CN117143884A - 一种与莲藕根状茎淀粉合成相关的转录因子NnMYB33基因及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种与莲藕根状茎淀粉合成相关的转录因子NnMYB33基因及其应用。淀粉是莲藕根状茎的主要贮藏物质，约占根状茎干物质重的70％以上；淀粉的含量和组分直接决定着莲藕根状茎的产量和食用品质，是反映莲藕加工制品好坏的指标本发明从莲藕中克隆得到一个新的NnMYB33基因。本发明利用基因工程技术将NnMYB33转录因子在马铃薯中过量表达，可以显著提高转基因植株的淀粉含量。本发明利用RT‑PCR技术从莲藕中克隆得到一个NnMYB33基因，能够提高植物的淀粉含量。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及到一种与莲藕根状茎淀粉合成相关的转录因子NnMYB33基因及其应用。
背景技术
莲藕(Nelumbo nucifera Gaertn.)属于莲科莲属水生草本植物，是中国栽培面积最大的水生蔬菜。莲藕根状茎富含淀粉、类黄酮、生物碱和多种维生素等物质，具有温补、清肺等重要的药用价值，是重要的“药食同源”型蔬菜。
淀粉是莲藕根状茎的主要贮藏物质，约占根状茎干物质重的70％以上；淀粉的含量和组分直接决定着莲藕根状茎的产量和食用品质，是反映莲藕加工制品好坏的指标。淀粉是由葡萄糖链接而成的天然聚合物，根据聚合物链长和分支的差异，将淀粉分为支链淀粉和直链淀粉。依据莲藕产品淀粉含量及组成，将莲藕分为脆质和粉质两类，其中，脆质莲藕淀粉含量一般占鲜重的15％以下；粉质莲藕淀粉含量一般占鲜重的17％以上。淀粉的生物合成是一个需要多种酶参与的复杂的代谢过程，其中主要包含5种酶，即1,6-二磷酸腺苷葡萄糖焦磷酸化酶、颗粒结合淀粉合成酶、淀粉合成酶、淀粉分支酶和淀粉去分支酶。此外，植物激素、蛋白激酶和转录因子等在淀粉生物合成中具有重要的调控作用。由于莲藕长期进行无性繁殖，导致淀粉等的遗传性状狭窄，难以通过传统杂交方法培育优质的莲藕新品种。明确淀粉生物合成中的调控机制，将为莲藕品质基因工程研究和应用提供科学依据，为利用分子育种手段培育优质莲藕新品种提供理论指导。
转录因子是植物生长发育过程中重要的调控元件，其中MYB转录因子作为植物中最大的一类转录因子在作为的品质调控、响应生物胁迫和非生物胁迫中发挥关键的作用。MYB转录因子参与植物苯丙烷类次生代谢途径的调节，与淀粉合成调控有着密切的关系，例如小麦转录因子TaMYB44可通过激活淀粉合成相关基因的表达调控淀粉的生物合成，此外香蕉中MaMYB16L和MaMYB33负调控淀粉降解相关基因的表达从而影响香蕉中淀粉的降解。通过鉴定莲藕优异的品质调控基因可为现代分子育种培育优质莲藕品种提供重要的科学依据。
发明内容
本部分的目的在于概述本发明的实施例的一些方面以及简要介绍一些较佳实施例。在本部分以及本申请的说明书摘要和发明名称中可能会做些简化或省略以避免使本部分、说明书摘要和发明名称的目的模糊，而这种简化或省略不能用于限制本发明的范围。
鉴于上述和/或现有技术中存在的问题，提出了本发明。
因此，本发明的目的是，克服现有技术中的不足，本发明提供一种与莲藕根状茎淀粉合成相关的转录因子NnMYB33基因及其应用。
该基因编码莲藕MYB转录因子NnMYB33，该转录因子能够促进淀粉生物合成途径中关键基因NnSS1启动子的活性，正向调控NnSS1的表达，从而促进淀粉的生物合成；利用基因工程技术将NnMYB33转录因子在马铃薯中过量表达，可以显著提高转基因植株的淀粉含量，对于莲藕的种质创新和高含量淀粉品种的选育具有重要意义。因此，本发明的目的是提供一个来源于莲藕的蛋白质NnMYB33在调控植物淀粉品质的应用。
第一方面，本发明要求保护NnMYB33蛋白或其相关生物材料在调控植物淀粉生物合成中的应用；所述相关生物材料为能够表达所述NnMYB33蛋白的核酸分子或含有所述核酸分子的表达盒、重组载体、重组菌或转基因细胞系；
所述NnMYB33蛋白为如下任一所示蛋白质：
(A1)由SEQ ID No.1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
(A2)SEQ ID No.1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且有相同功能的由序列1衍生的蛋白质；
(A3)与(A1)-(A2)中任一所限定的氨基酸序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性且具有相同功能的蛋白质；
(A4)在(A1)-(A3)中任一所限定的蛋白质的N端和/或C端连接标签后得到的融合蛋白。
(A5)SEQ ID NO.1所示蛋白质由SEQ ID NO.2所示基因进行编码。
所述NnMYB33蛋白来源于莲藕。
上述蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。
上述蛋白质中，所述标签可为Flag标签、His标签、MBP标签、HA标签、myc标签、GST标签和/或SUMO标签等。
所述应用具体体现为：所述NnMYB33蛋白或能够表达所述NnMYB33蛋白的核酸分子在所述植物中的活性和/或表达量提高，植物淀粉含量提高。
第二方面，本发明保护培育淀粉含量提高的植物品种的方法，包括使受体植物中NnMYB33蛋白的表达量和/或活性提高的步骤；所述NnMYB33蛋白为前文(A1)-(A4)中任一所示蛋白质。
进一步地，本发明要求保护培育转基因植物的方法，包括如下步骤：
向受体植物中导入能够表达NnMYB33蛋白的核酸分子，得到转基因植物；所述转基因植物淀粉含量高于受体植物，且因为淀粉的积累导致转基因植物可食用部位的膨大等。所述“向受体植物中导入能够表达NnMYB33蛋白的核酸分子”是通过向所述受体植物中导入含有能够表达NnMYB33蛋白的核酸分子的重组表达载体实现的。
可用现有的表达载体构建含有所述NnMYB33蛋白的编码基因的重组表达载体。所述植物表达载体包括双元农杆菌载体等。
为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用载体进行添加报告基因标签，如加入绿色荧光蛋白标签基因(GFP基因)，卡那霉素抗性蛋白标签基因，潮霉素抗性蛋白标签基因等。
在本发明中，所述重组表达载体具体可为在pCAMBIA1301载体中插入了NnMYB33核酸分子序列自5'端1至1674位核苷酸所示的DNA片段得到的重组质粒。
第三方面，本发明要求保护上述NnMYB33蛋白或其相关生物材料，或，以上任一所述的方法在植物育种中的应用。
所述育种的目的是选育淀粉含量提高的植物。
实验证明，本发明的NnMYB33可以提高植物中淀粉的含量，可以用于制备提高植物淀粉含量产品以及直接用于改善植物的淀粉品质，为利用现代分子育种培育优质高产的新品种提供了重要的科学依据。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。其中：
图1为本发明中莲藕NnMYB33蛋白与其他物种中MYB转录因子的序列比对分析；
图2为莲藕NnMYB33基因在莲藕不同组织中的表达检测分析示意图；
图3为实施例3中根据荧光强度换算得到的相对表达量示意图；
图4为实施例4中进行NnMYB33基因进行琼脂糖凝胶电泳示意图；
图中，条带集中片段大小为1677bp；
图5为NnMYB33过表达与对照组的淀粉含量测定；
图6为NnMYB33过表达与对照组的淀粉颗粒电镜扫描检测；
图7为实施例3中根据荧光强度换算得到的相对表达量示意图。
具体实施方式
为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合说明书实施例对本发明的具体实施方式做详细的说明。
在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明，但是本发明还可以采用其他不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似推广，因此本发明不受下面公开的具体实施例的限制。
其次，此处所称的“一个实施例”或“实施例”是指可包含于本发明至少一个实现方式中的特定特征、结构或特性。在本说明书中不同地方出现的“在一个实施例中”并非均指同一个实施例，也不是单独的或选择性的与其他实施例互相排斥的实施例。
本发明实施例中使用的‘MRH’为江苏地区大量种植的美人红品种。
实施例1
本实施例用以说明说明如何制备用于基因表达量检测的模板：
提取莲藕总RNA以及合成cDNA：参照北京庄盟国际生物基因科技有限公司的植物总RNA快速提取试剂盒(ZP405)提取‘MRH’莲藕根状茎成熟时期的RNA。根据TaKaRa公司的PrimeScriptTM 1st Strand cDNA Synthesis Kit(6110A)方法合成cDNA，用于作为淀粉合成相关基因表达量检测的模板。
实施例2
本实施例用以进行荧光定量PCR体系构建：
利用网站NCBI中的在线工具进行NnMYB33基因特异性引物对设计(NnMYB33DLF和NnMYB33DLR)，以实施例2中的cDNA为模板，采用诺唯赞的荧光定量试剂盒ChamQ UniversalSYBR qPCR Master Mix进行检测，检测体系如表1所示：
表1荧光定量PCR反应体系
PCR程序设定为：
对于MYB33在莲藕不同组织在莲藕种植后80天的荧光信号进行检测，得到的荧光信号强度，通过2－△△CT法分析得到MYB33的相对表达量，如图2所示。
由图2可得，MYB33在莲藕根状茎膨大的前期扩增效果最好，说明MYB33在初期开始就发挥有重要的作用。
此外通过对莲藕不同组织的转录组进行分析，发现MYB33在莲藕根状茎中高表达，说明MYB33主要在莲藕根状茎中发挥作用，如图3所示。
实施例3
本实施例用以进行目的基因的克隆、验证和回收：
NnMYB33基因的克隆：根据NnMYB33基因的序列设计引物对(NnMYB33F和NnMYB33R)，NnMYB33F和NnMYB33R分别如SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示，以实施例1中制得的莲藕cDNA为模板PCR扩增NnMYB33基因。
NnMYB33F：5'-ATGGGTCGTTCAACAAATGA-3'；
NnMYB33R：5'-TCAAGGGAGTTCAGACATATGACAAACC-3'。
PCR扩增产物进行1.2％琼脂糖凝胶电泳，采用普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(天根生化科技有限公司DP209)回收纯化1677bp左右的条带。
得到的条带如图4所示。
由图4可得，NnMYB33F:和NnMYB33R能够对于目的基因的克隆起到明显的效果，条带分布的集中位于同一位置且亮度较高，即我方发明中目的基因纯度高且得到的目的基因量较大。
实施例4
本实施例用以将目的基因进行转入，制得转基因马铃薯植株：
转基因马铃薯植株的获得：克隆NnMYB33基因全长序列，连接pCAMBIA1301过表达载体(载体上带有35S的CaMV启动子序列和卡那霉素选择标记基因KanR)并转化农杆菌株GV3101。选取在愈伤组织诱导培养基中预培养约15天的马铃薯‘鄂薯3号’薯片，置于含有农杆菌菌液的锥形瓶中震荡共培养约10min；利用无菌滤纸吸干菌液，将愈伤组织置于愈伤诱导培养基中黑暗(28℃)下共培养3天左右，用无菌水冲洗3次后，转入含600mg/L头孢霉素(Cef)和50mg/L卡那霉素(Kan)的愈伤组织诱导培养基上继续培养；将诱导生长较大的绿色愈伤组织转移到含600mg/L Cef和50mg/L Kan的愈伤组织分化培养基中培养；几天后，将得到的不定芽转入含600mg/L Cef和50mg/L Kan的MS培养基上进行生根；待长出马铃薯小苗，按照株系分为NnMYB33 OE-1～10，提取DNA和RNA进行转基因鉴定，获得阳性苗，得到的阳性苗按照不同的株系分为如下：NnMYB33 OE-3、NnMYB33 OE-7、NnMYB33 OE-8，如图5所示。
由图5可得，制得了含有目标基因的马铃薯作物。
实施例5
本实施例用以验证转基因植株的性能：
转基因植株淀粉含量测定：将转基因植株和对照植株(马铃薯块茎)取样后在烘箱105℃杀青1h，之后在60℃恒温下烘干至恒重，粉碎烘干后收集粉末备用。利用80％乙醇可以把样品中可溶性糖与淀粉分开，进一步采用酸水解法分解淀粉为葡萄糖，采用蒽酮比色法测定葡萄糖含量，即可计算出莲藕总淀粉含量。具体方法可参考索莱宝公司淀粉含量检测试剂盒说明书(BC0700)进行。测得的数据如图6所示。对于淀粉颗粒进行电镜扫描，得到图7。
由图6可得，转基因植株的淀粉含量相较对照组有着显著的提高。
利用支链淀粉和碘形成红紫色络合物的特性进行支链淀粉含量的检测。利用乙醇分开样本中的可溶性糖和淀粉，再利用碘与其反应得到支链淀粉含量。具体检测操作方法参照索莱宝公司支链淀粉含量检测试剂盒说明书(BC4270)。
表2转基因马铃薯与野生型马铃薯淀粉含量对比
“*”表示显著性相关，“NS”表示无相关；
由表2可得，在总淀粉含量上，转基因马铃薯相较野生型马铃薯有着较为显著的含量提升，在直链淀粉含量没有显著差别的基础上，显著提升了支链淀粉的含量。
实施例6
本实施例用以进行转基因植株的淀粉形态观测：
转基因植株淀粉粒形态的观测：采集长势相同的转基因和对照材料，处理后收集样品并放入干燥器中保存备用。用无水乙醇稀释淀粉样品为悬浊液，吸取适量悬浊液于样品台上，烘干后样品台放入粒子溅射喷镀仪中镀金，然后置于环境扫描电子显微镜(Philips XL-30)下观察。每个处理样品随机选取15张淀粉粒形态图片，并利用电镜的标尺对视野中淀粉粒的长轴和短轴分别进行测量，记录数据并进行统计分析，得到的数据记录在图7中。
由图7可知，过表达NnMYB33的转基因马铃薯中的淀粉颗粒总数显著高于野生型马铃薯中的，这表明NnMYB33可通过促进转基因植株淀粉粒数量的增加进而促进淀粉的积累。
应说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。
Claims (9)
1.一种与莲藕根状茎淀粉合成相关的转录因子NnMYB33基因，其特征在于：其基因序列如Seq ID No.2所示。
2.根据权利要求1所述的与莲藕根状茎淀粉合成相关的转录因子NnMYB33基因，其特征在于：所述NnMYB33基因长度为1877bp，NnMYB33基因中编码氨基酸的数目为558bp。
3.一种过表达NnMYB33基因的应用，其特征在于：将NnMYB33基因进行过表达。
4.根据权利要求3所述的过表达NnMYB33基因的应用，其特征在于：所述NnMYB33基因的过表达能够大幅提高支链淀粉含量。
5.根据权利要求3所述的过表达NnMYB33基因的应用，其特征在于：所述NnMYB33基因的过表达使得总淀粉和支链淀粉含量相较野生型表达量更多。
6.根据权利要求3所述的过表达NnMYB33基因的应用，其特征在于：所述NnMYB33基因的过表达的过表达载体为莲藕和马铃薯。
7.根据权利要求3所述的过表达NnMYB33基因的应用，其特征在于：选择植物材料：选择NnMYB33基因来源植物和最终转化到的受体植物中；
总RNA的提取和cDNA的合成：提取来源植物的总RNA，将总RNA反转成cDNA；
NnMYB33基因的克隆：设计克隆引物，以反转得到的cDNA为模板利用PCR进行克隆，连接到载体中；
序列分析：测序比较莲藕NnMYB33基因编码的氨基酸序列；
qPCR扩增：设计引物进行荧光定量PCR试验，检测NnMYB33基因在不同发育时期的表达量；
构建载体和转化到受体植物细胞中：设计引物利用同源重组技术实现NnMYB33基因连接到载体中，重组载体转化到受体植物细胞中；
表达淀粉：将转化的不同株系进行淀粉的表达。
8.根据权利要求3或7所述的过表达NnMYB33基因的应用，其特征在于：所述NnMYB33基因的克隆中，克隆引物为正向引物：5'-ATGGGTCGTTCAACAAATGA-3'；反向引物：5'-TCAAGGGAGTTCAGACATATGACAAACC-3'。
9.根据权利要求3或7所述的过表达NnMYB33基因的应用，其特征在于：所述构建载体和转化到受体植物细胞中，所述载体为pCAMBIA-1301载体。
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