HUT75075A - Transgenic fructan accumulating crops and methods for their production - Google Patents

Description

A találmány tárgyát olyan transzgenikus növények képezik, melyek bejuttatott idegen fruktoziltranszferáz(levanszukráz-), dextránszukráz- vagy alternánszukrázgének expresszálása útján alkalmasak fruktóz polimerek (fruktánok), dextránok vagy alternánok szintetizálására és felhalmozására. A találmány szerinti transzgenikus növények a bejuttatott idegen géneket előnyösen térben és időben szabályozottan expresszálják, azaz az expresszió szövet- és sejttérrész-specifikusan - például bizonyos sejtek vakuólumaiban - történik, egyedfejlődésileg meghatározott időintervallumban.

Aktaszámunk: 83672-7340/PÁ

ANVOTld

Π3Ι3ΐ422φΐ

Képviselő: ’!

DANUBIA SZABADALMI ÉS VÉDJEGY IRODA Kft.

Fruktán felhalmozására képes transzgenikus haszonnövények és eljárás előállításukra

A találmány tárgyát olyan transzgenikus növények képezik, melyek bejuttatott idegen fruktoziltranszferáz(levanszukráz-), dextránszukráz- vagy alternánszukrázgének expresszálása útján alkalmasak fruktóz polimerek (fruktánok), dextránok vagy alternánok szintetizálására és felhalmozására. A találmány szerinti transzgenikus növények a bejuttatott idegen géneket előnyösen térben és időben szabályozottan expresszálják, azaz az expresszió szövet- és sejttérrész-specifikusan - előnyösen bizonyos sejtek vakuólumaiban - történik, egyediejlődésileg meghatározott időintervallumban.

A találmány szerinti megoldás alkalmas előnyös fruktán-, dextrán- vagy alternánféleségeket felhalmozó haszonnövények előállítására és termesztésére, és ezáltal minden eddiginél előnyösebb ipari méretű fruktóz-, dextránés alternán-előállítási eljárások kifejlesztésére.

A száras növények legfontosabb tartalék szénhidrátjai a szacharóz, a keményítő és a fruktán (a fruktán nem redukáló fruktóz polimer, amely egy terminális glükózegységhez

Aktaszámunk: 83672-7340/PÁ kapcsolódik). A számos növénytermesztési és technikai probléma ellenére világszerte elterjedten terjesztenek haszonnövényeket specifikusan szacharóz és keményítő forrásként, elsődlegesen az édesitőiparban történő felhasználásra.

Amennyiben gazdaságosan kívánunk cukorrépát és cukornádat termeszteni és feldolgozni, többek között a következő nehézségeket kell leküzdenünk: korlátozott termesztési területek, munkaigényes betakarítási folyamatok, a betakarítás időpontjának pontosan meg kell egyezni azzal az időponttal, amikor a növény cukortartalma maximális, amennyiben a szállítással vagy feldolgozással késlekedünk, a növény összetétele és minősége kedvezőtlenül változik, valamint a hosszú távú, nem megfelelő tárolás során a kitermelhető cukor mennyisége csökken [ Salunkhe és Desai: Postharvest Technoi, of Sugár Crops, CRC Press, Boca

Raton, Florida (1988); Stout, J. Am. Soc. Sugár Beeet Technoi., 9, 350 (1957); Barnes: The sugarcane, 2. kiadás, Leonard Hill Books, London (1974)] . Amennyiben például a cukornád feldolgozását mindössze kilenc nappal betakarítása után próbáljuk megkezdeni, a vállalkozás teljesen haszontalan lesz, mivel enzimatikus degradáció következtében olyan nagy mértékű a szacharózveszteség [Alexander: Sugarcane Physiology, Elsvier, Amsterdam (1973); Gulibeau és mtsai. : Sugár J., 180, 18 (1955)] . Mivel a gazdaságos betakarításra és feldolgozásra egy viszonylag rövid időszak áll rendelkezésre, a cukornád esetében rendkívül pontosan kell megtervezni a betakarítás és feldolgozás időzítését. Amennyiben a tervezetthez képest váratlan késés következik be, például a rossz időjárás következtében, az nagymértékű termeléskiesést okozhat. A cukorrépa esetén is nehéz dolog meghatározni a betakarítás optimális idejét. A raffinóz ami a cukorrépából készített szirup elsődleges szennyezőanyaga - gátolja a szacharóz kristályosodását, és jelentősen gátolja a gazdaságos cukorrépa-feldolgozást. Kimutatták, hogy a cukorrépában a raffinóz mennyisége jelentősen növekszik ugyanabban az időszakban, amikor a szacharóz koncentráció eléri a legmagasabb szintet, és a raffinóz mennyisége tovább növekszik, amennyiben a cukorrépát olyan hőmérsékleten tároljuk, amely képes megakadályozni a szacharóz degradálódását [ Finkler és mtsai. : J. Am. Soc. Sugár Beet

Technoi., 10, 459 (1959); Brown: Anal. Chem., 24, 384 (1952)] . A cukorrépa-termesztés szacharóz kinyerése céljából tehát komplikált feladat, mivel a cukorrépában található szacharóz és raffinóz mennyisége együttesen határozza meg a termelt cukorrépa minőségét, és ezáltal a cukorrépafeldolgozás jövedelmezőségét.

A keményítő alapú édesítőszereket - melyeket elsősorban kukoricából állítanak elő - részben a cukornád- és cukorrépa-feldolgozás nehézségei miatt fejlesztették ki. A kukoricaalapú édesítőszerek kifejlesztése lehetővé tette azt is, hogy a gazdaság függetlenné váljék a szacharózbehozataltól. A szacharózellátásban a történelem folyamán sok esetben világméretű hiányok mutatkoztak, és a cukorárak mindig is ingatagok voltak, a különféle politikai események és természeti katasztrófák következtében.

r

Az Egyesült Államokban a szacharóztartalmú haszonnövények termesztéséről meglehetősen gyorsan tértek át a keményítőből történő édesítőszer előállításra, mivel ez számos előnnyel járt. Az egyik ilyen előny például az, hogy a kukorica megfelelő betakarítási és tárolási körülményei sokkal kedvezőbbek a cukorrépa vagy cukornád termesztés esetén betartandó feltételeknél. A kukorica esetén lehetőség van arra, hogy a betakarított termést sokkal hosszabb ideig tároljuk, anélkül, hogy minősége romlana, amennyiben várakozni kell a feldolgozó kapacitásra. A cukornádból történő gazdaságos szacharóz előállításnak a betakarítást követően néhány napon belül meg kell kezdődnie, a minőségromlás megelőzése céljából. Ezzel szemben megfelelő körülmények között a kukoricát akár egy évig is lehet tárolni, mielőtt megkezdenénk a keményítő kinyerését édesítőszer előállítása céljából, a hosszú tárolás ebben az esetben nem okoz jelentős veszteséget vagy minőségromlást a termény szempontjából. A kukorica egy másik előnye az olyan haszonnövényekkel szemben, mint például a cukornád, hogy sokkal változatosabb körülmények között is tenyészthető. A kukorica alkalmazása jelentősen megnövelte az Egyesült Államokban az édesítőszer ipari felhasználásra alkalmas haszonnövények termesztési területét. Az elmondottakon túl a keményítőalapú édesítőszerek végtermékét, a fruktózt a felhasználók jobban kedvelik a szacharóznál, mivel a fruktóz relatív édessége nagyobb a szacharózénál. Savas körülmények között a fruktóz akár 1,8-szer édesebb lehet a szacharóznál. Ez a felhasználó szempontjából megtakarítást eredményezhet, mivel azonos hatás eléréséhez kevesebb édesítőszert kell felhasználnia.

A fruktóztartalmú kukorica szirupot előállító ipar kereskedelmi sikeressége ellenére még számos lehetőség van további fejlesztésekre. A termelés költségeihez jelentősen hozzájárulnak azok a technikai nehézségek, melyeket le kell küzdeni ahhoz, hogy a keményítőt - ami egy glükóz polimer fruktózzá tudjuk átalakítani. A fruktóztartalmú szirup előállításának jelenlegi technológiája lényegében azzal kezdődik, hogy a keményítőt glükózzá hidrolizálják, ezt a hidrolízist enzim alkalmazásával végzik, hogy csökkentsék azokat a nem kívánt hatásokat - szín, íz, alacsony kitermelés melyek a használhatatlan oligomereknek köszönhetők, mely oligomerek abban az esetben keletkeznek, ha a hidrolízist enyhén savas kezeléssel hajtják végre. Annak ellenére, hogy a keményítő enzimes hidrolízise meglehetősen hatékony, a fruktóztartalmú sziruptermelés hatalmas nagyságrendjét figyelembe véve az enzimes hidrolízis mégis jelentős veszteséget okoz. Amennyiben a keményítőt 96 %-os kitermeléssel alakítjuk át glükózzá, a veszteség rendkívül nagy, amennyiben figyelembe vesszük, hogy évente több száz millió kg keményítőt hidrolizálnak el. Amennyiben a veszteség csak 4 %os - a keményítő tökéletlen hidrolízise következtében - a feldolgozási folyamatban a veszteség több 10 millió kg glükóznak felel meg, melyet egyébként végtermékként lehetne eladni. Ez évente több millió dolláros potenciális jövedelem kiesését eredményezi.

A teljes feldolgozási folyamat hatékonysága tovább csökken az izomerizációs lépés során. A glükóz enzimes fruktózzá alakítási folyamatának egyensúlya mindössze 42 % fruktóz termelődése után leáll. Ez a fruktóz-glükóz keverék nem megfelelő végtermék. Az iparban az összehasonlítási alap a szacharóz, és az izomerizációs lépéssel előállítható 42 %-os fruktózoldat édesség tekintetében nem összehasonlítható az ekvivalens szacharóz oldattal. Ebből az következik, hogy a 42 %-os fruktózoldatot ioncserélő kromatográfia alkalmazásával fruktózban gazdagabbá kell tenni, mely eljárási lépés jelentősen hozzájárul a termelés összköltségéhez . Az ioncserélő oszlopról 90 %-os fruktózoldat eluálódik, amit aztán összekevernek a 42 %-os fruktóz oldattal, és ily módon 55 %-os végterméket kapnak. Az 55 %-os fruktózoldat édessége egyenértékű a megfelelő szacharózoldat édességével.

Napjainkban a fruktózalapú édesítőszerek piacán a kristályos fruktóz iránti kereslet fokozódik a legnagyobb mértékben. Ezt a terméket egyre nagyobb mennyiségű pékáru és szárazkeverék készítéséhez használják fel. A kristályos fruktóz előállításához szükséges, hogy az ioncserélő oszlopról nyert 90 %-os fruktózszirupot további feldolgozási lépésnek vessék alá, ami tovább növeli a termék előállítási költségeit. További tisztítási lépések szükségesek, a szennyező glükóz eltávolítása céljából, hogy a fruktóz kikristályosítása lehetővé váljék. Ennek a felárral eladható terméknek az előállításához körülbelül 97 %-os tisztaságú fruktózra van szükség.

A glükózpolimer (keményítő) átalakítása fruktózzá számos előnnyel jár az édesítőszer-ipar számára, az átalakítás költsége azonban jelentős. Az eljárás költségeit csökkenteni lehetne, amennyiben a sziruptermelés kiindulási anyagaként keményítő helyett fruktánt használnánk. A növények eme harmadik szénhidráttároló anyagát már több, mint 150 éve ismerik. A fruktánok fruktózegységekből állnak, melyek 1521- és B2-6-kötésekkel vannak egymáshoz kapcsolódva. Ennek a polimernek a hidrolízise révén akár enzimes úton, akár enyhe savas kezeléssel lényegében tiszta fruktózt állíthatunk elő. A fruktánok tehát tisztaság és fruktántartalom vonatkozásában lényegesen előnyösebbek, mint a keményítő, és amennyiben kiindulási anyagként fruktánokat alkalmazunk, a feldolgozás folyamán elhagyhatjuk a szacharifikációs, izomerizációs és ioncserélési lépéseket, melyeket a fruktóz-szirup előállításánál jelenleg alkalmaznak. A költségmegtakarítást eredményező egyszerűbb feldolgozási lehetőség és a fruktóz szacharózhoz hasonlított nagyobb relatív édessége csak két ok azok közül, melyek miatt a fruktánok az édesítőszer-ipar kiváló kiindulási anyagai lehetnének. A fruktántartalmú haszonnövények termesztése azonban a szacharóztartalmú haszonnövények termesztésével összehasonlítható módon nehézkes. Bár 23 különböző növénycsaládról mutatták már ki, hogy fruktánokat halmoz fel [Hendry: New Phytol., 106, 201 (1987); Nelson és Spollen: Physiol. Plánt, 71, 512 (1987)] , ezek közül azonban csak két fajt tekintenek potenciális haszonnövénynek. A csicsókáról (Helianthus tuberosus) és a cikóriáról (Cichorium intybus) köztudomású, hogy olyan magas szénhidráttartalmúak, mint a hagyományos haszonnövények, és ezek a cukorrépával és a paradicsommal összehasonlítható mértékű szénhidrátmennyiséget halmoznak fel [ Fuchs: Starch, 39, 335 (1987)] . A csicsóka és a cikória azonban szezonális haszonnövények. A fruktánokat föld alatti gumókban halmozzák fel, a növekedési időszaknak csak egy bizonyos részében. A fruktánszintézis mértéke gyorsan lecsökken a gumónövekedés megszűntével. Az érés során a gumókban fokozódik a degradáló aktivitás, amely nagy mértékű marad a téli időszak alatt is [ Fuchs: Starch, 39, 335 (1987)] . A betakarítás időzítése különösen kritikus a csicsóka esetén. A kívánatos nagy molekulatömegű polimerláncok elsősorban a fiatal gumókban találhatók meg, amikor még a potenciális összmennyiséghez képest viszonylag kevés fruktán halmozódott fel. Az érett gumók száraz súlyának maximum 80 %-a a fruktán, de elsősorban kis molekulatömegű fruktánok találhatók az érett gumókban [ Haunold és mtsai.: J. Plánt Physiol. 134, 218 (1989)] . Mivel valamennyi fruktánmolekula tartalmaz egy terminális glükózegységet, amely a kiindulási szacharóz molekulából származik, minél nagyobb a fruktózegységek száma, annál tisztábbnak tekinthető a polimerlánc. Amennyiben tehát nagyobb méretű fruktánmolekulákból indulunk ki, kisebb mértékben kell a termékül kapott fruktózt a szennyező glükóztól tisztítani. Amennyiben a fruktánokat az év egy bizonyos rövid meghatározott időszakában tudnánk feldolgozni, a degradáció következtében fellépő veszteségek elkerülhetők lennének, így azonban a felhasználó kapacitás nem jól használható ki. A feldolgozó kapacitás azonban a rövid betakarítási időszakban minden bizonnyal véges, mivel a feldolgozáshoz olyan költséges berendezéshez van szükség, amely alkalmas egy különleges haszonnövény - melynek gyökerét kell hasznosítani - feldolgozására.

A csicsóka ipari méretű termesztésével kapcsolatos legnagyobb hátrányt a gumók vékony, érzékeny héja jelenti. A betakarítás során gyakran megsérülnek a gumók, ami fokozza a sejtlégzést, és ez nagy mértékű vízveszteséget eredményez, ami fokozott fruktándegradációhoz vezet a tárolás során. Környezeti hőmérsékleten a legjobb esetben is csak néhány hétig lehet tárolni a csicsókát, anélkül, hogy a fruktánok jelentős degradációja a gazdaságosságot csökkentené. Eljárhatunk úgy is, hogy a haszonnövényt konstans hőmérsékleten és nedvesség mellett tároljuk feldolgozásig, így megakadályozható a kitermelés romlása [Dykins és mtsai.: Industrial and Engineering Chemistry, 25, 937 (1933)], mindazáltal a nagyméretű tárolás magas költségei ennek a megoldásnak gátat szabnak.

Szabad ég alatt a fruktán-felhalmozódás rendkívül érzékeny a környezeti változásokra. Amennyiben a növényeket szárazság vagy fagy éri, a felhalmozódott fruktánok minősége drámai módon megváltozik [ Praznik és Beck: Agr. Bioi. Chem., 51, 1593 (1987)] . Hagyományos keresztezési eljárásokkal elvileg előállíthatok lennének olyan fajták, melyek fruktántartalma kevéssé csökkenne a káros környezeti hatások folytán. Az ilyen keresztezési eljárások azonban általában roppant időigényesek, jelenleg ilyen keresztezési

- 10 programok nem folynak, és feltehetően csak akkor kezdődnének meg, ha bebizonyosodna, hogy a fruktántermelő ipar életképes. A felsorolt problémákat a fruktántartalmú haszonnövények genetikai manipulációja útján is kiküszöbölhetnénk. A fruktán bioszintézisében szerepet játszó gén vagy gének túltermelése fokozott fruktántermeléshez vezethet, vagy nagyobb molekulatömegű fruktánok keletkezéséhez, de elképzelhető volna fagynak és szárazságnak jobban ellenállható növények előállítása is. Ezzel a megközelítésmóddal potenciálisan kiküszöbölhetnénk a speciális tárolási körülmények szükségességét. Egy ilyen génmalipulációs megközelítési mód sikeressége nagy mértékben azon múlna, hogy pontosan értjük-e a fruktánszintézis biokémiáját, a bioszintézisben résztvevő fehérjék kinetikai sajátságait, valamint a fruktánszintézisben szerepet játszó gének szabályozási mechanizmusait. Jelenleg ezzel a tudással nem rendelkezünk. A valamennyi fruktánfelhalmozásra képes növényre vonatkozó jelenleg érvényes modellt 1968-ban állították fel [ Eddleman és Jefford: New Phytol., 67, 517 (1968)] , és ez a modell arra utal, hogy a polimer szintézise és felhalmozódása két különböző fehérje egymást követő hatásának köszönhető. A modellben, melyet az eltelt időben egy kissé módosítottak [Wagner és mtsai.: Zeitschrift für Pflanzenphysiologie, 112, 359 (1983); Frehner és mtsai.: New Phytol. 116, 197 (1984)] még tisztázni kell egy kulcsfontosságú kérdést, a megfordítható fruktoziltranszferáz (FTF) aktivitás vonatkozásában, és legújabban is kritikának vetették alá az eredeti modellt [ Housley és mtsai.: New Phytol., 119, 491

- 11 (1991); Cairns, A. J.: New Phytol. 120, 463 (1992)] . A bioszintetikus reakcióútban szerepet játszó enzimeket nem tisztították még homogenitásig. Éppen ezért az olyan kísérletekre, melyek teljes mértékben felderítik a fruktán metabolizmust - minek következtében majd lehetővé válik a szintézis szabályozásának megváltoztatása, a degradálódás csökkentése és a felhalmozódott fruktánok molekulatömegének fokozása transzgenikus növényekben, mely kísérletekhez klónozott növényi gén vagy gének szükségesek - még néhány évet feltehetően várni kell.

Ismeretes, hogy mikroorganizmusok is termelnek fruktánokat. A jelenlegi rendszerekkel ellentétben a mikrobiális fruktánszintézis jól jellemzett (Összefoglaló munka: Hehre, Adv. in Enzymol., 11, 297 (1951); Hestrin:

The Bacteria: A Treatise on Structure and Function,

Academic Press, NY, szerk.: Gunsalas és Stanier, 3. kötet, 8. fejezet] . A bakteriális forrásból származó FTF enzimek olyan lineáris vagy elágazó láncú polimerek képződését katalizálják, melyek β2-1-, B2-6 vagy vegyesen β2-1- és β2-6kötésekkel összekapcsolt fruktózegységeket tartalmaznak. A fruktán láncok a keményítő és dextrán láncokhoz hasonlóan úgy növekszenek, hogy a növekedő lánc terminális nem redukáló fruktózegységének C6-hidroxil csoportjához egyenként újabb fruktofuranozil egységek kapcsolódnak. A fruktán láncokban az elágazások úgy keletkeznek, hogy bizonyos esetekben a fruktózegység a Cl-hidroxilcsoporthoz kapcsolódik. A fruktán láncok akár 12 %-ban is elágazók lehetnek [ Hestrin, Ann. N.Y. Acad. Sci., 66, 401 (1956); Hehre: Methods

- 12 Enzymol. 178 (1955); Han, Adv. Appl. Microbiol. 35, 171 (1990)] . A fruktán bioszintézist legalaposabban a Bacillus subtilis faj esetén tanulmányozták, és ennek a fajnak sok törzséről kimutatták, hogy fruktóz polimerizáló aktivitással rendelkezik [Evans és Hibbert: Adv. Carbohydr. Chem., 2, 253 (1946); Mantsala és Puntala: FEMS Microbio. Lett., 13, 395 (1982); Kleczowski és Wierzchowski: Soil Sci . , 49, 193 (1940)] . A fruktán bioszintézisben szerepet játszó bakteriális fehérjéket homogenitásig tisztították [ Chambert és mtsai.: Eur. J. Biochem., 41, 285 (1974)] és ki is kristályosították őket [ Berthou és mtsai.: J. Mól. Bioi., 82, 111 (1974)] . A tisztított bakteriális FTF aktivitású fehérje tanulmányozásával kiderítették, hogy a fruktán polimereket egyetlen fehérje szintetizálja, melynek kizárólagos szubsztrátja a szacharóz. A fruktán lánc úgy növekszik, hogy egymást követő lépésekben az enzim egy-egy fruktózegységet a donor szacharóz molekulából az akceptor fruktán polimerhez kapcsol. Kimutatták, hogy a szintézishez nincs szükség kofaktorok vagy láncindítók jelenlétére. A tisztított fehérje megléte lehetővé tette, hogy különböző fajokból megklónozzák a bakteriális FTF-gént [ Fouet, A., Arnaud, M., Klier, A. és Rapoport, G. : Biochem. Biophys. Rés. Commun. 119, 795 (1984); Shiroza, T. és Kuramitsu, H.

K.: J. Bacteriol. 170, 810 (1988); Tang, L. B., Lenstra, R., Borchert, T.V. és Nagarajan, V.: Gene, 96, 89 (1990)] . A megklónozott gének és a klónozott gének helyspecifikus mutagenezise további információt szolgáltattak a szubsztrátkötő régiókról, az enzim kinetikájáról és az in- 13 termedier fehérje-cukor-komplexekről [Chambert, R. és Petit-Glatron, M. F.: Biochem. J., 279, 35 (1991)] .

A mikrobiális fruktán bioszintézis tehát jól ismert, ami lehetővé teszi, hogy a növényekben génsebészeti módszerekkel szabályozni tudjuk a fruktán-felhalmozódást. A megklónozott bakteriális gének alkalmazásával lehetőség nyílik arra, hogy megváltoztassuk a fruktántartalmú haszonnövény fajokat, vagy arra, hogy olyan transzgenikus mezőgazdasági haszonnövényeket állítsunk elő, melyek fruktánokat halmoznak fel, annak ellenére, hogy a természetben nem tartalmaznak fruktánokat. Mivel azonban a bakteriális enzimek egyedüli szubsztrátja a szacharóz, ahhoz, hogy egy transzgenikus növényben az ilyen enzimet sikeresen expresszáljuk, sok potenciális problémát kell figyelembe vennünk. Amennyiben egy olyan bakteriális gént kívánunk egy transzgenikus növényben expresszáltatni, amely szerepet játszik a szacharóz-anyagcserében, figyelembe kell vennünk, hogy a magasabbrendű növények esetében a szacharóz kritikus szerepet játszik a növények növekedésében és egyedfejlődésében. A legtöbb vegyület, amely a növények nem fotoszintetizáló szöveteiben keletkezik, a szacharózból származik. Kimutatták azt is, hogy a szacharóz koncentráció sza-

bályozza a	génexpressziót [ Visser	és	mtsai . : Plánt	Mól.
Bioi., 17,	691 (1991); Wentzler	és	mtsai. : Plánt	Mól.
Bioi., 12,	41 (1989)] valamint azt	is,	hogy szerepe	van a

fotoszintézis sebességének szabályozásában [ Stitt és mtsai.: Planta, 183, 40 (1990); Krapp és mtsai.: The Plánt

J., 3, 817 (1993)] . A szacharóz koncentráció felsorolt sze- 14 repeit nem lehet és nem is szabad figyelmen kívül hagyni.

Amennyiben egy transzgenikus növényben nem megfelelően szabályozottan expresszáltatunk egy olyan gént, amely képes megváltoztatni a növényben a szacharóz koncentrációt, az azzal a következménnyel járhat, hogy valamely nem fotoszintetizáló szövetben elfogy valamely létfontosságú anyagcsere termék, ott, ahol arra a legnagyobb szükség lenne, és ennek az adott szövet fejlődése szempontjából súlyos következményei lehetnek. A megváltoztatott szacharózkoncentráció megváltoztathatja azon gének expresszióját, melyek összefüggésben vannak a sejten belüli szacharóz koncentrációval, ami előre kiszámíthatatlan, de minden bizonynyal súlyosan negatív következményekkel járhat.

A magasabbrendű növényekben specializálódott szerkezeteket találhatunk, melyeknek a funkciója a szacharóz továbbítása, begyűjtése és betöményítése. A szacharóz koncentráció nagysága ezért a növény különböző pontjain egymástól lényegesen eltérő lehet, különböző lehet a szacharóz koncentráció a különböző sejtszervecskékben és a különböző fajok esetén is. Bár az összességében szénvegyületeket exportáló szövetek (források) legfőbb transzportált szénhidrát vegyülete a szacharóz, melyet az összességében szénvegyületeket importáló szövetek (süllyesztők) felvesznek, sok növény a szacharóznak valamely más formáját transzportálja (például raffinózt), de vannak olyan növények is, melyek más szénhidrátokat transzportálnak (például mannitolt vagy szorbitolt). Az elmondottak értelmében rendkívül valószínűtlen, hogy sikeresen lehetne expresszálni valamely sza• · · · • · · · » * · · · · · • ·· ·· · ♦ ··«· ·· ·· ·· ·· ·

- 15 charóz anyagcserében résztvevő enzimet különböző növényfajokban, anélkül, hogy megváltoztatnánk a szabályozó jeleket és a sejten belüli expressziós mintázatot. Az ilyen gének expresszióját csak annak figyelembe vételével valósíthatjuk meg, hogy számos összetett mechanizmus létezik, a szacharóz transzportálására és betöményítésére, hogy a magasabbrendű növényekben szerepet játszanak a szacharóz átalakított formái is, és arra is tekintettel kell lenni, hogy a különböző növényi szövetekben a szacharóznak kritikus szerepe van.

Amennyiben transzgenikus növényekben bakteriális fruktánok halmozódnak fel, az a növényi fruktánokkal szemben számos előnnyel járna. A leginkább figyelemreméltó jelenség, ha a növényi és mikrobiális eredetű fruktánok között a fruktánláncok méretében van. A növényi fruktán polimerek kis molekulatömegűek, és átlagosan molekulánként 1030 fruktózegység találhatók bennük. Ezzel szemben a mikrobiális eredetű fruktánok molekulánként több mint 100 ezer fruktózegységet tartalmaznak, és molekulatömegük eléri a 10 -10 daltont. A találmány szerinti megoldás vonatkozásában a fruktán molekulák megnövekedett mérete igen nagy előnyt jelent, mivel minél hosszabb egy fruktán polimer, annál nagyobb az adott molekulában a fruktóz/glükóz arány, és ily módon kisebb mértékű tisztításra van szükség a hidrolízist követően a szennyező glükóz eltávolítása céljából. A nagy molekulaméret önmagában is előnyös, mivel a nagy méretű bakteriális fruktánok sokkal kevésbé oldódnak vízben, mint a kisebb méretű növényi polimerek. A növényi szövetek feldolgozása során ez az oldhatóságban mutatkozó különbség

- 16 is előnyt jelenthet. Amennyiben az izolálandó polimer molekulák nagy méretűek lennének, kisebb technikai nehézséget jelentene a fruktán molekulák elválasztása a nagy mértékben vizoldékony sejtösszetevőktől, például a szacharóztól, glükóztól és egyéb cukroktól. A nagy méretű fruktán molekulák felhalmozása esetén egy sejten belül nagyobb mennyiségű fruktóz halmozódhatna fel, anélkül, hogy megváltozna a belső ozmotikus nyomás, amennyiben kisebb méretű polimer molekulákban halmozódna fel azonos mennyiségű fruktóz, az ozmotikus nyomás megváltozna. Mivel a süllyesztő-szövetekben a szénvegyületek importálása szempontjából döntő fontosságú az ozmotikus nyomás megváltozása, lehetséges, hogy a nagy méretű fruktánok felhalmozódása esetén ez az utolsóként felsorolt előny bizonyulna a legjelentősebbnek.

A fruktánokat felhalmozó transzgenikus növények előnyös alternatívát jelentenének a jelenleg alkalmazott fruktóz alapú édesítőszer előállítási technológiával szemben. Ez különösen igaz a kukorica vonatkozásában, mely növény esetén a fruktóz polimerek felhalmozódása nem változtatná meg a szacharóztartalmú haszonnövényekkel szembeni előnyös tulajdonságokat, hanem az előnyök összeadódnának. Amennyiben fruktánok halmozódnának fel kukoricában, lehetőség volna a kukorica feldolgozás melléktermékeinek (olaj, étkezési és takarmányglutén) hasznosítására is, amellett, hogy megszűnne a glükóz fruktózzá alakításának jelentős költsége. Amennyiben a fruktánt fruktózegységekké hidrolizáljuk, a termék legalább 99 %-os tisztaságú fruktóz lenne. Ez a nagy tisztaságú termék előnyös alternatívát jelentene a jelenleg

- 17 alkalmazott kevéssé hatékony izomerizációs lépéssel szemben, és szükségtelenné válna a jelenleg a fruktóz dúsítását ceizo ioncserés Kromatograrias lépés. A rruKtöz Kristályosítása egyszerűbbé válna, amennyiben 99 % (+) tisztaságú fruktózból indulnánk ki.

A fruktózelőállítás költségeinek csökkentése nem csak az édesítőszer-előállító ipar szempontjából jelentős, de a fruktóz kémiai nyersanyagként történő felhasználása szempontjából is, ami a fruktóz készítmények hozzáférhetőségén, tisztaságán és versenyképes árán múlik. Pillanatnyilak a fruktóz előállító ipar csak a tisztaság vonatkozásában tudja kielégíteni az igényeket. Az Egyesült Államok noha a világ legnagyobb fruktóz előállítója, mégis fruktózbehozatalra szorul. Jelenleg az élelmiszeripar nagyobb mennyiségű fruktózt használ fel, mint amennyit előállítanak. Amennyiben a fruktóz versenyképes áron beszerezhető lenne, könnyen dehidratálni lehetne 5-hidroxi-metilfurfurállá (HMF), amit fel lehetne használni különféle gyógyászati készítmények kiindulási anyagaként, ilyen például a ranitidin, vagy a zantac , amely jelenleg a legkeresettebb fekélyellenes hatóanyag. A HMF különféle polimerek kiindulási anyagaként is hasznosítható lenne, ilyen például a kevlar es a nomex , de potenciálisan felhasználható lenne a HMF opto-elektronikai eszközökben is, a furán-mag speciális optikai hatásainak köszönhetően [ Schiweck és mtsai.: Carbohydrates as Organic Raw Materials, szerk.: Lichtenthaler, VHC Press, NY, 72. oldal (1992)] . A HMF átalakítható karbociklusos és heterociklusos vegyüle• · «··· ···· ··« ·· + · · · · _Λ · · · · • · · · * »· «· «β

- 18 tekké is, és ily módon szerepet játszhat az alkalmazott kémia csaknem minden területén, amennyiben a jelenlegi készítmények tisztasága kombinálható lehetne nagyobb méretekben történő kisebb költségekkel járó termeléssel.

Legújabban kimutatták, hogy kis mennyiségű fruktán hozzáadása egyszerű gyomrú állatok takarmányához különböző előnyös metabolikus és fiziológiai változásokat idéz elő [ Hashimoto és mtsai.: U. S. Patent 4,734,402 (1988);

Nakamura és mtsai.: 4 788 065 sz. USA-beli szabadalmi leírás (1988); Farnworth és mtsai.: Inulin and Inulin Containing Crops, szerk.: Fuchs, Elsvier, Amsterdam, 385. oldal, (1993)] . A fruktánok tápanyaghoz adva probiotikus hatásúak, ami feltehetően annak a következménye, hogy a kezelt populáció bélrendszerében előnyösen változik a mikroflóra. Ha a fruktánok alkalmazása következtében tapasztalható ritkábban fellépő hasmenés, valamint a fokozott tápanyag-hasznosítás a háziállat-tenyésztésben nyilvánvaló előnyöket jelent. Amennyiben a fruktánok a takarmánynövényben halmozódnának fel, az nem csak azért volna előnyös, mert a fruktán probiotikum, hanem lehetőség volna a fruktán hatóanyagnak az állattartás helyszínén történő felhasználására, anélkül, hogy szükség lenne drága takarmányőrlő és keverő berendezésekre.

Amennyiben a növényeket FTF-génnel transzformáljuk, az olyan gén bejuttatását eredményezi, amely hagyományos keresztezés! eljárással nem volna lehetséges, de ki lehetne használni a speciális tenyészterületekhez alkalmazott beltenyésztett vagy nemesített növényfajták előnyeit is.

• ·

- 19 Amennyiben a kukoricát bakteriális FTF-génnel transzformálnánk, előállíthatnánk az értékes fruktán polimer megújuló forrását, anélkül, hogy elveszítenénk a jelenleg is előállított hasznos melléktermékeket, például az olajat és az étkezési és takarmány glutént. Transzgenikus növények előállítása azzal az előnnyel is kecsegtet, hogy a fruktán olyan növényben halmozódhatna fel, amelyik nem képes a felhalmozódott polimer molekulákat degradálni. Ez azt jelentené, hogy a környezeti változások nem változtatnák meg a felhalmozódott polimer minőségét vagy mennyiségét, amint az a csicsóka vagy cikória esetében tapasztaljuk. A transzgenikus szöveteket tehát a degradációval kevésbé számolva lehetne tárolni. Amennyiben a hosszú távú tárolást nem speciális tárolókban végezhetnénk, az csökkentené vagy megszüntetné azokat a költségeket, és technikai igényeket, melyek a jelenlegi fruktán tartalmú haszonnövények betakarításával kapcsolatosak.

A találmány szerinti eljárások lehetővé teszik fruktóz és glükóz polimerek ipari méretű előállítását. Az FTF-ek olyan enzimek, melyek a hasonló fehérjéket tartalmazó ún. szukrázok csoportjába tartoznak, mely enzimek képesek szénhidrátokat polimerizálni kizárólagos szubsztrátként szacharózból kiindulva. A fehérjék szukráz családja sok tekintetben egymáshoz hasonló tagokból áll, például az ebbe a családba tartozó fehérjékre jellemző, hogy monomer formában aktívak, és szintetikus aktivitásuk kifejtéséhez nem szükséges kofaktorok vagy láncindítók jelenléte. Erről a fehérjecsaládról feltételezhető, hogy transzgenikus növényekben • · · ···· · · • · · · • · · ·

- csakúgy mint a kiméra-FTF-ek - működőképesek lesznek, mivel a család egyes tagjai között szembeötlőek a hasonlóságok. A végtermékként kapott transzgenikus növény tartalmazhat polimerizált fruktózt, melynek előállítását az FTF-ek katalizálják, de tartalmazhat glükózt is, melyet a glükozil transzferázoknak (GTF-ek) nevezett szukrázok képesek polimerizálni. A GFT-ek forrásukat és funkciójukat tekintve is különbözőek lehetnek egymástól, és ezért az általuk előállított polimerek típusai is változó. Számos GTF-et azonosítottak [például: az alternánszukrázt, GTF-I-t, a GTF-S és a GTF-SI-t (Cote, Carbo. Polym., 19, 249 (1992); Giffard és mtsai.: J. Gén. Micro. 139, 1511 (1993)] , mely enzimek mindegyike egymástól kissé különböző polimer előállítását katalizálja. Az előállított polimerek különbözhetnek egymástól méretükben, a bennük található kötések típusában és mintázatában. Amint az a keményítő esetén is megfigyelhető

- ami szintén glükózpolimer - a méretben, kötéstípusban és mintázatban mutatkozó különbségek meghatározzák az adott molekulatípus sajátságait, ami befolyásolja az illető molekula gazdasági hasznosíthatóságát. A GFT-ek - csakúgy mint bizonyos dextránszukrázok - a glükózt polimerizálhatják különleges kötések kialakulása útján is, ami a keményítőtől nagy mértékben különböző sajátságú polimerek keletkezéséhez vezet. A GFT-eket jelenleg egy glükóz polimer, a dextrán előállítására használják, melyet kutatási célokra, valamint a vérplazma térfogatának növelésére használnak. Amennyiben ezeket az eltérő szerkezetű polimereket nagy mennyiségben volnánk képesek termelni, az a fruktánok esetén ismertetet• · · ·

- 21 tekhez hasonló előnyökkel járna, ilyen előnyök például a különleges polimerek megújuló forrásának előállítása, a polimerek előállítási költségeinek csökkentése jelenleg is létező piacok vonatkozásában, és új piacok feltárása olyan alkalmazásokon keresztül, melyek pillanatnyilag nem költséghatékonyak.

A WO89/12386 számú közzétételi irat feltár egy eljárás glükóz és fruktóz polimerek előállítására transzgenikus paradicsomnövényekben. Az említett közzétételi irat a sejtplazma olyan kezelését írja le, amely nem biztos, hogy megvalósítható, továbbá a transzformált sejtek pusztulását eredményezi. A WO89/12386 számú közzétételi iratban nem található kitanítás a vakuólumokba történő inszercióra vonatkozóan .

A találmány tárgyát olyan eljárások és az eljárásokban alkalmazható anyagok képezik, melyek lehetővé teszik transzgenikus növényekben fruktóz polimerek szintézisét és felhalmozódását olyan helyeken, ahol ilyen polimerek természet szerint nem találhatók, és olyan növényfajokban, amelyek nem képesek a felhalmozódott polimer molekulákat elhidrolizálni vagy minőségüket megváltoztatni. A transzgenikus növényekben azáltal érjük el a fruktóz polimerek felhalmozódását, hogy egy bakteriális fruktozil transzferáz gént (FTF-gént) szövetspecifikusan és sejten belül expresszáltatunk, és az expresszáltatott FTF-enzim egyedüli szubsztrátként szacharózt használ, és nem igényel semmilyen kofaktort, vagy kívülről bejuttatandó láncindítót. A találmány szerinti megoldás kidolgozása során különösen nagy fi- 22 -

gyeimet szenteltünk, az adott sejteken belüli szacharóz koncentráció mértékének, az FTF-expresszió időzítésének, a növényfajokon belüli szövetspecifikus expressziónak, valamint az expresszió sejten belüli lokalizálásának. Ezekkel a felsorolt szempontokkal - melyek a találmány szerinti megoldás kidolgozása szempontjából döntő fontosságúak - az ismertté vált közlemények nem foglalkoztak.

A találmány szerinti megoldásban szövetspecifikus promoterek, egy vakuólumspecifikus szignálszekvencia és egy mikrobiális FTF-enzimet kódoló szekvencia egyedi kombinációját alkalmazzuk, valamint egy eljárást, az előállított DNS-fragmensek dohány-, paradicsom- és kukoricanövényekbe történő juttatására. Az elmondottak eredményeként a találmány szerinti megoldás egy olyan eljárás, melynek alkalmazásával transzgenikus növényekben fruktóz polimerek termelődnek és halmozódnak fel, és a találmány szerinti megoldás alkalmas egyéb olyan polimerek termeltetésére és fölhalmozására is, melyeket az enzimek szukráz családjához tartozó fehérjék szintetizálnak. A találmány szerinti eljárás alkalmazható különböző mezőgazdasági haszonnövények esetén, melyek jelentős mennyiségű szacharózt halmoznak fel, ilyenek például a cukorrépa és a cukornád. Ezen felül a fruktánt tartalmazó haszonnövények - mint például a cikória vagy a csicsóka - a találmány szerinti megoldás alkalmazásával feljavíthatok. A találmány szerinti technológia alkalmazásával lehetőség nyílik speciális polimerek különösen fruktánok - nagy mennyiségben történő termelésére, csökkentett előállítási költségek mellett, mely polime• · · ·

- 23 rek édesítőszerként alkalmazhatók, az ilyen polimerek sajátságai egészségügyileg kedvezők [ Hidaka és Hirayama: Biochem. Soc. Trans., 19, 561 (1991)] , de alkalmazhatók az előállított polimerek a háziállatok takarmányozása során probiotikumként [ Hashimoto és mtsai.: 4 734 402 sz. USAbeli szabadalmi leírás (1988); Nakamura és mtsai.:

788 065 sz. USA-beli szabadalmi leírás (1988)] , és felhasználhatók kémiai alapanyagként is, olyan új piacokon, melyeken alkalmazásuk a találmány szerinti megoldás felhasználása nélkül nem lenne gazdaságos [ Fuchs: Starke, 3 9, 335 (1981); Fuchs: Biochem. Soc. Trans., 19, 555 (1991)] . Kimutattuk, hogy a találmány szerinti transzgenikus növények esetében a fruktánok felhalmozódása nem befolyásolja hátrányosan a növekedést, az egyedfejlődést vagy a szaporodó képességet.

A találmány tárgyát képezi egy rekombináns DNSkonstrukció, amely tartalmaz egy szövetspecifikus promótert, funkcionálisan egy vakuólum specifikus szignálszekvenciához kapcsolva, amely funkcionálisan hozzá van kapcsolva egy levanszukrázgén kódoló szekvenciájához, oly módon, hogy a találmány szerinti DNS-konstrukcióval lehetséges kukorica, burgonya és dohány növények sejtjeit transzformálni, mely transzformáció következtében a transzformált növényi sejtben káros hatások nélkül a vakuólumban fruktán termelődik. A találmány tárgyát képezik továbbá a találmány szerinti DNS-konstrukcióval transzformált kukorica, burgonya és dohány növények, mely növények fruktánt termelnek, amely a növényi sejtek vakuólumában halmozódik fel. A ta• · · · ····

- 24 lálmány tárgyát képezi továbbá egy eljárás fruktóz előállítására, mely eljárás szerint a találmány szerinti transzgenikus növényeket termesztjük, betakarítjuk, majd a betakarított növényből a felhalmozódott fruktánt kinyerjük.

A találmány tárgyát képezi továbbá egy rekombináns DNS-konstrukció, amely tartalmaz egy szövetspecifikus promotert, funkcionálisan hozzá kapcsolva egy vakuólum specifikus szignálszekvenciához, amely funkcionálisan hozzá van kapcsolva valamely dextránszukrázgén kódoló szekvenciájához, oly módon, hogy amennyiben találmány szerinti DNSkonstrukcióval kukorica, burgonya vagy dohány sejteket transzformálunk, a transzformált sejtek vakuólumában dextrán fog termelődni, a transzformált sejtekre gyakorolt káros hatások nélkül. A találmány tárgyát képezik a találmány szerinti DNS-konstrukcióval transzformált kukorica, burgonya és dohány növények is, melyek dextránt termelnek, amely dextrán a növényi sejtek vakuólumában halmozódik fel. A találmány tárgyát képezi továbbá egy eljárás dextrán előállítására, mely eljárás szerint a találmány szerinti dextrántermeló növényeket termesztjük, betakarítjuk, majd a betakarított növényekből a dextránt kinyerjük.

A találmány tárgyát képezi továbbá egy rekombináns DNS-konstrukció, amely tartalmaz egy szövetspecifikus promotert, funkcionálisan hozzá kapcsolva egy vakuólumspecifikus szignálszekvenciához, amely funkcionálisan hozzá van kapcsolva valamely alternánszukrázgén kódoló szekvenciájához oly módon, hogy amennyiben a találmány szerinti DNSkonstrukcióval kukorica, burgonya vagy dohánysejteket ···· ····

	- 25 -	·· ·· .. .. ····
transzformálunk, a	transzformált	növényi	sej tek	vakuólu-
mában alternán fog	termelődni, a	növényi	sejtre	kifej tett
káros hatások nélkül	. A találmány	tárgyát	képezik	továbbá a

találmány szerinti DNS-konstrukcióval transzformált kukorica, burgonya és dohány növények, mely növények alternánt termelnek, amely a növényi sejtek vakuólumában halmozódik fel. A találmány tárgyát képezi továbbá egy eljárás alternán előállítására, mely eljárás szerint a találmány szerinti növényeket termesztjük, betakarítjuk, majd a betakarított növényekből az alternánt kinyerjük.

A leírásban számos szakkifejezést meghatározott értelemben használunk. A leírásban használt értelemben a promóter és promóterrégió kifejezések olyan DNSszekvenciát jelölnek, amely általában valamely struktúrgén kódoló szekvenciájától 5'-irányban található, és amely szekvencia képest a kódoló régió expresszióját szabályozni azáltal, hogy a szekvenciát felismeri az RNS-polimeráz és/vagy egyéb faktorok, melyek szükségesek ahhoz, hogy a transzkripció a megfelelő helyen kezdődjék. A promóter szekvenciák szükségesek, de nem minden esetben elégségesek valamely gén expressziójának szabályozására. A promóterfragmens kifejezés a promóterrégió DNS-szekvenciájának valamely fragmensét jelöli. Egy gén 3'-régiója (vagy 3'vége) a génnek azt a részletét jelenti - a transzkripció iniciálását végző 5'-végi szekvencia és a gén strukturális részének kivételével -, amely tartalmazza a poliadenilációs szignált és minden olyan egyéb szabályozó szignált, melyek alkalmasak az mRNS-érés (processing) vagy a génexpresszió • · · · ·»«·

- 26 befolyásolására. A poliadenilációs szignált általában az jellemzi, hogy az mRNS-prekurzor 3'-végére poliadenil farok szintézisét idézi elő. A poliadenilációs szignálok általában arról ismerhetők fel, hogy homológiát mutatnak a kanonikus 5'-AATAA-3' szekvenciarészlettel, bár a kanonikus szekvencia változatai sem szokatlanok.

A nukleinsav kifejezés nagy méretű egy vagy kétszálú molekulát jelöl, amely olyan monomerekből (nukleotidokból) áll, melyek tartalmaznak egy cukoregységet, egy foszfátegységet és vagy egy purin vagy egy pirimidin bázist. A magasabbrendű növényekben a dezoxiribonukleinsav (DNS) a genetikai átörökítő anyag, a ribonukleinsav (RNS) pedig a DNS-ben őrzött információ fehérjékké történő lefordításában játszik szerepet. A nukleotidszekvencia kifejezés polimer DNS- vagy RNS-molekulát jelent, amely lehet egy- vagy kétszálú, és adott esetben tartalmazhat szintetikus, nem természetes vagy módosított nukleotid bázisokat is, melyek képesek DNS- vagy RNS-polimerekbe beépülni.

Az RNS-transzkriptum kifejezés a DNS-szekvencia RNSpolimeráz által katalizált transzkripciójának termékét jelöli. Az RNS-transzkriptum lehet a kiindulási DNSszekvencia tökéletesen komplementer kópiája, és ez esetben elsődleges transzkriptumnak nevezzük, de lehet olyan RNSszekvencia is, amely az elsődleges transzkriptum poszttranszkripciós érése során keletkezett, és az ilyen RNStranszkritumot érett RNS-nek nevezzük.

A gén kifejezés olyan DNS-szekvenciát jelöl, mely valamely specifikus fehérjét kódol. A natív gén kifejezés

- 27 olyan gént jelöl, amely a természetben megtalálható. A kiméragén kifejezés olyan gént jelent, amely heterológ szabályozó és/vagy kódoló szekvenciákat tartalmaz. A mutáns gén kifejezés olyan génre utal, melynek nukleotid szekvenciájában valamely olyan változás található, amely a természetben általában nem található meg. A mutáció létrejöhet a génben véletlenül, de előidézhető szándékosan is,és megváltozott aktivitást eredményez, de a génterméket nem szükségszerűen változtatja meg.

A leírásban használt értelemben az alkalmas vagy megfelelő szabályoz szekvencia kifejezés olyan nukleotid szekvenciára utal, amely egy kiválasztott géntermék DNSszekvenciájától 5'-irányban, azon belül, és/vagy attól 3'irányban található, és a géntermék transzkripcióját és expresszióját szabályozza potenciálisan a sejt bioszintetikus rendszerében együttműködve. A szabályozás vagy szabályoz kifejezések a génexpresszió modulálására utalnak, olyan DNS-szekvenciaelemek által, melyek elsősorban de nem kizárólag - a gén transzkripciós startkódonjától 5'irányban találhatók. A szabályozás eredményezheti a génexpresszió valamely stimulustól függő vagy független voltát, de eredményezheti a génexpresszió szintjének változását is. A konstitutív expresszió kifejezés folyamatos expresszióra utal, amely minden olyan stimulustól függetlenül folyik, melyek a génexpresszióhoz önmagában is nem szükségesek. A szabályozható vagy szabályoz kifejezések valamely szabályozott promóter vagy gén expressziós szint···· ····

- 28 jében végbemenő olyan változásra utalnak, melyek valamely környezeti stimulus alkalmazásának eredményei.

A kódoló szekvencia kifejezés a gén azon részletét jelenti, amely egy fehérjét, polipeptidet vagy azok részletét kódolja, és ebbe a kifejezésbe nem értjük bele azokat a szabályozó szekvenciákat, melyek a transzkripció iniciálásához szükségesek. A kódoló szekvencia lehet olyan, amelyik normálisan megtalálható egy sejtben, de lehet olyan is, amelyik normális esetben nem található meg az adott celluláris helyen, ebben az esetben ezt a gént heterológ génnek nevezzük. Heterológ gének származhatnak teljes egészükben vagy részben bármely technika állása szerint ismert forrásból, beleértve a bakteriális genomot és episzómákat, az eukarióta nukleáris vagy plazmid DNS-t, cDNS-t vagy kémiailag előállított DNS-t. A struktúrgén állhat egy megszakítás nélküli kódoló régióból, de tartalmazhat egy vagy több intront is, melyeket a megfelelő érési kapcsoló szekvenciák szegélyeznek (splice junction szekvenciák). A struktúrgén tartalmazhat több különböző forrásból származó szegmenst is, melyek lehetnek természetesen előforduló vagy szintetikus szegmensek is.

A rekombináns DNS-konstrukció vagy egyszerűen konstrukció kifejezések olyan plazmidra, vírusra, önállóan replikálódó szekvenciára, fágra, lineáris vagy cirkuláris nukleotid szekvenciára, egy vagy kétszálú DNS- vagy RNS-molekulára utalnak, melyek bármely forrásból származhatnak, amely szekvencián belül több különböző nukleotidszekvencia van összekapcsolva, vagy rekombinálva valamely

- 29 olyan egyedi konstrukcióvá, amely alkalmas arra, hogy egy promóter fragmenst és egy kiválasztott génterméket kódoló DNS-szekvenciát alkalmas 3'-végi nem transzlálódó szekvenciákkal együtt valamely növényi sejtbe bejuttassuk.

A növény kifejezés alatt mind teljes növényeket, mind növényi eredetű szöveteket értünk. A növényi eredetű szövet kifejezés differenciálódott vagy nem differenciálódott növényi szöveteket jelöl, többek között gyökereket, hajtásokat, leveleket, pollent, makk-kezdeményeket, gumókat, magokat és különböző formájú tenyésztett sejteket, például ép sejteket, protoplasztokat, embriókat és kallusz szövetet. A növényi eredetű szövetek előfordulhatnak a növényben, valamely különálló növényi szervben, növényi szövetben vagy sejttenyészetben. Az egyszikű növény kifejezés olyan növényeket jelöl, melyek magjaiban csak egy sziklevél található, vagy egy olyan embrionális szerv, amely tartaléktápanyagot tartalmaz. A kétszikű növény kifejezés olyan növényeket jelöl, melyek magjaiban két sziklevél található. A leírásban használt értelemben a transzformáció kifejezés olyan eljárásokra utal, melyek végrehajtása során sejtek, szövetek vagy növények olyan sajátságokra tesznek szert, melyet valamely, a sejtbe, szövetbe vagy növénybe juttatott nukleinsav molekula kódol. A bejuttatás kifejezés olyan eljárásra utal, amely szerint valamely sejtbe DNS-t juttatunk be, ilyenek többek között a mikroinjektálás, a sejtmembrán permeabilizálása különböző fizikai (például elektroporáció) vagy kémiai (például polietilén glikol: PEG) behatások útján.

• · · · · · ·

- 30 A funkcionálisan hozzákapcsolt kifejezés arra utal, hogy kettő vagy több DNS-fragmenst megfelelő orientációban egymáshoz kapcsoltunk, oly módon, hogy a fúzió megőrizze vagy kialakítsa a megfelelő leolvasási fázist, vagy lehetővé tegye valamely DNS-szekvencia expressziójának megfelelő szabályozását, amennyiben a konstrukciót valamely növényi szövetbe transzformáljuk.

Az expresszió a leírásban használt értelemben valamely géntermék szekvenciáját kódoló gén transzkripcióját és/vagy transzlációját jelenti az illető géntermékké. Az expresszió során a géntermék szekvenciáját kódoló DNS-lánc először komplementer RNS-sé íródik át, ami gyakran egy mRNS-molekula, és azután az átíródott mRNS-molekula transzlálódik az említett géntermékké, amennyiben a géntermék egy fehérje. Az olyan expressziót, amely konstitutív és tovább fokozódik valamely külső hatások által szabályozott promóter fragmens jelenléte által, és ily módon számos mRNS-kópia keletkezik, és a kiválasztott géntermék nagy mennyiségben termelődik, túltermelésnek nevezzük. Az expressziós egység kifejezés olyan DNS-konstrukciót jelöl, amely tartalmaz egy promóterrégiót, amely funkcionálisan hozzá van kapcsolva egy kódoló szekvenciához, amely funkcionálisan hozzá van kapcsolva valamely 3'-végi szekvenciához, és amely DNS-konstrukció alkalmas arra, hogy a kódoló régióról mRNS keletkezését vezérelje, ami a növényi szövetben a kívánt fehérjetermék szintézisét eredményezi.

A transzlációs startkódon vagy iniciációs kódon kifejezések azt a három nukleotidot (kódont) jelentik egy

- 31 nukleinsav szekvencián belül, melyek meghatározzák a fehérjeszintézis kezdő pontját.

Az szignálpeptid kifejezés a polipeptidek Nterminális meghosszabbodását jelöli, a szignálpeptid a polipeptiddel összefüggően transzlálódik, és együttesen egy prekurzorfehérjét alkotnak, és a szignálpeptid szükséges ahhoz, hogy a prekurzorfehérje bejusson a kiválasztási reakcióútba. A szignálpeptidet, amely szükséges ahhoz, hogy egy polipeptid bekerüljön a kiválasztási reakcióútba, képes felismerni a meghatározott faj kiválasztó rendszere, de az is lehetséges, hogy egy szignálpeptidet valamely nem rokon faj kiválasztó rendszere is felismer. A szignálpeptid aktív lehet magokban, levelekben, gumókban és egyéb növényi szövetekben. A szignálszekvencia kifejezés azt a nukleotidszekvenciát jelöli, amely szignálpeptidet kódol. A vakuólumspecifikus szignálpeptid valamely polipeptid olyan N-terminális meghosszabbodását jelöli, amely a polipeptiddel összefüggően transzlálódik és ily módon olyan prekurzorfehérje jön létre, amely szükséges ahhoz, hogy a fehérje végül is a sejt vakuólumába jusson. A vakuólumspecifikus szignálpeptidet, amely szükséges ahhoz, hogy valamely polipeptid egy sejt vakuólumába kerüljön, képes felismerni egy adott faj transzportrendszere, de az is lehetséges, hogy nem rokon fajok transzportrendszerei is képesek felismerni. A vakuólum specifikus szignálpeptidek aktívak lehetnek magokban, levelekben, gumókban és egyéb növényi szövetekben is. A vakuólum specifikus szignálszekvencia kifejezés olyan nukleotidszekvenciát jelöl, mely vakuólum

- 32 specifikus szignálpeptidet kódol. A vakuólum kifejezés a növényi sejt valamely membránhoz kötött elhatárolt térrészét jelöli, amely különböző lehet méretét, funkcióját és tartalmát tekintve. A vakuólumok tartalmazhatnak a sejtek által előállított anyagcsere termékeket, és a sejten belüli vakuólumszám a különböző sejtek esetén nagy mértékben különböző lehet, és a különböző szövetekhez tartozó sejtek is eltérő számú vakuólumokat tartalmazhatnak.

A szövetspecifikus promóter kifejezés olyan DNSszekvenciát jelöl, amely az RNS-polimeráz és/vagy egyéb transzkripció iniciálásához szükséges faktorok számára felismerhető szignálokat tartalmaz, és ezáltal precízen szabályozza a hozzá kapcsolt kódoló szekvencia expresszióját bizonyos szövetekben vagy egy bizonyos szövet bizonyos sejtjeiben. A szövetspecifikus expresszió jelenthet olyan expressziót, amely csak egy adott szövetben történik meg, az is lehetséges, hogy az ilyen expresszió egy szövettípusnak csak bizonyos sejtjeiben játszódik le, de a szövetspecifikus expresszió lejátszódhat egyszerre egynél több szövetben is. Szövetspecifikus expresszió példája lehet többek között a kizárólag levelekben történő expresszió, amely egyéb növényi szövetekben nem játszódik le, vagy történhet a szövetspecifikus expresszió például szirmokban, makkkezdeményekben és porzókban, ugyanakkor más típusú növényi szövetekben nem.

Az örökölhető kifejezés arra utal, hogy egy növény képes érett növénnyé fejlődni, majd szexuális vagy aszexuális úton, magok termelése útján vagy egyéb módon ké···· «···

- 33 pes genetikai anyagát teljes egészében vagy részben átjuttatni leszármazottaiba. A leszármazottak genetikai anyaga felelős azért, hogy olyan új növény fejlődik ki, melynek sajátságai vagy jellemzői hasonlóak vagy azonosak a szülői növény megfelelő sajátságaival.

A levanszukráz kifejezés olyan fehérjét jelöl, melyet valamely olyan organizmus genetikai anyaga kódol, amely képes olyan szénhidrát polimereket szintetizálni, melyek egymást követő fruktózegységeket tartalmaznak, és az ilyen fehérje szubsztrátként szacharózt használ. A polimeren belül az egymást követő fruktózegységek B2-1-, vagy E>26-kötéssel kapcsolódnak egymáshoz, vagy ennek a két kötéstípusnak bármely kombinációja útján. Az ilyen fehérjéket nevezik fruktoziltranszferázoknak (FTF) is, de nevezik őket FTF-aktivitású fehérjéknek is. Az egymást követő fruktózegységeket tartalmazó polimer tartalmazhat egy terminális glükózegységet, amely egy szacharóz molekulából származik, és tartalmaz legalább két fruktózegységet. Az olyan polimereket, melyek egymást követő fruktózegységeket tartalmaznak, bármilyen formában, bármilyen kötéssel vagy azok kombinációjával összekapcsolva, általánosságban fruktánoknak nevezzük, függetlenül attól, hogy hány fruktózegységet tartalmaznak. A levanszukrázgén kifejezés olyan DNS-szekvenciát jelöl, amely levanszukráz-fehérjét kódol.

A dextánszukráz kifejezés olyan fehérjét jelöl, melyet valamely olyan mikroorganizmus genetikai anyaga kódol, amely képes olyan szénhidrát polimer keletkezését katali···· ···· • · • · · · · · · • · · ·· · · · · · I ·· ·· ·· ·· ·

- 34 zálni, amely egymást követő glükózegységekből áll, melyeket kizárólag vagy al-6- vagy al-3-kötések, vagy ezen kötéstípusok valamilyen kombinációja kapcsol össze. Az ilyen fehérjét nevezik glükoziltranszferáznak (GTF) is, vagy GTFaktivitású fehérjének. A polimer legalább két glükózegységet tartalmaz, és elnevezése dextrán. A dextránszukrázgén kifejezés olyan DNS-szekvenciát jelöl, mely dextránszukráz-fehérjét kódol.

Az olyan szénhidrátpolimer, amely a valódi dextránoktól abban különbözik, hogy benne az egymást követő glükózegységeket alternáló al-6- és al-3-kötések kapcsolják össze, alternán-nak nevezzük. Azt a fehérjeterméket, amely képes olyan reakciót katalizálni, amely alternán szintézist eredményez alternánszukráz-nak nevezzük. Az alternánszukrázgén kifejezés olyan DNS-szekvenciát jelöl, mely alternánszukráz-fehérjét kódol.

A káros hatás kifejezést a leírásban olyan értelemben használjuk, hogy az a fruktán-felhalmozódás következtében fellépő közvetlen vagy közvetett károsodást jelent, ilyen lehet például az, ha a növény vagy növényi sejt nem képes végrehajtani bizonyos funkcióit, ilyen funkciók lehetnek például a szénhidrátok szintézise és transzportja a sejten belül és az egész növény vonatkozásában, a transzgenikus növények vagy szövetek regenerálódása, a növények vagy növényi sejtek érett növénnyé történő fejlődése, vagy bizonyos sajátságok vagy tulajdonságok átadásának képessége az utódnövényekbe.

- 35 A szelektív expresszió kifejezés olyan expresszióra utal, amely csaknem kizárólag a növény egy bizonyos szervében történik, például levelekben, gumókban vagy magokban. A kifejezés jelölhet olyan expressziót is, amely valamely növényi szerv egy bizonyos egyedfejlődési fázisában történik, például a korai vagy késői embriogenezis során. A szelektív expresszió kifejezés jelölhet olyan expressziót is, amely egy sejten belül egy bizonyos helyen történik, például a sejtplazmában vagy a vakuólumban.

A szokásosnál nagyobb szacharózkoncentráció valamely sejtben meglévő olyan szacharózkoncentrációt jelöl, amely az adott faj vad típusú növényi sejtjeiben található természetes koncentrációtartománynál magasabb. A szokásosnál nagyobb szacharózkoncentráció előfordulhat a celluláris egyedfejlődés bármely fázisában, a sejten belül található gén vagy gének természetes mutációja vagy transzgenikus manipulációja folytán. Megnövekedett szacharózkoncentráció előfordulhat egy egész sejten belül mindenhol, de létrejöhet valamely szubcelluláris térrészben is. A szokásosnál nagyobb szacharózkoncentrációjú növény például a standard édes vagy szuperédes kukorica, melynek endospermiuma összehasonlítva a natív vagy lófogú kukorica endospermiumával, nagyobb szacharóztartalmú. A lófogú kukoricaként ismert kukoricafajták szacharózkoncentrációja a megporzás után 1518 nappal éri el a maximális szintet, és a szacharózfelhalmozódás a magok szárazanyagtartalmának 4-8 %-át érheti el . A lófogú kukorica érett magjaiban a szacharóz koncentráció végső értékben a szárazanyag-tartalom 0,5-1,5 %- 36 ára csökken. Nagy szacharóztartalmú fajták például: a standard édeskukorica (su), valamint a szuperédes kukoricafajták (sh2, bt2, su/se, stb.). A standard édeskukorica fajta esetén azonos fejlődési fázisban a szacharózkoncentráció a lófogú kukoricában összehasonlítva kétszeres mértékű. A szuperédes kukoricafajták esetén ez az érték a lófogú kukoricában mérhető érték 3-4-szeresét is eléri, azonos érettségi fázist figyelembe véve.

A találmány szerinti megoldás kidolgozása során alkalmazott DNS-rekombinációs eljárások szakember számára jól ismertek, és általános összefoglalásuk megtalálható például a következő kézikönyvben: Maniatis és mtsai.: Molecular Cloning A Laboratory Manual , Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1982).

A DNS enzimes kezelése

A restrikciós enzimes emésztéseket a gyártó által rendelkezésre bocsátott pufferekben és emésztési körülmények között végeztük valamennyi restrikciós enzim esetén. Az enzimeket olyan mennyiségben alkalmaztuk, hogy 1 pg DNS-re 510 egység enzim jusson, és a reakcióelegyek térfogatát vízzel állítottuk be a megfelelő mértékűre. A reakcióelegyeket a megfelelő hőmérsékleten körülbelül 2 órán keresztül inkubáltuk. A DNS-ligálásokat a fenti Maniatis-féle kézikönyv ajánlásai szerinti mennyiségű vektor és inszert öszszekeverése után végeztük. A DNS-ligálásokat a gyártó előírásai szerinti reakciókörülmények között végeztük, T4-DNSligáz alkalmazásával (Bethesda Research Laboratory, Gaithersburg, MD).

- 37 DNS-gélélektroforézis

A DNS-minták agaróz-gélelektroforézisét 0,7 %-os agaróz gélekben hajtottuk végre, Tris-borát-EDTA (TBE) puffer alkalmazásával, amely 89 mmol/1 Trist, 89 mmol/1 borátot (pH=8,3) és 2,5 mmol/1 EDTA-t tartalmazott. Az elektroforézist 50-150 V feszültséggel hajtottuk végre, az elektroforetizált DNS mennyiségétől és a kívánt futási időtől függően. Az elektroforézist követően a géleket 1 pg/ml koncentrációjú etídium-bromid-oldat alkalmazásával megfestettük, és a DNS-t tartalmazó csíkokat UV-lámpával tettük láthatóvá. A DNS-t a gélekből a Gene Clean reagenskészlet alkalmazásával hajtottuk végre, melyet a BIO-101 cégtől szereztünk be, a gyártó utasításai szerint.

Plazmidizolálás és tisztítás

A beléjük transzformált plazmidokat tartalmazó Escherichia coli sejteket (fagyasztott kompetens HB101sejtek, beszerezve a BRL cégtől) egy éjszakán át 37 °C-on 500 ml térfogatban tenyésztettük. A tenyésztést LBtáptalajban (10 g Bactotryptone , 5 g élesztőkivonat és 10 g nátrium-klorid) hajtottuk végre, amely 100 pg/ml ampicillint is tartalmazott. A plazmidok izolálását és tisztítását a Maxi-Prep DNS-tisztító rendszer alkalmazásával hajtottuk végre, melyet a Promega cégtől szereztünk be, a gyártó utasításai szerint.

Az alábbiakban röviden ismertetjük a szekvencialistában megadott szekvenciákat. A találmány szerinti megoldás jobban érthetővé válik, a leíráshoz csatolt részletes szekvencialista alapján. A szekvencialistában a 37 C.F.R.

- 38 1.822 jelzésű iratban definiált egybetűs kódokkal jelöltük az aminosavakat, mely iratot a kitanitás részeként kell tekinteni .

Az 1. azonosítószámú szekvencia a Bacillus amyloliquefaciens SacB-jelű FTF-génjének részleges nukleotidsorrendje. Ez a 31 bázispár hosszúságú szekvenciarészlet a prokarióta szignálpeptid lehasadásának helyét szegélyezi. Az 1. azonosítószámú szekvenciát megváltoztattuk oly módon, hogy tartalmazzon egy EcoRV restrikciós hasítóhelyet, a 13. nukleotiddal kezdődően. Ez a nukleoid szekvencia, melyet a DNS helyspecifikus mutagenezise céljából terveztünk, létrehoz egy egyedi EcoRV-hasítóhelyet egy kódonnyira 3'-irányban a szignálpeptid-hasítóhelytől.

A második azonosítószámú szekvencia a dohány SSUpromóterrégiójának részleges nukleotidsorrendje. A bemutatott 21 bázispáros nukleotid szekvenciarészlet 5'-irányban helyezkedik el az egyedi BglII-hasítóhelytől, a promóterrégión belül, és alkalmas 5' -> 3'-irányú láncindítóként, amennyiben a promóterrégió egy részletét kívánjuk PCR-eljárással szubklónozni.

A 3. azonosítószámú szekvencia a dohány SSU-promóterrégiójának egy szekvenciarészlete. Ez a szekvencia az SSUpromóterrégió 3' —» 5'-irányú komplementere, és oly módon van megváltoztatva, hogy tartalmazzon EcoRV- és Ncolhasítóhelyeket, melyek sorrendben a 7. és 12. nukleotidnál kezdődnek. A bemutatott 32 bázispáros szekvenciában található ATG-kódon, mely az Ncol-hasítóhely részlete, a natív SSU-gén iniciációs kódonja. Ezt az oligonukleotid szekven- 39 ······«· ·· * · • · · · · · · * · « · · · ···· ciát az SSU-Dromóter eay részletének PCR-eliárással véarehajtott szubklónozása céljából terveztük, a bemutatott szekvenciájú oligonukleotidot a 2. azonosítószámú szekvenciájú oligonukleotiddal kombinációban alkalmaztuk láncindítóként a klónozási eljárás során.

A 4. azonosítószámú szekvencia a Bacillus amyloliquefaciens SacB-jelű FTF-génjének egy szekvenciarészlete. A bemutatott 21 bázispáros oligonukleotid szekvencia megfelel a SacB-gén egy régiójának, amely 31 bázispárnyira 3'-irányban található a prokarióta hasítási szignáltól, és alkalmas PCR-láncindító, a genomi DNS-be intergálódott SacB-gén(ek) jelenlétének kimutatására.

Az 5. azonosítószámú szekvencia a Bacillus amyloliquefaciens SacB-jelű FTF-génjének egy szekvenciarészlete. Ez a szekvencia a konvencionális SacB-DNSszekvencia 3' —>5' irányú komplementere. A bemutatott 23 bázispáros szekvencia első nukleotidjától egy Sallhasítóhelyet kódoló szekvenciarészlet kezdődik. A natív SacB-génnek megfelelő szekvencia a 6. nukleotiddal kezdődik. Ezt az oligonukleotidot úgy terveztük, hogy PCReljárásban láncindítóként lehessen használni a 4. azonosítószámú szekvenciájú nukleotiddal kombinációban.

A 6. azonosítószámú szekvencia a sporamingén (az édes burgonyában található egyik tartalékfehérje génje) egy DNSszekvenciarészlete. A bemutatott 142 bázispáros szekvenciarészlet a vakuólumspecifikus szignálpeptidnek megfelelő Nterminális prepro- és propeptidet kódolja. A szekvenciát oly módon változtattuk meg, hogy az iniciációs kódon egy • · · · · Μ · · • «

- 40 BspHI-hasítóhelyben legyen található, amely a 14. nukleotidnál kezdődik. Az 1-6. nukleotidok között egy Spelhasítóhely található, és az Ncol- és Xhol-enzimek hasítóhelyei sorrendben a 130-136. és 137-142. nukleotidok között találhatók.

A 7. azonosítószámú szekvencia a sporamingén egy DNSszekvenciarészlete. A megadott szekvenciarészlet a hagyományos DNS-szekvenciához viszonyítva 3' —> 5'-irányú és a 6. azonosítószámú szekvencia tökéletes komplementer. Ezt a 142 bázispáros oligonukleotidot úgy terveztük, hogy képes legyen a 6. azonosítószámú szekvenciájú oligonukleotiddal hibridizálódni, miáltal egy szintetikus DNS-egység jön létre, amely tartalmazza a sporamingén vakuólumspecifikus szignálszekvenciáját, a 6. azonosítószámú szekvencia ismertetése során felsorolt restrikciós hasítóhelyekkel együtt. A DNS-egységben található restrikciós hasítóhelyek szubklónozási célra előnyösek.

A 8. azonosítószámú szekvencia az édes burgonya sporaminfehérjéje vakuólumspecifikus szignálpeptidének aminosavsorrendje, melyet a 6. és 7. azonosítószámú szekvenciák kódolnak. A prepro-peptid az 1. aminosavval kezdődik, és egész a 21. aminosavig tart. A propeptidnek megfelelő aminosavszekvencia a 22-37. aminosavak között található . A teljes prepro-peptid, amennyiben funkcionálisan natív vagy idegen fehérjékhez kapcsoljuk, a hozzákapcsolt fehérjét a növényi sejt vakuólumába fogja juttatni.

A 9. azonosítószámú szekvencia az árpalektin génjének [ Bednarak és Raikhel: The Plánt Cell, 3, 115 (1992);

· ·· S -·· · ·

- 41 Dombrowski és mtsai.: The Plánt Cell, 5, 587 (1993)] egy nukleotidszekvencia részlete. A bemutatott 56 bázispáros szekvencia az árpalektin C-terminális vakuólumspecifikus szignálpeptidét kódoló szekvenciát tartalmazza. A bemutatott DNS-szekvenciát oly módon változtattuk meg, hogy az a

4-9. és 51-56. nukleotidok között sorrendben HincII- és

BglII-hasítóhelyeket kódoljon.

A 10. azonosítószámú szekvencia az árpalektingén egy nukleotidszekvencia részlete. A bemutatott 56 nukleotid hosszúságú szekvenciarészlet a 9. azonosítószámú szekvencia tökéletes komplementere, és amennyiben egy 9. és egy 10. azonosítószámú szekvenciájú oligonukleotidot összehibridizáltatunk, a két oligonukleotid egy olyan DNS-fragmenst hoz létre, ami a megfelelő restrikciós enzimekkel emészthető, majd alkalmas expressziós vektorokba klónozható.

A 11. azonosítószámú szekvencia az árpalektin Cterminális, vakuólumspecifikus szignálpeptidje 15 aminosavának sorrendje. Ezt az aminosavszekvenciát kódolják a 9. és 10. azonosítószámon megadott szekvenciájú oligonukleotidok. Amennyiben ezt a peptidet funkcionálisan hozzákapcsoljuk valamely natív vagy idegen fehérjéhez, akkor a peptid az illető peptidet az endoplazmatikus retikulumból a növényi sejt vakuólumába fogja juttatni.

A 12. azonosítószámú szekvencia az árpalektingén DNSszekvenciájának egy részlete [ Bednarak és Raikhel: The Plánt Cell, 3, 115 (1992); Dombrowski és mtsai.: The Plánt

Cell, 5, 587 (1993)] . A megadott 38 bázispár hosszúságú szekvencia alkalmas arra, hogy az árpalektingén N- 42 terminális szekréciós szignálszekvenciájának előállításához PCR-láncindítóként használjuk. Ez a láncindító a szignálszekvencia 5' végéhez képes hibridizálódni, és tartalmaz egy EcoRI-hasítóhelyet, a 7. nukleotiddal kezdődően. Az EcoRI-hasítóhely szubklónozási szempontból hasznos. A szekvencia tartalmaz egy BspHI-hasítóhelyet is, a 14-19. nukleotidok között. Ez a hasítóhely alkalmas arra, hogy a PCR-eljárással előállított DNS-fragmenst megfelelő leolvasási fázisban összekapcsoljuk a 16-18. nukleotidok között található iniciációs kódonnal.

A 13. azonosítószámú szekvencia az árpalektingén egy DNS-szekvenciarészlete. Ez a 38 bázispáros szekvencia alkalmas arra, hogy alapján olyan PCR-láncindítót tervezzünk, mely alkalmas az árpalektingén N-terminális szekréciós szignálszekvenciájának megklónozására. A szekvenciarészletben az 1-6. és 6-11. nukleotidok között sorrendben

Sáli- és Ncol-hasítóhelyeket találhatunk. Ez a szekvenciarészlet az árpalektin-DNS reverz komplementere, és úgy terveztük, hogy a szekvencia alapján szintetizált oligonukleotid PCR-eljárásban láncindítóként legyen alkalmazható a 12. azonosítószámú szekvencia szerinti oligonukleotiddal kombinációban. A 12. és 13. azonosítószámú szekvenciájú oligonukleotidok alkalmazásával végrehajtott PCR-eljárásban keletkezett DNS-fragmens olyan peptidet kódol, amely alkalmas arra, hogy a funkcionálisan hozzá kapcsolt natív vagy idegen fehérjét egy növényi sejt kiválasztórendszerében juttassa.

- 43 A 14. azonosítószámú szekvencia a burgonya gumóspecifikus patatinfehérjéje génjének egy DNS-szekvenciarészlete. A megadott 20 bázispáros szekvenciarészlet a promóter régiónak felel meg, ami az iniciációs kódontól 1,0 kb-nyira 5’irányban található.

A 15. azonosítószámú szekvencia a burgonya gumóspecifikus patatinfehérje génjének egy DNS-szekvenciarészlete. A megadott 22 bázispáros szekvenciarészlet a patatin-DNSszekvencia reverz komplementere, és úgy terveztük, hogy amennyiben az alapján szintetizált oligonukleotidot a 14. azonosítószámú szekvenciájú nukleotiddal kombinációban PCReljárásban láncindítóként alkalmazzuk, egy 1,0 kb-os DNSfragmens amplifikálódjék, amely tartalmazza a gumóspecifikus génexpresszióhoz szükséges szabályozó szekvenciákat. A megadott szekvencia tartalmaz egy, a natív iniciációs kódon is magában foglaló Ncol-hasítóhelyet (1-6. nukleotidok).

A 16. azonosítószámú szekvencia a nagy kéntartalmú zein-tartalékfehérje génjének egy DNS-szekvenciarészlete [ Kirihara és mtsai.: Gene, 71, 359 (1988)] . A megadott 25 bázispáros DNS-szekvencia tartalmaz egy EcoRV restrikciós hasítóhelyet, a 25 nukleotiddal kezdődően.

A 17. azonosítószámú szekvencia a nagy kéntartalmú zein tartalékfehérje génjének egy DNS-szekvenciarészlete. Ez a 30 bázispáros szekvenciarészlet tartalmaz egy Xbal restrikciós hasítóhelyet, a 6-11. nukleotidok között. A 16. és 17. azonosítószámú szekvenciákat úgy terveztük, hogy az ezen szekvenciák alapján szintetizált oligonukleotidokat PCR-eljárásban kombinációban láncindítóként alkalmazhassuk, • ··· ····

- 44 és így egy 1,4 kb-os DNS-fragmens amplifikálódjék, amely tartalmazza a 10 kD-os zeinfehérje promóter régiójának és kódoló szekvenciájának egy részletét, és amely fragmens az EcoRV- és Xbal-hasítóhelyek felhasználásával izolálható és alkalmas vektorba klónozható.

A 18. azonosítószámú szekvencia a nagy kéntartalmú zein tartalékfehérje génjének egy DNS-szekvenciarészlete. Ezt a 30 bázispáros DNS-szekvenciát úgy terveztük, hogy a szekvencia alapján szintetizált oligonukleotidot PCReljárásban láncindítóként lehessen alkalmazni, mely eljárásban a 10 kD-os zeinfehérje génjének egy részlete fog amplifikálódni.

A 19. azonosítószámú szekvencia a nagy kéntartalmú zein tartalékfehérje egy DNS-szekvenciarészlete. Ez a 32 bázispáros DNS-szekvenciarészlet tartalmaz egy BamHI restrikciós hasítóhelyet a 6-11. nukleotidok között. A 18. és 19. azonosítószámú szekvenciák alapján szintetizált oligonukleotidokat PCR-láncindítóként alkalmazva egy 1,39 kilobázisos DNS-fragmens fog amplifikálódni, amely a zeingén egy részletét tartalmazza. Az amplifikálódott DNSfragmens alkalmas vektorba szubklónozható egy tompavéget eredményező restrikciós hasítóhely és a BamHI-hasítóhely felhasználásával.

A 20. azonosítószámú szekvencia a nagy kéntartalmú zein tartalékfehérje egy DNS-szekvenciarészlete. A megadott 13 bázispáros DNS-szekvenciarészletet adapterként terveztük, melynek alkalmazásával a 10 kD-os zeinfehérje génjének kódoló régiójában egy egyedi Smal restrikciós hasítóhelyet ···· ···· ·· • * · · . · · · ·

- 45 hozhatunk létre. A Smal restrikciós hasítóhely a DNSszekvenciarészlet 5. nukleotidjánál kezdődik.

A 21. azonosítószámú szekvencia a nagy kéntartalmú zein tartalékfehérje egy DNS-szekvenciarészlete. A megadott 13 bázispáros DNS-szekvencia a 20. azonosítószámú szekvencia részleges komplementer. Amennyiben a két DNS-szekvencia alapján szintetizált oligonukleotidokat összhibridzáljuk, egy egyedi Smal restrikciós hasítóhelyet hozhatunk létre, amely szubklónozási célból hasznos.

A találmány tárgyát képezik eljárások növénysejtek transzformálására valamely olyan expressziós egységgel, amely megfelelő szabályozó és célba juttató szekvenciákat tartalmaz, mely transzformációs eljárások eredményeként olyan növényeket állíthatunk elő, melyek magvaik vagy gumóik vakuólumaiban fruktánt halmoznak fel. A találmány szerinti expressziós egység tartalmaz egy promóter régiót. A találmány szerinti megoldás szempontjából előnyös promóter régiók a 10 kD-os zeinfehérje szövetspecifikus promótere és a patatinfehérje szövetspecifikus promóterrégiója. Az expressziós egységen belül a promóter régió funkcionálisan hozzá van kapcsolva egy kimérafehérje kódoló régiójához, amely egyrészt egy vakuólumspecifikus szignálszekvenciából, másrészt egy olyan enzim kódoló régiójából áll, amely képes fruktózt polimerizálni. Előnyös vakuólumspecifikus szignálpeptid származtatható az édes burgonya tartalékfehérjéjének, a sporaminnak N-terminális 30 aminosav hosszúságú szekvenciarészletéből, valamint az árpalektinfehérjének a vakuólumba történő célba jutásához szükséges •··· ····

- 46 N-terminális és C-terminális szekvenciából. Mind a sporamin, mind pedig az árpalektinfehérjék vakuólumspecifikus szignálszekvenciái elégségesek arra, hogy egy fehérjét az endoplazmatikus retikulumba (ER) juttassanak, ott a fehérje kiválasztódjék, és a Golgi-készüléken keresztül a vakuólumba jusson. A vakuólumspecifikus szignálszekvenciákat azonos leolvasási fázisban fúzionáltatjuk az érett Bacillus amyloliquefaciens FTF-fehérje kódoló régiój ával.

A találmány tárgyát képezik azok az egyszikű és kétszikű növények is, melyek a találmány szerinti expressziós egység legalább egy kópiájával transzformálva vannak, előnyös találmány szerinti transzformált növények a kukorica és a burgonya. A találmány tárgyát képezik a találmány szerinti növények magjai és gumói is.

A találmány tárgyát képezi továbbá egy eljárás fruktánon felhalmozására egyszikű vagy kétszikű növényekben is, mely eljárás az alábbi lépéseket tartalmazza:

(i) Valamely növényi sejtet egy találmány szerinti expressziós egységgel transzformálunk, amely tartalmazza a Bacillus amyloliquefaciens FRT-génjét funkcionálisan egy vakuólumspecifikus szignálszekvenciához kapcsolva, valamint alkalmas 5' és 3'-végi mag- vagy gumóspecifikus transzkripciós szabályozószekvenciákat;

(ii) A transzformált növényi sejtből szexuálisan érett termékeny növényeket nevelünk; és • ·

- 47 (iii) Kiválasztjuk az (ii) pont szerinti termékeny növények azon magjait vagy gumóit, melyek a megfelelő szövetekben fruktánokat halmoztak fel.

A leírásban feltárunk számos olyan találmány szerinti kiméragént, melyek szövetspecifikus szabályozószekvenciákat, vakuokumspecifikus szignálszekvenciákat és bakteriális eredetű FTF-enzimet kódoló szekvenciát tartalmaznak A kiméragén alkalmas arra, hogy génterméke szacharóz szubsztrát felhasználásával fruktóz polimert szintetizáljon, amennyiben a gént transzgenikus egyszikű vagy kétszikű növényekben expresszáltatjuk. Az FTF-gént megfelelően expresszáló transzgenikus kukorica növények (Zea mays), burgonya növények (Solanum tuberosum) vagy dohány növények (Nicotiana tabacum) abban különböznek az azonos fajhoz tartozó többi növénytől, hogy magjaikban, gumóikban vagy leveleikben felhalmozódott fruktán jelentéte mutatható ki.

Amennyiben a találmány szerinti DNS fragmenst egy növénybe juttatjuk, az a kívánt fehérjét oly módon expresszáltatja, hogy az említett hasznos polimer úgy halmozódik fel benne, hogy nem kell attól tartani, hogy a felhalmozódott polimer mennyisége csökkenne, vagy minősége megváltozna a növényben található degradáló enzimek működése következtében, a betakarítás, szállítás, vagy tárolás során, és anélkül, hogy az adott fajra jellemző általánosan hasznosított melléktermékek elvesznének. A bakteriális FTFgént, vakuólumspecifikus szingálszekvenciát és szövetspecifikus szabályozó szekvenciákat tartalmazó kiméragéneket hordozó transzgenikus haszonnövények megújuló forrást je··· ····

- 48 lentenek a nagy molekulatömegű fruktóz polimerek előállításának vonatkozásában. A fruktán felhalmozódásának mértékét részben: (1) a transzformált haszonnövényekben található kiméragén expressziójának mértéke fogja meghatározni. Az expresszió mértéke részben a szövetspecifikus expressziós szignálok hatékonyságán múlik, részben a növény genomjába integrálódott génkópiák számán, részben pedig attól függ, hogy a kiméragén a genomnak mely pontjára integrálódott be.

(2) A fruktán-felhalmozódás mértéke függhet a hozzáférhet szubsztrát mennyiségétől is. Az enzim számára hozzáférhető szubsztrát mennyisége a következő tényezőktől függ: transzformáit növény fajtája (a mutánsokat is beleértve), a szövet típusa, ahol az expresszió történik, az expresszió szubcelluláris lokalizációja, valamint az adott növény egyedfejlődési fázisa. (3) A bejuttatott fehérje stabilitása is befolyásolhatja a fruktán-felhalmozódás mértékét, a bejuttatott fehérje stabilitása pedig a következő tényezőktől függ: megfelelő poszt-transzlációs módosítások, megfelelő intracelluláris célba juttatás, valamint idegen környezetben való működőképesség.

A találmány szerinti megoldás kifejezett céljai közé tartozik a növényi sejtek vakuólumaiban tárolt, fotoszintézis útján keletkezett szacharóz hasznosítása, fruktánok felhalmozására, a találmány szerinti transzgenikus Zea mays magokban, Solanum tuberosum gumókban vagy Nícotiana tabacum levelekben, amit azáltal érhetünk el, hogy egy bakteriális FTF-gént alkalmas szövetspecifikus szabályozó szekvenciákkal és intracelluláris lokalizációt biztosító szekvenciák- 49 kai (például vakuólumbeli lokalizációt biztosító szekvenciákkal) együtt a megfelelő növénybe juttatunk.

Amennyiben sikeresen kívánunk expresszáltatni egy olyan gént, amely a B. amylolíquefaciens FTF-génjéhez hasonló szénhidrát metabolikus sajátságú enzimet kódol egy transzgenikus növényben, a következő tényezőket kell figyelembe vennünk: (1) a transzformálni kívánt növényfajta, (2) a szövet típusa, ahol az expressziót létre kívánjuk hozni, (3) az expresszió időzítése, valamint (4) a génexpresszió szubcelluláris lokalizációja. Mindezeket a tényezőket gondosan össze kell hangolnunk, amennyiben azt kívánjuk elérni, hogy valamely transzgenikus növényi sejtben fruktán termelődjék, anélkül, hogy a sejtet káros hatások érnék.

Amennyiben egy olyan szacharóz metabolizáló aktivitással bíró enzim génjét, mint például a bakteriális FTFfehérje, egy bizonyos transzgenikus növényfajban expresszáltatjuk, nem biztos, hogy azonos eredményeket kapunk, mint amikor az expressziót egy másik növényfaj sejtjeiben hajtjuk végre. Mivel a különböző növényfajok szénhidrát-tartalma egymástól különböző, arra lehet következtetni, hogy egy szacharózra specifikus enzim nem minden esetben talál elegendő szubsztrátot magának, és működésének nem egyforma lesz az eredménye, amennyiben az enzimet különböző fajokban expresszáltatjuk. A szacharóz szubsztrátként való hozzáférhetősége nem csak a különböző fajok esetén lehet nagy mértékben eltérő, de különbözhet egy adott fajon belül is a különböző mutánsok esetén [Lampe: Bot. Gaz., 91, 337 (1931)] . Bár a legtöbb növény szintetizált és

- 50 transzportál szacharózt, az azonban nem igaz, hogy valamenynyi növény a szacharóz transzportálásával oldja meg azt a feladatot, hogy széntartalmú vegyületeket juttasson a nem fotoszintetizáló szövetekbe. Például sok növényfaj szintetizál és transzportál· alditolokat. A zeller (Apium graveolens) leveleiben például mannitolt szintetizál, majd a mannitol a rosttasak nyalábokon keresztül transzportálódik, és a levélnyélben raktározódik [ Rumpho és mtsai.: Plánt Phys., 73, 869 (1983)] . Egy másik példa a

Cucurbitaceae nemzetség, amelyhez tartozó fajok elsődleges transzportálódó cukorszármazékai a raffinóz-szacharidok [Hendrix, Plánt Sci Lett., 39, 663 (1982); Webb és Gorham:

Plánt Physiol., 3 9, 663 (1964)] . Az elmondottakból következően a bejuttatott bakteriális FTF-enzim által szintetizált fruktánok mennyisége az adott növényfajban jelen lévő szénhidrátok minőségétől és a szacharóz koncentrációtól fog függni, amely a különböző fajok esetén meglehetősen különböző .

A szacharóz transzportálási mechanizmusok és a sülylyesztő-szövetekben történő felhalmozódás módja szintén jelentősen eltér a különböző növényfajok esetén. A fejlődő kukoricamagok esetén a szacharóz hidrolízise fontos összetevője az importálás! mechanizmusnak [ Porter és mtsai.: Plánt Phys., 77, 524 (1985)] , ugyanez azonban nem látszik szükségesnek a szójabab transzportmechanizmusa esetén [ Thorne: Plánt Phys., 70, 953 (1982)] , vagy a búza endospermium esetén [Jenner: Aust. J. Plánt Phys., 1, 319 (1974)] . Az FTF-gén expresszálása valamely növényfaj magja• · · · · · • · · · · • · · · ·« « · · · ·

- 51 iban bizonyos esetekben azt eredményezheti, hocry az enzim számára nagy mennyiségű szacharóz szubsztrát fog rendelkezésre állni, más növényfajok esetén azonban a fruktánszintézis a magokban gátolt lesz, mivel ezekben elsősorban hexóz cukrok találhatók.

A különböző növényfajok esetén megfigyelhető, eltérő szénhidrát felhalmozásra egy másik alkalmas példa lehet, a süllyesztő-szövetekben található cukrok összehasonlítása a paradicsom gyümölcse és a burgonya gumóinak vonatkozásában. A háziasított paradicsom gyümölcsében található szövetek elsősorban hexózokat halmoznak fel, három különböző invertáz enzim aktivitásának köszönhetően. Ha paradicsomgyümölcs vakuólumaiban található oldható savas invertáz valamint a sejtfalhoz kötött invertáz felelős elsősorban a hexóz felhalmozásért az egész szövet vonatkozásában. Leírták azonban egy sejtplazmában található lúgos invertáz jelenlétét is paradicsomban [Yelle és mtsai.: Plánt Phys., 95, 1026 (1991)] . Ezzel szemben a burgonyában az elsődleges süllyesztő szövetek - a fejlődő gumók - nem tartalmaznak invertáz aktivitást. A szacharóz a burgonya gumóiba intakt módon transzportálódik (ez igaz a paradicsom gyümölcse esetén is) , a hidrolízis azonban minimális szinten marad, mivel a burgonya gumóiban expresszálódik egy irreverzibilis fehérje-invertáz inhibitor [Pressey: Arch. Biochim. Biophys., 113, 667 (1966)] . A burgonya gumójának sejtjeiben a szacharóz hidrolízisét tovább gátolja az a tény, hogy a sejtplazmában található szacharóz-metabolikus enzimeknek kis mértékű az aktivitása. Az elmondottak következtében a

- 52 burgonya gumóiban a szacharóz legnagyobb része a vaku ól uniókban raktározódik, és hidrolizálatlan marad mindaddig, amíg fel nem használódik a keményítő bioszintéziséhez [Oparka és mtsai.: Planta, 182, 113 (1990)] .

Von Schaewen és mtsai. [EMBO J., 3033 (1990)] beszámoltak arról, hogy dohány növénybe transzformálva egy élesztő invertázgén expressziója - egy konstitutív növényi promóter, a CaMV-35S-promóter szabályozása alatt - eltérő fenotípust eredményezett, mint amikor ugyanezt a konstrukciót transzgenikus Arabidopsis thaliana-ban expresszáltatták. Ugyanazt az expressziós egységet, melynek segítségével az invertázt dohány növényben expresszáltatták [ von Schaewen, lásd fent] , felhasználták burgonya transzformálására is. A transzgenikus burgonya levelei az előző példáktól eltérően viselkedtek, ami valószínűleg annak a következménye, hogy bennük más a süllyesztőszövetek kapacitása, mint a dohányban és az Arabidopsis thaliana-ban [ Heineke és mtsai.: Plánt Phys. 100, 300 (1992)] . Mivel a forrásszövet - süllyesztőszövet - kölcsönhatás különböző fajok esetén különböző, nem meglepő, hogy amikor a kiméra invertázgént különböző növényfajokban expresszáltatták, ennek az egyensúlynak a megzavarása különböző hatásokat eredményezett.

Ha igaz az, hogy bizonyos növényfajok esetén az FTFfehérje sikeres expressziója gátolva van, akkor az is belátható, hogy egy adott fajon belül a különböző típusú szövetek is jelentős mértékben befolyásolhatják a termelődött fruktánok mennyiségét, és végeredményben a különböző szövetek különböző viselkedése együttesen fogja meghatározni, < * »··» ···· ···· ,»

- · · * » · • · · * * ·· ·*· ’»<’

- 53 hogy az adott növény hogyan reagál a fruktánok felhalmozódására. A növények növekedése és egyedfejlődés kritikus módon függ attól az energiától, amelyet a növény a fotoszintézis során a széndioxid szénhidrátokba történő fixálása útján nyer. Magasabbrendű növényekben a fotoszintézis elsődleges helye a levelekben és bizonyos mértékig a szárban van. Ezzel szemben a növények egyéb részei (például gyökerek, magok vagy gumók) nem járulnak hozzá jelentősen a szénhidrát szintézishez, hanem nagy mértékben függnek a fotoszintetikusán aktív szövetek által fixált széndioxidtól.

Ezért aztán létrejön egy energiaáramlás az exportáló szövetekből (forrásokból) kiindulva a fixált széndioxidot importáló (süllyesztő) szövetek irányába. A legtöbb növény esetén az elsődleges transzportált szénhidrát fotoasszimilátum a szacharóz, amely a forrásszövetektől a süllyesztő szövetek irányába transzportálódik. A szacharóz transzportálása a süllyesztő szövetek irányába sok növényfaj esetén tartalmaz egy aktív transzportlépést [ Daie, Plánt Mól. Bioi. Rep., Ί_, 106 (1989)] . Ez a transzport rendszer szacharózra specifikus, ezért ezen a rendszeren keresztül hexóz cukrok nem transzportálódnak hatékonyan, hanem újra abszorbeálódnak a rost edénnyalábokat körülvevő mezofil sejtekben [ Maynard és Lucas: Plánt Phys., 70, 1436 (1982)] . A szacharóz hidrolízise megzavarja az egész növényen belüli szénhidráteloszlást, ami végeredményben negatív hatást fejt ki azokra a szövetekre, amelyek leginkább függnek az importált energiától. Ez a süllyesztőszövet-forrásszövet kölcsönhatás nem csak a növény egyedfejlődése szempontjából központi je- 54 lentőségű, hanem döntő szerepe van a haszonnövények termőképessége szempontjból is [Turgeon: Ann. Rév. Plánt Physio.

Plánt Mól. Bio. 40, 119 (1989)] .

A szakirodalomban beszámoltak olyan esetekről, amikor egy élesztő invertázgén (melynek génterméke szacharózt hidrolizál) expressziója káros hatásokat váltott ki transzgenikus növények forrásszöveteiben [ Dickinson és mtsai.: Plánt Physiol 95, 420 (1991); Ding és mtsai.: The Plánt J., £, 179 (1993); Stitt és mtsai.: Planta 183, 40 (1990); von Schaewen és mtsai.: EMBO J., 9, 3033 (1990)] . Amennyiben egy élesztő invertázgént apoplasztokban expresszáltatunk, egyedülálló lehetőséget kapunk a sülylyesztőszövet-forrásszövet kölcsönhatások megzavarására és tanulmányozására. Amennyiben egy apoplasztspecifikus szignálszekvenciával fúzionáltatott invertázgént konstitutív módon expresszáltattak egy forrásszövetbe, a növekedés súlyos visszamaradását tapasztalták, a levelekben fokozott keményítő, glükóz és fruktóz felhaszhalmozódást, a fotoszintetikus aktivitás csökkent, és a gyökerek fejlődése visszamaradt transzgenikus dohánynövények [ von Schaewen és mtsai.: EMBO J., ]9, 3033 (1990)] és burgonyanövények esetén [Dickinson és mtsai.: Plánt Physiol 95, 420 (1991)] . Burgonyában az élesztő invertázgén megzavarta a szacharóz transzportot, ami a vízhiány okozta tünetekhez rendkívül hasonló tüneteket okozott, és végülis jelentősen csökkent mértékű gumótermelődést eredményezett [ Heineke és mtsai.: Plánt Phys. 100, 300 (1992)] . Valamennyi felsorolt eset azt mutatja, hogy amennyiben egy növényben a szénvegyületek

- 55 ···« · · · · ·· • · ·

transzportját megakadályozzuk azáltal, hogy egy forrásszövetben szacharózt hidrolizáló enzimet expresszáltatunk, a süllyesztőszövetek fejlődése visszamaradott lesz. Stitt és mtsai. [Planta, 183, 40 (1990)] szintén kimutatták, hogy a szacharóz transzport gátlása dohánylevelekben abban a szövetben szénhidrát-felhalmozódást eredményezett, ami a fotoszintetikus aktivitás csökkenéséhez vezetett. Amennyiben a szacharóz metabolizáló fehérjék expresszióját időzíteni kívánjuk, figyelembe kell vennünk a szacharóz koncentrációban tapasztalható jelentős változásokat, melyek a növény egyedfejlődése során bekövetkeznek. Egy szöveten belül a szacharózkoncentráció fontossága is változik időben. Például a szacharózkoncentráció szerepe egy süllyesztő-levélben meglehetőséen különbözik a szacharóz koncentráció forráslevélben betöltött szerepétől. A süllyesztő levelekben a szacharóz a növekedés érdekében metabolizálódik. Mindazáltal a levél érése során szacharóz exportálóvá válik. A levél működése szempontjából kevésbé kritikus módon a szacharóz átmenetileg a vakuólumokban tárolódik, majd a süllyesztő régiókba transzportálódik a rosttasak nyalábokon keresztül. A süllyesztő szövetek is változásokon mennek keresztül a szacharóz koncentráció vonatkozásában az egyedfejlődés során. Az édes dinnyékben például a szacharózkoncentráció a gyümölcs érése során változik. A fejlődés korai fázisaiban hexóz cukrok halmozódnak fel, amit a későbbiekben nagy mennyiségű szacharóz felhalmozódása követ [ Schaffer és mtsai.: Phytochemistry, 26, 1109 (1987)] . Ezzel szemben a borsómagokban az egyedfejlődés során a szacharóz koncentrá• ·

- 56 ció drámai módon lecsökken [ Holl és Vose: Can. J. Plánt Sci., 60, 1109 (1980)] . A fejlődő kukorica endospermiumban a megporzást követő 8-12. nap között a szacharóz koncentrációja növekszik, majd a megpórzás után 28 nappal a szacharóz koncentráció több mint 10-szeresére csökken [ Tsai és mtsai.: Plánt Phys. 46, 299 (1970)] . A szacharóz koncentráció a szója növény magjaiban is jelentősen változik az egyedfejlődés során, mivel a raffinóz-szacharidok koncentrációja a portokok kialakulását követően az 53. napon drámai módon megnövekszik [Amuti: Phytochemistry, 16, 529 (1977)] . Amint azt a fönti példák alapján láthatjuk, a növények egyedfejlődése során a szénhidrátok koncentrációja jelentősen változik, ebből is látható, hogy amennyiben ki akarjuk használni a fluktuáló szacharóz koncentrációból adódó előnyöket, rendkívül gondosan kell megválasztanunk a kívánt gén expresszáltatására használt promótert, hogy az expresszió a kívánt szövetben specifikusan, és a kívánt időben következzék be.

Egy transzgenikus növényfajta sajátságaira szintén drámai hatással lehet az, hogy a szacharóz metabolizmusban szerepet játszó enzimet - például egy invertázt vagy egy FTF-fehérjét milyen szubcelluláris lokalizációval expresszáltatjuk. Az olyan növények, melyek egy élesztő invertázgént a sejtplazmában, a vakuólumban vagy az apoplasztban expresszálták, egymástól jelentősen eltérő fenotípusos sajátságúak voltak, az expresszió szubcelluláris lokalizációjától függően. A transzgenikus dohánynövény sokkal érzékenyebb az invertázgén sejtplazmában

- 57 történő expresszáltatására, mint az apoplasztban történő expresszióra. Ez az eredmény arra utal, hogy amennyiben a sejtplazmában expresszáltatunk valamely szacharóz metabolizmusban szerepet játszó enzimet, akkor a szacharóz szintézisben zavar keletkezik [ Sonnewald és mtsai.: The Plánt Journal, 1^, 95 (1991)] . Az élesztő invertázt a vakuólumban expresszáló dohánynövények fenotípusos sajátságai nem voltak olyan drámaiak, ami arra utal, hogy a levelek vakuólumaiban átmenetileg tárolt szacharóz metabolikusan kevésbé aktív, mint a citoszolban található szacharózmennyiség .

A fotoasszimilátumok megoszlása a sejten belül a különböző elhatárolt térrészek között a növények növekedésének és egyedfejlődésének egyik fontos meghatározója. Azok az eredmények, melyeket úgy kaptak, hogy valamely szacharózmetabolizáló enzimet transzgenikus növények különböző sejten belüli térrészeiben expresszáltattak, világosan mutatják a szacharóz-kompartmentalizáció és a fehérje célba juttatás fontos szerepét a növények egyedfejlődésében és anyagcseréjében. Azon fenotípusos különbségek összefoglalását, melyek a szacharóz különböző szerepét tükrözik a különféle sejten belüli térrészekben, megtalálhatjuk Sonnewald és mtsai. publikációjában [ J. Exp. Bot., 44, 293 (1993)] . Az említett publikáció beszámol azokról a fenotípusos és biokémiai különbségekről is, melyek azokban a transzgenikus növényekben alakulnak ki, melyek az élesztőeredetű invertázgént a sejtplazmában, az apoplasztban vagy a vakuólumban expresszálják. Az említett sajátságok

- 58 attól függnek, hogy az invertáz melyik sejten belüli térrészben expresszálódik.

Amennyiben az invertázt a dohánynövény sejtplazmájában expresszáltatták, eredményül vastag összesodródott leveleket kaptak, ami feltehetőleg annak a következménye, hogy a levél felső felülete gyorsabban növekedett, mint az alsó. Amennyiben az ugyanezzel a promóterrel expresszáltatott azonos gén termékét a vakuólumba vagy az apoplasztba juttatták, a transzgenikus növényben elváltozások csak az öregedő levelek esetén jelentkeztek, ahol elszintelenedett és nekrotikus régiók alakultak ki. A fenotipusos különbségeken túl azon transzgenikus növények fiatalabb levelei, melyekben vakuólumspecifikus expresszió történt, nem mutattak észrevehető tüneteket, bár bennük a fotoszintézis mértéke valamivel nagyobb volt, mint a vad típusú kontrollnövények esetén. Azon transzgenikus növények esetén, melyekben az expresszió a sejtplazmában történt, a fotoszintézis mértéke kisebbnek bizonyult, mint a kontrollnövények esetén. A transzgenikus növények a sejtplazmában expresszáltatott invertázra rendkívül érzékenyek a sejtfalban expresszáltatott invertázhoz viszonyítva. Amennyiben valamely invertázt egy forrássejt sejtplazmájában expresszáltatunk, az közvetlenül megzavarja a szacharóz szintézist, az apoplasztban expresszált invertáz pedig gátolja a szacharóz transzportot. A vakuólumokban expresszáltatott invertáz szintén gátolhatja a szacharóz transzportot és arra utaló jelek vannak, hogy levélsejekben a vakuólumok és a sejtplazma közötti szacharóz csere meglehetősen nagy mértékű

- 59 lehet. Mivel a szacharóz a szénvegyületek növényen belüli továbbításában fontos szerepet játszik, megtalálható csaknem valamennyi növényi szövetben és számos sejten belüli térrészben. A különböző lokalizációjú szacharóz molekulák szerepe nem mindig azonos. A kompartmentalizáció a szacharóz vonatkozásában több fontos szerepet is betölt: távol tartja a szacharózt a metabolikus enzimek hatásától a transzportot megelőzően, bizonyos térrészek átmeneti szacharóz raktárként szolgálhatnak, amikor a szacharóz igény korlátozott, de bizonyos kompartmentek bizonyos fajok esetén a hosszútávú szacharóz raktározás céljait is szolgálhatják, például a cukornád és a cukorrépa esetén.

Az elmondottakból világosan következik, hogy az expresszió egyedfejlődési időzítésének és szubcelluláris lokalizációjának figyelmen kívül hagyásával nem tehető megalapoztt általánosított kijelentés szacharózanyagcserében szerepet játszó enzimek - például a bakteriális FTF-enzim - bármely növényfajban történő expreszszálásának hatékonyságáról. Amennyiben egy szacharóz anyagcserében szerepet játszó fehérjét egy konstitutív promóter alkalmazásával az egész növényben expresszáltatunk, az rendkívül káros lehet mint ahogy azt paradicsom esetén ki is mutatták [ Dickinson és mtsai.: Plánt Phys. 95, 420 (1991)] . A fotóasszimilátumok transzportjának megakadályozása paradicsomban a levelek deformálódásához vezetett, és a növekedés erős gátlásához. Ahhoz, hogy ilyen metabolikus enzimeket sikeresen expresszáltathassunk, az expressziót a megfelelő szövetspecifikus promóterrel kell szabályozni,

- 60 amely rendelkezik a megfelelő szacharóz raktárokhoz történő hozzáférés szempontjából alkalmas egyedfejlődési időzítéssel. Az elmondottak miatt az ilyen enzimek szubcelluláris célba juttatása is döntő fontosságú. Ahhoz, hogy a kívánt termék felhalmozódását valamely növényben káros hatások létrejötte nélkül elérhessük, szükséges gondosan összeválogatnunk az alkalmas promótereket, célba juttató szignálokat és a transzformálandó növényfajtákat. Mindeddig nem írták le heterológ szacharóz-metabolizáló enzim - mint például a bakteriális FTF-enzim - sikeres expresszióját növényi sejtekben, bár a fenti érvek alapján teljesen nyilvánvaló, hogy amennyiben egy ilyen fehérjét gondos térbeli és időbeli szabályozás nélkül expresszáltatunk egy növényben, az egyáltalán nem jelentené azt, hogy a kívánságunknak megfelelő növényt sikerülne előállítanunk.

A WO 89/123486 számú közzétételi iratban egy Streptococcus mutáns baktériumból származó FTF-gén paradicsomba történő bejuttatásáról számolnak be. Az Irakban feltárt expressziós egység egy mannopin szintáz promótert tartalmaz. Az Agrobacterium turnéfaciens-ből származó mannopin szintáz nagyon sokféle növényben konstitutív módon expresszálódik [ Barker és mtsai.: Plánt Mól. Bioi. 2, 335 (1983)] . Ezzel a promóterrel kapcsolatosan nem ismeretes, hogy bármely növényi szövetben vagy növényfajban szövetspecifikusán szabályozott lenne. Az említett szabadalmi bejelentésben leírt 19 transzformáns növény közül egy kivételével valamennyi esetén az integrálódás során a bejuttatott gén szekvenciája megsérült. Ennek következtében olyan meg- 61 rövidült RNS-transzkriptumok keletkeztek, melyekről nem várható, hogy FTF-aktivitással bíró fehérje keletkezne. Leírtak egy olyan transzformánst is, amely feltehetőleg teljes hosszúságú RNS-t termelt, de semmilyen kísérleti adatot nem találunk a leírásban, amely az FTF-aktivitás meglétét igazolná. Valószínű, hogy amennyiben az FTF-gént az egész transzgenikus paradicsomnövény valamennyi sejtjének sejtplazmájában expresszáltatjuk, az a szövetek fejlődése és növekedése szempontjából káros hatású, ahogy azt a dohánynövény esetén az élesztő invertázgén vonatkozásában kimutatták [ Sonnewald és mtsai.: The Plánt J., _1, 95 (1991)] . Feltehető, hogy az említett bejelentésben leírt transzformáció hatékonysága azért volt olyan alacsony, mivel a génexpresszió megakadályozta a fotóasszimilátumok süllyesztő szövetekbe történő transzportját. Amennyiben feltételezzük, hogy az ismertetett kísérletekben az aktív génexpresszióval szembeni szelekciós hatás lépett fel, könnyen megmagyarázhatjuk az idézett szabadalmi bejelentésben leírt génátrendeződési jelenséget. Elképzelhető, hogy valamely pontmutáció vagy néhány bázis deléciója - ami nem szokatlan jelenség olyan esetekben, amikor valamely gén expressziója valamely szövet szempontjából káros hatású olyan transzformánst eredményezhetett, amely látszólag teljes hosszúságú RNS-t termelt, de ez az RNS feltehetőleg nem transzlálódott működőképes FTF-fehérjévé.

A WO 89/12386 számú közzétételi iratban feltárják egy

GFT-gén apoplasztspecifikus expresszióját is paradicsomnövényben. Bár sikerült transzformáns növényeket előállítani,

- 62 a leírásban nem találunk információt a transzgenikus szövet enzimaktivitására vonatkozóan. Ez lehetséges, hogy annak a következménye, hogy a szénhidrát polimer szintézise a paradicsomsejtek apoplasztjában káros hatású. Egy élesztő invertázgén levél és szársejtek apoplasztjaiban történő expressziója esetén kimutatták, hogy paradicsom és dohány növényben az ilyen expresszió megszakítja a szénvegyületek áramlását és a szövetek fejlődését [Dickinson és mtsai.: Plánt Phys. 95, 420 (1991); von Schaewen és mtsai.: EMBO J. 9, 3033 (1990)] . GTF- vagy FTF-gének paradicsomnövény forrásszöveteiben történő expressziója feltehetőleg az élesztő invertázgén expressziója esetén leírtakhoz hasonlóan megszakítja a szénvegyületek transzportját és ezért káros hatású arra a szövetre nézve, amelyben az expresszió történik .

Amennyiben a leírt módon lehetséges volna szukrázokat expresszáltatni, akkor sem volna okunk feltételezni, hogy egyéb fajokban az expresszió azonos eredménnyel végrehajtható. A szacharóz anyagcserében szerepet játszó enzimek apoplasztikus expressziója különböző olyan szövetekben, mint például a kukorica endospermium, feltehetőleg kevés hatással járna az illető szövetre vonatkozóan, mivel ebben a sejttérrészben a szacharóz koncentráció minimális [ Shannon: Plánt Phys., 4 9, 203 (1972); Shannon: Plánt Phys., 4 9, 198 (1972); Felker és Shannon: Plánt Phys., 65, 864 (1980)] . Amennyiben egy FTF-gént burgonyagumók apoplasztjaiban expresszálnánk, feltehetően az FTF-enzim számára rendelkezésre állna szacharóz szubsztrát, de az is

- 63 feltételezhető, hogy az FTF-gén ilyen expressziója az említett szövetben káros hatású lenne. Oparka és Wright [ Planta, 175, 520 (1988)] kimutatták, hogy intakt gumósejtekbe szacharóz transzlokálódik, és amennyiben az ozmotikus potenciált megváltoztatjuk - például szacharóz hidrolízis útján - a hatás kritikus lesz, amely megakadályozza, hogy a szacharóz elérje a fejlődő gumókat [Oparka és Prior: Plánt Cell Env., 10, 667 (1987); Oparka és Wright: Planta, 174,

123 (1988)] .

Ahhoz, hogy megvalósítsuk fruktóz polimerek felhalmozódását olyan növénysejtekben, melyek természet szerint nem szintetizálnak ilyen típusú polimereket, és olyan helyen, ahol az expresszió lényegében nem káros hatású a szövetre nézve, olyan expressziós egységet kell előállítanunk, mely olyan transzkripciós és transzlációs iniciációs régiót tartalmaz, amely csak bizonyos kiválasztott növényi sejtekben működőképes; tartalmaznia kell egy FTF-gént, amely előnyösen tartalmaz valamely célba juttató szekvenciát megfelelő leolvasási fázisban, a struktúrgén 5'- vagy 3'-végén, amely célba juttató szekvenciák az FTF-fehérjét az endoplazmatikus retikulumba juttatják, majd a Golgi-készülékbe, onnan pedig a sejt vakuólumába; és az expressziós egységnek tartalmaznia kell egy transzkripciós terminációs régiót is.

Az FTF-enzim kifejezés olyan enzimet jelent, melynek fruktóz polimeráz aktivitása van. Előnyös FTF-enzim az extracelluláris FTF, levanszukráz EC 2.4.1.10. A találmány szerinti megoldásban alkalmazott FTF-gén származhat mikrobiális forrásból. Például olyan levanszukrázgéneket,

- 64 melyek a fruktózegységeket szacharóz molekulákból kiindulva polimerizálják levanná, különböző fajokból izolálhatunk, ilyenek többek között az Aerobacter levanicum [Evans és Hibbert: Adv. Carbohydr. Chem., 2, 253 (1946)]; a Bacillus subtilis [Dedonder, Methods Enzymol., 8_, 500 (1966); Bacillus polymyxa [Hestrin és mtsai.: Biochem. J., 37, 450 (1943)] ; Streptococcus salivarius [ Fuchs: Natúré, 17 8, 921 (1956)] és a Microbacterium levaniformus [Fuchs és mtsai.: Antonie van Leeuwenhoek, 51, 333 (1985)] . A találmány szerinti megoldásban előnyösen alkalmazott FTF kódoló szekvencia a Bacillus amyloliquefaciensből származik [ Mantsala és Puntala: FEMS Microbiol. Lett., 13, 395 (1982); Tang és mtsai.: Gene, 96, 89 (1990)] .

A találmány szerinti megoldás szempontjából az FTF-gén forrása nem döntő jelentőségű, csak az a lényeges, hogy alkalmas legyen a találmány szerinti megoldásban történő felhasználásra, azaz képes legyen transzgenikus növényi sejtekben nagy molekulatömegű fruktóz polimereket szintetizálni és felhalmozódásukat előidézni. A találmány szerinti FTF-fehérje szacharózt hasznosít, amely a legtöbb növény esetén a fotószintézből származó legfontosabb metabolit. Az ismertetett sajátságok alapján szakember képes más olyan fehérjét is alkalmazni a találmány szerinti megoldásban, amely szacharózt hasznosít szénhidrát polimer előállítása céljából. Az ilyen fehérjék egy csoportját szukrázoknak nevezik, ilyenek többek között a levanszukráz, az alternánszukráz, valamint a dextránszukrázok [ Abo és mtsai.: J. Bact., 173, 989 (1991); Gilmore és mtsai.:

- 65 Infec. and Immun., .58, 2452 (1990); Cote, Carbo. Poly. 19,

249 (1992); Giffard és mtsai.: J. Gén. Micro., 139, 1511 (1993)] . Mivel a dextránszukrázok és az alternánszukrázok az FTF-enzimekhez hasonló sajátságúak, feltételezhető, hogy az FTF-enzimekhez hasonlóképpen viselkednek, amennyiben transzgenikus növényekben expresszáltatják őket. A szukrázokat hasonló fehérjéknek tekinthetjük a következő szempontok alapján: valamennyi szukráz monomer molekulaként fejti ki hatását, egyedüli szubsztrátként szacharózt használnak, és valamely hexózegység polimerizációját katalizálják anélkül, hogy bármilyen más kofaktorra szükségük volna.

A dextránszukráz-fehérjék olyan glükóz polimerek keletkezését katalizálják, melyek ccl-3-, vagy otl-6kötésekkel, vagy ezek kombinációja által összekapcsolt glükózegységeket tartalmaznak. A különböző forrásokból izolált dextránszukrázgének, vagy az egyazon mikroorganizmusból izolált különböző, de rokon dextránszukrázgének expressziója során keletkező enzimek minősége határozza meg az adott polimer termékben található kötések és elágazások típusait. A glükózegységek összekapcsolódásainak típusa és a kötések mintázata közvetlen összefüggésben van a polimer sajátságaival. Az elsődlegesen al-3-kötésekkel összekapcsolt glükózegységeket tartalmazó polimerek például vízben oldhatatlanok, míg azok a polimerek, melyek elsődlegesen αΐ-β-kötéseket tartalmaznak, vízben jól oldódnak [Walker Int. Rév. in Biochem., 16, 75 (1978); Rolla és mtsai.: Special Supp. to Chem. Sci., 21. oldal, szerk.: Doyle és Ciardi (1983)] . Az alternánok olyan különleges dextránok, #··»

- 66 melyek alternáló al-3- és al-6-kötésekkel összekapcsolt glükózegységeket tartalmaznak [ Miasaki és mtsai.: Carbo. Rés., 84, 273 (1980)] . Az alternánok belső viszkozitása kicsi, hasonlóan a gumiarábikumhoz, melynek kis kalóriatartalmú töltőanyagként történő felhasználása iránt nagy igény mutatkozik. A gumiarábikum magas ára és a rendelkezésre álló kis kínálat miatt nagy igény mutatkozik alkalmas helyettesítőanyagra. Amennyiben az alternánokat versenyképes költségekkel lehetne termelni, kiváló helyettesítői lehetnének a gumiarábikumnak, de az alternánok egyéb módon is hasznosíthatók lennének, amennyiben megfelelő mennyiségben és megfelelő áron hozzáférhetők volnának.

A dextránokat jelenleg kereskedelmi méretekben fermentációval állítják elő, kizárólag nagy értékű nyersanyagként történő felhasználásra, például a tudományos kutatásban és vérplazma adalékanyagként. Amennyiben a dextránok felhalmozódása megvalósítható lenne transzgenikus növényekben, az növelné az előállítható mennyiséget, és csökkentené a jelenleg is hozzáférhető termékek árát, és az alacsony ár feltehetőleg új piacokat nyitna meg ezen újszerű polimerek számára. A felhasználási területeket a polimerek különleges sajátságai határoznák meg. A keményítők alkalmazhatóságát a glükózegységek közötti kötések mintázata és az elágazások száma határozza meg. A dextránok és alternánok egyedi glükóz-kötéseket tartalmaznak, melyek a keményítő molekulákban nem találhatók meg, és ezért a termékek olyan területeken lehetnének alkalmazhatók, ahol a természetes vagy módosított keményítők nem.

- 67 ···* ··«· «« · e * · · · ·· I * * · · · · « • · · · » · · ··· • · ·· ·· ·» f.

Ahhoz, hogy valamely FTF-gént vagy valamely szukrázgént megfelelő módon expresszáltassunk, szükségünk lehet olyan különböző kiméra expressziós egységek alkalmazására, melyek különböző promótereket tartalmaznak. A technika állása szerint idegen gének expresszálása transzgenikus növényekben nem jelent problémát [ De Blaere és mtsai.: Meth. Enzymol. 143, 227 (1987)] . A találmány szerinti megoldás előnyös megvalósítási módja az FTF-gén kukorica, burgonya és dohány növények - sorrendben - magjaiban, gumóiban és leveleiben történő expresszálása. A találmány szerinti megoldás alapján transzformálhatok többek között az alábbi növények mag és gumó szövetei, oly módon, hogy az említett vagy egyéb hasonló szénhidrát polimereket halmozzák fel (például dextránokat és alternánokat): cukorrépa, cukornád, csicsóka, cikória és canola.

A találmány szerinti megoldás szempontjából nem döntő fontosságú, hogy az FTF-expressziót szabályozó promótert milyen forrásból izoláljuk, csak az a lényeges, hogy a kiválasztott gazdanövényben és szövettípusban megfelelő mértékben képes legyen expresszáltatni az FTF-gént, ily módon megvalósítva a találmány szerinti megoldást. A találmány szerinti megoldásban előnyösen olyan promótereket alkalmazunk, amelyek lehetővé teszik fehérjék expresszióját specifikusan magokban, gumókban vagy levelekben. Specifikus magokban működő promoterek például a magokban található tartalékfehérjék promóterei. Az ilyen tartalékfehérjék expressziója szigorúan szabályozott, ezek a fehérjék kizárólag a magszövetben expresszálódnak. A szigorú szabályozás

- 68 döntő fontosságú lehet az optimális expresszió elérése szempontjából vagy abban az esetben, mikor az expresszáltatni kívánt enzim számára egy bizonyos szubsztrátkészletet kell hozzáférhetővé tenni. A magvakban található tartalékfehérjék expressziója rendkívüli mértékben szerv-specifikus, amellett, hogy fejlődési fázis specifikus is [Higgins és mtsai.: Ann. Rév. Plánt Physiol., 35, 191 (1984); Goldberg és mtsai.: Cell, 56, 149 (1989);

Goldberg és mtsai.: Bioassays, 10, 108 (1989)] . Az egyedfejlődés különböző fázisaiban különböző tartalékfehérjék expresszálódhatnak a magvakban. A technika állása szerint számos példa ismeretes tartalékfehérjék magspecifikus expressziójára kétszikű növényekben. Ily módon expresszálták például a szója lektingénjét [ Okumaro és mtsai.: Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83, 8240 (1986)] , a borsó legumingénjét [ Shirsat és mtsai.: Mól. Gén. Génét., 215, 326 (1989)] , valamint a repcemagok napinszukrázét [ Radke és mtsai.: Theor. Appl. Génét. 75, 685 (1988)] .

Kiméra-génkonstrukciók esetén kimutatták, hogy a heterológ kódoló szekvenciákhoz funkcionálisan kapcsolt magspecifikus promóterek transzgenikus növényekben megőrzik eredeti időbeli és térbeli expressziós mintázatukat. Példaként megemlíthetjük az Arabidopsis thaliana 2S-jelű magspecifikus tartalékfehérjéjének promoterét, melyet enkefalinpeptidek transzgenikus Arabidopsis és B. napus fajok magvaiban történő expresszálására használtak [ Vandekerckhove és mtsai.: Biotechnology, 7_, 929 (1989)] . Kimutatták azt is, hogy a bablektin és β-fazeolin

- 69 promóterei, melyeket luciferázgén expresszálására használtak, transzgenikus dohány növényekben megfelelően működtek [ Riggs és mtsai.: Plánt Sci., 63, 47 (1989)] .

A kukorica legnagyobb mennyiségben előforduló magspecifikus tartalékfehérjéi a zeineknek nevezett alkoholban oldódó polipeptidek. A zeinek néhány egymástól elkülönülő osztályba sorolhatók, SDS-poliakrilamid-gélelektroforézis alkalmazásával meghatározott méretük szerint. A zeingéncsalád termékei specifikusan a kukorica endospermium sejtjeinek szemcsés endoplazmatikus retikulumában szintetizálódnak, a megporzást követő 12-50. napok között [ Larkin és Hurkman: Plánt Phys., 62, 256 (1978)] . Mivel a zein promóterek szigorúan szabályozott szövetspecifikus expressziót biztosítanak, és RNS transzkripciós szintjük viszonylag magas, ezek a promóterek kiválóan alkalmasak heterológ gének transzgenikus kukorica endospermium sejtekben történő expresszálására. A technika állása szerint számos különböző zeinfehérjét azonosítottak már [ Pederson és mtsai.: J. Bioi. Chem., 261, 6279 (1986); Das és Messing: Mól. Cell Bioi., Ί_, 4490 (1987); Hiffman és mtsai.: EMBO, 6, 3213 (1987)] . A találmány szerinti nukleinsav fragmens magspecifikus expressziójának biztosítására előnyös promóter a 10 kD molekulatömegű magspecifikus zein tartalékfehérje [ Kirihara és mtsai.: Mól. Gén. Génét., 211, 477 (1988); Kirihara és mtsai.: Gene, 71, 359 (1988)] .

Burgonya esetén azok a promóterek alkalmazhatók előnyösen a találmány szerinti megoldásban, melyek lehetővé teszik az FTF-gén szövetspecifikus expresszióját a gumók- 70 bán. Gumóspecifikus promóterek például a granulum-kötött keményítő szintáz gének promóterei [ Visser és mtsai.: Plánt. Mól. Bio., 17, 691 (1991)] , a keményítő elágazgató enzim promótere [ KoBmann és mtsai.: Mól. Gén. Génét., 230, 39 (1991)], valamint a patatin-tartalékfehérje promótere [ Rocha-Sosa és mtsai.: EMBO J., Q_, 23 (1989)] . Kimutatták, hogy heterológ kódoló szekvenciákhoz funkcionálisan kapcsolt gumóspecifikus promóterek transzgenikus növényekben megtartják időbeli és térbeli expressziós mintázatukat. Példaként megemlítjük a GUS-markergén közvetlen expreszsziójára használt granulum-kötött keményítőszintáz promótert [Visser és mtsai.: Plánt Mól. Bioi., 17, 691 (1991);

van dér Steege és mtsai.: Plánt Mól. Bioi., 20, 19 (1992)] , valamint a CAT-markergén közvetlen expresszáltatására használt patatinpromótert [Twell és mtsai.: Plánt Mól. Bioi., 9, 345 (1987)] , ezt a promótert a GUS-gén expreszszáltatására is alkalmazták [Wenzler és mtsai.: Plánt Mól.

Bioi. 12, 41 (1989)] .

A találmány szerinti megoldás szempontjából rendkívül előnyösen alkalmazható gumóspecifikus génexpressziót biztosító promóter a patatinpromóter, melyet jól jellemeztek abban a vonatkozásban, hogy meghatározták a szövetspecifikus és az egyedfejlődés specifikus expresszióért felelős szabályozó szekvencia régióit [ Mignery és mtsai.: Nuc. Acids

Rés., 12, 7987 (1984); Jefferson és mtsai.: Plánt Mól. Bioi. 14, 995 (1990); Twell és mtsai.: Plánt Mól. Bioi. 9, 345 (1987)] . Burgonyában génexpresszióra különösen előnyösen alkalmazható promóter a I.

osztályba tartozó

- 71 patatinpromóter. Ezt a promótert nagy részletességgel jellemezték szövetspecifikus és egyedfejlődés-specifikus expresszié szempontjából. A találmány szerinti megoldás szempontjából előnyösen a szacharózt hasznosító enzimek génjét kizárólag a tartaléktápanyag-szövetekben expreszszáltatjuk, például gumószövetben, éppen ezért az I . osztályba tartozó patatinpromóterek, melyek a gumókban expresszálódnak, különösen előnyösek a II. osztályba tartozó patatinpromóterek azonban, melyek a gyökerekben is expresszálódnak, kevésbé előnyösek [ Pikaard és mtsai.: Nuc. Acids Rés., 15, 1979 (1987)] . Különösen előnyös az I. osztályba tartozó patatinpromóter egy rövidített változata, amely a transzkripciós iniciációs helytől 5'-irányban található 1,0 kb hosszúságú régiót tartalmazza. Ebben a patatinpromóter fragmensben két szövetspecifikus szekvenciaelemet azonosítottak, az egyik a -40 - -400. bázispárok közé esik, a másik pedig a -400 - -957 bázispárok közé, a transzkripciós iniciációs helytől számítva. Ez a két szekvenciaelem elégséges ahhoz, hogy gumóspecifikus expressziót biztosítson egy olyan kiméragén számára, amelyben ez a rövidített patatinpromóter fragmens a GUSmarkergénhez van fuzionáltatva [ Jefferson és mtsai.: Plánt Mól. Bioi. 14, 995 (1990)] . Kimutatták azt is, hogy a patatinpromóter egy -40 - -957 bázispárjai közé eső fragmense (a transzkripciós iniciációs helytől számítva) képes gumóspecifikussá változtatni a karfiol mozaik vírus promóterének egy rövidített változatát, mely promóterről kimutatták, hogy természetes állapotában az egész növényben mindenhol expresszálódik [ Jefferson és mtsai.: Plánt Mól. Bioi. 14, 995 (1990)] .

Azonosítottak olyan promótereket, melyek alkalmasak általában dohánylevelekben expresszió előidézésére. Egy ilyen promóter például a ribulóz-bisz-foszfát karboxiláz gén (SSU-gén) kis alegységének promótere [Mazur és Chui: Nuc. Acids Rés., 13, 2313 (1985)] . A karfiol mozaikvírus (CAMV) 35S-promótere is előnyösen alkalmazható dohánynövényben történő expresszióra, előnyösen levélszövetben. Leírták azokat a szekvenciarészleteket, melyek szükségesek ahhoz, hogy a CAMV-35S-promóter dohányszövetekben általános expressziót biztosítson [ Odell és mtsai.: Natúré 313, 810 (1985)] . A CAMV-35S- és SSU-promóterekről kimutatták, hogy képesek heterológ gének expresszióját hatékonyan irányítani nem csak azokban a fajokban, melyekből származnak, hanem számos más növényfajban is, bármely más eddig vizsgált promóternél több fajban.

A növényi sejtek sejtplazmájában szacharóz szintézis folyik és a termelődött szacharóz ugyanott fel is használódik. A szacharóz kiindulási anyag számos sejt-struktúra és sejttermék fölépítésénél. Bár a szacharóz a vakuólumokban felhalmozódik, ez a felhalmozódás a teljes egyedfejlődés időtartamát tekintve csak rendkívül rövid idejű is, de lehet valamivel hosszabb is, például a cukorrépa esetén. A vakuólumban felhalmozódott szacharóz metabolikusan nem aktív (a vakuólumokban nem hasznosítódik, mint bármely sejttermék előállításának metabolitja), éppen ezért amennyiben a vakuólumokban felhalmozódott szacharózt használjuk fel

- 73 rruKtanoK szintézisére, az reitenetoieg íenyegesen Kevésce fog káros hatással járni a növény számára, mintha a szintézishez a sejtplazmában található szacharózt használnánk. A vakuólumokban raktározott szacharózt oly módon hasznosíthatjuk például, hogy az FTF-gént a transzgenikus sejtek vakuólumaiba juttatjuk.

A növényi sejtek vakuóluma, amely a kiválasztó rendszer része, számos olyan feladatot lát el, melyek létfontosságúak a sejtek növekedése és fejlődése szempontjából, ilyen feladatok például: az aminosavak, a szervetlen ionok és a metabolikus intermedierek (például glükóz, fuktóz és szacharóz) felhalmozása. A felsorolt vegyületek közül sok fehérjékből álló csatornákon keresztül, vagy aktív transzporttal jut be a vakuólumba [ Matile, Ann. Rév. Plánt Physiol. 2 9, 193 (1978); és Wink, J. Exp. Bot. 44, 231 (1993)] . A vakuólumban működő fehérjék nem egyszerű diffúzióval jutnak a vakuólumba, és nem is a tonoplaszton keresztüli közvetlen transzport útján. A vakuólumspecifikus fehérjéket egy N-terminális szignálpeptid először a szemcsés endoplazmatikus retikulumba (ER) irányítja. A szignálpeptid az endoplazmatikus retikulumban lehasad, azt követően, hogy az endoplazmatikus retikulum a Golgi készülékkel fuzionálódik, ahol a fehérje további feldolgozása történik. A fehérjék vakuólumba történő célba jutását egy második szignálszekvencia határozza meg, amely a fehérjének vagy az N- vagy pedig a C-terminális végén található [Chrispeels: Ann. Rév. Plánt Phys. és Plánt Mól. Bioi. 42, (1991); Chrispeels és Rahikael: Cell, 68, 613 (1992)] .

-74 Ez a szekvencia lehetővé teszi, hogy a fehérje a Golgi készülékben kiválasztódjék. A Golgi készülék által kiválasztott vezikulumok, melyek az adott fehérjét tartalmazzák, fölismerik a tonoplasztokat és azokkal fuzionálnak, és ily módon a fehérjét a vakuólumba juttatják [ Neuhaus és mtsai.: Proc. Natl. Acad. Sci., 88, 10362 (1991); Bednarek és Raikhel: The Plánt Cell, 3, 1195 (1991); Chrispeels: Ann. Rév. Plánt Physiol és Plánt Mól. Bioi., 42, 21 (1991)] .

Azonosítottak számos vakuólumspecifikus szignálszekvenciát, többek között a dohány kitináz-A [ Neuhaus és mtsai.: Proc. Natl. Acad. Sci., 88, 10362 (1991)] , az árpaaluerain [ Holwerda és mtsai.: Plánt Cell, 4, 307 (1992)] , a dohány Bl-3-glukanáz [ Melchers és mtsai.: Plánt Mól. Bioi., 21, 583 (1993)] , valamint a patatin vakuólumspecifikus szignálszekvenciáját [ Sonnewald és mtsai.: The Plánt J., _1, 95 (1991)] .

A találmány szerinti megoldás szempontjából előnyös vakuólumspecifikus szignálszekvenciák az édesburgonya gyökérspecifikus tartalékfehérjéjének, a sporaminnak, valamint az árpa lektingénjének szignálszekvenciái. A sporaminfehérje prepro-peptidként szintetizálódik, és kizárólag Nterminális szignálszekvenciát tartalmaz. Az N-terminális szekvencia egy 21 aminosavhosszúságú prepeptidet tartalmaz, valamint egy további 16 aminosav hosszúságú propeptidet, mely szekvenciák felelősek az endoplazmatikus retikulumba történő bejutásért, és a vakuólumban történő kiválasztódásért [ Matsuoka és Nakamura: Proc. Natl. Acad. Sci., 88, 834 (1991)] . Az árpa lektingénje tartalmaz szignálszekvenciákat ·· ···· ··

- 75 mind az N- mind pedig a C-terminális végén, melyek - sorrendben - felelősek az endoplazmatikus retikulumba történő bejutásért és a Golgi készülékben történő kiválasztódásért [ Bednarek és Raikhel: The Plánt Cell, 3_, 1195 (1992); Dombrowski és mtsai.: Plánt Cell, 5, 587 (1993)] .

Kimutatták, hogy transzgenikus növényekben heterológ vakuólumspecifikus fehérjék képesek pontosan célba jutni [ Bednarak és mtsai.: Plánt Cell, _2, 1145 (1990); Matsuoka és Nakamura: Proc. Natl. Acad. Sci. 88, 834 (1991); Holwerda és mtsai.: Plánt Cell, £, 307 (1992)] . Az a tény, hogy kimutatták, miszerint az árpa vakuólumspecifikus lektinfehérjegénjének génterméke dohányban megfelelő módon nyeri el térszerkezetét, processzálódik, és célba jut, arra utal, hogy az egyszikűek és kétszikűek célba juttató rendszere meglehetősen hasonló egymáshoz [Wilkins és mtsai.: Plánt Cell 2y 301 (1992)] . Azt is kimutatták, hogy amennyiben vakuólumspecifikus gének szignálszekvenciáit funkcionálisan heterológ kódoló szekvenciákhoz kapcsoljuk kiméragénkonstrukciókban, a kiméragén transzgenikus növényekben vakuólumspecifikusan fog expresszálódni. A következő példákat említjük meg: a patatin vakuólumspecifikus szignálszekvenciáját fuzionáltatták az élesztő invertázt kódoló Suc2génjével, és kimutatták, hogy a géntermék transzgenikus dohánysejtekben pontosan célba jut a vakuólumokba [ Sonnewald és mtsai.: The Plánt J., 95 (1991)] , a dohány kitináz-A, (külön kísérletben) az árpalektin C-terminális szignálszekvenciáját fuzionáltatták az uborkakitináz szekretálódó formájával. A kiméra uborkakitináz pontosan célba jutott a do- 76 -

nanysejrex vaKuoiumawa mmaKet KiserietDen [ Neunaus es mtsai.: Proc. Natl. Acad. Sci., 88, 10362 (1991); Bednarek és Raikhel, The Plánt Cell, 3, 1195 (1991)] . Az FTF-fehérje célba juttatására kiválasztott vakuólumspecifikus szignálszekvencia forrása a találmány szerinti megoldás szempontjából nem lényeges, csak az a fontos, hogy az alkalmazott szignálszekvencia képes legyen a működőképes FTF-fehérjét a kívánt transzgenikus növényi sejtek vakuólumaiba juttatni.

A találmány szerinti megoldásban felhasználhatunk bármely olyan 3'-végi nem kódoló régiót, amely tartalmaz poliadenilációs szignált és egyéb szabályozó szekvenciákat, melyek szükségesek lehetnek az FTF kódoló régió megfelelő expresszálásához. Ilyen lehet például a nopalin szintáz gén 3'-végi régiója, különböző növényi vírusok génjeinek 3'végi régiói, például a 35S- és 19S-jelű CaMV-gének 3'-végi régiói, a kukorica Cl-gén 3'-végi régiója, valamint bármely más forrásból származó 3'-végi szekvenciák, azzal a feltétellel, hogy az alkalmazott szekvencia hordozza az ahhoz szükséges információkat, hogy a promóter / FTF kódoló régió kombináció, amelyhez funkcionálisan hozzá van kapcsolva, megfelelően expresszálódjék. A technika állása szerint számos olyan közlemény ismert, melyekben kitanítás található a különböző alkalmas 3'-végi nem kódoló régiók felhasználásáról [például: Inglebrecht és mtsai.: Plánt Cell, 1^, 671 (1989)] .

Az eddig elmondottak és a példákban adott kitanítás alapján szakember képes a találmány szerinti kiméra konstrukciókat megváltoztatni oly módon, hogy azokból a

Dromótert, a vakuólumspecifikus szianálszekvenciát, az FTFgén kódoló szekvenciáját vagy a 3'-végi transzkripciós terminációs régiót kiejti, és valamely hasonló funkciójú DNS-fragmenssel helyettesítik, mely fragmens származhat mikrobiális, növényi vagy egyéb forrásból, de az ily módon létrehozott konstrukciók, eljárások és transzgenikus növények nyilvánvalóan az igényelt oltalmi körön belül maradnak. A találmány szerinti eljárás alkalmas lehet olyan mikrobiális vagy növényi forrásból származó kódoló régió expresszáltatására is, amely nem feltétlenül FTF-aktivitású génterméket kódol, hanem expresszáltathatunk bármely olyan gént, melynek terméke szacharóz-szubsztrát felhasználásával valamely szénhidrát polimert szintetizál, ilyen géntermék lehet például az alternánszukráz, a dexránszukráz, a glikozil transzferáz vagy bármely szukráz enzim.

Szakember számára számos eljárás ismeretes, melyek alkalmazásával DNS-szekvenciákat magasabbrendű növényi sejtekbe lehet juttatni (például transzformálás; lásd például a 0 295 959 A2- és 0 138 341 Al-számú EPO közzétételi iratokat) . Alkalmas eljárások például az Agrobacteríum fajok Ti- és Ri-plazmidjain alakuló transzformációs vektorok alkalmazásai. Különösen előnyös a felsorolt vektorok bináris típusainak alkalmazása. A Ti-eredetű vektorok nagyon sokféle magasabbrendű növény transzformálására alkalmasak, ilyenek például a dohány, a burgonya és a canola.

A találmány szerinti kiméragéneket dohány vagy burgonya növényekbe juttatás céljából beépíthetjük az 1. példában leírt bináris vektorokba. Ezek a vektorok egy

- 78 Agrobacterium turnéfaciens eredetű bináris Ti-plazmidvektor rendszer részei [Bevan, Nuc. Acids Rés., 12, 8711 (1984)] . A találmány szerinti kiméragéneket kukorica növénybe bejuttathatjuk például nagy sebességű ballisztikus bombázással, a találmány szerinti nukleinsav konstrukciókkal vagy nukleinsav-fragmensekkel burkolt fémrészecskék alkalmazásával [Klein és mtsai.: Natúré (London), 327, 70 (1987); Klein, 4, 945, 050 sz. USA-beli szabadalmi leírás] . Az, hogy a találmány szerinti DNS-t milyen eljárással juttatjuk a kívánt növényi sejtekbe nem döntő fontosságú, csak az a fontos, hogy a találmány szerinti DNS-t vagy DNS-fragmenst oly módon juttassuk a növényi sejtbe, hogy a transzformáció következtében fruktánpolimerek szintetizálódjanak és halmozódjanak fel szövet- és szubcelluláris térrészspecifikusán .

Amennyiben a kiméragének expressziójának mértékét kívánjuk megvizsgálni a transzformált növények leveleiben, magjaiban és gumóiban, eljárhatunk például úgy, hogy az adott szövetből az FTF-fehérjét kivonjuk, majd a technika állása szerint ismert immunológiai módszerekkel azonosítjuk a fehérjét és mennyiségét meghatározzuk. Eljárhatunk úgy is, hogy a levél, mag vagy gumószövetet megőröljük, poláros oldószerrel extraháljuk, izoláljuk és betöményítjük a nagy molekulatömegű poliszacharidokat (a fruktánokat is beleértve) , majd a poliszacharidokat ezután úgy mutatjuk ki, hogy hidrolízis után kvantitatív enzimes karakterizálást, vagy kvalitatív TLC-analízist hajtunk végre, mely eljárásokat

- 79 kesztóz—specifikus festéssel kombinálunk [ Wise és mtsai. : Anal. Chem., 27, 33 (1955)] .

A találmány szerinti megoldást az alábbiakban bemutatott példákkal kívánjuk tovább szemléltetni, amelyben a megadott arányok és százalékok tömegarányt és tömegszázalékot jelentenek, a fokok pedig Celsius fokokat, ha másképp nem jeleztük. Megjegyezzük, hogy az alább bemutatott példák kizárólag a találmány szerinti megoldás szemléltetését szolgálják, előnyös megvalósítási módjainak bemutatása révén. A fenti kitanítás és az alábbi példák alapján szakember képes megérteni a találmányi megoldás lényegi jellemzőit, és anélkül, hogy a találmány szerinti megoldás alapgondolatától és az igényelt oltalmi körtől eltérne, létrehozhat a találmány szerinti megoldásban különféle változtatásokat vagy módosításokat, a találmány szerinti megoldás különböző feltételek közötti alkalmazás céljából. Valamennyi idézett publikációt - beleértve az idézett szabadalmi okiratokat is - teljes terjedelmében a kitanítás részeként kell tekinteni.

1. példa

A SacB-géntermék FTF-aktivitásának jellemzése

A SacB-jelű FTF-gén expresszálása Bacillus fajokban

A találmány szerinti FTF-gént (SacB) úgy állítottuk elő, hogy egy Bacillus amyloliquefacíens genomi DNSkönyvtárt az FTF-gén publikált szekvenciája alapján készített oligonukleotidokkal szkríneltünk [ Steinmetz és mtsai.:

Mól. Gén. Génét., 200, 220 (1985)] . Az alkalmazott

klónozási eljárást a Tang és mtsai. által leírtak szerint végeztük [Gene, 96, 89 (1990); Nagarajan és mtsai.:

5,162,2070 sz. USA-beli szabadalmi leírás] . Az FTF-gén izolálható például bármely Bacillus amyloliquefaciens DNSkönyvtárból. Ilyen baktériumok beszerezhetők az American Type Culture Collection Intézettől (Rockville, MD) . A Bacillus FTF-gén kódoló szekvenciáját úgy módosítottuk, hogy bejuttattunk egy EcoRV-hasítóhelyet a 29 aminosavból álló prokarióta szekréciós szignálszekvencia 3'-végi hasítóhelyére (a restrikciós hely kezdete a 894. bázispár). A EcoRV-hasítóhelyet helyspecifikus mutagenezissel juttattuk be, a Muta-gene™ in vitro mutagenezis reakciós készlet alkalmazásával (Bio-Rad, Richmond, CA) . Az EcoRVhasítóhely bejuttatására alkalmas oligonukleotid szekvenciáj át - melyet a Muta-gene reagenskészlettel együtt történő alkalmazásra terveztünk - az egyes szekvenciaazonosítószámon mutatjuk be. A bejuttatott EcoRV-hasítóhely jelenlétéről restrikciós hasítással győződtünk meg, és később DNS-szekvenálás útján is igazoltuk. A fentiek szerint kialakított plazmidot, amely tartalmazta a módosított FTFgént, pB311-nek neveztük el. A pB311-plazmid lehetővé tette a további DNS-manipulációs beavatkozásokat, mivel lehetséges izolálni belőle egy olyan DNS-fragmenst, amely tartalmazta az érett FTF-fehérjét kódoló génszekvenciát, a prokarióta szekréciós szignálszekvenciától elkülönítetten.

A pB311~plazmid által kódolt FTF-aktivitás jellemzése

A módosított FTF-gén analízisét úgy hajtottuk végre, hogy első lépésben egy Bacillus subtilis törzset (BE1500)

- 81 transzformáltunk a pB311-plazmid-DNS-sel. Ezt úgy hajtottuk végre, hogy egy 10 ml SPI-táptalajt tartalmazó 250 ml-es lombikot beoltottunk egy Bacillus subtilis tenyészettel úgy, hogy az OD₆₀₀-érték 0,15 legyen. A lombikot ezután 3 óráig 37 °C-on inkubáltuk, míg az OD₆₀₀-érték elérte az 1,0át. A sejteket ezután meghígítottuk 100 ml SPII-táptalaj hozzáadásával, majd 90 percen át az előzővel azonos hőmérsékleten inkubáltuk őket. A sejteket ezután kiülepítettük a táptalajból 10 percen át 8000 g-vel végrehajtott centrifugálással, szobahőmérsékleten. A sejteket ezután újra felszuszpendáltuk a felülúszó 10 ml-ében (ezáltal 10-szeres töményítést értünk el). Az ily módon kezelt sejteket ezután a következő módon transzformáltuk: egy steril centrifugacsőbe 50 μΐ SPII-EGTA-oldatot helyeztünk, ami 1-5 μg plazmid-DNS-t tartalmazott. Ezután a fentiek szerint kezelt 1 ml sejthez 2 ml SPII-EGTA-oldatot adtunk, majd ennek a szuszpenziónak 300 ml-ét helyeztük plazmid-DNS-t tartalmazó centrifuga csőbe. A reakcióelegyet ezután 37 °C-on enyhe rázatás közben 20-30 percig inkubáltuk. Az inkubálást követően a reakciótasakba 100 ml LB-táptalajt adtunk, majd az inkubálást ugyanazon a hőmérsékleten 30 percig folytattuk. Ennek az elegynek 100-100 μΙ-ét LB-agar-táptalajt tartalmazó Petri-csészékre szélesztettük, amely a pB311-plazmidot tartalmazó sejtek szelektálása céljából 5 μg/ml klóramfenikolt tartalmazott.

Az ismertetett kísérletekben az alábbi összetételű oldatokat és táptalajokat alkalmaztuk:

- 82 Tbase (1 x) (NH₄)₂SO₄ 1 g

K₂HPO₄ 7 g

KH₂PO₄ 3 g

Na-citrát 0,5 g

MgSO₄ 0,1 g kétszer desztillált víz 500 ml-ig

SPI

100 ml lxTbase-oldathoz az alábbi összetevőket adjuk:

ml 50 %-os glükózoldat ml 10 %-os élesztőkivonat (DIFCO) ml 1 %-os casamino acids-oldat ml 2 %-os MgS0₄-oldat

SPII

Ez a táptalaj azonos az SPI-táptalajjal, azzal az eltéréssel, hogy tartalmaz 0,5 ml 0,1 mol/1 CaCl₂-oldatot is.

SPII-EGTA

Ez a táptalaj azonos az SPI-táptalajjal, azzal az eltéréssel, hogy tartalmaz 0,2 ml 0,1 mol/1 EGTA-oldatot is. LB-agar-táptalaj g tryptone (DIFCO) g élesztőkivonat g NaCl

0,7 % agar

2xdesztillált víz 1 1-ig.

Nyers bakteriális fehérjekivonatok készítése

A pB311-plazmidot tartalmazó Bacillus törzsekből az alábbiak szerint készítettünk nyers fehérjekivonatokat. 2 • · ·· • · · · • · · * *

- 83 ml sejttenyészetet egy éjszakán át növesztettünk, 30 °C-on gazdag táptalajban (LB-táptalajban), amely 5 μg/ml klóramfenikolt és 2 % szacharózt is tartalmazott. A sejteket a tápközegből 20 percen át végzett 8000 g-vel történő centrifugálással ülepítettük ki. A felülúszóból az oldható cukrokat úgy távolítottuk el, hogy az extraktum 1 ml-ét ’’Sephadex G-25M oszlopra vittük fel (Pharmacia AB, Upsala, Svédország), majd az oszlopot 1 percig 1500 g-vel centrifugáltuk. A kiválasztott fehérjéket tartalmazó oldatot centrikon-30 koncentrátor (Amicon Co., Beverly, MA) alkalmazásával 10-szeresre töményítettük, a gyártó előírásai szerint.

LB-táptalaj g tryptone (DIFCO) g élesztőkivonat g NaCl

2xdesztillált víz 1 1-ig

Az FTF-aktivitás kimutatása a nyers fehérjekivonatokban

Az FTF-aktivitást többféle módon is meghatároztuk:

1) Az FTF-aktivitás meghatározása glükóz oxidáz alkalmazásával

Az FTF-aktivitást úgy határoztuk meg, hogy a fehérjekivonatokat 37 °C-on 30 percen át egy 2 % szacharózt tartalmazó 50 mmol/1 káliumfoszfát pufferoldattal (pH=6,0) inkubáltuk. Az enzimreakciót 10 perces 100 °C-os inkubálással állítottuk le. A negatív kontroll kísérleteket úgy végeztük, hogy a nyers fehérjekivonatot 10 percig 100 °C-on inkubáltuk, a foszfáttal puffereit szacharóz oldat

- 84 r··· ·»»· ·· · · i » « · » · « • · · * · · * • · · ·· · ····· a · · · · ♦ · · · hozzáadása előtt. Ez a kezelés az FTF-aktivitást elpusztítja, és így lehetővé válik, hogy meghatározzuk a vizsgált fehérjekivonatban a glükóz koncentráció alapvonalát. Az FTF-aktivitást úgy határoztuk meg, hogy mértük a felhasznált szacharózból felszabaduló glükóz koncentrációját. Ezt úgy hajtottuk végre, hogy az enzimreakció leállítása után a reakcióelegyeket glükóz oxidázzal és peroxidázzal együtt inkubáltuk, a Glucose Trider reagenskészlet alkalmazásával (Sigma Chemicals CO., St. Louis, MO) , a gyártó utasításai szerint, és meghatároztuk a keletkezett quinoneiminefesték mennyiségét, spektrofotometriás analízis útján (340 nm-nél mért OD-értékek alapján), és a mért értékeket összehasonlítottuk a negatív kontrollok és ismert koncentrációjú glükóz oldatok esetén mért értékekkel. A módosított FTFfehérjét tartalmazó őacillns-törzsből származó nyers fehér j ekivonatok glükóz oxidázos analízisének eredményeit az 1. táblázatban foglaltuk össze.

1. táblázat (Optikai denzitás 340 nm-en mérve) + szacharóz - szacharóz

Fehérjekivonat nélkül 0,18 0,18 pB311 2,97 0,17 pB311 (hővel inaktiválva) 0,70 0,19

Az 1. táblázatban látható adatokból egyértelműen kiderül, hogy a pB311-plazmidot tartalmazó Bacillus-törzsekből ···· ···· ··

- 85 származó nyers fehérjekivonatok tartalmaznak szacharóz bldroláz aktivitást.

2) Az FTF-aktivitás kimutatása enzim-kapcsolt vizsgálati eljárás alkalmazásával

A nyers fehérjekivonatokat 37 °C-on, 30 percen keresztül 2 % szacharózt tartalmazó 50 mmol/l-es káliumfoszfát pufferoldatban (pH=6,0) inkubáltuk. Az enzimreakciókat 10 perces 100 °C-os hőkezeléssel állítottuk le. Az inaktivált fehérjéket tartalmazó negatív kontrollokat úgy készítettük, hogy a nyers fehérjekivonatot a foszfáttal puffereit szacharózoldat hozzáadása előtt 10 percen keresztül 100 °Con hőkezeltük. Ez a kezelés elégséges az enzimaktivitás elpusztításához, és lehetővé teszi, hogy meghatározzuk az oldatban az FTF-aktivitástól függetlenül jelenlévő glükóz koncentrációt (alapvonal). Az FTF-aktivitást úgy mértük, hogy meghatároztuk a glükóz szacharózból történő felszabadulásának mértékét, oly módon, hogy a leállított reakcióelegyeket 20 percig 30 °C-on glükóz koncentrációmeghatározó oldattal inkubáltuk. Ezt a reakciót 10 perces forró vizes fürdőben történő inkubálással állítottuk le, és az enzimaktivitás mértékét úgy határoztuk meg, hogy 340 nmen mértük a NAD —» NADH átalakulás mértékét. A kapott értékeket összehasonlítottuk a negatív kontrollok és ismert koncentrációjú glükózoldatok esetén mérhető értékekkel.

Az FTF-aktivitásról további információt szereztünk azáltal, hogy meghatároztuk a szacharózból felszabaduló fruktóz mennyiségét, miután a fehérjekivonatokat a fentiek szerint szacharózzal inkubáltuk. Az aktivitást enzim-kapcsolt i

i reakcióval határoztuk meg, oly módon, hogy a leállított reakcióelegyeket 30 °C-on 20 percen keresztül hexózmeghatározó oldattal inkubáltuk, majd a reakciót forróvizes fürdőben történő 10 perces inkubálással állítottuk le. Az alkalmazott reakcióban a foszfoglükóz izomeráz átalakítja a szabad fruktózt glükózzá, mely átalakulás során további

NAD-molekulák alakulnak NADH-vá. Ebben az esetben a 340 rímnél mért OD-értékek a szabad glükóz- és fruktózkoncentráció összegét jellemzik. Amennyiben összehasonlítjuk a glükóz meghatározó eleggyel inkubált fehérjekivonatok esetén mért értékeket azokkal az értékekkel, melyeket a hexóz meghatározó oldattal történt inkubálás után kaptunk, lehetőség nyílik az oldatban található szabad fruktózkoncentrációjának meghatározására.

Glükózmeghatározó oldat 0,2 mol/1 HEPES/NaOH (pH=8,0) mmol/1 MgCl₂ mmól/ NAD mmol/1 ATP mmol/1 DTT

2,5 egység/ml hexokináz

2,5 egység/glükóz-6-foszfát dehidrogenáz Hexózmeghatározó oldat

Glükózmeghatározó oldat + 4 egység/ml foszfoglükóz izomeráz A pB311-plazmidot tartalmazó Bacíllus törzsekből készített fehérjekivonatok aktivitásmérése során kapott kísérleti adatokat a 2. táblázat foglalja össze.

- 87 ···· ···· · · • · · ·

- 87 2. táblázat (340 nm-en mért optikai sűrűség) Glükózmeghatározó oldat + szacharóz - szacharóz

Fehérjekivonat nélkül 0,09 0,10 pB311 (hővel inaktiválva) 0,07 0,09 pB311 1,17 0,36

Hexózmeghatározó oldat Fehérjekivonat nélkül 0,10 pB311 1,21

0, 18

0,33

A 2. táblázatban bemutatott kísérleti adatok megerősítik a glükóz oxidázos módszerrel (lásd 1. táblázat) kapott eredményeket, melyek arra utalnak, hogy az EcoRV-hasítóhely bevitelével módosított FTF-fehérje megtartja szacharózhidrolizáló aktivitását. A 2. táblázat adatai azt is mutatják, hogy a reakcióelegyekben a fruktóz nem 1:1 arányban található, ami abban az esetben lenne várható, ha a nyers fehérjekivonatokban kizárólag szacharózhidrolizáló aktivitás volna jelen. A polimerizált fruktóz nem reagál a hexózkimutató oldatban található foszfoglükóz izomeráz enzimmel. A szabad fruktóz koncentráció kis értéke arra utal, hogy a nyers fehérjekivonatban található fehérjék a szacharózból nem csak glükózt szabadítanak fel, hanem valahogy felhasználják a keletkezett fruktózt, valószínűleg polimerizáció útján.

- 88 3) Az FTF-aktivitás kimutatása HPLC-eljárással

Az FTF-aktivitás kvalitatív analízisét úgy hajtottuk végre, hogy a fehérjekivonatokban kimutattuk nagy molekulatömegű szénhidrát polimerek jelenlétét, melyek azután keletkeztek, hogy a fehérjekivonatokat 2 % szacharózt tartalmazó 50 mmol/l-es káliumfoszfát pufferoldatban (pH=6,0) 37 °C-on, 30-60 percig inkubáltuk. A negatív kontrollokat úgy készítettük, hogy a nyers fehérjekivonatokat 10 percig 100 °C-on hőkezeltük, a foszfáttal puffereit szacharózoldat hozzáadása előtt. Az inkubálást követően a termelődött fruktánt anioncserélő HPLC-eljárással analizáltuk, 0-100 mmol/l-es NaOH-gradiens alkalmazásával, Dionex PA-100 oszlopon, Dionex PAD detektor alkalmazásával (Dionex Sunnyvale, CA) . A reakcióelegyek kromatográfiás profilját összehasonlítottuk autentikus levan-standardok kromatográfiás profiljával (Sigma Chemical Co. St. Louis, MO) .

4) A fruktóz polimerek analízise vékonyréteg-kromatográfia alkalmazásával

Az FTF-aktivitás kvalitatív analízisét az alábbiak szerint is elvégeztük: a nyers fehérjekivonatokat 2 % szacharózt tartalmazó 50 mmól/ml-es nátrium-foszfát pufferoldattal (pH=6,0) inkubáltuk, 37 °C-on, 30-60 percen át. A negatív kontrollokat úgy állítottuk elő, hogy a nyers fehérjekivonatokat 10 percen át 100 °C-on hőkezeltük, a foszfáttal puffereit szacharózoldat hozzáadása előtt. Az inkubálást követően a reakcióelegy 5-10 μΐ-ét felvittük egy 20 cm x 20 cm-es Fisher Redi/plate™ vékonyréteg-lemezre (Fisher Scientific, Pittsburg, PA) , pozitív kontroliokkal

- 89 együtt (a következő pozitív kontrollokat alkalmaztuk: fruktóz, glükóz, szacharóz, keményítő és cikória inulin, melyeket a Sigma Chemicals Co. cégtől szereztünk be; St. Louis, MO) . A lemezt egy TLC-kamrában futtattuk, amely oldószerként a következő elegyet tartalmazta: víz, n-butanol és 2propanol, az oldószerek aránya 4:3:12 volt. Amikor az oldószer front a lemez felső szélétől 1 cm-re volt, a lemezt a kamrából kivettük, és levegőn megszárítottuk. A lemezt ezután bepermeteztük kesztóz-specifikus festékkel [ Wise és mtsai.: Anal. Chem., 27, 33 (1955)] . A festéket úgy állítottuk elő, hogy foszforsavat 1 mol/l-esre hígítottunk vízzel telített n-butanollal. Ehhez az elegyhez 3 g karbamidot adtunk, majd 5 ml etil-alkoholt.

A kesztóz-specifikus festéket levegőn hagytuk megszáradni a TLC-lemezen. A fruktózt és a fruktóz polimereket, melyek a szacharózból keletkeztek az FTF-aktivitás hatására, úgy tettük láthatóvá a TLC-lemezen, hogy azt 5-10 percig 100 °C-ra hevítettük. Az ismertetett eljárás során a glükóz rendkívül halvány jelet adott, a keményítő pedig nem adott látható jelet. A fruktóz és szacharóz jelek az oldószer front közelében voltak találhatók, az inulinstandardok pedig olyan jelet adtak, amely a kiindulási ponttól lényegesen nem vándorolt tovább.

5) A fruktánok mennyiségi kimutatása anthrone-analízissel

Az extraktumokat úgy állítottuk elő, hogy a szöveteket 80 %-os etanolban megőröltük, majd 10-15 percig 70 °C-on inkubáltuk a reakcióelegyet. Az etanolban oldhatatlan anyagot centrifugálással kiülepítettük (13000 g, 5 perc) . Az

9 9 9 99

- 90 üledéket újra felszuszpendáltuk 80 %-os etanolban, a szuszpenziót 10-15 percig 70 °C-on inkubáltuk, majd ismét kiülepítettük. Ezt a lépést harmadszor is megismételtük, és a végsó üledéket vízben felszuszpendáltuk. Az oldatot ezután 10-20 percen keresztül 70 °C-on inkubáltuk, majd 5 percen át 13000 g-vel centrifugáltuk. Az eltávolított felülúszót használtuk fel a fruktán koncentráció meghatározására.

A fruktán koncentrációt az alábbiak szerint határoztuk meg. Az etanolban oldhatatlan extraktumokat 10 percig 100 °C-on hevítettük tömény sósavban. A reakcióelegyet ezután lehűtöttük, és nátrium-hidroxiddal semlegesítettük. A sósavval kezelt mintákhoz 1 ml anthrone-oldatot adtunk, majd az elegyet 40 °C-on 20 percig inkubáltuk, ezt követően a reakcióelegyet lehűtöttük, és a fruktóz mennyiséget 620 nmen végzett spektrofotometriás analízissel meghatároztuk, oly módon, hogy a mért értékeket ismert koncentrációjú fruktóz oldatok esetén mért értékekkel hasonlítottuk össze.

Mivel az anthrone-nal vizsgált frakció etanolban oldhatatlan volt, feltételeztük, hogy az ebben a frakcióban található szénhidrátok eredetileg nagy molekulatömegűek voltak (azaz fruktánok voltak). Az oldható szénhidrátokat, amik befolyásolhatták volna a spektrofotometriás meghatározást, azokban a lépésekben távolítottuk el, melyekben az extraktumokat 80 %-os forró etanollal kezeltük. A spektrofotometriás analízist megelőzően TLC-analízissel kimutattuk, hogy az extraktumok nem tartalmaztak oldható szénhidrátokat, melyek a pontos meghatározást megzavarták volna. Az elmondottak értelmében a fent leírt módon végrehajtott anthrone-os

- 91 analízis megbízható értékeket szolgáltat a jelenlevő fruktán mennyiségének meghatározása vonatkozásában.

Anthrone-oldat ml tömény kénsavat hozzáadtunk 20 ml vízhez. Az így készített kénsavoldathoz 0,15 g anthrone-t adtunk (Sigma

Chemicals, St. Louis, MO).

2. példa

Kiméragénkonstrukciók a SacB-FTF-gén expresszálására

Nicotíana tabacuiriban

FTF-gén konstitutív expressziója Nicotiana tabacumban

Előállítottunk egy olyan expressziós egységet, amely a

Bacillus FTF-gént a Nicotiana tabacum leveleinek és szárainak sejtplazmájában konstitutív módon képes volt expresszáltatni, oly módon, hogy első lépésként az SSU-gén iniciációs kódonjában létrehoztunk egy Ncol-hasítóhelyet, a DNS-fragmens szubklónozásának céljából. Ezt oly módon értük el, hogy a pNtSS23-plazmidot [ Mazur és Chui, Nuc. Acids Rés., 13, 2373 (1985)] megemésztettük SphI-enzimmel, és a túlnyúló 3'-végi nukleotidokat Escherichia coli DNSpolimeráz enzim alkalmazásával eltávolítottuk, 37 °C-on 10 percig tartó emésztéssel, a következő reakcióelegyben: 40 mmol/1 kálium-foszfát (pH=7,5), 6,6 mmol/1 magnéziumklorid és 1 mmol/1 2-merkapto-etanol. Ezután a plazmidot egy Ncol-hasítóhelyet tartalmazó kapcsoló oligonukleotid alkalmazásával (New England Biolabs) összeligáltűk, majd megszekvenáltuk, annak eldöntése céljából, hogy az újonnan kialakított Ncol-hasítóhely ATG-szekvenciarészlete ugyanab···· · · · · • · · · • · · · · · · • · · · · · · • · · ·· · · ····

- 92 bán a pozícióban található-e, mint az eredeti iniciációs kódon. Az ily módon előállított p338-nak neveztük el.

A p338-plazmidból izoláltunk egy 1,0 kb-os HindlII/NcoI-fragmenst, majd a fragmens ragadós végeit Klenow-enzim és dNTP-k alkalmazásával, önmagában ismert eljárással tompavégűvé feltöltöttük. A fenti HindlII/NcoIfragmens szekvenciája tartalmazza az SSU-gén szabályozó szekvenciájának azt a részletét, amely szükséges a fénnyel indukált génexpresszióhoz kétszikű növények szárában és leveleiben [ Mazur és Chui: Nuc. Acids Rés. 13, 2373 (1985)] .

Ezt a fragmenst a pDH51-plazmidba ligáltuk [ Pietrzak és mtsai.: Nuc. Acids Rés., 14, 5857 (1986)] , melyet előzőleg

EcoRI-enzimmel megemésztettük, és a túlnyúló végeit feltöltöttük, kicserélve ily módon a plazmidban eredetileg található CaMV-promótert. A ligációs elegyekkel Escherichía coli DH5a-törzset transzformáltunk [supE44 dél lacU169 (phi 80 lacZ dél M15) hsdR17 recAl endAl gyrl96 thil relAl] , majd ampicillinrezisztens kolóniákat szelektáltunk. A szelektált kiónokat a belőlük izolált plazmid-DNS restrikciós endonukleázos analízisével szkríneltük.

Az ily módon kialakított pSSUDH51-jelű plazmidban az iniciációs kódont tartalmazó Ncol-hasítóhely helyreállt, és egy EcoRV-hasítóhelyet is beiktattunk a plazmidba, az iniciációs kódonnal azonos leolvasási fázisban, PCR-eljárás alkalmazásával, egy Applied Biosystems cég által forgalmazott DNS-szintetizátoron szintetizált oligonukleotidok alkalmazásával. A láncindítóként használt oligonukleotidok szekvenciáját a 2. és 3. azonosítószámon adtuk meg. A 3.

• ·

- 93 azonosítószámú szekvenciában egy Xbal-hasítóhely is található szubklónozási célokra.

A PCR-reakcióelegy mindkét láncindítóból 0,1-0,3 ng-ot tartalmazott, maximum 1 gg templát DNS-t, 4 μΐ 2,5 mmol/1 dNTP-oldatokat, 5 μΐ lOxreakciópuffért [ 800 mmol/1 Tris (pH=9, 0), 200 mmol/1 (NH₄)₂SO₄, 15 mmol/1 MgCl₂] , 1 μΐ Perfect Match™-oldatot (Stratagene, La Jolla, CA) , valamint vizet, amivel a reakcióelegy térfogatát 49 μΙ-re egészítettük ki. A kezdeti 95 °C-on 5 percig végzett denaturálas után valamennyi reakcióelegyhez 1 μΐ TAQ -polimerázt adtunk, és a PCR-t a következő ciklus szerint hajtottuk végre: 95 °C: 1 perc, 42 °C: 2 perc, 72 °C: 3 perc, 40 ciklus. A PCR-rel előállított DNS-fragmenseket 1,2 %-os agaróz gélben választottuk szét és ethidium-bromiddal tettük őket láthatóvá.

Az izolált DNS-fragmenst BglII- és Xbal-enzimekkel megemésztettük, és a pSSUDH51-plazmidba ligáltuk, melyet előzőleg szintén megemésztettünk ugyanazokkal a restrikciós enzimekkel, előállítva ily módon a pSSU/P-plazmidot. A Bacillus amyloliquefaciens FTF-génjének kódoló szekvenciáját - a bakteriális szekréciós szignál nélkül - úgy építettük be a pSSU/P-plazmidba, hogy a pB311-plazmidot EcoRV- és Xbal-enzimekkel hasítottuk. Ezután a FTF-gén kódoló régióját tartalmazó 1,3 kb-os fragmenst beligáltuk a szintén EcoRV- és Xbal-enzimekkel emésztett pSSU/P-plazmidba, előállítva ily módon a pSSU-SacB-plazmidot. A pSSU-SacBplazmidból BglII- és KpnI-enzimekkel végzett emésztés után izoláltunk egy DNS-fragmenst, amely tartalmazta az SSU- 94 promotert - a 365 bázispárral kezdődően (BglII-hasítóhely, lásd Mazur és Chui: Nuc. Acids Rés., 13, 2373 (1985)] -, az FTF-gén teljes kódoló szekvenciáját, valamint a CaMVtranszkripciós terminátor szekvenciáját, majd az izolált fragmenst egy bináris Agrobacterium tumefaciens Ti-plazmid alapú vektorba ligáltuk, a pZS97-be.

A pZS97 vagy pZS97K bináris vektorokat használtuk a kiméragének növényekbe történő juttatására. Mind a pZS97, mind pedig a pZS97K bináris vektorok részei egy Tiplazmidon alapuló bináris vektorrendszernek [ Bevan, Nucl. Acids Rés. 12, 8711 (1984)] , mely Agrobacterium tumefaciens eredetű. A vektorok a következő lényeges összetevőket tartalmazzák: (1) transzformált növényi sejtekben szelektálható markerként egy nopalin szintáz::neomicinfoszfotranszferáz kiméragént [nos::NTPII; Bevan és mtsai.: Natúré 304, 184 (1983)], (2) a Ti-plazmid T-DNS-ének baloldali és jobboldali határoló szekvenciáit [ Bevan, Nucl. Acids Rés. 12, 8711 (1984)] , (3) az Escherichia coli lacZgénjének α-komplementáló szegmensét [ Viering és mtsai.: Gene 19, 259 (1982), egyedi Sáli-, BamHI- és Kpnlhasítóhelyekkel (pZS97K) , vagy egyedi Hindin-, BamHI- és KpnI-hasítóhelyekkel (pZS97) a polilinker régióban, (4) a pVSl-jelű Pseudomonas plazmidból származó bakteriális replikációs origót [ Itoh és mtsai.: Plasmid 11, 206 (1984)], valamint (5) a Tn5-transzpozonból származó bakteriális neomicin foszfotranszferáz gént [ pZS97K; Berg és mtsai.: Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 72, 3628 (1975)] vagy a bakteriális β-laktamáz gént (pZS97), mely gének a transz- 95 formált Agrobacterium sejtekben használhatók szelekciós markerként. A kiméragéneket tartalmazó bináris vektorokat három résztvevős keresztezés útján [ Ruvkin és mtsai. : Natúré 289, 85 (1981)] az LBA4404/pAL4404-jelű

Agrobacterium törzsbe juttattuk [ Hockema és mtsai.: Natúré 303, 179 (1983)] , majd ampicillin rezisztenciára (pZS97) vagy kanamycin rezisztenciára (pZS97K) szelektáltunk. Dohánylevél-lemezek transzformálása Agrobacteriummal történő fertőzés útján

A bináris vektorokat tartalmazó Agrobacterium tenyészeteket használtuk fel dohánylevél-lemezek transzformálására [ Horsch és mtsai.: Science 227, 1229 (1985)] . A leveleket úgy sterilizáltuk, hogy 30 percig mostuk őket a következő összetevőket tartalmazó oldatban: 900 ml steril víz, 100 ml klorox-fehérítő és 10 ml 10 %-os SDS-oldat.

Ezután a leveleket háromszor leöblítettük steril vízzel, és levéllemezkéket készítettünk belőlük, vagy oly módon, hogy a leveleket 1 cm-es négyzetekre vagdaltuk, vagy oly módon, hogy steril lukasztóval állítottunk elő levéldarabkákat. A lemezeket a megfelelő bináris vektorokat tartalmazó

Agrobacterium sejtekkel oltottuk be, oly módon, hogy a levéldarabkákat a baktériumokat tartalmazó LB-táptalajba merítettük. A beoltott levéllemezkéket CN-táptalajba vittük át, majd három napon keresztül fényben szobahőmérsékleten inkubáltuk őket. A három napos inkubálást követően a levéllemezkéket átvittük olyan CN-táptalajba, amely tartalmazott 500 mg/1 Claforan-t (cefotaxime) és 300 mg/1 kanamycint, majd a lemezkéket további 4-6 héten keresztül

- 96 inkubáltuk. Az említett időtartam elteltével a lemezkékről levágtuk a kifejlődött hajtásokat, és azokat gyökereztető táptalajra helyeztük, amely tartalmazott 500 mg/ml Claforan-t (cefotaxime) és 300 mg/1 kanamycint. Miután a hajtások 2-4 hetet töltöttek a gyökereztető táptalajon, körülbelül 40-50 %-uk hajtott gyökeret. A gyökeres hajtásokat átültettük nedves metro-mix-táptalajba, 8 inch átmérőjű cserepekbe, majd megvizsgáltuk, hogy jelen van-e bennük a bejuttatni kívánt kiméragén.

CN-táptalaj egy csomag Murashige és Skoog-féle (MS) szerves minimáltáptalaj, szacharózzal kiegészítve (KC Biochemicals vagy GIBCO) % BAP

0,1 μg/l naladixin-sav g agar

500 ml víz (pH=5,8)

Gyökereztető táptalaj egy csomag Murashige és Skoog-féle (MS) szerves minimáltáptalaj, szacharóz nélkül (KC Biochemicals vagy

GIBCO) g szacharóz g agar

500 ml víz (pH=5,8)

A pSSU-SacB-gén expressziója meggátolja a dohánynövény regenerálódását

Dohánylevél lemezkék beoltására olyan bináris vektort tartalmazó Agrobacterium-ok tenyészetét alkalmaztuk, mely

- 97 vektor alkalmas volt a pSSU-SacB expressziós egység dohánygenomba történő juttatására, a beoltást együtttenyésztés útján hajtottuk végre [ lásd fent, valamint Horsch és mtsai.: Science, 227, 1229 (1985)] . Miután megkíséreltük a transzgenikus növényeket kanamycint tartalmazó szelektív táptalajon regenerálni, mindössze három életképes hajtást kaptunk. A kapott hajtásokat gyökereztető táptalajra vittük át, a szokásosan alkalmazott idő alatt azonban gyökerek nem fejlődtek (3-5 hét) A kontrollkísérletben azokból a levéllemezkékből, melyeket olyan Agrobacterium tumefaciens baktériumokkal inkubáltunk, melyek kizárólag a pZS97 bináris vektort tartalmazták, legalább 10-szer több hajtást kaptunk, azonos levéllemezke számra vonatkoztatva. A kontroll hajtások a gyökereztető táptalajon, amely kanamycint is tartalmazott 2-4 hét alatt gyökeret hajtottak. A fentiekben ismertetett teljes kísérletet megismételtük, egészen a pB311-plazmidból származó FTF-génfragmens fentiek szerinti szubklónozásától elindulva, beleértve a bináris vektor bejuttatását, a három résztvevős keresztezést és a dohány levéllemezkékkel történő inkubálást, abból a célból, hogy sikerüljön olyan életképes dohánynövényeket regenerálni, melyek az SSU-SacB expressziós egységet tartalmazzák. A második kísérlet eredményeként mindössze négy regenerált dohányhajtást sikerült előállítanunk a szelektív táptalaj on.

• · • ······ • · · · · · · • ·· ·· · · · · · ·

- 98 A potenciális transzformánsok tesztelése kanamycinrezisztenciára, kalluszképző táptalajon történő tenyésztéssel

A négy regenerálódott hajtásból származó levéllemezkéket, valamint pozitív kontrollszövetet (kizárólag a bináris vektorral transzformált szövet) olyan kalluszképző táptalajra helyeztünk, mely 50 gg/ml kanamycint is tartalmazott szelekciós célból. A kizárólag az NPTII-gént tartalmazó pozitív kontroll levéllemezkék szélei körül 4-6 hét szobahőmérsékleten végrehajtott inkubálást követően kallusz képződött. A fent leírt kísérlet során előállított négy hajtásból készített levéllemezkék szélén kallusz-szövet nem képződött. Valószínűnek tűnik, hogy a kísérlet során létrehozott hajtások nem voltak valódi transzformánsok, hanem a CNtáptalajon végrehajtót kanamycin szelekció előli menekültek voltak. A két ismertetett kísérlet eredményeiből levonhatjuk azt a következtetést, hogy az alkalmazott promóter segítségével az FTF-gén expresszáltatása dohánysejtekben rendkívül káros hatású a dohánynövények növekedésére, egyedfejlődésére és regenerálódására.

Kalluszképző táptalaj egy csomag Murashige- és Skoog-féle (MS) minimáltáptalaj (KC Biologicals) g szacharóz g agar víz, 500 ml-ig (pH=5,8) szerves

3. példa

A bakteriális FTF-gén indukálható expressziója dohánynövényben

Indukálható FTF expressziós egység előállítása

Lehetőség nyílt az FTF-aktivitás káros természetének megértésére - amennyiben az FTF-gént dohánylevél sejtek sejtplazmájában expresszáltatjuk indukálható expressziós egység létrehozásával. Amennyiben a dohánynövényt olyan FTF-génnel transzformáljuk, amely nem íródik át mRNS-sé, és ezért nem transzlálódik működőképes fehérjévé indukálás nélkül, lehetővé teszi, hogy a transzformánsokat regeneráljuk, anélkül, hogy az FTF-aktivitás növekedésre és egyedfejlődésre kifejtett gátló hatása a sejtekben megnyilvánulna. Az ily módon bejuttatott gént azután a dohánynövény egyedfejlődésének különböző fázisaiban aktiválhatjuk, hatásának analizálása céljából.

Kémiailag indukálható FTF expressziós egység előállítása

A pB311-plazmidból [Tang és mtsai.: Gene 96, 89 (1990); Nagarajan és mtsai.: 05,162,207 sz. USA-beli szabadalmi bejelentés] izoláltuk a SacB-promótert és kódoló régiót - amely tartalmazta a bakteriális szekréciós szignálszekvenciát is -, oly módon, hogy a plazmidot KpnI- és Xbal-enzimekkel hasítottuk. Az izolált KpnI/Xbal-fragmenst a pUC18-plazmidba (New England Biolabs, Beverly MA) ligáltuk, melyet előzőleg ugyanezekkel a restrikciós enzimekkel hasítottunk. Az eredményül kapott plazmidot p3114nek neveztük el. A p3114-plazmidot azután megemésztettük EcoRV- és HindlI-enzimekkel, majd az érett FTF-gént kódoló

-100régiót egy 1,3 kb-os DNS-fragmensen izoláltuk a promótertől és a szekréciós szignálszekvenciától. Ezt az 1,3 kb-os fragmenst beépítettük egy EcoRV- és Smal-enzimekkel emésztett Bluescript-SK(+) klónozó vektorba (Stratagene La Jolla, California). Az Xhol-hasítóhelyre beépítettünk egy BglII kapcsoló oligonukleotidot, a p3114-plazmidból származó EcoRV/HindlI-fragmenst tartalmazó pBluescript-SK(+)plazmidban, megközelítőleg 48 bázisnyira 3'-irányban a transzlációs terminációs szignáltól. Az így előállított plazmidot pSacB-BglII-nek neveztük. A transzkripciós terminációs régiót úgy építettük be a pSacB-BglIIplazmidba, hogy a BglII- és KpnI-enzimekkel megemésztett plazmidba beépítettük a 2-1.12-gén [ Hershey és Stoner: Plánt. Mól. Bioi. 17, 679 (1991); Hershey: 07,327,205 sz. USA-beli szabadalmi leírás] 503 bázispáros BglII/Kpnlfragmensét. Az eredményül kapott plazmidot, amely tartalmazta a SacB-FTF-gén érett fehérjét kódoló régióját, valamint a 2.1.12-gén transzkripciós terminációs régióját, pSacB:2-1-nek neveztük el.

Előállítottunk egy olyan expressziós egységet, mely az alábbi összetevőket tartalmazta: 2-2.3-promóterrégió [Hershey és Stoner: Plánt Mól. Bioi., 17, 679 (1991)] , a klorofil-a/b-kötó fehérje (Cab) génjének transzlációs vezető szekvenciája [ Dunsmuir: Nuc. Acids Rés., 13, 2503 (1985)] , valamint a nopalinszintáz (Nos) gén 3'-végi transzkipciós terminációs régiója [ Depicker és mtsai.: J. Mól. Appl. Génét., 1^, 561 (1982)] . Az iniciációs kódon (ATG) egy Ncol-hasítóhelyben található (melyet egy Ncol-101kapcsoló ligálásával juttatunk be), amely a 2-1.3-promóter és a Cab transzlációs vezetőszekvencia kapcsolódásánál található. Ezt az indukálható vektort pTDS136-nak neveztük el.

A pTDS136-plazmidot megemésztettük Ncol-enzimmel és az 5'-túlnyúló végeket Klenow-enzim és dNTP-k alkalmazásával feltöltöttük. Az Ncol-enzimmel hasított és tompavégűvé tett plazmidot ezután megemésztettük BamHI-enzimmel, majd izoláltuk a 2-2.3-promótert tartalmazó 1.0 kb-os fragmenst. Ezt a fragmenst a BamHI- és EcoRV-enzimekkel emésztett pSacB:2-1-plazmidba ligáltuk. Az eredményül kapott pCIP:SacB:2-1-plazmid az iniciációs kódont (ATG) az érett FTF-fehérjét kódoló szekvenciával és a 2-1 3'-végi régióval azonos leolvasási fázisban tartalmazta. Ezt a plazmidot megemésztettük BamHI- és KpnI-enzimekkel, majd izoláltunk belőle egy 2,8 kb-os fragmenst, amit aztán a pZS97Kplazmidba ligáltunk. A promótert és transzkripciós terminációs szekvenciákat funkcionálisan az FTF-génhez kapcsolva tartalmazó bináris vektort három résztvevős keresztezéssel Agrobacterium sejtekbe juttattuk, a 2. példában leírtak szerint. Az indukálható expressziós egységet tartalmazó bináris vektort szintén a 2. példában leírtak szerint transzformáltuk dohánynövényekbe.

DNS-izolálás dohánylevelekből

DNS előállítására a regenerált dohánynövények leveleit használtuk fel. Az előállított DNS-t PCR-analízissel vizsgáltuk, annak eldöntése céljából, hogy a transzformált dohánynövény tartalmazza-e a CIP:SacB:2-l expressziós egysé*··· ··«· • ····«· • · · · · · · • ·· ·· · · ···· ·« ·· ♦ · ·· ·

-102get. A levélszövet 2 grammját - melyet 10 cm hosszúságú levelekből állítottunk elő - olyan mozsárba helyeztük, amely szárazjeget és folyékony nitrogént tartalmazott. A levélszövetet finom porrá zúztuk. Ezt a port összekevertük 10 ml extrakciós pufferrel (50 mmol/1 Tris, pH = 9,0, 10 mmol/1

EDTA, 2 % SDS) 50 °C-on, egy 50 ml-es steril polietilén centrifugacsőben. Az elegyhez ezután 5 mg proteináz-K-t adtunk, majd a reakcióelegyet 10 percig 50 °C-on inkubáltuk, és időnként megkevertük. A kapott oldatot kétszer extraháltuk fenol:kloroform:izoamil-alkohol eleggyel (25:24:1), majd kétszer kloroform:izoamil-alkohol eleggyel (24:1). A vizes fázishoz 0,3 mol/1 koncentrációig nátrium-acetátot adtunk, majd a nukleinsavakat 2,5 térfogat hideg etanol hozzáadásával kicsaptuk. A reakcióelegyet 8000 g-vel lecentrifugáltuk, és a nukleinsavakat tartalmazó üledéket 70 %-os etanollal megmostuk, és vákuumban megszárítottuk. Az üledéket ezután 10,0 ml vízben felszuszpendáltuk, összekevertük egyenlő térfogat 4 mol/l-es LiCl₂-oldattal, majd az elegyet a kicsapódás elősegítése céljából egy órán át jégen tartottuk. A reakcióelegyet ezután 25 percig 4 °C-on 12000 g-vel centrifugáltuk. Ebben a lépésben az RNS kicsapódik, a

DNS viszont oldatban marad. A DNS-t tartalmazó felülúszót 1 térfogat hideg 2-propanollal kicsaptuk, a DNS-t centrifugálással kiülepítettük, 70 %-os etanollal megmostuk, majd vízben felszuszpendáltuk, majd ezt követően PCR-eljárásban használtuk.

A sikeres transzformációt PCR-eljárással igazoltuk (a

2. példában leírtak szerint), templátként a levelekből izo-103*·····«· «· · · « ··«·«« • · · · · · · • · · ·· · * «*·· ·· · « ·· * · ·

Iáit DNS-t használtuk, és a PCR-láncindítók szekvenciáját a

4. és 5. azonosítószámon adjuk meg. A láncindítók az FTFgénre specifikusak, egymástól körülbelül 1,3 kb távolságra. Transzgéntartalom vonatkozásában csak azokat a növényeket tekintettük pozitívnak, melyek DNS-éről a PCR-eljárásban sikerült a várható 1,3 kb-os DNS-fragmenst előállítani.

Az In2-2-promóter és kiméragének bejuttatása transzgenikus növényekbe

A CIP:SacB:In2-1 expressziós vektort úgy indukáltuk, hogy egy transzgenikus dohánynövényről egy levelet levágtunk, és szárának végét azonnal belemerítettük egy 200 pg/l N-(amino-karbonil)-2-klór-benzol-szulfonamidot (2-DBSU-t) tartalmazó 0,5xHoagland-oldatba (KC Biological). Az indukált RNS termelődése a bemerítést követően 1-2 órával megkezdődik, és az indukció a maximális értéket a kezelés kezdetétől számítva 24 óra elteltével éri el [ Hershey és Stoner: Plánt Mól. Bioi., 17, 679 (1991)] . A kontrollkísérletekben traszgenikus leveleket olyan 0,óxHoagland-oldatba merítettük, amely nem tartalmazott 2-CBSU-t.

A_2-CBSU-val_indukált_FTF-expresszió_analízise transzgenikus dohánylevelekben

6-8 órás indukálást követően a transzformált levelek vízzel telített fenotípusúakká váltak és észrevehetően megfonnyadtak. A transzformált levelek hosszabb indukció (12— 14 óra) következtében teljesen elpusztultak. Amennyiben a transzformált levelekből borotvával vékony szeleteket hasítottunk le, és azokat 6-8 óráig indukáltuk, majd a szeleteket fénymikroszkópban megvizsgáltuk, azt találtuk, hogy a ···· ··4 · ·· • · · te · · • ·· ·· · · ···· ·· »· ·· ·> · ·

-104sejtek belső szerkezete összeomlott. A kloroplasztok rendezettsége megszűnt, és összekondenzálódtak a sejt középpontjában, amely pozíciót normális esetben a vakuólum foglal el. A kontroll levelek (nem indukált dohánylevelek, melyek a CIB:SacB:In2-1 expressziós vektort tartalmazták) a 12-14 órás kezelés teljes időtartama alatt megőrizték rendezett szerkezetüket.

Fruktán izolálása transzgenikus növényi szövetből

A CIB:SacB:In2-1 expressziós vektorral transzformált levelekből 12-14 óra indukció után az alábbiak szerint izoláltunk fruktánt. Az oldható és oldhatatlan szénhidrátokat kivontuk, és egymástól elválasztottuk. A transzgenikus levelekből származó szövetet (200-400 mg) felaprítottuk 500 μΐ 80 %-os etanolban egy mikrocentrifugacsőben, műanyag mozsártörő alkalmazásával, majd a centrifugacsövet 10 percig 80 °C-on hevítettük. A felmelegített reakcióelegyet 1015 percig 10000 g-vel centrifugáltuk, szobahőmérsékleten. A felülúszót elöntöttük, és az üledéket felszuszpendáltuk 500 μΐ 80 %-os etanolban, a szuszpenziót alaposan összekevertük, majd 10 percig 80 °C-on hevítettük, és lecentrifugáltuk. Az említett lépést harmadszor is megismételtük, és az utolsó lépést követően az üledéket 200-400 μΐ steril vízben szuszpendáltuk fel. A kapott oldatot alaposan összekevertük, 10-20 percig 100 °C-on hevítettük, majd 10 percig 10000 g-vel centrifugáltuk. Ennek a centrifugálási lépésnek a felülúszója tartalmazza a nagy molekulatömegű szénhidrátokat, a fruktánokat is beleértve, és ez a felülúszó oldható cukroktól mentes. A felülúszóban a fruktánokat az 1.

···· ····

-105példában felsorolt eljárások valamelyikének alkalmazásával detektálhatjuk. Ebben a kísérletben a transzgenikus szövetben felhalmozódott fruktánokat az 1. példa szerinti enzimkapcsolt vizsgálati eljárással határoztuk meg. A végső felülúszóban található fruktán teljes mértékű fruktózzá történő hidrolíziséhez elegendő, ha a felülúszóhoz tömény sósavat adunk, 10 percig 70 °C-on hevítjük, majd nátriumhidroxiddal semlegesítjük. A fentiek szerint előállított oldat fruktózkoncentrációját ismert koncentrációjú fruktózoldatokkal összehasonlítva határozzuk meg, és összehasonlítjuk olyan vad típusú kontroll növényekből mérhető fruktózkoncentrációval, melyek fruktánt nem tartalmaznak.

A CIP:SacB:In2-l-vektort tartalmazó levelek indukálást követően fruktánra vonatkozóan pozitívnak bizonyultak, a fentiek szerint kezelt felülúszó fruktózkoncentrációja nagyobb volt, mint a vad típusú kontrollok esetén. Ezek az eredmények arra utalnak, hogy az FTF-aktivitás és a fruktán-felhalmozódás következtében pusztultak el a 2-CBSUval indukált levelek. A fenti kísérleti eredmények, valamint a 2. példában bemutatott kísérleti eredmények igazolják, hogy a sejtplazmában konstitutív módon expresszált FTF-aktivitás a normális sejtműködés szempontjából káros. Az a tény, hogy a CIB:SacB-In2-l expressziós egységet tartalmazó dohánylevelek pusztulása csak abban az esetben következett be, amikor az expressziós egységet indukáltuk, világosan mutatja, hogy az FTF-fehérje aktivitása okozza a letális hatásokat, amennyiben valamely növényi sejt sejtplazmájában expresszálódik.

• ·

-106Az ismertetett bizonyítékok egyértelműen arra utalnak, hogy amennyiben valamely Bacillus FTF-gént vagy ahhoz hasonló gént - melynek génterméke szacharóz metabolizáló aktivitású - sejtplazmában expresszálunk, akkor a kifejeződött enzimaktivitás megzavarja a sejt normális szacharóz szintézisét, szacharóz transzportját a süllyesztő szövetek irányába és/vagy megváltoztatja a sejt ozmotikus potenciálját. Az ilyen expresszió rendkívül komoly káros hatásokat eredményez a növényi sejtekben, és éppen ezért - az ismertetett kísérleti adatok alapján - azt a következtetést kell levonnunk, hogy ahhoz, hogy egy FTF- vagy hasonló aktivitású fehérjével valamely növényt sikeresen transzformálhassunk, alkalmas szövetspecifikus és szubcelluláris térrészspecifikus szabályozó szekvenciákat kell alkalmaznunk .

4. példa

A Bacillus eredetű FTF-gén expressziója növényi sejtek vakuólumában

A bakteriális FTF-gén levélsejtek sejtplazmájában történő konstitutív expressziója nem volt sikeres. Ebből a tényből, valamint abból, hogy a csicsókában és a cikóriában szintetizálódott fruktánok a raktározó sejtek vakuólumaiban halmozódnak fel, arra a következtetésre jutottunk, hogy amennyiben az FTF-fehérjét a növényi sejtek vakuólumába juttatjuk, hogy az enzim az ott található szacharózt hasznosítsa, lehetséges lenne a transzgenikus növényi sejtben jelentős káros hatások nélkül fruktánt felhalmozni.

»··· ··«·

-107Kémiailag indukálható vakuólumspecifikus expressziót biztosító FTF expressziós egység létrehozása

A kétszikű édes burgonya sporaminfehérjéje vakuólumspecifikus szignálszekvenciájának FTF-génhez történő kapcsolása

A sporaminfehérje vakuólumspecifikus szignálszekvenciáját - a publikált DNS-szekvencia alapján [Matsuoka és mtsai.: J. Bioi. Chem., 32, 19750 (1990)] - két különálló oligonukleotidként szintetizáltuk meg. A 6. és 7. azonosítószámú szekvenciájú oligonukleotidok együttesen tartalmazzák a 37 aminosav hosszúságú prepro- és propeptid kódolásához szükséges információt, mely peptid alkalmas arra, hogy a funkcionálisan hozzá kapcsolt kimérafehérjéket a transzgenikus növényi sejtek vakuólumaiba juttassa. Az oligonukleotidok által kódolt aminosav sorrendet a 8. azonosítószámon adjuk meg.

A 6. és 7. azonosítószámú oligonukleotidok szekvenciája magában foglalja a következő restrikciós enzimek hasítóhelyeit is: Spel, BspHI, Ncol és Xhol, melyek alkalmasak arra, hogy különböző fragmenseket működőképes expressziós egységekbe klónozhassunk. A sporaminfehérje szignálszekvenciáját kódoló oligonukleotidokat a következő reakcióelegyben foszforiláltuk: 50 mmol/1 Tris-HCl (pH=7,5), 7 mmol/1 MgCl₂, 10 mmol/1 2-merkaptoetanol, 1 pmol/1 5'-vég, valamint 1 egység T4 polinukleotid kináz, a reakcióelegy végtérfogata 25 μΐ volt, az inkubálást 37 °Con 30 percig végeztük. A foszforilált oligonukleotidokat két térfogat etanollal csaptuk ki, és 20 percig 10000 g-vel

-108centrifugáltuk a reakcióelegyet, majd az üledéket vízben felszuszpendáltuk. Az újraoltást követően mindkét oligonukleotidból 250 ng-nyit összekevertünk, a reakcióelegyet 5 percig 100 °C-on hevítettük, majd engedtük összehibridizálódni az oligonukleotidokat, oly módon, hogy a reakcióelegyet 30 perc alatt hagytuk szobahőmérsékletre hűlni.

Az összehibridizálódott oligonukleotidokat megemésztettük Spel és Xhol restrikciós enzimekkel, majd előzetesen Spel és Xhol-enzimekkel emésztett pBluesciprt-SK(+)plazmidba ligáltuk őket. A megszintetizált és megklónozott DNS-fragmens szekvenciáját didezoxi-láncterminációs eljárással határoztuk meg, és összehasonlítottuk azt a Matsuoka és mtsai. által leírt szekvenciájával [ J. Bioi. Chem., 32, 19750 (1990)] . Ezután a sporamin-szignálszekvenciát izoláltuk a pBluescript-SK(+) klórozó vektorból, BspHI-és Xholemésztéssel, majd a szignálszekvenciát előzetesen Ncol- és Xhol-enzimekkel emésztett TDS-136-plazmidba ligáltuk. Az eredményül kapott pl36-Spor-plazmid tartalmazott egy kémiailag indukálható promóter régiót (2-2), valamint tartalmazta a sporamin vakuólumspecifikus szignálszekvenciáját, az említett promóter régióhoz funkcionálisan hozzákapcsolva, oly módon, hogy a szignálszekvencia a natív a CIP-eredetű iniciációs kódonról kiindulva transzlálódjék. A pl36-Sporplazmidot ezután Ncol-enzimmel elhasítottuk, Klenowenzimmel tompavégűvé töltöttük fel, majd Xbal-enzimmel emésztettük. A Cl-promótert és a vakuólumspecifikus szignálszekvenciát tartalmazó 1,1 kb-os fragmenst izoláltuk, és beligáltuk az előzetesen Xbal- és EcoRV-enzimekkel hasított • ·

-109pSacB:In2-l-plazmidba. A ligálás eredményeként egy olyan teljes expressziós egységet kaptunk, amely tartalmazta a Cl-promótert, funkcionálisan hozzákapcsolva a sporaminfehérje vakuólumspecifikus szignálszekvenciájához, ami funkcionálisan hozzá volt kapcsolva a Bacillus eredetű FTFgén kódoló régiójához és az In-2-1 transzkripciós terminációs szekvenciához. Az így előállított p-CIP-Sporplazmidot BamHI- és KpnI-enzimekkel emésztettük. Ezután a megfelelő szabályozó és célba juttató szekvenciákat tartalmazó FTF-gént egyetlen DNS-fragmenssel izoláltuk, és beligáltuk a pZS97K bináris vektorba, melyet előzőleg ugyanazokkal a restrikciós enzimekkel hasítottunk. Az expressziós egység Agrobacteriuiríoa történő bejuttatását három résztvevős keresztezés útján, valamint a dohánynövények transzformálását a 2. példában leírtak szerint végeztük. A CIP-Spor-SacB expressziós egység jelenlétét a transzformált dohánynövényekben PCR-analízissel mutattuk ki (2. példa), a 3. példa szerinti FTF-génre specifikus láncindító oligonukleotidok alkalmazásával (szekvenciaazonosító számok: 4 és 5).

A CIP-Spor-SacB expressziós egység indukálása dohánynövényekben

Teljes méretű érett leveleket és éretlen, 8-10 cm-es leveleket vágtunk le PCR-pozitív dohánynövényekről, melyek tartalmazták a CIP-Spor-SacB expressziós egységet, és ezeket a 3. példában leírtak szerint indukáltuk. Amennyiben a CIP:SacB:Inc2-1 expressziós egységet indukáltuk (nem célba juttatott FTF-fehérje, lásd 3. példa), azt tapasztaltuk,

-110hogy a dohánylevelek rendkívül rövid idő alatt jelentősen károsodnak. A vakuólumspecifikus szignálszekvencia hozzáadása után a most leírt kísérletben jelentős fenotípusos változást tapasztaltunk, amennyiben a leveleket 2-CBSU-val azonos ideig indukáltuk. A CIP-Spor-SacB expressziós egység 8-10 órás indukcióját követően (vakuólumba juttatott FTFfehérje) az expressziós egységet tartalmazó dohánylevelek nem mutattak fenotípusos különbséget a pozitív kontrollokhoz viszonyítva (vad típusú dohánylevelek). A negatív kontroll levelek, melyekben az FTF-fehérjét vakuólumspecifikus szignálszekvencia nélkül expresszáltattuk (CIP:SacB:In2-1) ismét vízzel teltnek tűntek, és fonnyadni kezdtek. A CIPSpor-SacB expressziós egységet tartalmazó dohánynövények is végül fonnyadó fenotípust mutattak, de csak 24-36 órával az indukciót követően. 36 óra elteltével azonban a vad típusú kontroll levelek is bizonyos mértékig fonnyadó fenotípust mutattak, a CIP:SacB:In2-1 expressziós egységeket tartalmazó levelek azonban ebben az időpontban már barnák voltak, szárazak és teljesen elpusztultak.

Teljes celluláris RNS izolálása indukált levélszövetből

A CIP-Spor-SacB expressziós egységet tartalmazó, valamint a vad típusú kontroll leveleket, melyek 12-14 órán át indukáltunk, eltávolítottuk a 2-CBSU-t tartalmazó illetve 2-CBSU-t nem tartalmazó Hoagland-oldatból, és steril vízben leöblítettük őket. Az indukált és indukálatlan levelekből az össz-RNS-t guanidin-tiocianáttal izoláltuk.

A guanidin-tiocianát reagenst a következő módon állítottuk elő: egy 100 grammos flakon (Kodak Laboratory and

-111Specialty Chemicals) tartalmát feloldottuk 80 ml vízben, majd az oldathoz hozzáadtunk 10,6 ml 1 mol/l-es Tris-HClpuffert (pH=7,6), valamint 10,6 ml 200 mmol/1 Na₂EDTA-t. Az elegyet ezután addig rázattuk, míg a szilárd anyag teljesen feloldódott, majd 4,24 g natrium-lauril-szarkozinátot és 2,1 ml 2-merkapto-etanolt adtunk hozzá. Ezután az oldat térfogatát 212 ml-re állítottuk be steril víz hozzáadásával, majd az így elkészített oldatot sötétben tároltuk 4 °C-on felhasználásig.

A levélmintákat gyorsan megfagyasztottuk folyékony nitrogénbe történő bemerítéssel. Ezután 10-15 g fagyasztott szövetet átvittünk egy mozsárba, és ott finom porrá törtük

TM azt. Az elporított szövetet ezután egy 150 ml-es Corex centrifugacsőbe helyeztük, amely 5 térfogat (térfogat/tömeg) jéghideg guanidin-tiocianát reagenst alkalmazott, 0,5 ml kloroformot, 0,2 ml n-oktanolt, valamint 2,5 ml vanadil-ribonukleozid komplexet (Bethesda Research Laboratories, Gaithersburg, MD) . A szövetet ezután tovább aprítottuk egy Brinkman gyártmányú politronban ( PT10/35), egy percen keresztül, maximális sebességgel. A nyers szövetkivonatot ezután 27000 g-vel 10 percig centrifugáltuk 4 °C-on. A felülúszót átöntöttük egy mérőhengerbe, és minden 2,5 ml oldathoz 1 g CsCl-ot adtunk. Az elegyet ezután 36000 g-vel centrifugáltuk 10 percig, 4 °C-on, majd a kapott felülúszót egy 9/16 x 3-1/2 méretű poliallomár ultracentrifuga csőbe rétegeztük, 2 ml 5,7 mol/l-es CsCloldat fölé. Az így létrehozott lépcsős gradienst 28000 gvel 15-20 órán keresztül 10 °C-on centrifugáltuk, Beckman

-112• · ·

gyártámányú SW4lTi-rotorban. A centrifugálást követően a csöveket óvatosan lecsapoltuk, és az oldalaikat tisztára töröltük. Az üledékeket 0,2 ml TES-pufferben [ 10 mmol/l Tris-HCl, (pH=7,4), 5 mmól/EDTA, 1 % SDS] , majd az oldatot egy 15 ml-es centrifugacsőbe vittük át. Az RNS-oldatot öszszekevertük azonos térfogat kloroform:n-butanol eleggyel (4:1), majd a centrifugacsőbe rövid ideig vortexeltük. A kapott emulziót 5 percig 20 °C-on 8000 g-vel centrifugáltuk. A vizes fázist átvittük egy új 15 ml-es centrifugacsőbe, a szerves fázist visszaextraháltuk azonos térfogat TESpufferrel, és az így kapott vizes fázist összeöntöttük az előző vizes fázissal. Az RNS-t legalább két órán át -20 °Con csaptuk ki, 0,1 térfogat 3,0 mol/l-es natrium-acetát (pH=6,0) és 2 térfogat etanol hozzáadása után. Az RNS-t 20 percen keresztül 4 °C-on végzett 10000 g-vel történő centrifugálással ülepítettük ki. A felülúszót óvatosan leszívattuk, és a centrifugacsőben maradt RNS-t 0,5 ml steril vízben feloldottuk. Az oldat egy kis részletét 100-szorosra hígítottuk vízzel, és ennek a hígított oldatnak az ODértékét meghatároztuk 260 nm-en, az RNS-koncentráció meghatározása céljából.

Az össz-RNS-preparátum slot-blot-analízise

Megnedvesítettünk egy nitrocellulóz-filtert (Schleicher és Schuell, BA-85), oly módon, hogy kétszer 10 percig vízben áztattuk, majd 10 percen át 1 mol/l-es ammóniumacetát oldatban. A filtert ezután egy slot-blotkészülékbe helyeztük (Schleicher és Schuell, Kheene, NH). A kezeletlen levelekből és a 2-CBSU-val indukált levelekből

-113«······· · · · · « * · · · · · • ·· · · · · ···· ·· ·· * · ·· · származó RNS-ből több 2,5 pg-os mintát vettünk, és ezeket steril vízzel 80 pl-re hígítottuk. A hígítást követően minden mintához 40 pl denaturáló puffért adtunk (30 % formaldehid, 100 mmol/1 nátrium-foszfát, pH = 6,8), majd a mintákat 10-20 percen keresztül 65 °C-on keresztül inkubáltuk, majd hirtelen lehűtöttük őket, 5 perces jeges fürdőben történő inkubálással. A hűtés után minden mintához 30 pl 4 mol/l-es ammóniu-acetát-oldatot adtunk, majd a biotoló berendezés mintafelvivő helyeire ( siót-ok) 150-150 ml mintát vittünk fel, 10-15 Hgmm vákuum alkalmazásával. A filtert ezután eltávolítottuk a biotoló berendezésből, levegőn megszárítottuk, majd vákuumban 2 órán át 70 °C-on hevítettük. A filtert ezután 10 ml előhibridizáló pufferben inkubáltuk [ 50 % ioncserélt formamid, 5xSSC-oldat, 5xDenhardt-oldat, 100 pg/ml denaturált borjú tímusz-DNS, 40 mmol/1 nátrium-foszfát, (pH=6,8), és 0,5 % marhaszérum albumin] , egy hővel lezárható tasakban, 6 órán keresztül 42 °C-on, és az tasakot időnként megkevertük. A filtert ezután egy nick-transzlált (³²P-izotóppal jelölve, egy BRL által forgalmazott nick-transzlációs reagenskészlet alkalmazásával) FTF-génpróbával hibridizáltuk (a próba egy 1,3 kb-os EcoRV/Xbal-DNS-fragmens volt, melyet a pB311-plazmidból izoláltunk, és kizárólag az FTF kódoló régióval volt homológ) . A hibridizációt úgy hajtottuk végre, hogy az előhibridizáló oldatot az tasakból kiöntöttük, és azt 2,5 ml hibridizációs pufferre cseréltük [ 50 % ioncserélt formamid, 5xSSC-oldat, 100 pg/ml denaturált borjútimusz-DNS, valamint 40 mmol/1 nátrium-foszfát, (pH = 6,8), amely tartalmazott ···»

-1141,25χ10⁷ cpm nick-transzlált FTF-génpróbát, melyet a fentiek szerint állítottunk el. A nick-transzlált DNS-t 10 perces forralással denaturáltuk, majd a próbát jégen gyorsan lehűtöttük. A filtert ezután időnként kevergetve egy éjszakán át 42 °C-on hibridizáltuk.

A következő napon a filtert kivettük a tasakból, kétszer mostuk szobahőmérsékleten 10-15 percig rázógép alkalmazásával a következő összetételű oldatban: 2xSSC-oldat, 1 mmol/1 EDTA, 20 mmol/1 nátrium-foszfát, pH=6,8, 1 mmol/1 nátrium-pirofoszfát, valamint 0,5 % SDS. A filtert ezután kétszer 30 percig 65 °C-on mostuk, 0,5 % SDS-t tartalmazó 0,lxSSC-oldatban. A filtert ezután rövid ideig levegőn szárítottuk, majd polisztirol háztartási fóliába csomagoltuk, és egy éjszakán át autoradiografáltuk, Kodak XAR-5 típusú filmmel, egy DuPont Lightning Plus típusú erősítőernyő alkalmazásával.

A vad típusú dohánynövényből készített minta nem adott jelet a röntgenfilmen, még abban az esetben sem, amikor 48 órán át exponáltuk a slot-blot filtert. A vizsgált 22 transzgenikus CIP-Spor-SacB expressziós egységet tartalmazó növényből származó minta közül azonban 15 tartalmazott olyan RNS-t, mely specifikusan hibridizálódott az FTFgénpróbával, és ezek a röngtenfilmen pozitív jelet adtak, de csak azokban a sávokban, melyek indukált levelekből származó RNS-mintát tartalmaztak. A különböző transzformáns növényekből származó különböző minták esetén a kimutatható RNS mennyisége nagy mértékben különbözött.

-115Az FTF-fehérje dohánynövénysejtek vakuólumaiba történő juttatása,_az_egyszikű_árpalekt ingénből_származó vakuólumspecifikus szignálszekvencia alkalmazásával

A CIP-Blec-SacB expressziós egység előállítása

Az FTF-gént funkcionálisan az árpalektin N- és Cterminális ER- és vakuólumspecifikus szignálszekvenciájához kapcsoltan tartalmazó expressziós egységet, amelyben az FTF-gén funkcionálisan kémiailag indukálható szabályozószekvenciákhoz volt kapcsolva, úgy állítottuk elő, hogy először megszintetizáltunk két komplementer oligonukleotidot, melyek szekvenciáját a 9. és 10. azonosítószámon adjuk meg. A 9. és 10. azonosítószámú oligonukleotidokat egy olyan publikált DNS-szekvencia alapján szintetizáltuk, melyről kimutatták, hogy szükséges és elégséges idegen fehérjék - melyek bejutottak a kiválasztási rendszerbe - dohánysejtek vakuólumába történő juttatásához [ Bednarek és mtsai.: Plánt Cell, _2, 1146 (1990); Dombrowski és mtsai.: Plánt Cell, 5, 587 (1993)] . Az oligonukleotidokat a fent leírtak szerint foszforiláltuk és hibridizáltuk egymáshoz. Az összehibridizált oligonukleotidokat elhasítottuk BglII- és HincII-enzimekkel (ezeket a hasítóhelyeket tartalmazták a megszintetizált oligonukleotidok szekvenciái), majd az elhasított DNSfragmenst a pSacB::In2-l-plazmidba ligáltuk, melyet előzetesen ugyanazokkal a restrikciós enzimekkel emésztettünk. A kapott plazmidot pSacB:CTPP:In2-1-jellel láttuk el.

Az árpalektingén C-terminális vakuólumspecifikus szignálszekvenciája (melyet a 9. és 10. azonosítószámú szekven···· ····

-116ciák tartalmaznak) csak abban az esetben elegendő valamely fehérje növényi sejtek vakuólumába történő juttatására, ha a fehérje már bejutott a növénykiválasztási rendszerébe. Az árpalektingén előállított oligonukleotidok által kódolt Cterminális részletének aminosavsorrendjét a 11. azonosítószámon közöljük. Az árpalektin-fehérje tartalmaz egy Nterminális szignálszekvenciát is, amely a fehérjéket a növények kiválasztási rendszerébe irányítja. Az N-terminális szekréciós szignálszekvenciát árpa DNS-ből klónoztuk meg, PCR-elj árássál.

Előállítottunk két láncindító oligonukleotidot, melyek szekvenciája két oldalról szegélyezi az árpalektingén szekréciós szignálszekvenciáját, és ezeket az oligonukleotidokat alkalmaztuk a PCR-eljárásban. Az 5'-végi láncindítók szekvenciáját a szekvencialistában 12., a 3'végi reverz komplementer láncindító nukleotidszekvenciáját pedig 13. azonosítószámon adtuk meg. A 12. azonosítószámú oligonukleotid tartalmazza az EcoRI- és BspHI-enzimek hasítóhelyeit is. A 13. azonosítószámú szekvenciájú oligonukleotid láncindító pedig az Ncol- és Sallhasítóhelyeket tartalmazza. Az említett láncindító oligonukleotidokat (szekvenciaazonosító szám: 12. és 13.) az árpalektingén publikált N-terminális szekréciós (ER) szignálszekvenciája alapján szintetizáltuk meg [ Lerner és Raikel: Plánt Phys., 91, 124 (1989)] . Az oligonukleotidokat genomi árpa-DNS-hez hibridizáltuk, és egy PCR-reakcióban templátként használtuk őket (az eljárást a 2. példában leírtak szerint végeztük). A PCR-reakció eredményeként kelet-117• · · · ···· ·· • · · • · · • · · · · ·· ·· ·* kező körülbelül 100 bázispáros DNS-fragmenst izoláltunk, megemésztettük EcoRI- és Sall-enzimekkel, majd a pBluescript-SK ( + ) klónozóvektorba ligáltuk (Stratagene. La Jolla, CA) . Az így kapott plazmidot pSK-5'-BLEC-nek neveztük el. A beépített DNS-fragmenst megszekvenáltuk, és igazoltuk, hogy nukleotid sorrendje azonos az árpalektingén 5'-végi ER-szignálszekvenciájával.

Az 5'-végi árpa ER-szignálszekvenciát funkcionálisan hozzákapcsoltuk a Cl-promóter iniciációs kódonjához, oly módon, hogy a pSK-5'-Blec-plazmidot megemésztettük BspHIés Sall-enzimekkel. A PCR-fragmenst beligáltuk az előzetesen Ncol és Sáli restrikciós enzimekkel emésztett pTDS-136plazmidba, előállítva ily módon a pl36-BLEC-plazmidot. A pCIP:Blec:SacB:Blec:In2-l-plazmidot úgy állítottuk elő, hogy a pl36-BLEC-plazmidot megemésztettük Ncol-enzimmel, majd a túlnyúló végeket Klenow-enzimmel feltöltöttük. Ezután a DNS-t kicsaptuk, majd Xbal-enzimmel megemésztettük. A Cl-promótert és a funkcionálisan hozzákapcsolt 5'-végi árpalektin ER-szignálszekvenciát tartalmazó izolált DNSfragmenst beligáltuk a pSacB:CTPP:In2-l-plazmidba, melyet előzetesen Xbal- és EcoRV-enzimekkel emésztettünk. A

CIP:Blec:SacB:Blec:In2-l-jélű teljes expressziós egységet amely tartalmazza az árpalektingén szignálszekvenciáit, melyek elégségesek arra, hogy egy fehérjét a sejtek vakuólumaiba juttassanak- megemésztettük BamHI- és KpnIenzimekkel, beligáltuk a pZS97K-jelű bináris vektorba, és a kapott plazmidot három résztvevős keresztezés útján Agrobacterium sejtekbe juttattuk, a 2. példában leírtak ···· ····

-118szerint. Ezután szintén a 2. példában leírtak szerint dohánynövényeket transzformáltunk a bináris vektorba inszertált CIP:Blec:SacB:Blec:In2-1 expressziós egységgel. Azokat a transzgenikus növényeket, melyek tartalmazták az expressziós vektort, a korábban leírtak szerint azonosítottuk (a 2. példában leírt PCR-eljárást alkalmaztuk, a 3. példa szerinti bakteriális FTF-génre specifikus láncindítók alkalmazásával. A Cl-promóter indukálását és a célba juttató szekvenciákkal ellátott FTF-gén expresszióját a 3. példában leírtak szerint hajtottuk végre. Az össz-RNSizolálást, és az RNS slot-blot-analízist is a fentiek szerint hajtottuk végre.

A vad típusú dohánynövény a röntgenfilmen nem adott jelet a slot-blot-filter 48 órás exponálása után sem. A 31 vizsgált transzgenikus CIP-Blec-SacB-Blec-leszármazottak közül azonban 16 pozitívnak bizonyult a slot-blotanalízisben, de csak azon levelek esetében, melyeket 2CBSU-val indukáltunk, a fent leírtak szerint. Az indukált

RNS mennyisége ebben a kísérletben is nagy mértékben eltérő volt a különböző leszármazott! vonalak esetén.

Az a tény, hogy a CIP-SacB-növények és a ClP-SporSacB-, valamint CIP-Blec-SacB-Blec-növények között nagymértékű fenotípusos különbségek találhatók (az előbbi növényekben az FTF-gén célba juttatás nélkül expresszálódik, az utóbbi két növénytípusban pedig az FTF-fehérje a vakuólumba van juttatva) , arra utal, hogy mind egyszikű mind pedig kétszikű növényekből származó vakuólumspecifikus szignálszekvencia alkalmazásával a dohánysejtek vakuólu• · · · ····

-119maiba juttatható az FTF-fehérje. Az a tény, hogy a célba juttatás nélkül FTF-fehérjét expresszáló növények sérült leveleiben fruktán-felhalmozódást tudtunk kimutatni, tovább erősíti azt az érvet, hogy amennyiben ezt, vagy hasonló aktivitású enzimet növényi sejtek sejtplazmájában expresszáltatunk, az a sejtekre nézve rendkívül káros hatású, ami végül is a növény egyedfejlődésének leállásához vezet .

Vakuólumba juttatott FTF-fehérje konstitutív expressziója

A p35S:Spor:SacB-In2-l expressziós vektor előállítása

Előállítottunk egy levelekben működőképes expressziós egységet, amely tartalmazta a 35S-CaMV-promóterrégiót [ Odell és mtsai.: Natúré 313, 810 (1985); Hull és mtsai.: Virology, 8 6, 482 (1987)] , a klorofil-a/b-kötő fehérje (Cab) génjének transzlációs vezetőszekvenciáját [ Dunsmuir, Nuc. Acids Rés., 13, 2503 (1985)], valamint a nopalinszintázgén (Nos) 3'-végi transzkripciós terminációs régióját [ Depicker és mtsai.: J. Mól. Appl. Génét., U 561 (1982)] . Az expressziós egységet pMH40-nek neveztük el.

A sporamin vakuólumspecifikus szignálszekvenciáját a fent leírt pSK(+)Spor-plazmidból izoláltuk, egy 114 bázispáros BspHI-NcoI-DNS-fragmensen. Ezt a 114 bázispáros fragmenst beligáltuk a pMH40-plazmidba, melyet előzetesen Ncol-enzimmel emésztettünk. Mivel a ligálás eredményeként a vakuólumspecifikus szignálszekvencia két különböző orientációban épülhetett be, megszekvenáltunk néhány eredményül kapott transzformáns kiónban található plazmidot, és egy plazmidot, amely a natív sporamingénben találhatónak megfe-120lelő 5' —> 3'-orientációban tartalmazta a szignálszekvenciát, elneveztünk pMH40:Spor-plazmidnak. Ezután a pSacB:Inc21-plazmidot BamHI- és EcoRV-enzimekkel megemésztettük, és összeligáltuk egy DNS-fragmenssel, amely a CaMV-35Spromótert tartalmazta, egy vakuólumspecifikus szignálszekvenciához fuzionáltatva, mely fragmenst a pMH40-Sporplazmidból izoláltunk, melyet Ncol-enzimmel emésztettünk meg, majd a túlnyúló végeit Klenow-enzimmel feltöltöttük, majd megemésztettük BamHI-enzimmel is. Az előállított konstrukciót p35S:Spor:SacB:Inc2-l-nek neveztük el. Az előállított plazmidból BamHI- és KpnI-enzimekkel végzett emésztés után izoláltuk a 35S:Spor:SacB:Inc2-1 növényi expressziós egységet tartalmazó DNS-fragmenst, és azt a pZS97K bináris vektorba ligáltuk. Ezt a vektort azután Agrobacterium sejtekbe juttattuk, melyeket később levéllelemezke-fertőzés útján dohánynövényekbe juttattunk, a 2. példában leírtak szerint. A 35S:Spor:SacB:In2-1 expressziós egységet tartalmazó növényeket PCR-eljárással azonosítottuk, a megfelelő méretű DNS-fragmens amplifikálódása alapján, szintén a 2. példában leírtaknak megfelelően. Az FTF-génre specifikus PCR-láncindítók leírása megtalálható a 2. példában. 15 pozitív transzgenikus dohánynövényt talajba ültettünk, és érett növénnyé neveltük őket.

A 35S:Spor:SacB:Inc2-1 transzkripciós egységgel transzformáit növények analízise fruktán jelenlétének kimutatása céljából

A nagy molekulatömegű szénhidrát polimereket a 3. példa szerinti etanolos kicsapással izoláltuk a

-12135S:Spor:SacB:Inc2-1 expressziós egységgel transzformált növények leveleiből. Az etanolban oldhatatlan extraktumokat két frakcióra osztottuk, az egyik mintát 1 mol/l-es sósavoldattal 100 °C-on 10 percig hidrolizáltuk, majd 1 mol/l-es nátriumhidroxid oldattal semlegesítettük. A másik frakciót további kezelés nélkül vetettük alá a vizsgálati eljárásnak. A mintákból készített két különböző frakciót TLCeljárással vizsgáltuk, az 1. példában leírtak szerint.

A vad típusú levelek sem a savval kezelt, sem a kezeletlen extraktumok esetén nem adtak jelet. Ez a kísérleti adat azt bizonyítja, hogy a dohánynövény nem halmoz fel endogén fruktánokat. Ezzel szemben a négy vizsgált transzformáns növény közül kettő pozitív jelet adott, amely nem vándorolt el a kiindulási pontból a TLC-lemezen, ami arra utal, hogy a termelődött polimer nagy molekulatömegű. A pozitív növények extraktumai a savval kezelt minták esetén is pozitív jelet adtak, amely ebben az esetben a fruktóz kontrollal azonos távolságra futott. A további kontrollok - a TLC-lemezekre felvitt glükóz- vagy keményítőminták nem adtak pozitív jelet. A cikóriából izolált fruktánminták sósavas kezelés után és anélkül is a megfelelő transzgenikus dohánynövény kivonatokkal azonos helyre futó pozitív jeleket adtak (azaz a kezeletlen minták olyan pozitív jeleket adtak, melyek nem mozdultak el a felvitel helyétől, a sósavval kezelt minták pedig olyan pozitív jeleket adtak, melyek a fruktóz kontrollal azonos távolságra futottak). A fenti eredményeket összegezve elmondhatjuk, hogy nagy molekulatömegű szénhidrát polimerek csak a ···· ····

-12235S:Spor:SacB:In2-1 expressziós egységgel transzformált növényekben halmozódtak fel, és a felhalmozódott polimer szacharóz egységeket tartalmazott, melyek savas kezeléssel felszabadíthatok voltak.

Az etanolban oldhatatlan kivonatok anthrone-analízise

A 35S:Spor:SacB:In2-1 expressziós egységgel transzformáit, fentiek szerint előállított növényekből származó kivonatokat 10 percig 100 °C-on inkubáltuk, tömény sósav jelenlétében, ezután a mintákat lehűtöttük, majd nátriumhidroxiddal semlegesítettük. Ez a kezelés alkalmas arra, hogy a fruktán-polimereket egyedi fruktózegységekké hidrolizálja. A sósavval kezelt mintákat fruktóz kimutatása céljából kvantitatív anthrone-analízisnek vetettük alá, az 1. példában leírtak szerint. Mivel az anthrone-nal analizált frakció etanolban oldhatatlan volt, a meghatározott szénhidrátot nagy molekulatömegűnek tekintettük. Az anthroneanalízis eredménye azt mutatta, hogy az ismertetett expressziós vektorral transzformált dohánynövények közül a legnagyobb mennyiségű fruktánt felhalmozó növények esetén a felhalmozódott fruktánok mennyisége a levél szárazanyag tartalmának 1-2 %-át tette ki.

A 35S:Spor:SacB:In2-1 expressziós egységgel transzformáit növények egy kivételével érett növénnyé fejlődtek, és magot hoztak. A kifejlődött növények kissé satnyák voltak, a fruktán jelenléte azonban az egyébként normális megjelenésű növényekben azt igazolja, hogy amennyiben az FTF-gén termékét a vakuólumba juttatjuk, akkor a növény számára el• · · · · · · • ·

-123fogadható módon szintetizálódik és halmozódik fel a nagy molekulatömegű fruktóz polimer a transzgenikus növényekben.

5. példa

Az FTF-gén expresszálása transzgenikus burgonyában

Burgonyagumó-specifikus sejtplazmában történő expressziót biztosító expressziós egység előállítása

A patatin elnevezésű tartalékfehérje promoterét a 2. példában leírtak szerint PCR-eljárassal izoláltuk, a 14. és

15. azonosítószámon megadott szekvenciájú oligonukleotid láncindítók alkalmazásával. A láncindítók szekvenciáját az 1. osztályhoz tartozó patatingén publikált szekvenciája alapján terveztük [ Rocha-Sosa és mtsai. : EMBO J., _8, 23 (1989)] . A 15. azonosítószámú szekvencia tartalmaz egy Ncol-hasítóhelyet is az iniciációs kódonnál.

A PCR-eljárás végrehajtása után egy 1,0 kb-os DNSfragmenst izoláltuk (templátként burgonya genomi DNS-t alkalmaztunk) , melyet a pUC18 klónozó vektorba ligáltunk (New England Biolabs, Beverly, MA), melyet előzőleg Smalenzimmel emésztettünk. Az eredményül kapott plazmidot pPPROOl-nek neveztük el. A pPPROOl-plazmidot - amely tartalmazta a patatain promóter azon régióját, mely elégséges a burgonyagumókban történő szövetspecifikus expresszió megvalósításához - Hindin- és HincII restrikciós enzimekkel emésztettük. Az 1,0 kb-os fragmenst előzetesen HindlII- és Smal-enzimekkel emésztett pBluescript-SK(+) és pBluescriptSK(-) vektorokba ligáltuk (Stratagene, La Jolla, CA) . A promóterfragmenst ily módon két orientációban klónoztuk ··*· «·*·

R ·

-124meg. A plazmidot, amely megfelelő orientációban tartalmazta a promóterfragmenst, az FTF-gén expresszálása céljára, pPatB-plazmidnak neveztük.

A pPatB-plazmidot megemésztettük Ncol-enzimmel, és a túlnyúló 5'-végeket Klenow-enzimmel feltöltöttük. Ezután a plazmidot BamHI-enzimmel emésztettük és izoláltunk egy 1,0 kb-os fragmenst, ami tartalmazta a patatin-promótert és az érintetlen iniciációs kódont. Ezt a fragmenst beligáltuk a pSacB:2-1-plazmidba, melyet előzetesen BamHI- és EcoRVenzimekkel hasítottunk, és a ligálás eredményeként előállt a PatB:SacB:2-1 expressziós egység. Ezután a pPatB:SacB:21-plazmidot megemésztettük BamHI- és KpnI-enzimekkel, izoláltunk egy 2,8 kb-os fragmenst, és azt a pZS97K-plazmidba ligáltuk, előállítva ily módon egy bináris vektort, mely egy olyan expressziós egységet tartalmazott, amely alkalmas volt az FTF-gén transzgenikus burgonyagumókban történő szövetspecifikus expresszálására. Ezt a bináris vektort Agrobacterium sejtekbe juttattuk, a 2. példában leírtak szerint.

Burgonyanövények transzformálása

A fentiek szerint előállított bináris vektort az alábbiak szerint transzformáltuk burgonyanövénybe. A burgonyanövények transzformálására a levéllemezkés eljárást alkalmaztuk, szelekciós markerként NPTII-gént alkalmazva. A burgonyanövényből (cultivar Desiree) előállított steril levéllemezkéket együtt tenyésztettük a gumóspecifikus FTF expressziós egységet tartalmazó pZS97K bináris vektort hordozó LBA4404-jelű Agrobacterium tumefaciens törzzsel. Az ··«· ···· ··

-125együttes tenyésztést 48 órán keresztül, S2-táptalajban, csekély megvilágítás mellett végeztük. Az Agrobacterium sejtekkel végrehajtott együtt-tenyésztést követően a leveleket 1 g/1 carbanicillint tartalmazó S2-táptalajjal lemostuk, megszárítottuk őket, majd 50 ml/1 kanamycint tartalmazó S3-táptalajra helyeztük a levéllemezkéket. A levéllemezkéket egy hét erős megvilágítást követően áthelyeztük friss S3-táptalajra, amely 50 mg/1 kanamycint tartalmazott. Ezen a táptalajon két hét elteltével kis kalluszok keletkeztek, melyeket 50 mg/1 kanamycint tartalmazó S5-táptalajra helyeztünk át, ahol további 2-3 hétig tartottuk őket. Ezalatt az idő alatt a kalluszok tovább fejlődtek, majd azokat 50 mg/1 kanamycint tartalmazó S7táptalajra vittük át. Az S7-táptalajon a kalluszok két hét alatt kis hajtásokat hoztak (körülbelül 0,5 cm magas hajtásokat) . A hajtásokat levágtuk, és 100 μg/l kanamycint tartalmazó gyökereztető táptalajra helyeztük őket. Két héttel ezután a hajtások olyan mértékben megnőttek, hogy lehetőség nyílt a levelekből DNS izolálására, és az izolált DNS-t PCR-eljárassal analizáltuk FTF-gén jelenlétére vonatkozóan, a korábbiakban leírtak szerint (2. példa). A PCR-eljárásban FTF-génre specifikus láncindítókat alkalmaztunk (szekvenciaazonosító szám: 4. és 5.). A pozitív utódokat további analizálás céljából talajba ültettük.

S2-táptalaj g/1 szacharóz

0,5 g/1 MES (pH=5,5) g/1 mannitol • ·

-126S3-táptalaj

200 mg/1 glutamin

0,5 g/1 2-[ N-morfolino] -etan-szulfonsav (MES, pH=5,7) 0,5 g/1 polivinil-pirolidin 20 g/1 mannitol g/1 glükóz mg/1 adenin-szulfát

0,5 % agaróz mg/1 transz-zeatin

0,1 gg/l naladixinsav g/1 carbanicillin

Só-táptalaj

200 mg/1 glutamin

0,5 g/1 MES (pH=5,7)

0,5 g/1 polivinil-pirolidin g/1 mannitol g/1 glükóz mg/1 adenin-szulfát

0,5 % agaróz mg/1 transz-zeatin g/1 carbanicillin

S7-táptalaj

200 mg/1 glutamin

0,5 g/1 2-[ N-morfolino] -etan-szulfonsav (MES, pH=5,7) 0,5 g/1 polivinil-pirolidin 20 g/1 mannitol g/1 glükóz mg/1 adenin-szulfát

-1270,5 % agaróz mg/1 transz-zeatin 0,1 gg/l naladixinsav 1 g/1 carbanicillin S5-táptalaj

200 mg/1 glutamin

0,5 g/1 MES (pH=5,7)

0,5 g/1 polivinil-pirolidin 20 g/1 mannitol g/1 glükóz mg/1 adenin-szulfát 0,5 % agaróz 1 mg/1 transz-zeatin 0,01 ug/l gibberellinsav 1 g/1 carbanicillin Gyökereztető táptalaj 200 mg/1 glutamin 0,5 g/1 MES (pH=5,7)

0,5 g/1 polivinil-pirolidin g/1 szacharóz g/1 mannitol g/1 glükóz mg/1 adenin-szulfát

150 mg/1 CaCl₂

0,4 % agaróz mg/1 transz-zeatin

100 mg/1 carbanicillin ···· ····

-128A transzgenikus burgonyanövények analízise

A transzgenikus burgonyanövényeket és transzformálatlan negatív kontrollokat talajban teljes érettségig növesztettünk, és a növényeket gumóztattuk hűvös, gyengén megvilágított szobai körülmények között (12 óra napfény, 22 °C és 12 óra sötét, 20 °C) .

A transzgenikus burgonyanövények fenotípusos analízise

A PatB:SacB:2-1-pozitív transzgenikus burgonyanövények, valamint a vad típusú és transzformált negatív kontrollok (a negatív kontrollokat kizárólag a pZS97K bináris vektorral transzformáltuk) fenotípusa nagy mértékben különbözött egymástól. A talajba kiültetett fiatal növények mérete a kontrollokéval azonos volt. A növények érése során azonban a transzgenikus utódok növekedése jelentősen elmaradt a vad típusú növények mögött. A visszamaradottság mértéke különböző volt, de bizonyos transzgenikus növények meglehetősen satnyák voltak. A cserépbe ültetés után körülbelül 6-8 héttel a vad típusú növények és a transzformált negatív kontrollok néhány gumót hoztak, melyek mérete különböző volt egyazon növény esetén is. A transzgenikus növények levelei tovább degenerálódtak, és azokon nagy méretű nekrotikus régiók alakultak ki. A hat transzformáns közül kettőn nem fejlődtek ki gumók, és a többi transzformált növényen is csak rendkívül kis méretű, színtelen gumók fejlődtek. A PatB:SacB transzgenikus növények (melyek az FTFgént célba juttatás nélkül expresszálták) többsége számos kis méretű zöld gumót fejlesztett - melyeket külszíni gumóknak neveznek - a növény földhöz közeli részén. A külszí···· · · · ·

-129ni gumók nem valódi gumók, hanem a szacharózraktározás helyszínei, abban az esetben, ha a szénvegyületek transzportja a gumók felé gátolt. Ez a jelenség a kontroll növények esetében nem volt megfigyelhető. A kis méretű transzformáit gumókból nem sikerült növényeket regenerálnunk. A kontroll növények esetében azonban a várakozásnak megfelelően sikerült a gumókból növényeket regenerálnunk.

A külszíni gumók analízise fruktánok jelenlétére vonatkozóan

A kis zöld külszíni gumókat megőröltük etanolban, ahogy azt a levélkivonatok készítése esetén a 3. példában leírtuk, majd a kivonatokat részben kezeltük sósavban, részben pedig nem kezeltük a 4. példában leírtak szerint. A fruktánkimutatást TLC-eljárással végeztük (az 1. példa szerint) . A vad típusú növények és a transzformált negatív kontrollok gumói a TLC-eljárás során nem adtak detektálható jelet, ami arra utal, hogy a valódi burgonyagumók nem tartalmaznak és nem halmoznak fel endogén fruktánokat. A PatBSacB-konstrukciót tartalmazó transzgenikus növények közül egy sem adott pozitív jelet a TLC-lemezeken. A transzgenikus növények rendkívüli satnyasága, a külszíni gumótermelés és a fruktán-felhalmozódás hiánya kifejezetten arra utal, hogy az FTF-gén sejtplazmában történő expresszálása a fejlődő gumósejtekben káros a sejtfejlődésre. A káros hatást valószínűleg az okozza, hogy meggátlódik a szacharóz transzlokációja az éretlen gumókba. A gumósejtek növekedésének gátlása az ismertetett kísérlet során hasonló a 3. példában ismertetett eredményekhez, ahol arról • ·

-130számoltunk be, hogy a dohánylevelek sejtjeinek növekedését is gátolta a sejtplazmában expresszált FTF-fehérje. Több közlemény [Oparka és Wright: Planta, 175, 520 (1988);

Oparka és Wright: Planta, 174, 123 (1988)] is beszámol arról, hogy a gumófejlődés szempontjából az ozmotikus potenciál döntő jelentőségű és az ozmotikus potenciál megzavarása lelassíthatja vagy meggátolhatja a gumók növekedését, azáltal, hogy gátlódik a szacharóz transzlokációja a fejlődő gumókba. A fent ismertetett eredmények ezekkel a közleményekkel egybehangzóan értelmezhetők oly módon, hogy a gumók fejlődését az gátolta meg, hogy az éretlen gumósejtek sejtplazmájában az FTF-aktivitás megakadályozta a szacharóz transzlokációj át.

Vakuólumspecifikus, gumóspecifikus FTF-expressziót biztosító expressziós egység előállítása

A pPatB-plazmidot megemésztettük Ncol-enzimmel, a túlnyúló végeket feltöltöttük Klenow-enzimmel, majd a plazmidot Xhol-enzimmel is megemésztettük. Ebbe a plazmidba beligáltuk a vakuólumspecifikus szignálszekvenciát, amit úgy hajtottunk végre, hogy a 4. példa szerinti sporamin szignálszekvenciát tartalmazó pBluescript(+) szubklónozó vektorból izoláltuk a megfelelő DNS-fragmenst, BspHI- és Xhol-enzimmel végrehajtott emésztés után. A kialakított plazmidot pPatB:Spor-plazmidnak neveztük el. A pPatB-Sporplazmidot azután megemésztettük Ncol-enzimmel, a túlnyúló végeket Klenow-enzimmel feltöltöttük, majd a plazmidot Spel restrikciós enzimmel is megemésztettük. Ebbe a plazmidba beligáltunk egy pSacB:Inc2-l-plazmidból származó fragmenst,

-131melyet úgy állítottunk elő, hogy a plazmidból Spel és EcoRV restrikciós endonukleázokkal végzett emésztést követően izoláltunk egy 1,8 kb-os fragmenst. A kapott plazmidot pPatB:Spor:SacB:In2-l-plazmidnak neveztük el. Ez a plazmid tartalmazott egy gumóspecifikus promótert, egy vakuólumspecifikus szignálszekvenciát, funkcionálisan az FTF kódoló régióhoz kapcsolva, valamint egy transzkripciós terminációs régiót. Ezt a plazmidot megemésztettük BamHIés KpnI-enzimekkel, izoláltuk az expressziós egységet tartalmazó fragmenst, és a pZS97K bináris vektorba ligáltuk, majd a bináris vektort Agrobacterium sejtekbe transzformáltuk. Az Agrobacterium sejtek transzformálását háromrésztvevős keresztezéssel hajtottuk végre, a 2. példában leírtak szerint. A vektort tartalmazó Agrobacterium sejtekkel a korábban leírtak szerint transzformáltuk a burgonyanövényeket. A pozitív transzformáns burgonya növényeket a 2. példa szerint PCR-analízissel azonosítottuk, a 3. példában leírt FTF-specifikus láncindító oligonukleotidok alkalmazásával. Vad típusú burgonyanövényeket és PatB:Spor:SacB:Inc2-1 transzgenikus utódokat érésig növesztettünk, a fent leírt körülmények között.

A PatB:Spor:SacB:Inc2-1 jelű transzgenikus burgonyanövények

RNS-analízise

A fejlődő gumókból össz-RNS-t izoláltunk, a 4. példában, a dohánylevelekből történő RNS-izolálásra vonatkozóan leírtak szerint. Az izolált RNS-t 1 %-os agaróz gélben választottuk el, amely 3 % formaldehidet tartalmazott, 0,18 mmol/1 dinátrium-EDTA-t tartalmazó 5 mmol/l-es nátrium-

-132tetraborát pufferben. Az elválasztott RNS-mintát átvittük Zetaprobe™ -membránra, 20xSSC-puffér alkalmazásával, és a blotot a megfelelő ³²P-jelzett DNS-próba fragmenssel hibridizáltuk (a próba a pB311-plazmid 1,3 kb-os EcoRV/Xbal-DNSfragmense volt, amely az FTF gén kódoló régiójával volt homológ), 45 °C-on, majd háromszor mostuk a membránt 0,1 % SDS-t tartalmazó 2xSSC-pufferrel 25 °C-on, majd újabb három mosás következett 0,1 % SDS-t tartalmazó 0, lxSSC-pufferrel 55 °C-on. A transzformált génről származó RNStranszkriptumokat úgy tettük láthatóvá, hogy a membránt röntgenfilmmel exponáltuk 12-48 órán keresztül.

A gumókból a fentiek szerint készített Northernblot-analízis során a PatB-Spor-SacB expressziós egységgel (vakuólumspecifikus FTF expressziós egység) gumók a pB311próbával pozitív hibridizációs jelet adtak. A vad típusú gumók és azok a gumók, melyek kizárólag a pZS97K bináris vektort tartalmazták, nem adtak jelet. A különböző transzgenikus leszármazási vonalak esetén az RNStranszkriptumok mennyisége nagy mértékben eltérőnek mutatkozott .

A Spor-SacB-gént expresszáló gumók fruktánanalízise

A gumókat etanolban felaprítottuk oly módon, ahogy azt a 3. példában a nagy molekulatömegű szénhidrátok levelekből történő izolálásának vonatkozásában leírtuk. Az extraktumokat a 4 . példa szerint sósavval kezeltük, és a fruktántartalmat TLC-eljárással analizáltuk, az 1. példában leírtak szerint. A vad típusú gumók és a transzformált kontroll növények (kizárólag a bináris vektort tartalmaz-

-133ták) nem adtak detektálható jelet TLC-lemezeken, mely eredmény új fent igazolja, hogy a burgonyagumók nem halmoznak fel endogén fruktánokat. A vizsgált öt PCR-pozitív gumó közül kettő a TLC-lemezen látható jelet adott, amely a kezeletlen minták esetén nem mozdult el a felvitel helyétől, a hidrolizált minták esetén pedig a fruktóz-kontrollokkal azonos távolságra futott. A keményítő kontrollok - akár sósavval kezelve, akár kezeletlenül - nem adtak pozitív jelet a TLC-lemezeken. Ezek a kísérleti adatok igazolják, hogy nagy molekulatömegű fruktánok szintetizálódtak és halmozódtak fel a transzgenikus gumósejtek vakuólumaiban. Az ismertetett kísérleti eredmények - miszerint a vakuólumspecifikus SacB-FTF-gént expresszáló gumókban fruktán jelenléte kimutatható, és hogy azok a transzformált burgonyanövények, melyek az FTF-gént célba juttatás nélkül expresszálják, rendellenesen fejlődtek, és a gumónövekedés gátolva volt bennük - világosan jelzik, hogy ennek a szacharóz anyagcserében szerepet játszó génnek a sejtplazmában történő expresszálása káros hatású a növényi sejtekre. A nem célzottan expresszált FTF-génnel transzformált gumókkal szemben az ebben a kísérletben előállított gumók, amennyiben talajba helyeztük őket, kicsíráztak, érett növény fejlődött belőlük, melyek szintén képesek voltak gumókat növeszteni .

-1346. példa

A vakuólumspecifIkusan expresszált FTF-gén szövetspecifikus expressziója kukoricában

A 10 kD molekulatömegű zeinfehérje génjének nukleotid szekvenciáját - a promoter szekvenciát is beleértve - megtalálhatjuk a következő publikációkban: Kirihara és mtsai.: Gene, 71, 359 (1988) . A találmány szerinti megoldás kivitelezése céljából előállítottunk egy endospermium-specifikus expressziós vektort az alábbiak szerint. Először izoláltuk a 10 kD molekulatömegű zeinfehérje génjének 5'-végét, azaz a teljes promoter régiót és a kódoló szekvencia egy részletét. Ezt úgy hajtottuk végre, hogy a publikált szekvencia alapján oligonukleotidokat szintetizáltunk PCR-eljárásban láncindítóként történő alkalmazásra. Az előállított oligonukleotidok - szekvenciáikat a 16. és 17. azonosítószámon adjuk meg - tartalmaztak restrikciós endonuklezáz hasítóhelyeket is az előállított PCR-termék pTZ18 klónozó vektorba történő klónozása céljából (Pharmacia, New Brunswick, NJ). A 16. azonosítószámú oligonukleotid egy EcoRV-hasítóhelyet tartalmaz, a 17. azonosítószámú oligonukleotid pedig egy Xbal-hasítóhelyet.

A PCR-reakció után izoláltunk egy 1,4 kb-os DNSfragmenst, ezt megemésztettük EcoRV- és Xbal-enzimekkel, majd a pTZ18-plazmidba szubklónoztuk, melyet előzetesen Smal- és Xbal-enzimekkel emésztettünk. Az eredményül kapott plazmidot plOKl-nek neveztük el, amely tartalmazta a zeinfehérje nukleotid szekvenciáját -950-450-ig [a transzlációs iniciációs kódon adenozin-nukleotidját tekintve az • · ·· »··· ·*·· ·· • · 1 * · * « · · * · · · · ·

-135első nukleotidnak; Kirihara és mtsai.: Gene, 71, 359 (1988)] .

Végrehajtottunk egy második PCR-reakciót is, amelyben láncindító oligonukleotidokként a 18. és 19. azonosítószámú szekvenciájú oligonukleotidokat használtuk fel, és így egy 1,39 kb nagyságú DNS-fragmenst izoláltunk, amely az 1-1395.

nukleotidokat tartalmazta. A 19. azonosítószámú nukleotid tartalmazott egy BamHI-hasítóhelyet, és az előállított PCRterméket megemésztettük BamHI-el, majd beligáltuk a pTZ18vektorba BamHI- és Smal-hasítóhelyeire. Az így kialakított vektort plOK3-nak neveztük el. Az előállított két plazmidból - a plOKl-ből és a plOK3-ból - összeállítottuk a teljes zeingént, amely tartalmazta a promóter régiót és a teljes kódoló szekvenciát, a mindkét plazmidban megtalálható egyedi Spel-hasítóhely felhasználásával. A plOKlplazmidot megemésztettük EcoRI- és Spel-enzimmel, és izoláltunk egy 994 bázispáros DNS-fragmenst. Ezt a fragmenst beligáltuk a plOK3-plazmidba, melyet előzőleg ugyanazokkal a restrikciós enzimekkel emésztettünk, előállítva ily módon a pCC3-plazmidot, amely tartalmazta a teljes zeingént. A plazmidban található restrikciós hasítóhelyeket a szubklónozás megkönnyítése céljából tovább módosítottuk. Kialakítottunk egy egyedi Smal-hasítóhelyet a kódoló régió 5'-végénél (1590 bp) oly módon, hogy a plazmidot Xbalenzimmel megemésztettük, és a hasítóhelyre beépítettük a 20. és 21. azonosítószámú oligonukleotidokat. Az oligonukleotidokat önmagukban ismert DNS-manipulációs eljárások

-136alkalmazásával szintetizáltuk meg, foszforiláltuk, hibridizáltuk össze, és ligáltuk be a pCC3-plazmidba.

A találmány szerinti megoldásban alkalmazott 10 kD molekulatömegű zeinfehérje promóter régióját a pCC3plazmidból izoláltuk. Ezt úgy hajtottuk végre, hogy a pCC3plazmidot EcoRI-enzimmel hasítottuk, majd a túlnyúló végeket Klenow-enzimmel feltöltöttük. Az EcoRI-el hasított és feltöltött végű plazmidot megemésztettük SmaI-enzimmel, és izoláltunk egy 923 bázispáros DNS-fragmenst, amely a 10 kD molekulatömegű zeinfehérje génjének promóter régióját tartalmazta, majd a fragmenst a pBluescript-SK(+)-plazmidba ligáltuk (Stratagene, La Jolla, Kalifornia) , melyet előzőleg HindlI-enzimmel emésztettünk. A kapott plazmidot, melyet pSK(+)1OkD-nek neveztünk, megemésztettük Ncol- és Xhol-enzimekkel. Az emésztett pSK(+)lOkD-plazmidba beligáltuk a fentiekben leírt pSK-Spor-plazmid egy BspHI/XhoIfragmensét, amely tartalmazta a sporamingén vakuólumspecifikus szignálszekvenciáját. A kapott plazmidot plOkDSpor-plazmidnak neveztük el. Ezt a plazmidot megemésztettük Ncol-enzimmel, a túlnyúló végeket feltöltöttük Klenowenzimmel, majd megmésztettük a plazmidot Spel-enzimmel is. A kukorica magspecifikus promóterét funkcionálisan az édes burgonya sporamingénjének vakuólumspecifikus szignálszekvenciájához kapcsolva tartalmazó DNS-fragmenst izoláltuk és beligáltuk a pSacB:In2-l-plazmidba, melyet előzőleg megemésztettünk Spel- és EcoRV-enzimekkel, és így előállítottuk a végső expressziós egységet, a lOkD-Spor:SacB:In2-1 expressziós egységet. Ezt az expressziós egységet közvetle-137-

nül használtuk fel kukorica transzformálására, részecskebombázás alkalmazásával.

Kukorica transzformálása a bakteriális FTF-génnel

A188 és B73 genotípusú kukoricákat kereszteztünk, és 10-12 nappal a beporzás után a magokból éretlen embriókat izoláltunk (körülbelül 1,5-2,0 mm-eseket) , és kallusz tenyészeteket állítottunk elő belőlük. Az embriókat tengelyoldalukkal lefelé ráhelyeztük agarózzal megszilárdított N6táptalajra. Az embriókat 27 °C-on sötétben tartottuk. Az éretlen embriók scutellumából (pajzsocskájából) töredező embriogén kallusz szövet proliferációja indul meg, amely differenciálatlan sejttömegből és szomatikus proembrioidokból és embrioidokból áll, melyek ún. szuszpenzorstruktúrákon növekednek. Az elsődleges explantumból izolált embriogén kallusz szövetet N6-táptalajon tenyésztettük, majd ugyanazon a táptalajon minden 2-3 hétben szubkultúrákat hoztunk létre belőle.

A kallusztenyészet sejtjeibe részecskebombázásos eljárással juttattunk be géneket. Ezekben a kísérletekben egy Biolistic™ PDS-1000/He jelzésű készüléket használtunk (DuPont, Medical Product). A transzformációs kísérletekben egy olyan plazmidvektort alkalmaztunk, amely tartalmazhatott egy szelektálható markergént. Az alkalmazott pALSLUCjelű plazmid [ Fromm és mtsai.: Biotechnology, 8^, 833 (1990)] tartalmazza a kukorica acetolaktát dehidrogenáz szintáz (ALS) gén cDNS-ét. Az ALS-cDNS-t in vitro elmutáltatták oly módon, hogy a gén által kódolt enzim rezisztenssé váljék chlorsulfuronra. A mutáció a cDNS 1626. pozíció-138ját érintette, és egy triptofán-kódonból leucin-kódont hozott létre. Az alkalmazott plazmidban az ALS-gént a CaMV35S-promóter szabályozza [ Odell és mtsai.: Natúré, 313, 810 (1985)], valamint az Agrobacterium tumefaciens Tiplazmidjának T-DNS-éből származó nopalin szintáz gén 3'régiój a.

A pALSLUC-plazmidot aranyrészecskék felületére csaptuk ki. Ezt úgy hajtottuk végre, hogy 5 Hg pALSLUC-plazmidot körülbelül 1 μg/ml-es Tris-EDTA-pufferben készített oldatban hozzáadtunk 50 μΐ aranyrészecskéhez (a részecskék átlagos átmérője 1 μπι volt), melyek vízben voltak felszuszpendálva (60 mg arany/ml). Ezután az arany-DNS-szuszpenzióhoz vortexelés közben kálcium-kloridot (50 μΐ 2,5 mol/l-es oldatot) és spermidint (20 μΐ 1,0 mol/l-es oldatot) adtunk. A részecskéket ezután mikrocentrifugában 10 másodpercig centrifugáltuk, majd a felülúszót eltávolitottuk. Ezután a részecskéket felszuszpendáltuk 200 μΐ abszolút alkoholban. Ezután a részecskéket ismét lecentrifugáltuk, és a felülúszót eltávolitottuk. A részecskéket ezután 30 μΐ etanolban szuszpendáltuk fel. Az így előállított DNS-sel burkolt aranyrészecske-szuszpenzióból 5 μΙ-t vittünk fel minden egyes makro-hordozó lemezre.

Egy agarózzal megszilárdított N6-táptalajt tartalmazó 12 cm átmérőjű Petri-csészében a táptalaj felszínére kis méretű (2-3 mm átmérőjű) embriogén kalluszdarabkákat rendeztünk el. A szövetdarabkák egy körülbelül 6 cm átmérőjű köralakú területe takartak el a Petri-csésze felületén.

Ezután a szövetdarabkákat tartalmazó Petri-csészét behe-139········ ·· · · • · · · · · · • · · ·· · · · · · · lyeztük a PDS-1000/He-készülék kamrájába. A kamrából ezután kiszivattyúztuk a levegőt, és 711 Hgmm-es vákuumot állítottunk elő. A makrohordozót hélium-sokkhullám alkalmazásával felgyorsítottuk, olyan szakítómembrán alkalmazásával, amely akkor robban szét, amikor a hélium nyomása a sokkcsőben eléri az 1000 psi-t. A szövetdarabkákat körülbelül 8 cm-re helyeztük a megállító ernyőtől. 10 szövetdarabkákat tartalmazó Petri-csészét bombáztunk a DNS-el burkolt aranyrészecskékkel .

A bombázás után 7 nappal a szövetdarabkákat átvittük 50 mmol/1 chlorsulfuront tartalmazó N6-táptalajra, amely nem tartalmazott sem kazeint, sem prolint. A szövet ezen a táptalajon is lassan tovább növekedett. További két hét elteltével a szövetet átvittük friss chlorsulfuron-tartalmú

N6-táptalajra. 8 hét elteltével az egyik Petri-csészén, amelyben chlorsulfuronnal kiegészített táptalaj volt, megfigyeltünk egy körülbelül 1 cm-es átmérőjű aktívan növekedő kalluszt. Ez a kaliusz tovább növekedett, amikor szelektív táptalajon szubkultúrákat hoztunk létre belőle. A kalluszszövet egy részét növényregeneráló táptalajra vittük át. N6-táptalaj

Komponens Mennyiség 1 1-ben

I. oldat	10,0	ml
CaCl2 (1 mol/1)	1,25	ml
III. oldat	10, 0	ml
MgSO4 (1 mol/1)	0,75	ml
V. oldat	1,0 ]	ml

vitamin-torzsoldat

1,0 ml

-140kazein-hidrolizátum 0,1 g szacharóz 60,0 g mio-inozitol 0,1 g

2,4-D (2 mg/ml-es törzsoldat 0,5 ml a pH-t 5,8-ra állítjuk szilárd táptalaj készítése esetén plusz 6 g agaróz

I. oldat (NH₄)₂SO₄ kno₃

KH₂PO₄ h₂o

II. oldat

Na₂EDTA

FeS0₄x7H₂0

H₂O

V. oldat

H₃BO₃

MnSO₄xH₂O

ZnSO₄x7H₂O

KI

Na₂Mo0₄x2H₂0

CuSO₄x5H₂O

CoC1₂x2H₂0 h₂o

Vitamin-törzsoldat niacin tiamin piridoxin

23,0 g

141,5 g 20,0 g

500,0 ml

1,85 g 1, 35 g

500,0 ml

0, 16 g 0,33 g 0, 15 g

0, 08 g

0,025 g

0,0025 g

0, 0025 g

100,0 ml

0, 13 g 0,025 g

0,025 g

-141kálcium-pantotenát

0, 025 g

100,0 ml

H₂O

A transzformált kallusz Southern-analízise

A bejuttatott kiméra-FTF-gén kimutatása céljából a kalluszt Southern-analízisnek vetettük alá. A Southernanalí zist úgy hajtottuk végre, hogy a 2. példa szerinti DNS-extrakciós eljárások alkalmazásával a kallusz szövetből genomi DNS-t izoláltunk. DNS-t izoláltunk a transzformált kallusz szövetből, valamint azonos genotípusú kallusz szövetből, amelyet nem transzformáltunk, kontrollként történő alkalmazásra. A genomi DNS-t BglII-enzimmel emésztettük. Az emésztett DNS-t agaróz gélben történő elektroforézissel frakcionáltuk, majd önmagában ismert eljárással a frakcionált DNS-t nylonmembránra vittük át. A nylonblotot a pB311plazmidból izolált ”nick-transzlált EcRV/Xbal-DNSfragmenssel hibridizáltuk. A hibridizációs próba csak az FTF-gén kódoló szekvenciájának egy részletét tartalmazza.

Az FTF-fel transzformált kalluszból izolált DNS-mintában azonosítottunk egy domináns sávot, amely megfelelt a kiméragénnek. A további különböző hosszúságú hibridizáló sávokat a bejuttatott expressziós egység átrendeződött változatainak tekintettük.

A transzgenikus kukorica növények Southern-analízise

A 2. példa szerinti DNS-extrakciós eljárás alkalmazásával érett kukorica levelekből DNS-t izoláltunk. A transzgenikus növényekből és a nem transzformált negatív kontroll növényekből izolált DNS-t megvizsgáltuk a lOkDSpor:SacB:Inc2-1 expressziós egység jelenlétére vonatkozóan

-142PCR-analízissel, a 2. példában leírt eljárás és láncindítók alkalmazásával, valamint a 3. példában leírt FTF-specifikus láncindítók alkalmazásával.

Az izolált genomi DNS-t teljes mértékben megemésztettük BglII-enzimmel, a kapott fragmenseket 1,0 %-os agaróz gélben választottuk el, majd a frakcionált DNS-t 20xSSCpuffer alkalmazásával Hybond-M -membránra vittük át, és a blotot egy digoxigeninnel jelölt DNS-fragmenssel hibridizáltuk. A hibridizációs próbaként alkalmazott DNS-fragmenst a pB311-plazmidból izoláltuk, EcoRV és Xbal restrikciós enzimekkel történő emésztést követően. Ez a fragmens csak a bakteriális FTF-génből származó kódoló szekvenciákat tartalmazta. A blotolási eljárásokat, a hibridizációs próba didoxigeninnel történő jelölését, a hibridizációt, a mosásokat és a jel láthatóvá tételét ellenanyagok alkalmazáséval a gyártó utasításai szerint végeztük, a Genius biotoló reagenskészlet használati utasítása szerint (USB, Cleveland, OH). A transzgenikus növények Southern-blotanalízise eredményeként kimutattuk a lOkD:Spor:SacB:In2-1 expressziós egység többszörösen beinszertálódott intakt és átrendeződött kópiáit. Csak az intakt expressziós egységeket tartalmazó transzgenikus növényeket tekintettük pozitív leszármazási vonalaknak.

Fruktán jelenlétének kimutatása TLC-analízissel transzgenikus kukoricamagvakban

A lOkD:Spor:SacB:In2-1 expressziós egységgel transzformáit leszármazási vonalakat üvegházban növesztettük, és

30-35 nappal a megporzást követően vagy az érettség eléré-143-

sekor különálló magokat vizsgáltunk fruktánok jelenlétére vonatkozóan. Egy transzgenikus növényből származó magok különböző csoportjait külön-külön megőröltük 80 %-os etanolban, a 3. példa szerinti szénhidrát-extrakciós eljárás alkalmazásával. Az extraktumokat az 5. példában leírtak szerint sósavval kezeltük, és az 1. példában leírtak szerint TLC-lemezeken meghatároztuk fruktántartalmukat. A nem transzformált kontroll növények nem adtak pozitív fruktánjelet a TLC-lemezeken, ami arra utal, hogy a kukorica nem szintetizál vagy nem halmoz fel magvaiban endogén fruktánokat. A vizsgált 15 kukorica leszármazási vonal közül 8 pozitívnak bizonyult fruktánra vonatkozóan a TLCanalízisben. A PCR-eljárással vagy Southern-analízissel pozitívnak talált transzgenikus leszármazási vonalak mindegyike pozitív TLC-jelet adott. A kezeletlen minták esetén a fruktánjel nem mozdult el lényegesen a felvitel helyétől, a sósavval és hővel kezelt minták esetén pedig a jel a fruktózkontrollal megegyező távolságra futott a TLClemezen. Ezek a kísérleti adatok igazolják, hogy nagy molekulatömegű fruktózpolimer csak azokban a kukoricamagokban szintetizálódik és halmozódik fel, melyek transzformálva vannak a 1OkD:Spor:SacB:In2-1 expressziós egységgel.

Anthrone-analízis

Érett száraz magokat megőröltünk és etanolban oldhatatlan extraktumokat készítettünk belőlük a 3. példában leírtak szerint. Pozitív transzformált leszármazási vonalakból és negatív kontrollnövényekből (vad típusú kukorica) készített extraktumokat analizáltunk az 5. példa szerinti

-144anthrone-eljárással, és a kísérleti eredményeket az alábbi 3. táblázatban foglaltuk össze.

3. táblázat

A felhalmozott fruktán mennyisége transzgenikus kukorica endospermium-sejtekben, anthrone-analízissel meghatározva

FRUKTÓZ

(mg/g friss súly)
LH 195
(kontroll)	0, 0
1033.8.5	2,2
1033.6.1	2.7
1033.2.1	2,1

A 3. táblázat adataiból nyilvánvaló, hogy a lOkD-SporSacB (vakuólumspecifikus FTF) expressziós egységet hordozó vektorral transzformált kukoricamagvak etanolban oldhatatlan frakciójában fruktán halmozódik fel, és hogy az ilyen leszármazási vonalakban a fruktán felhalmozódása nem akadályozza meg a növény érését. Valamennyi transzformáns leszármazási vonalból érett korban takarítottuk be a magvakat, majd azokat megszárítottuk és talajba helyeztük. A transzformált növények magvainak kicsírázási aránya nem különbözött a nem transzformált kontroll növények magvainak kicsírázási arányától.

-1457. példa

Sej tplazma-specifikus_és_vakuólumspecif ikus_SacB expressziós egységeket tartalmazó transzgenikus kukorica leszármazási vonalak

A lOkD-SacB expressziós egység előállítása

Előállítottuk egy expressziós egységet, amely a

Bacillus eredetű SacB-gént tartalmazta a 10 kD molekulatömegű zeinfehérje promóterének transzkripciós szabályozása alatt, oly módon, hogy a 2. példa szerinti pSSU-SacBplazmidot megemésztettük Sáli restrikciós enzimmel, majd a túlnyúló végeket Klenow-enzimmel feltöltöttük. Ezután a plazmidot Ncol-enzimmel is megemésztettük, és így izolálni tudtunk egy 1,3 kb-os fragmenst, agaróz-gélelektroforézis útján. Az 1,3 kb-os NcoI/Sall-tompavég-fragmenst a pCC3plazmidba ligáltuk (melynek leírása a 6. példában található) , mely plazmidot előzőleg Ncol- és Smal-enzimekkel emésztettünk. A kapott rekombináns plazmiodot plOkD-SacBnek neveztük el. Az előállított lOkD-SacB expressziós egységet - amely a 10 kD molekulatömegű zeinfehérje promóterét tartalmazta, és elégséges a SacB-gén endospermium-sejtek sejtplazmájában történő szövetspecifikus és egyedfejlődésspecifikus expresszálására - közvetlenül felhasználtuk kukoricanövények transzformálására, a 6. példa szerinti részecskebombázásos eljárás alkalmazásával.

• · · · »·«· ··

-146A lOkD-SacB expressziós egységet tartalmazó transzgenikus magvak fenotípusos jellemzése

A lOkD-SacB expressziós egységet tartalmazó transzgenikus kukorica leszármazási vonalakat üvegházi környezetben neveltük, és önbeporzással termékenyítettük meg. Az egyedfejlődés korai szakaszában (10-15 nappal a megporzást követően) a transzgenikus kukoricamagvak - melyek a lOkD-SacB expressziós egységet tartalmazták - nem voltak könnyen megkülönböztethetők a vad típusú magvaktól. Az érett transzgenikus magvak azonban rendkívül aszott fenotípusúak voltak, és nagy mértékben különböztek az azonos csövekben található vad típusú magvaktól (olyan transzgenikus magvaktól, melyek nem tartalmazták a lOkDSacB expressziós egységet). A magvak súlyában mérhető különbségeket az alábbi 4. táblázat foglalja össze.

A lOkD-SacB expressziós egységet tartalmazó transzgenikus magvak analízise

Érett transzgenikus és vad típusú magvakat gyűjtöttünk be fruktánok jelenlétének kimutatása céljából (körülbelül 45-55 nappal a megporzást követően). Megvizsgáltunk néhány normális fogalakú és néhány aszott fenotípusú kukoricamagvat az 1. példa szerinti TLC-eljárás alkalmazásával fruktánok jelenlétére vonatkozóan. Csak az aszott fenotípusú magvak adtak pozitív jelet a karbamidfoszforsavval megfestett TLC-lemezen. A pozitív fruktán jel nem mozdult el a felvitel helyétől a TLC-lemezen, ami arra utal, hogy a jelet nagy molekulatömegű polimer okozza.

···· »*tf·

-147A rogaiaxu es aszott renotipusü magvawan a jelenlevő fruktánok kvantitatív analízisét az 5. példa szerinti anthrone-módszerrel végeztük. A magvak méretét és a száraz súlyra vonatkoztatott százalékos fruktántartalmakat a 4. táblázatban foglaltuk össze.

4. táblázat

Magvak tömege (mg) Fruktóz-% (magvak száraz tömegére vonatkoztatva)

A mag sorszáma

654#1	30	1,19
654#2	30	2,38
654#3	20	0,71
654#4	40	2, 77
654#5	20	1,25
654#6	270	0,23
654#7	220	0,36
654#8	240	0,16

A 4. táblázatban látható TLC-analízis kísérleti adatai azt mutatják, hogy a fog alakú fenotípusú (654# 6, 7 és 8) magvak nem halmoztak fel fruktánt, hanem csak a nagy mértékben aszott fenotípusú (654# 1-5) magvak szintetizálták ezt a polimert. A bemutatott kísérleti adatokból látható, hogy a SacB-gén kukorica endospermiumban, sejtplazmában történő expressziója drámai módon befolyásolja az endospermium fejlődését. Az endospermium kifejlődését fel• 9

-148tehetően károsan befolyásolja a szárazanyag mennyiség csökkent felhalmozódása a lOkD-SacB expressziós egységet tartalmazó magvakban. Bár keményítő felhalmozódása megfigyelhető volt a fruktántartalmú magvak esetén is (jódos festéssel mutattuk ki) , a felhalmozódott keményítő mennyisége azonban sokkal kisebb volt, mint a vad típusú magvak esetén, figyelembe véve a 10-szeres súlycsökkenést.

A lOkD-SacB expressziós egységet tartalmazó magvak csírázása aszott fenotípusú magvat metro-mix-talajba helyeztünk, és üvegházi körülmények között csírázni engedtük őket. Három hét alatt a 15 mag közül mindössze egy csírázott ki (0,067 %-os csírázási arány). Az egyetlen kis hajtás (3,7 cm) nem látszott életerősnek, és nem élte túl a következő 2-3 napot. A talajban kapott eredményekkel szemben 10 transzgenikus mag közül, melyeket szacharóztartalmú szilárd táptalajon csíráztattunk (#64-táptalaj) három kihajtott (30 %-os csírázási arány). Mindhárom hajtás normálisan fejlődött, és érett növény lett belőlük, melyek magot is hoztak.

A lOkD-SacB expressziós egységet tartalmazó magvak csírázási vizsgálata határozottan arra utal, hogy az endospermium szövet sejtplazmájában felhalmozódó fruktánok megváltoztatják a mag fejlődését, feltehetőleg oly módon, hogy gátolják a tápanyagok (különösen a szénhidrátok) felhalmozódását a magvakban. Ezeknek a hatásoknak az az eredménye, hogy a csírázási arány jelentősen visszaesik, és a magoncok életképessége csökken.

• ·

-149#64-táptalaj

Komponens Mennyiség 1 1-ben

Schenk- és Hildebrandt-féle alapvető sók (Sigma #S6765) 1,6 g

Nitsch- és Nitsch-féle vitamin törzsoldat (#390) 1,0 ml

Szacharóz 10,27 g

A lOkD-Blec-SacB expressziós egység előállítása

A Bacillus eredetű SacB-gént funkcionálisan az árpalektingén N- és C-terminális ER- és vakuólumspecifikus szignálszekvenciáihoz kapcsoltan tartalmazó expressziós egységet - melyben a kiméragén funkcionálisan hozzá volt kapcsolva a 10 kD molekulatömegű zeinfehérje génjének promóteréhez - úgy állítottuk elő, hogy először beépítettük a C-terminális, vakuólumspecifikus szignálszekvenciát a pSacB:In2-l-plazmidba, előállítva ily módon a pSacB:CTPP:In2-l-plazmidot, melynek leírása a 4. példában található.

A 4. példában leírt pSK-5'-BLEC-plazmidban található árpaeredetű N-terminális szignálszekvenciát fuzionáltattuk a 10 kD molekulatömegű zeinfehérje promóterével, a pCC3plazmidban (a plazmid leírása a 6. példában található). Ezt úgy hajtottuk végre, hogy a pSK-5'-BLEC-plazmidot megemésztettük BspHI- és Xhol-enzimekkel. Az emésztés után izolált fragmenst a pCC3-plazmidba ligáltuk, melyet előzőleg Ncolés Xhol-enzimekkel hasítottunk, előállítva ily módon a pCC3-BLEC-plazmidot. Az expressziós egység előállítása céljából megemésztettük az előállított pCC3-BLEC-plazmidot • ·

-150Ncol-enzimmel, és a túlnyúló végeket Klenow-enzimmel feltöltöttük. A DNS-t ezután kicsaptuk, vízben feloldottuk, majd megemésztettük Xbal-enzimmel, a 4. példában leírtak szerint. Ezután izoláltuk a 10 kD-os zeinfehérje promóterét funkcionálisan az 5'-végi árpalektin ER-specifikus szignálszekvenciájához kapcsoltan tartalmazó fragmenst, majd azt a pSacB:CTPP:In2-l-plazmidba ligáltuk, melyet előzetesen Xbal- és EcoRV-enzimekkel emésztettünk, előállítva ily módon a kívánt expressziós egységet, melyet lOkD-Blec-SacBnek neveztünk el.

A fentiek szerint előállított lOkD-Blec-SacB expressziós egység, amely tartalmazta a szövet és egyedfejlődés-specifikus 10 kD-os zeinpromóterert, valamint az árpalektingén ER- és vakuólumspecifikus szignálszekvenciáit, elégséges arra, hogy a SacB-fehérjét a sejtek vakuólumaiba irányítva expresszálja.

Az előállított expressziós egységgel a 6. példa szerinti részecskebombázásos eljárás alkalmazásával közvetlenül kukorica növényeket transzformáltunk.

A transzgenikus kukoricamagvak kvalitatív analízise fruktán jelenlétére vonatkozóan, TLC-eljárással

A 1OkD-BLEC-SacB expressziós egységgel transzformált kukorica növényeket üvegházban neveltük, és kiválasztott magvaikat egyenként analizáltuk fruktán jelenlétére vonatkozóan a megporzást követően 30-35 nappal, vagy érett állapotban (45-55 nappal a megporzás után). Az 1. példa szerinti TLC-eljárással több különböző regenerált növény számos magját analizáltuk. A hat vizsgált kukoricanövény közül • · • · ·

-151kettő adott pozitív jelet, amellyel nem vándorolt el a felvitel helyétől a TLC-lemezen, ami arra utal, hogy a kapott jel nagy molekulatömegű fruktóz polimertől származott.

A_lOkD-BLEC-SacB_expressziós_egységet_tartalmazó transzgenikus magvak csíráztatása

A lOkD-BLEC-SacB expressziós egységet tartalmazó magvakat metro-mix-talajba helyeztük, és üvegházi körülmények között csíráztattuk. Az elültetett 35 mag közül 29 kicsírázott (83 %-os csírázási arány), a kicsírázott magvak érett növénnyé fejlődtek, és fruktánt tartalmazó R2-magvakat termeltek. Nem tapasztaltunk semmiféle különbséget a transzgenikus és vad típusú - egyaránt fogalakú fenotípusú - növények között, sem a csírázási arány, sem a magoncok életképessége, sem pedig a termés mennyisége tekintetében.

A lOkD-BLEC-SacB expressziós egységgel transzformált, fruktánpozitív kukoricamagvak kvantitatív analízise

Az előzőekben azonosított két pozitív leszármazási vonalból származó 10 érett magot egyenként megvizsgáltunk fruktán koncentráció vonatkozásában, az 5. példában leírt anthrone-módszer alkalmazásával. Az első generációs kukoricanövények magvai a várakozásnak megfelelően szegreglódtak a SacB-génre vonatkozóan, és ezért bizonyos magvak nem halmoztak fel fruktánt. A kísérletben a fruktánnegatív magvak belső kontrollként szolgáltak. Negatív kontrollként analizáltunk négy darab vad típusú (fog alakú) magvat is. A kapott kísérleti eredményeket az alábbi 5. táblázat foglalja össze.

-1525. táblázat

A lOkD-BLEC-SacB expressziós egységgel transzformált kukoricamagvak és kontrollok fruktántartalmának kvantitatív meghatározása

Fruktán-% (szárazanyagtartalomra vonatkoztatva)

Fogalakú mag	#1		0, 06
Fogalakú mag	#2		0,00
Fogalakú mag	#3		0, 04
Fogalakú mag	#4		0,23
1OkD-BLEC-Sac transzformáns	625#1	0, 012
		625#2	0,28
		625#3	0,29
		625#4	0, 88
		625#5	0,28
		625#6	0, 33
		625#7	0,26
		625#8	1,35
		625#9	0,20
		625#10	1, 94

Az 5. táblázatban látható adatok azt mutatják, hogy a lOkD-BLEC-SacB expressziós egységgel transzformált magvakban a fruktán felhalmozódásának mértéke megegyezik a lOkD:Spor:In2-1 expressziós egységekkel transzformált magvakban tapasztalttal (lásd 3. táblázat, 6. példa). A kapott kísérleti eredmények arra utalnak, hogy a SacB-gén termékét sikerült az endospermium sejtek vakuólumába juttatni, ami-153bői az is következik, hogy a receptor/ok/ - melyek felelősek a fehérjék kukorica endospermium-sejtek vakuólumaiba történő juttatásáért - felismerik mind az egyszikű, mind pedig a kétszikű célba juttató szignálokat. Az ebben a példában bemutatott eredmények alátámasztják, hogy nagy molekulatömegű fruktánok felhalmozódása transzgenikus kukorica endospermium-sejtek sejtplazmájában károsan befolyásolja az adott mag kifejlődését, gátolja a csírázást és károsan hat a magoncok életképességére. Ezt a káros hatást meg lehet szüntetni, amennyiben a SacB-fehérje génjét (akár egyszikű, akár kétszikű növényből származó) vakuólumspecifikus szignálszekvenciákkal fuzionáltatjuk. A vakuólumba juttatott SacB-fehérje az egyedfejlődésre kifejtett káros hatások nélkül szintetizált fruktánokat, nem befolyásolja sem a csírázást, sem a magoncok életképességét, és a fruktánok jelenléte nem akadályozza meg azt sem, hogy ez a bejuttatott sajátság az utódokban is megnyilvánuljon.

8. példa

Fokozott fruktán-felhalmozódás nagy cukortartalmú kukoricanövényekben

Számos mutáns kukoricafajtát leírtak már, melyeket gyakran a magvak eltérő fizikai sajátságai alapján izoláltak, ilyen például a magvak eltérő áttetszősége, vagy a vad típusú fog alakú magvaktól (a vad típusú kukoricát mezei kukoricának is nevezik) eltérő magforma. Leírtak például néhány mutáns kukoricafajtát, melyek aszott magvakat termelnek, és kimutatták, hogy ezek a magvak kevesebb keményí• ·

-154tőt, de nagyobb mennyiségű oldható cukrot tartalmaznak [összefoglaló munka: Doehlert és Min Kuo: Plánt Cell Physiol., 35, 411 (1994)] . Az izolált mutánsok esetén a mutáció biokémiája nem minden esetben tisztázott, így például az shrunken-4 (sh4) vagy a sugary/sugary enhancer (su/se) mutánsfajták esetén sem. Mindazáltal a mutáns alléit jól jellemezték, és több mutánsfajta esetén megklónozták az érintett géneket is, ilyen fajták például a shruken 1 (shl), shrunken 2 (sh2) és a brittle-2 (bt2) [ McCarthy és mtsai.: Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 83, 9099 (1986); Brave és mtsai.: The Plánt Cell, 2^, 281 (1990)] . Bár a mutációk a keményítő bioszintetikus reakcióútjának számos különböző lépésében előfordulhatnak, a mutációk eredménye gyakran csökkent keményítőfelhalmozódás, és az oldható cukrok - a szacharózt is beleértve - fokozott felhalmozódása. A különböző mutánsfajták esetében eltérő a reakcióút blokkoltsága, és ezért a felhalmozódott oldható cukrok mennyisége is.

Amennyiben a SacB-gént homozigóta keményítő mutánsfajtában expresszáltatjuk, a nagyobb mennyiségű hozzáférhető szacharóz jelenlétének következtében nagyobb mennyiségű fruktán halmozódik fel. A SacB-gén expresszióját valamely mutáns fajtában megvalósíthatjuk közvetlen transzformáció útján, vagy oly módon, hogy egy SacB expressziós egységet például a 6. vagy 7. példában leírt expressziós egységet tartalmazó transzgenikus kukoricafajtát hagyományos módon keresztezünk egy mutáns fajtával. Az itt leírt kísérletek során úgy állítottuk elő SacB-gént tartalmazó mutáns kuko-155ricafajtákat, hogy genetikailag kereszteztük a plOkDSpor:SacB:In2-1 expressziós vektort tartalmazó fog alakú fajtát az shl-, sh2-, sh4- és su/se-mutánsokkal. A transzgenikus SacB-fajta az shl-, sh2- és su/se-lókuszokban vad típusú alléit tartalmaz, ezért az eredeti keresztezésből származó Fl-magvakat önbeporzással szaporítottuk, és a kapott F2-magvakban a SacB-gén együtt szegregálódott a homozigóta és heterozigóta mutáns aliélekkel. A keményítő bioszintézisben mutáns homozigóta magvakat könnyű volt azonosítani ráncos vagy aszott fenotípusuk alapján. Az aszott és normális fenotípusra szegregálódó magvakat külön válogattuk, és azokat egyenként kvantitatív fruktán analízisnek vetettük alá, az 5. példában leírt anthrone-eljárás alkalmazásával. Az anthrone-analízis eredményeit az alábbi 6. táblázatban foglaljuk össze.

6. táblázat

A mutáns kukoricafajtákban található nagy szacharózkoncentrációból adódó fokozott fruktánfelhaimozódás

Fruktán-% (a magvak szárazanyagtartalmára vonatkoztatva)

202.1	4094-1.128	4092-1.20	4097-4.46	4089-4.68
SacB-Fog	SacB-sh4	SacB-sh2	SaB-su	SacB-shl
1.53	0,32	1.85	2.18	4.82
2.22	0.39	10.09	1.59	0, 41
2.90	0.13	13.98	1.55	5.75

-156-

202.1	4094-1.128	4092-1.20	4097-4.46	4089-4.68
SacB-Fog	SacB-sh4	SacB-sh2	SaB-su	SacB-shl
0.48	0.21	6.93	3.26	3.07
0.10	0.22	0.23	4.43	0.39
1.43	0.00	9.23	2.06	0.38
0.00	0.23	0.40	2.68	1.44
1.19	0.33	2.17	5.01	0.40
0.11	0.26	7.80	2.16	0.33
0.00	0.24	7.81	1.22	3.00
1.52	0.04	0.91	1.25	0.36
0.00	0.24	6, 81	1.41	1.10
1.36	0.22	10.70	0.72	1.47
0.00		8.61	0.71	0.97
2.77		2.92	8.69	0.92

A 6. táblázat adatai arra utalnak, hogy amennyiben a SaB-gént különböző kukoricafajtákban expresszáltatjuk, a fruktán-felhalmozódás mértéke különböző lesz. A 4094.1.128 jelű mutáns fajta nem halmoz fel olyan mértékben fruktánt, mint a SacB-gént expresszáló fog alakú fajták (lásd 6. és

7. példák), ami arra utal, hogy az ebben a fajtában található genetikai hiba károsan befolyásolja a SacBexpresszióját is. Az erre utaló bizonyítékokat megtalálhatjuk Doehlert és Min Kuo publikációjában [ Plánt Cell Physiol., 35, 411 (1994)] . Az sh4-fajtában található genetikai hiányosság - amely megnövekedett mértékű szacharózfelhalmozódáshoz vezet - feltehetőleg érinti a

-157-

Λ · · · · · · · piridoxil-foszfát-anyagcserét. Ez azt eredményezi, hogy a fejlődő magvakban valamennyi fehérje szintézise csökkent mértékű lesz. Doehlert és Min Kuo azt is kimutatták, hogy az sh4-magvakban a transzkriptumok és fehérjék koncentrációja egyaránt jelentősen csökkent. Az itt leírt sh4kukoricafajtában a SacB-gén expresszióját a zeinpromóter irányítja. A zeinfehérjék expressziójának csökkent mértéke ebben a mutánsban feltehetőleg azt is eredményezi, hogy a SacB-fehérje is kisebb mértékben expresszálódik, ami megmagyarázza azt a kísérleti tényt, hogy miért nem halmozódik fel ebben a fajtában nagyobb mennyiségű fruktán annak ellenére, hogy ebben a mutánsban nagyobb mennyiségű szacharóz található, mint a fog alakú fajtákban.

A 4092-1.20-fajta homozigóta és heterozigóta sh2-allél és a SacB-gén vonatkozásában szegregálódik. A vizsgált mutáns fajták közül az sh2-fajtákról írták le, hogy a legnagyobb koncentrációban tartalmaznak szacharózt [ Doehlert és Min Kuo: Plánt Cell Physiol., 35, 411 (1994)] . A 6. táblázat adatai azt mutatják, hogy a SacB-gén terméke ebben a környezetben képest felhalmozni a legnagyobb mennyiségű fruktánt. A 4094-4.26 és a 4089-4.68 fajták sorrendben homozigóta és heterozigóta su- és shl-allélokra szegregálódnak. Ezek a fajták SacB-gén vonatkozásában is szegregálódnak. A su- és shl-fajták hasonló nagyságrendben, de kissé nagyobb mennyiségben halmoznak fel szacharózt, mint a vad típusú endospermium. A 6. táblázatból kitűnik, hogy ezek a fajták a SacB-gént tartalmazó fogalakú kukori-158cafaj fákkal szemben nagyobb mennyiségű fruktánt halmoznak fel, mindazáltal kevesebbet, mint az sh2-mutánsok.

A 6. táblázat adataiból kitűnik, hogy az sh4-mutáns fajták kivételével (ezt a kivételt a fentiekben értelmeztük) a keményítő bioszintézisben blokkolt mutáns fajták SacB-gént tartalmazó magvai nagyobb mennyiségben halmoztak fel fruktánt, mint a többi magvak. A genetikai blokk következtében megnövekedő sejtplazmabeli szacharózkoncentráció egyensúlyban van a vakuólumban található szacharóz koncentrációval, a mutáns törzsek esetén, ami a fruktánszintézis fokozódását eredményezi. Bár kézenfekvő lehet, hogy egy vakuólumspecifikusan expresszált SacB-fehérjét tartalmazó sejt vakuólumában a szacharózkoncentráció növekedése fokozott fruktán-felhalmozódáshoz vezethet, az ebben a példában bemutatott kísérleti adatok világosan igazolják, hogy amennyiben egy sejt sejtplazmájában megváltoztatjuk a szacharózkoncentrációt, elérhetjük, hogy a kukorica endospermiumában megváltozzon a fruktán-felhalmozódás mértéke. A szacharózkoncentráció fokozódását többféleképpen is elérhetjük (például antiszensz orientációjú szacharózmetabolizáló gének túltermelésével), például az ebben a példában bemutatott módon is, úgy, hogy a SacB-gént keményítő-bioszintézisben deficiens mutáns fajtában expresszáltatjuk .

-159SZEKVENCIALISTA

AZ 1. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 31 bázispár

TÍPUSA: nukleinsav

HÁNY SZÁLÚ: egy

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS: cDNS

HIPOTETIKUS: nem

ANTISZENSZ: nem

NÉV/MEGJELÖLÉS: misc_feature

ELHELYEZKEDÉS: 1...31

EGYÉB INFORMÁCIÓK: termék = szintetikus oligomer AZ 1. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

CTTCGCGAAG AAGATATCAA TAACCAAAAG C 31

A 2. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 21 bázispár

TÍPUSA: nukleinsav

HÁNY SZÁLÚ: egy

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS: cDNS

HIPOTETIKUS: nem

ANTISZENSZ: nem

NÉV/MEGJELÖLÉS: misc_feature

ELHELYEZKEDÉS: 1...21

-160-

EGYÉB INFORMÁCIÓK: termék = szintetikus A 2. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA

GAAGTTTGAA TCTTGAGATC T

A 3. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 32 bázispár

TÍPUSA: nukleinsav

HÁNY SZÁLÚ: egy

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS: cDNS

HIPOTETIKUS: nem

ANTISZENSZ: nem

NÉV/MEGJELÖLÉS: misc_feature

ELHELYEZKEDÉS : 1...32

EGYÉB INFORMÁCIÓK: termék = szintetikus A 3. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA

TCTAGAGATA TCCATGGTTA ATTACACTTA GA

A 4. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 21 bázispár

TÍPUSA: nukleinsav

HÁNY SZÁLÚ: egy

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS: cDNS

HIPOTETIKUS: nem oligomer oligomer

ANTISZENSZ: nem • »

-161NÉV/MEGJELÖLÉS: misc_feature

ELHELYEZKEDÉS: 1...21

EGYÉB INFORMÁCIÓK: termék = szintetikus oligomer A 4. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

ACGTACGCG TCTCTCATAT T 21

AZ 5. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 24 bázispár

TÍPUSA: nukleinsav

HÁNY SZÁLÚ: egy

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS: cDNS

HIPOTETIKUS: nem

ANTISZENSZ: nem

NÉV/MEGJELÖLÉS: misc_feature

ELHELYEZKEDÉS: 1...24

EGYÉB INFORMÁCIÓK: termék = szintetikus oligomer AZ 5. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

GTCGACTTAG TTGACTGTCA GCTG 24

A 6. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 137 bázispár

TÍPUSA: nukleinsav

HÁNY SZÁLÚ: egy

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS: cDNS

-162.-Í «

HIPOTETIKUS: nem

ANTISZENSZ: nem

NÉV/MEGJELÖLÉS: misc_feature

ELHELYEZKEDÉS: 1...137

EGYÉB INFORMÁCIÓK: termék = szintetikus oligomer A 6. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

ACTAGTACCT	GCGATCATGA	AAGCCCTCAC	ACTCGCTCTC	TTCTTAGCTC	TTTCCCTCTA	60
TCTCCTGCCC	AACCCAGCTC	ATTCTAGGTT	CAATCCAATC	AGGCTTCCAA	CCACACACGA	120
ACCCGCCATG	GCTCGAG					137

A 7. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 137 bázispár

TÍPUSA: nukleinsav

HÁNY SZÁLÚ: egy

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS: cDNS

HIPOTETIKUS: nem

ANTISZENSZ: nem

NÉV/MEGJELÖLÉS: misc_feature

ELHELYEZKEDÉS: 1...137

EGYÉB INFORMÁCIÓK: termék = szintetikus oligomer

A 7. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

CTCGAGCCAT GGCGGGTTCG TGTGTGGTGG GGAGGCGGAT GGGATTGAAC CTGGAATGGG 60

CTGGATTGGG CAGGAGATAG AGGGAAAGAG CTAAGAAGAG AGCGAGTGTG AAGGCTTTCA 120

TGATCGCAGG TACTAGT

137

-163Α 8. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 39 bázispár

TÍPUSA: aminosav

HÁNY SZÁLÚ: egy

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS: peptid

HIPOTETIKUS: nem

ANTISZENSZ: nem

NÉV/MEGJELÖLÉS: peptid

ELHELYEZKEDÉS: 1...38

A 8. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

Met Lys Alá Leu Thr Leu Alá Leu Phe Leu Alá Leu Ser Leu Tyr Leu

5 10 15

Leu Pro Asn Pro Alá Hys Ser Arg Phe Asn Prolié Arg Leu Pro Thr

25 30

Thr His Glu Pro Alá Met Pro

A 9. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 56 bázispár

TÍPUSA: nukleinsav

HÁNY SZÁLÚ: egy

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS: cDNS

HIPOTETIKUS: nem

ANTISZENSZ: nem ··· ♦···

-164NÉV/MEGJELÖLÉS: misc_feature

ELHELYEZKEDÉS: 1...56

EGYÉB INFORMÁCIÓK: termék = szintetikus oligomer

A 9. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

GAGGTCTACG CCGAGGCCAT CGCCGCCAAC TCCACTCTTG TCGCAGAATG AGATCT 56

A 10. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 56 bázispár

TÍPUSA: nukleinsav

HÁNY SZÁLÚ: egy

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS: cDNS

HIPOTETIKUS: nem

ANTISZENSZ: nem

NÉV/MEGJELÖLÉS: misc_feature

ELHELYEZKEDÉS: 1...56

EGYÉB INFORMÁCIÓK: termék = szintetikus oligomer

A 10. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

AGATCTCATT CTGCGACAAG AGTGGAGTTG GCGGCGATGG CCTCGGCGTA GACCTC 56

A 11. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 16 bázispár

TÍPUSA: aminosav

HÁNY SZÁLÚ: egy

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS: peptid

-165HIPOTETIKUS: nem

ANTISZENSZ: nem

NÉV/MEGJELÖLÉS: peptid

ELHELYEZKEDÉS: 1...15

EGYÉB INFORMÁCIÓK: jel = peptid

A 11. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

Val Tyr Alá Glu Alá Ile Alá Alá Asn Ser Thr Leu Val Alá Glu Pro

5 10 15

A 12. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 38 bázispár

TÍPUSA: nukleinsav

HÁNY SZÁLÚ: egy

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS: cDNS

HIPOTETIKUS: nem

ANTISZENSZ: nem

NÉV/MEGJELÖLÉS: misc_feature

ELHELYEZKEDÉS : 1...38

EGYÉB INFORMÁCIÓK: termék = szintetikus oligomer

A 12. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

CTAACAGAAT TCATCATGAA GATGATGAGC ACCAGGGC 38

A 13. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 38 bázispár

TÍPUSA: nukleinsav

-166HÁNY SZÁLÚ: egy

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS: cDNS

HIPOTETIKUS: nem

ANTISZENSZ: nem

NÉV/MEGJELÖLÉS: misc_feature

ELHELYEZKEDÉS : 1...38

EGYÉB INFORMÁCIÓK: termék = szintetikus oligomer A 13. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

GTCGACCATG GTCTGGGCGT GCGCGGTGCG GCGGCGGA 38

A 14. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 20 bázispár

TÍPUSA: nukleinsav

HÁNY SZÁLÚ: egy

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS: cDNS

HIPOTETIKUS: nem

ANTISZENSZ: nem

NÉV/MEGJELÖLÉS: misc_feature

ELHELYEZKEDÉS: 1...20

EGYÉB INFORMÁCIÓK: termék = szintetikus oligomer A 14. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

TTGTAGTTAA TGCGTATTAG

-167-

··

A 15. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 22 bázispár

TÍPUSA: nukleinsav

HÁNY SZÁLÚ: egy

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS: cDNS

HIPOTETIKUS: nem

ANTISZENSZ: nem

NÉV/MEGJELÖLÉS: misc_feature

ELHELYEZKEDÉS: 1...22

EGYÉB INFORMÁCIÓK: termék = szintetikus oligomer A 15. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

CCATGGTGCA AATGTTCAAA GT 22

A 16. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 25 bázispár

TÍPUSA: nukleinsav

HÁNY SZÁLÚ: egy

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS: cDNS

HIPOTETIKUS: nem

ANTISZENSZ: nem

NÉV/MEGJELÖLÉS: misc_feature

ELHELYEZKEDÉS : 1...25

EGYÉB INFORMÁCIÓK: termék = szintetikus oligomer

-168··«···«· ·· « · • · · · · · ·

A 16. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA: ATGACATACC ATCATATTTG ATATC 25

A 17. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 30 bázispár

TÍPUSA: nukleinsav

HÁNY SZÁLÚ: egy

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS: cDNS

HIPOTETIKUS: nem

ANTISZENSZ: nem

NÉV/MEGJELÖLÉS: misc_feature

ELHELYEZKEDÉS: 1...30

EGYÉB INFORMÁCIÓK: termék = szintetikus oligomer A 17. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

TTCTATCTAG AATGCAGCAC CACAAAGGG 30

A 18. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 30 bázispár

TÍPUSA: nukleinsav

HÁNY SZÁLÚ: egy

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS: cDNS

HIPOTETIKUS: nem

ANTISZENSZ: nem

NÉV/MEGJELÖLÉS: mise feature • « »· ·«·* ·4

-169ELHELYEZKEDÉS: 1...30

EGYÉB INFORMÁCIÓK: termék = szintetikus oligomer A 18. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

ATGGCAGCCA AGATGCTTGC ATTGTTCGCT 30

A 19. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 32 bázispár

TÍPUSA: nukl einsav

HÁNY SZÁLÚ: egy

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS: cDNS

HIPOTETIKUS: nem

ANTISZENSZ: nem

NÉV/MEGJELÖLÉS: misc_feature

ELHELYEZKEDÉS : 1...32

EGYÉB INFORMÁCIÓK: termék = szintetikus oligomer A 19. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

GACTCGGATC CAGCTGAGAA TTAGGAGCCT TG 32

A 20. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 13 bázispár

TÍPUSA: nukleinsav

HÁNY SZÁLÚ: egy

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS: cDNS

HIPOTETIKUS: nem

-170·· ··

ANTISZENSZ: nem

NÉV/MEGJELÖLÉS: misc_feature

ELHELYEZKEDÉS : 1...13

EGYÉB INFORMÁCIÓK: termék = szintetikus oligomer A 20. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

CTAGCCCGGG TAC 13

A 21. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 13 bázispár

TÍPUSA: nukleinsav

HÁNY SZÁLÚ: egy

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS: cDNS

HIPOTETIKUS: nem

ANTISZENSZ: nem

NÉV/MEGJELÖLÉS: misc_feature

ELHELYEZKEDÉS: 1...13

EGYÉB INFORMÁCIÓK: termék = szintetikus oligomer A 21. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

CTAGGTACCC GGG •···«· ·«

-171SZABADALMI IGÉNYPONTOK

Claims (22)

1. Rekombináns DNS-konstrukció, amely tartalmaz egy szövetspecifikus promótert, funkcionálisan egy vakuólumspecifikus szignálszekvenciához kapcsolva, mely szignálszekvencia funkcionálisan hozzá van kapcsolva egy levanszukrázgén kódoló szekvenciájához, amely konstrukció az alább felsorolt növényi sejtek valamelyikébe transzformálva az adott sejt vakuólumában fruktántermelődést képes előidézni: kukoricasejtek, burgonyasejtek és dohánysejtek.

2. Kukorica-, burgonya- vagy dohánynövény, amely 1. igénypont szerinti DNS-konstrukcióval van transzformálva, oly módon, hogy a növény sejtjeinek vakuólumaiban fruktán termelődik.

3. Eljárás fruktóz előállítására, azzal jellemezve, hogy egy 2. igénypont szerinti növényt termesztünk, a növényt learatjuk, majd a növényben található fruktánt a learatott növényből kinyerjük.

4. Rekombináns DNS-konstrukció, amely tartalmaz egy szövetspecifikus promótert, funkcionálisan egy vakuólumspecifikus szignálszekvenciához kapcsolva, mely szignálszekvencia funkcionálisan hozzá van kapcsolva egy dextránszukrázgén kódoló szekvenciájához, amely konstrukció az alább felsorolt növényi sejtek valamelyikébe transzformálva az adott sejt vakuólumában dextrántermelődést képes előidézni: kukoricasejtek, burgonyasejtek és dohánysejtek.

5. Kukorica-, burgonya- vagy dohánynövény, amely 4. igénypont szerinti DNS-konstrukcióval van transzformálva, ···· ···· ··«· ·* * h · » · • · · · • » · · · ·

-172oly módon, hogy a növény sejtjeinek vakuólumaiban dextrán termelődik.

6. Eljárás dextrán előállítására, azzal jellemezve, hogy egy 5. igénypont szerinti növényt termesztünk, a növényt learatjuk, majd a növényben található dextránt a learatott növényből kinyerjük.

7. Rekombináns DNS-konstrukció, amely tartalmaz egy szövetspecifikus promótert, funkcionálisan egy vakuólumspecifikus szignálszekvenciához kapcsolva, mely szignálszekvencia funkcionálisan hozzá van kapcsolva egy alternánszukrázgén kódoló szekvenciájához, amely konstrukció az alább felsorolt növényi sejtek valamelyikébe transzformálva az adott sejt vakuólumában alternántermelődést képes előidézni: kukoricasejtek, burgonyasejtek és dohánysejtek.

8. Kukorica-, burgonya- vagy dohánynövény, amely 7. igénypont szerinti DNS-konstrukcióval van transzformálva, oly módon, hogy a növény sejtjeinek vakuólumaiban alternán termelődik.

9. Eljárás fruktóz előállítására, azzal jellemezve, hogy egy 8. igénypont szerinti növényt termesztünk, a növényt learatjuk, majd a növényben található alternánt a learatott növényből kinyerjük.

10. Az 1., 4. vagy 7. igénypont szerinti DNSkonstrukció, amely szövetspecifikus promóterként magspecifikus promótert tartalmaz.

• ·

-17311. Az 1., 4. vagy 7. igénypont szerinti DNSkonstrukció, amely szövetspecifikus promóterként gumóspecifikus promótert tartalmaz.

12. Növény, amely a 10. igénypont szerinti DNSkonstrukcióval van transzformálva, és amely a magvakban felhalmozódó fruktánt termel.

13. Növény, amely a 10. igénypont szerinti DNSkonstrukcióval van transzformálva, és amely a magvakban felhalmozódó dextránt termel.

14. Növény, amely a 10. igénypont szerinti DNSkonstrukcióval van transzformálva, és amely a magvakban felhalmozódó alternánt termel.

15. Növény, amely a 11. igénypont szerinti DNSkonstrukcióval van transzformálva, és amely a gumókban felhalmozódó fruktánt termel.

16. A Növény, amely a 11. igénypont szerinti DNSkonstrukcióval van transzformálva, és amely a gumókban felhalmozódó dextránt termel.

17. Növény, amely a 11. igénypont szerinti DNSkonstrukcióval van transzformálva, és amely a gumókban felhalmozódó alternánt termel.

18. Eljárás fruktántartalom növelésére növényekben, azzal jellemezve, hogy valamely olyan növénybe, amely a természetben előfordulónál nagyobb koncentrációban tartalmaz szacharózt, olyan rekombináns DNS-konstrukciót juttatunk, amely tartalmaz egy szövetspecifikus promótert, amely funkcionálisan hozzá van kapcsolva egy vakuólumspecifikus szignálszekvenciához, mely szignálszekvencia funkcionálisan

-174- ···· hozzá van kapcsolva egy levanszukrázgén kódoló szekvenciájához, olv módon, hoav a bejuttatott konstrukció úav transzformálja a növényi sejtet, hogy a transzformált növény fruktánt szintetizál és halmoz fel.

19. Növény, amely 18. igénypont szerint alkalmazott

DNS-konstrukcióval van transzformálva.

20. Mag, melyet a 19. igénypont szerinti transzformált növény termelt.

21. A 18. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy kukoricanövényt transzformálunk, amely ezáltal megváltozott fruktántartalmú kukoricamagvakat termel.

22. Rekombináns DNS-konstrukció, amely szövetspecifikus promótert tartalmaz, amely funkcionálisan hozzá van kapcsolva egy vakuólumspecifikus szignálszekvenciához, mely szignálszekvencia funkcionálisan hozzá van kapcsolva egy levanszukrázgén mutáns kódolószekvenciájához, mely konstrukció alkalmas növényi sejtek transzformálására, oly módon, hogy a növényi sejt sejtplazmájában fruktán-felhalmozódást idéz elő.

23. Szójababnövény, amely a 22. igénypont szerinti

DNS-konstrukcióval van transzformálva.

A meghatalmazott: