SFT)产生果聚糖的方法和组合物。

Description

寡糖的产生

相关申请的交叉引用

本申请要求于2019年9月24日提交的标题为“寡糖的产生”的美国临时申请序列号62/905,246(其的公开内容通过引用被整体并入本文)的在35U.S.C§119(e)下的权益。

对经由EFS-WEB作为文本文件提交的序列表的引用

本申请含有已经经由EFS-Web以ASCII格式提交的序列表，并且特此通过引用整体并入。创建于2020年9月23日的所述ASCII副本名称为G091970034WO00-SEQ-FL，并且大小为276千字节。

发明领域

本公开涉及对于蔗糖至果聚糖的转化有用的酶、核酸和细胞。

背景

聚果聚糖是包括果糖单体的寡糖。这些寡糖通常还包括葡萄糖。聚果聚糖具有多种用途(包含作为益生元、脂肪替代品、糖替代品、质构改良剂、以及在工业过程中)。聚果聚糖可以包括β(2,6)键和/或β(2,1)键，其中聚果聚糖的类型取决于果糖残基的键合位置。例如，革兰明糖(graminan)是具有不同聚合度的β(2,1)-连接-D-果糖基骨架和β(2,6)-连接-D-果糖基侧链的支链聚果聚糖寡糖的复杂混合物。三种不同类别的酶可以用于产生聚果聚糖：通过在糖类中引入β(2,1)键生成支链聚果聚糖的蔗糖:蔗糖1-果糖基转移酶(1-SST)；通过形成β(2,1)键促进果糖单体在糖上的聚合的果聚糖:果聚糖1-果糖基转移酶(1-FFT)；以及通过β(2,6)键催化果糖单体的添加以产生聚果聚糖的蔗糖:果聚糖-6-果糖基转移酶(6-SFT)。

概述

本公开至少部分地涉及生成含有用于例如通过将蔗糖转化为聚果聚糖来产生聚果聚糖寡糖的酶的经工程化的细胞。这些经工程化的细胞对于产生复杂的支链聚果聚糖而言是有用的。

本公开的方面涉及包括一种或更多种异源多核苷酸的宿主细胞，所述一种或更多种异源多核苷酸编码：蔗糖:蔗糖1-果糖基转移酶(1-SST)；果聚糖:果聚糖1-果糖基转移酶(1-FFT)；以及蔗糖:果聚糖-6-果糖基转移酶(6-SFT)。

在一些实施方案中，1-SST酶包括与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:24至少90％一致的氨基酸序列。

在一些实施方案中，1-FFT酶包括与SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:31至少90％一致的氨基酸序列。

在一些实施方案中，6-SFT酶包括与SEQ ID NO:13或SEQ ID NO:38至少90％一致的氨基酸序列。

在一些实施方案中，宿主细胞包括一种或更多种编码1-SST酶、1-FFT酶和6-SFT酶中的两种或更多种的异源核苷酸。

在一些实施方案中，宿主细胞包括一种或更多种编码1-SST酶、1-FFT酶和6-SFT酶的异源核苷酸。

在一些实施方案中，1-SST酶、1-FFT酶和6-SFT酶中的至少两种在相同的异源多核苷酸上表达。

在一些实施方案中，宿主细胞是植物细胞、藻类细胞、酵母细胞、细菌细胞或动物细胞。

在一些实施方案中，酵母细胞是酵母属细胞、耶氏酵母属细胞或毕赤酵母属细胞。在一些实施方案中，宿主细胞是巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)细胞。

在一些实施方案中，1-SST酶包括SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:24的氨基酸序列。

在一些实施方案中，1-FFT酶包括SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:31的氨基酸序列。

在一些实施方案中，6-SFT酶包括SEQ ID NO:13或SEQ ID NO:38的氨基酸序列。

在一些实施方案中，1-SST酶、1-FFT酶和6-SFT酶中的一种或更多种由宿主细胞分泌。

本公开另外的方面提供包括培养本申请中本文公开的宿主细胞中的任何一种的方法。

在一些实施方案中，方法还包括从宿主细胞中纯化1-SST酶、1-FFT酶和6-SFT酶中的一种或更多种。

本公开的另外的方面提供产生果聚糖的方法。在一些实施方案中，方法包括使蔗糖与下列中的一种或更多种接触：(a)1-SST酶，1-SST酶包括与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:24至少90％一致的氨基酸序列；(b)1-FFT酶，1-FFT酶包括与SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:31至少90％一致的氨基酸序列；(c)6-SFT酶，6-SFT酶包括与SEQ ID NO:13或SEQ ID NO:38至少90％一致的氨基酸序列。

在一些实施方案中，使蔗糖与1-SST酶、1-FFT酶和6-SFT酶中的两种或更多种接触。

在一些实施方案中，使蔗糖与1-SST酶、1-FFT酶和6-SFT酶接触。

在一些实施方案中，果聚糖包括β(2,1)键、β(2,6)键或其组合。

在一些实施方案中，果聚糖是蔗果三糖、菊粉和/或革兰明糖。

在一些实施方案中，果聚糖具有至少3的聚合度。

在一些实施方案中，方法还包括纯化果聚糖。

在一些实施方案中，1-SST酶、1-FFT酶和/或6-SFT酶由一种或更多种宿主细胞分泌。

在一些实施方案中，在含有蔗糖的培养基中培养一种或更多种宿主细胞，其中使蔗糖与培养基中的1-SST酶、1-FFT酶和/或6-SFT酶接触。

在一些实施方案中，从培养基中纯化果聚糖。

在一些实施方案中，1-SST酶、1-FFT酶和/或6-SFT酶是纯化的酶。

在一些实施方案中，蔗果三糖是6-蔗果三糖。

在一些实施方案中，蔗果三糖是1-蔗果三糖。

在一些实施方案中，果聚糖包括左聚糖。

本公开的方面提供产生果聚糖的方法，方法包括(a)使蔗糖与1-SST酶接触以产生蔗果三糖；以及(b)使蔗果三糖与1-FFT酶和/或6-SFT酶接触以产生果聚糖。

在一些实施方案中，a)中产生的蔗果三糖被纯化，并且纯化的蔗果三糖在b)中与1-FFT酶和/或6-SFT酶接触。

在一些实施方案中，方法还包括纯化b)中产生的果聚糖。

在一些实施方案中，1-SST酶、1-FFT酶和/或6-SFT酶由一种或更多种宿主细胞分泌。在一些实施方案中，在含有蔗糖的培养基中培养一种或更多种宿主细胞，其中蔗糖与培养基中的1-SST酶接触。在一些实施方案中，1-SST酶、1-FFT酶和/或6-SFT酶是纯化的酶。在一些实施方案中，b)中产生的果聚糖是菊粉。在一些实施方案中，b)中产生的果聚糖是支链菊粉。在一些实施方案中，b)中产生的果聚糖是革兰明糖。

本公开的方面提供包括一种或更多种异源多核苷酸的宿主细胞，所述一种或更多种异源多核苷酸编码下列中的一种或更多种：(a)1-SST酶，1-SST酶包括与选自SEQ ID NO:1-4和SEQ ID NO:24-28的序列至少90％一致的氨基酸序列；(b)1-FFT酶，1-FFT酶包括与选自SEQ ID NO:7-10和SEQ ID NO:31-35的序列至少90％一致的氨基酸序列；以及(c)6-SFT酶，6-SFT酶包括与选自SEQ ID NO:13-21和SEQ ID NO:38-52的序列至少90％一致的氨基酸序列。

本公开的方面提供产生果聚糖的方法，方法包括使蔗糖与下列中的一种或更多种接触：(a)1-SST酶，1-SST酶包括与选自SEQ ID NO:1-4和SEQ ID NO:24-28的序列至少90％一致的氨基酸序列；(b)1-FFT酶，1-FFT酶包括与选自SEQ ID NO:7-10和SEQ ID NO:31-35的序列至少90％一致的氨基酸序列；以及(c)6-SFT酶，6-SFT酶包括与选自SEQ ID NO:13-21和SEQ ID NO:38-52的序列至少90％一致的氨基酸序列。

本发明的限制中的每个可以涵盖本发明的各种实施方案。因此，预期涉及任何一个要素或要素的组合的本发明的限制中的每个都可以包含在本发明的每个方面中。本发明的应用不限于在以下描述中所示或者在附图中所图示说明的构造细节和组分的布置。本发明能够具有其他实施方案并且能够以各种方式被实践或进行。此外，本公开中使用的措辞和术语是出于描述的目的，而不应当被视为限制性的。“包含”、“包括”、或“具有”、“含有”、“涉及”及其变体的使用意在涵盖其后列出的项目及其等同物以及附加项目。

附图的简要说明

附图并非旨在按比例绘制。在附图中，在各种图中图示说明的每个相同或几乎相同的组成部分由类似的数字表示。为清楚起见，并非每个组成部分都可以在每个图中标记。在附图中：

图1描绘了示出所选择的果聚糖(菊粉、左聚糖和革兰明糖)的化学结构的示意图。

图2描绘了示出太匮龙舌兰(Agave tequiliana)中的果聚糖产生中涉及的生物合成转化和相关酶的实例的示意图。

图3A-图3B描绘了示出来自酶库的筛选的数据的图表。图3A示出一图表，该图表显示出单独的酶和由与蔗糖的孵育形成的所得产物(β(2,6)果聚糖(在y轴上标记为‘2→6’)或β(2,1)果聚糖(在x轴上标记为‘蔗果三糖’))。根据产物形成，单独的酶被分类为：无活性；具有转化酶活性；具有蔗果三糖转移酶(1-SST)活性；或者具有β(2,6)支化(6-SFT)活性。图3B示出一图表，该图表显示出单独酶和由与蔗果三糖的孵育形成的所得产物(β(2,1)菊粉(在y轴上标记为‘耐斯糖(Nystose)’)或β(2,1)果聚糖(在x轴上标记为‘蔗果三糖’))。根据产物形成，单独的酶被分类为：无活性；具有蔗果糖酶(kestase)活性；或者具有1-FFT活性。通过HPLC分析图3A-图3B中的全部反应产物，并且使用峰积分定量。

图4描绘了示出果聚糖的代表性HPLC-RID迹线的示意图。顶部图片中示出酶促生物转化反应的实例(与蔗糖孵育的单独的酶)。底部图片中示出耐斯糖(A)、1-蔗果三糖(B)、蔗糖(C)、葡萄糖(D)和果糖(E)的可商业获得的标准品的制备的实例。

图5描绘了示出支链菊粉的合成的示意图。起始于蔗糖(葡萄糖和果糖的二聚体)，使用1-SST活性酶促形成蔗果三糖(包括β(2,1)键)。1-FFT活性催化线性菊粉的形成，线性菊粉可以与具有6-SFT活性的酶反应以提供β2,6支链菊粉(G＝葡萄糖；F＝果糖)。

图6A-图6D示出通过生物转化形成支链菊粉的确认。图6A示出生物转化反应的HPLC-RID迹线，从而表明支链菊粉已经产生并且可以与起始材料(蔗糖)和副产物(葡萄糖)区分开来。图6B示出一示意图，该示意图描绘了当通过GC/MS使支链菊粉经受分析时所生成的片段化产物。这些片段化产物提供独特的质谱特征，该独特的质谱特征表明β2,6支化的存在。图6C示出下列的GC/MS光谱分析的实例：生物转化样品；线性糖类(菊苣；Nicie)；以及已知的支链糖(‘最佳基准(Best Ground)’)。图6D是图6C中GC/MS分析介于28.0-29.6min之间的放大。

图7是SEQ ID NO:2-4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8-10、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:14-21和SEQ ID NO:63的序列一致性分析的非限制性实例。示出所示SEQ ID NO之间的百分比序列一致性。SEQ ID NO:6是高羊茅1-SST。SEQ ID NO:12是硬叶蓝刺头1-FFT。SEQ IDNO:63对应于梯牧草6-SFT(SEQ ID NO:23)的第60位残基至第623位残基。依据对数期望的多重序列比较(Multiple Sequence Comparison by Log-Expectation)(MUSCLE)用于序列一致性分析。

发明的详细说明

在一些方面，本公开提供被工程化用于由蔗糖产生聚果聚糖的细胞和酶。这些酶包含1-SST酶、1-FFT酶和6-SFT酶。本申请中公开的酶和包括这样的酶的宿主细胞可以用于促进果聚糖(包含支链果聚糖，如支链菊粉)的产生。在一些实施方案中，果聚糖包括β(2,1)键、β-(2,6)键或其组合。

果聚糖

如本申请中所使用的，“果聚糖”(也可以称为“聚果聚糖”或“果寡糖”)指包括果糖单体的寡糖。果聚糖通常还包括葡萄糖。在一些实施方案中，果聚糖包括至少一个β(2,1)键、至少一个β(2,6)键或其组合。在一些实施方案中，果聚糖是蔗果三糖(例如，1-蔗果三糖或6-蔗果三糖)、菊粉和/或革兰明糖。在一些实施方案中，果聚糖具有至少3(例如，至少3、至少4、至少5、至少6)的聚合度(DP)，其中聚合度指果聚糖中单糖单元(例如，果糖单元)的总数量或者果聚糖混合物中单糖单元的平均数量。在一些实施方案中，果聚糖包括左聚糖(例如，线性左聚糖或支链左聚糖，例如，包括至少一个β(2,1)键和/或至少一个β(2,6)键)。在一些实施方案中，果聚糖是菊粉。在一些实施方案中，菊粉是线性菊粉或支链菊粉(例如，包括至少一个β(2,1)键和/或至少一个β(2,6)键)。在一些实施方案中，果聚糖是革兰明糖。

式1是包括β(2,1)键的果聚糖的实例：

式2是包括β(2,6)键的果聚糖的实例：

式3示出1-蔗果三糖：

式4示出6-蔗果三糖：

式5示出耐斯糖：

式6示出菊粉，其中n为任何整数

式7示出革兰明糖的实例，其中n1为任何整数

式8示出革兰明糖的实例，其中n1和n2可以独立地为任何整数

如本领域普通技术人员将理解的，使用本申请中描述的方法产生的果聚糖中的任何一种可以具有多种应用(包含工业用途)。作为非限制性实例，长链果聚糖(例如，左聚糖)可以用于发酵过程中和醋的产生中。也参见，例如，Niness,J Nutr.1999Jul；129(7Suppl):1402S-6S；Kolida et al.,Br J Nutr.2002；Koga et al.,Pediatr Res.2016Dec；80(6):844-851；Roberfroid,J Nutr.2007Nov；137(11Suppl):2493S-2502S；Suzuki et al.,Bioscience Microflora Vol.25(3),109-116,2006；Lopez and Urias-Silvas,RecentAdvances in Fructooligosaccharides Research(pp.297-310),2007；以及Vijn andSmeekens,Plant Physiology,June 1999,Vol.120,pp.351-359。

蔗糖:蔗糖1-果糖基转移酶(1-SST)

如本申请中所使用的，“蔗糖:蔗糖1-果糖基转移酶(1-SST)”指通过在糖类中引入β(2,1)键生成支链聚果聚糖(例如，由蔗糖形成1-蔗果三糖)的酶。1-SST酶可以使用蔗糖作为底物。在一些实施方案中，与其他糖类相比，1-SST对蔗糖展现出特异性。在一些实施方案中，1-SST由蔗糖产生1-蔗果三糖。在一些实施方案中，1-SST可以使用左聚糖作为底物以产生具有β(2-6)键和β(2-1)键的支链左聚糖。

本申请中描述的宿主细胞可以包括1-SST酶和/或编码这样的酶的异源多核苷酸。在一些实施方案中，宿主细胞包括编码1-SST酶的异源多核苷酸，1-SST酶包括与下列中的任何一种至少70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％一致、或100％(包含之间的全部值)一致的氨基酸序列：SEQ ID NO:1-4、SEQ IDNO:6和SEQ ID NO:24-28；表2中的1-SST酶；或本申请中另外描述的1-SST酶。在一些实施方案中，宿主细胞包括与下列中的任何一种至少70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％一致、或100％(包含之间的全部值)一致的异源多核苷酸：SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:29-30和SEQ ID NO:62；编码表2中的1-SST酶的多核苷酸；或编码本申请中另外描述的1-SST酶的多核苷酸。

在一些实施方案中，宿主细胞不包括来源于高羊茅的1-SST。在一些实施方案中，宿主细胞不包括对应于SEQ ID NO:6的1-SST。

在一些实施方案中，相对于对照，表达编码1-SST酶的异源多核苷酸的宿主细胞可以将蔗糖至1-蔗果三糖的转化增加多0.5倍、1倍、1.5倍、2倍、2.5倍、3倍、3.5倍、4倍、4.5倍、5倍、5.5倍或6倍(例如，多2倍至6倍)，和/或将寡糖中β(2,1)键的引入增加多0.5倍、1倍、1.5倍、2倍、2.5倍、3倍、3.5倍、4倍、4.5倍、5倍、5.5倍或6倍(例如，多2倍至6倍)。在一些实施方案中，对照是表达编码SEQ ID NO:6的异源多核苷酸的宿主细胞。在一些实施方案中，对照是表达编码SEQ ID NO:6的异源多核苷酸的巴斯德毕赤酵母菌株(如在Lüscher,M.et.al.,“Cloning and Functional Analysis of Sucrose:Sucrose 1-Fructosyltransferase from Tall Fescue,”Plant Physiology,124:1217-1227(2000)中所描述的，并且由Lüscher,M.et.al.,“Cloning and Functional Analysis of Sucrose:Sucrose 1-Fructosyltransferase from Tall Fescue,”Plant Physiology,124:1217-1227(2000)通过引用所并入的)。

在一些实施方案中，相对于其他糖类，表达编码1-SST酶的异源多核苷酸的宿主细胞在存在蔗糖的情况下可以展现出高至少0.5倍、1倍、1.5倍、2倍、2.5倍、3倍、3.5倍、4倍、4.5倍、5倍、5.5倍或6倍(例如，高2倍至6倍)的活性。在一些实施方案中，活性对应于蔗糖至1-蔗果三糖的转化，和/或增加寡糖中β(2,1)键的引入。

在一些实施方案中，1-SST包括与SEQ ID NO:1-4、SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:24-28中的任何一种至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％(包含之间的全部值)一致的序列。

果聚糖:果聚糖1-果糖基转移酶(1-FFT)

如本申请中所使用的，“果聚糖:果聚糖1-果糖基转移酶(1-FFT)”指催化包括β(2,1)键的寡糖(例如，1-蔗果三糖)向寡糖的较长聚合物链的转化(例如，1-蔗果三糖至菊粉的转化)的酶。1-FFT酶可以使用1-蔗果三糖、蔗糖和/或果糖作为底物。在一些实施方案中，1-FFT酶可以使用黑麦双叉寡糖或新蔗果三糖作为底物。在一些实施方案中，1-FFT由1-蔗果三糖产生菊粉(例如，支链菊粉)。

本申请中描述的宿主细胞可以包括1-FFT酶和/或编码这样的酶的异源多核苷酸。在一些实施方案中，宿主细胞包括编码1-FFT酶的异源多核苷酸，1-FFT酶包括与下列中的任何一种至少70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％一致、或100％(包含之间的全部值)一致的氨基酸序列：SEQ ID NO:7-10、SEQ IDNO:12和SEQ ID NO:31-35；表2中的1-FFT酶；或者本申请中另外描述的1-FFT酶。在一些实施方案中，宿主细胞包括与下列中的任何一种至少70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％一致、或100％(包含之间的全部值)一致的异源多核苷酸：SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:36和SEQ ID NO:37；编码表2中的1-FFT酶的多核苷酸；或者编码本申请中另外描述的1-FFT酶的多核苷酸。

在一些实施方案中，宿主细胞不包括来源于硬叶蓝刺头的1-FFT酶。在一些实施方案中，宿主细胞不包括对应于SEQ ID NO:12的1-FFT酶。

在一些实施方案中，相对于对照，表达编码1-FFT酶的异源多核苷酸的宿主细胞可以将1-蔗果三糖至菊粉的转化增加多0.5倍、1倍、1.5倍、2倍、2.5倍、3倍、3.5倍、4倍、4.5倍、5倍、5.5倍或6倍(例如，多2倍至6倍)，和/或将包括β(2,1)键的寡糖向寡糖的较长聚合物链的转化增加多0.5倍、1倍、1.5倍、2倍、2.5倍、3倍、3.5倍、4倍、4.5倍、5倍、5.5倍或6倍(例如，多2倍至6倍)。在一些实施方案中，对照是表达编码SEQ ID NO:12的异源多核苷酸的宿主细胞。在一些实施方案中，对照是表达编码SEQ ID NO:12的异源多核苷酸的巴斯德毕赤酵母菌株(如在Van den Ende,W.et al.,“Cloning and Functional Analysis of aHigh DP Fructan:Fructan 1-Fructosyl transferase from Echinops ritro(Asteraceae):Comparison of the native and recombinant enzymes,”Journal ofExperimental Botany,57(4):775-789(2006)中所描述的，并且由Van den Ende,W.etal.,“Cloning and Functional Analysis of a High DP Fructan:Fructan 1-Fructosyltransferase from Echinops ritro(Asteraceae):Comparison of the native andrecombinant enzymes,”Journal of Experimental Botany,57(4):775-789(2006)通过引用所并入的)。

在一些实施方案中，1-FFT酶包括与SEQ ID NO:7-10、SEQ ID NO:12和SEQ ID NO:31-35中的任何一种至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％(包含之间的全部值)一致的序列。

蔗糖:果聚糖-6-果糖基转移酶(6-SFT)

如本申请中所使用的，“蔗糖:果聚糖-6-果糖基转移酶(6-SFT)”指通过在糖类中引入β(2,6)键生成果聚糖(例如，由蔗糖产生6-蔗果三糖)或者通过在前体果聚糖中引入β(2,6)键生成更复杂的果聚糖(例如，由1-蔗果三糖产生黑麦双叉寡糖)的酶。6-SFT可以使用蔗糖、6-蔗果三糖、1-蔗果三糖、黑麦双叉寡糖和/或新蔗果三糖作为底物。在一些实施方案中，6-SFT由蔗糖产生6-蔗果三糖。在一些实施方案中，6-SFT由1-蔗果三糖产生黑麦双叉寡糖。在一些实施方案中，6-SFT由黑麦双叉寡糖产生革兰明糖。

本申请中描述的宿主细胞可以包括6-SFT酶和/或编码这样的酶的异源多核苷酸。在一些实施方案中，宿主细胞包括编码6-SFT酶的异源多核苷酸，6-SFT酶包括与下列中的任何一种至少70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％一致、或100％(包含之间的全部值)一致的氨基酸序列：SEQ ID NO:13-21、SEQID NO:23和SEQ ID NO:38-52；表2中的6-SFT酶；或者本申请中另外描述的6-SFT酶。在一些实施方案中，宿主细胞包括与下列中的任何一种至少70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％一致、或100％(包含之间的全部值)一致的异源多核苷酸：SEQ ID NO:22和SEQ ID NO:53-59；编码表2中的6-SFT酶的多核苷酸；或者编码本申请中另外描述的6-SFT酶的多核苷酸。

在一些实施方案中，宿主细胞不包括来源于梯牧草的6-SFT酶。在一些实施方案中，宿主细胞不包括对应于SEQ ID NO:23的6-SFT酶。在一些实施方案中，宿主细胞不包括对应于SEQ ID NO:63的6-SFT酶。

在一些实施方案中，相对于对照，表达编码6-SFT酶的异源多核苷酸的宿主细胞可以将蔗糖至1-蔗果三糖的转化增加多0.5倍、1倍、1.5倍、2倍、2.5倍、3倍、3.5倍、4倍、4.5倍、5倍、5.5倍或6倍(例如，多2倍至6倍)，将1-蔗果三糖至黑麦双叉寡糖的转化增加多0.5倍、1倍、1.5倍、2倍、2.5倍、3倍、3.5倍、4倍、4.5倍、5倍、5.5倍或6倍(例如，多2倍至6倍)，将黑麦双叉寡糖向革兰明糖的转化增加多0.5倍、1倍、1.5倍、2倍、2.5倍、3倍、3.5倍、4倍、4.5倍、5倍、5.5倍或6倍(例如，多2倍至6倍)，和/或将β(2,6)键向果聚糖中的引入增加多0.5倍、1倍、1.5倍、2倍、2.5倍、3倍、3.5倍、4倍、4.5倍、5倍、5.5倍或6倍(例如，多2倍至6倍)。在一些实施方案中，对照是表达编码SEQ ID NO:23的异源多核苷酸的宿主细胞。在一些实施方案中，对照是表达编码SEQ ID NO:23的异源多核苷酸的巴斯德毕赤酵母菌株(如在Tamura,K.I.,et al.“Cloning and Functional Analysis of a FructosyltransferasecDNA for Synthesis of Highly Polymerized Levans in Timothy(Phleum pratenseL.)”Journal of Experimental Botany,60(3),893-905(2009)中所描述的，并且由Tamura,K.I.,et al.“Cloning and Functional Analysis of a FructosyltransferasecDNA for Synthesis of Highly Polymerized Levans in Timothy(Phleum pratenseL.)”Journal of Experimental Botany,60(3),893-905(2009)通过引用所并入的)。在一些实施方案中，对照是表达编码SEQ ID NO:63的异源多核苷酸的宿主细胞。在一些实施方案中，对照是表达编码SEQ ID NO:63的异源多核苷酸的巴斯德毕赤酵母菌株。

在一些实施方案中，6-SFT包括与SEQ ID NO:13-21、SEQ ID NO:23和SEQ ID NO:38-52中的任何一种至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％(包含之间的全部值)一致的序列。

变体

本公开也涵盖本申请中描述的酶和蛋白质的变体(例如，1-SST、1-FFT或6-SFT)(包含核酸序列和氨基酸序列的变体)。变体可以与参考序列共有至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％(包含之间的全部值)的序列一致性。

除非另外指出，否则本领域已知的术语“序列一致性”指通过序列比较(比对)确定的两个多肽或多核苷酸的序列之间的关系。在一些实施方案中，在序列(如参考序列)的整个长度上确定序列一致性，而在其他实施方案中，在序列的区上确定序列一致性。在一些实施方案中，在序列(例如，1-SST序列、1-FFT序列或6-SFT序列)的区(例如，氨基酸或核酸的段，例如，跨越活性位点的序列)上确定序列一致性。例如，在一些实施方案中，在与参考序列的长度的至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、或超过100％对应的区上确定序列一致性。

一致性测量具有由特定数学模型、算法或计算机程序解决的空位比对(如果有的话)的两个或更多个序列中的较小序列之间一致匹配的百分比。

可以通过本领域普通技术人员已知的方法中的任何一种容易地计算相关多肽或核酸序列的一致性。可以例如使用Karlin and Altschul Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87:2264-68,1990的算法、Karlin and Altschul Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:5873-77,1993中修改的算法来确定两个序列(例如，核酸序列或氨基酸序列)的“百分比一致性”。这样的算法被并入Altschul et al.,J.Mol.Biol.215:403-10,1990的

程序和

程序(版本2.0)。例如，可以用XBLAST程序(评分＝50，字长＝3)进行

蛋白质搜索，以获得与本申请中描述的蛋白质同源的氨基酸序列。在两个序列之间存在空位的情况下，例如，如Altschul et al.,Nucleic Acids Res.25(17):3389-3402,1997中所描述的，可以利用Gapped

当利用

程序和Gapped

程序时，如本领域普通技术人员将理解的，可以使用各自程序(例如，

和

)的系统内定参数，或者可以适当地调整参数。

例如，可以使用的另外的局部比对技术基于史密斯-沃特曼算法(Smith,T.F.&Waterman,M.S.(1981)“Identification of common molecular subsequences.”J.Mol.Biol.147:195-197)。例如，可以使用的通用全局比对技术是基于动态编程的尼德曼-翁施算法(Needleman,S.B.&Wunsch,C.D.(1970)“A general method applicable tothe search for similarities in the amino acid sequences of two proteins.”J.Mol.Biol.48:443-453)。

最近，开发了一种快速最优全局序列比对算法(FOGSAA)，据称该算法比其他最优全局比对方法(包含尼德曼-翁施算法)更快地产生核酸序列和氨基酸序列的全局比对。在一些实施方案中，通过比对两个氨基酸序列、计算相同氨基酸的数量、并且除以氨基酸序列之一的长度来确定两个多肽的一致性。在一些实施方案中，通过比对两个核苷酸序列并且计算相同核苷酸的数量并且除以核酸之一的长度来确定两个核酸的一致性。

对于多序列比对，可以使用计算机程序(包含Clustal Omega(Sievers et al.,Mol Syst Biol.2011Oct 11；7:539))。

在优选实施方案中，当使用Karlin and Altschul Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87:2264-68,1990(如在Karlin and Altschul Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:5873-77,1993中修改的)的算法(例如，

程序、

程序、

程序或Gapped

程序，使用各程序的默认参数)确定序列一致性时，发现序列(包含核酸序列或氨基酸序列)(如本申请中公开的和/或权利要求中限定的序列)与参考序列具有特定的百分比一致性。

在一些实施方案中，当使用史密斯-沃特曼算法(Smith,T.F.&Waterman,M.S.(1981)“Identification of common molecular subsequences.”J.Mol.Biol.147:195-197)或尼德曼-翁施算法(Needleman,S.B.&Wunsch,C.D.(1970)“A general methodapplicable to the search for similarities in the amino acid sequences of twoproteins.”J.Mol.Biol.48:443-453)使用默认参数确定序列一致性时，发现序列(包含核酸序列或氨基酸序列)(如本申请中公开的和/或权利要求中限定的序列)与参考序列具有特定的百分比一致性。

在一些实施方案中，当使用快速最优全局序列比对算法(FOGSAA)使用默认参数确定序列一致性时，发现序列(包含核酸序列或氨基酸序列)(如本申请中公开的和/或权利要求中限定的序列)与参考序列具有特定的百分比一致性。

在一些实施方案中，当使用Clustal Omega(Sievers et al.,Mol SystBiol.2011Oct 11；7:539)使用默认参数确定序列一致性时，发现序列(包含核酸序列或氨基酸序列)(如本申请中公开的和/或权利要求中限定的序列)与参考序列具有特定的百分比一致性。

如本申请中所使用的，当使用本领域已知的氨基酸序列比对工具比对序列X和序列Y且当序列“X”中的残基在序列“Y”中的“n”的对应位置处时，序列“X”中的残基(如核酸残基或氨基酸残基)被称为对应于不同序列“Y”中的位置或残基(如核酸残基或氨基酸残基)“n”。

变体序列可以是同源序列。如本申请中所使用的，同源序列是共有一定百分比一致性(例如，至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％(包含之间的全部值)百分比一致性)的序列(包含核酸序列或氨基酸序列)。同源序列包含但不限于旁系同源序列、直系同源序列、或者来源于趋同进化的序列。旁系同源序列由物种的基因组内的基因的复制产生，而直系同源序列在物种形成事件之后趋异。由于趋同进化，两个不同物种可能已经独立地进化，但可能各自包括与来自其他物种的序列共有一定百分比一致性的序列。

在一些实施方案中，多肽变体(如1-SST酶变体、1-FFT酶变体或6-SFT酶变体)包括与参考多肽(例如，参考1-SST酶、参考1-FFT酶或参考6-SFT酶)共有二级结构(例如，α螺旋、β片层)的域。在一些实施方案中，多肽变体(如1-SST酶变体、1-FFT酶变体或6-SFT酶变体)与参考多肽(例如，参考1-SST酶、参考1-FFT酶或参考6-SFT酶)共有三级结构。作为非限制性实例，变体多肽(例如，1-SST酶变体、1-FFT酶变体或6-SFT酶变体)与参考多肽相比可以具有低的一级序列一致性(例如，小于80％、小于75％、小于70％、小于65％、小于60％、小于55％、小于50％、小于45％、小于40％、小于35％、小于30％、小于25％、小于20％、小于15％、小于10％、或小于5％的序列一致性)，但共有一个或更多个二级结构(例如，包含但不限于环、α螺旋或β片层)，或者具有与参考多肽相同或相似的三级结构。例如，环可以位于β片层与α螺旋之间、两个α螺旋之间、或两个β片层之间。同源建模可以用于比较两个或更多个三级结构。

可以通过本领域普通技术人员已知的多种方法在核苷酸序列中进行突变。例如，可以通过PCR定向突变、根据Kunkel的方法(Kunkel,Proc.Nat.Acad.Sci.U.S.A.82:488-492,1985)的定点突变、通过编码多肽的基因的化学合成、通过基因编辑技术、或者通过插入(如标签(例如，HIS标签或GFP标签)的插入)来进行突变。突变可以包含例如通过本领域已知的任何方法生成的置换、缺失和易位。可以在参考文献(如Molecular Cloning:ALaboratory Manual,J.Sambrook,et al.,eds.,Fourth Edition,Cold Spring HarborLaboratory Press,Cold Spring Harbor,New York,2012或者Current Protocols inMolecular Biology,F.M.Ausubel,et al.,eds.,John Wiley&Sons,Inc.,New York,2010)中找到用于产生突变的方法。

在一些实施方案中，用于产生变体的方法包含环状变换(Yu and Lutz,TrendsBiotechnol.2011Jan；29(1):18-25)。在环状变换中，可以环化多肽的线性一级序列(例如，通过连接序列的N末端和C末端)，并且可以在不同位置处切断(“断裂”)多肽。因此，如由线性序列比对方法(例如，Clustal Omega或BLAST)所确定的，新多肽的线性一级序列可以具有低的序列一致性(例如，小于80％、小于75％、小于70％、小于65％、小于60％、小于55％、小于50％、小于45％、小于40％、小于35％、小于30％、小于25％、小于20％、小于15％、小于10％、小或小于5％(包含之间的全部值))。然而，两种蛋白质的拓扑分析可以揭示两种多肽的三级结构类似或者不类似。不受特定理论的束缚，通过参考多肽的环状变换创建并且具有与参考多肽的三级结构类似的三级结构的变体多肽可以共有类似的功能特性(例如，酶活性、酶动力学、底物特异性或产物特异性)。在一些情况下，环状变换可以改变二级结构、三级结构或四级结构，并且产生具有不同功能特性(例如，增加或减少的酶活性、不同的底物特异性、或不同的产物特异性)的酶。参见，例如，Yu and Lutz,TrendsBiotechnol.2011Jan；29(1):18-25。

应当理解的是，在已经经历环状变换的蛋白质中，蛋白质的线性氨基酸序列将不同于尚未经历环状变换的参考蛋白质。然而，本领域普通技术人员将能够通过例如比对序列和检测保守基序、和/或通过比较蛋白质的结构或预测结构(例如，通过同源建模)容易地确定已经经历环状变换的蛋白质中的哪些残基对应于尚未经历环状变换的参考蛋白质中的残基。

在一些实施方案中，本申请中描述的确定感兴趣的序列与参考序列之间的百分比一致性的算法说明了序列之间的环状变换的存在。可以使用本领域已知的任何方法(包含，例如，RASPODOM(Weiner et al.,Bioinformatics.2005Apr 1；21(7):932-7))检测环状变换的存在。在一些实施方案中，在计算感兴趣的序列与本申请中描述的序列之间的百分比一致性之前，对环状变换的存在进行校正(例如，重排至少一个序列中的域)。应当理解本申请的权利要求包含在考虑序列的潜在环状变换后计算与参考序列的百分比一致性的序列。

本公开也涵盖本申请中公开的重组1-SST酶、1-FFT酶或6-SFT酶的功能变体。例如，功能变体可以结合相同底物中的一种或更多种或者产生相同产物中的一种或更多种。可以使用本领域已知的任何方法鉴别功能变体。例如，上文描述的Karlin and AltschulProc.Natl.Acad.Sci.USA 87:2264-68,1990的算法可以用于鉴别具有已知功能的同源蛋白质。

也可以通过搜索具有功能注释域的多肽鉴别推定的功能变体。数据库(包含Pfam(Sonnhammer et al.,Proteins.1997Jul；28(3):405-20))可以用于鉴别具有特定域的多肽。

同源建模也可以用于鉴别适合突变而不影响功能的氨基酸残基。这样的方法的非限制性实例可以包含位置特异性评分矩阵(position-specific scoring matrix)(PSSM)和能量最小化协议的使用。

位置特异性评分矩阵(PSSM)使用位置权重矩阵来鉴别共有序列(例如，基序)。可以在核酸序列或氨基酸序列上进行PSSM。方法使用比对序列，并且考虑在特定位置处观察到的特定残基(例如，氨基酸或核苷酸)的频率和所分析的序列的数量。参见，例如，Stormoet al.,Nucleic Acids Res.1982May 11；10(9):2997-3011。可以计算在给定位置处观察到特定残基的可能性。不受特定理论的束缚，具有高变异性的序列中的位置可以适合突变(例如，PSSM评分≥0)以产生功能同系物。

PSSM可以与Rosetta能量函数的计算配对，Rosetta能量函数确定野生型与单点突变体之间的差异。Rosetta能量函数将该差异计算为(ΔΔG_calc)。利用Rosetta函数，突变的残基与周围原子之间的键合相互作用被用于确定突变是增加还是减小蛋白质稳定性。例如，然后可以使用Rosetta能量函数分析由PSSM评分(例如，PSSM评分≥0)指定为有利的突变，以确定突变对蛋白质稳定性的潜在影响。不受特定理论的束缚，潜在稳定化的突变对于蛋白质工程(例如，功能同系物的产生)是期望的。在一些实施方案中，潜在稳定化的突变具有小于-0.1(例如，小于-0.2、小于-0.3、小于-0.35、小于-0.4、小于-0.45、小于-0.5、小于-0.55、小于-0.6、小于-0.65、小于-0.7、小于-0.75、小于-0.8、小于-0.85、小于-0.9、小于-0.95、或小于-1.0)Rosetta能量单位(R.e.u.)的ΔΔG_calc值。参见，例如，Goldenzweig etal.,Mol Cell.2016Jul 21；63(2):337-346.Doi:10.1016/j.molcel.2016.06.012。

在一些实施方案中，1-SST酶、1-FFT酶或6-SFT酶编码序列包括在与参考(例如，1-SST酶、1-FFT酶或6-SFT酶)编码序列对应的1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个、31个、32个、33个、34个、35个、36个、37个、38个、39个、40个、41个、42个、43个、44个、45个、46个、47个、48个、49个、50个、51个、52个、53个、54个、55个、56个、57个、58个、59个、60个、61个、62个、63个、64个、65个、66个、67个、68个、69个、70个、71个、72个、73个、74个、75个、76个、77个、78个、79个、80个、81个、82个、83个、84个、85个、86个、87个、88个、89个、90个、91个、92个、93个、94个、95个、96个、97个、98个、99个、100个或超过100个位置处的突变。在一些实施方案中，相对于参考(例如，1-SST酶、1-FFT酶或6-SFT酶)编码序列，1-SST酶、1-FFT酶或6-SFT酶编码序列在编码序列的1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个、31个、32个、33个、34个、35个、36个、37个、38个、39个、40个、41个、42个、43个、44个、45个、46个、47个、48个、49个、50个、51个、52个、53个、54个、55个、56个、57个、58个、59个、60个、61个、62个、63个、64个、65个、66个、67个、68个、69个、70个、71个、72个、73个、74个、75个、76个、77个、78个、79个、80个、81个、82个、83个、84个、85个、86个、87个、88个、89个、90个、91个、92个、93个、94个、95个、96个、97个、98个、99个、100个或更多个密码子中包括突变。如本领域普通技术人员将理解的，由于遗传码的简并性，密码子内的突变可以改变由密码子编码的氨基酸或者可以不改变由密码子编码的氨基酸。在一些实施方案中，相对于参考多肽(例如，1-SST酶、1-FFT酶或6-SFT酶)的氨基酸序列，编码序列中的一个或更多个突变不改变编码序列(例如，1-SST酶、1-FFT酶或6-SFT酶)的氨基酸序列。

在一些实施方案中，相对于参考多肽(例如，1-SST酶、1-FFT酶或6-SFT酶)的氨基酸序列，重组1-SST酶序列、重组1-FFT酶序列或重组6-SFT酶序列中的一个或更多个突变改变多肽(例如，1-SST酶、1-FFT酶或6-SFT酶)的氨基酸序列。在一些实施方案中，相对于参考多肽(例如，1-SST酶、1-FFT酶或6-SFT酶)的氨基酸序列，一个或更多个突变改变重组多肽(例如，1-SST酶、1-FFT酶或6-SFT酶)的氨基酸序列，并且相对于参考多肽改变(增强或降低)多肽的活性。

可以使用常规方法测量本申请中描述的重组多肽(例如，1-SST酶、1-FFT酶或6-SFT酶)中任何一种的活性(包含比活性)。作为非限制性实例，可以通过测量重组多肽的底物特异性、产生的一种或多种产物、产生的一种或多种产物的浓度、或其任何组合来确定重组多肽的活性。如本申请中所使用的，重组多肽的“比活性”指每单位时间针对给定量(例如，浓度)的重组多肽产生的特定产物的量(例如，浓度)。

本领域技术人员还将认识到，重组多肽(例如，1-SST酶、1-FFT酶或6-SFT酶)编码序列中的突变可以造成保守氨基酸置换，保守氨基酸置换提供前述多肽的功能等效变体(例如，保留多肽的活性的变体)。如本申请中所使用的，“保守氨基酸置换”指不改变进行氨基酸置换的蛋白质的相对电荷特性或尺寸特性或功能活性的氨基酸置换。

在一些情况下，氨基酸的特征在于其R基团(参见，例如，表1)。例如，氨基酸可以包括非极性脂族R基团、带正电荷的R基团、带负电荷的R基团、非极性芳族R基团、或极性不带电荷的R基团。包括非极性脂族R基团的氨基酸的非限制性实例包含丙氨酸、甘氨酸、缬氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸和异亮氨酸。包括带正电荷的R基团的氨基酸的非限制性实例包含赖氨酸、精氨酸和组氨酸。包括带负电荷的R基团的氨基酸的非限制性实例包含天门冬氨酸盐和谷氨酸盐。包括非极性芳族R基团的氨基酸的非限制性实例包含苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸。包括极性不带电荷的R基团的氨基酸的非限制性实例包含丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、脯氨酸、天门冬酰胺和谷氨酰胺。

多肽的功能等效变体的非限制性实例可以包含本申请中公开的蛋白质的氨基酸序列中的保守氨基酸置换。如本申请中所使用的，“保守置换”与“保守氨基酸置换”可互换地使用，并且指表1中提供的氨基酸置换中的任何一种。

在一些实施方案中，在制备变体多肽时，可以改变1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个或超过20个残基。在一些实施方案中，氨基酸被保守氨基酸置换替代。

表1.保守氨基酸置换

原始残基	R基团类型	保守氨基酸置换
			Ala	非极性脂族R基团	Cys、Gly、Ser
Arg	带正电荷的R基团	His、Lys
			Asn	极性不带电荷的R基团	Asp、Gln、Glu
Asp	带负电荷的R基团	Asn、Gln、Glu
			Cys	极性不带电荷的R基团	Ala、Ser
Gln	极性不带电荷的R基团	Asn、Asp、Glu
			Glu	带负电荷的R基团	Asn、Asp、Gln
Gly	非极性脂族R基团	Ala、Ser
			His	带正电荷的R基团	Arg、Tyr、Trp
Ile	非极性脂族R基团	Leu、Met、Val
			Leu	非极性脂族R基团	Ile、Met、Val
Lys	带正电荷的R基团	Arg、His
			Met	非极性脂族R基团	Ile、Leu、Phe、Val
Pro	极性不带电荷的R基团
			Phe	非极性芳族R基团	Met、Trp、Tyr
Ser	极性不带电荷的R基团	Ala、Gly、Thr
			Thr	极性不带电荷的R基团	Ala、Asn、Ser
Trp	非极性芳族R基团	His、Phe、Tyr、Met
			Tyr	非极性芳族R基团	His、Phe、Trp
Val	非极性脂族R基团	Ile、Leu、Met、Thr

可以通过改变多肽的编码序列来进行多肽的氨基酸序列中的氨基酸置换以产生具有期望性质和/或活性的重组多肽变体。类似地，通常通过改变重组多肽的编码序列来进行多肽的氨基酸序列中的保守氨基酸置换以产生多肽的功能等效变体。

编码本公开的酶的序列还可以编码分泌信号。作为非限制性实例，可以根据感兴趣的宿主细胞选择分泌信号。在一些实施方案中，分泌信号可以是酵母分泌信号、植物分泌信号或细菌分泌信号。

在一些实施方案中，分泌信号包括与

至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％一致的序列。

在一些实施方案中，编码分泌信号的核酸序列包括与

至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％一致的序列。

应当理解的是，本领域普通技术人员已知的其他分泌信号也将与本公开的方面相容。

编码本公开的酶的核酸

本公开的方面涉及重组酶、其功能化修饰和变体、以及与其相关的应用。例如，本申请中描述的酶和细胞可以用于促进果聚糖(例如，支链果聚糖，例如，支链菊粉)的产生。方法可以包括使用包括本申请中公开的一种或更多种酶的宿主细胞、细胞裂解物、分离的酶、或其任何组合。本公开涵盖包括在宿主细胞中重组表达编码本申请中公开的酶的多核苷酸的方法。本公开还涵盖包括使反应混合物中的用于产生聚果聚糖的一种或更多种酶与本申请中公开的BCAA途径酶反应的体外方法。在一些实施方案中，BCAA途径酶是1-SST酶、1-FFT酶、或6-SFT酶、或其组合。

编码重组多肽1-SST、1-FFT和/或6-SFT中的任何一种或更多种的核酸被本公开涵盖，并且可以被包括在宿主细胞内。在一些实施方案中，核酸是操纵子的形式。在一些实施方案中，至少一个核糖体结合位点存在于核酸中存在的编码序列中的一个或更多个之间。

在一些实施方案中，本申请中提供的核酸是在高严格性条件或中等严格性条件下与编码1-SST、1-FFT和/或6-SFT的核酸杂交并且具有生物学活性的核酸。例如，高严格性条件可以包含在65℃的0.2×SSC至1×SSC，然后在65℃以0.2×SSC洗涤。在一些实施方案中，本申请中提供的核酸是在低严格性条件下与编码1-SST、1-FFT和/或6-SFT的核酸杂交并且具有生物学活性的核酸。例如，低严格性条件可以包含在室温的6×SSC，然后在室温以2×SSC洗涤。其他杂交条件包含在40℃或50℃的3×SSC、然后在20℃、30℃、40℃、50℃、60℃或65℃在1×SSC或2×SSC洗涤。

可以在存在甲醛(例如，10％、20％、30％、40％或50％)的情况下进行杂交，甲醛的存在进一步增加了杂交的严格性。例如，S.阿格拉瓦尔(S.Agrawal)(编者)分子生物学方法(Methods in Molecular Biology)，第20卷；和泰森(Tijssen)(1993)生物化学和分子生物学实验技术-核酸探针杂交(Laboratory Techniques in biochemistry and molecularbiology-hybridization with nucleic acid probes)(例如，第I部分第2章“杂交原理和核酸探针测定的策略的概述(Overview of principles of hybridization and thestrategy of nucleic acid probe assays)”，纽约爱思维尔)中描述了核酸杂交的理论和实践。示例性蛋白质可以与1-SST蛋白、1-FFT蛋白、或6-SFT蛋白或其域(例如，催化域)具有至少约50％、70％、80％、90％、95％、98％或99％的同源性或一致性。其他示例性蛋白质可以由与编码1-SST蛋白、1-FFT蛋白、或6-SFT蛋白或其域(例如，催化域)的核酸具有至少约50％、70％、80％、90％、95％、98％或99％)同源性或一致性的核酸编码。

可以通过本领域已知的任何方法将编码本申请中描述的重组多肽中任何一种或更多种的核酸并入任何适当的运载体中。例如，运载体可以是表达载体(包含但不限于病毒运载体(例如，慢病毒运载体、逆转录病毒运载体、腺病毒运载体、或腺相关病毒运载体)、适合于瞬时表达的任何运载体、适合于组成型表达的任何运载体、或者适合于诱导型表达的任何运载体(例如，半乳糖诱导型运载体或强力霉素诱导型运载体))。

在一些实施方案中，运载体在细胞中自主复制。在一些实施方案中，将运载体整合到细胞内的染色体中。运载体可以含有一个或更多个核酸内切酶限制性位点，核酸内切酶限制位点被限制性核酸内切酶切割以插入和连接含有本申请中描述的基因的核酸，以产生能够在细胞中复制的重组运载体。运载体通常由DNA组成，尽管RNA运载体也是可用的。克隆运载体包含(但不限于)：质粒、F黏粒(fosmid)、噬菌粒、病毒基因组和人工染色体。如本申请中所使用的，术语“表达运载体”或“表达构建体”指重组或合成生成的、具有一系列容许特定核酸在宿主细胞(例如，微生物)(如酵母细胞)中转录的指定核酸元件的核酸构建体。在一些实施方案中，将本申请中描述的基因的核酸序列插入克隆运载体中，使得其可操作地连接至调控序列，并且在一些实施方案中表达为RNA转录物。在一些实施方案中，运载体含有一种或更多种标志物(如可选择的标志物)，以鉴别用重组运载体转化或转染的细胞。在一些实施方案中，本申请中描述的基因的核酸序列被重新编码。重新编码可以将基因产物的产量相对于未经重新编码的参考序列增加至少2％％、至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、或至少100％(包含之间的全部值)。

当编码序列和调控序列共价地连接并且编码序列的表达或转录受到调控序列的影响或控制时，编码序列和调控序列被称为“可操作地连接(operably joined)”或“可操作地连接(operably linked)”。如果编码序列被翻译成功能蛋白，则如果5’调控序列中启动子的诱导容许编码序列被转录，并且如果编码序列与调控序列之间的联接的性质不会(1)造成移码突变的引入；(2)干扰启动子区指导编码序列的转录的能力、或(3)干扰相应RNA转录物被翻译成蛋白质的能力，则编码序列和调控序列被称为是可操作地连接。

在一些实施方案中，编码本申请中描述的蛋白质中的任何一种或更多种的核酸受调控序列(例如，增强子序列)的控制。在一些实施方案中，核酸在启动子的控制下表达。启动子可以是天然启动子(例如，基因在其内源环境中的启动子，该启动子提供基因表达的正常调控)。可替代地，启动子可以是与基因的天然启动子不同的启动子，例如，启动子与基因在其内源环境中的启动子不同。

本文公开的酶可以由相同的异源多核苷酸或者由不同的异源多核苷酸编码。例如，至少2种、3种、4种、5种、6种、7种、8种、9种、10种或超过10种酶可以由相同的异源多核苷酸编码或者可以由一种或更多种不同的异源多核苷酸编码。

在一些实施方案中，编码1-SST酶的异源多核苷酸也编码1-FFT酶和/或6-SFT酶；编码1-FFT酶的异源多核苷酸也编码1-SST酶和/或6-SFT酶；或者编码6-SFT酶的异源多核苷酸也编码1-SST酶和/或1-FFT酶。

在一些实施方案中，异源多核苷酸包括可操作地连接至编码至少一种酶的多核苷酸的单个启动子。例如，编码至少1种、至少2种、至少3种、至少4种、至少5种、至少6种、至少7种、至少8种、至少9种或至少10种酶的单个核酸可以可操作地连接至单个启动子。可以通过本领域已知的任何方法(包含例如通过内部核糖体进入位点(IRES)或者多肽切割信号(如2A序列))来控制单个异源多核苷酸内酶的表达。

在一些情况下，异源多核苷酸包括超过一个启动子。在一些情况下，单独的启动子可操作地连接至至少两个多核苷酸序列，至少两个多核苷酸序列各自编码用于产生聚果聚糖的酶。在一些情况下，单独的启动子可操作地连接至编码用于产生聚果聚糖的酶的每个多核苷酸序列。

在一些实施方案中，启动子是真核启动子。真核启动子的非限制性实例包含如本领域普通技术人员已知的TDH3、PGK1、PKC1、PDC1、TEF1、TEF2、RPL18B、SSA1、TDH2、PYK1、TPI1 GAL1、GAL10、GAL7、GAL3、GAL2、MET3、MET25、HXT3、HXT7、ACT1、6-SFT1、6-SFT2、CUP1-1、ENO2、pAOX1、pGAP1和SOD1(参见，例如，Addgene网站：blog.addgene.org/plasmids-101-the-promoter-region)。在一些实施方案中，启动子是原核启动子(例如，噬菌体启动子或细菌启动子)。如本领域普通技术人员所已知的，噬菌体启动子的非限制性实例包含Pls1con、T3、T7、SP6和PL。细菌启动子的非限制性实例包含Pbad、PmgrB、Ptrc2、Plac/ara、Ptac和Pm。

在一些实施方案中，启动子是诱导型启动子。如本申请中所使用的，“诱导型启动子”是受到分子的存在或不存在控制的启动子。例如，这可以用于可控地诱导酶的表达。在一些情况下，诱导型启动子用于可控地阻遏酶的表达。诱导型启动子的非限制性实例包含化学调控的启动子和物理调控的启动子。对于化学调控的启动子，转录活性可以由一种或更多种化合物(如醇、四环素、半乳糖、类固醇、金属、或其他化合物)调控。对于物理调控的启动子，转录活性可以受现象(如光或温度)的调控。四环素调控的启动子的非限制性实例包含脱水四环素(aTc)响应性启动子和其他四环素响应性启动子系统(例如，四环素阻遏蛋白(tetR)、四环素操纵子序列(tetO)和四环素反式激活子融合蛋白(tTA))。类固醇调控的启动子的非限制性实例包含基于大鼠糖皮质激素受体、人雌激素受体、蛾蜕皮激素受体的启动子，以及来自类固醇/类维生素A/甲状腺受体超家族的启动子。金属调控的启动子的非限制性实例包含来源于金属硫蛋白(结合并且螯合金属离子的蛋白质)基因的启动子。发病机制调控的启动子的非限制性实例包含由水杨酸、乙烯或苯并噻二唑(BTH)诱导的启动子。温度/热诱导型启动子的非限制性实例包含热激启动子。光调控的启动子的非限制性实例包含来自植物细胞的光响应性启动子。在某些实施方案中，诱导型启动子是半乳糖诱导型启动子。在一些实施方案中，通过一种或更多种生理条件(例如，pH、温度、辐射、渗透压、盐水梯度、细胞表面结合、或者一种或更多种外在诱导剂或内在诱导剂的浓度)来诱导诱导型启动子。外在诱导物或诱导剂的非限制性实例包含氨基酸和氨基酸类似物、糖类和多糖、核酸、蛋白质转录激活子(activator)和阻遏子(repressor)、细胞因子、毒素、石油基化合物、含金属的化合物、盐、离子、酶底物类似物、激素或其任何组合。在一些实施方案中，诱导型启动子是pAOX1启动子。在一些实施方案中，诱导型启动子用于驱动真核细胞中的表达。在一些实施方案中，真核细胞是酵母细胞。在一些实施方案中，酵母细胞是毕赤酵母属细胞。在一些实施方案中，酵母细胞是酵母属细胞。

在一些实施方案中，启动子是组成型启动子。如本申请中所使用的，“组成型启动子”指允许基因的连续转录的未经调控的启动子。组成型启动子的非限制性实例包含TDH3、PGK1、PKC1、PDC1、TEF1、TEF2、RPL18B、SSA1、TDH2、PYK1,TPI1、HXT3、HXT7、ACT1、6-SFT1、6-SFT2、ENO2、pGAP1和SOD1。在一些实施方案中，组成型启动子用于驱动真核细胞中的表达。在一些实施方案中，真核细胞是酵母细胞。在一些实施方案中，酵母细胞是毕赤酵母属细胞。在一些实施方案中，酵母细胞是酵母属细胞。

本领域普通技术人员已知的其他诱导型启动子或组成型启动子也与本公开的方面相容。

基因表达所需的调控序列的确切性质可能在物种或细胞类型之间变化，但通常可以视需要包含分别涉及转录和翻译的起始的5’非转录序列和5’非翻译序列(如TATA框、加帽序列、CAAT序列等)。特别地，这样的5’非转录调控序列可以包含启动子区，该启动子区包含用于可操作地连接的基因的转录控制的启动子序列。调控序列还可以包含增强子序列或上游激活子序列。本申请中公开的运载体可以包含5’前导序列(leader)或信号序列。调控序列还可以包含终止子序列。在一些实施方案中，终止子序列在转录期间标记DNA中基因的末端。适合于诱导异源生物体中的本申请中描述的一个或更多个基因的表达的一种或更多种适当的运载体的选择和设计在本领域普通技术人员的能力和判断范围之内。

含有表达必需元件的表达运载体是可商业获得的，并且是本领域普通技术人员已知的(参见，例如，Sambrook et al.,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,FourthEdition,Cold Spring Harbor Laboratory Press,2012)。

宿主细胞

本公开的蛋白质或酶中的任何一种可以在宿主细胞中表达。术语“宿主细胞”指可以用于表达多核苷酸(如编码在寡糖的产生中使用的酶的多核苷酸)的细胞。

用巴斯德毕赤酵母细胞举例说明所公开的方法、组合物和宿主细胞，但也适用于其他宿主细胞。在本申请中，术语“巴斯德毕赤酵母”与术语“法夫驹形氏酵母(Komagataella phaffii)”可互换地使用。

适合的宿主细胞包含(但不限于)：酵母细胞、细菌细胞、藻类细胞、植物细胞、真菌细胞、昆虫细胞和动物细胞(包含哺乳动物细胞)。在一个说明性实施方案中，适合的宿主细胞包含巴斯德毕赤酵母。

适合的酵母宿主细胞包含(但不限于)：假丝酵母属、埃希氏菌属、汉逊酵母属、酵母属、裂殖酵母属、毕赤酵母属、克鲁维酵母属和耶氏酵母属。在一些实施方案中，酵母细胞是大肠埃希氏菌、多形汉逊酵母、酿酒酵母、卡尔斯伯酵母(Saccaromycescarlsbergensis)、糖化酵母(Saccharomyces diastaticus)、诺地酵母(Saccharomycesnorbensis)、克鲁弗酵母(Saccharomyces kluyveri)、粟酒裂殖酵母、芬兰毕赤酵母(Pichia finlandica)、喜海藻糖毕赤酵母(Pichia trehalophila)、Pichia kodamae、膜蹼毕赤酵母(Pichia membranaefaciens)、仙人掌毕赤酵母(Pichia opuntiae)、耐热毕赤酵母(Pichia thermotolerans)、柳毕赤酵母(Pichia salictaria)、栋树毕赤酵母(Pichiaquercuum)、皮杰普氏毕赤酵母(Pichia pijperi)、树干毕赤酵母(Pichia stipitis)、甲醇毕赤酵母(Pichia methanolica)、安格斯毕赤酵母(Pichia angusta)、乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)、白假丝酵母(Candida albicans)、或解脂耶氏酵母(Yarrowialipolytica)。

在一些实施方案中，酵母菌株是工业多倍体酵母菌株。真菌细胞的其他非限制性实例包含获自曲霉属、青霉属、镰刀菌属、根霉属、支顶孢属、脉孢菌属、粪壳菌属、稻瘟菌属、异水霉属、黑粉菌属、葡萄孢属和木霉属的细胞。

在某些实施方案中，宿主细胞是藻类细胞(如衣藻属(例如，莱茵衣藻)和席藻属(席藻属ATCC29409))。

在其他实施方案中，宿主细胞是原核细胞。适合的原核细胞包含革兰氏阳性细菌细胞、革兰氏阴性细菌细胞和革兰氏不定细菌细胞。宿主细胞可以是(但不限于)：农杆菌属、脂环酸芽孢杆菌属(Alicyclobacillus)、鱼腥藻属、倒囊藻属、不动杆菌属、热酸菌属(Acidothermus)、节杆菌属、固氮菌属、芽孢杆菌属、双歧杆菌属、短杆菌属、丁酸弧菌属、布赫纳氏菌属(Buchnera)、油菜属菌属(Campestris)、弯曲菌属、梭菌属、棒状杆菌属、着色菌属、粪球菌属、埃希氏菌属、肠球菌属、肠杆菌属、欧文氏菌属、梭杆菌属、粪杆菌属、弗朗西斯氏菌属、黄杆菌属、地芽孢杆菌属、嗜血杆菌属、螺杆菌属、克雷伯菌属、乳杆菌属、乳球菌属、泥杆菌属(Ilyobacter)、微球菌属、微杆菌属、中间根瘤菌属(Mesorhizobium)、甲基杆菌属、甲基杆菌属、分枝杆菌属、奈瑟氏菌属、泛菌属、假单胞菌属、原绿球藻(Prochlorococcus)、红细菌属、红假单胞菌属、红假单胞菌属、罗氏菌属(Roseburia)、红螺菌属、红球菌属、栅藻属、链霉菌属、链球菌属、聚球藻属(Synecoccus)、糖单孢菌属、糖多孢菌属、葡萄球菌属、沙雷氏菌属、沙门氏菌属、志贺氏菌属、嗜热厌氧杆菌属(Thermoanaerobacterium)、Tropheryma、Tularensis、Temecula、嗜热聚球藻属(Thermosynechococcus)、热球菌属(Thermococcus)、尿素原体(Ureaplasma)、黄杆菌属、小菌属(Xylella)、耶尔森氏菌属和发酵单胞菌属。

在一些实施方案中，细菌宿主菌株是工业菌株。许多细菌工业菌株是已知的，并且适合于本申请中描述的方法和组合物。

在一些实施方案中，细菌宿主细胞是农杆菌属(例如，放射形农杆菌(A.radiobacter)、发根农杆菌(A.rhizogenes)、悬钩子农杆菌(A.rubi))、节杆菌属(例如，金黄节杆菌(A.aurescens)、柠檬节杆菌(A.citreus)、球形节杆菌(A.globformis)、裂烃谷氨酸节杆菌(A.hydrocarboglutamicus)、迈索尔节杆菌(A.mysorens)、烟草节杆菌(A.nicotianae)、石蜡节杆菌(A.paraffineus)、原玻璃蝇节杆菌(A.protophonniae)、玫瑰色石蜡节杆菌(A.roseoparaffinus)、硫磺节杆菌(A.sulfureus)、产脲节杆菌(A.ureafaciens))、或者芽孢杆菌属(例如，苏云金芽孢杆菌(B.thuringiensis)、炭疽芽孢杆菌(B.anthracis)、巨大芽孢杆菌(B.megaterium)、枯草芽孢杆菌(B.subtilis)、迟缓芽孢杆菌(B.lentus)、环状芽孢杆菌(B.circulars)、短小芽孢杆菌(B.pumilus)、灿烂芽孢杆菌(B.lautus)、凝结芽孢杆菌(B.coagulans)、短芽孢杆菌(B.brevis)、坚强芽孢杆菌(B.firmus)、嗜碱芽孢杆菌(B.alkaophius)、地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)、克劳氏芽孢杆菌(B.clausii)、嗜热脂肪芽孢杆菌(B.stearothermophilus)、耐盐芽孢杆菌(B.halodurans)和解淀粉芽孢杆菌(B.amyloliquefaciens))。在特定实施方案中，宿主细胞是工业芽孢杆菌菌株(包含但不限于枯草芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、克劳氏芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌和解淀粉芽孢杆菌)。在一些实施方案中，宿主细胞是工业梭菌属(例如，丙酮丁醇梭菌(C.acetobutylicum)、破伤风梭菌E88(C.tetaniE88)、象牙海岸梭菌(C.lituseburense)、糖丁基梭菌(C.saccharobutylicum)、产气荚膜梭菌(C.perfringens)、拜氏梭菌(C.beijerinckii))。在一些实施方案中，宿主细胞是工业棒状杆菌属(例如，谷氨酸棒状杆菌(C.glutamicum)、嗜醋酸棒状杆菌(C.acetoacidophilum))。在一些实施方案中，宿主细胞是工业埃希氏菌属(例如，大肠埃希氏菌)。在一些实施方案中，宿主细胞是工业欧文氏菌属(例如，噬夏孢欧文氏菌(E.uredovora)、软腐欧文氏菌(E.carotovora)、菠萝欧文氏菌(E.ananas)、草生欧文氏菌(E.herbicola)、斑点欧文氏菌(E.punctata)、E.terreus)。在一些实施方案中，宿主细胞是工业泛菌属(例如，柠檬泛菌(P.citrea)、成团泛菌(P.agglomerans))。在一些实施方案中，宿主细胞是工业假单胞菌属(例如，恶臭假单胞菌(P.putida)、绿脓假单胞菌(P.aeruginosa)、梅瓦隆假单胞菌(P.mevalonii))。在一些实施方案中，宿主细胞是工业链球菌属(例如，相似型链球菌(S.equisimiles)、酿脓链球菌(S.pyogenes)、乳房链球菌(S.uberis))。在一些实施方案中，宿主细胞是工业链霉菌属(例如，产二素链霉菌(S.ambofaciens)、不产色链霉菌(S.achromogenes)、阿维链霉菌(S.avermitilis)、天蓝色链霉菌(S.coelicolor)、金霉素链霉菌(S.aureofaciens)、金色链霉菌(S.aureus)、杀真菌链霉菌(S.fungicidicus)、灰色链霉菌(S.griseus)、变铅青链霉菌(S.lividans))。在一些实施方案中，宿主细胞是工业发酵单胞菌属(例如，运动发酵单胞菌(Z.mobilis)、解脂发酵单胞菌(Z.lipolytica))。

本公开也适合于与多种动物细胞类型(包含哺乳动物细胞，例如，人类细胞系(包含293细胞、海拉细胞、WI38细胞、PER.C6细胞和Bowes黑素瘤细胞)、小鼠细胞系(包含3T3、NS0、NS1、Sp2/0)、仓鼠细胞系(CHO、BHK)、猴细胞系(COS、FRhL、Vero)和杂交瘤细胞系)使用。

在各种实施方案中，公众易于从多个培养物保藏中心(如美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection)(ATCC)、德国微生物菌种保藏中心(DeutscheSammlung von Mikroorganismen and Zellkulturen GmbH)(DSM)、荷兰微生物菌种保藏中心(Centraalbureau Voor Schimmelcultures)(CBS)和美国农业研究服务专利培养物保藏中心北方地区研究中心(Agricultural Research Service Patent Culture Collection,Northern Regional Research Center)(NRRL)获取可以在本公开的实践中使用的菌株(包含原核菌株和真核菌株两者)。本公开也适合于与多种植物细胞类型使用。

如本申请中所使用的，术语“细胞”可以指单个细胞或细胞群体(如属于相同细胞系或菌株的细胞群体)。不应当将单数术语“细胞”的使用解释为明确地指单个细胞而不是细胞群体。相对于野生型对应物，宿主细胞可以包括基因修饰。

可以使用本领域已知的任何方法将编码本申请中描述的重组多肽(例如，1-SST、1-FFT和/或6-SFT)中任何一种或更多种的运载体引入适合的宿主细胞中。可以在本领域普通技术人员理解的任何适合的条件下培养宿主细胞。例如，可以使用本领域已知的任何培养基、温度和孵育条件。对于携带诱导型运载体的宿主细胞，可以用适当的诱导剂培养细胞以促进表达。

可以在接触和/或核酸的整合之前、在接触和/或核酸的整合期间、和/或在接触和/或核酸的整合之后在任何类型(富集的或基本的)和任何组成的培养基中培养本申请中公开的任何细胞。如本领域普通技术人员所理解的，可以通过常规实验优化培养物或培养过程的条件。在一些实施方案中，选择的培养基补充有各种组分。在一些实施方案中，优化补充组分的浓度和量。在一些实施方案中，通过常规实验优化培养基和生长条件(例如，pH、温度等)的其他方面。在一些实施方案中，优化培养基补充一种或更多种补充组分的频率、以及培养细胞的时间量。

可以在本领域已知且使用的培养容器中进行本申请中描述的细胞的培养。在一些实施方案中，充气反应容器(例如，搅拌釜反应器)用于培养细胞。在一些实施方案中，生物反应器或发酵器用于培养细胞。因此，在一些实施方案中，在发酵中使用细胞。术语“生物反应器”和术语“发酵器”在本申请中可互换地使用，并且指在其中发生生物反应、生物化学反应和/或化学反应(涉及活生物体或活生物体的一部分(包含一种或更多种分泌的酶))的包围物或部分包围物。“大规模生物反应器”或“工业规模生物反应器”是用于以商业规模或准商业规模生成产物的生物反应器。大型生物反应器通常具有在升、数百升、数千升、或更大范围内的体积。

在一些实施方案中，本公开的培养一种或多种细胞的方法包括本申请中描述的酶的过度表达。在一些实施方案中，培养一种或多种细胞的方法还包括分离或纯化由一种或多种细胞表达的酶(例如，在由细胞分泌酶后分离酶)。

生物反应器的非限制性实例包含：搅拌釜发酵器、通过旋转混合装置搅动的生物反应器、恒化器、通过振动装置搅动的生物反应器、气升式发酵器、填充床反应器、固定床反应器、流化床生物反应器、采用波诱导的搅动的生物反应器、离心生物反应器、滚瓶、以及中空纤维生物反应器、滚转器设备(例如，台式种类、推车安装式种类、和/或自动化种类)、竖直堆叠的板、旋转瓶、搅拌瓶或摇动瓶、振动的多孔板、MD瓶、方瓶、洛克斯氏瓶、多表面组织培养繁殖器、改良的发酵器、以及经涂覆的珠(例如，用血清蛋白、硝化纤维素或羧甲基纤维素涂覆的珠以防止细胞附着)。

在一些实施方案中，生物反应器包含细胞培养系统，其中细胞(例如，细菌细胞)与运动的液体和/或气泡接触。在一些实施方案中，细胞或细胞培养物悬浮生长。在其他实施方案中，细胞或细胞培养物附着于固相载体。载体系统的非限制性实例包含微载体(例如，可以是多孔或无孔的聚合物球、微珠和微盘)、带有特定化学基团(例如，叔胺基团)的交联珠(例如，右旋糖酐)、2D微载体(包含捕获在无孔聚合物纤维中的细胞)、3D载体(例如，载体纤维、中空纤维、多筒反应器(multicartridge reactor)、以及可以包括多孔纤维的半渗透膜)、具有降低的离子交换能力的微载体、微囊化细胞、毛细管、以及聚集体。在一些实施方案中，由材料(如右旋糖酐、明胶、玻璃、或纤维素)制造载体。

在一些实施方案中，以连续模式、半连续模式或非连续模式操作工业规模的过程。操作模式的非限制性实例是分批、补料分批(fed batch)、扩展分批(extended batch)、重复分批(repetitive batch)、抽取/填充、旋转壁、旋转瓶、和/或灌注操作模式。在一些实施方案中，生物反应器允许连续或半连续补充底物原料(例如，碳水化合物来源)和/或从生物反应器连续或半连续分离产物。

在一些实施方案中，生物反应器或发酵器包含传感器和/或控制系统以测量和/或调整反应参数。反应参数的非限制性实例包含生物学参数(例如，生长速率、细胞尺寸、细胞数量、细胞密度、细胞类型、或细胞状态等)、化学参数(例如，pH、氧化还原电位、反应底物和/或产物的浓度、溶解的气体的浓度(如氧气浓度和CO₂浓度)、营养物浓度、代谢物浓度、寡肽的浓度、氨基酸的浓度、维生素的浓度、激素的浓度、添加剂的浓度、血清浓度、离子强度、离子的浓度、相对湿度、摩尔浓度、同渗容摩、其他化学物质(例如，缓冲剂、佐剂或反应副产物)的浓度)、物理/机械参数(例如，密度、传导率、搅拌程度、压力、和流速、剪切应力、剪切速率、粘度、颜色、浊度、光吸收、混合速率、转化率、以及热力学参数(如温度、光强度/质量)等)。测量本申请中描述的参数的传感器对于相关机械和电子领域的普通技术人员来说是公知的。控制系统基于来自本申请中描述的传感器的输入来调整生物反应器中的参数是生物反应器工程领域的普通技术人员公知的。

在一些实施方案中，方法涉及分批发酵(例如，摇瓶发酵)。分批发酵(例如，摇瓶发酵)的一般考虑因素包含氧气和葡萄糖的水平。例如，分批发酵(例如，摇瓶发酵)可能受限于氧气和葡萄糖，因此在一些实施方案中，菌株在设计良好的补料分批发酵中进行的能力被低估。另外，最终产物可以在溶解性、毒性、细胞累积和分泌方面显示出与底物的一些差异，并且在一些实施方案中可以具有不同的发酵动力学。

在一些实施方案中，本公开的细胞适合于在体内消耗蔗糖并且产生果聚糖。在一些实施方案中，细胞适合于产生一种或更多种用于经由转化为1-蔗果三糖、6-蔗果三糖和/或菊粉消耗蔗糖的酶(例如，1-SST、1-FFT和/或6-SFT)。在这样的实施方案中，酶可以通过在体外过程中的生物转化来催化用于蔗糖的消耗的反应。

在一些实施方案中，本公开的一种或多种细胞(例如，一种或多种宿主细胞)包括一种或更多种编码1-SST酶、1-FFT酶和/或6-SFT酶的异源多核苷酸。在一些实施方案中，宿主细胞包括一种或更多种编码1-SST酶和1-FFT酶的异源多核苷酸。在一些实施方案中，宿主细胞包括一种或更多种编码1-SST酶和6-SFT酶的异源多核苷酸。在一些实施方案中，宿主细胞包括一种或更多种编码1-FFT酶和6-SFT酶的异源多核苷酸。在一些实施方案中，宿主细胞包括一种或更多种编码1-SST酶、1-FFT酶和6-SFT酶的异源多核苷酸。

就多核苷酸(如包括基因的多核苷酸)而言，术语“异源”与术语“外源的”和术语“重组”可互换地使用，并且指：已经被人工地提供给生物系统的多核苷酸；已经在生物系统内修饰的多核苷酸、或者已经在生物系统内操纵其表达或调控的多核苷酸。被引入宿主细胞中或者在宿主细胞中表达的异源多核苷酸可以是来自与宿主细胞不同的生物体或物种的多核苷酸，或者可以是合成的多核苷酸，或者可以是也在与宿主细胞相同的生物体或物种中内源表达的多核苷酸。例如，当在宿主细胞中内源表达的多核苷酸非天然地位于宿主细胞中；在宿主细胞中稳定或瞬时重组表达；在宿主细胞内被修饰；在宿主细胞内被选择性编辑；在宿主细胞内以不同于天然存在的拷贝数的拷贝数表达；或者在宿主细胞内以非天然方式表达(如通过操纵控制多核苷酸的表达的调控区)时，在宿主细胞中内源表达的多核苷酸可以被认为是异源的。在一些实施方案中，异源多核苷酸是一多核苷酸，所述多核苷酸在宿主细胞中内源表达，但所述多核苷酸的表达由不天然调控多核苷酸表达的启动子驱动。在其他实施方案中，异源多核苷酸是一多核苷酸，所述多核苷酸在宿主细胞中内源表达，并且所述多核苷酸的表达由天然调控多核苷酸表达的启动子驱动，但所述启动子或另外的调控区被修饰。在一些实施方案中，启动子被重组激活或阻遏。例如，基于基因编辑的技术可以用于调控多核苷酸(包含内源多核苷酸)自启动子(包含内源启动子)的表达。参见，例如，Chavez et al.,Nat Methods.2016Jul；13(7):563-567。与参考多核苷酸序列相比，异源多核苷酸可以包括野生型序列或突变序列。

方法

在一些方面，本公开提供包括培养本申请中描述的宿主细胞(例如，包括编码至少一种选自由1-SST、1-FFT和6-SFT组成的组的酶的异源多核苷酸的宿主细胞)的方法。在一些实施方案中，本公开提供由蔗糖产生果聚糖(例如，菊粉)的方法，方法包括培养本申请中描述的宿主细胞(例如，包括编码1-SST、1-FFT和/或6-SFT的异源多核苷酸的宿主细胞)。在一些实施方案中，在体内发生产生和培养。在一些实施方案中，在体外发生一种或更多种产物的产生。在一些实施方案中，使用宿主细胞产生果聚糖的方法包括由细胞分泌表达的酶(例如，1-SST、1-FFT和/或6-SFT)。涉及分泌的酶的方法可以包括使分泌的酶与培养基中或宿主细胞周围溶液中的蔗糖接触。

在一些方面，本公开提供使用分离的或纯化的酶的方法。可以例如在Janson,Protein purification:principles,high resolution methods,and applications,Third Edition(2011)中找到用于蛋白质纯化的非限制性方法。在一些实施方案中，本公开提供包括使糖类与本申请中描述的一种或更多种酶接触(或孵育)以产生果聚糖的方法。在一些实施方案中，产生果聚糖的方法包括使糖类(例如，蔗糖)与下列中的一种或更多种接触：1-SST酶；1-FFT酶；和6-SFT酶。在一些实施方案中，产生果聚糖的方法包括使糖类(例如，蔗糖)与1-SST酶和1-FFT酶接触或孵育。在一些实施方案中，产生果聚糖的方法包括使糖类(例如，蔗糖)与1-SST酶和6-SFT酶接触或孵育。在一些实施方案中，产生果聚糖的方法包括使糖类(例如，蔗糖)与1-FFT酶和6-SFT酶接触或孵育。在一些实施方案中，产生果聚糖的方法包括使糖类(例如，蔗糖)与1-SST酶、1-FFT酶和6-SFT酶接触或孵育。

可以以一方法进行果聚糖的产生，凭借该方法，全部反应在一个反应器(如生物反应器)中进行，这可以称为“一锅法生物转化”。在一些实施方案中，在单个反应器中使用至少两种酶。在一些实施方案中，在单个反应器中使用至少三种酶。

作为一锅法生物转化的非限制性实例，在一些实施方案中，单个菌株可以用于将多种酶分泌至含有蔗糖的培养基中以产生聚果聚糖。在其他实施方案中，可以将各自编码一种或更多种酶的多种菌株组合到单一发酵中，其中其将各自把酶分泌至培养基中。分泌的酶可以将蔗糖转化为支链菊粉。不受特定理论的束缚，从该过程释放的葡萄糖和蔗糖可以用于提高菌株的增加的生物量，并且为支链菊粉的形成提供附加的底物。在一些情况下，一锅法生物转化包括使一种或更多种纯化的酶与底物在单个反应器中孵育以产生聚果聚糖。

在一些情况下，多个反应器用于产生聚果聚糖。超过一个反应器的使用可以称为多锅生物转化。在一些情况下，使用至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个或至少10个反应器。作为非限制性实例，多锅生物转化可以包括使分离的1-SST与蔗糖孵育以形成蔗果三糖。然后，可以分离产生的蔗果三糖，并且与1-FFT和6-SFT孵育以将蔗果三糖转化为支链菊粉。也可以分离所得到的蔗糖和葡萄糖，并且用于宿主细胞生物量累积、用于生物转化或者用于可替代的过程。在一些实施方案中，多锅生物转化包括从一个反应器中纯化感兴趣的产物以及随后将纯化的感兴趣的产物作为底物引入第二反应器中。

在一些情况下，一种或更多种选自1-SST、1-FFT和6-SFT的酶不包括分泌信号。在一些情况下，一种或更多种酶(例如，两种或更多种酶或者三种或更多种酶)通过发酵催化细胞内果聚糖的产生。例如，果聚糖可以在细胞内产生，并且随后从细胞中分泌、从细胞中分离、或者从细胞中纯化。在一些情况下，分泌的果聚糖是另外的反应的底物。在一些情况下，分泌的果聚糖作为另外的反应的底物被细胞输入。在一些情况下，果聚糖在细胞内产生，并且随后从细胞中分离或纯化。分离或纯化的果聚糖可以用作另外的反应的底物。

在一些方面，本公开提供产生果聚糖的方法，方法包括首先使蔗糖与1-SST酶接触以产生蔗果三糖(例如，1-蔗果三糖)；以及随后使蔗果三糖(例如，1-蔗果三糖)与1-FFT酶和/或6-SFT酶接触以产生果聚糖。在一些实施方案中，这样的两步法包括宿主细胞(例如，包括1-SST、1-FFT和/或6-SFT)的使用和/或分离的酶(例如，1-SST、1-FFT和/或6-SFT)的使用。在一些实施方案中，通过使蔗糖与1-SST酶接触产生的蔗果三糖在与1-FFT酶和/或6-SFT酶接触之前被纯化。

产生果聚糖的方法可以包括根据本领域已知的任何分离或纯化技术分离或纯化离开宿主细胞和/或酶的所述果聚糖。

通过以下实施例进一步阐明本发明，但不应当将以下实施例解释为限制。贯穿本申请所引用的全部参考文献(包含文献参考、授权专利、公布的专利申请、以及待审专利申请)的全部内容特此通过引用被明确并入。如果并入本申请的参考文献含有定义与本公开中定义的相同术语的定义不一致或不相容的术语，则应当以本公开中归于该术语的含义为准。对本申请中引用的任何参考文献、文章、出版物、专利、专利公布和专利申请的提及不被认为是其构成有效现有技术或者形成世界上任何国家中的公知常识的一部分的承认或任何形式的暗示，也不应当被认为其构成有效现有技术或者形成本领域技术人员的公知常识的一部分的承认或暗示。

实施例

为了可以更充分地理解本申请中描述的发明，示出下列实施例。本申请中描述的实施例被提供以阐明本申请中提供的系统和方法，并且不被解释为限制其范围。

实施例1：酶库设计和筛选

酶发现

基于机器学习的生物信息学工具用于在公共序列数据库(SwissProt和TrEMBL，一起被称为UniProt)中针对三种期望的酶促活性(1-SST、1-FFT和6-SFT)中的每种鉴别候选酶。针对活性中的每种对152种酶的单一库进行测试。

库合成

全部1-SST酶、1-FFT酶和6-SFT酶的DNA序列都被编码以用于在巴斯德毕赤酵母中表达。在T7启动子的控制下在诱导型巴斯德毕赤酵母表达运载体中合成编码序列。

细胞生长和酶制备

将具有库质粒的菌株转化到巴斯德毕赤酵母表达宿主细胞中。酶被分泌到培养基中，从细胞中去除，并且浓缩。

酶筛选

生物转化反应涉及将单独的酶与蔗糖或1-蔗果三糖孵育96小时。随后通过煮沸停止反应。使样品经受高效液相色谱，并且通过折光率检测器(HPLC-RID)进行分析。

如图3A中所示，涉及单独的酶与蔗糖的孵育的反应提供所得的产物混合物，可以针对其包括β(2,6)键的果聚糖的浓度和包括β(2,1)键的果聚糖(对应于1-蔗果三糖)的浓度对所得的产物混合物进行定量。与蔗糖的孵育鉴别具有6-SFT活性或1-SST活性的酶。1-SST酶产生高水平的3-糖寡糖，3-糖寡糖在HPLC上与蔗果三糖共迁移。与1-SST的孵育不产生较长的糖聚合物。6-SFT酶产生高水平的包括β(2,6)键的高分子量寡糖。在聚合蔗糖中显示出最小活性的一些酶表现出转化酶活性，并且产生高水平的葡萄糖和果糖。

如图3B中所示，涉及单独的酶与1-蔗果三糖的孵育的反应提供所得的产物混合物，可以针对其包括β(2,1)键的菊粉(标记为“耐斯糖”)的浓度和更高阶蔗果三糖分子的浓度对所得的产物混合物进行定量。与蔗果三糖的孵育鉴别具有1-FFT活性的酶。针对高水平的4+含糖寡糖对反应进行测定，从而造成作为副产物的蔗糖的产生。许多酶生成这些高分子量物质。另一类酶(蔗果糖酶)形成蔗糖，但在聚合高分子量寡糖方面未显示出任何活性。

通过计算HPLC色谱的曲线下面积来定量所产生的聚果聚糖。图4(顶部图片)中示出生物转化反应(与蔗糖孵育的单独的酶)的HPLC色谱图的实例。图4(底部图片)中还示出可商业获得的标准品的制剂的HPLC色谱图。

实施例2：高性能酶的表征

选择性能最佳的酶用于进一步开发。实施例1中显示出6-SFT活性、1-SST活性或1-FFT活性的单独的酶被重新表达、分离、并且测定产生果聚糖的能力。在通过HPLC-RID分析生物转化反应并且与糖类标准品进行比较之前，使酶制剂与蔗糖或1-蔗果三糖孵育。通过HPLC保留时间鉴别峰，并且通过HPLC积分的相对峰面积来定量蔗糖至其他糖类的转化。表2中提供的酶代表三类酶(6-SFT、1-SST和1-FFT)中的每类的最具活性的酶。“高活性”指被测试的蛋白质的最高活性。针对功能性对全部蛋白质进行测试，并且根据其在聚合糖类方面的活性进行等级排序。将SEQ ID NO:3-4修饰成包含巴斯德毕赤酵母的分泌信号，并且经修饰的构建体(分别为SEQ ID NO:25和SEQ ID NO:27)也被鉴别为具有1-SST活性。还将SEQID NO:9-10修饰成包含巴斯德毕赤酵母的分泌信号，并且经修饰的构建体(分别为SEQ IDNO:32和SEQ ID NO:34)被鉴别为具有1-FFT活性。还将SEQ ID NO:15-21修饰成包含巴斯德毕赤酵母的分泌信号，并且经修饰的构建体(分别为SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:41、SEQ IDNO:43、SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:49和SEQ ID NO:51)被鉴别为具有6-SFT活性。

表2.性能最佳的酶

酶	SEQ ID NO(氨基酸)	SEQ ID NO(DNA)
			1-SST	1	5
1-FFT	7	11
			6-SFT	13	22

实施例3：蔗糖至支链菊粉的生物转化-“一锅”生物转化

使用表2中描述的酶，进行蔗糖至支链菊粉的生物转化。如图5中所示，可以使用1-SST酶将蔗糖(葡萄糖和果糖的二聚体)转化为1-蔗果三糖(包括β(2,1)键)。然后，1-FFT酶催化线性菊粉的形成，线性菊粉自身可以与6-SFT酶反应以提供β(2,6)支链菊粉。

在单个反应中混合三种酶(1-SST、1-FFT和6-SFT)，并且与蔗糖孵育96小时。在96小时之后，通过煮沸停止反应。通过HPLC-RID和气相色谱/质谱(GC/MS)测定至支链菊粉的生物转化。基于HPLC洗脱时间鉴别糖类。如图6A中所示，较高分子量的糖类(n＝3至n＝6)被鉴别为在蔗糖之前洗脱的HPLC峰。该一锅法转化反应显示出葡萄糖形成的增加以及早期洗脱的高分子量材料的形成，这与该峰代表支链菊粉的假设一致。该材料与标准品的比较表明，这由聚合度大于3(DP3)的材料组成。葡萄糖不与菊粉(支链或其他)共洗脱。反应的HPLC测定显示出葡萄糖的高释放作为正在产生支链菊粉(作为早洗脱峰)的样品中的后洗脱峰(参见，例如，图6A)。

然后，GC/MS用于鉴别该生物转化产物混合物中β(2,1)键和β(2,6)两者的存在。使用4步法进行GC/MS分析之前的衍生化，4步法由下列组成：1)使游离醇-OH基团甲基化；

2)水解糖键；3)还原酮基和醛基；以及4)使步骤3期间形成的醇-OH基团酰化。按照该方案，通过GC/MS分析样品，GC/MS显示出具有公认洗脱顺序和特征片段化模式的一系列产物(图6C-图6D)。生物转化样品的GC/MS造成指示β(2,6)支链菊粉的特征。生物转化样品在28.71分钟处包括峰，该峰是已知的支链糖(“最佳基准”)的特性。值得注意的是，在线性糖类(菊苣；Nicie)的GC/MS分析中未发现该特征峰。

实施例4：蔗糖至支链菊粉的生物转化-“两锅”生物转化

使分离的1-SST酶与蔗糖孵育以形成蔗果三糖。分离蔗果三糖，并且然后与1-FFT酶和6-SFT酶孵育，1-FFT酶和6-SFT酶将蔗果三糖转化为支链菊粉。

可以分离所得到的蔗糖和葡萄糖，并且用于宿主细胞生物量累积、生物转化的材料、或者可替代的过程。

序列

1-SST序列的非限制性实例

(SEQ ID NO：1；分泌信号被加以下划线)

(SEQ ID NO：2；分泌信号被加以下划线)

(SEQID NO：3；分泌信号被加以下划线)

(SEQ ID NO：25；分泌信号被加以下划线)

(SEQ ID NO：4；分泌信号被加以下划线)

(SEQ ID NO：27；分泌信号被加以下划线)

来自高羊茅的1-SST：

1-FFT序列的非限制性实例

(SEQ ID NO：7；分泌信号被加以下划线)

(SEQ ID NO：8；分泌信号被加以下划线)

(SEQ ID NO：9；分泌信号被加以下划线)

(SEQ ID NO：32；分泌信号被加以下划线)

(SEQ ID NO：10；分泌信号被加以下划线)

(SEQ ID NO：34；分泌信号被加以下划线)

来自硬叶蓝刺头的1-FFT：

6-SFT序列的非限制性实例

(SEQ ID NO：13；分泌信号被加以下划线)

(SEQ ID NO：14；分泌信号被加以下划线)

(SEQ ID NO：15；分泌信号被加以下划线)

(SEQ ID NO：39；分泌信号被加以下划线)

(SEQ ID NO：16；分泌信号被加以下划线)

(SEQ ID NO：41；分泌信号被加以下划线)

(SEQ ID NO：17；分泌信号被加以下划线)

(SEQ ID NO：43；分泌信号被加以下划线)

(SEQ ID NO：45；分泌信号被加以下划线)

(SEQ ID NO：19；分泌信号被加以下划线)

(SEQ ID NO：47；分泌信号被加以下划线)

(SEQ ID NO：20；分泌信号被加以下划线)

(SEQ ID NO：21；分泌信号被加以下划线)

(SEQ ID NO：51；分泌信号被加以下划线)

来自梯牧草的6-SFT：

等同物

本领域技术人员仅使用常规实验就将认识到或能够确知本申请中描述的本发明的具体实施方案的许多等同物。这样的等同物旨在由以下权利要求书涵盖。

本申请中公开的全部参考文献(包含专利文件)通过引用被整体(特别是本申请中引用的公开内容)并入本文。

应当理解的是，本申请中公开的序列可以含有分泌信号或者可以不含有分泌信号。本申请中公开的序列涵盖具有分泌信号的型式或者不具有分泌信号的型式。还应当理解的是，本申请中公开的蛋白质序列可以描述为具有起始密码子(M)或者不具有起始密码子(M)。本申请中公开的序列涵盖具有起始密码子的型式或者不具有起始密码子的型式。因此，在一些情况下，氨基酸编号可以对应于含有起始密码子的蛋白质序列，而在其他情况下，氨基酸编号可以对应于不含有起始密码子的蛋白质序列。还应当理解的是，本申请中公开的序列可以描述为具有终止密码子或者不具有终止密码子。本申请中公开的序列涵盖具有终止密码子的型式或者不具有终止密码子的型式。本公开的方面涵盖包括本申请中描述的序列中的任何一种及其片段的宿主细胞。

序列表

<110> 银杏生物制品公司

<120> 寡糖的产生

<130> G0919.70034WO00

<140> 尚未分配

<141> 同此同时

<150> US 62/905,246

<151> 2019-09-24

<160> 63

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 651

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 1

Met Arg Phe Pro Ser Ile Phe Thr Ala Val Leu Phe Ala Ala Ser Ser

1 5 10 15

Ala Leu Ala Ala Pro Val Asn Thr Thr Thr Glu Asp Glu Thr Ala Gln

20 25 30

Ile Pro Ala Glu Ala Val Ile Gly Tyr Ser Asp Leu Glu Gly Asp Phe

35 40 45

Asp Val Ala Val Leu Pro Phe Ser Asn Ser Thr Asn Asn Gly Leu Leu

50 55 60

Phe Ile Asn Thr Thr Ile Ala Ser Ile Ala Ala Lys Glu Glu Gly Val

65 70 75 80

Ser Leu Glu Lys Arg Glu Ala Glu Ala Asn Leu Met Arg Leu Arg Glu

85 90 95

Asn Asp Tyr Pro Trp Thr Asn Asp Met Leu Arg Trp Gln Arg Thr Gly

100 105 110

Phe His Phe Gln Pro Gly Lys Asn Phe Gln Ala Asp Pro Asn Ala Ala

115 120 125

Met Phe Tyr Lys Gly Trp Tyr His Phe Phe Tyr Gln Tyr Asn Pro Thr

130 135 140

Gly Val Ala Trp Asp Tyr Thr Ile Ser Trp Gly His Ala Val Ser Lys

145 150 155 160

Asp Leu Leu His Trp Asn Tyr Leu Pro Met Ala Leu Arg Pro Asp His

165 170 175

Trp Tyr Asp Arg Lys Gly Val Trp Ser Gly Tyr Ser Thr Leu Leu Pro

180 185 190

Asp Gly Arg Ile Val Val Leu Tyr Thr Gly Gly Thr Lys Glu Leu Val

195 200 205

Gln Val Gln Asn Leu Ala Val Pro Val Asn Leu Ser Asp Pro Leu Leu

210 215 220

Leu Glu Trp Lys Lys Ser His Val Asn Pro Ile Leu Val Pro Pro Pro

225 230 235 240

Gly Ile Glu Asp His Asp Phe Arg Asp Pro Phe Pro Val Trp Tyr Asn

245 250 255

Glu Ser Asp Ser Arg Trp His Val Val Ile Gly Ser Lys Asp Pro Glu

260 265 270

His Tyr Gly Ile Val Leu Ile Tyr Thr Thr Lys Asp Phe Val Asn Phe

275 280 285

Thr Leu Leu Pro Asn Ile Leu His Ser Thr Lys Gln Pro Val Gly Met

290 295 300

Leu Glu Cys Val Asp Leu Phe Pro Val Ala Thr Thr Asp Ser Arg Ala

305 310 315 320

Asn Gln Ala Leu Asp Met Thr Thr Met Arg Pro Gly Pro Gly Leu Lys

325 330 335

Tyr Val Leu Lys Ala Ser Met Asp Asp Glu Arg His Asp Tyr Tyr Ala

340 345 350

Leu Gly Ser Phe Asp Leu Asp Ser Phe Thr Phe Thr Pro Asp Asp Glu

355 360 365

Thr Ile Asp Val Gly Ile Gly Leu Arg Tyr Asp Trp Gly Lys Phe Tyr

370 375 380

Ala Ser Lys Thr Phe Tyr Asp Gln Glu Lys Gln Arg Arg Val Leu Trp

385 390 395 400

Gly Tyr Val Gly Glu Val Asp Ser Lys Arg Asp Asp Ala Leu Lys Gly

405 410 415

Trp Ala Ser Leu Gln Asn Ile Pro Arg Thr Ile Leu Phe Asp Thr Lys

420 425 430

Thr Lys Ser Asn Leu Ile Leu Trp Pro Val Glu Glu Val Glu Ser Leu

435 440 445

Arg Thr Ile Asn Lys Asn Phe Asn Ser Ile Pro Leu Tyr Pro Gly Ser

450 455 460

Thr Tyr Gln Leu Asp Val Gly Glu Ala Thr Gln Leu Asp Ile Val Ala

465 470 475 480

Glu Phe Glu Val Asp Glu Lys Ala Ile Glu Ala Thr Ala Glu Ala Asp

485 490 495

Val Thr Tyr Asn Cys Ser Thr Ser Gly Gly Ala Ala Asn Arg Gly Val

500 505 510

Leu Gly Pro Phe Gly Leu Leu Val Leu Ala Asn Gln Glu Leu Ser Glu

515 520 525

Gln Thr Ala Thr Tyr Phe Tyr Val Ser Arg Gly Ile Asp Gly Asn Leu

530 535 540

Arg Thr His Phe Cys Gln Asp Glu Leu Arg Ser Ser Lys Ala Gly Ala

545 550 555 560

Ile Thr Lys Arg Val Val Gly Ser Thr Val Pro Val Leu His Gly Glu

565 570 575

Thr Trp Ala Leu Arg Ile Leu Val Asp His Ser Ile Val Glu Ser Phe

580 585 590

Ala Gln Arg Gly Arg Ala Val Ala Thr Ser Arg Val Tyr Pro Thr Glu

595 600 605

Ala Ile Tyr Ser Ser Ala Arg Val Phe Leu Phe Asn Asn Ala Thr Asp

610 615 620

Ala Ile Val Thr Ala Lys Thr Val Asn Val Trp His Ile Asn Ser Thr

625 630 635 640

Tyr Asn His Val Phe Pro Gly Leu Val Ala Pro

645 650

<210> 2

<211> 621

<212> PRT

<213> 太匮龙舌兰

<400> 2

Met Ala Ser Ser Thr Lys Asp Val Glu Ala Pro Pro Thr Leu Asp Ala

1 5 10 15

Pro Leu Leu Gly Pro Ala Ala Pro Arg Ser Arg Leu Arg Val Ala Pro

20 25 30

Val Ser Leu Ser Val Met Ala Phe Leu Leu Val Ala Ile Ala Ala Ala

35 40 45

Val Leu Tyr Tyr Asn Pro Gly Gly Val Ala Ser Asn Leu Met Arg Leu

50 55 60

Arg Glu Asn Asp Tyr Pro Trp Thr Asn Asp Met Leu Arg Trp Gln Arg

65 70 75 80

Thr Gly Phe His Phe Gln Pro Gly Lys Asn Phe Gln Ala Asp Pro Asn

85 90 95

Ala Ala Met Phe Tyr Lys Gly Trp Tyr His Phe Phe Tyr Gln Tyr Asn

100 105 110

Pro Thr Gly Val Ala Trp Asp Tyr Thr Ile Ser Trp Gly His Ala Val

115 120 125

Ser Lys Asp Leu Leu His Trp Asn Tyr Leu Pro Met Ala Leu Arg Pro

130 135 140

Asp His Trp Tyr Asp Arg Lys Gly Val Trp Ser Gly Tyr Ser Thr Leu

145 150 155 160

Leu Pro Asp Gly Arg Ile Val Val Leu Tyr Thr Gly Gly Thr Lys Glu

165 170 175

Leu Val Gln Val Gln Asn Leu Ala Val Pro Val Asn Leu Ser Asp Pro

180 185 190

Leu Leu Leu Glu Trp Lys Lys Ser His Val Asn Pro Ile Leu Val Pro

195 200 205

Pro Pro Gly Ile Glu Asp His Asp Phe Arg Asp Pro Phe Pro Val Trp

210 215 220

Tyr Asn Glu Ser Asp Ser Arg Trp His Val Val Ile Gly Ser Lys Asp

225 230 235 240

Pro Glu His Tyr Gly Ile Val Leu Ile Tyr Thr Thr Lys Asp Phe Val

245 250 255

Asn Phe Thr Leu Leu Pro Asn Ile Leu His Ser Thr Lys Gln Pro Val

260 265 270

Gly Met Leu Glu Cys Val Asp Leu Phe Pro Val Ala Thr Thr Asp Ser

275 280 285

Arg Ala Asn Gln Ala Leu Asp Met Thr Thr Met Arg Pro Gly Pro Gly

290 295 300

Leu Lys Tyr Val Leu Lys Ala Ser Met Asp Asp Glu Arg His Asp Tyr

305 310 315 320

Tyr Ala Leu Gly Ser Phe Asp Leu Asp Ser Phe Thr Phe Thr Pro Asp

325 330 335

Asp Glu Thr Ile Asp Val Gly Ile Gly Leu Arg Tyr Asp Trp Gly Lys

340 345 350

Phe Tyr Ala Ser Lys Thr Phe Tyr Asp Gln Glu Lys Gln Arg Arg Val

355 360 365

Leu Trp Gly Tyr Val Gly Glu Val Asp Ser Lys Arg Asp Asp Ala Leu

370 375 380

Lys Gly Trp Ala Ser Leu Gln Asn Ile Pro Arg Thr Ile Leu Phe Asp

385 390 395 400

Thr Lys Thr Lys Ser Asn Leu Ile Leu Trp Pro Val Glu Glu Val Glu

405 410 415

Ser Leu Arg Thr Ile Asn Lys Asn Phe Asn Ser Ile Pro Leu Tyr Pro

420 425 430

Gly Ser Thr Tyr Gln Leu Asp Val Gly Glu Ala Thr Gln Leu Asp Ile

435 440 445

Val Ala Glu Phe Glu Val Asp Glu Lys Ala Ile Glu Ala Thr Ala Glu

450 455 460

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Asn Leu Arg Thr His Phe Cys Gln Asp Glu Leu Arg Ser Ser Lys Ala

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Gly Ala Ile Thr Lys Arg Val Val Gly Ser Thr Val Pro Val Leu His

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<212> PRT

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Val Ser Phe Lys Val Lys Glu Leu Glu Lys Ala Asp Val Ile Glu Pro

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Ser Arg Ser Ser Leu Asn Asp Glu Asn Asp Lys Ser Thr Phe Gly Ala

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500 505 510

Ile Asp His Ser Ile Val Glu Ser Tyr Gly Gly Gly Gly Arg Thr Cys

515 520 525

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Ser Ala Trp Ser Leu Lys Ser Ala Gln Ile Asn Gly Asp Leu Met Ser

565 570 575

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<210> 4

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<212> PRT

<213> 石刁柏

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Met Ala Ser Pro Ser Asp Leu Glu Ser Pro Pro Thr Leu Ser Ala Gln

1 5 10 15

Leu Leu Glu Ser Arg Pro Pro Arg Ser Lys Leu Arg Leu Val Ala Leu

20 25 30

Thr Leu Thr Ala Ala Ala Phe Leu Val Ala Leu Ala Leu Phe Leu Ala

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Asp Gly Ser Ala Ser Arg Phe Val Ser Gly Leu Ala Arg Lys Leu Arg

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Gly Ser Lys Asp Ser Asn His His Gly Ile Val Leu Leu Tyr Lys Thr

245 250 255

Lys Asp Phe Phe Asn Phe Thr Leu Leu Pro Ser Leu Leu His Thr Ser

260 265 270

Thr Gln Ser Val Gly Met Phe Glu Cys Val Asp Leu Tyr Pro Val Ala

275 280 285

Thr Gly Gly Pro Leu Ser Asn Arg Gly Leu Glu Met Ser Val Asp Leu

290 295 300

Ser Asn Gly Gly Ile Lys His Val Leu Lys Ala Ser Met Asp Glu Glu

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Arg His Asp Tyr Tyr Ala Ile Gly Thr Phe Asp Leu Asp Ser Phe Lys

325 330 335

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Asp Trp Gly Lys Phe Tyr Ala Ser Lys Thr Phe Phe Asp Thr Glu Lys

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385 390 395 400

Ile Leu Leu Asp Thr Lys Thr Gln Ser Asn Leu Ile Ile Trp Pro Val

405 410 415

Glu Glu Val Glu Asp Leu Arg Thr Asp Gly Asn Ile Phe Asn Asp Ile

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Ser Ser Lys Ala Gly Asp Ile Val Lys Arg Val Val Gly Ser Val Val

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<212> DNA

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tctctcgaga aaagagaggc tgaagctaac ttgatgcgtt taagagagaa tgattatccc 300

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aaaggtgttt ggagcggtta ctctacttta ttgccagacg gtagaattgt tgtcttgtac 600

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ggcaagttct acgcgtccaa gactttttac gaccaagaaa aacaaagaag agttttgtgg 1200

ggatacgtcg gtgaagttga ctcgaagcgt gatgatgctc tgaaaggttg ggcttctttg 1260

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ccagttgaag aagtcgagtc tttaagaact attaacaaga atttcaattc aatccctttg 1380

tatcctggtt ctacttacca gcttgatgtg ggtgaagcta cccaattgga tattgtggcc 1440

gagttcgaag tcgatgaaaa ggctattgaa gctactgccg aagctgatgt tacatataac 1500

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gatggtaact taagaacaca tttttgtcaa gacgaactgc gatcttccaa ggctggtgcc 1680

atcactaagc gggtagttgg ttctaccgtc ccagttctac atggcgaaac ctgggccttg 1740

agaattttgg tcgatcactc aatcgtagag tcttttgcac agagaggtag agctgttgcc 1800

acgagtagag tctatcctac agaagcaatt tatagctcag ctagagtctt tctattcaac 1860

aatgccactg acgctattgt taccgctaag acagtaaacg tttggcacat caactccacc 1920

tacaatcatg tttttccggg tctggtcgct cca 1953

<210> 6

<211> 654

<212> PRT

<213> 高羊茅

<400> 6

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<211> 631

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 7

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Leu Arg Ser Asn Val Arg Glu Phe Lys Glu Met Thr Leu Glu Pro Gly

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485 490 495

Ser Phe Gly Pro Phe Gly Ile Ala Val Leu Ala Asp Gly Thr Leu Ser

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515 520 525

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530 535 540

Asp Ser Glu Lys Val Val Tyr Gly Ser Thr Ile Pro Val Leu Asp Gly

545 550 555 560

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565 570 575

Phe Ala Gln Gly Gly Arg Thr Val Ile Thr Ser Arg Val Tyr Pro Thr

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Lys Ala Ile Tyr Glu Gly Ala Lys Leu Phe Val Phe Asn Asn Ala Thr

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<212> PRT

<213> 牛蒡

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Arg Leu Leu Ile Arg Val Leu Ser Ser Ile Thr Phe Val Ser Leu Phe

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Pro Ala Lys Asn Phe Ile Tyr Asp Pro Asn Gly Pro Leu Phe His Met

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Gly Val Leu Ser Gly Ser Thr Thr Ala Leu Pro Asn Gly Gln Ile Phe

165 170 175

Ala Leu Tyr Thr Gly Asn Ala Asn Asp Phe Ser Gln Leu Gln Cys Lys

180 185 190

Ala Val Pro Val Asp Val Ser Asp Pro Leu Leu Val Lys Trp Val Lys

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Tyr Asp Gly Asn Pro Ile Leu Tyr Thr Pro Pro Gly Ile Gly Leu Lys

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Asp Tyr Arg Asp Pro Ser Thr Val Trp Thr Gly Pro Asp Gly Lys His

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Arg Met Ile Met Gly Thr Lys Arg Gly Thr Thr Gly Leu Val Leu Val

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Tyr His Thr Thr Asp Phe Thr Asn Tyr Val Met Leu Asp Glu Pro Leu

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His Ser Val Pro Asn Thr Asp Met Trp Glu Cys Val Asp Leu Phe Pro

275 280 285

Val Ser Thr Thr Asn Asp Ser Ala Leu Asp Ile Ala Ala Tyr Gly Ser

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Phe Tyr Ser Ile Gly Thr Tyr Asp Ala Ile Asn Asp Lys Trp Thr Pro

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Asp Asn Pro Glu Leu Asp Val Gly Ile Gly Leu Arg Cys Asp Tyr Gly

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Leu Ser Glu Leu Thr Pro Val Tyr Phe Tyr Ile Ala Lys Asn Thr Lys

500 505 510

Gly Gly Val Asp Thr His Phe Cys Thr Asp Lys Leu Arg Ser Ser Leu

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Asp Tyr Asp Ser Glu Lys Val Val Tyr Gly Ser Thr Ile Pro Val Leu

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<211> 622

<212> PRT

<213> 橡胶草

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<212> PRT

<213> 短角蒲公英

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Phe Val Leu Ala Phe Val Leu Ile Val Leu Asn Gln Gln Asp Ser Thr

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Gly His Gly Met Asp Leu Tyr Ser Ile Gly Thr Tyr Asp Ala Tyr Lys

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<210> 12

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<212> PRT

<213> 硬叶蓝刺头

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Ile Asn Asp Lys Trp Trp Pro Asp Asn Pro Glu Leu Asp Leu Gly Met

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 13

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<213> 普那菊苣

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Arg Met Val Met Gly Ser Lys His Asn Glu Thr Ile Gly Cys Ala Leu

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Val Tyr Arg Thr Thr Asn Phe Thr His Phe Glu Leu Asn Glu Glu Val

275 280 285

Leu His Ala Val Pro His Thr Gly Met Trp Glu Cys Val Asp Leu Tyr

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Pro Asn Val Lys Tyr Ile Leu Lys Gln Ser Gly Asp Glu Asp Arg His

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Leu Arg Pro Gly Ser Leu Ile Pro Leu Glu Ile Gly Thr Ala Thr Gln

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Leu Asp Ile Ser Ala Thr Phe Glu Ile Asp Glu Lys Lys Leu Glu Ser

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485 490 495

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Ser Lys Asp Lys Asp Val Gly Lys Trp Val Tyr Gly Ser Ser Val Pro

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<212> PRT

<213> 西尔斯山羊草

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Leu Pro Asn Gly Thr Val Ile Met Ile Tyr Thr Gly Ala Thr Asn Ala

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Ser Ala Val Glu Val Gln Cys Ile Ala Thr Pro Ala Asp Pro Asn Asp

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195 200 205

Ser Pro Pro Gly Val Gly Thr Lys Asp Phe Arg Asp Ser Met Thr Ala

210 215 220

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<211> 616

<212> PRT

<213> 未知

<220>

<223> 硬粒小麦

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<212> PRT

<213> 未知

<220>

<223> 硬粒小麦

<400> 17

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<210> 18

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<212> PRT

<213> 小麦

<400> 18

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<212> PRT

<213> 洋葱

<400> 19

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Lys Gly Ile Lys His Val Leu Lys Ala Ser Met Asp Asp Glu Arg His

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325 330 335

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340 345 350

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355 360 365

Arg Ile Leu Trp Gly Tyr Val Gly Glu Val Asp Ser Lys Ala Asp Asp

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Ile Leu Lys Gly Trp Ala Ser Val Gln Asn Ile Ala Arg Thr Ile Leu

385 390 395 400

Phe Asp Ala Lys Thr Arg Ser Asn Leu Leu Val Trp Pro Val Glu Glu

405 410 415

Leu Asp Ala Leu Arg Thr Ser Gly Lys Glu Phe Asn Gly Val Val Val

420 425 430

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435 440 445

Asp Ile Glu Ala Glu Phe Glu Ile Asn Lys Glu Ala Val Asp Ala Val

450 455 460

Val Glu Ala Asp Val Thr Tyr Asn Cys Ser Thr Ser Asp Gly Ala Ala

465 470 475 480

His Arg Gly Leu Leu Gly Pro Phe Gly Leu Leu Val Leu Ala Asn Glu

485 490 495

Lys Met Thr Glu Lys Thr Ala Thr Tyr Phe Tyr Val Ser Arg Asn Val

500 505 510

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515 520 525

Lys Ala Asn Asp Ile Thr Lys Arg Val Val Gly His Thr Val Pro Val

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<210> 20

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<212> PRT

<213> 太匮龙舌兰

<400> 20

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Leu Leu Leu Glu Trp Lys Lys Ser His Val Asn Pro Ile Leu Val Pro

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Tyr Asn Glu Ser Asp Ser Arg Trp His Val Val Ile Gly Ser Lys Asp

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Pro Glu His Tyr Gly Ile Val Leu Ile Tyr Thr Thr Lys Asp Phe Val

245 250 255

Asn Phe Thr Leu Leu Pro Asn Ile Leu His Ser Thr Lys Gln Pro Val

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275 280 285

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Leu Lys Tyr Val Leu Lys Ala Ser Met Asp Asp Glu Arg His Asp Tyr

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Tyr Ala Leu Gly Ser Phe Asp Leu Asp Ser Phe Thr Phe Thr Pro Asp

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Asp Glu Thr Ile Asp Val Gly Val Gly Leu Arg Tyr Asp Trp Gly Lys

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Leu Trp Gly Tyr Val Gly Glu Val Asp Ser Lys Arg Asp Asp Ala Leu

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Val Ala Glu Phe Glu Val Asp Glu Lys Ala Ile Glu Ala Thr Ala Glu

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565 570 575

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<210> 21

<211> 623

<212> PRT

<213> 洋葱

<400> 21

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Leu Gln Thr Ser Pro Pro Ile Lys Ser Ser Lys Leu Lys Val Ala Leu

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Leu Ala Thr Ser Thr Ser Val Leu Leu Leu Ile Ala Ala Phe Phe Ala

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Asp Tyr Tyr Ala Ile Gly Thr Phe Asp Leu Glu Ser Phe Ser Trp Val

325 330 335

Pro Asp Asp Asp Thr Ile Asp Val Gly Val Gly Leu Arg Tyr Asp Tyr

340 345 350

Gly Lys Phe Tyr Ala Ser Lys Thr Phe Tyr Asp Gln Glu Lys Lys Arg

355 360 365

Arg Ile Leu Trp Gly Tyr Val Gly Glu Val Asp Ser Lys Ala Asp Asp

370 375 380

Ile Leu Lys Gly Trp Ala Ser Val Gln Asn Ile Ala Arg Thr Ile Leu

385 390 395 400

Phe Asp Ala Lys Thr Arg Ser Asn Leu Leu Val Trp Pro Val Glu Glu

405 410 415

Leu Asp Ala Leu Arg Thr Ser Gly Lys Glu Phe Asn Gly Val Val Val

420 425 430

Glu Pro Gly Ser Thr Tyr His Leu Asp Val Gly Thr Ala Thr Gln Leu

435 440 445

Asp Ile Glu Ala Glu Phe Glu Ile Asn Lys Glu Ala Val Asp Ala Val

450 455 460

Val Glu Ala Asp Val Thr Tyr Asn Cys Ser Thr Ser Asp Gly Ala Ala

465 470 475 480

His Arg Gly Leu Leu Gly Pro Phe Gly Leu Leu Val Leu Ala Asn Glu

485 490 495

Lys Met Thr Glu Lys Thr Ala Thr Tyr Phe Tyr Val Ser Arg Asn Ala

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Asp Gly Gly Leu Gln Thr His Phe Cys Gln Asp Glu Leu Arg Ser Ser

515 520 525

Lys Ala Asn Asp Ile Thr Lys Arg Val Val Gly His Thr Val Pro Val

530 535 540

Leu His Gly Glu Thr Phe Ser Leu Arg Ile Leu Val Asp His Ser Ile

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Val Glu Ser Phe Ala Gln Lys Gly Arg Ala Val Ala Thr Ser Arg Val

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Tyr Pro Thr Glu Ala Ile Tyr Asp Ser Thr Arg Val Phe Leu Phe Asn

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Asn Ala Thr Ser Ala Thr Val Thr Ala Lys Ser Val Lys Ile Trp His

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Met Asn Ser Thr His Asn His Pro Phe Pro Gly Phe Pro Ala Pro

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<210> 22

<211> 1917

<212> DNA

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<220>

<223> 合成的

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tctctcgaga aaagagaggc tgaagctgta cccggtaaat tagaatcgaa tgccgatgtc 300

gagtggcaac gttctgcata ccattttcag ccagacaaga acttcatatc cgatcctgac 360

ggcccaatgt atcacatggg atggtaccac ctattctacc aatataaccc ggaatcagct 420

atttggggga atatcacttg gggtcatagt gtgtctaggg acatgattaa ctggtttcac 480

ttgccattcg ctatggttcc agatcattgg tacgacatcg aaggtgttat gaccggtagc 540

gctacggttc ttcctaacgg tcaaatcatt atgttgtata ctggtaatgc gtacgatttg 600

tctcaattgc aatgcttagc ttatgccgtc aactcctcag atccactact cttggaatgg 660

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aagcacaacg agacaatcgg atgtgctttg gtctatcgaa ctaccaattt cactcacttt 840

gaacttaacg aagaagtttt acatgctgta ccacacacag gaatgtggga atgtgtggat 900

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gaagctgacg ttttattcaa ctgtacaact tcagaaggtt ccgtcggtag aggtgttcta 1500

ggccctttcg gtatcgttgt cttggctgat gctaacagat ccgaacaatt gccagtttac 1560

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gagggtgaaa actataatat gagattgctc gtcgatcatt cgattgtaga aggttttgcc 1740

caagggggta gaaccgttgt cacctctcgc gtttatccaa cgatggcaat ctacggtgcc 1800

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<210> 23

<211> 623

<212> PRT

<213> 梯牧草

<400> 23

Met Ala Pro Pro Gln Ala Ile Ala Asn Gly Ala Pro Ala Pro Leu Pro

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Tyr Ala Tyr Ala Arg Leu Pro Ser Ser Gly Asp Glu Lys Gln Asp Gln

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Ser Glu Val Leu Tyr Val Ile Lys Ala Ser Met Asp Asp Glu Arg His

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Asp Tyr Tyr Ala Leu Gly Met Tyr Asp Ala Ala Ala Asn Thr Trp Thr

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Thr Arg Gly Ala Leu Gly Pro Phe Gly Leu Leu Val Leu Ala Ala Glu

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Asn Ala Thr Asn Ala Ser Val Thr Ala Glu Arg Ile Ile Val His Glu

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<212> PRT

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<220>

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Gly Ala Ala Asn Arg Gly Val Leu Gly Pro Phe Gly Leu Leu Val Leu

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Ala Asn Gln Glu Leu Ser Glu Gln Thr Ala Thr Tyr Phe Tyr Val Ser

435 440 445

Arg Gly Ile Asp Gly Asn Leu Arg Thr His Phe Cys Gln Asp Glu Leu

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Val Pro Val Leu His Gly Glu Thr Trp Ala Leu Arg Ile Leu Val Asp

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500 505 510

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Ala Pro

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 25

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<220>

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180 185 190

Asp Gly Arg Val Ile Val Leu Tyr Thr Gly Gly Thr Pro Glu Leu Val

195 200 205

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Gly Ile Gly Thr Ser Asp Phe Arg Asp Pro Phe Pro Ile Trp Tyr Asn

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His His Gly Ile Val Leu Leu Tyr Lys Thr Lys Asp Phe Phe Asn Phe

275 280 285

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290 295 300

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Asn Arg Gly Leu Glu Met Ser Val Asp Leu Ser Asn Gly Gly Ile Lys

325 330 335

His Val Leu Lys Ala Ser Met Asp Glu Glu Arg His Asp Tyr Tyr Ala

340 345 350

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<211> 565

<212> PRT

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<220>

<223> 合成的

<400> 28

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Trp Gly His Ala Val Ser Arg Asp Leu Ile His Trp Leu His Leu Pro

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Met Ala Met Val Pro Asp His Trp Tyr Asp Ala Lys Gly Val Trp Ser

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Gly Tyr Ser Thr Leu Leu Pro Asp Gly Arg Val Ile Val Leu Tyr Thr

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Gly Gly Thr Pro Glu Leu Val Gln Val Gln Asn Leu Ala Val Pro Ala

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Asp Ala Ser Asp Pro Leu Leu Leu Lys Trp Lys Lys Ser Ser Val Asn

130 135 140

Pro Ile Leu Val Pro Pro Pro Gly Ile Gly Thr Ser Asp Phe Arg Asp

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Pro Phe Pro Ile Trp Tyr Asn Glu Thr Asp Ser Asn Trp His Val Leu

165 170 175

Ile Gly Ser Lys Asp Ser Asn His His Gly Ile Val Leu Leu Tyr Lys

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Thr Lys Asp Phe Phe Asn Phe Thr Leu Leu Pro Ser Leu Leu His Thr

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Ser Thr Gln Ser Val Gly Met Phe Glu Cys Val Asp Leu Tyr Pro Val

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Ala Thr Gly Gly Pro Leu Ser Asn Arg Gly Leu Glu Met Ser Val Asp

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Leu Ser Asn Gly Gly Ile Lys His Val Leu Lys Ala Ser Met Asp Glu

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Glu Arg His Asp Tyr Tyr Ala Ile Gly Thr Phe Asp Leu Asp Ser Phe

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Lys Trp Thr Pro Asp Asp Pro Ser Ile Asp Val Gly Val Gly Leu Arg

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Tyr Asp Trp Gly Lys Phe Tyr Ala Ser Lys Thr Phe Phe Asp Thr Glu

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Lys Gln Arg Arg Ile Leu Trp Gly Tyr Val Gly Glu Val Asp Ser Lys

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Asp Asp Asp Lys Met Lys Gly Trp Ala Thr Leu Gln Asn Ile Pro Arg

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Val Glu Glu Val Glu Asp Leu Arg Thr Asp Gly Asn Ile Phe Asn Asp

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Ile Lys Ile Gly Ala Gly Ser Ser Val Gln Leu Asp Ile Gly Ala Ala

370 375 380

Ser Gln Leu Asp Ile Glu Ala Glu Phe Glu Leu Asp Asn Ser Ala Leu

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Asp Gly Ala Ile Glu Ala Asp Val Thr Tyr Asn Cys Ser Thr Ser Gly

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Gly Ala Ala Asn Arg Gly Leu Leu Gly Pro Phe Gly Leu Leu Val Leu

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Ala Asn Gln Asp Leu Thr Glu Gln Thr Ala Thr Tyr Phe Tyr Val Ser

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Arg Gly Thr Asp Gly Asp Leu Arg Thr His Phe Cys Gln Asp Glu Leu

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Arg Ser Ser Lys Ala Gly Asp Ile Val Lys Arg Val Val Gly Ser Val

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Val Pro Val Leu His Gly Glu Thr Trp Ser Leu Arg Ile Leu Val Asp

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His Ser Ile Ile Glu Ser Phe Ala Gln Arg Gly Arg Ala Val Ala Thr

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Ser Arg Val Tyr Pro Thr Glu Ala Ile Tyr Asn Lys Ala Arg Leu Phe

515 520 525

Leu Phe Asn Asn Ala Thr Asp Ala Lys Val Thr Ala Lys Ser Val Lys

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Ile Trp His Met Asn Ser Thr His Asn His Pro Phe Pro Gly Leu Glu

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Ser Leu Phe Glu Ser

565

<210> 29

<211> 1947

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 29

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<210> 30

<211> 1965

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 30

atgagatttc cttcaatttt tactgctgtt ttattcgcag catcctccgc attagctgct 60

ccagtcaaca ctacaacaga agatgaaacg gcacaaattc cggctgaagc tgtcatcggt 120

tactcagatt tagaagggga tttcgatgtt gctgttttgc cattttccaa cagcacaaat 180

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tctctcgaga aaagagaggc tgaagctaga tcagatccta ttaaagagca tgactatcca 300

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<210> 31

<211> 542

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 31

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Pro Asp Gly Lys His Arg Met Ile Met Gly Thr Lys Arg Gly Thr Thr

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Ala Ala Tyr Gly Ser Gly Ile Lys His Val Leu Lys Glu Ser Trp Glu

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Gly His Ala Met Asp Phe Tyr Ser Ile Gly Thr Tyr Asp Ala Ile Asn

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Arg Thr Ile Val Leu Asp Arg Lys Thr Gly Thr His Leu Leu Gln Trp

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Pro Val Glu Glu Leu Glu Ser Leu Arg Ser Asn Val Arg Glu Phe Lys

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Glu Met Thr Leu Glu Pro Gly Ser Ile Val Pro Leu Asp Ile Gly Ser

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Ala Thr Gln Leu Asp Ile Ile Ala Thr Phe Glu Val Asp Gln Glu Ala

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Leu Lys Ala Thr Ser Asp Ala Asn Asp Glu Tyr Ala Cys Thr Thr Ser

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Ser Gly Ala Ala Glu Arg Gly Ser Phe Gly Pro Phe Gly Ile Ala Val

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Leu Ala Asp Gly Thr Leu Ser Glu Leu Thr Pro Val Tyr Phe Tyr Ile

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Ala Lys Asn Thr Lys Gly Gly Val Asp Thr His Phe Cys Thr Asp Lys

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Leu Arg Ser Ser Leu Asp Tyr Asp Ser Glu Lys Val Val Tyr Gly Ser

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 32

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Ile Pro Ala Glu Ala Val Ile Gly Tyr Ser Asp Leu Glu Gly Asp Phe

35 40 45

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Ser Leu Glu Lys Arg Glu Ala Glu Ala Ser Ser Val Lys His Ser Gln

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Lys His Val Ile Lys Glu Ser Trp Glu Gly His Gly Met Asp Leu Tyr

325 330 335

Ser Ile Gly Thr Tyr Asp Ala Tyr Lys Asp Lys Trp Thr Pro Asp Asn

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Trp Gly Tyr Val Ala Glu Ser Asp Ser Ser Asp Gln Asp Leu Asn Arg

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Ser Ile Ile Pro Leu Asp Ile Gly Met Ala Thr Gln Leu Asp Ile Val

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 34

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515 520 525

Leu Val Thr His Phe Cys Thr Asp Lys Leu Arg Ser Ser Leu Asp Tyr

530 535 540

Asp Gly Glu Arg Val Val Tyr Gly Gly Thr Val Pro Val Leu Asp Gly

545 550 555 560

Glu Glu Leu Thr Met Arg Leu Leu Val Asp His Ser Val Val Glu Gly

565 570 575

Phe Ala Gln Gly Gly Arg Thr Val Ile Thr Ser Arg Val Tyr Pro Thr

580 585 590

Asn Ala Ile Tyr Glu Glu Ala Lys Ile Phe Leu Phe Asn Asn Ala Thr

595 600 605

Gly Ala Ser Val Lys Ala Ser Leu Lys Ile Trp Gln Met Gly Ser Ala

610 615 620

Ser Ile Gln Ala Tyr Pro Phe

625 630

<210> 35

<211> 542

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 35

Ser Ser Val Lys His Ser Gln Ser Asp Arg Leu Arg Trp Glu Arg Thr

1 5 10 15

Ala Tyr His Phe Gln Pro Ala Lys Asn Phe Ile Tyr Asp Pro Asn Gly

20 25 30

Pro Leu Phe His Met Gly Trp Tyr His Leu Phe Tyr Gln Tyr Asn Pro

35 40 45

Tyr Ala Pro Ile Trp Gly Asn Met Ser Trp Gly His Ala Val Ser Lys

50 55 60

Asp Met Ile His Trp Phe Glu Leu Pro Val Ala Met Val Pro Thr Glu

65 70 75 80

Trp Tyr Asp Ile Glu Gly Val Leu Ser Gly Ser Thr Thr Ala Leu Pro

85 90 95

Asn Gly Gln Ile Phe Ala Leu Tyr Thr Gly Asn Ala Lys Asp Phe Ser

100 105 110

Gln Leu Gln Cys Lys Ala Val Pro Leu Asn Ala Ser Asp Pro Leu Leu

115 120 125

Val Asp Trp Val Lys Tyr Glu Asp Asn Pro Ile Leu Tyr Ile Pro Pro

130 135 140

Gly Ile Gly Pro Lys Asp Tyr Arg Asp Pro Ser Thr Val Trp Thr Gly

145 150 155 160

Pro Asp Gly Lys His Arg Met Ile Met Gly Thr Lys Gln Asn Gly Thr

165 170 175

Gly Met Val His Val Tyr His Thr Thr Asp Phe Ile Asn Tyr Val Leu

180 185 190

Leu Asp Glu Pro Leu His Ser Val Pro Asn Thr Asp Met Trp Glu Cys

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Val Asp Phe Tyr Pro Val Ser Thr Ile Asn Asp Ser Ala Leu Asp Ile

210 215 220

Ala Ala Tyr Gly Ser Asp Ile Lys His Val Ile Lys Glu Ser Trp Glu

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Gly His Gly Met Asp Leu Tyr Ser Ile Gly Thr Tyr Asp Ala Tyr Lys

245 250 255

Asp Lys Trp Thr Pro Asp Asn Pro Glu Leu Asp Val Gly Ile Gly Leu

260 265 270

Arg Val Asp Tyr Gly Arg Leu Phe Ala Ser Lys Ser Leu Tyr Asp Pro

275 280 285

Leu Lys Lys Arg Arg Val Thr Trp Gly Tyr Val Gly Glu Ser Asp Ser

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Pro Asp Gln Asp Ile Asn Arg Gly Trp Ala Thr Ile Tyr Asn Val Gly

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Arg Thr Val Val Leu Asp Arg Lys Thr Gly Thr His Leu Leu His Trp

325 330 335

Pro Val Glu Glu Ile Glu Ser Leu Arg Ser Asn Val Arg Glu Phe Asn

340 345 350

Glu Ile Glu Leu Val Pro Gly Ser Ile Ile Pro Leu Asp Ile Gly Met

355 360 365

Ala Thr Gln Leu Asp Ile Val Ala Thr Phe Lys Val Asp Pro Glu Ala

370 375 380

Leu Met Ala Lys Ser Asp Ile Asn Ser Glu Tyr Gly Cys Thr Thr Ser

385 390 395 400

Ser Gly Ala Thr Gln Arg Gly Ser Leu Gly Pro Phe Gly Ile Val Val

405 410 415

Leu Ala Asp Leu Ala Leu Ser Glu Leu Thr Pro Leu Tyr Phe Tyr Ile

420 425 430

Ala Lys Asn Thr Asp Gly Gly Leu Val Thr His Phe Cys Thr Asp Lys

435 440 445

Leu Arg Ser Ser Leu Asp Tyr Asp Gly Glu Arg Val Val Tyr Gly Gly

450 455 460

Thr Val Pro Val Leu Asp Gly Glu Glu Leu Thr Met Arg Leu Leu Val

465 470 475 480

Asp His Ser Val Val Glu Gly Phe Ala Gln Gly Gly Arg Thr Val Ile

485 490 495

Thr Ser Arg Val Tyr Pro Thr Asn Ala Ile Tyr Glu Glu Ala Lys Ile

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Ile Trp Gln Met Gly Ser Ala Ser Ile Gln Ala Tyr Pro Phe

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<210> 36

<211> 1896

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 36

atgagatttc cttcaatttt tactgctgtt ttattcgcag catcctccgc attagctgct 60

ccagtcaaca ctacaacaga agatgaaacg gcacaaattc cggctgaagc tgtcatcggt 120

tactcagatt tagaagggga tttcgatgtt gctgttttgc cattttccaa cagcacaaat 180

aacgggttat tgtttataaa tactactatt gccagcattg ctgctaaaga agaaggggta 240

tctctcgaga aaagagaggc tgaagctagt tccgttaaac attctcagtc agatcgattg 300

aggtgggaac gtactgccta ccactttcaa ccagcaaaga acttcatata tgaccctaat 360

ggtccacttt tccacatggg atggtaccat ctattttacc aatataaccc gtatgctcca 420

atttggggca atatgtcttg gggtcacgct gtgtccaagg acatgatcca ttggttcgag 480

ctgcccgtcg ctatcgttcc aacggaatgg tacgatattg aaggtgtatt aagcggttcg 540

acaactgcgt tgccaaacgg tcaaattttc gccttgtaca ccggtaatgc taaggatttt 600

tctcaattac aatgcaaagc tgtccctttg aacgcttccg acccattgtt ggttgaatgg 660

gttaagtacg aagataaccc tatcctatat attccaccag gcatcggtcc taaggactac 720

agagatccat ctaccgtgtg gacaggtcca gatggtaaac acagaatgat tatgggaacc 780

aagcaaaacg gtactgggat ggttcatgtc taccacacca ctgactttat aaattatgtc 840

ttattagacg agccgttgca ctccgtccca aacaccgata tgtgggaatg tgtggacttc 900

tacccagtat ctactatcaa tgacagcgcg ttggatattg cagcctacgg ttcagacatc 960

aagcatgtta taaaagaatc ttgggaaggt catggtatgg atttatactc tattggtact 1020

tatgacgctt acaaggataa gtggacgcca gataaccccg agttcgatgt tgggattggt 1080

ctgagagttg attacggcag attctttgct tccaagagct tgtacgaccc gttgaagaag 1140

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ggttgggcca caatctataa cgttggtaga actgtcgtct tggaccggaa aaccggtaca 1260

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aatgaaattg aattggttcc aggatcgatc ataccattgg atattggtat ggctactcaa 1380

ttggacatcg ttgccacctt caaagtagac ccagaagctc ttatggctaa gtccgatatt 1440

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agtttggact acgatggaga aagagttgtt tacggttcaa ctgttccagt cttggacggt 1680

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<210> 37

<211> 1896

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 37

atgagatttc cttcaatttt tactgctgtt ttattcgcag catcctccgc attagctgct 60

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<210> 38

<211> 549

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 38

Val Pro Gly Lys Leu Glu Ser Asn Ala Asp Val Glu Trp Gln Arg Ser

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 39

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Asp Trp Asp Asp Gly Met Glu Trp Gly His Ala Val Ser Arg Asn Leu

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<213> 人工序列

<220>

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Asp Glu Glu Ala Ala Gly Gly Phe Pro Trp Ser Asn Glu Met Leu Gln

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Asp Pro Asn Gly Leu Met Tyr Tyr Arg Gly Trp Tyr His Met Phe Phe

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435 440 445

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<210> 41

<211> 644

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

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Ser Leu Glu Lys Arg Glu Ala Glu Ala Asp Glu Glu Ala Ala Gly Gly

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Phe Pro Trp Ser Asn Glu Met Leu Gln Trp Gln Arg Ser Gly Tyr His

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Phe Gln Thr Ala Lys Asn Tyr Met Ser Asp Pro Asn Gly Leu Met Tyr

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Asp Trp Asp Asp Gly Met Glu Trp Gly His Ala Val Ser Arg Asn Leu

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Asp Ile Leu Gly Val Leu Ser Gly Ser Met Thr Val Leu Pro Asn Gly

180 185 190

Thr Val Ile Met Ile Tyr Thr Gly Ala Thr Asn Ala Ser Ala Val Glu

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Val Gln Cys Ile Ala Thr Pro Ala Asp Pro Thr Asp Pro Leu Leu Arg

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Arg Trp Thr Lys His Pro Ala Asn Pro Val Ile Trp Ser Pro Pro Gly

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Val Gly Thr Lys Asp Phe Arg Asp Pro Met Thr Ala Trp Tyr Asp Glu

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Ser Asp Asp Thr Trp Arg Thr Leu Leu Gly Ser Lys Asp Asp Asn Asn

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Gly His His Asp Gly Ile Ala Met Met Tyr Lys Thr Lys Asp Phe Leu

275 280 285

Asn Tyr Glu Leu Ile Pro Gly Ile Leu His Arg Val Glu Arg Thr Gly

290 295 300

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Pro

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tactcagatt tagaagggga tttcgatgtt gctgttttgc cattttccaa cagcacaaat 180

aacgggttat tgtttataaa tactactatt gccagcattg ctgctaaaga agaaggggta 240

tctctcgaga aaagagaggc tgaagctgac gaagaggctg ccggtggatt tccctggtca 300

aacgaaatgt tacaatggca gagatccggt taccacttcc aaacagcaaa aaattatatg 360

tctgatccta acggcctaat gtactatagg ggttggtacc atatgttctt ccaatacaac 420

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tggagaacgc tattgggctc taaggatgac aataatggtc accacgacgg tattgctatg 840

atgtacaaaa ctaaggattt cttgaactac gagctgattc ctggtatcct ccatagagtt 900

gaaagaacag gagaatggga atgcatagac ttttatccgg tcggtcgtag aacctctgat 960

aactcgtccg aaatgttgca tgttttaaag gcttccatgg atgacgagag acacgactac 1020

tactctctag gtacttatga tagtgccgcc aataggtgga ctccaattga cccagaattg 1080

gatttgggta ttggtttgag atatgactgg gggaaattct acgcttccac cagcttctat 1140

gatcccgcaa agaagagaag agttttgatg ggttacgtcg gtgaagtgga ctctaaacgc 1200

gctgacgttg ttaagggttg ggcctctatc caaagtgtcc cacgcaccat tgctctggac 1260

gaaaaaactc gtacaaacct tttattgtgg ccagtagaag aaatcgaaac cttaagattg 1320

aacgctactg agttgtccga cgttacttta aacactggtt ccgtcatcca cattccattg 1380

agacagggaa cccaattgga tattgaagca acctttcatc tcgatgcgag tgctgttgca 1440

gctttcaatg aagctgatgt cggttacaat tgttcatctt cgggtggtgc tgttaataga 1500

ggtgctctag ggcctttcgg cctcttagtc ttggctgccg gtgatagaag aggtgaacaa 1560

accgctgttt acttttacgt atctcgtggt ttggacggcg gtctacacac ctctttttgt 1620

caggatgagt taagatcctc aagggctaag gacgttacta agagagtcat aggatcaact 1680

gtgcccgttt tggatggtga agccttttct atgcgtgtac ttgttgatca ttccatagtc 1740

caaggtttcg caatgggtgg tagaacaact atgacgagca gagtttatcc aatggaagcg 1800

taccaagaag ctaaggttta tcttttcaac aacgcaacag gtgcctctgt tacagccgag 1860

agattggtcg tacacgaaat ggactccgcc cacaaccaat tgtcgaacat ggacgaccac 1920

tcgtatgttc aataa 1935

<210> 55

<211> 1950

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 55

atgagatttc cttcaatttt tactgctgtt ttattcgcag catcctccgc attagctgct 60

ccagtcaaca ctacaacaga agatgaaacg gcacaaattc cggctgaagc tgtcatcggt 120

tactcagatt tagaagggga tttcgatgtt gctgttttgc cattttccaa cagcacaaat 180

aacgggttat tgtttataaa tactactatt gccagcattg ctgctaaaga agaaggggta 240

tctctcgaga aaagagaggc tgaagctagt ggcccttatt ctgcttcggg tggttttcca 300

tggtctaatg ccatgttgca gtggcaacgt acaggatacc acttccaacc cgaaaaaaac 360

taccaaaacg acccaaacgg tccagtctac tataagggtt ggtatcattt cttttaccaa 420

cataatccag gtggtaccgg gtggggtaac atctcatggg gtcacgcagt ttccagagat 480

atggtacact ggaggcattt accactagct atggttcctg agcattggta cgatatagaa 540

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ccactgttga gagaatgggc taagcacccg gccaacccag tagtttaccc gccaccaggt 720

atcggtatga aagactacag agatccaact acagcttggt tcgataactc agacaatacc 780

tggagaataa tcattggttc taagaatgat actgatcact ctggtatcgt ttttacttac 840

aagaccaagg acttcgtcag ctacgaactg attcctggat acctatatag aggtccagcc 900

gggacgggta tgtacgaatg cattgatttg ttcgctgttg gtggtgggcg tgctgcatca 960

gatatgtata actctaccgc tgaagatgtc ttatacgttt tgaaagaatc ctccgacgac 1020

gacagacggg attactatgc cttagggcga tttgacgctg ccgctaatac ttggacaccc 1080

atagatacag aaagagagtt gggtgtcgca ctcagatatg attacggtag atacgatact 1140

tctaagtctt tctacgaccc agttaagcaa aggagaattg tctggggtta cgttgtcgaa 1200

accgacagtt ggtccgctga cgctgcaaaa ggttgggcta acctgcaatc tatccctaga 1260

actgttgaat tggatgaaaa gactcgaaca aaccttgtac agtggccagt gggtgagttg 1320

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ttgacagaac agaccgctgt ttatttttat gtttccaagg gtttagacgg tggtttacga 1620

acccacttct gtcatgacga attgaggtct acacacgcta ccgacgtcgc caaggaggtt 1680

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tccattaccg cagaaaaatt ggtggtacat gacatggatt cctcctacaa cagaatcttt 1920

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<210> 56

<211> 1935

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 56

atgagatttc cttcaatttt tactgctgtt ttattcgcag catcctccgc attagctgct 60

ccagtcaaca ctacaacaga agatgaaacg gcacaaattc cggctgaagc tgtcatcggt 120

tactcagatt tagaagggga tttcgatgtt gctgttttgc cattttccaa cagcacaaat 180

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ggtcccgtct actacggagg ttggtatcac tttttctacc aatataatcc gtctggtagt 420

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cacttaccac cagctttggt cccagatcaa tggtacgaca taaagggtgt tctaaccggg 540

tcaattacgg tccttcctga tggtaaggtg atcttgttat atactggtaa tacagaaacc 600

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<210> 57

<211> 1953

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 57

atgagatttc cttcaatttt tactgctgtt ttattcgcag catcctccgc attagctgct 60

ccagtcaaca ctacaacaga agatgaaacg gcacaaattc cggctgaagc tgtcatcggt 120

tactcagatt tagaagggga tttcgatgtt gctgttttgc cattttccaa cagcacaaat 180

aacgggttat tgtttataaa tactactatt gccagcattg ctgctaaaga agaaggggta 240

tctctcgaga aaagagaggc tgaagctgac gatcctccat ctgatagtga agattaccca 300

tggaccaatg agatgcttaa atggcaaagg acgggttatc acttccagcc cccaaaccat 360

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aaaggagttt ggtccggcta cgctactact ttgccagatg gtagaataat tgtcttgtat 600

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gatccactat tgatcgaatg gaagaagtca aacggaaacc caattttgat gcctccgccg 720

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acatggcaca tgttgatcgg ttctaaagat gacaatcact acggtaccgt tctaatttat 840

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tacgttggtg aagtagactc taaggctgac gacatcttaa aaggttgggc gagcgttcaa 1260

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tccacatctg atggtgctgc tcacagaggt ttgttgggac cattcggtct tttggtttta 1560

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gggggtctac aaactcattt ctgtcaagac gagcttagaa gctctaaagc taacgatatt 1680

accaaacgtg tcgttggcca cactgttcca gttctgcatg gtgaaacctt ctccttgaga 1740

attttagtag accactcgat cgttgaatcg tttgcgcaga agggtagagc agtcgctacg 1800

tctagggtgt atccaactga agctatctac gattctacaa gagttttcct cttcaacaac 1860

gccacttcag ctacggtcac tgccaagtcc gtaaagatat ggcatatgaa cagtacccat 1920

aaccaccctt ttccaggttt ccccgcacca taa 1953

<210> 58

<211> 1956

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 58

atgagatttc cttcaatttt tactgctgtt ttattcgcag catcctccgc attagctgct 60

ccagtcaaca ctacaacaga agatgaaacg gcacaaattc cggctgaagc tgtcatcggt 120

tactcagatt tagaagggga tttcgatgtt gctgttttgc cattttccaa cagcacaaat 180

aacgggttat tgtttataaa tactactatt gccagcattg ctgctaaaga agaaggggta 240

tctctcgaga aaagagaggc tgaagctaac ttgatgcgtt taagagagaa tgattatccc 300

tggactaacg acatgctaag atggcaacgc acgggatttc acttccagcc tgaaaaaaac 360

ttccaagccg acccaaatgc agctatgttt tacaagggct ggtaccattt cttttatcaa 420

tacaacccga ccggtgtggc ttgggattac acaatctcct ggggtcacgc tgtcagtaag 480

gatttgctgc attggaatta tcttccaatg gccttgaggc ctgaccactg gtacgataga 540

aaaggtgttt ggagcggtta ctctacttta ttgccagacg gtagaattgt tgtcttgtac 600

accggtggaa ctaaggaatt agttcaagtc caaaacttgg ctgtcccagt aaacctttct 660

gacccattgc tattggaatg gaagaagtca cacgttaacc caatactcgt tccacctccg 720

gggatcgagg atcatgattt ccgagatcca ttcccagtgt ggtataatga atctgactcg 780

cggtggcacg ttgtaattgg ttccaaagat ccagaacact atggtattgt cttgatctac 840

actaccaagg acttcgttaa ctttacgtta ttaccaaaca tattgcattc caccaagcag 900

ccggttggta tgctggaatg tgtagacttg ttcccagttg ctacaactga ttctcgtgca 960

aatcaagctt tggatatgac taccatgagg cccggtcctg gcctcaaata tgtgttaaag 1020

gcgagtatgg atgacgaaag acacgattac tacgccctag gtagctttga cttggactcg 1080

ttcactttta caccagatga tgaaaccatt gacgtcggtg tcggtttgag atacgactgg 1140

ggtaagttct atgcttcaaa aactttctat gaccaagaaa agcatagaag agttttatgg 1200

ggttacgtgg gggaagttga ttctaagaga gatgacgcgt taaaaggctg ggcttccttg 1260

caaaacatcc caagaacaat tttgttcgat accaaaacta agtctaatct aatcttgtgg 1320

ccagttgaag aggtcgaatc attgagaact attaacaaga attttaactc tataccactt 1380

tacccaggtt ccacttacca attggatgtt ggggaagcca cccaactgga tattgtcgct 1440

gaatttgaag tcgatgagaa ggctattgaa gcaactgctg aagctgacgt tacatataac 1500

tgctctacca gcggtggtgc cgctaacaga ggtgttttgg gtcctttcgg tctattggtt 1560

ctagccaatc aagaactttc cgaacagact gccacttact tctatgtatc gcgtggtatc 1620

gacggcaacc tgagaaccca cttttgtcaa gacgaattga gatcctccaa agccggtgct 1680

atcaccaaga gggtcgtagg ttctacagtt cctgttttgc atggtgaaac gtgggcttta 1740

cgtatcctag ttgaccactc tattgtcgag tcttttgcac aacggggacg cgccgtcgct 1800

accagtagag tatacccaac tgaggctata tactcttcgg ctagagtctt tctcttcaat 1860

aacgcaaccg atgccattgt tacagctaaa acggtcaacg tttggcatat gaatagcact 1920

tacaaccacg tctttcctgg tttggttgct ccataa 1956

<210> 59

<211> 1953

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 59

atgagatttc cttcaatttt tactgctgtt ttattcgcag catcctccgc attagctgct 60

ccagtcaaca ctacaacaga agatgaaacg gcacaaattc cggctgaagc tgtcatcggt 120

tactcagatt tagaagggga tttcgatgtt gctgttttgc cattttccaa cagcacaaat 180

aacgggttat tgtttataaa tactactatt gccagcattg ctgctaaaga agaaggggta 240

tctctcgaga aaagagaggc tgaagctgac gatcctccat ctgatagtga agattaccca 300

tggaccaatg agatgcttaa atggcaaagg acgggttatc acttccagcc cccaaaccat 360

tttatggcag acccaaacgc cgctatgtac tacaaggggt ggtatcactt cttttaccaa 420

tataacccta atggttcagc ttgggactac tccatctcgt ggggtcatgc tgtatctaag 480

gacatgattc actggctgca tttaccagtc gccatggttc cagatcattg gtacgatagc 540

aaaggagttt ggtccggcta cgctactact ttgccagatg gtagaataat tgtcttgtat 600

accggtggta cagaccaatt ggttcaagtg caaaatttag ccgaaccagc ggacccttct 660

gatccactat tgatcgaatg gaagaagtca aacggaaacc caattttgat gcctccgccg 720

ggtgtaggtc cacacgattt cagagatcca ttcccagttt ggtacaacga atctgactcc 780

acatggcaca tgttgatcgg ttctaaagat gacaatcact acggtaccgt tctaatttat 840

actactaagg attttgagac atacacttta ttgccagaca tcctacataa gaccaaggac 900

tcggttggta tgttggaatg tgtcgatctt tatccagtgg ctactaccgg gaatcaaatt 960

ggtaacggtt tagaaatgaa aggtggttcc ggcaagggta tcaagcacgt cctgaaggct 1020

tctatggacg atgaacgtca cgattattac gccataggta cgttcgactt ggaatccttt 1080

agttgggttc cggacgacga taccatagat gtcggcgtcg gcttgcgcta tgactacggt 1140

aagttctacg cttcaaaaac tttctatgat caggaaaaga agagaagaat tttgtgggga 1200

tacgttggtg aagtagactc taaggctgac gacatcttaa aaggttgggc gagcgttcaa 1260

aatattgcaa gaactatcct atttgatgca aaaactagaa gtaacttgct cgtctggccc 1320

gtcgaggaat tggacgcttt gcgaacctct ggtaaggaat ttaacggtgt ggttgttgaa 1380

cctggttcta cttaccattt agacgtaggt accgccaccc aattggatat tgaagctgaa 1440

tttgagatca ataaggaagc tgttgacgct gttgtcgaag ccgatgttac atacaactgc 1500

tccacatctg atggtgctgc tcacagaggt ttgttgggac cattcggtct tttggtttta 1560

gctaatgaaa agatgacaga aaaaaccgcc acttatttct acgtcagtcg taacgctgat 1620

gggggtctac aaactcattt ctgtcaagac gagcttagaa gctctaaagc taacgatatt 1680

accaaacgtg tcgttggcca cactgttcca gttctgcatg gtgaaacctt ctccttgaga 1740

attttagtcg atcactcaat tgtcgagtcc ttcgcgcaaa agggtagggc tgttgcaacc 1800

tctcgggtgt atccaactga agccatctac gattctacga gagtttttct cttcaacaac 1860

gctacttcgg caacggtaac tgctaagtcc gtaaagatat ggcatatgaa cagtacccat 1920

aaccaccctt ttccaggttt ccccgcgcca taa 1953

<210> 60

<211> 89

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 60

Met Arg Phe Pro Ser Ile Phe Thr Ala Val Leu Phe Ala Ala Ser Ser

1 5 10 15

Ala Leu Ala Ala Pro Val Asn Thr Thr Thr Glu Asp Glu Thr Ala Gln

20 25 30

Ile Pro Ala Glu Ala Val Ile Gly Tyr Ser Asp Leu Glu Gly Asp Phe

35 40 45

Asp Val Ala Val Leu Pro Phe Ser Asn Ser Thr Asn Asn Gly Leu Leu

50 55 60

Phe Ile Asn Thr Thr Ile Ala Ser Ile Ala Ala Lys Glu Glu Gly Val

65 70 75 80

Ser Leu Glu Lys Arg Glu Ala Glu Ala

85

<210> 61

<211> 267

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 61

atgagatttc cttcaatttt tactgctgtt ttattcgcag catcctccgc attagctgct 60

ccagtcaaca ctacaacaga agatgaaacg gcacaaattc cggctgaagc tgtcatcggt 120

tactcagatt tagaagggga tttcgatgtt gctgttttgc cattttccaa cagcacaaat 180

aacgggttat tgtttataaa tactactatt gccagcattg ctgctaaaga agaaggggta 240

tctctcgaga aaagagaggc tgaagct 267

<210> 62

<211> 1956

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 62

atgagatttc cttcaatttt tactgctgtt ttattcgcag catcctccgc attagctgct 60

ccagtcaaca ctacaacaga agatgaaacg gcacaaattc cggctgaagc tgtcatcggt 120

tactcagatt tagaagggga tttcgatgtt gctgttttgc cattttccaa cagcacaaat 180

aacgggttat tgtttataaa tactactatt gccagcattg ctgctaaaga agaaggggta 240

tctctcgaga aaagagaggc tgaagctaac ttgatgcgtt taagagagaa tgattatccc 300

tggactaacg acatgctaag atggcaacgc acgggatttc acttccagcc tggtaaaaac 360

ttccaagccg acccaaatgc agctatgttt tacaagggct ggtaccattt cttttatcaa 420

tacaacccga ccggtgtggc ttgggattac acaatctcct ggggtcacgc tgtcagtaag 480

gatttgctgc attggaatta tcttccaatg gccttgaggc ctgaccactg gtacgataga 540

aaaggtgttt ggagcggtta ctctacttta ttgccagacg gtagaattgt tgtcttgtac 600

accggtggaa ctaaggaatt agttcaagtc caaaacttgg ctgtcccagt aaacctttct 660

gacccattgc tattggaatg gaagaagtca cacgttaacc caatactcgt tccacctccg 720

gggatcgaag atcatgattt ccgagatcca ttcccagtgt ggtataatga atctgactcg 780

cggtggcacg ttgtaattgg ttccaaagat ccagagcact atggtattgt cttgatctac 840

actaccaagg acttcgttaa ctttacgtta ttaccaaaca tattgcattc caccaagcag 900

ccggttggta tgctggaatg tgtagacttg ttcccagttg ctacaactga ttctcgtgca 960

aatcaagctt tggatatgac taccatgagg cccggtcctg ggctcaaata tgtgttaaag 1020

gcgagtatgg atgacgaaag acacgattac tacgccctag gtagctttga cttggactcg 1080

ttcactttta caccagatga tgaaaccatt gacgtcggta ttggtcttag atacgactgg 1140

ggcaagttct acgcgtccaa gactttttac gaccaagaaa aacaaagaag agttttgtgg 1200

ggatacgtcg gtgaagttga ctcgaagcgt gatgatgctc tgaaaggttg ggcttctttg 1260

caaaatatcc cacgtacaat cttgttcgac accaaaacca agtccaacct aattttgtgg 1320

ccagttgaag aagtcgagtc tttaagaact attaacaaga atttcaattc aatccctttg 1380

tatcctggtt ctacttacca gcttgatgtg ggtgaagcta cccaattgga tattgtggcc 1440

gagttcgaag tcgatgaaaa ggctattgaa gctactgccg aagctgatgt tacatataac 1500

tgctccacct ccggtggtgc agctaataga ggggttttgg gtccattcgg tttgttagtt 1560

ttagctaacc aagagttgtc tgaacaaact gctacttact tctatgtctc tcgcggcata 1620

gatggtaact taagaacaca tttttgtcaa gacgaactgc gatcttccaa ggctggtgcc 1680

atcactaagc gggtagttgg ttctaccgtc ccagttctac atggcgaaac ctgggccttg 1740

agaattttgg tcgatcactc aatcgtagag tcttttgcac agagaggtag agctgttgcc 1800

acgagtagag tctatcctac agaagcaatt tatagctcag ctagagtctt tctattcaac 1860

aatgccactg acgctattgt taccgctaag acagtaaacg tttggcacat caactccacc 1920

tacaatcatg tttttccggg tctggtcgct ccataa 1956

<210> 63

<211> 564

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 63

Gly Ala Arg Val Gly Leu Gly Gly Ile Tyr Asp Asp Ala Asp Ala Phe

1 5 10 15

Ala Trp Asn Asn Ser Met Leu Gln Trp Gln Arg Ala Gly Phe His Phe

20 25 30

Gln Thr Glu Lys Asn Phe Met Ser Asp Pro Asn Gly Pro Val Tyr Tyr

35 40 45

Arg Gly Tyr Tyr His Leu Phe Tyr Gln Tyr Asn Met Lys Gly Val Val

50 55 60

Trp Asp Asp Gly Ile Val Trp Gly His Val Val Ser Arg Asp Leu Val

65 70 75 80

His Trp Arg His Leu Pro Ile Ala Met Val Pro Asp His Trp Tyr Asp

85 90 95

Ser Met Gly Val Leu Ser Gly Ser Ile Thr Val Leu Gln Asn Gly Ser

100 105 110

Leu Val Met Ile Tyr Thr Gly Val Phe Ser Lys Thr Thr Asp Arg Ser

115 120 125

Gly Met Met Glu Val Gln Cys Leu Ala Val Pro Ala Asp Pro Asn Asp

130 135 140

Pro Leu Leu Arg Ser Trp Thr Lys His Pro Ala Asn Pro Val Leu Val

145 150 155 160

His Pro Pro Gly Ile Lys Asp Met Asp Phe Arg Asp Pro Thr Thr Ala

165 170 175

Trp Phe Asp Glu Ser Asp Ser Thr Tyr Arg Thr Val Ile Gly Thr Lys

180 185 190

Asp Asp His His Gly Ser His Ala Gly Phe Ala Met Val Tyr Lys Thr

195 200 205

Lys Asp Phe Leu Ser Phe Gln Arg Ile Pro Gly Ile Leu His Ser Val

210 215 220

Glu His Thr Gly Met Trp Glu Cys Met Asp Phe Tyr Pro Val Gly Gly

225 230 235 240

Gly Asp Asn Ser Ser Ser Glu Val Leu Tyr Val Ile Lys Ala Ser Met

245 250 255

Asp Asp Glu Arg His Asp Tyr Tyr Ala Leu Gly Met Tyr Asp Ala Ala

260 265 270

Ala Asn Thr Trp Thr Pro Leu Asp Gln Glu Leu Asp Leu Gly Ile Gly

275 280 285

Leu Arg Tyr Asp Trp Gly Lys Leu Tyr Ala Ser Thr Thr Phe Tyr Asp

290 295 300

Pro Ala Lys Arg Arg Arg Val Met Leu Gly Tyr Val Gly Glu Thr Asp

305 310 315 320

Ser Arg Arg Ser Asp Glu Ala Lys Gly Trp Ala Ser Ile Gln Ser Ile

325 330 335

Pro Arg Thr Val Ala Leu Asp Glu Lys Thr Arg Thr Asn Leu Leu Leu

340 345 350

Trp Pro Val Glu Glu Ile Glu Thr Leu Arg Leu Asn Ala Thr Glu Phe

355 360 365

Asn Asp Ile Asn Ile Asp Thr Gly Ser Val Phe His Leu Pro Ile Arg

370 375 380

Gln Gly Asn Gln Leu Asp Ile Glu Ala Ser Phe Arg Leu Asp Ala Ser

385 390 395 400

Ala Val Ala Ala Ile Asn Glu Ala Asp Val Gly Tyr Asn Cys Ser Ser

405 410 415

Ser Gly Gly Ala Ala Thr Arg Gly Ala Leu Gly Pro Phe Gly Leu Leu

420 425 430

Val Leu Ala Ala Glu Gly Ile Gly Glu Gln Thr Ala Val Tyr Phe Tyr

435 440 445

Val Ser Arg Gly Leu Asp Gly Gly Leu Arg Thr Ser Phe Cys Asn Asp

450 455 460

Glu Leu Arg Ser Ser Trp Ala Arg Asp Val Thr Lys Arg Val Val Gly

465 470 475 480

Ser Thr Val Pro Val Leu Asn Gly Glu Thr Leu Ser Met Arg Val Leu

485 490 495

Val Asp His Ser Ile Val Gln Ser Phe Ala Met Gly Gly Arg Val Thr

500 505 510

Ala Thr Ser Arg Val Tyr Pro Thr Glu Ala Ile Tyr Ala Ala Ala Gly

515 520 525

Val Tyr Leu Phe Asn Asn Ala Thr Asn Ala Ser Val Thr Ala Glu Arg

530 535 540

Ile Ile Val His Glu Met Asp Ser Ile Asp Asn Asn Gln Ile Phe Leu

545 550 555 560

Ile Asp Asp Leu

Claims (40)

1.一种包括一种或更多种异源多核苷酸的宿主细胞，所述一种或更多种异源多核苷酸编码：

a)蔗糖:蔗糖1-果糖基转移酶(1-SST)，所述蔗糖:蔗糖1-果糖基转移酶(1-SST)包括与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:24至少90％一致的氨基酸序列；

b)果聚糖:果聚糖1-果糖基转移酶(1-FFT)，所述果聚糖:果聚糖1-果糖基转移酶(1-FFT)包括与SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:31至少90％一致的氨基酸序列；和/或

c)蔗糖:果聚糖-6-果糖基转移酶(6-SFT)，所述蔗糖:果聚糖-6-果糖基转移酶(6-SFT)包括与SEQ ID NO:13或SEQ ID NO:38至少90％一致的氨基酸序列。

2.如权利要求1所述的宿主细胞，其中所述一种或更多种异源多核苷酸编码a)、b)和c)中的两种或更多种。

3.如权利要求1所述的宿主细胞，其中所述一种或更多种异源多核苷酸编码a)、b)和c)。

4.如权利要求1-3中任一项所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞是植物细胞、藻类细胞、酵母细胞、细菌细胞或动物细胞。

5.如权利要求4所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞是酵母细胞。

6.如权利要求5所述的宿主细胞，其中所述酵母细胞是酵母属细胞、耶氏酵母属细胞或毕赤酵母属细胞。

7.如权利要求6所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞是巴斯德毕赤酵母细胞。

8.如权利要求1-7中任一项所述的宿主细胞，其中1-SST酶包括SEQ ID NO:1或SEQ IDNO:24的氨基酸序列。

9.如权利要求1-8中任一项所述的宿主细胞，其中1-FFT酶包括SEQ ID NO:7或SEQ IDNO:31的氨基酸序列。

10.如权利要求1-9中任一项所述的宿主细胞，其中6-SFT酶包括SEQ ID NO:13或SEQID NO:38的氨基酸序列。

11.如权利要求1-10中任一项所述的宿主细胞，其中1-SST酶、1-FFT酶和6-SFT酶中的一种或更多种从所述宿主细胞分泌。

12.如权利要求1-11中任一项所述的宿主细胞，其中1-SST酶、1-FFT酶和6-SFT酶中的至少两种由相同的异源多核苷酸编码。

13.一种包括培养权利要求1-12中任一项所述的宿主细胞的方法。

14.如权利要求13所述的方法，所述方法还包括从所述宿主细胞中纯化1-SST酶、1-FFT酶和6-SFT酶中的一种或更多种。

15.一种产生果聚糖的方法，所述方法包括使蔗糖与下列中的一种或更多种接触：

a)蔗糖:蔗糖1-果糖基转移酶(1-SST)，所述蔗糖:蔗糖1-果糖基转移酶(1-SST)包括与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:24至少90％一致的氨基酸序列；

b)果聚糖:果聚糖1-果糖基转移酶(1-FFT)，所述果聚糖:果聚糖1-果糖基转移酶(1-FFT)包括与SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:31至少90％一致的氨基酸序列；以及

c)蔗糖:果聚糖-6-果糖基转移酶(6-SFT)，所述蔗糖:果聚糖-6-果糖基转移酶(6-SFT)包括与SEQ ID NO:13或SEQ ID NO:38至少90％一致的氨基酸序列。

16.如权利要求15所述的方法，其中所述蔗糖与1-SST酶、1-FFT酶和6-SFT酶中的两种或更多种接触。

17.如权利要求15所述的方法，其中所述蔗糖与1-SST酶、1-FFT酶和6-SFT酶接触。

18.如权利要求15-17中任一项所述的方法，其中所述果聚糖包括β(2,1)键、β(2,6)键或其组合。

19.如权利要求15-18中任一项所述的方法，其中所述果聚糖是蔗果三糖、菊粉和/或革兰明糖。

20.如权利要求15-19中任一项所述的方法，其中所述果聚糖具有至少3的聚合度。

21.如权利要求15-20中任一项所述的方法，所述方法还包括纯化所述果聚糖。

22.如权利要求15-21中任一项所述的方法，其中1-SST酶、1-FFT酶和/或6-SFT酶由一种或更多种宿主细胞分泌。

23.如权利要求22所述的方法，其中在含有蔗糖的培养基中培养所述一种或更多种宿主细胞，并且其中所述蔗糖与所述培养基中的所述1-SST酶、所述1-FFT酶和/或所述6-SFT酶接触。

24.如权利要求23所述的方法，其中从所述培养基中纯化所述果聚糖。

25.如权利要求15-21中任一项所述的方法，其中1-SST酶、1-FFT酶和/或6-SFT酶是纯化的酶。

26.如权利要求19-25中任一项所述的方法，其中所述蔗果三糖是6-蔗果三糖。

27.如权利要求19-25中任一项所述的方法，其中所述蔗果三糖是1-蔗果三糖。

28.如权利要求15-25中任一项所述的方法，其中所述果聚糖包括左聚糖。

29.一种产生果聚糖的方法，所述方法包括：

a)使蔗糖与蔗糖:蔗糖1-果糖基转移酶(1-SST)接触以产生蔗果三糖；以及

b)使所述蔗果三糖与果聚糖:果聚糖1-果糖基转移酶(1-FFT)和/或蔗糖:果聚糖-6-果糖基转移酶(6-SFT)接触以产生所述果聚糖。

30.如权利要求29所述的方法，其中a)中产生的所述蔗果三糖被纯化，并且其中纯化的蔗果三糖在b)中与1-FFT酶和/或6-SFT酶接触。

31.如权利要求29或30所述的方法，所述方法还包括纯化b)中产生的所述果聚糖。

32.如权利要求29-31中任一项所述的方法，其中1-SST酶、1-FFT酶和/或6-SFT酶由一种或更多种宿主细胞分泌。

33.如权利要求32所述的方法，其中在含有蔗糖的培养基中培养所述一种或更多种宿主细胞，并且其中所述蔗糖与所述培养基中的所述1-SST酶接触。

34.如权利要求29-31中任一项所述的方法，其中1-SST酶、1-FFT酶和/或6-SFT酶是纯化的酶。

35.如权利要求29-34中任一项所述的方法，其中b)中产生的所述果聚糖是菊粉。

36.如权利要求29-35中任一项所述的方法，其中b)中产生的所述果聚糖是支链菊粉。

37.如权利要求29-34中任一项所述的方法，其中b)中产生的所述果聚糖是革兰明糖。

38.一种包括一种或更多种异源多核苷酸的宿主细胞，所述一种或更多种异源多核苷酸编码：

a)蔗糖:蔗糖1-果糖基转移酶(1-SST)，所述蔗糖:蔗糖1-果糖基转移酶(1-SST)包括与选自SEQ ID NO:1-4和SEQ ID NO:24-28的序列至少90％一致的氨基酸序列；

b)果聚糖:果聚糖1-果糖基转移酶(1-FFT)，所述果聚糖:果聚糖1-果糖基转移酶(1-FFT)包括与选自SEQ ID NO:7-10和SEQ ID NO:31-35的序列至少90％一致的氨基酸序列；和/或

c)蔗糖:果聚糖-6-果糖基转移酶(6-SFT)，所述蔗糖:果聚糖-6-果糖基转移酶(6-SFT)包括与选自SEQ ID NO:13-21和SEQ ID NO:38-52的序列至少90％一致的氨基酸序列。

39.如权利要求38所述的宿主细胞，其中1-SST酶、1-FFT酶和6-SFT酶中的至少两种由相同的异源多核苷酸编码。

40.一种产生果聚糖的方法，所述方法包括使蔗糖与下列中的一种或更多种接触：

a)蔗糖:蔗糖1-果糖基转移酶(1-SST)，所述蔗糖:蔗糖1-果糖基转移酶(1-SST)包括与选自SEQ ID NO:1-4和SEQ ID NO:24-28的序列至少90％一致的氨基酸序列；

b)果聚糖:果聚糖1-果糖基转移酶(1-FFT)，所述果聚糖:果聚糖1-果糖基转移酶(1-FFT)包括与选自SEQ ID NO:7-10和SEQ ID NO:31-35的序列至少90％一致的氨基酸序列；以及

c)蔗糖:果聚糖-6-果糖基转移酶(6-SFT)，所述蔗糖:果聚糖-6-果糖基转移酶(6-SFT)包括与选自SEQ ID NO:13-21和SEQ ID NO:38-52的序列至少90％一致的氨基酸序列。

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