KR101272473B1

KR101272473B1 - 형질전환 억새 식물체의 제조 방법 및 그에 따른 식물체

Info

Publication number: KR101272473B1
Application number: KR1020110110371A
Authority: KR
Inventors: 유창연; 성은수; 유지혜; 이재근; 김명조; 허권
Original assignee: 강원대학교산학협력단
Priority date: 2011-10-27
Filing date: 2011-10-27
Publication date: 2013-06-17
Also published as: KR20130046048A

Abstract

본 발명은 (a) 억새 종자를 캘러스 유도 배지에 치상하여 억새 캘러스를 유도하는 단계; (b) 상기 유도된 억새 캘러스와 외래 유전자가 삽입된 식물 발현 벡터를 포함하는 아그로박테리움 튜머파시엔스 (Agrobacterium tumefaciens)를 공동배양 배지에서 공동배양하여 형질전환시키는 단계; (c) 상기 공동배양한 식물세포를 항생제가 첨가된 선발 배지에서 선발하는 단계; (d) 상기 선발된 억새 세포를 재분화 개체를 발근시키기 위한 신장 (elongation) 배지에서 신장시키는 단계; 및 (e) 상기 신장된 세포를 발근 유도배지에서 발근을 유도하는 단계를 포함하는 형질전환 억새 식물체의 제조 방법, 상기 방법에 의해 제조된 형질전환 억새 식물체 및 이의 종자에 관한 것이다.

Description

형질전환 억새 식물체의 제조 방법 및 그에 따른 식물체 {Method for producing transgenic Miscanthus plant and the plant thereof}

본 발명은 형질전환 억새 식물체의 제조 방법 및 그에 따른 식물체에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 (a) 억새 종자를 캘러스 유도 배지에 치상하여 억새 캘러스를 유도하는 단계; (b) 상기 유도된 억새 캘러스와 외래 유전자가 삽입된 식물 발현 벡터를 포함하는 아그로박테리움 튜머파시엔스 (Agrobacterium tumefaciens)를 공동배양 배지에서 공동배양하여 형질전환시키는 단계; (c) 상기 공동배양한 식물세포를 항생제가 첨가된 선발 배지에서 선발하는 단계; (d) 상기 선발된 억새 세포를 재분화 개체를 발근시키기 위한 신장 (elongation) 배지에서 신장시키는 단계; 및 (e) 상기 신장된 세포를 발근 유도배지에서 발근을 유도하는 단계를 포함하는 형질전환 억새 식물체의 제조 방법, 상기 방법에 의해 제조된 형질전환 억새 식물체 및 이의 종자를 제공한다.

억새 (Miscanthus sinensis)는 우리나라 전 지역에 걸쳐 널리 분포하고 있는 다년생 초본으로서 30 ~ 35℃에서 최대의 광합성 효율을 나타내고 생장속도는 7 ~ 8월 사이에 가장 빠르다. 그리고 억새는 생활력이 강하여 폭풍우, 산불, 벌목, 경작 등 자연적, 인위적 교란에 의해 기존의 식생이 파괴된 자리에 다시 잘 발달하여 이차 천이식생을 이루는 대표적인 식물 중 하나이다. 더욱이 예로부터 소나 말의 중요한 조사료로서 널리 이용되어 왔을 뿐만 아니라, 억센 뿌리와 건조한 환경조건에서 잘 자라는 특성 때문에 산지토양의 유실을 방지하는 피복식물로서도 많이 이용되어 왔다.

최근 세계적인 바이오 에너지 개발 열풍으로 인해 바이오 에탄올 원료 작물에 대한 연구가 활발히 이루어지고 있으며, 그 중에서 국내에 자생하고 있는 우리나라 억새는 생산량이 많고, 전국 각지의 다양한 환경에 잘 자라는 특성으로 인해 아주 우수한 잠재성을 가진 바이오 에탄올 원료작물 중에 하나이다. 억새는 광합성, 수분, 영양분 이용 면에서 아주 효율적이기 때문에 1년에 1ha 당 수량이 40톤 정도로 아주 높은 편이다. 또한, 옥수수와 사탕수수와 달리 비식용 작물이기 때문에 바이오 에너지 원료 작물로 개발될 경우 식량이나 사료를 원료로 개발한다는 윤리적인 문제를 피할 수 있는 측면에서도 그 잠재성은 더욱 크다.

억새와 같은 셀룰로스계 원료 작물로부터 바이오 에탄올을 제조함에 있어서 가장 중요한 것은 단위 면적당 수량이 많은 원료 작물을 확보하는 것과 효율적인 당화 및 발효 공정의 개발이라 할 수 있다. 따라서, 무엇보다 수량성이 높은 작물을 개발하는 것과 당화 및 발효 효율이 높은 원료 작물을 개발하는 것은 매우 중요하다.

원료 작물의 구성성분 중 바이오에탄올로 이용 가능한 것은 셀룰로스와 헤미셀룰로스이다. 따라서 당화가 불가능하고 셀룰로스나 헤미셀룰로스의 당화 반응도 저해하는 저해물질인 리그닌의 함량을 획기적으로 줄인 신품종을 개발하는 연구가 이루어져야 할 것이다.

리그닌의 함유량을 감소시킨 신품종 억새의 개발을 위해서 전통적인 육종법과 분자육종법을 사용할 수 있다. 전통적인 육종법에 의한 신품종 육종에는 많은 시간과 노력 및 공간이 필요하고 도입 가능한 유전형질의 제한 등 여러 가지 단점이 있다. 따라서, 형질전환과 같은 분자육종법에 의한 신품종 개발이 빠른 시간 내에 경쟁력을 확보할 수 있다.

한편, 한국등록특허 제1035036호에서는 억새 성숙종자로부터의 식물체 재분화 방법이 개시되어 있고, 한국등록특허 제1066011호에서는 억새 성숙종자로부터의 배발생 캘러스 유도 및 식물체 재분화방법이 개시되어 있다.

본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명자들은 특정 농도의 식물생장 호르몬 및 기타 성분을 포함하는 배지들을 이용하여 억새 성숙종자로부터 캘러스를 유도하고, 특정 아그로박테리움을 매개로 특정 공동배양 배지에서 최적의 기간 동안 배양함으로써 형질전환한 후 재분화시킨 고효율의 형질전환 억새를 제조하는 기술을 확립함으로써, 본 발명을 완성하였다.

상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은

(a) 억새 종자를 캘러스 유도 배지에 치상하여 억새 캘러스를 유도하는 단계;

(b) 상기 유도된 억새 캘러스와 외래 유전자가 삽입된 식물 발현 벡터를 포함하는 아그로박테리움 튜머파시엔스 (Agrobacterium tumefaciens)를 공동배양 배지에서 공동배양하여 형질전환시키는 단계;

(c) 상기 공동배양한 식물세포를 항생제가 첨가된 선발 배지에서 선발하는 단계;

(d) 상기 선발된 억새 세포를 재분화 개체를 발근시키기 위한 신장 (elongation) 배지에서 신장시키는 단계; 및

(e) 상기 신장된 세포를 발근 유도배지에서 발근을 유도하는 단계를 포함하는 형질전환 억새 식물체의 제조 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 방법에 의해 제조된 형질전환 억새 식물체 및 이의 종자를 제공한다.

본 발명을 통하여, 억새 종자로부터 캘러스를 이용하여 형질전환 효율이 높은 억새를 제조하는 기술을 확립함으로써 유용유전자 도입을 통한 가축 사료용, 바이오에너지용 억새 개발에 매우 유용한 방법이 될 수 있다.

도 1은 MsCOMT - AS 유전자가 포함된 벡터를 이용한 억새의 형질전환을 나타낸다. A, 미숙화기를 이용한 캘러스 생산; B, 카나마이신이 첨가된 선발용 재분화 배지에서 유기된 캘러스로부터 신초 재분화 및 임의의 형질전환체 선발; C, 재분화된 식물체로부터 항생제가 포함된 배지에서 발근 유도.
도 2는 MsCOMT - AS 유전자가 포함된 벡터를 이용한 억새 형질전환체의 PCR 및 서던 분석을 나타낸다. A, 식물 선발 마커인 카나마이신 저항성 유전자 NPT II의 특이적인 정방향 및 역방향 프라이머를 이용한 PCR 검출; B, 벡터 내의 35S 프로모터 부위에 특이적인 정방향 프라이머와 유전자 내의 검출 - 역방향 프라이머 (antisense construct)를 이용한 PCR 검출 (M, 1 kb DNA ladder marker, P, 플라스미드 DNA의 양성 대조군, N, 억새의 음성 대조군, 1-13, 추정 형질전환 라인의 검출); C, 서던 분석 (유전자의 특이적인 염기서열 부위의 프로브를 이용한 검정).

본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은

본 발명의 일 구현예에 따른 형질전환 억새 식물체의 제조 방법에서, 상기 억새 종자를 캘러스 유도 배지에 치상하여 억새 캘러스를 유도하는 기간은 바람직하게는 4 ~ 5주간, 가장 바람직하게는 4주간일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 일 구현예에 따른 형질전환 억새 식물체의 제조 방법에서, 상기 (b)의 공동배양은 AS (acetosyringone)가 첨가된 공동배양 배지에서 수행할 수 있으며, 상기 공동배지에 AS의 첨가 농도는 바람직하게는 150 ~ 250μM, 더욱 바람직하게는 180 ~ 220μM, 가장 바람직하게는 200μM 일 수 있다.

상기 공동배양 배지는 바람직하게는 180 ~ 220μM AS (acetosyringone); MS 비타민; 20 ~ 40 g/L 수크로스; 400 ~ 600 mg/L 카제인 수화물; 200 ~ 400 mg/L 글루타민; 2 ~ 3 g/L 프롤린; 2 ~ 4 mg/L 2,4-D (2,4-dichlorophenoxyacetic acid); 0.01 ~ 0.2 mg/L BAP (6-benzylaminopurine); 및 1 ~ 3 g/L 젤라이트가 첨가된 MS 배지일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 200μM AS (acetosyringone); MS 비타민; 30 g/L 수크로스; 500 mg/L 카제인 수화물; 300 mg/L 글루타민; 2.88 g/L 프롤린; 3 mg/L 2,4-D; 0.1 mg/L BAP (6-benzylaminopurine); 및 2 g/L 젤라이트가 첨가된 MS 배지일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

또한, 상기 공동배양은 바람직하게는 3 ~ 5일, 더욱 바람직하게는 3.5 ~ 4.5일, 가장 바람직하게는 4일간 수행할 수 있다.

본 발명의 일 구현예에 따른 형질전환 억새 식물체의 제조 방법에서, 상기 (b)의 아그로박테리움 균주는 아그로박테리움 튜머파시엔스 LBA4404일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 아그로박테리움 튜머파시엔스 LBA4404 균주를 사용함으로서 형질전환 억새 식물체의 재분화율을 높일 수 있었다.

본 발명의 일 구현예에 따른 형질전환 억새 식물체의 제조 방법에서, 상기 (b)의 외래 유전자가 삽입된 식물 발현 벡터는 외래 유전자를 도입한 식물체 내에서 일시적으로 발현시킬 수 있는 일시적 (transient) 발현 벡터 및 외래 유전자를 도입된 식물체에서 영구적으로 발현시킬 수 있는 식물 발현 벡터로 사용할 수 있다.

본 발명에 이용될 수 있는 바이너리 벡터는 A. tumefaciens의 Ti 플라스미드와 함께 존재 시 식물체를 형질전환시킬 수 있는 T-DNA의 RB (right border)과 LB (left border)을 함유하는 어떤 바이너리 벡터도 될 수 있으나, 바람직하게는 당업계에서 자주 사용되는 pBI101(Cat#: 6018-1, Clontech, 미국), pBIN19(Genbank 수탁번호 U09365), pBI121, pCAMBIA 벡터 등을 사용하는 것이 좋다.

발현 벡터는 바람직하게는 하나 이상의 선택성 마커를 포함한다. 상기 마커는 통상적으로 화학적인 방법으로 선택될 수 있는 특성을 갖는 핵산 서열로, 형질전환된 세포를 비형질전환 세포로부터 구별할 수 있는 모든 유전자가 이에 해당된다. 그 예로는 글리포세이트(glyphosate) 또는 포스피노트리신과 같은 제초제 저항성 유전자, 카나마이신, G418, 블레오마이신(Bleomycin), 하이그로마이신(hygromycin), 클로람페니콜(chloramphenicol)과 같은 항생제 내성 유전자가 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 일 구현 예에 따른 식물 발현 벡터에서, 프로모터는 CaMV 35S, 액틴, 유비퀴틴, pEMU, MAS 또는 히스톤 프로모터일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. "프로모터"란 용어는 구조 유전자로부터의 DNA 업스트림의 영역을 의미하며 전사를 개시하기 위하여 RNA 폴리머라아제가 결합하는 DNA 분자를 말한다. "식물 프로모터"는 식물 세포에서 전사를 개시할 수 있는 프로모터이다. "구성적(constitutive) 프로모터"는 대부분의 환경 조건 및 발달 상태 또는 세포 분화하에서 활성이 있는 프로모터이다. 형질전환체의 선택이 각종 단계에서 각종 조직에 의해서 이루어질 수 있기 때문에 구성적 프로모터가 본 발명에서 바람직할 수 있다. 따라서, 구성적 프로모터는 선택 가능성을 제한하지 않는다.

본 발명의 일 구현 예에 따른 식물 발현 벡터에서, 터미네이터는 통상의 터미네이터를 사용할 수 있으며, 그 예로는 노팔린 신타아제(NOS), 벼 α-아밀라아제 RAmy1 A 터미네이터, 파세올린(phaseoline) 터미네이터, 아그로박테리움 튜머파시엔스(Agrobacterium tumefaciens)의 옥토파인(Octopine) 유전자의 터미네이터 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 일 구현예에 따른 형질전환 억새 식물체의 제조 방법에서, 상기 (a)의 캘러스 유도 배지는 바람직하게는 MS 비타민; 20 ~ 40 g/L 수크로스; 400 ~ 600 mg/L 카제인 수화물; 200 ~ 400 mg/L 글루타민; 2 ~ 3 g/L 프롤린; 2 ~ 4 mg/L 2,4-D (2,4-dichlorophenoxyacetic acid); 0.01 ~ 0.2 mg/L BAP (6-benzylaminopurine); 및 1 ~ 3 g/L 젤라이트가 첨가된 MS 배지일 수 있고, 더욱 바람직하게는 MS 비타민; 30 g/L 수크로스; 500 mg/L 카제인 수화물; 300 mg/L 글루타민; 2.88 g/L 프롤린; 3 mg/L 2,4-D (2,4-dichlorophenoxyacetic acid); 0.1 mg/L BAP (6-benzylaminopurine); 및 2 g/L 젤라이트가 첨가된 MS 배지일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 일 구현예에 따른 형질전환 억새 식물체의 제조 방법에서, 상기 (c)의 선발배지는 바람직하게는 MS 비타민; 10 ~ 30 g/L 수크로스; 4 ~ 6 mg/L BAP; 200 ~ 300 ㎍/L NAA (1-naphthaleneacetic acid) 또는 0.5 ~ 2 mg/L 2,4-D; 20 ~ 30 mg/L 카나마이신; 및 200 ~ 300 mg/L 세포탁심을 포함하는 MS 배지일 수 있고, 더욱 바람직하게는 MS 비타민; 20 g/L 수크로스; 5mg/L BAP; 240 ㎍/L NAA (1-naphthaleneacetic acid) 또는 1 mg/L 2,4-D; 25 mg/L 카나마이신; 및 250 mg/L 세포탁심을 포함하는 MS 배지일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 일 구현예에 따른 형질전환 억새 식물체의 제조 방법에서, 상기 (d)의 신장배지는 바람직하게는 MS 비타민; 10 ~ 30 g/L 수크로스; 20 ~ 30 mg/L 카나마이신; 200 ~ 300 mg/L 세포탁심; 및 2 ~ 4 g/L 젤라이트가 포함된 MS 배지일 수 있고, 더욱 바람직하게는 MS 비타민; 20 g/L 수크로스; 25 mg/L 카나마이신; 250 mg/L 세포탁심; 및 3 g/L 젤라이트가 포함된 MS 배지일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 일 구현예에 따른 형질전환 억새 식물체의 제조 방법에서, 상기 (e)의 발근 유도배지는 바람직하게는 MS 비타민; 10 ~ 30 g/L 수크로스; 0.5 ~ 2 ㎎/L NAA; 25 mg/L 카나마이신; 40 ~ 60 mg/L 세포탁심; 및 2 ~ 4 g/L 젤라이트가 포함된 MS 배지일 수 있고, 더욱 바람직하게는 MS 비타민; 20 g/L 수크로스; 1 ㎎/L NAA; 25 mg/L 카나마이신; 50 mg/L 세포탁심; 및 3 g/L 젤라이트가 포함된 MS 배지일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

따라서, 본 발명의 일 구현예에 따른 형질전환 억새 식물체의 제조 방법은 바람직하게는

(b) 상기 유도된 억새 캘러스와 외래 유전자가 삽입된 식물 발현 벡터를 포함하는 아그로박테리움 튜머파시엔스 LBA4404를 180 ~ 220μM AS가 첨가된 공동배양 배지에서 3.5 ~ 4.5일간 공동배양하여 형질전환시키는 단계;

(e) 상기 신장된 세포를 발근 유도배지에서 발근을 유도하는 단계를 포함할 수 있으며,

더욱 바람직하게는

(a) 억새 종자를 MS 비타민; 20 ~ 40 g/L 수크로스; 400 ~ 600 mg/L 카제인 수화물; 200 ~ 400 mg/L 글루타민; 2 ~ 3 g/L 프롤린; 2 ~ 4 mg/L 2,4-D (2,4-dichlorophenoxyacetic acid); 0.01 ~ 0.2 mg/L BAP (6-benzylaminopurine); 및 1 ~ 3 g/L 젤라이트가 첨가된 MS 배지에 치상하여 4 ~ 5주간 억새 캘러스를 유도하는 단계;

(c) 상기 공동배양한 식물세포를 MS 비타민; 10 ~ 30 g/L 수크로스; 4 ~ 6 mg/L BAP; 200 ~ 300 ㎍/L NAA (1-naphthaleneacetic acid) 또는 0.5 ~ 2 mg/L 2,4-D; 20 ~ 30 mg/L 카나마이신; 및 200 ~ 300 mg/L 세포탁심을 포함하는 MS 배지에서 선발하는 단계;

(d) 상기 선발된 억새 세포를 재분화 개체를 발근시키기 위해 MS 비타민; 10 ~ 30 g/L 수크로스; 20 ~ 30 mg/L 카나마이신; 200 ~ 300 mg/L 세포탁심; 및 2 ~ 4 g/L 젤라이트가 포함된 MS 배지에서 신장시키는 단계; 및

(e) 상기 신장된 세포를 MS 비타민; 10 ~ 30 g/L 수크로스; 0.5 ~ 2 ㎎/L NAA; 25 mg/L 카나마이신; 40 ~ 60 mg/L 세포탁심; 및 2 ~ 4 g/L 젤라이트가 포함된 MS 배지에서 발근을 유도하는 단계를 포함할 수 있으며,

가장 바람직하게는

(a) 억새 종자를 MS 비타민; 30 g/L 수크로스; 500 mg/L 카제인 수화물; 300 mg/L 글루타민; 2.88 g/L 프롤린; 3 mg/L 2,4-D (2,4-dichlorophenoxyacetic acid); 0.1 mg/L BAP (6-benzylaminopurine); 및 2 g/L 젤라이트가 첨가된 MS 배지에 치상하여 4주간 억새 캘러스를 유도하는 단계;

(b) 상기 유도된 억새 캘러스와 외래 유전자가 삽입된 식물 발현 벡터를 포함하는 아그로박테리움 튜머파시엔스 LBA4404를 200μM AS가 첨가된 공동배양 배지에서 4일간 공동배양하여 형질전환시키는 단계;

(c) 상기 공동배양한 식물세포를 MS 비타민; 20 g/L 수크로스; 5mg/L BAP; 240 ㎍/L NAA (1-naphthaleneacetic acid) 또는 1 mg/L 2,4-D; 25 mg/L 카나마이신; 및 250 mg/L 세포탁심을 포함하는 MS 배지에서 선발하는 단계;

(d) 상기 선발된 억새 세포를 재분화 개체를 발근시키기 위해 MS 비타민; 20 g/L 수크로스; 25 mg/L 카나마이신; 250 mg/L 세포탁심; 및 3 g/L 젤라이트가 포함된 MS 배지에서 신장시키는 단계; 및

(e) 상기 신장된 세포를 MS 비타민; 20 g/L 수크로스; 1 ㎎/L NAA; 25 mg/L 카나마이신; 50 mg/L 세포탁심; 및 3 g/L 젤라이트가 포함된 MS 배지에서 발근을 유도하는 단계를 포함할 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실험방법

식물 재료

국내에서 자생하는 물억새와 참억새를 이용하여 형질전환 실험을 수행하였다. 자생하는 억새의 종자 및 미숙화기를 실험재료로 이용하였다. 억새의 종자를 3% NaOCl (Sodium Hypochlorite Solution)로 10분간 세척한 후 멸균된 증류수로 3번 헹군 뒤 실험에 사용하였다. 자생하는 억새의 미숙화기는 개화가 되지 않은 부분을 잘라 껍질을 벗기지 않은 상태로 3% NaOCl로 30분간 세척한 후 메스를 이용하여 절단한 뒤 순수 미숙화기를 0.1% NaOCl에 10분간 재세척하였다. 그 후 증류수로 3 ~ 4번 헹군 다음 실험에 사용하였다. 종자로부터 캘러스 유기를 위한 배양조건으로는 25℃ 식물 배양기에서 암배양 하였다. 미숙화기는 2주마다 같은 배지에 계대배양을 하였고 4주 동안 생긴 캘러스를 미숙화기로부터 분리하여 순수 캘러스를 2주마다 계대배양하여 유지, 증식하였다. 본 캘러스는 아그로박테리움 접종을 위한 재료로 사용하였다.

형질전환을 위한 배지 종류별 제조

형질전환하기 전 억새 종자로부터 캘러스 유기를 위한 배지 조성은 MS 비타민, 30 g/L 수크로스, 500 mg/L 카제인 수화물, 300 mg/L 글루타민, 2.88 g/L 프롤린, 3 mg/L 2,4-D (2,4-dichlorophenoxyacetic acid), 0.1 mg/L BAP (6-benzylaminopurine), 및 2 g/L 젤라이트가 첨가된 MS 배지 (pH 5.5)로 구성하여 한달간 암조건으로 캘러스를 유기하였다. MS 비타민이 포함된 MS 배지는 Duchefa (카탈로그 #M0222.0050)로부터 구입하였다. 아그로박테리움과 억새 캘러스와의 공동배양배지는 MS 비타민, 30 g/L 수크로스, 500 mg/L 카제인 수화물, 300 mg/L 글루타민, 2.88 g/L 프롤린, 3 mg/L 2,4-D (2,4-dichlorophenoxyacetic acid), 0.1 mg/L BAP (6-benzylaminopurine), 및 2 g/L 젤라이트가 첨가된 MS 배지 (pH 5.2)에 200μM 아세토시린곤으로 구성되었고 2 ~ 4일간 25℃ 암상태로 배양하였다. 공동배양 후 선발배지는 MS 비타민, 20 g/L 수크로스, 5mg/L BAP, 240 ㎍/L NAA (1-naphthaleneacetic acid) 또는 1 mg/L 2,4-D, 25 mg/L 카나마이신, 및 250 mg/L 세포탁심을 포함하는 MS 배지 (pH 5.5 배지)를 이용하였다. 2주마다 새로운 같은 배지로 계대배양하였다. 신초 (shoot) 유기된지 2 ~ 3주 후에 신장 (elongation) 배지로 옮겨준다. 선발배지에서 자란 재분화 개체를 발근시키기 위한 신장 배지로서 MS 비타민, 20 g/L 수크로스, 25 mg/L 카나마이신, 250 mg/L 세포탁심, 및 3 g/L 젤라이트가 포함된 MS 배지 (pH 5.5) 조건으로 제조하였다. 신장 배지에서 자란 재분화 개체의 발근유도를 위해 MS 비타민, 20 g/L 수크로스, 1 ㎎/L NAA, 25 mg/L 카나마이신, 50 mg/L 세포탁심, 및 3 g/L 젤라이트가 포함된 MS 배지 (pH 5.7 배지)를 이용하였다.

형질전환에 사용된 벡터

억새로부터 분리한 COMT (caffeic acid O-methyltransferase) 유전자를 식물발현용 바이너리 벡터 pMBP1의 XbaI과 SacI 제한효소 사이트 내 역방향 (antisense)으로 클로닝하였다.

발근된 형질전환체 추정라인의 순화

멸균된 상토를 가지고 포트에 형질전환 추정 라인의 억새 식물을 26℃ 식물 생장상에서 순화하였다.

형질전환체의 유전자 삽입 여부 확인

형질전환체의 유전자 삽입을 분석하기 위해 형질전환 추정 개체들로부터 DNA를 분리하여 특정 유전자 프라이머를 이용하여 PCR을 통한 유전자 삽입 여부를 확인하였다. 또한 특정 유전자 부위를 방사선 동위원소로 표지하여 서던 블럿 기법을 이용한 유전자 삽입을 분석하였다.

실시예 1. 억새 형질전환을 위한 공동배양 조건

억새 형질전환 체계를 확립하기 위하여 공동배양 기간 조건별 캘러스 형성율 및 재분화율을 조사한 결과 1 ~ 2일간 공동배양한 경우 캘러스 형성에는 문제가 없었으나, 재분화 개체는 얻지 못하였다. 공동배양기간이 3 ~ 4일간 지날수록 캘러스 형성율 및 재분화율이 49.3% 와 4.7%로 증가한 것으로 나타났다 (표 1).

억새의 아그로박테리움 매개 형질전환시 선별배지에서 공동배양 기간에 따른 영향

Coculture	Callus (%)	Regeneration (%)
1 days	17.3 ±3.1	0.0 ±0.0
2 days	44.0 ±4.0	0.0 ±0.0
3 days	46.7 ±7.0	0.7 ±1.2
4 days	49.3 ±1.2	4.7 ±1.2

(50 개씩 3회 반복하였음)

실시예 2. 억새 형질전환시 공동배양 배지의 아세토시린곤 첨가 농도 조건

아그로박테리움의 독성 유도 (virulence induction)를 위한 아세토시린곤 농도별 조건을 조사한 결과, 200 μM 아세토시린곤 농도에서 캘러스 형성율이 44%와 재분화율 2.7%로 가장 양호하게 나타났다 (표 2).

억새의 아그로박테리움 매개 형질전환시 공동배양 배지에서 아세토시린곤의 농도에 따른 영향

Acetosyringone (μM)	Callus (%)	Regeneration (%)
50	33.3 ±3.1	0.0 ±0.0
100	42.7 ±3.1	0.0 ±0.0
150	34.0 ±3.5	0.7 ±1.2
200	44.0 ±5.3	2.7 ±1.2

(50 개씩 3회 반복하였음)

실시예 3. 아그로박테리움 접종 식물체 부위별 억새 형질전환 효과

억새 형질전환시 식물 절편체 부위별 조건을 탐색한 결과, 미숙화기 (immature influorescence)를 이용한 것보다 종자로부터 유도된 캘러스를 아그로박테리움 배양액에 접종하여 형질전환한 것이 재분화율이 3.3%로 높게 나타났으며, 미숙화기를 이용한 경우 재분화 개체를 얻지 못하였다 (표 3).

억새의 아그로박테리움 매개 형질전환시 접종 식물체 부위에 따른 영향

Explant type	Callus (%)	Regeneration (%)
미숙화기	38.0 ±4.0	0.0 ±0.0
종자로부터 유도된 캘러스	19.0 ±3.0	3.3 ±2.3

(50 개씩 3회 반복하였음)

실시예 4. 아그로박테리움 균주의 종류에 따른 억새 형질전환 효과

아그로박테리움 균주의 종류별 실험에서는 캘러스 형성율에서는 별 차이가 없었으나, EHA105 균주로 형질전환한 경우 재분화 개체를 얻지 못하였고 LBA4404 균주를 이용한 경우 1.3%의 재분화 개체를 획득하였다 (표 4).

억새의 형질전환시 아그로박테리움 균주의 종류에 따른 영향

Strain	Callus (%)	Regeneration (%)
EHA105	32.7 ±2.3	0.0 ±0.0
LBA4404	39.3 ±2.3	1.3 ±1.2

(50 개씩 3회 반복하였음)

실시예 5. 억새 형질전환체의 분자생물학적 검정

COMT 유전자 특이적인 염기서열 부위로 프라이머 디자인하여 PCR한 결과 억새에 원래 가지고 있는 COMT 유전자의 상동 부위가 같이 검출되어 여러 밴드가 확인되었다. 그래서 선발마커 유전자 NPT II 부위의 프라이머를 이용하여 PCR한 결과 12개체에서 형질전환체임이 확인되었다. 좀더 자세한 연구결과를 얻기 위하여 실험에 이용한 벡터내 35S 프로모터 부위의 정방향 및 COMT 유전자 내의 역방향 프라이머를 이용하여 6개의 형질전환 추정 라인에서 특정 밴드가 검출되었다. 유전자의 특이적 부위 (0.3 kb)를 이용한 서던 방법을 통해 유전자 게놈 내로 삽입된 형질전환 개체가 있음을 확인하였다 (도 1 및 도 2). 따라서 위의 방법을 이용한다면 형질전환이 어려운 바이오 에너지 작물의 억새의 형질전환 효율을 증대시킬 수 있을 것으로 판단된다.

Claims

(a) 억새 종자를 캘러스 유도 배지에 치상하여 억새 캘러스를 유도하는 단계;
(b) 상기 유도된 억새 캘러스와 외래 유전자가 삽입된 식물 발현 벡터를 포함하는 아그로박테리움 튜머파시엔스 (Agrobacterium tumefaciens)를 180 ~ 220μM AS (acetosyringone)가 첨가된 공동배양 배지에서 3.5 ~ 4.5일간 공동배양하여 형질전환시키는 단계;
(c) 상기 공동배양한 식물세포를 항생제가 첨가된 선발 배지에서 선발하는 단계;
(d) 상기 선발된 억새 세포를 재분화 개체를 발근시키기 위한 신장 (elongation) 배지에서 신장시키는 단계; 및
(e) 상기 신장된 세포를 발근 유도배지에서 발근을 유도하는 단계를 포함하는 형질전환 억새 식물체의 제조 방법.
삭제
제1항에 있어서, 상기 (b)의 공동배양 배지는 180 ~ 220μM AS (acetosyringone); MS 비타민; 20 ~ 40 g/L 수크로스; 400 ~ 600 mg/L 카제인 수화물; 200 ~ 400 mg/L 글루타민; 2 ~ 3 g/L 프롤린; 2 ~ 4 mg/L 2,4-D (2,4-dichlorophenoxyacetic acid); 0.01 ~ 0.2 mg/L BAP (6-benzylaminopurine); 및 1 ~ 3 g/L 젤라이트가 첨가된 MS 배지인 것을 특징으로 하는 형질전환 억새 식물체의 제조 방법.
제1항에 있어서, 상기 (b)의 아그로박테리움 균주는 아그로박테리움 튜머파시엔스 LBA4404인 것을 특징으로 하는 형질전환 억새 식물체의 제조 방법.
제1항에 있어서, 상기 (a)의 캘러스 유도 배지는 MS 비타민; 20 ~ 40 g/L 수크로스; 400 ~ 600 mg/L 카제인 수화물; 200 ~ 400 mg/L 글루타민; 2 ~ 3 g/L 프롤린; 2 ~ 4 mg/L 2,4-D (2,4-dichlorophenoxyacetic acid); 0.01 ~ 0.2 mg/L BAP (6-benzylaminopurine); 및 1 ~ 3 g/L 젤라이트가 첨가된 MS 배지인 것을 특징으로 하는 형질전환 억새 식물체의 제조 방법.
제1항에 있어서, 상기 (c)의 선발배지는 MS 비타민; 10 ~ 30 g/L 수크로스; 4 ~ 6 mg/L BAP; 200 ~ 300 ㎍/L NAA (1-naphthaleneacetic acid) 또는 0.5 ~ 2 mg/L 2,4-D; 20 ~ 30 mg/L 카나마이신; 및 200 ~ 300 mg/L 세포탁심을 포함하는 MS 배지인 것을 특징으로 하는 형질전환 억새 식물체의 제조 방법.
제1항에 있어서, 상기 (d)의 신장배지는 MS 비타민; 10 ~ 30 g/L 수크로스; 20 ~ 30 mg/L 카나마이신; 200 ~ 300 mg/L 세포탁심; 및 2 ~ 4 g/L 젤라이트가 포함된 MS 배지인 것을 특징으로 하는 형질전환 억새 식물체의 제조 방법.
제1항에 있어서, 상기 (e)의 발근 유도배지는 MS 비타민; 10 ~ 30 g/L 수크로스; 0.5 ~ 2 ㎎/L NAA; 25 mg/L 카나마이신; 40 ~ 60 mg/L 세포탁심; 및 2 ~ 4 g/L 젤라이트가 포함된 MS 배지인 것을 특징으로 하는 형질전환 억새 식물체의 제조 방법.
(a) 억새 종자를 캘러스 유도 배지에 치상하여 억새 캘러스를 유도하는 단계;
(b) 상기 유도된 억새 캘러스와 외래 유전자가 삽입된 식물 발현 벡터를 포함하는 아그로박테리움 튜머파시엔스 LBA4404를 180 ~ 220μM AS가 첨가된 공동배양 배지에서 3.5 ~ 4.5일간 공동배양하여 형질전환시키는 단계;
(c) 상기 공동배양한 식물세포를 항생제가 첨가된 선발 배지에서 선발하는 단계;
(d) 상기 선발된 억새 세포를 재분화 개체를 발근시키기 위한 신장 (elongation) 배지에서 신장시키는 단계; 및
(e) 상기 신장된 세포를 발근 유도배지에서 발근을 유도하는 단계를 포함하는 형질전환 억새 식물체의 제조 방법.
제9항에 있어서,
(a) 억새 종자를 MS 비타민; 20 ~ 40 g/L 수크로스; 400 ~ 600 mg/L 카제인 수화물; 200 ~ 400 mg/L 글루타민; 2 ~ 3 g/L 프롤린; 2 ~ 4 mg/L 2,4-D (2,4-dichlorophenoxyacetic acid); 0.01 ~ 0.2 mg/L BAP (6-benzylaminopurine); 및 1 ~ 3 g/L 젤라이트가 첨가된 MS 배지에 치상하여 4 ~ 5주간 억새 캘러스를 유도하는 단계;
(b) 상기 유도된 억새 캘러스와 외래 유전자가 삽입된 식물 발현 벡터를 포함하는 아그로박테리움 튜머파시엔스 LBA4404를 180 ~ 220μM AS (acetosyringone); MS 비타민; 20 ~ 40 g/L 수크로스; 400 ~ 600 mg/L 카제인 수화물; 200 ~ 400 mg/L 글루타민; 2 ~ 3 g/L 프롤린; 2 ~ 4 mg/L 2,4-D (2,4-dichlorophenoxyacetic acid); 0.01 ~ 0.2 mg/L BAP (6-benzylaminopurine); 및 1 ~ 3 g/L 젤라이트가 첨가된 MS 배지에서 3.5 ~ 4.5일간 공동배양하여 형질전환시키는 단계;
(c) 상기 공동배양한 식물세포를 MS 비타민; 10 ~ 30 g/L 수크로스; 4 ~ 6 mg/L BAP; 200 ~ 300 ㎍/L NAA (1-naphthaleneacetic acid) 또는 0.5 ~ 2 mg/L 2,4-D; 20 ~ 30 mg/L 카나마이신; 및 200 ~ 300 mg/L 세포탁심을 포함하는 MS 배지에서 선발하는 단계;
(d) 상기 선발된 억새 세포를 재분화 개체를 발근시키기 위해 MS 비타민; 10 ~ 30 g/L 수크로스; 20 ~ 30 mg/L 카나마이신; 200 ~ 300 mg/L 세포탁심; 및 2 ~ 4 g/L 젤라이트가 포함된 MS 배지에서 신장시키는 단계; 및
(e) 상기 신장된 세포를 MS 비타민; 10 ~ 30 g/L 수크로스; 0.5 ~ 2 ㎎/L NAA; 25 mg/L 카나마이신; 40 ~ 60 mg/L 세포탁심; 및 2 ~ 4 g/L 젤라이트가 포함된 MS 배지에서 발근을 유도하는 단계를 포함하는 형질전환 억새 식물체의 제조 방법.
제1항, 제3항 내지 제10항 중 어느 한 항의 방법에 의해 제조된 형질전환 억새 식물체.
제11항에 따른 식물체의 종자.