BR102018073082A2 - Método para obtenção de sementes de mamoneira sem ricina/rca, plantas de mamona sem ricina/rca, método de identificação de plantas de mamona sem ricina/rca, polinucleotídeos, construções, e usos das mesmas - Google Patents

Abstract

método para obtenção de sementes de mamoneira sem ricina/rca, plantas de mamona sem ricina/rca, método de identificação de plantas de mamona sem ricina/rca, polinucleotídeos, construções, e usos das mesmas. a presente invenção está relacionada com um método para obtenção de plantas de mamona sem ricina/rca através da inserção de construções gênicas em células vegetais, particularmente de mamona, resultando na produção de sementes de mamoneira sem ricina/rca. outro aspecto da invenção está em prover plantas de mamona, e partes da mesma, contendo a referida construção gênica. o método da presente invenção se mostrou eficiente para a geração de plantas de mamona sem ricina ou com baixo nível de expressão dessa proteína, permitindo o uso da mamona para produção de tortas detoxificada tanto para alimentação animal quanto para fertilizante, além de permitir a sua produção em países com restrições devido à toxicidade da ricina. dessa forma também são providos método e kit de identificação de plantas transformadas contendo as contruções gênicas aqui fornecidas.

Description

MÉTODO PARA OBTENÇÃO DE SEMENTES DE MAMONEIRA SEM RICINA/RCA, PLANTAS DE MAMONA SEM RICINA/RCA, MÉTODO DE IDENTIFICAÇÃO DE PLANTAS DE MAMONA SEM RICINA/RCA, POLINUCLEOTÍDEOS, CONSTRUÇÕES, E USOS DAS MESMAS.

CAMPO DA INVENÇÃO

[1] A presente invenção está relacionada ao campo da biotecnologia vegetal e biologia molecular. Mais especificamente, a presente invenção está relacionada com um método para obtenção de plantas de mamona sem ricina/RCA através da inserção de construções gênicas em células vegetais, particularmente de mamona, resultando na produção de sementes de mamoneira sem ricina/RCA. Outro aspecto da invenção está em obter plantas de mamona, e partes da mesma, contendo a referida construção gênica. Adicionalmente, são providos método de identificação da planta transformada assim como kit de identificação da planta transformada.

FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO

[2] A mamona (Ricinus communis) é uma oleaginosa pertencente à Família Euphorbiaceae com distribuição mundial, porém mais cultivada em regiões tropicais e subtropicais. Essa cultura tem como produto de maior importância o óleo de rícino que compõe de 45-55% do peso da semente. O principal uso industrial do óleo de mamona e derivados é como matéria-prima para fabricação de nylon, na produção de resinas sintéticas e fibras, plásticos, oleados e couro artificial (Grand View Research (2016) Castor Oil And Derivatives Market Analysis By Product (Sebacic Acid, Ricinoleic Acid, Undecylenic Acid, Castor Wax, Dehydrated Castor Oil), By Application (Lubricants, Surface Coatings, Biodiesel, Cosmetics & Pharmaceuticals, Plastics& Resins) And Segment Forecasts To 2024. Recuperado em 13 junho 2018 de https://www.grandviewresearch.com/industry-analysis/castor-oil-derivatives-industry). O óleo também pode ser utilizado: na síntese de monômeros e polímeros renováveis; na produção de sabão, ceras, lubrificantes, fluidos hidráulicos e de freio; em revestimentos e tintas; e tem importância ainda nas indústrias de cosméticos, farmacêutica e de alimentos (Grand View Research (2016) Castor Oil And Derivatives Market Analysis By Product (Sebacic Acid, Ricinoleic Acid, Undecylenic Acid, Castor Wax, Dehydrated Castor Oil), By Application (Lubricants, Surface Coatings, Biodiesel, Cosmetics & Pharmaceuticals, Plastics& Resins) And Segment Forecasts To 2024. Recuperado em 13 junho 2018 de

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2/26 https://www.grandviewresearch.com/industry-analysis/castor-oil-derivatives-industry). Na parte de cosméticos, o óleo de mamona é utilizado como emoliente (ZOFCHAK, OBEJI; MOSQUERA, 1996) e em perfumaria (NAUTIYAL, 2017); no setor alimentício, é usado na parte de doces como agentes de liberação e antiaderente (FDA, 1984); e na indústria farmacêutica, o óleo de mamona tem propriedades laxativas e também é utilizado como veículo de entregas de drogas (drug delivery vehicle), bem como excipiente e aditivo (BAKER; GRANT, 2018).

[3] Após a extração do óleo da semente de mamona resta a torta que é o subproduto de maior importância da cultura. A torta de mamona pode ser usada como fertilizante, tanto para agricultura convencional quanto para a agricultura orgânica (MELLO, Gabriel Alves Botelho de et al. Organic cultivation of onion under castor cake fertilization and irrigation depths. Acta Sci., Agron., Maringá , v. 40, e34993, 2018. Available from <http://www.scielo.br/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S1807-

86212018000100605&lng=en&nrm=iso>. access on 21 June 2018. Epub Feb 05, 2018.

http://dx.doi.org/10.4025/actasciagron.v40i1.34993), por ser uma importante fonte de nitrogênio, fósforo, potássio, além de micronutrientes (Lima, R.L.S., Severino, L.S., Sampaio, L.R., Sofiatti,V., Gomes, J.A., Beltrão, N.E.M., 2011. Blends of castor meal and castor husks for optimized use as organic fertilizer. Ind. Crops Prod. 33, 364-368). Um outro uso da torta de mamona é na alimentação animal. Porém seu uso como ração é inadequado devido à presença da ricina, uma proteína tóxica e de difícil eliminação.

[4] A toxicidade da torta de mamona que inviabiliza seu uso como alimento animal ocorre principalmente devido à presença da ricina (RCA60), uma proteína altamente tóxica, mas com baixo potencial de hemaglutinação. Além disso, estão presentes alguns compostos de baixa toxidez: a ricinina, complexo CB-1A e RCA120 (Severino LS (2005) O que sabemos sobre a torta de mamona. Documentos, 134. Embrapa Algodão, Campina Grande, PB; Barnes DJ, Baldwin BS, Braasch DA (2009) Ricin accumulation and degradation during castor seed development and late germination. Ind Crops Prod 30:254-258; Bozza WP, Tolleson WH, Rosado LAR, Zhanga B (2015) Ricin detection: Tracking active toxin. Biotechnol Adv 33:117123). A presença de ricina pode inativar os ribossomos, podendo levar a morte de animais, incluindo seres humanos. As doses letais para animais variam de 0,1 g/kg para equinos até 2,3 g/kg para suínos (FONSECA; SOTO-BLANCO, 2014). Para humanos, a ingestão de cinco sementes pode ser letal (OSNES, S. The history of ricin, abrin and related toxins. Toxicon, v.44, n.4, p.361-370, 2004). Para a utilização da torta como ração animal é necessária sua detoxificação prévia, mas os métodos até então desenvolvidos geralmente são pouco eficientes

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3/26 e/ou economicamente inviáveis em grande escala (Severino LS, Auld DL, Baldanzi M, Cândido MJD, Chen G, Crosby W, Tan D, He X, Lakshmamma P, Lavanya C, Machado OLT, Mielke T, Milani M, Miller TD, Morris JB, Morse SA, Navas AA, Soares DJ, Sofiatti V, Wang ML, Zanotto MD, Zieler H (2012) A review on the challenges for increased production of castor. Agron J 104:853-880.).

[5] Com relação aos documentos de patente relacionados ao desenvolvimento de plantas de mamona sem ricina, existem descritos no estado da técnica poucos documentos sobre o assunto, e nenhum visando a obtenção de plantas de mamona sem ricina por técnicas de biologia molecular. O que existe relatado são documentos visando a melhoria da produção do ácido ricinoleico, como no caso do documento de patente WO200070052, que diz respeito a um gene isolado a partir do DNA genômico de Ricinus communis e que codifica uma proteína capaz de interagir com a enzima oleato 12-hidroxilase. No entanto, quando analisamos documentos de patente visando à obtenção de plantas de mamona detoxificadas, encontramos mais tecnologias disponíveis, como é o caso de processos de detoxificação de sementes e torta de mamona (BR102015030887, CN103766598, CN103766599, CN103892145 e FR2940804).

[6] Sabe-se que existem várias cópias do gene da ricina no genoma da mamona (Chan AP, Crabtree J, Zhao Q, Lorenzi H, Orvis J, Puiu D, Melake-Berhan A, Jones KM, Redman J, Chen G, Cahoon EB, Gedil M, Stanke M, Haas BJ, Wortman JR, Fraser-Liggett CM, Ravel J, Rabinowicz PD (2010) Draft genome sequence of the oilseed species Ricinus communis. Nat Biotechnol 28:951-956) e a quantidade de ricina varia conforme a variedade (Baldoni AB, Araújo ACG, Carvalho MH, Gomes ACMM, Aragão FJL (2010) Immunolocalization of ricin accumulation during castor bean (Ricinus communis L.) seed development. Int J Plant Biol 1:6165.), mas não existe relato da existência de variedades sem ricina. Portanto, uma estratégia para a produção de uma torta de mamona sem ricina é o silenciamento gênico desta proteína por meio da técnica de RNA interferente, pela utilização de um protocolo de transformação eficiente. Como a cadeia A da ricina é muito similar a cadeia A da RCA120 (uma forte aglutinina também presente na torta) é possível o seu silenciamento em conjunto com a utilização dessa técnica (Chan AP, Crabtree J, Zhao Q, Lorenzi H, Orvis J, Puiu D, Melake-Berhan A, Jones KM, Redman J, Chen G, Cahoon EB, Gedil M, Stanke M, Haas BJ, Wortman JR, Fraser-Liggett CM, Ravel J, Rabinowicz PD (2010) Draft genome sequence of the oilseed species Ricinus communis. Nat Biotechnol 28:951-956). Isto possibilita a obtenção de plantas de mamona com sementes detoxificadas que permitirão o emprego da torta como ração animal, gerando um produto de maior valor agregado para o produtor.

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[7] O silenciamento gênico pós-transcricional refere-se à transativação de genes homólogos devido à degradação de RNA. Embora existam trabalhos de indução de PTGS com insertos de simples-cópia, a presença de repetições invertidas e múltiplas cópias dos transgenes estão tipicamente associadas com silenciamento (como mencionado no pedido de patente US20030135888, Jorgensen et al., Plant Mol. Biol., 31:957 (1996)). Acredita-se que o pareamento ectópico DNA-DNA ou DNA-RNA, ou a formação de transcritos antisense que dão origem a dsRNA (RNA dupla fita), resultam na formação de transcritos de RNA aberrantes (incluindo perda da poliadenilação do RNA, ou curta poliadenilação do RNA, geralmente como resultado da transcrição incompleta) que ativam o silenciamento (como mencionado no pedido de patente US20030135888, Baulcombe et al. Curr. Opin. Biotechnol, 7:173 (1996); Depicker et al., Curr. Opin. Cell Biol., 9:373 (1997); Metzlaff et al., Cell, 88:845 (1997); Montgomery et al., Trends Genet., 14:255 (1998); Que et al., Dev. Genet., 22:110 (1998); Stam et al., Mol Cell Biol., 18: 6165 (1998); e Wassenegger et al., Plant Mol. Biol., 37:349 (1998)). O método mais simples de PTGS com a formação de dsRNA envolve uma construção contendo uma sequência de ácido nucleico, ou fragmento do mesmo, cuja orientação em relação ao promotor está no sentido contrário, resultando na formação de um mRNA antisense. Este mRNA antisense, quando transcrito no interior da célula do organismo, irá se ligar complementariamente a uma molécula de mRNA endógena levando à formação de uma molécula de mRNA dupla fita que irá desencadear um processo envolvendo várias enzimas para amplificar a resposta resultando no silenciamento do gene específico para o mRNA, ou seja, na redução ou ausência da proteína codificada por tal gene (US5107065, US20030135888, US20040216190).

[8] Uma forma derivada da tecnologia antisense é a inserção de construções gênicas no interior de organismos contendo sequências de ácidos nucléicos na orientação sense e antisense separadas por uma sequência espaçadora (por exemplo, íntron), o que levará à formação de uma estrutura em forma de grampo artificial de mRNA em dupla fita (dsRNA). Essa tecnologia, denominada também de RNA interferente, mostrou ser muito mais eficiente do que apenas a inserção da molécula de ácido nucléico na orientação antisense, uma vez que a molécula de mRNA não precisa encontrar a molécula complementar. A utilização da interferência de RNA (RNAi) mostrou ser possível a obtenção de plantas com níveis de transcrição indetectáveis ou ausentes (Wesley SV, Heliwell CA, Smith NA, Wang M, Rouse DT, Liu Q, Gooding PS, Singh SP, Abbott D, Stoutjesdijk PA, Robinson SP, Gleave AP, Green AG & Waterhouse PM (2001) Construct design for efficient, effective and high-throughput gene silencing in plants, The Plant Journal. 27: 581-590, WO9953050, US20030175783, US20030180945, US20050120415), mostrando-se uma metodologia eficaz no silenciamento de ricina em plantas.

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[9] Dessa forma, a presente invenção traz uma novidade com grande aplicação industrial que é a produção de plantas de mamona sem a toxina da ricina/RCA, obtidas através do silenciamento gênico pós-transcricional dos genes da ricina.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[10] A presente invenção está relacionada com um método para obtenção de plantas de mamona sem ricina/RCA através da inserção de construções gênicas em células vegetais, particularmente de mamona, resultando na produção de sementes de mamoneira sem ricina/RCA.

[11] Uma primeira concretização da invenção é prover moléculas de polinucleotídeo sintético compreendendo uma primeira região com sequência de ácidos nucléicos com similaridade de pelo menos 90% com a sequência descrita em SEQ ID No 12 e uma segunda região com o complemento da sequência da primeira região.

[12] Uma concretização adicional da invenção provê um polinucleotídeo sintético compreendendo uma primeira região com sequência de ácidos nucléicos conforme sequência descrita em SEQ ID No 12, uma segunda região com sequência de ácidos nucléicos conforme sequência descrita em SEQ ID No 13 e uma região espaçadora entre a primeira região e a segunda região com sequência de ácidos nucleicos conforme a sequencia descrita em SEQ ID No 5.

[13] Também é fornecida uma construção gênica compreendendo um polinucleotídeo sintético compreendendo uma primeira região com sequência de ácidos nucléicos com similaridade de pelo menos 90% com a sequência descrita em SEQ ID No 12 e uma segunda região com o complemento da sequência da primeira região e uma região de promotor gênico ativo operacionalmente ligado ao polinucleotídeo sintético. Também é fornecido vetor contendo a referida construção gênica.

[14] Adicionalmente, a presente invenção provê um vetor compreendendo um promotor gênico conforme sequência descrita em SEQ ID No 4, uma primeira região codificante com sequência de ácidos nucléicos conforme sequência descrita em SEQ ID No 12, uma segunda região codificante com sequência de ácidos nucléicos conforme sequência descrita em SEQ ID No 13, uma região espaçadora entre a primeira região e a segunda região com sequência de

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6/26 ácidos nucleicos conforme a sequencia descrita em SEQ IDNo 5, um sinal de terminação conforme sequência descrita em SEQ ID No 6, um gene marcador compreendendo o promotor descrito na SEQ ID NO 7, uma região codificadora descrita na SEQ ID NO 8 e um sinal de terminação descrito na SEQ ID NO 9 e um gene de seleção compreendendo o promotor descrito na SEQ ID NO 1, uma região codificadora descrita na SEQ ID NO 2 e um sinal de terminação descrito na SEQ ID NO 3.

[15] Em outra concretização é fornecida a molécula de ribonucleotídeo de filamento duplo produzida pela expressão de qualquer uma das moléculas nucleotídicas mencionadas anteriormente.

[16] Também é provido, no presente documento, um método para obtenção de plantas de mamona sem ricina/RCA compreender as etapas de:

a. Inserir em células vegetais de mamona qualquer das moléculas de DNA mencionadas anteriormente;

b. Crescer ou regenerar as células em meios específicos;

c. Selecionar as plantas com o gene da ricina silenciado.

[17] A presente invenção também fornece célula eucariótica e planta compreendendo qualquer uma das moléculas de ácido nucléico mencionadas anteriormente. A sementa da planta também é provida.

[18] Outra concretização diz respeito ao método de identificação da planta transformada geneticamente e compreende as seguintes etapas:

a. formar uma mistura compreendendo uma amostra biológica contendo DNA de mamona e um par de primers capaz de amplificar uma molécula de ácido nucleico específica de um evento TB14S-5D de mamona;

b. reagir a mistura sob condições que permitam que o par de primers de ácido nucleico amplifiquem uma molécula específica de ácido nucleico do evento TB14S-5D de mamona;

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c. detectar a presença da molécula de ácido nucleico amplificada, de forma que a presença da molécula de ácido nucleico específica do evento TB14S-5D de mamona indica que a planta de mamona é um evento TB14S-5D de planta de mamona.

[19] Também é fornecido um kit de identificação de molécula de ácido nucleíco de mamona em amostra biológica compreendendo um par de primers de ácido nucleico selecionado dentre os seguintes pares SEQ ID NO 19 com SEQ ID NO 20, SEQ ID NO 21 com SEQ ID NO 22 ou SEQ ID NO 23 com SEQ ID NO 24.

[20] Por fim, a presente invenção provê óleo de semente de mamona extraído de semente transgênica e a torta da semente de mamona obtida por processo utilizando semente transgênica.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[21] Figura 1 - Representação esquemática da construção utilizada para transformação da mamona. Vetor para biobalística pRicRNAi composto pelo cassete de transformação, um fragmento do gene da ricina (ric) em sentido senso e antissenso intercalado por um íntron, sob o controle do promotor 35SCaMV e terminador OCS, o gene ahas (AtAhas) e o gene gus dirigidos pelo promotor AtACT2.

[22] Figura 2 - Expressão do gus no evento TB14S-5D a partir de ensaio histoquímico. Embriões não transgênicos (NT) não mostram expressão do gus.

[23] Figura 3 - O ensaio de Southern blot mostra a presença de transgenes representando Áricin (cassete de interferência) integratedo no genoma em duas plantas do evento TB14S-5D enquanto não é observado sinal em plantas não transgênicas (NT).

[24] Figura 4 - O Northern blot mostra a presença de siRNAs (pequenos RNAs) e a ausência de transcritos do gene da ricina no evento TB14S-5D (+). Em contrapartida, siRNAs não foram observados e os transcritos do gene da ricina estavam presentes em plantas NT ou segregantes negativas do evento TB14S-5D (-).

[25] Figura 5 - Detecção do silenciamento da ricina no evento TB14S-5D. Um teste ELISA foi realizado para detectar e quantificar a ricina em endosperma de sementes do evento TB14S-5D. A ricina foi detectada no endosperma das sementes não transgênicas e nas sementes segregantes negativas. Porem, a ricina não pode ser detectada em sementes positivas do evento TB14S-5D.

[26] Figura 6 - O silenciamento da RCA120 pode ser observado no ensaio de hemaglutinação. Proteínas de sementes do evento TB14S-5D não aglutinaram hemácias, conforme ocorreu com controle negativo (PBS) formando um ponto no fundo da placa, enquanto proteínas de sementes

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8/26 não transgênicas (NT) aglutinaram hemácias como ocorreu no controle positivo (RCA₁₂₀) formando um fundo difuso.

[27] Figura 7 - Análises de PCR mostrando a presença de fragmentos resultantes da amplificaão de um fragmento correspondente a uma sequencia do cassete de interferencia (Áricin). NT é uma planta não-transgênica e pRIcRNAi é o vetor utilizado na transformação genética de mamona.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[28] A presente invenção aborda a produção de plantas de mamona sem a toxina da ricina/RCA, obtidas através do silenciamento gênico pós-transcricional do gene da ricina.

[29] No contexto dessa descrição, inúmeros termos serão utilizados e por isso serão detalhados a seguir.

[30] O termo “ácido nucléico” refere-se a uma grande molécula a qual pode ser fita simples ou fita dupla, composta de monômeros (nucleotídeos) contendo um açúcar, um fosfato e uma base purina ou pirimidina. Um “fragmento de ácido nucléico” é uma fração de uma dada molécula de ácido nucléico. “Complementaridade” refere-se ao pareamento específico de bases purinas e pirimidinas que consistem de ácidos nucléicos: pares de adenina com timina e pares de guanina com citosina. Então, o “complemento” de um primeiro fragmento de ácido nucléico refere-se ao segundo fragmento de ácido nucléico cuja sequência de nucleotídeos é complementar à primeira sequência de nucleotídeos.

[31] Em plantas mais desenvolvidas, ácido desoxirribonucléico (DNA) é o material genético enquanto ácido ribonucléico (RNA) está envolvido na transferência da informação do DNA em proteínas. Um “genoma” é toda parte principal do material genético contida em cada célula de um organismo. O termo “sequência de nucleotídeo” refere-se às sequências de polímeros de nucleotídeos, formando uma fita de DNA ou RNA, as quais podem ser simples ou dupla-fita, opcionalmente sintéticas, não naturais ou com bases de nucleotídeos alteradas capazes de incorporação dentro de polímeros de DNA ou RNA. O termo “oligômero” refere-se a sequências curtas de nucleotídeos, usualmente até 100 bases de comprimento. O termo “homólogo” à ligação entre as sequências de nucleotídeos de duas moléculas de ácido nucléico ou entre as sequências de aminoácidos de duas moléculas de proteínas. A estimativa de tal homologia é provida através da hibridização de DNA-DNA ou RNA-RNA sob condições de estringência como definido no estado da técnica (como mencionado no documento US20030074685, Hames and Higgins, Ed. (1985) Nucleic Acid Hybridization, IRL Press, Oxford, U.K); ou pela

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9/26 comparação de similaridade de sequência entre duas moléculas de ácido nucléico ou proteína (como mencionado no documento US20030074685, Needleman et al., J. Mol. Biol. (1970) 48:443-453).

[32] “Gene” refere-se ao fragmento de nucleotídeo que expressa uma proteína específica, incluindo sequências regulatórias precedentes (região 5' não traduzida) e posteriores (região 3' não traduzida) à região codificadora. “Gene nativo” refere-se a um gene isolado com sua própria sequência reguladora encontrada na natureza. “Gene quimérico” refere-se ao gene que compreende sequências codificadoras, regulatórias e heterogêneas não encontradas na natureza. “Gene endógeno” refere-se ao gene nativo normalmente encontrado em sua localização natural no genoma e não é isolado. Um “gene exógeno” refere-se a um gene que não é normalmente encontrado no organismo hospedeiro, mas que é introduzido por transferência gênica. “Pseudogene” refere-se a uma sequência nucleotídica que não codifica uma enzima funcional.

[33] “Sequência codificadora” refere-se à sequência de DNA que codifica uma proteína específica e exclui a sequência não codificadora. Uma “sequência codificadora interrompida” significa a sequência que atua como separadora (por exemplo, um ou mais íntrons ligados através de junções).

[34] Um “íntron” ou “região espaçadora” é uma sequência de nucleotídeo que é transcrita e está presente no pré mRNA, mas é removida através de clivagem e a re-ligação do mRNA dentro da célula gerando um mRNA maduro que pode ser traduzido em uma proteína. Exemplos de íntrons incluem, mas não são limitados a íntron pdk, pdk2, íntron catalase da mamona, íntron Delta 12 desnaturase de algodão, Delta 12 desnaturase de Arabidopsis, íntron ubiquitina de milho, íntron de SV40, íntrons do gene da ricina. A presente invenção utilizou o íntron pdk (SEQ ID NO 5)

[35] “Transcrito de RNA” refere-se ao produto resultante da transcrição catalisada pela RNA polimerase de uma sequência de DNA. Quando o transcrito de RNA é uma cópia perfeita da sequência de DNA, ele é referido com transcrito primário ou ele pode ser uma sequência de RNA derivada de um processo pós-transcricional do transcrito primário e é então referido como transcrito maduro. “RNA mensageiro (mRNA)” refere-se ao RNA que está sem íntrons. “RNA sense” refere-se a um transcrito de RNA que inclui o mRNA. “RNA antisense” refere-se a um transcrito de RNA que é complementar a todas as partes de um transcrito primário ou mRNA e que pode bloquear a expressão de um gene alvo através da interferência no processamento, transporte e/ou tradução do seu transcrito primário ou mRNA. A complementaridade de um RNA antisense pode ser com qualquer parte do transcrito gênico específico, isto é, sequência 5' não traduzida, sequência 3' não traduzida, íntrons ou sequência codificadora. Além disso, o RNA

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10/26 antisense pode conter regiões de sequências ribozima que aumentam a eficácia do RNA antisense para bloquear a expressão gênica. “Ribozima” refere-se ao RNA catalítico e inclui sequências específicas de endoribonucleases. “DsRNA (dupla-fita)” refere-se a estrutura em grampo formada entre a sequência do mRNA ou RNA sense, a sequência de uma região espaçadora/íntron e a sequência do RNA antisense.

[36] O termo “similaridade” refere-se a fragmentos de ácidos nucléicos nos quais mudanças em uma ou mais bases de nucleotídeos não afetam a habilidade do fragmento de ácido nucléico mediar a alteração da expressão gênica pelo silenciamento gênico através, por exemplo, da tecnologia antisense, co-supressão ou RNA de interferência (RNAi). Fragmentos de ácido nucléico similares da presente invenção podem ser caracterizados também pela porcentagem de similaridade de suas sequências de nucleotídeos com as sequências de nucleotídeo do fragmento de ácido nucléico descritas aqui (SEQ ID NO 12 e SEQ ID NO 13), como determinada por algoritmos comuns empregados no estado da técnica. O alinhamento de sequência e o cálculo de porcentagem de similaridade da presente invenção foram realizados utilizando-se o Programa DNAMAN for windows (Lynnon Corporation, 2001), utilizando sequências depositadas no Gene Bank, através da integração do Web browser. Para a presente invenção também podem ser utilizadas outras regiões da cadeia A com efeito semelhante, bem como sequencias da cadeia B, sem, no entanto, nesse cas, com efeito sobre a RCA/RCA120 (Ricinus communis agglutinin).

[37] Para que o dsRNA seja formado, é necessário que estejam presentes na molécula de DNA a sequência de nucleotídeos do gene alvo na orientação sense, e uma sequência de nucleotídeos na orientação antisense, podendo haver ou não uma região espaçadora/íntron entre as sequências de nucleotídeos sense e antisense. As sequências de nucleotídeos mencionadas podem ser constituídas de cerca de 19nt a 470 nt ou ainda cerca de 1740 nucleotídeos ou mais, cada um tendo uma similaridade substancial de sequência total com cerca de 40% a 100%. Quanto mais longa for a sequência, menos estringência é requerida para similaridade substancial total da sequência. Os fragmentos contendo pelo menos cerca de 19 nucleotídeos devem ter preferencialmente cerca de 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência quando comparada com a sequência de referência, com possibilidade de ter cerca de 2 nucleotídeos distintos não contíguos. Preferencialmente são utilizados fragmentos acima de 60 pb, mais preferencialmente ainda fragmentos entre 150 a 500pb.

[38] Em um dos aspectos da invenção, a molécula de dsRNA pode compreender uma ou mais regiões tendo uma similaridade substancial de sequência para as regiões com pelo menos cerca de 14 nucleotídeos consecutivos dos nucleotídeos sense do gene alvo, definida como primeira região e, uma ou mais regiões tendo uma similaridade substancial de sequência para as regiões

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11/26 com cerca de 15 nucleotídeos consecutivos do complemento dos nucleotídeos sense do gene alvo, definida como segunda região, onde essas regiões podem ter pares de bases separando-as uma da outra. Para a presente invenção foram utilizados fragmentos de 461 nucleotídeos (SEQ ID NO 12 e SEQ ID NO 13) do gene da ricina de mamona.

[39] Convenientemente, o dsRNA (RNA de dupla fita) como descrito pode ser expresso em células hospedeiras à partir de construção gênica introduzida e possivelmente integrada ao genoma da célula hospedeira. Portanto, em uma concretização, a invenção diz respeito a um polinucleotídeo sintético compreendendo Uma primeira região com sequência de ácidos nucléicos com similaridade de pelo menos 90, 95, 99 ou 100% com a sequência descrita em SEQ ID No 12 e uma segunda região com o complemento da sequência da primeira região. Tal polinucleotídeo pode apresentar uma região espaçadora entre a primeira e a segunda região, podendo essa região espaçadora ser uma sequência de íntron selecionada dentre íntron pdk (SEQ ID No 5), íntron pdk2, íntron catalase da mamona, íntron Delta 12 desaturase de algodão, Delta 12 desaturase de Arabidopsis, íntron ubiquitina de milho, íntron de SV40 e íntrons do gene da ricina.

[40] “Promotor” refere-se à sequência de DNA em um gene, usualmente localizada a montante da sequência codificadora, a qual controla a expressão da sequência codificadora promovendo o reconhecimento pela RNA polimerase e outros fatores requeridos para a própria transcrição. Em uma construção de DNA artificial, promotores podem também ser utilizados para transcrever dsRNA. Promotores podem também conter sequências de DNA que estão envolvidas na ligação de fatores de proteínas as quais controlam o efeito do início da transcrição em resposta a condições fisiológicas ou de desenvolvimento.

[41] Em um dos aspectos da invenção, é fornecida uma construção gênica compreendendo o polinucleotídeo caracterizado anteriormente e uma região de promotor gênico tivo operacionalmente ligado ao referido polinucleotídeo.

[42] Tal promotor pode ser um promotor expresso em plantas. Como usado aqui, o termo “promotor expresso em plantas” significa uma sequência de DNA que é capaz de iniciar e/ou controlar a transcrição em uma célula de planta. Isso inclui qualquer promotor de origem vegetal; qualquer promotor de origem não vegetal o qual seja capaz de direcionar a expressão em uma célula vegetal, por exemplo promotores de origem viral ou bacteriana tais como CaMV35S (como mencionado no pedido de patente US20030175783, Hapster et al, 1988 Mol. Gen. Genet. 212, 182-190) e promotores do gene presentes no T-DNA de Agrobaterium; promotores tecidoespecíficos ou órgão-específicos, incluindo mas não limitados a promotores semente-específicos (WO8903887), promotores específicos de órgãos primordiais (como mencionado no pedido de

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12/26 patente US20030175783, An et al., 1996 The Plant Cell 8, 15-30), promotores específicos de caule (como mencionado no pedido de patente US20030175783, Keller et al., 1988 EMBO J. 7: 3625-3633), promotores específicos de folhas (como mencionado no pedido de patente US20030175783, Hudspeth et al., 1989 Plant Mol Biol 12:579-589), promotores específicos de mesófilo, promotores específicos de raiz (como mencionado no pedido de patente US20030175783, Keller et al., 1989 Genes Devel. 3:1639-1646), promotores específicos de tubérculos (como mencionado no pedido de patente US20030175783, Keil et al., 1989 EMBO J. 8: 1323:1330), promotores específicos de tecidos vasculares (como mencionado no pedido de patente US20030175783, Peleman et al., 1989 Gene 84: 359-369), promotores específicos de estames (WO8910396, WO9213956), promotores específicos da zona de deiscência (WO9713865); e semelhantes. Para a presente invenção foram utilizados preferencialmente os seguintes promotores: 1) Promotor do gene Ahas de Arabidopsis thaliana que dirige a expressão do gene ahas (pAtAhas - SEQ ID NO 1); 2) Promotor constitutivo CaMV35S que dirige a expressão do K7 de RNAi para o fragmento de Ricina (pCaMV35S - SEQ ID NO 4) e 3) Promotor constitutivo do gene de Actina 2 de Arabidopsis thaliana que dirige a expressão do gene gus (pAtAct2 - SEQ ID NO 7).

[43] O promotor pode conter elementos “enhancers”. Um “enhancer” é uma sequência de DNA que pode estimular a atividade do promotor. Ela pode ser um elemento inato do promotor ou um elemento heterólogo inserido para aumentar o nível e/ou a tecido-especificidade de um promotor. Na presente invenção foi utilizada a sequência enhancer do Alfalfa mosaic vírus (35SCaMV).

[44] “Promotores constitutivos” referem-se àqueles que dirigem a expressão gênica em todos os tecidos e durante todo tempo. Promotores “tecido-específicos” ou “desenvolvimentoespecíficos” são aqueles que dirigem a expressão gênica quase que exclusivamente em tecidos específicos, tais como folhas, raízes, caules, flores, frutos ou sementes, ou em estágios do desenvolvimento específicos em um tecido, como no início ou final da embriogênese. O termo “expressão” refere-se a transcrição e acumulação estável do RNA derivado dos fragmentos de ácidos nucléicos da invenção que, em conjunto com a aparelhagem de produção de proteína da célula, resulta em níveis alterados de mio-inositol 1-fosfato sintase. “Inibição por interferência” refere-se a produção de transcritos de dsRNA capazes de prevenir a expressão da proteína alvo.

[45] “Sinal de terminação” ou “terminadores” são sequencias que indicam para a enzima RNA polimerase que ela deve parar a transcrição do RNA. O sinal de terminação da transcrição/terminadores da presente invenção inclui, mas não está limitado a, sinal de terminação de SV40, sinal de adenilação de HSV TK, sinal de terminação do gene da nopalina

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13/26 sintetase de Agrobacterium tumefasciens (nos), sinal de terminação do gene RNA 35S do CaMV, sinal de terminação do vírus que ataca o Trifolium subterranean (SCSV), sinal de terminação do gene trpC de Aspergillus nidulans, e outros semelhantes. Para a presente invenção foram utilizados preferencialmente os seguintes “sinais de terminação” ou “terminadores”: 1) Sequência do terminador do gene Ahas-3' de Arabidopsis thaliana (SEQ ID NO 3); 2) Sequência do terminador ocs-3' que finaliza a expressão do K7 de RNAi Ric (SEQ ID NO 6); e 3) Sequência do terminador nos-3' que finaliza a transcrição do gene repórter gus ou uidA (SEQ ID NO 9).

[46] “Sequências regulatórias apropriadas” referem-se a sequências de nucleotídeos em genes nativos ou quiméricos que estão localizadas acima (região 5' não traduzida), dentro, e/ou abaixo (região 3' não traduzida) dos fragmentos de ácido nucleicos da invenção, as quais controlam a expressão dos fragmentos de ácido nucleicos da invenção.

[47] “Níveis alterados” referem-se à produção de produtos gênicos em organismos transgênicos em quantidades ou proporções que diferem daquelas em organismos normais ou não-transgênicos. A presente invenção também relata vetores/construções gênicas, os quais incluem fragmentos de sequências do gene da ricina de mamona na orientação sense e antisense, e células hospedeiras, as quais são geneticamente engenheiradas com vetores da invenção. “Transformação” refere-se a transferência do gene exógeno para dentro do genoma de um organismo hospedeiro e sua herança geneticamente estável.

[48] “Plantas” referem-se a organismos fotossintéticos e eucariotos. Os ácidos nucleicos da invenção podem ser utilizados para conferir tratos desejados em essencialmente qualquer planta. Então, a invenção possui uso sobre várias espécies de plantas, incluindo espécies dos gêneros Anacardium, Anona, Arachis, Artocarpus, Asparagus, Atropa, Avena, Brassica, Carica, Citrus, Citrullus, Capsicum, Carthamus, Cocos, Coffea, Cucumis, Cucurbita, Daucus, Elaeis, Fragaria, Glycine, Gossypium, Helianthus, Heterocallis, Hordeum, Hyoseyamus, Lactuca, Linum, Lolium, Lupinus, Lycopersicon, Malus, Manihot, Majorana, Medicago, Nicotiana, Olea, Oryza, Panieum, Pannesetum, Passiflora, Persea, Phaseolus, Pistachia, Pisum, Pyrus, Prunus, Psidium, Raphanus, Ricinus, Secale, Senecio, Sinapis, Solanum, Sorghum, Theobromus, Trigonella, Triticum, Vicia, Vitis, Vigna, e Zea. Preferencialmente para a presente invenção as plantas são plantas do gênero Ricinus. Mais especificamente, a presente invenção diz respeito a plantas de Ricinus communis.

[49] Outro objeto da presente invenção é prover células eucariotas, e organismos eucariotas contendo moléculas de dsRNA da invenção, ou contendo os construções gênicas capazes de

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14/26 produzir moléculas de dsRNA da invenção. Tais construções gênicas podem estar estavelmente integradas no genoma das células de organismos eucariotas.

[50] Em outro aspecto da invenção, as construções gênicas podem estar providas em uma molécula de DNA capaz de se replicar de forma autônoma nas células de organismos eucariotas, tais como vetores virais. Na presente invenção foi utilizada uma sequência da origem de replicação do Plasmídeo do pKannibal (SEQ ID NO 10). O gene quimérico ou o dsRNA pode também estar disposto de forma transiente nas células de organismos eucariotas.

[51] As construções gênicas da presente invenção apresentam ainda sequencias codificadoras para genes de seleção e genes marcadores para auxiliar no processo de recuperação do evento transgênico. Existem diversos genes mercadores e genes de seleção que podem ser utilizados na presente invenção, tais como, mas não limitado a: nptII, hpt, neo, bar, ahas, epsps. Na presente invenção foram utilizados preferencialmente: 1) Sequência da região codante do gene Ahas de Arabidopsis thaliana (SEQ ID NO 2); 2) Sequência do gene repórter gus ou uidA (SEQ ID NO 8); e 3) Sequência do gene de resistência a ampicilina do plasmídeo do pKannibal (SEQ ID NO 11).

[52] Uma concretização da invenção diz respeito a um vetor para transformação de plantas compreendendo:

• Promotor gênico conforme sequência descrita em SEQ ID No 4;

• Uma primeira região codificante com sequência de ácidos nucléicos conforme sequência descrita em SEQ ID No 12;

• Uma segunda região codificante com sequência de ácidos nucléicos conforme sequência descrita em SEQ ID No 13;

• Uma região espaçadora entre a primeira região e a segunda região com sequência de ácidos nucleicos conforme a sequencia descrita em SEQ ID No 5;

• Sinal de terminação conforme sequência descrita em SEQ ID No 6;

• Gene marcador compreendendo o promotor descrito na SEQ ID NO 7, uma região codificadora descrita na SEQ ID NO 8 e um sinal de terminação descrito na SEQ ID NO 9;

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15/26 • Gene de seleção compreendendo o promotor descrito na SEQ ID NO 1, uma região codificadora descrita na SEQ ID NO 2 e um sinal de terminação descrito na SEQ ID NO 3.

[53] Os polinucleotídeos, construções gênicas e vetores da invenção podem ser introduzidos dentro do genoma da planta hospedeira desejada através de uma variedade de técnicas convencionais. Por exemplo, pode ser introduzido diretamente dentro do DNA genômico da célula vegetal utilizando técnicas tais como eletroporação e microinjeção de protoplastos de células de plantas, ou a construção pode ser introduzida diretamente no tecido vegetal utilizandose métodos balísticos, tais como bombardeamento de partículas recobertas com DNA.

[54] Técnicas de microinjeção são conhecidas no estado da técnica e bem descritas em literatura científica e patentária. A introdução de construções gênicas utilizando-se precipitações de polietileno glicol é descrita em Paszkowski et al. Embo J. 3:2717-2722, 1984 (como mencionado no pedido de patente US20020152501). Técnicas de eletroporação são descritas em From et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:5824, 1985 (como mencionado no pedido de patente US20020152501). Técnicas de transformações balísticas são descritas em Klein et al. Nature 327:70-73, 1987 (como mencionado no pedido de patente US20020152501).

[55] Alternativamente, as construções gênicas podem ser combinadas com regiões flanqueadoras de T-DNA apropriadas e introduzidas dentro de vetor convencional hospedeiro Agrobacterium tumefasciens. A função de virulência do hospedeiro Agrobacterium tumefasciens direcionará a inserção das construções gênicas e marcador adjacente dentro do DNA da célula vegetal quando a célula é infectada pela bactéria. Técnicas de transformação mediadas por Agrobacterium tumefasciens, incluindo desarmamento e o uso de vetores binários, são bem descritas na literatura científica (como mencionado no pedido de patente US 20020152501, Horsch et al. Science 233:496-498, 1984; e Fraley et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:4803, 1983). Para a presente invenção foi utilizada preferencialmente a técnica de biobalística. No entanto plantas geneticamente modificadas de mamona podem ser obtidas por A. tumefaciens.

[56] Células de plantas transformadas que são derivadas de qualquer uma das técnicas de transformação descritas acima podem ser cultivadas para regenerar uma planta inteira que possua o genótipo transformado e então o fenótipo desejado tal como ausência ou redução da massa de sementes. Tais técnicas de regeneração contam com a manipulação de certos fitohormônios em meio de crescimento de cultura de tecidos, tipicamente contendo um marcador biocida e/ou herbicida, que deve ser introduzido junto com a sequência de nucleotídeos desejada.

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Regeneração de plantas a partir de cultura de protoplastos é descrita em Evans et al., Protoplasts Isolation and Culture, Handbook of Plant Cell Culture, pp. 124-176, MacMillilan Publishing Company, New York, 1983; e Binding, Regeneration of Plants, Plant Protoplasts, pp. 21-73, CRC Press, Boca Raton, 1985 (como mencionado no pedido de patente US20020152501). A regeneração pode ser também obtida através de calos de planta, explantes, órgãos, ou parte da mesma. Tais técnicas de regeneração são descritas geralmente em Klee et al., Ann. Ver. Of Plant Phys. 38:467-486, 1987 1985 (como mencionado no pedido de patente US20020152501).

[57] A presente invenção diz respeito, portanto, a um método para obtenção de plantas de mamona sem ricina/RCA caracterizado por compreender os estágios de:

a. Inserir em células vegetais de mamona molécula de ácido nucléico descrita anteriormente, podendo ser um polinucleotídeo, constrção gênica ou vetor já definidos;

b. Crescer ou regenerar as células de mamona em meios específicos;

c. Selecionar as plantas de mamona com o gene da ricina silenciado.

[58] Sem restringir a invenção para um particular modo de ação, espera-se que a enzima em células eucariotas responsável por gerar pequenas moléculas de RNA com cerca de 19 nucleotídeos de dsRNA (como a DICER em Drosophila) possa ser saturada através da inclusão de um excesso de sequências de dsRNA (isto é, moléculas de RNA complementares) que não estão relacionadas com a sequência de nucleotídeos do gene alvo ou do gene a ser silenciado.

[59] A variação natural na regulação posterior da expressão do gene alvo ocorrendo entre diferentes linhagens de organismos eucariotos compreendendo a mesma molécula de dsRNA será substituída através da manipulação do espectro de silenciamento gênico. Esse fato pode ocorrer através da inclusão de sequências de nucleotídeos de dsRNA extras não relacionadas com o gene alvo, as quais são operacionalmente ligadas aos dsRNA formados pela primeira e segunda região.

[60] A invenção também diz respeito ao uso da molécula de ribonucleotídeo de filamento duplo da presente invenção para supressão da expressão do gene da ricina/RCA.

[61] Em outra concretização da invenção pe fornecido um método de identificação do evento TB14S-5D de mamona transgênicocompreendendo as etapas de:

a. formar uma mistura compreendendo uma amostra biológica contendo DNA de mamona e um par de primers capaz de amplificar uma molécula de ácido nucleico específica de um evento TB14S-5D de mamona;

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b. reagir a mistura sob condições que permitam que o par de primers de ácido nucleico amplifiquem uma molécula específica de ácido nucleico do evento TB14S-5D de mamona;

c. detectar a presença da molécula de ácido nucleico amplificada, de forma que a presença da molécula de ácido nucleico específica do evento TB14S-5D de mamona indica que a planta de mamona é um evento TB14S-5D de planta de mamona.

[62] Os primers para identificação do evento transgênico de mamona estão descritos abaixo:

[63] Cassete de interferência Nricin

[64] PSIUINTF (SEQ ID NO 19): GAACCCAATTTCCCAACTG

[65] PSIUINTR (SEQ ID NO 20): AGGTACCCCAATTGGTAAGGA

[66] Fragmento gerado: 798 pb

[67] Primers para amplificar a sequencia do gene ricina (cadeia a)

[68] RcRinR (SEQ ID NO 21): GAAGCTTGGTACCTAATTCTCGTGCGCAT

[69] RcRinf (SEQ ID NO 22): GTCTAGACTCGAGACATGAAATACCAGTGTTGC

[70] Fragmento gerado: 460pb

[71] A invenção também é concretizada através de um kit de identificação de uma molécula de ácido nucleico do evento TB14S-5D de mamona em uma amostra biológica compreendendo um par de primers de ácido nucleico selecionado dentre os seguintes pares SEQ ID NO 19 com SEQ ID NO 20, SEQ ID NO 21 com SEQ ID NO 22 ou SEQ ID NO 23 com SEQ ID NO 24, que são capazes de amplificar uma molécula de ácido nucleico do evento TB14S-5D de mamona.

[72] A presente invenção também provê um método de reprodução de uma planta de mamona sem ricina/RCA, caracterizado pelas etapas de:

1. cruzar a planta de mamona contendo uma molécula de ácido nucleico do evento TB14S-5D com uma segunda planta de mamona;

2. obter sementes do cruzamento da etapa (a);

3. obter amostra de DNA da semente; e

4. detectar a presença da molécula de ácido nucleico do evento TB14S-5D de planta de mamona.

[73] Finalmente, a presente invenção fornece óleo de semente de mamona extraído de sementes transgênicas de plantas transformadas compreendendo as moléculas de ácidos

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18/26 nucleicos providas e torta de semente de mamona obtida por processo que utiliza também as referidas sementes.

[74] Vários experimentos foram realizados para verificar a presença/ausência da ricina e estão descritos nos exemplos deste relatório. Enquanto os endospermas das sementes geneticamente modificas foram usados para os testes de hemaglutinação, sobrevivência de células epiteliais de intestino de rato (IEC-6) e ratos, os eixos embrionários (T1) foram cultivados in vitro e depois transferidos para casa de vegetação. Além disso, as plantas GM apresentam uma forte atividade histoquímica da GUS, que torna folhas, endospermas e eixos embrionários visivelmente azul em 20 minutos. O uso deste marcador será muito útil para determinar, mesmo em condições de campo, se uma variedade específica é geneticamente modificada. Isso é deverá ser importante para o uso seguro das variedades GM para alimentação animal, uma vez que o uso de variedades com ricina é fatal.

[75] EXEMPLOS

[76] A sequencia completa da construção gênica utilizada na presente invenção está descrita em SEQ ID NO 14 e qualquer especialista na área pode ser capaz de sintetizar essa sequencia para inserir no organismo eucarioto desejado.

[77] A presente invenção é ainda definida nos seguintes Exemplos. Deve ser entendido que esses Exemplos, enquanto indicam parte da invenção, são colocados como forma de ilustração somente, não tendo, portanto, qualquer cunho limitante do escopo das presentes invenções.

[78] Técnicas usuais de biologia molecular tais como transformação de bactérias e eletroforese em gel de agarose de ácidos nucleicos são referidos através de termos comuns para descrevê-los. Detalhes da prática dessas técnicas, bem conhecidos no estado da técnica, são descritos em Sambrook, et al. (Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2^nd ed. (1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press). Várias soluções utilizadas nas manipulações experimentais são referidas por seus nomes comuns tais como “solução de lise”, “SSC”, “SDS”, etc. As composições dessas soluções podem ser encontradas na referência Sambrook, et al. (supracitada).

[79] Exemplo 1

[80] Construção de vetores para transformação genética de mamona

[81] Para a construção do vetor foi utilizado um fragmento do gene RcRCAI (SEQ ID NO 12, - sense e SEQ ID NO 13 - antisense) que codifica a cadeia A da ricina com alta similaridade com a RCA120, pois a cadeia A é a responsável pela toxicidade.

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[82] Foi isolado o DNA total de tecidos frescos de mamona usando o DNeasy Plant Mini Kit (Qiagen, Valencia, CA, USA) e realizadas reações de PCR para clonar o gene RcRCAI, usando os primers RcRINF (5' - GTCTAGACTCGAGACATGAAATACCAGTGTTGC - 3') e

RcRINR (5' - GAAGCTTGGTACCTAATTCTCGTGCGCAT - 3') acrescidos de sítios das enzimas KpnI/XhoI e HindIII/XbaI na extremidade de cada um. O fragmento amplificado de cerca de 480 pb foi clonado no vetor pGEM-TEasy (Kobs, G. (1997) Cloning blunt-end DNA fragments into the pGEM®-T Vector Systems. Promega Notes 62, 15-18). Então, a construção do tipo intron-hairpin foi feita a partir da inserção do fragmento do gene RcRCAI no sentido sense (SEQ ID NO 12) e antisense (SEQ ID NO 12) no vetor pKANNIBAL (Wesley, S., Helliwell, C., Smith, N., Wang, M., Rouse, D., Liu, Q., Gooding, P., Singh, S., Abbott, D., Stoutjesdijk, P., Robinson, S., Gleave, A., Green, A., and Waterhouse, P. 2001. Construct design for efficient, effective and high-throughput gene silencing in plants. Plant J. 27:581-590.) separados pelo íntron PDK (SEQ ID NO 5), sob domínio promotor 35SCaMV (SEQ ID NO 4) e com terminador OCS (SEQ ID NO 6), permitindo a expressão do RNA de fita como fonte da geração de RNAs interferentes. O cassete de transformação (Promotor 35SKaMV - fragmento da ricina sense - íntron - fragmento da ricina antisense - teminador OCS) foi retirado do vetor pKANNIBAL no sítio NotI e inserido no vetor pAG1 (Aragão, F. J. L., Sarokin, L., Vianna, G. R., and Rech, E. L. 2000. Selection of transgenic meristematic cells utilizing a herbicidal molecule results in the recovery of fertile transgenic soybean (Glycine max (L.) Merrill) plants at high frequency. Theor. Appl. Genet. 101:1-6.) que contém o gene gus (β-Glucuronidase - uidA) como gene repórter e o gene ahas como gene de seleção, formando o vetor/construção gênica pRICRNAi. (Figura 1, SEQ ID NO 14). A expressão do gene repórter gus (SEQ ID NO 8) é regulada, nesta construção, pelo promotor constitutivo do gene de Actina 2 de Arabidopsis thaliana (SEQ ID NO 7) e pelo terminador nos-3' (SEQ ID NO 9). Já o gene de seleção ahas (SEQ ID NO 2) é regulado pelo promotor do gene Ahas de Arabidopsis thaliana e pelo terminador do gene Ahas-3' de Arabidopsis thaliana (SEQ ID NO 3).

[83] Exemplo 2

[84] Transformação de plantas de mamona

[85] A metodologia para obtenção das linhagens de mamoneira geneticamente modificadas foi desenvolvida a partir do bombardeamento de partículas em regiões meristemáticas dos embriões zigóticos de mamoneira.

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[86] Sementes saudáveis da cultivar EBDA-MPA-34 foram selecionadas e desinfestadas com uma lavagem em álcool 70% por 1 minuto, seguida de uma lavagem em hipoclorito de sódio 2% acrescido de Tween 20 (20gL para cada 100 mL de solução) por 20 minutos. O método descrito aqui não está restrito á variedade EBDA-MPA-34 (outras variedades podem ser utilizadas com resultados similares). As sementes foram lavadas 4 vezes com água destilada autoclavada e deixadas de molho por 24 horas. Após o período, o tegumento das sementes foi quebrado com ajuda de um alicate e os embriões zigóticos foram retirados com auxilio de pinça e deixados em água para não desidratar. Os embriões foram lavados três vezes com água destilada autoclavada, desinfestados em Hipoclorito de sódio 0,5% por 10 minutos e lavados cinco vezes com água destilada autoclavada, então o excesso de água foi retirado e os embriões foram colocados em meio de indução inicial (MII) contendo MS (Murashige and Skoog basal medium - Sigma M5519) acrescido de caseína 300 mg.L-1, tiamina 100 mg.L-1, sacarose 3%, ácido indol-butirico (AIB) 0,05 mg.L-1, thidiazuron (TDZ) 0,5 mg.L-1, ágar 1,4% e pH 4,0, no qual permaneceram por 48 horas em estufa a 28°C no escuro.

[87] Após esse período o meristema dos embriões foi exposto retirando-se os cotilédones e os primórdios foliares com auxílio de um bisturi, e foram colocados novamente no meio MII, por 24 horas antes da transformação.

[88] Os embriões zigóticos de mamona com meristema exposto foram posicionados em meio de bombardeamento (MB), contendo MS (Murashige and Skoog basal medium - Sigma M5519) 0,5X acrescido de sacarose 3%, phytagel 0,8% e pH 5,8, de forma que o meristema se encontrasse posicionado para cima, e a transformação genética por biobalística foi realizada de acordo com Aragão et al. 2000 (Aragão, F. J. L., Sarokin, L., Vianna, G. R., and Rech, E. L. 2000. Selection of transgenic meristematic cells utilizing a herbicidal molecule results in the recovery of fertile transgenic soybean (Glycine max (L.) Merrill) plants at high frequency. Theor. Appl. Genet. 101:1-6).

[89] A partir de análises histológicas e anatômicas dos explantes induzidos e cultivados em meios de cultura, antes e após a transformação genética, visando a visualização das camadas de células do meristema apical do embrião zigótico que estavam sendo transformadas, células competentes para transformação genética e para regeneração foram induzidas nos meios de cultura específicos para gerar gemas de novo, e dessa forma, obter brotos transgênicos. O segundo gargalo do processo foi o enraizamento in vitro dos brotos transgênicos, que foi

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21/26 induzido, possibilitando a obtenção de uma planta inteira GM com transferência dos transgenes para sua descendência.

[90] Dessa forma, em seguida a transformação, os embriões foram transferidos novamente para o meio MII onde permaneceram por 24 horas e então foram transferidos para o meio de indução e seleção MIS contendo MS (Murashige and Skoog basal medium - Sigma M5519) acrescido de inositol 100 mg.L^-1, caseína 300 mg.L^-1, tiamina 100 mg.L^-1, sacarose 3%, AIB 0,05 mg.L^-1, TDZ 0,5 mg.L^-1, imazapyr 150 nM, ágar 1,4% e pH 4,0 onde permaneceram por sete dias. Após esse período os explantes foram transferidos para meio de manutenção de multibrotação e seleção (MMM) contendo MS (Murashige and Skoog basal medium - Sigma M5519) acrescido de inositol 100 mg.L^-1, caseína 300 mg.L^-1, tiamina 100 mg.L^-1, sacarose 3%, AIB 0,1 mg.L^-1, zeatina 1 mg.L^-1, imazapyr 150 nM, ágar 1,4% e pH 4,0 por 15 dias. Após o período, os brotos foram separados e transferidos para meio de alongamento de brotos (MAB) contendo MS (Murashige and Skoog basal medium - Sigma M5519) acrescido de inositol 100 mg.L^-1, caseína 300 mg.L^-1, tiamina 100 mg.L^-1, sacarose 3%, AIB 1 mg.L^-1, ácido giberélico (GA3) 1 mg.L^-1, nitrato de prata 5 pM, imazapyr 200 nM, ágar 1,4% e pH 4,0, e mantidos, com repicagens a cada 15 dias, até o aparecimento de explantes bem estruturados e alongados com cerca de 2-3 cm que foram transferidos para meio de enraizamento ME contendo MS (Murashige and Skoog basal medium - Sigma M5519) acrescido de inositol 100 mg.L^-1, caseína 300 mg.L^-1, tiamina 100 mg.L^-1, sacarose 3%, AIB 2 mg.L^-1, ácido giberélico (GA3) 0,5 mg.L^-1, nitrato de prata 5 pM, ágar 1,4% e pH 4,0. Plântulas com cerca de 3-4 cm e com raízes foram aclimatizados em casa de vegetação em copos de 700 mL contendo solo e vermiculita (1:1) com um saco plástico para manter a umidade. Após serem aclimatizadas, as plantas foram transferidas para vaso de 8 L contendo solo.

[91] Exemplo 3

[92] Regeneração das plantas de mamona

[93] Em seguida a transformação, os embriões foram transferidos novamente para o meio MII onde permaneceram por 24 horas e então foram transferidos para o meio de indução e seleção MIS contendo MS (Murashige and Skoog basal medium - Sigma M5519) acrescido de inositol 100 mg.L-1, caseína 300 mg.L-1, tiamina 100 mg.L-1, sacarose 3%, AIB 0,05 mg.L-1, TDZ 0,5 mg.L-1, imazapyr 150 nM, ágar 1,4% e pH 4,0 onde permaneceram por sete dias. Após esse período os explantes foram transferidos para meio de manutenção de multibrotação e seleção

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22/26 (MMM) contendo MS (Murashige and Skoog basal medium - Sigma M5519) acrescido de inositol 100 mg.L-1, caserna 300 mg.L-1, tiamina 100 mg.L-1, sacarose 3%, AIB 0,1 mg.L-1, zeatina 1 mg.L-1, imazapyr 150 nM, ágar 1,4% e pH 4,0 por 15 dias. Após o período, os brotos foram separados e transferidos para meio de alongamento de brotos (MAB) contendo MS (Murashige and Skoog basal medium - Sigma M5519) acrescido de inositol 100 mg.L-1, caserna 300 mg.L-1, tiamina 100 mg.L-1, sacarose 3%, AIB 1 mg.L-1, ácido giberélico (GA3) 1 mg.L-1, nitrato de prata 5 gM, imazapyr 200 nM, ágar 1,4% e pH 4,0, e mantidos, com repicagens a cada 15 dias, até o aparecimento de explantes bem estruturados e alongados com cerca de 2-3 cm que foram transferidos para meio de enraizamento ME contendo MS (Murashige and Skoog basal medium - Sigma M5519) acrescido de inositol 100 mg.L-1, caseína 300 mg.L-1, tiamina 100 mg.L-1, sacarose 3%, AIB 2 mg.L-1, ácido giberélico (GA₃) 0,5 mg.L-1, nitrato de prata 5 gM, ágar 1,4% e pH 4,0. Plântulas com cerca de 3-4 cm e com raízes foram aclimatizados em casa de vegetação em copos de 700 mL contendo latossolo vermelho e vermiculita (1:1) com um saco plástico para manter a umidade. Após serem aclimatizadas, as plantas foram transferidas para vasos contendo latossolo vermelho.

[94] Exemplo 4

[95] Identificação de plantas de mamoma geneticamente modificadas por análise histoquímica do sus

[96] Pode-se utilizar tecidos do evento TB14S-5D em um ensaio histoquimico para identificar o evento TB14S-5D a partir da expressão da proteína GUS no substrato x-gluc de acordo com (Jefferson, R.A., Kavanagh, T.A. & Bevan, M.W. GUS fusions: β-glucuronidase as a sensitive and versatile gene fusion marker in higher plants. EMBO J. 6, 3901-3907, 1987).

[97] A Figura 2 mostra que a planta transgênica possui a construção contendo gene GUS enquanto que a planta controle não mostrou expressão do marcador GUS.

[98] Exemplo 5

[99] Identificação de plantas de mamoma geneticamente modificadas por Southern blot

[100] É possivel detectar o evento TB14S-5D ao fixar o DNA total do evento TB14S-5D em uma membrana e hibridizar com uma sonda homologa a região Aricin correspondente a região amplificada com os primers PSIUINTF (SEQ ID NO 19) e PSIUINTR (SEQ ID NO 20). Metodologia de acordo com [Lacorte, C., Vianna, G., Aragão, F. J. L. & Rech, E. L. Molecular

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Characterization of Genetically Manipulated Plants in Plant Cell Culture: Essential Methods (ed. Davey, M. R. & Anthony, P.) 261-279 (John Wiley & Sons, 2010)].

[101] A Figura 3 mostra os resultados de Southern blot com a identificação dos eventos transgênicos.

[102] Exemplo 6

[103] Identificação de plantas de mamoma geneticamente modificadas por análise de Northern blot

[104] As análises de RNAi dos endospermas das sementes T1, possibilitaram a identificação dos mRNAs de Ricina/RCA nas plantas não GM, e a identificação dos siRNAs nos endospermas das sementes T1 geneticamente modificadas.

[105] Pode ser detectado o silenciamento da ricina no evento TB14S-5D a partir do isolamento de RNA e hibridização com uma sonda homologa a região da ricina correspondente a um fragmento de 148 pb amplificado utilizando o par de primers Ric149RNAiF (SEQ ID NO 23) / RcRinf: (SEQ ID NO 24). A metodologia foi realizada de acordo com (Aragão, F. J. L., Nogueira, E. O. P. L., Tinoco, M. L. P. & Faria, J. C. Molecular characterization of the first commercial transgenic common bean immune to the Bean golden mosaic virus. J. Biotechnol. 166, 42-50; 10.1016/j.jbiotec.2013.04.009, 2013).

[106] A Figura 4 mostra as plantas transgênicas do evento identificadas via Northern blot.

[107] Exemplo 7

[108] Identificação de plantas de mamoma geneticamente modificadas por ELISA

[109] É possível detectar o silenciamento da ricina no evento TB14S-5D a partir da extração de proteinas totais e quantificação da ricina em sementes maduras do evento TB14S-5D por ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) de acordo com (Baldoni, A.B., Araújo, A.C.G., Carvalho, M.H., Gomes, A.C.M.M. & Aragão, F.J.L. Immunolocalization of ricin accumulation during castor bean (Ricinus communis L.) seed development. Int. J. Plant Biol. 1:e12, 61-65, 2010).

[110] Análise por ELISA foi utilizada para detectar e quantificar a ricina em sementes segregantes da linhagem transgênica TB14S-5D. Os resultados mostraram que as sementes do tipo selvagem (Não GM) apresentaram 20 ng de ricina/pg de proteína total, enquanto que as sementes segregantes que não contém os transgenes, apresentaram quantidades estatisticamente semelhantes de ricina em comparação com o controle (plantas não transgênicas). Em contraste, a

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24/26 ricina não foi detectável por ELISA nas sementes transgênicas. Considerando que o anticorpo produzido contra a cadeia A da ricina reage de forma cruzada com a RCA120 devido à elevada identidade entre elas, nossos resultados indicaram que tanto a ricina quanto a RCA120 foram silenciadas.

[111] A Figura 5 mostra a detecção do silenciamento da ricina no evento TB14S-5D. A ricina foi detectada no endosperma das sementes não transgênicas e nas sementes segregantes negativas. Porem, a ricina não pôde ser detectada em sementes positivas do evento TB14S-5D.

[112] Exemplo 8

[113] Ensaio de hemaglutinação

[114] O silenciamento da RCA120 no evento TB14S-5D pode ser detectado a partir de um ensaio de hemaglutinação de hemácias a partir da extração de proteínas totais do evento TB14S5D e adição em uma solução de sangue diluído de forma seriada, podendo ser observada não hemaglutinação das hemácias.

[115] A Ricina é uma lectina que tem sido descrita como fraca hemaglutinina, enquanto a RCA120 apresenta uma forte atividade de hemaglutinação. Assim sendo, realizamos teste de hemaglutinação com proteínas totais isoladas do endosperma de sementes de mamona transgênicas e não transgênicas. Observamos forte hemaglutinação quando proteínas isoladas de sementes não transgênicas foram usadas na concentração de 2,5 pg/pL de proteína total, tendo sido evidente até a concentração de 19 ng/pL de proteína total. Em contraste, nenhuma atividade de hemaglutinação foi visível com proteínas isoladas a partir de sementes transgênicas, mesmo na maior concentração de proteína (aproximadamente 131 vezes mais concentrada). Além disso, a atividade de aglutinação não foi observada em células sanguíneas de boi incubadas com PBS (branco), enquanto que a RCA120 purificada apresentou forte atividade de hemaglutinação até na concentração de 0,39 ng/pL. Além da não presença de transcritos, as proteínas ricina e RCA120 não foram detectadas nos endospermas das sementes T1 da linhagem TB14S-5D, confirmando o eficiente silenciamento da Ricina e da RCA120.

[116] A Figura 6 mostra o resultado de um ensaio de hemaglutinação feito com proteínas de sementes do evento TB14S-5D e controle mostrando que proteínas de sementes do evento TB14S-5D não aglutinaram hemácias, conforme ocorreu com controle negativo (PBS) formando um ponto no fundo da placa, enquanto proteínas de sementes não transgênicas aglutinaram hemácias como ocorreu no controle positivo (RCA120) formando um fundo difuso.

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[117] Exemplo 9

[118] Identificação de plantas de mamoma geneticamente modificadas por PCR

[119] É possivel detectar o evento TB14S-5D por PCR com a utilização dos primers PSIUINTF (SEQ ID NO 19) e PSIUINTR (SEQ ID NO 20). Metodologia de acordo com [Lacorte, C., Vianna, G., Aragão, F. J. L. & Rech, E. L. Molecular Characterization of Genetically Manipulated Plants in Plant Cell Culture: Essential Methods (ed. Davey, M. R. & Anthony, P.) 261-279 (John Wiley & Sons, 2010)].

[120] A Figura 7 mostra que as plantas transgênicas do evento foram detectadas com os primers utilizados.

[121] Exemplo 10

[122] Teste de viabilidade celular

[123] Células epiteliais de intestino de rato (IEC-6) foram incubadas durante 24 h com proteínas totais isoladas de endosperma de semente transgênica e não transgênica. A viabilidade das células expostas a proteínas isoladas de planta não GM contendo 1 ou 10 ng de ricina/mL foi reduzida a 53% e 16%, respectivamente. No entanto, células expostas à quantidade equivalente de proteínas de semente transgênica mantiveram sua viabilidade a 97% (a 0,5 gg proteína total/mL), e a 78% na maior concentração de proteína (50 gg de proteína total/mL). Não houve diferença estatística entre os valores de viabilidade de 97% e 78%, e esses resultados foram corroborados pelo fato de que a síntese proteica foi inibida de 40% a 90% em células cultivadas durante 5 h com proteínas de sementes não transgênicas contendo 0,1 e 1 ng de ricina/mL, respectivamente. No entanto, nenhuma inibição foi observada em células cultivadas na presença da quantidade equivalente de proteínas isoladas a partir de sementes transgênicas, mesmo na maior concentração de proteína total. Assim sendo, demonstramos que as sementes de plantas GM não foram tóxicas para o cultivo de células epiteliais de intestino de rato.

[124] Exemplo 11

[125] Teste de sobrevivência

[126] Ratos (Swiss Webster) foram tratados via administração intraperitoneal com endosperma de sementes de mamona para medir a toxicose por ricina no teste de desafio letal. Realizamos o desafio de ricina injetando ratos com proteínas totais isoladas do evento TB14S-5D e de sementes não transgênicas. Como esperado, todos os animais que foram submetidos à injeção

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26/26 intraperitoneal de 20 pg de proteínas de sementes do tipo selvagem/g de peso corporal (552 pg de ricina/kg de peso corporal) morreram no primeiro período de 24 h. No entanto, animais injetados com as quantidades equivalentes de proteínas totais isoladas de sementes do evento TB14S-5D sobreviveram, sem sintomas visíveis de intoxicação por ricina (diarréia, fraqueza, baixo apetite, fezes escuras e perda de peso). Na verdade, observou-se uma diminuição notável na glicemia de animais injetados com proteínas de sementes não transgênicas. No entanto, não houve significante alteração na glicemia de animais injetados com proteínas de sementes transgênicas por um período de 60 h. Os animais foram monitorados por um período adicional de sete dias e nenhuma morte foi registrada para aqueles injetados com proteínas do evento TB14S5D. No teste de toxicidade in vivo com proteínas totais isoladas de sementes do evento TB14S5D, mesmo numa quantidade de 15 a 230 vezes os valores da DL50, não apresentaram efeitos tóxicos nos ratos. Com base em nossos resultados, foi possível prever que os ratos poderiam consumir até 52% de seu peso corporal de torta de mamona derivada da planta GM, sem intoxicação aguda. Geralmente, vacas, ovelhas e cabras consomem apenas 1 a 2% de seu peso corporal por dia como fonte de proteínas.

Claims (29)

1. REIVINDICAÇÕES

   1. Polinucleotídeo sintético caracterizado por compreender:

   A) uma primeira região com sequência de ácidos nucléicos com similaridade de pelo menos 90% com a sequência descrita em SEQ ID No 12;

   B) uma segunda região com o complemento da sequência de (A).
2. 2. Polinucleotídeo de acordo com a reivindicação 1 caracterizado por a sequência de ácidos nucléicos de (A) apresentar pelo menos 95% de similaridade com a sequência descrita em SEQ ID No 12.
3. 3. Polinucleotídeo de acordo com a reivindicação 2 caracterizado por a sequência de ácidos nucléicos de (A) apresentar pelo menos 99% de similaridade com a sequência descrita em SEQ ID No 12.
4. 4. Polinucleotídeo de acordo com a reivindicação 3 caracterizado por a sequência de ácidos nucléicos de (A) apresentar a sequência descrita em SEQ ID No 12.
5. 5. Polinucleotídeo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3 caracterizado por a primeira e a segunda região serem capazes de produzir uma molécula de RNA dupla-fita.
6. 6. Polinucleotídeo de acordo com a reivindicação 5 caracterizado por apresentar uma região espaçadora entre a primeira região e a segunda região.
7. 7. Polinucleotídeo de acordo com a reivindicação 6 caracterizado por a sequência espaçadora ser um íntron.
8. 8. Polinucleotídeo de acordo com a reivindicação 7 caracterizado por o íntron ser selecionado do grupo consistindo de íntron pdk, íntron pdk2, íntron catalase da mamona, íntron Delta 12 desaturase de algodão, Delta 12 desaturase de Arabidopsis, íntron ubiquitina de milho, íntron de SV40 e íntrons do gene da ricina.
9. 9. Polinucleotídeo de acordo com a reivindicação 8 caracterizado por a região espaçadora ser o intron pdk.
10. 10. Polinucleotídeo sintético caracterizado por compreender:

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    a) uma primeira região com sequência de ácidos nucléicos conforme sequência descrita em SEQ ID No 12;

    b) uma segunda região com sequência de ácidos nucléicos conforme sequência descrita em SEQ ID No 13;

    c) uma região espaçadora entre a primeira região e a segunda região com sequência de ácidos nucleicos conforme a sequencia descrita em SEQ IDNo 5.
11. 11. Construção gênica caracterizada por compreender:

    i) um polinucleotídeo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10;

    ii) região de promotor gênico ativo operacionalmente ligado ao polinucleotídeo definido em (i).
12. 12. Construção gênica de acordo com a reivindicação 11 caracterizada por o promotor gênico de (ii) apresentar sequência de ácidos nucleícos conforme sequência descrita em SEQ ID No 4.
13. 13. Vetor para transformação de plantas caracterizado por compreender construção gênica de acordo com a reivindicação 11 ou 12.
14. 14. Vetor para transformação de plantas caracterizado por compreender:

    (i) promotor gênico conforme sequência descrita em SEQ ID No 4;

    (ii) uma primeira região codificante com sequência de ácidos nucléicos conforme sequência descrita em SEQ ID No 12;

    (iii) uma segunda região codificante com sequência de ácidos nucléicos conforme sequência descrita em SEQ ID No 13;

    (iv) uma região espaçadora entre a primeira região e a segunda região com sequência de ácidos nucleicos conforme a sequencia descrita em SEQ ID No 5;

    (v) sinal de terminação conforme sequência descrita em SEQ ID No 6;

    (vi) gene marcador compreendendo o promotor descrito na SEQ ID NO 7, uma região codificadora descrita na SEQ ID NO 8 e um sinal de terminação descrito na SEQ ID NO 9;

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    3/4 (vii) gene de seleção compreendendo o promotor descrito na SEQ ID NO 1, uma região codificadora descrita na SEQ ID NO 2 e um sinal de terminação descrito na SEQ ID NO 3.
15. 15. Molécula de ribonucleotídeo de filamento duplo caracterizada por ser produzida a partir da expressão de uma molécula de ácido nucleico de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 14.
16. 16. Uso da molécula da reivindicação 15 caracterizado por resultar na supressão da expressão do gene da ricina/RCA.
17. 17. Método para obtenção de plantas de mamona sem ricina/RCA caracterizado por compreender as seguintes etapas:

    I) inserir em células vegetais de mamona molécula de ácido nucléico de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 14;

    II) crescer ou regenerar as células em meios específicos;

    III) selecionar as plantas com o gene da ricina silenciado.
18. 18. Célula eucariótica caracterizada por compreender uma molécula nucleotídica de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 14.
19. 19. Célula eucariótica de acordo com a reivindicação 18 caracterizada por ser uma célula de Ricinus communis.
20. 20. Planta transformada caracterizada por compreender uma molécula nucleotídica definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 14.
21. 21. Planta de acordo com a reivindicação 20 caracterizada por ser uma planta de Ricinus communis.
22. 22. Planta de acordo com a reivindicação 21 caracterizada por ser o evento TB14S5D.
23. 23. Semente transgênica ou parte propagativa caracterizada por ser de planta de acordo com a reivindicação 20.
24. 24. Método de identificação de planta transformada geneticamente caracterizado por compreender as etapas de:

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    A. formar uma mistura compreendendo uma amostra biológica contendo DNA de mamona e um par de primers capaz de amplificar uma molécula de ácido nucleico específica de um evento TB14S-5D de mamona;

    B. reagir a mistura sob condições que permitam que o par de primers de ácido nucleico amplifiquem uma molécula específica de ácido nucleico do evento TB14S-5D de mamona;

    C. detectar a presença da molécula de ácido nucleico amplificada, de forma que a presença da molécula de ácido nucleico específica do evento TB14S-5D de mamona indica que a planta de mamona é um evento TB14S-5D de planta de mamona.
25. 25. Método de acordo com a reivindicação 24 caracterizada por o par de primers ser selecionado dentre os seguintes pares SEQ ID NO 19 com SEQ ID NO 20, SEQ ID NO 21 com SEQ ID NO 22 ou SEQ ID NO 23 com SEQ ID NO 24.
26. 26. Kit de identificação de uma molécula de ácido nucleico de mamona em uma amostra biológica capaz de amplificar molécula de ácido nucleico do evento TB14S-5D caracterizado por compreender um par de primers de ácido nucleico selecionado dentre os seguintes pares SEQ ID NO 19 com SEQ ID NO 20, SEQ ID NO 21 com SEQ ID NO 22 ou SEQ ID NO 23 com SEQ ID NO 24.
27. 27. Método de obtenção de uma planta de mamona sem ricina/RCA caracterizado por compreender as seguintes etapas:

    I. cruzar a planta de mamona contendo uma molécula de ácido nucleico do evento TB14S-5D com uma segunda planta de mamona;

    II. obter sementes do cruzamento da etapa I;

    III. obter amostra de DNA da semente; e

    IV. detectar a presença da molécula de ácido nucleico do evento TB14S-5D de planta de mamona.
28. 28. Óleo de mamona caracterizado por ser obtido de semente transgênica definida na reivindicação 23.
29. 29. Torta de mamona sem ricina caracterizada por ser obtida da semente transgênica definida na reivindicação 23.