CN101939431B - 通过修饰特定细胞色素p450基因改变烟草生物碱含量 - Google Patents

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Abstract

提供了用于降低烟草属植物和其植物部分中降烟碱和N′-亚硝基降烟碱(NNN)的水平的组合物和方法。组合物包含在此类植物中参与烟碱至降烟碱的代谢转化的细胞色素P450的分离的多核苷酸和多肽。还提供了包含靶向公开的细胞色素P450多肽的表达或功能的抑制性序列的表达盒、载体、植物和其植物部分。还提供了使用此类新型序列抑制参与该代谢转化的细胞色素P450多肽的表达或功能的方法。该方法用于产生烟草制品，所述烟草制品具有降低水平的降烟碱和其致癌代谢产物NNN，从而对于消费此类烟草制品或暴露于源自此类制品的二手烟的个体具有降低的致癌潜能。

Description

通过修饰特定细胞色素P450基因改变烟草生物碱含量
发明领域
本发明涉及用于降低作为烟草属(Nicotiana)的成员的植物中降烟碱和其代谢物N′-亚硝基降烟碱(NNN)的水平的组合物和方法，特别地用于抑制参与烟碱至降烟碱的代谢转化的细胞色素P450多肽的表达或功能的组合物和方法。
发明背景
商业烟草品种中发现的主要生物碱是烟碱，其通常占据总生物碱库的90％至95％。剩下的生物碱级分主要是3种另外的吡啶类生物碱：降烟碱、新烟碱和新烟草碱。降烟碱通过烟碱N-脱甲基酶直接从烟碱产生。降烟碱通常代表低于5％的总吡啶类生物碱库。然而，最初产生非常少量的降烟碱的烟草植物可产生将大百分比的叶的烟碱代谢“转化”成降烟碱的后代。该过程称为“转换”。在已进行遗传转换的烟草植物(即，“转换子”)中，大部分降烟碱的产生在成熟叶的衰老和加工过程中发生(Wernsman & Matzinger(1968)Tob.Sci.12：226-228)。白肋烟(burley tobaccos)特别易于遗传转换，在一些栽培品种中观察到高达每代20％的比率。
在烟草叶的处理和加工过程中，一部分降烟碱代谢成NNN(被认定为在实验室动物中致癌的烟草特异性亚硝胺(TSNA))(Hecht &Hoffmann(1990)Cancer Surveys 8：273-294；和Hoffmann等人(1994)J.Toxicol.Environ.Health 41：1-52；Hecht(1998)Chem.Res.Toxicol.11：559-603)。在烤烟中，TSNA主要通过生物碱与极少量的氮氧化物(存在于用于常规烘烤室的直燃式加热系统中的燃烧气体中)反应形成(Peele & Gentry(1999)“Formation of tobacco-specificnitrosamines in flue-cured tobacco，”CORESTA Meeting，Agro-Phyto Groups，Suzhou，China)。然而，当用热交换器(其可消除燃烧气体与烘烤气体(curing air)的混合，从而减少以该方式烘烤的烟中的TSNA)改进烘烤室时，可消除燃烧气体(Boyette &Hamm(2001)Rec.Adv.Tob.Sci.27：17-22.)。相反地，在晾干的白肋烟中，TSNA主要通过烟草生物碱与亚硝酸盐的反应(由叶生(leaf-borne)微生物催化的过程)形成(Bush等人(2001)Rec.Adv.Tob.Sci.27：23-46)。迄今，对于晾干的烟草，通过改变处理条件同时保持可接受的质量标准来减少TSNA的努力仍未获得成功。
在白肋烟植物中，叶的降烟碱含量与经处理的叶中积累的NNN的量之间存在正相关(Bush等人(2001)Rec.Sdv.Tob.Sci，27：23-46；和Shi等人(2000)Tob.Chem.Res.Conf.54：Abstract 27)。然而，由于转换的原因，在白肋烟植物中将降烟碱水平保持在最低水平是非常困难的。植物育种者和种子生产者传统上负责使积累高水平降烟碱的白肋烟植物的数量减少至最少。尽管最终生长在田间的转换子的百分比通过在种子库(seed stock)繁殖过程中除去(roguing)转换子而减少。不幸地，该方法花费高，非常费时并且有缺陷。
在植物转换后，高降烟碱性状以单显性基因的形式遗传(Griffith等人(1955)Science 121：343-344；Burke & Jeffrey(1958)Tob.Sci.2：139-141；和Man等人(1964)Crop Sci.4：349-353)。然而该基因的性质目前还不清楚。在最简单的场景中，转换基因座(conversionlocus)可代表在转换子中可能通过动员突变诱导性转座元件重新获得其功能的无功能烟碱N-脱甲基酶基因。备选地，转换子基因座可编码起始最终使得转换子能够将烟碱代谢成降烟碱的级联事件的蛋白质，这表明可能牵涉多个基因。
无论存在一个还是许多个与转换相关的基因，编码具有烟碱脱甲基酶活性的多肽的基因在该过程中起着中枢作用。虽然不能从粗制提取物中纯化活性烟碱N-脱甲基酶阻碍了该酶的分离和鉴定，但存在一些证据证明单加氧酶的细胞色素P450超家族的成员可能牵涉其中(Hao & Yeoman(1996)Phytochem.41：477-482；Hao & Yeoman(1996)Phytochem.42：325-329；Chelvarajan等人(1993)J.Agric，FoodChem.41：858-862；和Hao & Yeoman(1998)J.Plant Physiol.152：420-426)。不幸地，这些研究不是结论性的，因为经典P450抑制剂例如一氧化碳和tetcylasis不能以与其他报导的P450介导的反应相当的速率降低酶活性(Chelvarajan等人(1993)J.Agric.FoodChem.41：858-862)。
此外，细胞色素P450是独特的跨膜蛋白质，其参与代谢许多种化合物(由Schuler(1996)Crit.Rev.Plant Sci.15：235-284；和Schuler & Werck-Reichhart(2003)Annu.Rev.Plant Biol.54：629-667综述)。由细胞色素P450介导的生物化学反应的实例包括羟基化、脱甲基化和环氧化。在植物中，细胞色素P450基因家族非常大。例如，总基因组序列检查在拟南芥中发现272个预测的细胞色素P450基因和在稻中发现至少455个独特的细胞色素P450基因(参见，例如，Nelson等人(2004)Plant Physiol.135(2)：756-772)。即使细胞色素P450牵涉烟碱至降烟碱的转化，该蛋白质家族的至关重要的参与成员的鉴定仍然是个挑战。
除了用作NNN的前体外，最近的研究表明烟草制品中发现的降烟碱具有不期望的健康后果。例如，Dickerson & Janda证明降烟碱在细胞内引起异常的蛋白质糖基化(Dickerson & Janda(2002)Proc.Natl.Acad.Sci USA 99：15084-15088)。同样，降烟碱-修饰蛋白的浓度在吸烟者的血浆中远比非吸烟者高。此外，降烟碱可共价修饰经常开于处方中的类固醇药物例如泼尼松，这可以改变此类药物的功效和毒性。
考虑到与转换相关的困难以及降烟碱积累的不期望的健康效应，因而期望获得用于减少烟草品种特别地白肋烟植物中的降烟碱含量的改进方法。此类方法不仅帮助改善上述的降烟碱本身的潜在负面健康后果，而且还帮助降低NNN水平。
发明概述
提供了用于减少作为烟草属的成员的植物中降烟碱含量的组合物和方法。组合物包括参与植物特别地烟草属物种中烟碱至降烟碱的转化的分离的细胞色素P450多核苷酸和多肽。分离的多核苷酸包括包含SEQ ID NO：1，3或4中所示的核酸序列、编码SEQ ID NO：2，5-12，14-24中所示的多肽的核酸序列的多核苷酸，以及其片段和变体。本发明的分离的多肽包括包含SEQ ID NO：2，5-12或14-24中所示的氨基酸序列、由SEQ ID NO：1，3或4中所示的核酸序列编码的氨基酸序列的多肽，以及其片段和变体。
在第一方面，本发明概述为可在植物中抑制参与烟碱至降烟碱的代谢转化的烟碱脱甲基酶(包括本发明的烟碱脱甲基酶)的表达的多核苷酸。本发明提供了具有能够在植物细胞中发挥功能的有效连接至核酸序列的启动子的分离的多核苷酸，所述核酸序列包含SEQ ID NO：1的大约100个核苷酸至大约350个核苷酸的区域，所述区域从选自在位点253、353、647、733、1050、1397和其组合上的核酸的序列获得。本发明还提供了包含编码绿叶烟碱脱甲基酶的核酸序列的分离的多核苷酸，其中编码的烟碱脱甲基酶的氨基酸序列在选自残基235，449，174，410，224，72，143和422的位点中的氨基酸残基上具有置换，其中编号根据SEQ ID NO：2。还提供的是分离的多核苷酸，其包含能够在植物细胞中发挥功能的启动子，所述启动子与包含SEQ ID NO：4的大约100个核苷酸至大约350个核苷酸的区域的核酸序列有效连接。还提供的是编码SEQ ID NO：2中所示的氨基酸序列(其具有与其他P450多肽不同的残基至保守残基的突变)的分离的多核苷酸。备选地，还提供的是编码SEQ ID NO：2中所示的氨基酸序列(其在选自残基85、118、216、245和466的位点上具有突变，其中85位上的残基不是异亮氨酸，118位上的残基不是天冬酰胺，216位上的残基不是酪氨酸，245位上的残基不是酪氨酸以及466位上的残基不是缬氨酸)的分离的多核苷酸。
在第二方面，本发明概述为包含编码SEQ ID NO：2的氨基酸序列的多核苷酸的表达盒，所述多核苷酸有效连接至在植物细胞中具有功能的启动子。本发明提供了包含多核苷酸的表达盒，所述多核苷酸包含与在植物细胞中具有功能的启动子有效连接的SEQ ID NO：3的核酸序列或其至少25个连续核苷酸的片段。还提供了包含SEQ ID NO：3的核酸序列的至少25个核苷酸的分离的多核苷酸。另外提供的是包含选自SEQ ID NO：2，5-12和14-24的氨基酸序列的分离的多肽。在第二方面的一个实施方案中，分离的多肽包含与SEQ ID NO：2 99％同一的氨基酸序列，从而其能够在烟草的绿叶中将烟碱转化成降烟碱。
在第三方面，本发明概述为包含表达盒的烟草属植物或其植物部分，所述表达盒编码SEQ ID NO：2、其片段或任一个的互补序列。还提供的是与非转基因植物相比较在绿叶中具有更低水平的烟碱至降烟碱的转化率的转基因烟草属植物，所述植物包含含有能够在植物细胞中发挥功能的启动子的外源核酸构建体，所述启动子有效地连接至具有第一核酸序列(所述序列包含编码SEQ ID NO：2的氨基酸序列的绿叶烟草烟碱脱甲基酶序列的大约100个核苷酸至大约350个核苷酸的区域)和能够与第一序列形成双链RNA的第二核酸序列的多核苷酸。还提供的是与非转基因植物相比较在绿叶中具有更低水平的烟碱至降烟碱转化率的转基因烟草属植物，所述植物包含含有能够在植物细胞中发挥功能的启动子的外源核酸构建体，所述启动子有效地连接至具有第一核酸序列(所述序列包含具有SEQ ID NO：3的核酸序列的绿叶烟草烟碱脱甲基酶序列的大约100个核苷酸至大约350个核苷酸的区域)和能够与第一序列形成双链RNA的第二核酸序列的多核苷酸。还提供的是与非转基因植物相比较，在绿叶中具有更低水平的烟碱至降烟碱转化率的转基因烟草属植物，所述植物包含含有能够在植物细胞中发挥功能的启动子的外源核酸构建体，所述启动子有效地连接至具有第一核酸序列(所述序列包含具有SEQ ID NO：4的核酸序列的绿叶烟草烟碱脱甲基酶序列的大约100个核苷酸至大约350个核苷酸的区域)和能够与第一序列形成双链RNA的第二核酸序列的多核苷酸。
在第四方面，本发明概述为与非转基因植物相比较在绿叶中具有更低水平的烟碱至降烟碱的转化率的转基因烟草属植物的种子，所述植物包含能够在植物细胞中发挥功能的异源启动子，所述启动子有效地连接至具有第一核酸序列(所述序列包含具有SEQ ID NO：4的氨基酸序列的绿叶烟草烟碱脱甲基酶序列的大约100个核苷酸至大约350个核苷酸的区域)和能够与第一序列形成双链RNA的第二核酸序列的多核苷酸。还提供的是可再生烟草细胞的组织培养物，其包含含有第一多核苷酸(所述多核苷酸具有SEQ ID NO：1，3或4的核酸序列的片段)和能够与第一多核苷酸形成双链RNA的第二多核苷酸的植物细胞。
在第五方面，本发明概述为烟草制品，所述烟草制品包含与非转基因植物相比较在绿叶中具有更低水平的烟碱至降烟碱的转化率的转基因烟草属植物细胞，所述植物细胞包含能够在植物细胞中发挥功能的异源启动子，所述异源启动子有效地连接至具有第一核酸序列(所述序列包含具有SEQ ID NO：4的核酸序列的绿叶烟草烟碱脱甲基酶序列的大约100个核苷酸与大约350个核苷酸的区域)和能够与第一核酸序列形成双链RNA的第二多核苷酸的多核苷酸。还提供的是具有经改变抑制至少绿叶烟碱脱甲基酶的表达的基因组的烟草细胞，其中所述细胞对于编码绿叶烟碱脱甲基酶的基因中的突变是纯合的。还提供的是包含转基因的烟草细胞，所述转基因包含侧翼连接选择标记基因的绿叶烟碱脱甲基酶核酸序列，其中选择标记基因破坏了烟碱脱甲基酶基因，从而产生其中内源绿叶烟碱脱甲基酶基因已被破坏的烟草细胞。备选地，提供的是包含转基因的烟草细胞，所述转基因包含侧翼连接选择标记基因的绿叶烟碱脱甲基酶核酸序列，其中选择标记基因破坏了烟碱脱甲基酶基因，从而产生其中内源绿叶烟碱脱甲基酶基因已被破坏的烟草细胞。
在第六方面，本发明概述为用于降低来源于烟草属植物的植物部分中降烟碱水平的方法，所述方法包括a)抑制烟碱脱甲基酶的表达，其中烟碱脱甲基酶具有SEQ ID NOs：2和5-12中所示的氨基酸序列；和b)降低来源于烟草属植物的植物部分中降烟碱的水平。还提供的是降低烟草制品中降烟碱的水平的方法，所述方法包括a)种植转基因烟草植物，其中植物具有包含含有异源启动子和烟碱脱甲基酶的表达盒的植物部分，其中烟碱脱甲基酶具有选自SEQ ID NOs：2和5-12的氨基酸序列；和b)从烟草植物部分制备烟草制品。还提供的是用于降低烟草制品中降烟碱的水平的方法，所述方法包括a)种植转基因烟草植物，其中植物具有包含特异性结合具有选自SEQ ID NOs：2和5-12的氨基酸序列的多肽的抗体的植物部分；和b)从烟草植物部分制备烟草制品。备选地，提供的是降低烟草制品中降烟碱的水平的方法，所述方法包括a)种植转基因烟草植物，其中植物具有包含与异源启动子有效连接的绿叶烟碱脱甲基酶的片段的植物部分，并且所述片段具有来自编码选自SEQ ID NOs：2和5-12的多肽的多核苷酸的至少25个连续核苷酸；和b)从烟草植物部分制备烟草制品。还提供的是用于降低来源于烟草属植物的植物部分中降烟碱的水平的方法，所述方法包括a)修饰功能性CYP82E5v2等位基因以将等位基因变成无功能的CYP82E5v2，其中无功能的CYP82E5v2在选自残基235，449，174，410，224，72，143和422的位点的氨基酸残基上具有置换，其中编号根据SEQ ID NO：2；和b)降低来源于烟草属植物的植物部分中降烟碱的水平。本发明还提供了用于减少烟草制品的致癌潜能的方法，所述方法包括通过a)种植转基因烟草植物，其中植物包括包含与异源启动子有效连接的绿叶烟碱脱甲基酶的片段的植物部分，并且所述片段包含来自编码选自SEQ ID NOs：2和5-12的多肽的多核苷酸的至少25个连续核苷酸；和b)从烟草植物部分制备烟草制品来制备烟草制品。此外，本发明提供了减少烟草属植物中烟碱至降烟碱的转化的方法，所述方法包括：a)用包含能够在植物中发挥功能的启动子的核酸构建体转化烟草属植物，所述启动子有效地连接至具有第一核酸序列(所述序列包含SEQ ID NO：1，3或4的100个核苷酸至大约350个核苷酸的区域)和能够与第一序列形成双链RNA的第二核酸序列的多核苷酸；和b)再生转基因烟草属植物。
在第七方面，本发明概述为筛选绿叶烟碱脱甲基酶序列的方法，所述方法包括a)获得与SEQ ID NO：1具有至少200个核苷酸的序列同一性的核酸序列；和b)鉴定在编码的多肽的位点422上编码终止密码子的密码子序列，其中编号根据SEQ ID NO：2。还提供的是筛选绿叶烟碱脱甲基酶序列的方法，所述方法包括a)获得与SEQ ID NO：1具有至少200个核苷酸的序列同一性的核酸序列；和b)鉴定在编码的多肽的位点449上编码不是脯氨酸的密码子的密码子序列，其中编号根据SEQ ID NO：2。还提供的是用于鉴定具有低水平的降烟碱的烟草植物的方法，所述方法包括a)从目的烟草植物获得DNA样品；和b)就SEQ IDNO：1中的突变筛选样品。本发明还提供了用于降低来源于烟草属植物的植物部分中降烟碱的水平的方法，所述方法包括a)抑制CYP82E4v2烟碱脱甲基酶和CYP82E5v2烟碱脱甲基酶的表达；和b)降低来源于烟草属植物的植物部分中降烟碱的水平。还提供的是包含多肽的烟草植物材料，所述多肽具有在选自残基458、364、329和其组合的位点上具有突变的SEQ ID NO：13的氨基酸序列。此外还包括的是包含在选自残基458，364，329和其组合的位点上具有突变的CYP82E4v2的烟草植物材料，其中编号根据SEQ ID NO：13。还包括的是包含在残基376上具有突变的CYP82E4v2的烟草植物材料，其中所述残基不是缬氨酸并且残基的编号根据SEQ ID NO：13。
附图概述
图1A-C显示已在酵母和/或转基因植物中就烟碱脱甲基酶活性进行了测定的CYP82E2基因家族成员的氨基酸序列比对。以斜体字和下划线标示的序列对于烟碱脱甲基酶活性是阳性的(CYP82E4v2和CYP82E5v2)；以黑色开头的序列在测定中未显示活性。在成员之间不同的残基以灰色阴影标示。在图1中，CYP82E4v2示于SEQ ID NO：13；CYP82E4v6示于SEQ ID NO：26；CYP82E4v12示于SEQ ID NO：27；58-166示于SEQ ID NO：28；CYP82E3示于SEQ ID NO：29；CYP82E2v1示于SEQID NO：30；CYP82E2v2示于SEQ ID NO：31；和CYP82E5v2示于SEQ IDNO：2。
核酸序列的描述
SEQ ID NO：1显示CYP82E5v2的编码区的核酸序列。
SEQ ID NO：2显示CYP82E5v2的氨基酸序列。
SEQ ID NO：3显示CYP82E5v2的内含子的核酸序列。
SEQ ID NO：4显示基因组CYP82E5v2的核酸序列。
SEQ ID NO：5显示CYP82E5v2 P235S的氨基酸序列。
SEQ ID NO：6显示CYP82E5v2 P449L的氨基酸序列。
SEQ ID NO：7显示CYP82E5v2 S174L的氨基酸序列。
SEQ ID NO：8显示CYP82E5v2 A410V的氨基酸序列。
SEQ ID NO：9显示CYP82E5v2 M224I的氨基酸序列。
SEQ ID NO：10显示CYP82E5v2 P72L的氨基酸序列。
SEQ ID NO：11显示CYP82E5v2 L143F的氨基酸序列。
SEQ ID NO：12显示CYP82E5v2 W422Stop的氨基酸序列。
SEQ ID NO：13显示CYP82E4v2的氨基酸序列。
SEQ ID NO：14显示CYP82E4v2 P458S的氨基酸序列。
SEQ ID NO：15显示CYP82E4v2 K364N的氨基酸序列。
SEQ ID NO：16显示CYP82E4v2 P38L的氨基酸序列。
SEQ ID NO：17显示CYP82E4v2 E201K的氨基酸序列。
SEQ ID NO：18显示CYP82E4v2 R169Q的氨基酸序列。
SEQ ID NO：19显示CYP82E4v2 G459R的氨基酸序列。
SEQ ID NO：20显示CYP82E4v2 E296K的氨基酸序列。
SEQ ID NO：21显示CYP82E4v2 T427I的氨基酸序列。
SEQ ID NO：22显示CYP82E4v2 W329Stop的氨基酸序列。
SEQ ID NO：23显示CYP82E4v2 V376M的氨基酸序列。
SEQ ID NO：24显示CYP82E4v2 D171N的氨基酸序列。
SEQ ID NO：25显示CYP82E4的氨基酸序列。
SEQ ID NO：26显示CYP82E4v6的氨基酸序列。
SEQ ID NO：27显示CYP82E4v12的氨基酸序列。
SEQ ID NO：28显示58-166的氨基酸序列。
SEQ ID NO：29显示CYP82E3的氨基酸序列。
SEQ ID NO：30显示CYP82E2v1的氨基酸序列。
SEQ ID NO：31显示CYP82E2v2的氨基酸序列。
SEQ ID NO：32显示用于CYP82E4v2的外显子1的正向引物的核酸序列。
SEQ ID NO：33显示用于CYP82E4v2的外显子1的反向引物的核酸序列。
SEQ ID NO：34显示用于CYP82E4v2的外显子2的正向引物的核酸序列。
SEQ ID NO：35显示用于CYP82E4v2的外显子2的反向引物的核酸序列。
SEQ ID NO：36显示用于CYP82E5v2的外显子1的正向引物的核酸序列。
SEQ ID NO：37显示用于CYP82E5v2的外显子1的反向引物的核酸序列。
SEQ ID NO：38显示用于CYP82E5v2的外显子2的正向引物的核酸序列。
SEQ ID NO：39显示用于CYP82E5v2的外显子2的反向引物的核酸序列。
SEQ ID NO：40显示引物E5Gen_F1的核酸序列。
SEQ ID NO：41显示引物E5Gen_R1的核酸序列。
SEQ ID NO：42显示引物E5Gen_F2的核酸序列。
SEQ ID NO：43显示引物E5Gen_R2的核酸序列。
SEQ ID NO：44显示引物E4Rt_F的核酸序列。
SEQ ID NO：45显示引物E4Rt_R的核酸序列。
SEQ ID NO：46显示引物E5Rt_F的核酸序列。
SEQ ID NO：47显示引物E5Rt_R的核酸序列。
SEQ ID NO：48显示引物G3PDH_F的核酸序列。
SEQ ID NO：49显示引物G3PDH_R的核酸序列。
SEQ ID NO：50显示CYP82E4v2的编码区的核酸序列和编码的蛋白质(即，SEQ ID NO：13)。
定义
本发明包括用于抑制烟碱脱甲基酶多肽的表达或功能的组合物和方法，所述多肽参与植物，特别地烟草属植物(包括各种商业品种的烟草植物)中烟碱至降烟碱的代谢转化。
如本文中使用的，“抑制”、“阻抑”和“阻止”被定义为本领域已知的或本文中描述的减少目的基因产物(即，靶基因产物)的表达或功能的任何方法。
“抑制”可用于两种植物(例如，遗传改变的植物对野生型植物)之间的比较的背景中。比较可在植物之间进行，其中一种植物缺乏能够减少试剂的DNA序列。靶基因产物的表达或功能的抑制还可用于相同植物内的植物细胞、细胞器、器官、组织或植物部分之间或不同植物之间的比较的背景中，包括相同植物或植物部分中发育阶段或时相阶段之间或植物或植物部分之间的比较。
“抑制”可包括目的基因产物的功能或产量的任何相对减少，直至和包括该基因产物的功能或产生的完全消除。当比较试剂的水平时，优选在具有相似遗传背景的生物之间进行这样的比较。优选，相似的遗传背景是其中待比较的生物共有50％或更大，更优选75％或更大和更优选90％或更大的核遗传物质的序列同一性的背景。相似的遗传背景是其中待比较的生物是植物并且除了最初使用植物转化技术导入的任何遗传物质或通过人干预产生的突变外植物是同基因的背景。试剂的水平或量的测量可通过任何合适的方法来进行，其非限定性实例包括但不限于mRNA转录物水平、蛋白质或肽的水平、和/或表型，特别是烟碱至降烟碱的转化的比较。如本文中所使用的，mRNA转录物可包括加工的和未加工的mRNA转录物，多肽或肽可包括具有或不具有任何翻译后修饰的多肽或肽。
如本文中所使用的，“宿主细胞”意指包含本发明的异源核酸序列的细胞。尽管可将本发明的核酸序列和其片段及变体导入任何目的细胞，但特别感兴趣的细胞是植物细胞，更特别地烟草属植物物种，例如下面描述的烟草植物物种和变种的细胞。
如本文中所使用的，“变体”意指大体上相似的序列。变体可具有与目的野生型多肽不同的功能或与其大体上相似的功能。对于烟碱脱甲基酶，大体上相似的功能是在相同条件下或在接近同基因的品系中至少99％、98％、97％、95％、90％、85％、80％、75％、60％、50％、25％或15％的野生型酶的将烟碱转化成降烟碱的功能。野生型CYP82E5v2是SEQ ID NO：2。野生型CYP82E4v2是SEQ ID NO：13。如本文中所使用的，“变异多核苷酸”或“变异多肽”意指不为野生型的核酸或氨基酸序列。
变体可具有1个添加、缺失或置换；2个或更少的添加、缺失或置换；3个或更少的添加、缺失或置换；4个或更少的添加、缺失或置换；或5个或更少的添加、缺失或置换。突变包括添加、缺失和置换。此类缺失或添加可在C末端、N末端或C和N末端。融合多肽或带有表位标签的多肽也包括在本发明中。“沉默”核苷酸突变不改变给定的位点上的编码的氨基酸。氨基酸置换可以是保守的。保守置换是氨基酸的变化，其中变化是至与原始氨基酸相同的氨基酸家族内的氨基酸的变化。家族根据个体氨基酸的侧链来定义。氨基酸的家族可具有碱性、酸性、不带电荷的极性或非极性侧链。参见，Alberts等人，(1994)Molecular biology of the cell(第3版，第56-57页，GarlandPublishing Inc.，New York，New York)，其通过引用合并入本文就如同以其全文显示一样。可在相同位点对另一个CYP82E家族成员的氨基酸进行缺失、置换或添加。参见，图1A-C。如本文中所使用的，“片段”意指多核苷酸的部分或多肽的部分，以及由其编码的蛋白质。
如本文中所使用的，“植物部分”意指可从其再生完整植物的植物细胞、植物原生质体、植物细胞组织培养物，在植物中或植物的部分例如胚、花粉、花药、胚珠、种子、叶、花、茎、枝、果实、根、根尖等中完整的植物愈伤组织、植物团块(plant clump)和植物细胞。再生植物的后代、变体和突变体也包括在本发明的范围内，只要它们包含导入的本发明的多核苷酸。如本文中所使用的，“烟草植物材料”意指植物部分的任何部分或植物部分的任何组合。
如本文中所使用的，“有效连接的”意指两个或多个元件之间的功能性连接。例如，目的多核苷酸与调控序列(即，启动子)之间的有效连接是允许目的多核苷酸表达的功能性连接。有效连接的元件可以是连续或非连续的。当用于指两个蛋白质编码区的融合时，有效连接意指编码区符合相同的阅读框架。
如本文中所使用的，“异源”意指源自外源物种的序列，或，如果来自相同物种，基本上在组成和/或基因组基因座上通过有意的人工干预从其天然形式修饰而来的序列。例如，与异源多核苷酸有效连接的启动子来自与所述多核苷酸所源自的物种不同的物种，或者，如果来自相同/类似物种，其一或两者基本上从它们的原始形式和/或基因组基因座修饰而来，或启动子对于有效连接的多核苷酸来说不是天然启动子。此外，如本文中所使用的，“嵌合基因”意指与对于编码序列是异源的转录起始区有效连接的编码序列。
发明详述
烟碱脱甲基酶多核苷酸和多肽以及其变体和片段
本发明的组合物包括细胞色素P450多肽。细胞色素P450多肽可具有烟碱脱甲基酶活性。此类烟碱脱甲基酶多核苷酸和多肽参与植物(包括烟草植物的商业品种)中烟碱至降烟碱的代谢转化。还包括的是此类烟碱脱甲基酶的变体。特别地，本发明的组合物包括包含SEQ IDNOS：2和5-24中显示的氨基酸序列的分离的多肽、包含SEQ ID NOS：1，3和4中显示的核酸序列的分离的多核苷酸和编码包含SEQ ID NOS：2和5-24的氨基酸序列的多肽的分离的多核苷酸。本发明的多核苷酸可用于抑制参与植物特别地烟草植物中烟碱至降烟碱的代谢转化的烟碱脱甲基酶多肽或其变体的表达。一些本发明的多核苷酸具有抑制野生型烟碱脱甲基酶的烟碱脱甲基酶活性的突变。本发明的多肽的抑制在降低烟草品系(其中遗传转换在少于30％、50％、70％和90％的群体中发生)例如烤烟的降烟碱水平中是有效的。本发明的多肽的抑制在降低烟草群体(其中遗传转换在至少90％、80％、70％、60％和50％的植物群体中发生)的降烟碱水平中是有效的。群体优选包含多于大约25、50、100、500、1,000、5,000或25,000株植物，其中更优选至少大约10％、25％、50％、75％、95％或100％的植物包含本发明的多肽。
本发明还提供表达盒，所述表达盒包含具有SEQ ID NO：1，3或4中所示的核酸序列的多核苷酸的全部或部分，和编码具有SEQ ID NOS：2和5-24的氨基酸序列的多肽的分离的多核苷酸，其互补序列或片段，或与SEQ ID NO：1，3或4具有大体上的序列同一性的序列，或编码具有SEQ ID NOS：2和5-24的氨基酸序列的多肽的多核苷酸，或其互补序列或片段，与异源启动子有效连接，所述启动子在用于表达干扰烟碱脱甲基酶多肽的表达(即，转录和/或翻译)的抑制性RNA转录物的植物细胞中是有功能的。在一些实施方案中，表达盒包含SEQ ID NO：1，3或4中所示的核苷酸序列，其互补序列或片段，或与SEQ ID NO：1，3或4具有大体上的序列同一性的序列，或其互补序列或片段。将此类表达盒导入目的烟草属植物(特别是通常称为烤烟品种或浅色烟品种、白肋烟品种、深色烟品种和东方型/土耳其烟品种的烟草植物品种)，导致具有减少的降烟碱和NNN的量的烟草植物的产生。来自此类转基因植物的叶和茎材料可用于产生多种具有降低的降烟碱水平和相伴减少的NNN的烟草制品。
本发明的烟碱脱甲基酶多核苷酸和编码的多肽包括称为CYP82E5v2烟碱脱甲基酶基因的新的细胞色素P450基因，其新近被鉴定为在烟草植物的烟碱至降烟碱的代谢转化中具有作用。转基因烟草植物中编码的多肽的表达的抑制导致此类转基因植物的绿叶中降烟碱的积累显著减少。然而不受理论束缚，此类多肽的代谢作用可以是直接作用，即，直接催化N-脱甲基化反应，或间接作用，即产生导致叶的烟碱脱甲基酶活性的上调的产物。无论什么机制，借以在烟草属植物中靶向本发明的多肽的表达和/或功能以进行抑制或定点诱变的任何方法在降低此类植物的叶和茎中的降烟碱的水平和NNN的水平中是有效的。
本发明包括分离的或大体上纯化的本发明的多核苷酸或多肽组合物。“分离的”或“纯化的”多核苷酸或多肽或其生物学活性部分大体上或基本上不含通常伴随多核苷酸或蛋白质或与其相互作用的组分，如在其天然发生环境中发现的。因此，分离的或纯化的多核苷酸或多肽基本上不含其他细胞材料或培养基(当通过重组技术产生时)或基本上不含化学前体或其他化学药品(当化学合成时)。最佳地，“分离的”多核苷酸不含在所述多核苷酸所源自的生物的基因组DNA中天然侧翼于所述多核苷酸的序列(最佳地蛋白质编码序列)(即，位于所述多核苷酸的5′和3′末端的序列)。例如，在不同的实施方案中，分离的多核苷酸可包含小于大约5kb、4kb、3kb、2kb、1kb、0.5kb或0.1kb的在所述多核苷酸所源自的细胞的基因组DNA中天然侧翼于所述多核苷酸的核苷酸序列。基本上不含细胞材料的多肽包括具有低于大约30％，20％，10％，5％或1％(按干重计算)的污染性蛋白质的制剂。当重组产生本发明的多肽或其生物学活性部分时，最佳地培养基代表低于大约30％，20％，10％，5％或1％(按干重计算)的化学前体或非目的蛋白化学药品。
公开的多核苷酸的片段和由其编码的多肽也包括在本发明中。多核苷酸的片段可编码保持天然多肽的生物学活性，从而参与植物中烟碱至降烟碱的代谢转化的多肽片段。备选地，用作杂交探针或PCR引物(使用下述方法)的多核苷酸的片段一般不编码保持生物学活性的片段多肽。此外，公开的多核苷酸的片段包括可在用于基因沉默(使用本领域内已知的任何方法)的重组构建体内装配的那些，所述方法包括但不限于有义抑制/共抑制、反义抑制、双链RNA(dsRNA)干扰、发夹RNA干扰和包含内含子的发夹RNA干扰、扩增子介导的干扰、核酶和小干扰RNA或微RNA，如本领域中和下文中所描述的。因此，取决于期望的结果，多核苷酸的片段可在至少大约20个核苷酸、大约50个核苷酸、大约70个核苷酸、大约100个核苷酸、大约150个核苷酸、大约200个核苷酸、250个核苷酸、300个核苷酸直至编码本发明的多肽的全长多核苷酸的范围内。例如，多核苷酸的片段的长度可以是100至大约350个核苷酸、100至大约325个核苷酸、100至大约300个核苷酸、大约125至大约300个核苷酸、大约125至大约275个核苷酸、大约200至大约320个连续核苷酸、大约200至大约420个连续核苷酸、大约250至大约450个连续核苷酸。备选地，片段的长度可以是大约300至大约450个连续核苷酸。
编码本发明的细胞色素P450多肽的生物学活性部分的本发明的烟碱脱甲基酶多核苷酸的片段将编码至少15、25、30、50、75、100、125、150、175、200、250、300、350、400、450或500个连续氨基酸，或直至存在于本发明的全长烟碱脱甲基酶多肽中的总氨基酸数目(例如，对于SEQ ID NOS：2和5，517个氨基酸)，或将编码至少15、25、30、50、75、100、125、150个氨基酸或直至存在于本发明的部分长度的细胞色素P450多肽中的总氨基酸数目(例如，对于SEQ IDNO：12，422个氨基酸)。优选，片段包含直至所编码的多肽的氨基酸残基330。可通过下述来制备烟碱脱甲基酶多肽的生物学活性部分：分离本发明的一个细胞色素P450多核苷酸的部分，表达所编码的细胞色素P450多肽的部分(例如，通过体外重组表达)，然后使用本领域内已知的测定法和本文中下面提供的测定法估量所编码的细胞色素P450多肽的部分的活性，即促进烟碱至降烟碱的转化的能力。
作为本发明的细胞色素P450核苷酸序列的片段的多核苷酸包含至少16、20、50、75、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、800、900、950、1000、1050、1100、1150、1200、1250、1300、1350、1400、1450、1500、1550、1600、1650或1700个连续核苷酸，或直至存在于本文中公开的全长细胞色素P450多核苷酸中的核苷酸数目(例如，对于SEQ ID NO：1，1554个核苷酸；或对于SEQ ID NO：4，2608个核苷酸)。作为本发明的细胞色素P450核苷酸序列的片段的多核苷酸包含大约20至大约1700个连续核苷酸，大约50至大约1600个连续核苷酸，大约75至大约1500个连续核苷酸，大约100至大约1400个连续核苷酸，大约150至大约1300个连续核苷酸，大约150至大约1200个连续核苷酸，大约175至大约1100个连续核苷酸，大约200至大约1000个连续核苷酸，大约225至大约900个连续核苷酸，大约500至大约1600个连续核苷酸，大约775至大约1700个连续核苷酸，大约1000至大约1700个连续核苷酸，或大约300至大约800个连续核苷酸的来自本文中公开的细胞色素P450多核苷酸的片段。例如，多核苷酸片段可包含多核苷酸序列，所述多核苷酸序列含有来自在细胞色素P450编码序列的大约位点700至大约位点1250上的，在细胞色素P450基因组序列的大约位点700至大约位点1250上的，在细胞色素P450内含子序列的大约位点10至大约位点900上的，或在细胞色素P450内含子序列的大约位点100至大约位点800上的多核苷酸的核酸序列。
本发明还包括公开的多核苷酸的变体和由其编码的多肽。天然发生的变体包括与本文中公开的细胞色素P450多核苷酸和多肽共有大体上的序列同一性的变体。天然发生的变体可与本文中公开的细胞色素P450多核苷酸共有大体上的功能同一性。本发明的组合物和方法可用于靶向任何天然发生的细胞色素P450的表达或功能，所述细胞色素P450与公开的细胞色素P450多肽共有大体上的序列同一性。此类细胞色素P450可具有或不具有相关的细胞色素P450活性，即，参与植物中烟碱至降烟碱的代谢转化。此类变体可通过例如遗传多态性或人工操作(如通过育种和选择发生)产生。本发明的细胞色素P450蛋白的生物学活性变体例如SEQ ID NO：2和5-24中所示的多肽的变体，将与野生型蛋白的氨基酸序列具有至少大约40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更大的序列同一性，如通过本文中其他地方描述的序列比对程序和参数所测定的，并且可以表征为功能性参与或不参与植物中烟碱至降烟碱的代谢转化。本发明的多肽的生物学活性变体可以与野生型多肽相异于少至1-15个氨基酸残基，少至10个，少至9个，少至8个，少至7个，少至6个，少至5个，少至4个，少至3个，少至2或少至1个氨基酸残基。本发明的蛋白的生物学无活性变体可与该多肽相异于少至1至15个氨基酸残基，少至10个，少至9个，少至8个，少至7个，少至6个，少至5个，少至4个，少至3个，少至2个或少至1个氨基酸残基。
本发明的多核苷酸的变体包括天然发生的多核苷酸，所述多核苷酸编码参与植物中烟碱至降烟碱的代谢转化的烟碱脱甲基酶多肽。此类多核苷酸变体可在本文中公开的天然多核苷酸内的一个或多个位点上包含一个或多个核苷酸的缺失和/或添加和/或在天然多核苷酸中的一个或多个位点上包含一个或多个核苷酸的置换。由于遗传密码子的简并性，多核苷酸的保守变体包括编码本发明的细胞色素P450多肽之一的氨基酸序列的那些序列。天然发生的变体例如此类变体可利用熟知的分子生物学技术例如用本领域内已知的和本文中公开的聚合酶链式反应(PCR)和杂交技术来鉴定。变体多核苷酸还包括合成来源的多核苷酸，例如通过例如使用定点诱变产生的但与本文中公开的天然发生的序列仍然共有大体上的序列同一性，从而可用于本发明的方法以抑制参与烟碱至降烟碱的代谢转化的烟碱脱甲基酶(包括SEQ ID NOS：2、5、7-11、13、16-21和23-24中所示的烟碱脱甲基酶多肽)的表达或功能的多核苷酸。通常，本发明的特定多核苷酸(例如，SEQ ID NO：3的多核苷酸序列或编码SEQ ID NO：2和5-24中所示的氨基酸序列的多核苷酸序列)的变体，将与该特定多核苷酸具有至少大约40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更大的序列同一性，如通过本文中其他地方描述的序列比对程序和参数所测定的。
本发明的特定多核苷酸(也称为参照多核苷酸)的变体还可通过比较由参照多核苷酸编码的多肽与由变体多核苷酸编码的多肽之间的百分比序列同一性来估量。任何两个多肽之间的百分比序列同一性可使用本文中其他地方描述的序列比对程序和参数来计算。当通过比较由它们编码的两个多肽所共有的百分比序列同一性来评估任何给定的本发明的多核苷酸对时，两个编码的多肽之间的百分比序列同一性为至少大约40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更大的序列同一性。本发明的变体多肽可包括在细胞色素P450多肽的位点458上具有丝氨酸、位点364上具有天冬酰胺、在细胞色素P450的位点329上具有终止密码子或其任何组合的多肽，其中编号相应于SEQ ID NO：13。
此外，本发明的多核苷酸可用于从其他生物，特别地其他植物，更特别地烟草属的其他成员分离相应的细胞色素P450序列。PCR、杂交和其他类似的方法可用于鉴定此类序列(基于它们与本文中所示序列的序列同源性)。基于它们与本文中所示的核苷酸序列或与其变体和片段的序列同一性分离的序列包括在本发明中。此类序列包括这样的序列，其是公开的序列的直系同源物。
如本文中所使用的，“直系同源物”意指来源于共同祖先基因的基因，其由于物种形成而在不同物种中发现。在不同物种中发现的基因，当它们的核苷酸序列和/或它们的编码的蛋白质序列共有至少60％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更大的序列同一性时，被认为是直系同源物。直系同源物的功能在物种间通常高度保守。因此，编码烟碱脱甲基酶多肽(其参与烟碱至降烟碱的代谢转化)并且在严格条件下与本文中公开的细胞色素P450序列或与其变体或片段杂交的分离的多核苷酸包括在本发明中。此类序列可用于本发明的方法中以抑制参与植物中烟碱至降烟碱的代谢转化的烟碱脱甲基酶多肽的表达。
通过使用PCR，可设计寡核苷酸引物来用于PCR反应中以从提取自任何目的植物的cDNA或基因组DNA扩增相应DNA序列。用于设计PCR引物和PCR克隆的方法通常在本领域内是已知的，其公开于Sambrook等人(1989)Molecular cloning：a laboratory manual(第2版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Plainview，New York)，Innis等人，eds.(1990)PCR protocols：a guide to methods andapplications(Academic Press，New York)；Innis & Gelfand，eds.(1995)PCR strategies(Academic Press，New York)；和Innis& Gelfand，eds.(1999)PCR methods manual(Academic Press，NewYork)。已知的PCR方法包括但不限于使用成对引物、嵌套此物、单特异性引物、简并引物、基因特异性引物、载体特异性引物、部分错配的引物等的方法。
杂交技术包括将已知的多核苷酸的全部或部分用作探针，所述探针与存在于来自选择的生物的克隆的基因组DNA片段或cDNA片段的群体(即，基因组或cDNA文库)中的其他相应多核苷酸选择性杂交。
可在严格条件下进行杂交。如本文中所使用的，“严格条件”或“严格杂交条件”意指这样的条件，在该条件下探针将与其靶序列杂交至比与其他序列杂交更高的可检测程度(例如，高于背景至少2倍)。严格条件是序列依赖性的并且在不同环境下是不同的。通过控制杂交和/或清洗条件的严格性，可鉴定与探针100％互补的靶序列(同源探测)。备选地，可调整严格性条件以允许序列中存在一些错配，从而可检测较低程度的相似性(异源探测)。通常，探针在长度上短于大约1000个核苷酸，最佳地在长度上短于500个核苷酸。
通常，严格条件可以是这样的条件，其中在pH 7.0至8.3下盐浓度低于大约1.5M Na离子，通常大约0.01至1.0M Na离子浓度(或其他盐)并且温度是至少大约30℃。严格条件还可通过加入去稳定剂例如甲酰胺来获得。示例性低严格条件包括使用30至35％的甲酰胺，1M NaCl，1％ SDS(十二烷基硫酸钠)的缓冲溶液于37℃下的杂交，和在1X至2X SSC(20X SSC＝3.0M NaCl/0.3M柠檬酸三钠)中于50至55℃下的清洗。示例性中等严格条件包括在40至45％的甲酰胺，1.0MNaCl，1％ SDS中于37℃下进行的杂交，和在0.5X至1X SSC中于55至60℃下进行的清洗。示例性高严格条件包括在50％的甲酰胺，1MNaCl，1％ SDS中于37℃下进行的杂交和在0.1X SSC中于60至65℃下进行的清洗。任选地，清洗缓冲液可包含大约0.1％至大约1％ SDS。杂交的持续时间通常低于大约24小时，通常大约4至大约12小时。清洗的持续时间可以为至少足以达到平衡的时间长度。
优选，严格条件包括在含有5X SSC，0.5％ SDS，5X Denhardt′s，0.45ug/ul poly A RNA，0.45ug/ul小牛胸腺DNA和50％甲酰胺的溶液中于42℃下进行的杂交，和在包含大约0.01X SSC至大约1X SSC的溶液中进行的至少一次杂交后清洗。杂交的持续时间是大约14至大约16小时。
特异性通常是杂交后清洗的函数，临界因子(critical factor)是终清洗溶液的离子强度和温度。对于DNA-DNA杂交，Tm根据Meinkoth& Wahl(1984)Anal.Biochem.138：267-284的公式近似得出：Tm＝81.5℃+16.6(log M)+0.41(％GC)-0.61(％ form)-500/L；其中M是单价阳离子的摩尔浓度，％GC是DNA中鸟嘌呤和胞嘧啶核苷酸的百分比，％ form是杂交溶液中甲酰胺的百分比，L是碱基对形式的杂交物的长度。Tm是50％的互补靶序列与完全匹配的探针杂交时所处的温度(在确定的离子强度和pH下)。每错配1％，Tm下降大约1℃；因此，可调整Tm、杂交和/或清洗条件以与具有期望的同一性的序列杂交。例如，如果寻找具有≥90％的同一性的序列，那么可将Tm降低10℃。通常，选择严格条件，使其比在确定的离子强度和pH下特定序列与其互补序列的熔解温度(thermal melting point，Tm)低大约5℃。然而，高度严格条件可使用在低于熔解温度(Tm)1、2、3或4℃的温度下进行的杂交和/或清洗；中度严格条件可使用在低于熔解温度(Tm)6、7、8、9或10℃的温度下进行的杂交和/或清洗；低严格性条件可利用在低于熔解温度(Tm)11、12、13、14、15或20℃的温度下进行的杂交和/或清洗。本领域技术人员将理解杂交和/或清洗溶液的严格性的变化可通过使用公式，杂交和清洗组合物以及期望的Tm进行内在描述。如果期望的错配程度导致低于45℃(水溶液)或32℃(甲酰胺溶液)的Tm，则增加SSC浓度以便可使用更高的温度是最佳的。对核酸杂交的更详尽的指导见于Tijssen(1993)Laboratory techniques inbiochemistry and molecular biology-hybridization with nucleicacid probes，第I部分，第2章(Elsevier，New York)；和Ausubel等人，eds.(1995)Current protocols in molecular biology，第2章(Greene Publishing和Wiley-Interscience，New York)。也参见，Sambrook等人(1989)Molecular cloning：a laboratory manual(第2版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Plainview，New York)。
杂交探针可以是基因组DNA片段、cDNA片段、RNA片段或其他寡核苷酸，并且可用可检测基团例如32P或任何其他可检测的标记物来标记。例如，用于杂交的探针可通过标记基于本发明的细胞色素P450多核苷酸序列合成的寡核苷酸来制备。用于制备用于杂交的探针和用于构建cDNA和基因组文库的方法通常在本领域内是已知的并且公开于Sambrook等人(同上)中。
例如，本文中公开的细胞色素P430多核苷酸或其一个或多个部分可用作能够特异性杂交相应的细胞色素P450多核苷酸和信使RNA的探针。为了在多种条件下获得特异性杂交，此类探针包括在细胞色素P450多核苷酸序列间是独特的或对于一种细胞色素P450多核苷酸序列(包括编码序列的上游5′区和编码序列的下游3′区以及内含子区)是独特的序列，并且优选地长度为至少大约10个连续核苷酸，更优选地长度为至少大约20个连续核苷酸，更优选地长度为至少大约50个连续核苷酸，更优选地长度为至少大约75个连续核苷酸，和更优选地长度为至少大约100个连续核苷酸。此类探针可用于扩增相应的细胞色素P450多核苷酸。该技术可用于从期望的植物分离另外的编码序列或突变，或可用作确定植物中编码序列的存在的诊断测定。杂交技术包括涂板的DNA文库(噬菌斑或集落；参见例如，Sambrook等人，同上)的杂交筛选。
如本文中所使用的，关于两个或更多个多核苷酸或多肽之间的序列关系，术语“参照序列”意指用作序列比较的基础的确定的序列。参照序列可以是指定的序列的子集(subset)或整体；例如全长cDNA或基因序列的区段或完整cDNA或基因序列。
如本文中所使用的，“比较窗口”意指多核苷酸序列的连续和指定的区段，其中比较窗口中的多核苷酸序列，与参照序列(其不包含添加或缺失)相比较，可包含添加或缺失(即，缺口)以进行两个多核苷酸的最佳比对。通常，比较窗口在长度上是至少20个连续核苷酸，任选地可以是30、40、50或100个连续核苷酸或更长。本领域技术人员理解为了避免由于在多核苷酸序列中包含缺口而导致的与参照序列的高相似性，通常引入缺口罚分并且将其从匹配的数目中扣除。
用于比较的序列比对方法在本领域内是是熟知的。因此，任何两个序列之间百分比序列同一性的测定可使用数学算法来完成。此类数学算法的非限定性实例是Myers & Miller(1988)CABIOS 4：11-17的算法；Smith等人(1981)Adv.Appl.Math.2：482的局部比对算法；Needleman & Wunsch(1970)J.Mol.Biol.48：443-453的全局比对算法；Pearson & Lipman(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.85：2444-2448的搜索局部比对法(search-for-local alignmentmethod)；Karlin & Altschul(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA872264的算法，如在Karlin & Altschul(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：5873-5877中进行改进的。
Altschul等人(1990)J.Mol.Biol.215：403的BLAST程序基于Karlin & Altschul(1990)(同上)的算法。可使用BLASTN程序，评分＝100，字长＝12进行BLAST核苷酸搜索以获得与编码本发明的蛋白质的核苷酸序列同源的核苷酸序列。使用BLASTX程序，评分＝50.字长＝3进行BLAST蛋白质搜索以获得与本发明的蛋白质或多肽同源的氨基酸序列。为了获得带缺口的比对(用于比较目的)，可如Altschul等人(1997)Nucleic Acids Res.25：3389中所述使用GappedBLAST(在BLAST 2.0中)。备选地，PSI-BLAST(在BLAST 2.0中)可用于进行检测分子之间的疏远关系的迭代搜索。参见Altschul等人(1997)，同上。当使用BLAST、带缺口的BLAST、PSI-BLAST时，可使用各自程序(例如，用于核苷酸序列的BLASTN，用于蛋白质的BLASTX)的缺省参数(参见www.ncbi.nlna.nih.gov)。还可通过目测来人工地进行比对。
使用BLASTX(Altschul等人(1997)同上)、Clustal W(Higgins等人(1994)Nucleic Acids Res.22：4673-4680)和GAP(university ofWisconsin Genetic Computing Group software package)算法，利用缺省参数计算本文中提供的序列同一性/相似性值。本发明还包括其任何等同的程序用于分析和比较核酸和蛋白质序列的用途。“等同的程序”意指任何这样的序列比较程序，对于任何两个考虑的序列，当与利用BLASTX、Clustal W或GAP产生的相应比对相比较时，其产生具有相同核苷酸或氨基酸残基匹配和相同百分比序列同一性的比对。
为了本发明包括的变异核苷酸和多肽序列的上述目的，两个多核苷酸或多肽序列背景中的“序列同一性”或“同一性”涉及两个序列中的残基，当就指定的比较窗口上的最大相应性进行比对时所述残基是相同的。当百分比序列同一性用于指蛋白质时，应认识到不相同的残基位点通常相异在于保守氨基酸置换，其中氨基酸残基替代为具有相似化学特性(例如，电荷或疏水性)的其他氨基酸残基，从而不改变分子的功能特性。当序列相异在于保守置换时，可向上调整百分比序列同一性以就置换的保守性质进行矫正。相异在于此类保守置换的序列据认为具有“序列相似性”或“相似性”。用于进行(malting)该调整的方法对于本领域技术人员来说是熟知的。一般地这包括将保守置换评分为部分而非完全错配，从而增加百分比序列同一性。因此，例如，在给予相同氨基酸1的评分且给予非保守置换0的评分的情况下，给予保守置换0与1之间的评分。计算保守置换的评分，例如，如程序PC/GENE(Intelligenetics；Mountain View，CA)中所进行的。
如本文中所使用的，“序列同一性百分比”意指通过在比较窗口上比较两个最佳比对的序列所确定的值，其中与参照序列(其不包含添加或缺失)相比较，比较窗口中多核苷酸序列的部分可包括添加或缺失(即，缺口)以进行两个序列的最佳比对。通过下述来计算百分比：测定在两个序列上发生相同核酸碱基或氨基酸残基的位点的数目以产生匹配的位点的数目，将匹配的位点的数目除以比较窗口中总的位点数目，然后将结果乘以100以产生序列同一性百分比。
因此，可使用本文中提供的序列鉴定细胞色素P450多核苷酸和多肽序列。此类方法包括获得与SEQ ID NO：1，3或4的多核苷酸序列或其互补序列或片段，或SEQ ID NO：2或5-24的多肽序列具有至少80％、85％、90％、95％、98％或99％的序列同一性的多核苷酸或多肽序列。优选实施方案包括在细胞色素P450多肽的位点458上具有丝氨酸，位点364上具有天冬酰胺，或在细胞色素P450的位点329上具有终止密码子或其组合的相应于SEQ ID NO：13的多肽，其中编号相应于SEQ IDNO：13。
用于本发明的方法的表达盒
本发明的组合物还包括表达盒，所述表达盒包含能够抑制参与烟草属植物或其植物部分中烟碱至降烟碱的转化的烟碱脱甲基酶多肽的表达或功能的抑制性序列，其中抑制性序列有效地连接至在植物细胞中具有功能的启动子。通过这种方式，构建表达盒以用于本文中下面描述的本发明的基因沉默方法，所述表达盒包含与在植物细胞中具有功能的启动子有效连接的全部或部分的SEQ ID NO：1，3或4中所示的序列或编码SEQ ID NO：2或5-24的序列、其互补序列或片段、与此类序列共有大体上的序列同一性的序列或其互补序列或片段。此类序列在本文中称为“抑制性序列”或“抑制性多核苷酸序列”，因为它们能够表达为抑制靶细胞色素P450多肽，例如SEQ ID NO：2或5-24中所示的多肽和其变体的表达(即，转录和/或翻译)的RNA分子，其中变体多肽与这些公开的细胞色素P450多肽具有大体上的序列同一性。此类变体可参与或不参与植物中烟碱至降烟碱的代谢转化。此类序列还包括靶细胞色素P450多核苷酸或多肽的片段序列。例如，片段序列可包括细胞色素P450序列的任何部分，包括编码和非编码序列(例如，5′UTR、内含子和3′UTR序列)，且可包括100至大约350个核苷酸，大约125至大约300个核苷酸，或大约125至275个核苷酸的片段。优选，烟碱脱甲基酶的片段可在大约20至大约420，大约30至大约420，大约40至大约320，大约50至大约200，大约50至大约400，大约50至大约420，大约60至大约320，大约70至大约220，大约100至大约200，大约100至大约320，大约150至大约200，大约150至大约220，大约150至大约400，大约200至大约300，或大约300至大约400个连续核苷酸之间。备选地，细胞色素P450的片段在长度上可以是大约100、大约150、大约200、大约220、大约250、大约300、大约320或大约350个连续核苷酸。备选地，与全长相比较，细胞色素P450片段在长度上减少大约20、大约40、大约60、大约80、大约100、大约120、大约140、大约160、大约180、大约200、大约220、大约240、大约260、大约280、大约290、大约300、大约320、大约340、大约360、大约380、大约400个连续核苷酸。对于所有这些细胞色素P450片段，截断或缺失可始于5′末端，始于3′末端，或在细胞色素P450或细胞色素P450内含子内部。对于细胞色素P450内含子片段，细胞色素P450内含子的完整序列可以是SEQ ID NO：3。
此外，细胞色素P450多核苷酸或多肽的片段可包含来自完整基因的大约1、2、5、10、20、30、40、50、60、70、80或90％的连续核苷酸。备选地，细胞色素P450多核苷酸或多肽的片段可以是完整细胞色素P450的长度的大约5％至大约80％，大约10％至大约70％，大约10％至大约60％，大约10％至大约50％，大约25％至大约60％，大约25％至大约50％，大约40％至大约60％，大约40％至大约80％，大约50％至大约90％。
本发明的表达盒包括包含调控表达水平、表达的发育时间选择或发生表达的组织类型的另外的结构域的表达盒(例如，AU专利AU-A-77751/94和美国专利5,466,785和5,635,618)。可基于期望的结果选择启动子。可将本发明的核酸与诱导型、组成型、病原体或创伤诱导的、受环境或发育调控的、细胞或组织偏爱型启动子或其他启动子组合以在植物中进行表达。
通过应用外源化学调节剂，化学诱导型启动子可用于抑制参与植物中烟碱至降烟碱的代谢转化的细胞色素P450的表达。化学诱导型启动子在本领域内是已知的并且包括但不限于烟草PR-1a启动子，所述启动子由水杨酸激活。其他目的化学诱导型启动子包括类固醇响应型启动子(steroid-responsive promoter)(参见例如，糖皮质激素诱导型启动子(Schena等人(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88：10421-10425；和McNellis等人(1998)Plant J.14(2)：247-257)和四环素诱导型启动子(参见例如，Gatz等人(1991)Mol.Gen.Genet.227：229-237；和美国专利5,814,618和5,789,156)，其各自通过引用合并入本文就如同以其全文显示一样。
组成型启动子包括例如美国专利6,072,050中公开的Rsyn7启动子的核心启动子和外部组成型启动子；核心CaMV 35S启动子(Odell等人(1985)Nature 313：810-812)；泛素(Christensen等人(1989)Plant Mol.Biol.12：619-632；和Christensen等人(1992)PlantMol.Biol.18：675-689)；pEMU(Last等人(1991)Theor.Appl.Genet.81：581-588)；MAS(Velten等人(1984)EMBO J.3：2723-2730)；ALS启动子(美国专利5,659,026)等。其他组成型启动子包括例如美国专利5,608,149；5,608,144；5,604,121；5,569,597；5,466,785；5,399,680；5,268,463；5,608,142和6,177,611中公开的启动子。
组织偏爱型启动子可用于将本发明的抑制性多核苷酸序列的表达靶向特定植物组织内。组织偏爱型启动子包括Yamamoto等人(1997)Plant J.12(2)：255-265；Kawamata等人(1997)Plant Cell Physiol.38(7)：792-803；Hansen等人(1997)Mol.Gen Genet.254(3)：337-343；Russell等人(1997)Transgenic Res.6(2)：157-168；Rinehart等人(1996)Plant Physiol.112(3)：1331-1341；Van Camp等人(1996)Plant Physiol.112(2)：525-535；Canevascini等人(1996)PlantPhysiol.112(2)：513-524；Yamamoto等人(1994)Plant Cell Physiol.35(5)：773-778；Lam(1994)Results Probl.Cell Differ.20：181-196；Orozco等人(1993)Plant Mol Biol.23(6)：1129-1138；Matsuoka等人(1993)Proc Natl.Acad.Sci.USA 90(20)：9586-9590；和Guevara-Garcia等人(1993)Plant J.4(3)：495-505中公开的组织偏爱型启动子。
本文中特别感兴趣的是主要在叶组织中提供表达的叶偏爱型启动子。参见，例如，Yamamoto等人(1997)Plant J.12(2)：255-265；Kwon等人(1994)Plant Physiol.105：357-67；Yamamoto等人(1994)PlantCell Physiol.35(5)：773-778；Gotor等人(1993)Plant J.3：509-18；Orozco等人(1993)Plant Mol.Biol.23(6)：1129-1138；Baszczynski等人(1988)Nucl.Acid Res.16：4732；Mitra等人(1994)PlantMolecular Biology 26：35-93；Kayaya等人(1995)Molecular andGeneral Genetics 248：668-674；和Matsuoka等人(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90(20)：9586-9590。Senecence-regulated等人(1998)Plant Physiol.116：329-335)；SAG 13(Gan和Amasino(1997)PlantPhysiol.113：313-319)；SAG 15(Gan(1995)“MolecularCharacterization and Genetic Manipulation of PlantSenescence，”Ph.D.Thesis，University of Wisconsin，Madison)；SEN1(Oh等人(1996)Plant Mol.Biol.30：739-754)；用于IPT表达的衰老特异性基因的启动子(Gan和Amasino 91995)Science 270：1986-1988)等等(参见例如，Or等人(1999)Plant Cell 11：1073-1080；和McCabe等人(2001)Plant Physiol.127：505-516)。
本发明的表达盒可包括可用于增强翻译的5′前导序列。翻译前导序列在本领域内是已知的并且包括但不限于微小核糖核酸病毒前导序列，例如EMCV前导序列(脑心肌炎5′非编码区；Elroy-Stein等人(1989)Proc.Natl.Acid.Sci.USA 86：6126-6130)；马铃薯Y病毒(potyvirus)前导序列，例如，TEV前导序列(烟草蚀纹病毒；Gallie等人(1995)Gene 165(2)：233-238)、MDMV前导序列(玉米矮花叶病毒；Virology 154：9-20)和人免疫球蛋白重链结合蛋白(BiP；Macejak等人(1991)Nature 353：90-94)；来自苜蓿花叶病毒的外壳蛋白mRNA的非翻译前导序列(AMV RNA 4；Jobling等人(1987)Nature 325：622-625)；烟草花叶病毒前导序列(TMY；Gallie等人(1989)inMolecular biology of RNA，ed.Cech(Liss，New York)，pp.237-256)；和玉蜀黍萎黄斑点病毒(Maize chlorotic mottle virus)前导序列(MCMV；Lommel等人(1991)Virology 81：382-385)。也参见，Della-Cioppa等人(1987)Plant Physiol.84：965-968。还可使用已知增强翻译的其他方法。
抑制烟碱脱甲基酶的表达或功能的方法
提供了在烟草属植物或植物部分，特别地叶组织中减少本发明的细胞色素P450多肽的浓度、含量和/或活性的方法。可单独或组合地使用许多方法来减少或消除本发明的细胞色素P450多肽，特别地CYP82E5v2烟碱脱甲基酶的活性。此外，可将方法的组合用于减少或消除两种或更多种不同细胞色素P450多肽，更特别地CYP82E5v2和CYP82E4v2烟碱脱甲基酶的活性。优选，CYP82E5v2是在SEQ ID NO：2中具有至少一个氨基酸突变的多肽，所述多肽在绿叶中负面影响转化，CYP82E4v2具有SEQ ID NO：13中所示的序列(所述序列具有至少一个在衰老的叶中负面影响转化的氨基酸突变)。
根据本发明，如果细胞色素P450多肽的蛋白质水平在统计学上低于植物(所述植物未进行遗传修饰或诱变以抑制该细胞色素P450多肽的表达并且已使用相同的方案进行种植和收获)中相同细胞色素P450多肽的蛋白质水平，则本发明的细胞色素P450多肽的表达被抑制。在本发明的特定实施方案中，根据本发明的修饰的植物中细胞色素P450多肽的蛋白质水平低于95％，低于90％，低于80％，低于70％，低于60％，低于50％，低于40％，低于30％，低于20％，低于10％，或低于5％的植物(所述植物不是突变体或未进行遗传修饰以抑制该细胞色素P450多肽的表达并且使用相同方案进行种植和收获)中相同细胞色素P450多肽的蛋白质水平。可以例如通过测定烟草属植物或植物部分中表达的细胞色素P450转录物或细胞色素P450多肽的水平来直接测量，或例如通过测量烟草属植物或植物部分中烟碱至降烟碱的转化来间接测量细胞色素P450多肽的表达水平。用于监控多肽的表达水平的方法在本领域内是已知的，包括但不限于Northern印迹分析和RNA差异测定。用于测定被靶向的细胞色素P450多肽在将烟碱转化成降烟碱中的活性的方法在本领域内是已知的并且描述于本文中下面的其他地方，且包括但不限于使用气相色谱进行的生物碱分析。
在一些情况下，通过用表达盒转化植物或植物部分来减少或消除一种或多种细胞色素P450多肽的活性，所述表达盒包含编码抑制本发明的一种或多种细胞色素P450多肽的活性的多肽的多核苷酸。许多方法已用于在一个植物中组合转基因或突变-包括有性杂交、再转化、共转化和连接的转基因的使用。具有连接的部分基因序列的嵌合转基因可用于协同抑制许多植物内源基因。模仿病毒多聚蛋白质的构建体可用于同时将多个编码基因导入植物细胞。关于综述，参见Halpin等人，Plant Mol.Biol.47：295-310(2001)。可将在CYP82E4v2中具有突变(其在衰老的叶中抑制烟碱脱甲基酶活性)的植物与在CYP83E5v2中具有突变(其在绿叶中抑制烟碱脱甲基酶)的植物杂交以产生具有低于大约0.2％、0.3％、0.4％、0.5％、0.6％或0.7％的转化水平的植物。备选地，可将在CYP82E4v2中在位点458、364、38、201、169、459、296、427、329、376或171上具有一个或多个突变的植物与在CYP83E5v2中在位点235、449、174、410、224、72或143上具有一个或多个突变的植物杂交以产生具有低于0.2％、0.3％、0.4％、0.5％、0.6％或0.7％的转化水平的植物。备选地，可将在CYP82E4v2中在位点458、364或329上具有一个或多个突变的植物与在CYP83E5v2中在位点235、449、174、410、224、72或143上具有一个或多个突变的植物杂交以产生具有低于0.2％、0.3％、0.4％、0.5％、0.6％或0.7％的转化水平的植物。烟碱至降烟碱的特别优选的转化水平可以是0.05％至0.4％、0.1至0.6％、0.1％至0.3％、0.1％至0.5％、0.1％至0.4％、0.1％至0.7％、或0.1％至1.0％。导致CYP83E4v2或CYP83E5v2多肽在保守的血红素结合基序之前被截断的本发明的多核苷酸的任何突变将抑制酶并且可用于上述杂交。细胞色素P450蛋白的结构域在本领域内是已知的。参见，例如，Xu等人(2007)Physiologia Plantarum 129：307-319，其通过引用合并入本文就如同以其全文显示一样。通过杂交具有无功能或被抑制的CYP82E4v2基因、无功能或被抑制的CYP82E5v2基因、或无功能或被抑制的CYP82E4v2和CYP82E5v2基因的植物可在烟草植物中降低降烟碱的水平。
如果烟草属植物或植物部分中的烟碱脱甲基酶多肽将烟碱转化成降烟碱的活性在统计学上低于烟草属植物或植物部分(所述植物或植物部分未进行遗传修饰以抑制该细胞色素P450多肽的转化活性并且使用相同的方案进行种植和收获)中的相同细胞色素P450多肽的转化活性，则根据本发明烟草属植物或植物部分中的烟碱脱甲基酶多肽的该转化活性被抑制。在特定的实施方案中，如果根据本发明的修饰的烟草属植物或植物部分中细胞色素P450多肽将烟碱转化成降烟碱的活性低于95％、低于90％、低于80％、低于70％、低于60％、低于50％、低于40％，、低于30％、低于20％、低于10％、低于5％、低于2％或低于1％的烟草属植物(所述植物未进行遗传修饰以抑制烟碱脱甲基酶多肽的表达并且使用相同的方案进行种植和收获)中相同细胞色素P450多肽的转化活性，则根据本发明的修饰的烟草属植物或植物部分中细胞色素P450多肽的该活性被抑制。当烟草属植物或植物部分中烟碱脱甲基酶多肽将烟碱转化成降烟碱的活性通过本领域内已知的或本文中描述的测定法不能检测到时，根据本发明该活性被消除。使用气相色谱测定烟草属植物中细胞色素P450多肽将烟碱转化成降烟碱的活性的方法公开于下文实施例中。
在特定的实施方案中，将本文中描述的细胞色素P450抑制性多核苷酸或烟碱脱甲基酶突变导入烟草属植物或植物部分。然后，使用本领域技术人员已知的方法选择具有导入的本发明的抑制性多核苷酸的烟草属植物或植物部分，所述方法包括但不限于Southern印迹分析、DNA测序、PCR分析或表型分析。本发明的多核苷酸或多肽序列包括全长多核苷酸或多肽序列、截断的多核苷酸或多肽序列、多核苷酸或多肽序列的片段、多核苷酸或多肽序列的变体、有义方向(sense-oriented)的核苷酸序列、反义方向(antisense-oriented)的核苷酸序列、有义或反义方向的核苷酸序列的互补序列、核苷酸序列的反转区(inverted regions)、核苷酸序列的发夹、双链核苷酸序列、单链核苷酸序列、其组合等。将通过上述方法改变或修饰的植物或植物部分在形成植物的条件下培养，进行足以调控植物中本发明的多肽的浓度和/或活性的时间。形成植物的条件在本领域内是熟知的并且在本文中的其他地方进行了概述。
含有本文中描述的烟碱脱甲基酶抑制性多核苷酸序列的转化的烟草植物具有降低的烟碱至降烟碱的转化水平。在特定的实施方案中，根据本发明的转化的烟草植物或植物部分中烟碱至降烟碱的转化低于95％、低于90％、低于80％、低于70％、低于60％、低于50％、低于40％、低于30％、低于20％、低于10％、低于5％、低于2％或低于1％的烟草植物(所述植物未进行遗传修饰以抑制该烟碱脱甲基酶多肽的表达并且使用相同的方案进行种植和收获)中的转化。在一些情况下，转化的烟草植物是转换子(converter)烟草植物。备选地，转化的烟草植物是非转换子烟草植物。仍然备选地，转化的烟草植物具有低于在商业非转换子烟草植物中观察到的转换率的转换率。
可通过使用不能在转化的植物中指导蛋白质或RNA的表达的多核苷酸调节多肽的水平和/或活性。例如，可将本发明的多核苷酸用于设计可用于改变或突变生物的基因组核苷酸序列的方法中的多核苷酸构建体。此类多核苷酸构建体包括但不限于RNA:DNA载体、RNA:DNA突变载体、RNA:DNA修复载体、混合双链寡核苷酸、自我互补(self-complementary)RNA:DNA寡核苷酸和致重组寡核碱基。此类核苷酸构建体和使用方法在本领域内是已知的。参见，美国专利5,565,350；5,731,181；5,756,325；5,760,012；5,795,972和5,871,984；其各自通过引用合并入本文就如同以其全文显示一样。也参见，国际专利申请公开案WO 98/149350、WO 99/107865和WO99/125921；和Beetham等人(1999)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 96：8774-8778；其各自通过引用合并入本文就如同以其全文显示一样。
本发明的方法不依赖于完整烟碱脱甲基酶抑制性多核苷酸至基因组的整合，只要求烟草属植物或其植物部分由于该抑制性多核苷酸至细胞内的导入而发生改变。同样，基因组可在烟碱脱甲基酶抑制性多核苷酸导入细胞后发生改变。例如，抑制性多核苷酸或其任何部分可整合入植物的基因组。对基因组的改变包括但不限于核苷酸至基因组的添加、缺失和置换。虽然本发明的方法不依赖于任何特定数目的核苷酸的添加、缺失和置换，但应认识到此类添加、缺失和/或置换包含至少一个核苷酸。
此外，可通过只在某些发育阶段引发序列的效应并在其他阶段(其中不再期望表达)关闭效应来降低烟碱脱甲基酶序列的水平和/或活性。可通过使用诱导型或组织偏爱型启动子获得烟碱脱甲基酶表达的控制。备选地，可使用位点特异性重组酶、转座子或重组系统反转或缺失基因，这也可打开或关闭细胞色素P450序列的表达。
根据本发明，本发明的细胞色素P450多肽的水平、比率、活性或分布的变化或烟草属植物或植物部分表型的变化，特别地降烟碱和其致癌代谢物NNN的减少的积累，可通过将受试植物或植物部分与对照植物或植物部分相比较来测量，其中使用相同的方案种植和/或收获受试植物或植物部分和对照植物或植物部分。如本文中所使用的，受试植物或植物部分是其中已就目的烟碱脱甲基酶多肽进行了遗传改变例如转化的植物或植物部分，或是源自这样改变的并且包含改变的烟草属植物或植物部分的烟草属植物或植物部分。对照植物或植物部分提供了用于测量受试植物或植物部分的表型变化的参照点。可在任何时间(包括在植物发育过程中、衰老过程中或在处理后)测量植物或植物部分中的表型变化。在其他实施方案中，可测量在任何条件下生长的植物(包括在生长室、温室中或在田间生长的植物)中的表型变化。在一个实施方案中，表型变化可通过测定烟碱至降烟碱的转化率来测量。在优选实施方案中，转化可通过将降烟碱的百分比(作为总组织重量的百分比)除以烟碱和降烟碱的百分比的和(作为总组织重量的百分比)，然后乘以100来测量。
根据本发明，对照植物或植物部分可包括野生型烟草属植物或植物部分，即与用于遗传改变以产生受试植物或植物部分的起始材料具有相同的基因型的植物或植物部分。对照植物或植物部分还可包括与起始材料具有相同的基因型但已用无效构建体(即，对目的性状没有已知效应的构建体，例如包含选择标记基因的构建体)转化的烟草属植物或植物部分。备选地，对照植物或植物部分可包括在受试植物或植物部分的后代中为非转化的分离子的烟草属植物或植物部分，或在遗传上与受试植物或植物部分相同但未暴露于诱导目的烟碱脱甲基酶基因的抑制的条件或刺激的烟草属植物或植物部分。最后，对照植物或植物部分可包括在其中不表达烟碱脱甲基酶抑制性序列的条件下的受试植物或植物部分本身。在所有此类情况下，使用相同的方案种植和收获受试植物或植物部分以及对照植物或植物部分。
如本文中其他地方所描述的，提供了方法，其通过向烟草属植物或植物部分中导入能够抑制烟碱脱甲基酶多肽(其参与烟碱至降烟碱的代谢转化)的表达或功能的烟碱脱甲基酶抑制性多核苷酸序列来减少或消除本发明的烟碱脱甲基酶多肽的活性和/或浓度。在一些情况下，可通过用表达抑制烟碱脱甲基酶多肽的表达的多核苷酸的表达盒转化植物或植物部分例如植物细胞来导入抑制性序列。多核苷酸可通过阻止烟碱脱甲基酶多肽信使RNA的翻译直接地，或通过编码抑制编码烟碱脱甲基酶多肽的烟碱脱甲基酶多肽基因的转录或翻译的多肽间接地抑制烟碱脱甲基酶多肽的表达。用于抑制或消除植物中基因产物的表达的方法在本领域内是熟知的，并且任何这样的方法可在本发明中用于抑制烟碱脱甲基酶多肽的表达。
在其他实施方案中，本发明的烟碱脱甲基酶多肽的活性可通过破坏编码烟碱脱甲基酶多肽的基因来减少或消除。本发明包括在细胞色素P450基因中具有突变的经诱变的植物，其中所述突变减少烟碱脱甲基酶基因的表达或抑制编码的本发明的烟碱脱甲基酶多肽的活性。
为了获得期望的植物，可用能够表达抑制烟碱脱甲基酶序列的表达的多核苷酸的表达盒转化烟草属植物或植物部分。此类方法可包括有义抑制/共抑制、反义抑制、双链RNA(dsRNA)干扰、发夹RNA干扰和含有内含子的发夹RNA干扰、扩增子介导的干扰、核酶和小干扰RNA或微RNA的使用。
为了进行共抑制，设计表达盒以表达RNA分子，所述RNA分子在“有义”方向上相应于编码目的细胞色素P450多肽(例如，包含SEQ IDNO：2或5-24中所示的序列或与SEQ ID NO：2或5-24具有大体上的序列同一性的序列的细胞色素P450多肽)的信使RNA的全部或部分。RNA分子的过表达可导致减少的天然基因的表达。然后筛选用共抑制表达盒转化的多个植物品系以鉴定显示最大的烟碱脱甲基酶多肽表达的抑制的植物品系。
用于共抑制的多核苷酸可相应于编码本发明的细胞色素P450多肽的序列的全部或部分，细胞色素P450多肽转录物的5′和/或3′非翻译区的全部或部分，或编码细胞色素P450多肽的转录物的编码序列和非翻译区的全部或部分。在一些其中多核苷酸包括本发明的细胞色素P450多肽的编码区的全部或部分的实施方案中，可设计表达盒来消除多核苷酸的起始密码子以便不转录多肽产物。
共抑制可用于抑制植物基因的表达以产生具有不可检测的由此类基因编码的多肽的水平的植物或还可用于抑制相同植物中多个蛋白质的表达(例如，Broin等人(2002)Plant Cell 14：1417-1432；和美国专利5,942,657)。使用共抑制来抑制植物中内源基因的表达的方法描述于Flavell等人(1994)Proc Nati.Acad.Sci.USA 91：3490-3496；Jorgensen等人(1996)Plant Mol.Biol.31：957-973；Johansen和Carrington(2001)Plant Physiol.126：930-938；Brain等人(2002)Plant Cell 14：1417-1432；Stoutjesdijk等人(2002)Plant Physiol.129：1723-1731；Yu等人(2003)Phytochemistry 63：753-763；和美国专利5,034,323；5,283,184和5,942,657；其各自通过引用合并入本文就如同以其全文显示一样。可通过在表达盒中在有义序列3′端的位点和多腺苷酸化信号的5′端处包括poly-dT区来增加共抑制的效率。参见，美国专利申请公开案2002/0048814，其通过引用合并入本文就如同以其全文显示一样。通常，这样的核苷酸序列与内源基因的转录物的序列具有大体上的序列同一性，优选大于大约65％的序列同一性，更优选大于大约95％的序列同一性，最优选大于大约99％的序列同一性(例如，美国专利5；283,184和5,034,323；其通过引用合并入本文就如同以其全文显示一样)。
本发明的细胞色素P450多肽的表达的抑制还可通过反义抑制来获得。关于反义抑制，设计表达盒以表达与编码细胞色素P450多肽的信使RNA的全部分或部分互补的RNA分子。反义RNA分子的过表达可导致减少的天然基因的表达。因此，筛选用反义抑制表达盒转化的多个植物品系以鉴定显示最大的烟碱脱甲基酶多肽表达的抑制的品系。
用于反义抑制的多核苷酸可相应于编码细胞色素P450多肽的序列的互补序列的全部或部分，细胞色素P450多肽转录物的5′和/或3′非翻译区的互补序列的全部或部分，或编码细胞色素P450多肽的转录物的编码序列和非编码区的互补序列的全部或部分。此外，反义多核苷酸对于靶序列可以是完全互补的(即，与靶序列的互补序列100％同一)或部分互补的(即，与靶序列的互补序列低于100％同一)。
反义抑制还可用于抑制相同植物中多个蛋白质的表达(例如，美国专利5,942,657)。此外，反义核苷酸的部分可用于破坏靶基因的表达。通常，可使用至少50个核苷酸、100、200、300、400、450、500、550个核苷酸或更多个核苷酸的序列。使用反义抑制来抑制植物中内源基因的表达的方法公开于例如Liu等人(2002)Plant Physiol.129：1732-1743；和美国专利5,759,829和5,942,657中；其各自通过引用合并入本文就如同以其全文显示一样。可通过在表达盒中在反义序列3′端的位点和多腺苷酸化信号的5′端处包括poly-dT区来增加反义抑制的效率。参见，美国专利申请公开案2002/0048814，其通过引用合并入本文就如同以其全文显示一样。
为了进行dsRNA干扰，在相同的细胞中表达有义RNA分子(如上文对于共抑制描述的)和与有义RNA分子完全或部分互补的反义RNA分子，从而导致相应的内源信使RNA的表达的抑制。有义和反义分子的表达可通过设计包含针对靶细胞色素P450序列的有义序列和反义序列的表达盒来实现。备选地，可针对有义和反义序列使用分开的表达盒。然后筛选用dsRNA干扰表达盒转化的多个植物品系以鉴定显示被靶向的细胞色素P450多肽的表达的最大抑制的植物品系。使用dsRNA干扰来抑制内源植物基因的表达的方法描述于Waterhouse等人(1998)Pros.Natl.Acad.Sci.USA 95：13939-13964；Liu等人(2002)Plant Physiol.129：1732′-1743；和国际专利申请公开案WO99/149024，WO 99/153050，WO 99/161631和WO 00/149035中；其各自通过引用合并入本文就如同以其全文显示一样。
扩增子表达盒包含含有靶基因的全部或部分但通常不包含天然病毒的全部基因的植物病毒来源的序列。存在于表达盒的转录产物中的病毒序列允许转录产物指导其自己的复制。由扩增子产生的转录物相对于靶序列(即，参与烟碱至降烟碱的代谢转化的细胞色素P450多肽的信使RNA)可以是有义的或反义的。使用扩增子抑制内源植物基因的表达的方法描述于例如，Angell & Baulcombe(1997)EMBO J.16：3675-3684；Angell & Baulcombe(1999)Plant J.20：357-362；和美国专利6,646,805中，其各自通过引用合并入本文就如同以其全文显示一样。
在一些情况下，由本发明的表达盒表达的多核苷酸是催化RNA或具有特异于本文中描述的细胞色素P450多肽的信使RNA的核酶活性。因此，多核苷酸引起内源信使RNA的降解，从而导致减少的细胞色素P450多肽的表达。该方法描述于例如美国专利4,987,071中，其通过引用合并入本文就如同以其全文显示一样。
在其他情况下，一个或多个烟碱脱甲基酶多肽的表达的抑制可通过表达编码微RNA(miRNA)的基因利用RNA干扰来获得。miRNA是由大约22个核糖核苷酸组成的调控试剂。miRNA在抑制内源基因的表达上高度有效。参见，例如，Javier等人(2003)Nature 425：257-263，其通过引用合并入本文就如同以其全文显示一样。
为了进行miRNA干扰，设计表达盒以表达模仿内源miRNA基因的RNA分子。miRNA基因编码形成含有与另一个内源基因(靶序列)互补的22-核苷酸序列的发夹结构的RNA。为了抑制烟碱脱甲基酶多肽的表达，22-核苷酸序列选自细胞色素P450多肽转录物序列并且包含以有义方向编码该细胞色素P450多肽序列的22个核苷酸和与有义序列互补的相应反义序列的21个核苷酸。miRNA分子在抑制内源基因的表达上高度有效，并且它们诱导的RNA干扰由植物的后代继承。
备选地，一个或多个细胞色素P450多肽的表达的抑制可通过发夹RNA(hpRNA)干扰或含有内含子的发夹RNA(ihpRNA)干扰获得。此类方法在内源基因的表达的抑制上高度有效。参见，Waterhouse &Helliwell(20013)Nat.Rev.Genet.4：29-38和其中引用的参考资料。
还可设计用于hpRNA干扰的表达盒，以便有义序列和反义序列不相应于该实施方案中的内源RNA，有义和反义序列侧翼于包含相应于靶基因的内源信使RNA的全部或部分的核苷酸序列的环序列。因此，环区域确定了RNA干扰的特异性。参见，例如，国际专利申请公开案WO 02/00904，其通过引用合并入本文就如同以其全文显示一样。
可通过使用其中发夹的反向重复与待沉默的基因的启动子区域共有序列同一性的hpRNA构建体来实现转录基因沉默(TGS)。将hpRNA加工成可与同源启动子区域相互作用的短RNA可引发降解或甲基化，从而导致沉默(Aufsatz等人(2002)Proc.Natl.Acad.Sci.99：16499-16506；和Mette等人(2000)EMBO J.19：5194-5201)。
在一些情况下，多核苷酸编码结合至少一种细胞色素P450多肽，并且减少本发明的细胞色素P450多肽的活性的抗体。在另一个实施方案中，抗体的结合通过细胞质量控制机制导致增加的抗体-细胞色素P450多肽复合物的周转。植物部分中抗体的表达以及植物部分中由抗体的表达和与蛋白质的结合引起的分子途径的抑制在本领域内是熟知的。参见，例如，Conrad & Sonnewald(2003)Nature Biotech.21：35-36，其通过引用合并入本文就如同以其全文显示一样。
可通过破坏编码细胞色素P450多肽的基因来减少或消除本发明的细胞色素P450多肽的活性。可通过本领域内已知的任何方法来破坏编码细胞色素P450多肽的基因，例如通过转座子标记或通过使用随机或靶向诱变(targeted mutagenesis)诱变植物，并选择具有减少的烟碱脱甲基酶活性或在CYP82E4v2或CYP82E5v2中具有突变的植物。
转座子标记(transposon tagging)可用于减少或消除本发明的一种或多种细胞色素P450多肽的活性。转座子标记包括将转座子插入内源细胞色素P450基因内以减少或消除细胞色素P450多肽的表达。
用于植物中特定基因的转座子标记的方法在本领域内是熟知的。参见，例如，Maes等人(1999)Trends Plant Sci.4：90-96；Dharmapuri& Sonti(1999)FEMS Micerobiol.Lett.179：53-59；Meissner等人(2000)Plant J.22：265-274；Phogat等人(2000)J.Biosci.25：57-63；Walbot(2000)Curr.Opin.Plant Biol.2：103-107；Gai等人(2000)Nucleic Acids Res.28：94-96；和Fitzmaurice等人(1999)Genetics 153：1919-1928)。
用于减少或消除植物中内源基因的表达的另外的方法在本领域内也是已知的并且可类似地用于本发明。此类方法包括其他形式的诱变，使用诱变或致癌化合物的诱变包括甲基磺酸乙酯诱导的诱变、缺失诱变和在反向遗传学(使用PCR)中用于鉴定其中内源基因已缺失的植物品系的快中子缺失诱变。关于此类方法的实例，参见，Ohshima等人(1998)Virology 213：472-481；Okubara等人(1994)Genetics 137：867-874；和Quesada等人(2000)Genetics 154：421-4315；其各自通过引用合并入本文就如同以其全文显示一样。此外，用于筛选化学诱导的突变的快速且可自动化的方法，TILLING(Targeting InducedLocal Lesions In Genomes)(其使用变性HPLC或选择的PCR产物的选择性内切核酸酶降解)也可用于本发明。参见，McCallum等人(2000)Nat.Biotechnol.18：455-457，其通过引用合并入本文。
影响基因表达或干扰编码的细胞色素P450蛋白的功能的突变可使用本领域内熟知的方法来确定。基因外显子中的插入突变通常导致无效突变体。保守残基中的突变在抑制编码的蛋白质的代谢功能中可以是特别有效的。已描述了适合用于目的在于消除细胞色素P450多肽在烟草属植物或植物部分中将烟碱转化成降烟碱的活性的诱变的植物细胞色素P450多肽的保守残基。植物细胞色素P450多肽的保守残基公开于图1A-C，其中与其他P450多肽不同的残基以灰色阴影显示。保守残基是各位点上不以灰色阴影显示的残基。此类突变体可根据熟知的方法来分离。
显性突变体可用于触发因基因倒位和重复基因座的重组而引起的RNA沉默。参见，例如，Kusaba等人(2003)Plant Cell 15：1455-1467。
许多序列可用于实施本发明，特别地编码SEQ ID NO：2和13的序列具有特定的用途。然而不希望受任何特定作用机制限制，本发明者认为此类序列编码催化烟碱至降烟碱的氧化N-脱甲基化的烟碱脱甲基酶。因此，特异性抑制此类编码序列而不抑制其他P450序列的方法对于重组植物是有益的。即，可证明导致该个体基因座的基因功能的抑制的策略优于抑制整个基因家族的策略。P450酶参与植物中的许多机制，其抑制对植物的生长和发育是不利的或有害的或可负面地影响因素例如植物的疾病防御能力。同样地，因为烟草属植物P450酶牵涉植物代谢产物例如类苯基丙烷(phenylpropanoid)、生物碱、萜类化合物、脂质、生氰糖苷(cyanogenic glycoside)、芥子油苷(glucosinolate)和许多其他化学实体，因此P450活性的破坏可改变参与烟草风味、质地或影响植物的商业用途的其他特性的组分。因此，使用上述方法以特异性靶向编码SEQ ID NO：2或13的序列的方式抑制表达可以是优选的，包括靶向突变策略，例如嵌合修复术(chimeraplasty)。参见，例如，Stewart等人(2000)Biotechniques24：838-843；和Graham等人(2002)Biochim Biophys Acta 1587：1-6；其各自通过引用合并入本文就如同以其全文显示一样。在一些实施方案中，上述方法用于以特异性靶向SEQ ID NO：1(编码SEQ ID NO：2)、SEQ ID NO：50(编码SEQ ID NO：13)或这两个序列的方式抑制表达。
本发明的组合物可用于筛选方法中以鉴定用于育种程序的非转换子植物。以这样的方式，本发明的核苷酸序列可用于筛选在一个或多个本文中鉴定的P450基因中具有稳定的突变的非转换子植物的天然种质。通过本发明的方法鉴定的这些非转换子植物可用于开发育种系。
除了编码P450编码序列的核苷酸序列外，本发明的组合物包含可用于筛选方法的CYP82E5v2序列的内含子序列。然而不希望受任何特定作用机制的束缚，CYP82E5v2基因可能代表细胞色素P450家族中参与烟草绿叶中烟碱至降烟碱的代谢转化(并且如之前所述存在极大可能性--CYP82E5v2 cDNA源自单个独特的基因座的)的出众的成员。对于某些应用，具有在诊断上将细胞色素P450基因家族的该特定成员与该家族内的其余密切相关的序列相区别的方法是有用的。例如，在天然存在的烟草种质中(或在诱变群体中)，可能存在这样的增加物(accession)，其中该基因是天然功能失常的，并因此其作为永久性非转换子来源可能是有价值的。此类功能失常的基因可包括编码SEQID NOS：6和12中所示的多肽的基因。特异性地测定此类基因型(例如，缺失突变体、重排等)的方法可用作强有力的工具。本发明包括设计用于特异性扩增CYP82E5v2或CYP82E4v2的外显子1和外显子2的引物，其中两个引物对之一相应于外显子之间的内含子。用于扩增CYP82E4v2的外显子的引物的实例包括SEQ ID NO：32与SEQ IDNOS：33-35。用于扩增CYP82E5v2的外显子的引物的实例包括SEQ IDNO：36与37和SEQ ID NO：38与39。这些相同的引物可用于产物的序列分析。
当相应于CYP82E2家族的成员的任何cDNA在烟草基因组DNA的Southern印迹测定中用作杂交探针时，观察到复合模式(complexpattern)。这是预料之中的，因为存在多个关系密切的该基因家族的成员。因为基因的内含子区域通常不如外显子保守，因此预期内含子特异性探针的使用减少该复杂性并且使技术人员能够更好地将相应于CYP82E4v2基因或CYP82E5v2基因的基因与家族的其他成员相区分。CYP82E4v2或CYP82E5v2内含子特异性探针和/或用于产生产物的PCR引物的使用在确定任何天然发生的或诱变的烟草植物是否具有缺失或重排(其可使所述基因失活)的测定中提供了强有力的工具。然后可将这样的植物用于育种程序以产生不能转换的烟草品系。
具有降低的降烟碱和NNN含量的转化的植物、植物部分和产物
本发明的细胞色素P450多核苷酸和其变体和片段可用于本发明的方法以抑制参与植物中烟碱至降烟碱的代谢转化的细胞色素P450。以这样的方式，将靶向本文中公开的细胞色素P450多肽的表达或功能的抑制性序列导入目的植物或植物细胞。可以使用本领域内已知的任何合适的转化方法包括本文中描述的方法将本文中描述的表达盒导入目的植物，例如本文中下面提及的烟草属植物。
本发明的方法不依赖于将序列导入植物或植物部分的特定方法，只要期望的序列能够进入植物或植物部分的至少一个细胞的内部。用于将多核苷酸序列导入植物的方法在本领域内是已知的并且包括但不限于稳定转化方法、瞬时转化方法和病毒介导的转化方法。
转化方案以及用于将异源多核苷酸序列导入植物的方案取决于被靶向以进行转化的植物或植物细胞的类型。本发明的将多核苷酸导入植物细胞的合适的方法包括显微注射(Crossway等人(1986)Biotechniques 4：320-334)、电穿孔(Shillito等人(1987)Meth.Enzymol.153：313-336；和Riggs等人(1986)Proc.Natl.Acad Sci.USA 83：5602-56116)、农杆菌(Agrobacterium)介导的转化(美国专利5,104,310；5,149,645；5,177,010；5,231,019；5,463,174；5,464,763；5,469,976；4,762,785；5,004,863；5,159,135；5,563,055和5,981,840)、直接基因转移(Paszkowski等人(1984)EMBO J.1：2717-2722)和弹道微粒加速(ballistic particleacceleration)(美国专利4,945,050；5,141,131；5,886,244；5,879,918和5,932,782；Tomes等人(1995)in Plant cell，tissue，and organ culture fundamental methods，ed.Gamborg & Phillips(Springer-Verlag，Berlin)；McCabe等人(1988)Biotechnology 6：923-926)。也参见，Weissinger等人(1988)Ann.Rev.Genet.22：421-477；Christou等人(1988)Plant Physiol.87：671-674(大豆)；McCabe等人(1988)Bio/Technology 6：923-926(大豆)；Finer &McMullen(1991)In Vitro Cell Dev.Biol.27P：175-182(大豆)；Singh等人(1998)Theor.Appl.Genet.96：319-324(大豆)；De Wet等人(1985)in The experimental manipulation of ovule tissues，ed.Chapman等人(Longman，New York.)；pp.197-209(花粉)；Kaeppler等人(1990)Plant Cell Reports 9：415-418；和Kaeppler等人(1992)Theor.Appl.Genet，84：560-566(whisker介导的转化)；D′Halluin等人(1992)Plant Cell 4：1495-1505(电穿孔)；其各自通过引用合并入本文就如同以其全文显示一样。
随后可使用克隆方法(无论是通过器官发生还是胚发生)繁殖的任何植物组织可用包含细胞色素P450抑制性序列的重组构建体，例如本发明的表达盒进行转化。如本文中所使用的，“器官发生”意指籍以从分生组织中心相继发育芽(shoot)和根的方法。如本文中所使用的，“胚发生”意指籍以以协同的方式(非相继地)一起发育芽和根(无论从体细胞还是从配子)的方法。适合用于本文中描述的各种转化方案的示例性组织包括但不限于愈伤组织、现有分生组织(例如，顶端分生组织、腋芽和根分生组织(root ineristem))和诱导的分生组织(例如，子叶分生组织和下胚轴分生组织)、下胚轴、子叶、叶盘、花粉、胚等。
如本文中所使用的，“稳定转化”意指导入植物的目的核苷酸构建体整合入植物的基因组并且能够由其后代继承。同样，“瞬时转化”意指将序列导入植物并且其仅短暂地表达或仅短暂地存在于植物中。
可使用多种瞬时转化方法给植物提供本发明的抑制性序列。可使用本领域内已知的技术将本发明的抑制性序列瞬时转化入植物。此类技术包括病毒载体系统和多核苷酸的沉淀(以防止DNA的随后释放的方式)。因此，可发生从颗粒结合的DNA进行的转录，但其被释放以整合入基因组的频率大大降低。此类方法包括使用包被有聚乙烯亚胺的颗粒(PEI；Sigma 4P3143)。
备选地，可通过将植物与病毒或病毒核酸接触来将本发明的抑制性序列导入植物。一般地，此类方法包括将本发明的表达盒整合在病毒DNA或RNA分子内。用于本发明的表达盒的启动子还包括用于通过病毒RNA聚合酶进行转录的启动子。用于将多核苷酸(包括病毒DNA或RNA分子)导入植物并且表达其中编码的蛋白质的方法在本领域内是已知的。参见，例如，美国专利5,889,191；5,889,190；5,866,785；5,589,367；5,316,931；和Porta等(1996)Molecular Biotechnology5：209-221；其各自通过引用合并入本文就如同以其全文显示一样。
可按照常规方法将转化的细胞培养成烟草属植物。参见，例如，Vasil & Hildebrandt(1965)Science 150：889；Negaard & Hoffman(1989)Biotechniques 7(8)：808-812。然后种植此类植物，用相同的转化品系或不同品系对其进行授粉，鉴定表达期望的表型特征的所得后代，即，植物中，特别地叶组织中一种或多种参与烟碱至降烟碱的代谢转化的烟碱脱甲基酶的减少的表达，从而减少的降烟碱的含量，和伴随的减少的其亚硝胺代谢产物NNN的含量。可种植两代或更多代以确保期望的表型特征的表达得到稳定保持和遗传，然后收获种子以确保已获得期望的表型特征的表达。通过该方式，本发明提供了具有稳定地整合入它们的基因组的本发明的多核苷酸，例如本发明的表达盒的转化的种子(也称为“转基因种子”)。
本发明的组合物和方法可用于在烟草属任何植物的特别地叶和茎中减少降烟碱的含量，所述烟草属植物包括但不限于下列物种：acuminata，affinis，花烟草(alata)，attenuate，毕基劳氏烟草(bigelovii)，克氏烟草(clevelandii)，香密烟草(excelsior)，福氏烟草(forgetiana)，粉蓝烟草(glauca)，心叶烟草(glutinosa)，朗氏烟草(langsdorffii)，长花烟草(longiflora)，obtusifolia，palmeri，圆锥烟草(paniculata)，皱叶烟草(plumbaginifolia)，qudrivalvis，repanda，黄花烟草(rustica)，suaveolens，林烟草(sylvestris)，普通烟草(tabacum)，绒毛烟草(tomentosa)，三角叶烟草(trigonophylla)和红花烟草(x sanderae)。本发明还包括任何品种的烟草属植物的转化，包括但不限于Nicotianaacuminata multiflora，大花烟草(Nicotiana alata grandiflora)，Nicotiana bigelovii quadrivalvis，Nicotiana bigelovii wallacei，Nicotiana obtusifolia obtusifolia，Nicotiana obtusifoliaplameri，Nicotiana quadrivalvis bigelovii，Nicotianaquadrivalvis quadrivalvis，Nicotiana quadrivalvis wallacei和Nicotiana trigonophylla palmeri，以及通常称为烤烟品种或浅色烟品种、白肋烟品种、深色烟品种和东方型/土耳其烟品种的品种。
本文中描述的烟草属转基因植物适合于常规种植和收获技术，例如在富含粪肥的土壤中或不含粪肥的情况下栽培，给花套袋或不套袋，或截梢或不截梢。收获的叶和茎可用于任何传统烟草制品，包括但不限于烟斗烟(pipe tobacco)、雪茄和香烟，以及任何形式的嚼烟(包括叶烟、烟丝(shredded tobacco)或烟丝(cut tobacco))。
因此本发明提供了包含本发明的表达盒和减少量的降烟碱和N′-亚硝基降烟碱的烟草属植物，特别地此类植物的叶组织。如本文中所使用的，“减少的量”或“减少的水平”意指经处理的或转基因的烟草属的植物或其植物部分或烟草制品中降烟碱和/或NNN的量低于来自相同烟草品种(其以相同方式进行操作(即，种植和收获)，但未进行处理或未进行转基因以减少降烟碱和/或NNN)的烟草属植物或植物部分或烟草制品中发现的量。降烟碱的量可减少大约10％至大于大约90％，包括大于大约20％、大约30％、大约40％、大约50％、大约60％、大约70％和大约80％。在本发明的植物、植物部分和制品中，更特别地在CYP82E4v2和CYP825v2中具有突变的植物，植物部分中，烟碱至降烟碱的转化可以低于0.3％、低于0.5％、低于0.7％、在0.1％至0.5％之间、在0.1％至0.4％之间、在0.1％至0.7％之间或在0.1％至1.0％之间。
如本文中所使用的，“烟草制品”是指，但不限于，发烟材料(smoking material)(例如，任何香烟，包括小雪茄、不透气(non-ventilated)或透气(vented)嵌入式过滤嘴香烟(recessfilter cigarette)、雪茄、烟斗烟)、无烟制品(例如，鼻烟、嚼烟、生物可降解嵌入物(例如，树胶(gum)、锭剂、溶解性条(dissolvingstrip))。参见，例如，美国专利申请公开案2005/0019448，其通过引用合并入本文就如同以其全文显示一样。烟草制品还包括可通过将常规烟草与不同量的本文中描述的低降烟碱和/或NNN烟草组合来制备的混合物(blend)。烟草制品还包括上文描述为烤烟的烟草属植物或植物部分。
本文中描述的烟草制品降低了通过消费烟草制品例如雪茄、香烟或烟斗烟直接吸入的或作为二手烟吸入(即，个体吸入由消费烟草制品例如雪茄、香烟或烟斗烟的个体产生的烟草烟雾)的烟草烟雾的致癌潜能。本文中描述的烤烟可用于制备烟草制品，特别地由于加热而经历化学变化的烟草制品，其在直接吸入的或作为二手烟吸入的烟流中包含减少量的降烟碱和/或NNN。同样地，本发明的烟草制品可用于制备无烟烟草制品例如嚼烟、鼻烟等。
来源于本发明的转基因烟草植物的烟草制品因此可用于降低此类烟草制品的致癌潜能和减少人(特别地其为此类烟草制品的使用者的个体)对致癌亚硝胺NNN的暴露的方法中。以举例说明而非限定的方式提供下列实施例。
实验
在下文描述的实验中使用下列材料和方案。
植物材料
所有植物材获自Dr.Earl Wernsman，Department of Crop Science，North Carolina State University(Raleigh，NC)。绒毛状烟草(N.tomentosiformis)和林烟草(N.sylvestris)种子获自由NorthCarolina State University维持的烟草属种质收集中心。在将植物转移至温室之前，将它们在生长室中培养2个月。白肋烟品系DH98-325-5(非转换子)和DH 98-325-6(转换子)代表接近同基因的品系，即，从相同母本单倍体植物回收的品系。SC58是烤烟品种，其非转换子个体称为SC58(cTcT)。SC58(CTCT)是接近同基因的稳定转换子品系，其通过将烟草祖先物种绒毛状烟草中发现的单显性转换子基因座(Cr)基因渗入至SC58内产生(Mann等人(1964)Crop Sci.，4：349-353)。在与SC58进行8次另外的回交后，产生接近同基因的SC58(CTCT)品系，其随后通过自花受精进行维持。
使用标准盆栽土和肥料将所有植物维持在生长室或温室中。植物保持在14/10光/黑暗周期中，根据需要每天浇灌一次，用PetersAll Purpose Plant Food肥料(20-20-20；SpectrumBrands Inc.；Madison，WI)每周施肥一次。为了促进衰老，通过将各叶浸入0.2％乙烯利溶液中30秒来处理离体绿叶。在黑暗的条件下在塑料袋中烘烤叶直至它们变黄。
为了进行甲烷磺酸乙酯(EMS)诱变，用50％的漂白剂对2克来自强转换子白肋烟草品系DH98-325-6的种子进行表面消毒，进行12分钟，然后在无菌dH2O中漂洗6次。然后将大约80mg等分试样置于螺旋盖小瓶中并且在1ml dH2O中浸渗12小时。轻轻倒出dH2O，将种子在黑暗中在室温下于1ml 0.5％ EMS(Sigma；St.Louis，MO)中温育并且在Mixer(TCS Scientific Corp.；New Hope，PA)上轻轻摇动，进行12小时。在除去EMS溶液后，将处理的种子在1ml体积的dH2O中(轻轻摇动5分钟)清洗8次。在最后一次清洗后，将种子收集至布氏漏斗(Buchner funnel)上以进行最后的漂洗，然后在土壤上播种之前让其在滤纸上干燥。幼苗在标准浮盘(float tray)上生长大约7周，然后将其移植至田间。使田间生长的植物自花授粉，每株植物收集5至10个荚果(含有M1代种子)，并编制目录(相应于大约4000个独立的M0个体)。
NtabCYP82E5v2 cDNA的分离
使用(Invitrogen；Carlsbad，CA)按照厂商的方案从DH98-325-6烟草的绿叶和衰老的叶中提取总RNA。通过按照厂商的方案用TURBO DNA-freeTM DNase试剂盒(Ambion；Austin，TX)处理提取物来除去基因组DNA。使用StrataScriptTM First-Strand试剂盒(Stratagene；Cedar Creek，TX)，用oligo dT引物和3μg的不含DNA酶的总RNA进行cDNA合成。按照厂商的方案，使用E5Orf_F正向和E5Orf_R反向引物，10ng烟草叶cDNA文库(作为模板)和LongRangeTM PCR Enzyme Blend(GeneChoice，Inc.；Frederick，MD)扩增全长NtabCYP82E5v2 cDNA。引物的DNA序列信息列于序列表和上文中。PCR条件如下：在95℃下进行3分钟起始变性，然后进行33个循环的在94℃下30秒、在60℃下退火30秒和在68℃下延伸90秒，然后在68℃下温育7分钟。将PCR产物克隆入-T Easy克隆性载体(Promega Corp.；Madison，WI)，然后按照双脱氧法使用合成的寡核苷酸作为引物进行测序(Sanger等人(1977)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.74：5463-5467)。
基因组CYP82E5片段的分离
按照Plant试剂盒(BD Bioscience Clontech；PaloAlto，CA)的说明书，使用基于十六烷基三甲基溴化铵的提取法从绒毛状烟草和DH98-325-6烟草的绿叶中分离基因组DNA。
使用嵌套引物在两个连续的PCR反应中扩增CYP82E5直系同源物的基因组片段。第一PCR混合物包含0.5μM的各E5Gen_F1正向(SEQID NO：40)和E5Gen_R1反向(SEQ ID NO：41)引物，200μM的各dNTP，20ng的基因组DNA模板和2U的Taq聚合酶(Invitrogen)。在下列条件下进行PCR扩增：在90℃下进行3分钟；进行30个循环的在94℃下变性30秒、在57℃下退火30秒和在68℃下延伸2.2分钟，然后在68℃下进行最后的延伸，进行5分钟。除了加入引物E5Gen_F2(SEQ ID NO：42)和E5Gen_R2(SEQ ID NO：43)且使用1μl的50倍稀释的第一PCR产物的样品作为模板外，第二PCR的组成和条件与对于第一扩增所描述的组成和条件相同。将纯化的终PCR产物连接入pGEM-T-Easy克隆性载体，然后经历DNA测序。
酵母中NtabCYP82E5v2 cDNA的表达
为了促进酵母中NtabCYP82E5v2 cDNA的表达，将基因的开放阅读框插入pYeDP60酵母表达载体的半乳糖诱导的、葡萄糖抑制的GAL10-CYC1启动子的下游(Cullin & Pompon 1988)。使用Gietz等人(1992)Nucleic Acids Res.20：1425-1425描述的基于醋酸锂的转化方法将重组质粒导入WAT11酵母株系。按照Pompon等人(1996)Methods Enzymol.272：51-64的方案进行酵母培养、半乳糖介导的基因表达的诱导和微粒体级分的分离。
NtabCYP82E5介导的烟碱代谢的动力学分析
在150μl Pi缓冲液，pH 7.1的终体积中于含有0.75mM NADPH，2.5μM[吡咯烷-2-14C]烟碱(Moravek Biochemicals；Brea，CA)和90μg的酵母微粒体的反应混合物中进行烟碱代谢测定。可通过加入非放射性标记的烟碱至范围在0.7和13μM之间的终浓度来调整烟碱浓度。从含有空载体的酵母分离的微粒体制剂用作阴性对照。将反应混合物在25℃下温育7分钟，然后用50μl丙酮终止反应。在以16,000xg离心3分钟后，将50μl样品点在250-μm Whatman K6F硅板(silicaplate)上。在氯仿∶甲醇∶铵(60∶10∶1)溶剂系统中将板显影。通过用Bioscan System 400图像扫描仪测量它们的放射性示踪剂的相对丰度来定量烟碱和其降烟碱衍生物。通过使用10.0制图软件(Systat Software，Inc.；San Jose，CA)使Michaelis-Menten方程式拟合不同底物浓度上的烟碱脱甲基测量值来计算Km和vmax值。
CYP82E4v2和CYP82E5v2表达的定量实时PCR分析
使用Green I荧光化学药品(Morrison等人(1998)Biotechniques 24：954-962)通过等位基因特异性定量实时PCR(qrt-PCR)分析CYP82E4v2和CYP82E5v2的绒毛状烟草和烟草直系同源物的表达。使用本文中针对NtabCYP82E5v2 cDNA分离的所描述的方法从3月龄的植物的绿叶和烘烤叶中提取总RNA。使用E4Rt_F(SEQ IDNO：44)和E5Rt_F(SEQ ID NO：46)正向引物(与E4Rt_R(SEQ ID NO：45)和E5Rt_R(SEQ ID NO：47)反向引物组合)分别扩增CYP82E4v2和CYP82E5v2转录物。qrt-PCR混合物包含1xiQTM Green Supermix(Bio-Rad Laboratories)、0.5μM的各引物和0.5μg cDNA。使用通过扩增已知量的靶DNA和甘油醛-3-磷酸脱氢酶(G3PDH)基因的220-bp片段(用G3PDH_F(SEQ ID NO：48)和G3PDH_R(SEQ ID NO：49)引物扩增，以提供cDNA测量的内部标准)产生的标准曲线获得转录物的测量值。在下列条件下使用实时PCR系统(Bio-Rad Laboratories；Hercules，CA)进行DNA扩增：在95℃下进行2分钟；进行35个循环的95℃下30秒、57℃下30秒、72℃下50秒，然后在72℃下进行终延伸5分钟。通过克隆PCR产物和测定20个随机选择的克隆的序列验证通过qrt-PCR产生的扩增子的DNA序列。
转基因植物分析
在pKYL80克隆性载体(Schardl等人(1987)Gene 61：1-11)中装配基于RNAi的基因沉默构建体，所述pKYL80克隆性载体经工程改造在多接头的Xhol与Sacl限制性位点之间包含151-bp的大豆FAD3基因内含子片段(pKYLX80I)。为了产生其中FAD3内含子被CYP82E5v2的有义和反义片段侧翼连接的构建体，分别以其有义和反义方向将400-bp的内含子区域克隆在pKYLX801的HindIII-Xhol和Sacl-Xbal限制性位点之间。将所得的HindIII-Xbal片段(其包含CYP8E5v2有义臂、FAD3内含子和CYP82E5v2反义臂)亚克隆入pKYLX71植物二元表达载体(Maiti等人(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：6110-6114)的35S CaMV启动子与核酮糖二磷酸羧化酶-加氧酶小亚基终止子之间。
通过用CYP82E5v2、CYP82E5v2变体或CYP82E4v2变体cDNA的全长编码区替代植物二元表达载体pBI121(Clontech)的3-葡糖醛酸糖苷酶ORF来产生过表达构建体。这将烟草P450置于35S CaMV启动子的转录控制之下。将基于pBI121和pKYLX71的构建体转化入根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)株系LBA 4404并且使用已建立的方案(Horsch等人(1985)Science 227：1229-1231)将其分别导入烟草品种Petite Havana和DH98-325-6(转换子)。
Northern印迹分析
如厂商(Invitrogen)所描述的，使用法从烟草叶分离的总细胞RNA。在1.2％的于TBE缓冲液中制备的琼脂糖凝胶上按大小分级分离5至10微克的RNA。按照厂商的说明书(Roche)，使用DIG核酸标记和检测试剂盒进行RNA固定、探针标记和信号检测。备选地，按照Random Primed DNA Labeling试剂盒(Roche)附带的方案使用32P-dCTP合成探针。
来自EMS-诱变处理的植物的DNA的分离
从单株温室培养的M1植物(其来自各独立的M1种子库)的幼叶材料分离基因组DNA。1.5ml螺旋盖小瓶用于从各植物收集单个叶盘，然后在-80℃下贮存样品直至对它们进行处理。通过离心将叶组织沉积在瓶子底部，将试管置于浅量的液氮中以帮助使用研杵进行研磨。通过加入320μl提取缓冲液(200mM Tris-Cl，pH 7.5，250mM NaCl，25mMEDTA，0.5％ SDS)从研磨的材料中分离基因组DNA。将样品涡旋20秒，在室温下静置5分钟，然后在37℃下温育3分钟。将裂解的材料离心10分钟，将上清液转移至新试管中。加入50μl的蛋白沉淀溶液(Qiagen)，短暂地涡旋样品，然后置于冰上进行5分钟，然后以16,000xg离心4分钟。通过向上清液中加入0.7体积的异丙醇，然后以12,000xg离心7分钟来进行核酸的沉淀。在70％乙醇清洗后，将沉淀重悬浮于50μl TE中。
用于测序的模板的制备
CYP82E4v2和CYP82E5v2各自包含被大内含子(分别1001bp和1054bp)分隔的2个外显子。设计PCR引物以特异性扩增各基因的外显子1和外显子2。由于CYP82E2基因家族成员的cDNA之间共有高序列同源性，因此两个引物对相应于内含子序列以获得特异于期望的基因的扩增产物(归因于这样的事实，该基因家族的内含子序列远不如外显子序列保守)。CYP82E4v2的外显子1-特异性引物是5′-TGGAATTATGCCCATCCTACA-3′(正向)(SEQ ID  NO：32)和5′-CATTAGTGGTTGCACCTGAGG-3′(反向)(SEQ ID NO：33)。CYP82E4v2外显子2-特异性引物是5′-GATGAGATGTGTGCATACTTG-3′(正向)(SEQID NO：34)和5′-CCAAATTAGAAAAACTCGTACTG-3′(反向)(SEQ ID NO：35)。对于CYP82E5v2，用于扩增外显子1的特异性引物是5′-ATTGTAGGACTAGTAACCCTTACAC-3′(正向)(SEQ ID NO：36)和5′-GAGGCACAAAGAATTCTCATC-3′(反向)(SEQ ID NO：37)；对于CYP82E5v2的外显示子2，使用引物5′-GAGTAGAGGGATTGTTTCCG-3′(正向)(SEQ ID NO：38)和5′-GTACAATCAAGATAAAACATCTAAGG-3′(反向)(SEQ ID NO：39)。在96孔微量滴定板中使用1μl模板于25μl含有10pmole的各引物，200μM dNTP，1.5mM MgCl和1.4单位的高保真Taq DNA聚合酶(Roche)的反应体积中进行PCR反应。使用下述条件来进行CYP82E4v2序列的DNA扩增：最初在94℃下变性3分钟，然后进行30个循环的在94℃下变性30秒、在55℃下引物退火30秒和在72℃下延伸1.5分钟，然后在72℃下进行最后的延伸7分钟。除了退火温度为53℃外，用于CYP82E5v2基因片段的扩增条件相同。使用Millipore′s Montage PCRμ96过滤单元纯化PCR反应产物。在测序之前使用琼脂糖凝胶电泳评估经纯化的PCR产物的量和质量。
序列分析
按照厂商的说明书，使用Applied Biosystems Big Dye Version3.1在96孔版式的测序反应中将PCR产物经历循环测序。用于测序的引物(3.2pmole/反应)如下：5′-TGGAATTATGCCCATCCTACA-3′(SEQ IDNO：32)和5′-CCTATAAAAAGGAAGTTGCCG-3′(SEQ ID NO：44)(用于CYP82E4v2的外显子1的正向和反向引物)；5′-GATGAGATGTGTGCATACTTG-3′(SEQ ID NO：34)和5′-CCAAATTAGAAAAACTCGTACTG-3′(SEQ ID NO：35)(用于CYP82E4v2的外显子2的正向和反向引物)；5′-ATTGTAGGACTAGTAACCCTTACAC-3′(SEQ ID NO：36)和5′-CTCATCTTTTTTCCATTTATCATTC-3′(SEQ ID NO：45)(用于CYP82E5v2的外显子1的正向和反向引物)；和5′-CAAGGTTCGGCAGATAGTG-3′(SEQ ID NO：46)和5′-GTACAATCAAGATAAAACATCTAAGG-3′(SEQ ID NO：39)(用于CYP82E5v2的外显子2的正向和反向引物)。使用EdgeBioSystems 96孔板清洁测序反应，使用高通量Applied Biosystems 3700或3730毛细管测序仪进行分析。使用Vector NTI软件包(Invitrogen)中提供的ClustalW算法比对序列。通过对姐妹M1植物(来自相应的(cognate)M0种子批次)重复序列分析来验证假定的突变。
生物碱分析
如之前所述通过气相色谱法进行生物碱分析。简而言之，通过分离烟草叶并且将它们浸入1％乙烯利的溶液中，然后在生长室中晾干7至10天来进行生物碱分析。将处理的叶子在50℃下干燥2天，然后研磨成细粉。按照University of Kentucky建立的“LC-方案”(可在University of Kentucky的网站上在线获得，其通过引用合并入本文)使用Perkin Elmer Autosystem XL Gas Chromatograph进行烟碱、降烟碱、新烟草碱和新烟碱含量的定量测定。
实施例1：CYP82E5V2的分离的和表征
绒毛状烟草和各种烟草基因型中的烟碱转化
为了评估野生型植物的生物碱组成，使用气相色谱法测定绒毛状烟草和各种烟草基因型的绿叶和烘烤叶中烟碱和降烟碱的浓度。在绒毛状烟草中，降烟碱在绿叶和烘烤叶中都表现为主要的生物碱(表1)。转换子白肋烟品种DH-98-325-6和转换子烤烟品种SC58C在绿叶中含有低水平的降烟碱(大约3％)，但大百分比(分别地大约95和25％)的烟碱含量在叶子衰老时代谢成降烟碱(参见，表1)。降烟碱的水平在非转换子白肋烟和烤烟品种(分别地DH98-325-5和SC58NC)的绿叶和烘烤叶中都较低，尽管烟碱转化在烘烤后略微增加。
表1.绒毛状烟草和各种烟草基因型的绿叶和烘烤叶的生物碱分析。
a叶干重的百分比。
b[％降烟碱(％烟碱+％降烟碱)-1]X100。
c用0.2％乙烯利处理叶并烘烤叶直至它们变黄。
d3株植物的生物碱含量的平均值，除了SC58C(其中由于较低的转换频率而使用一株植物)外。
e括号内的值代表平均值的标准误。
缩写：GLC，绿叶转换子；NC，非转换子；SLC，衰老叶转换子。
NtabCYP82E5v2 cDNA自烟草的分离
为了鉴定来自烟草的假定的烟碱脱甲基酶基因，使用基于PCR的基因扩增策略，其中引物与NtabCYP82E3编码区的5′和3′末端互补。引物设计基于这样的观察结果，密切相关的CYP82E2基因亚家族的所有成员在紧接ATG起始信号之后和TAA终止密码子之前的区域上展示高度的DNA序列同一性(Siminszky等人(2005)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.102：14919-14924)，从而为另外的家族成员的扩增提供充分保守的引物靶位点。进行使用CYP82E3-特异性引物和允许的退火温度的PCR以从烟草绿叶cDNA文库扩增假定的烟碱脱甲基酶基因。20个随机选择的从PCR产物产生的克隆的DNA序列分析产生19个NtabCYP82E3cDNA序列和一个其DNA序列与CYP82E2基因亚家族的所有功能上得到表征的成员不同的cDNA(Siminszky等人(2005)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.102：14919-14924)。使用BLAST算法对GenBank数据库进行的同源性搜索显示代表独特DNA序列的克隆与未知功能的烟草CYP82E5v1 cDNA共有99.7％的核苷酸同一性和99.2％的预测的氨基酸同一性。根据P450命名委员会的指导方针，将cDNA命名为NtabCYP82E5v2。NtabCYP82E5v2的预测的氨基酸序列分别与NtabCYP82E2、NtabCYP82E3和NtabCYP82E4v2的序列89.2、91.9和91.3％同一。
NtabCYP82E5v2编码功能性烟碱脱甲基酶
为了确定NtabCYP82E5v2是否编码烟碱脱甲基酶活性，在WAT11酵母株系中表达NtabCYP82E5 cDNA。对WAT11株系进行工程改造以提供高效转基因表达和通过表达在半乳糖诱导型启动子的转录控制下的拟南芥P450还原酶基因ATR1来为P450介导的反应提供最佳氧化还原环境(Pompon等人(1996)Methods Enzymol.272：51-64)。从表达NtabCYP82E5v2的酵母分离的微粒体片段活跃地催化烟碱的N-脱甲基化。NtabCYP82E5v2介导的烟碱脱甲基酶反应的Km和vmax值分别为5.6±1.4μM和0.7±0.02nmol分钟-1mg-1蛋白质(平均值±标准误)。相反地，当向催化测定中加入从用空质粒转化的酵母分离的微粒体时，烟碱脱甲基酶活性不明显。
NtabCYP82E5v2来源于祖先绒毛状烟草
烟草的异源四倍体基因组由两个遗传组分组成，由林烟草贡献的S基因组和来源于绒毛状烟草的T基因组，因此这两个祖先物种中哪一个将NtabCYP82E5v2贡献给烟草还不清楚。为此，设计CYP82E5-特异性引物以扩增来自烟草和贡献NtabCYP82E5v2的祖先的CYP82E5基因的基因组片段。当从烟草或绒毛状烟草分离的基因组DNA用作模板时PCR扩增产生独特的2243bp产物，但当扩增林烟草的基因组DNA时未检测到扩增子，这表明NtabCYP82E5v2来源于绒毛状烟草。DNA序列分析显示NtabCYP82E5v2和NtomCYP82E5的基因组片段包含侧翼于604bp 5′和585bp 3′编码区的1054bp内含子并且在15个位点(其中9个和6个位点分别位于编码区和内含子内)上相异。
此外，10个随机选择的从烟草分离的基因组克隆的编码区与NtabCYP82E5v2 cDNA共有100％的核苷酸同一性，这表明NtabCYP82E5v2是位于DH98-325-6烟草中的唯一CYP82E5变体。
NtabCYP82E5v2以低水平在绿叶和黄叶中表达
为了研究植物中CYP82E5的催化作用，使用定量实时(qrt)-PCR分析测定转换子(DH98-325-6)和非转换子(DH98-325-5)白肋烟、转换子和非转换子烤烟(SC58)以及绒毛状烟草的绿叶和衰老的叶中的CYP82E5v2的转录特征谱。
表2.通过定量实时聚合酶链式反应分析进行的来源于绒毛状烟草和不同烟草基因型的绿叶和烘烤的叶的CYP82E4v2和CYP82E5v2cDNA的绝对定量。
*平均值针对于3株独立植物的1片叶，每样品3次cDNA测量(n＝9)，除了SC58C外(其中使用一株植物)(n＝3)。
*根据F测验保护最小显著差数法(Fisher’s protected LSD)，不同字母前的数字差异显著(0.05)。
NtabCYP82E5v2在所有烟草品种的绿叶或黄叶中低水平表达(参见，表2)。NtabCYP82E5v2的表达在转换子和非转换子白肋烟品种的烘烤叶中相对于在绿叶中显著增加，但在烤烟中保持未变。
NtomCYP82E5在绒毛状烟草的绿叶中的表达比在烟草中高，但在两个物种的烘烤叶之间差异不显著(表2)。为了比较CYP82E5v2的表达水平与CYP82E4v2(之前表征的烟碱脱甲基酶基因，其转录经显示在绒毛状烟草和转换子烟草的衰老的叶中急剧上调(Gavilano等人(2007)J.Biol.Chem.282：249-256))的表达水平，在用于定量CYP82E5v2mRNA的相同提取物中比较CYP82E4v2的转录物积累。在所有烟草品种、绒毛状烟草的绿叶中和在非转换子烟草植物的烘烤的叶中，NtabCYP82E5v2的转录显著高于NtabCYP82E4v2的转录。然而，在转换子烟草和绒毛状烟草的烘烤的叶中趋势相反(表2)。迄今，在两个表征的烟碱脱甲基酶基因中，CYP82E4v2是绒毛状烟草和烟草中衰老诱导的降烟碱产生中的主要因素(dominant factor)。此外，NtabCYP82E5v2的活性是烟草绿叶中烟碱转化的关键决定因素。
实施例2：对细胞色素P450基因家族成员的序列同一性
即使CYP82E5v2和CYP82E4v2都是烟碱脱甲基酶，它们彼此的序列同源性比例如CYP82E5v2与CYP82E3的序列同源性更低。
表3.CYP82E4v2烟碱脱甲基酶与已就烟碱脱甲基酶活性进行测定的其他CYP82E2蛋白之间共有的氨基酸序列同一性。CYP82E5v2和CYP82E4v2是提供的具有烟碱脱甲基酶活性的仅有的蛋白质。
  CYP82E4v6   CYP82E4v12   58-166   CYP82E3   CYP82E2v1   CYP82E2v2   CYP82E5v2
  CYP82E4v2SEQ ID NO：13 99.6％ 99.4％ 94.8％ 94.2％ 92.6％ 92.6％ 91.1％
表4.CYP82E4v2烟碱脱甲基酶与其他CYP82E2蛋白之间共有的氨基酸序列同一性。CYP82E5v2和CYP82E4v2是提供的具有烟碱脱甲基酶活性的仅有的蛋白质。
  CYP82E4v2   CYP82E3   CYP82E2
  CYP82E5v2SEQ ID NO：2 91.1％ 91.9％ 91.3％
表5.已就烟碱脱甲基酶活性进行了测定的CYP82E2基因家族成员的表达特征谱。CYP82E5v2和CYP82E4v2是提供的对于烟碱脱甲基酶活性呈阳性的仅有的蛋白质。
  CYP82E4v2   CYP82E4v6   CYP82E4v12   58-166   CYP82E3   CYP82E2v1  CYP82E2v2   CYP82E5v2
  在绿叶中极低；在乙烯诱导的衰老的叶中极高   在绿叶中较低；在乙烯诱导的衰老的叶中较高   无报导   在绿叶和乙烯诱导的衰老的叶中都极低   在绿叶和乙烯诱导的衰老的叶中都较低   在绿叶中极低；在乙烯诱导的衰老的叶中极高  无报导   在绿叶中较低；在乙烯诱导的衰老的叶中非常低
实施例3：CYP82E4V2和CYP82E5V2中的突变
获得CYP82E4v2的EMS-衍生的变体
为了促进将随机突变导入至烟草基因组内，用化学诱变剂甲烷磺酸乙酯(EMS)处理数千粒强转换子白肋烟品系DH98-325-6的种子。在田间种植大约4000株诱变的植物(M0代)，让其自花授粉。将来自各个体植物的几个荚果组合以产生分离的M1种子群体，各自相应于个体M0植物。从单株温室培养的M1植物(来自各M1种子库)的幼叶组织分离基因组DNA。为了鉴定在CYP82E4v2基因中具有突变的植物，设计特异性引物来独立地扩增基因的两个外显子的每一个。使用扩增产物的96孔高通量序列分析来获得DNA序列信息。96株个体植物的完全分析包括4个分开的96孔测序反应：外显子1的扩增产物的正向和反向测序，和外显2的PCR产物的正向和反向测序。
通过对给定的实验进行所有96个序列的多序列比对，并寻找与野生型序列的差异来鉴定突变。预期在亲本M0植物中发生的任何给定的突变以1∶2∶1的比在M1代中分离(突变型对野生型等位基因)。对于EMS诱导的突变是纯合的M1植物容易地被识别，因为多态性偏离野生型序列(在两个方向上都得到验证)。对于CYP82E4v2中的突变是杂合的M1植物预期具有突变型和野生型等位基因(各自代表50％的扩增产物)。在测序后，这样的突变的位置预期注释为“N”，因为在该位点上的荧光读数是两个可选择的碱基的混合物。使用互补引物，结合相应色谱图的目测检查发现的相同核苷酸位置上“N”的出现辨别出对于CYP82E4v2中的突变是真实杂合的植物，并且使此类真实杂合子与人工序列异常相区分。
CYP82E4v2中的突变
672株独立的M1植物的高通量序列分析导致11株在CYP82E4v2基因内具有点突变的个体的鉴定(参见，表6)。经鉴定具有CYP82E4v2突变的11株植物中有6株对于突变等位基因是纯合的(参见，表6)。所有11个突变都导致编码的蛋白质的预测的氨基酸序列的变化。
表6.在CYP82E4v2基因中具有突变的EMS处理的DH98-325-6植物的M1品系。
  植物品系  核苷酸突变*   氨基酸变化**   突变等位基因的接合性
  DH98-325-6 #101  C1372T   P458S   纯合的
  DH98-325-6 #121  G1092T   K364N   纯合的
  DH98-325-6 #164  C113T   P38L   纯合的
  DH98-325-6 #321  G601A   E201K   杂合的
  DH98-325-6 #377  G506A   R169Q   杂合的
  DH98-325-6 #569  G1375A   G459R   杂合的
  DH98-325-6 #506  G886A   E296K   杂合的
  DH98-325-6 #453  C1280T   T427I   杂合的
  DH98-325-6 #775  G986A   W329Stop   纯合的
  DH98-325-6 #610  G1126A   V376M   纯合的
  DH98-325-6 #761  G511A   D171N   纯合的
*核苷酸位置以CYP82E4v2 cDNA(参见SEQ ID NO：50)的ATG起始密码子为参照。数字左边的核苷酸表示野生型残基，而右边的核苷酸表示突变残基(例如C1372T表示位于位点1372的C残基突变成T残基)。
**氨基酸位置以CYP82E4v2多肽(参见SEQ ID NO：13)的起始甲硫氨酸为参照。数字左边的氨基酸表示野生型残基，而右边的氨基酸表示由突变等位基因产生的残基(例如，P458S表示位于蛋白质序列的位点458上的脯氨酸残基已变成丝氨酸)。“Stop”表示未成熟终止密码子的导入。
植物#775在密码子329上具有突变，其将色氨酸密码子(TGG)改变成未成熟终止密码子(TAG)。该突变使得编码的蛋白质完全丧失功能，因为酶的必需的血红素结合结构域和其他高度保守的区域位于密码子329的下游。其他植物包含影响由绝大多数P450酶共有的高度保守的基序的突变，包括：植物#101(其中紧邻血红素结合Cys氨基酸的保守的Pro残基变成Ser)；植物#164(蛋白质的高度保守的富含Pro的“铰链”区内的Pro残基变成Leu)；和植物#569(作为非常高度保守的血红素结合基序的部分的Gly残基变成Arg)。
CYP82E4v2变体的生物碱分析
对变异个体的烘烤的叶进行生物碱分析以估量突变对烟碱至降烟碱的代谢转化的影响。如表7中所示，3个个体(#101、#121和#775)显示与来自已经进行了筛选从而消除了转换子个体(TN90 LC植物)的种子批次的非转换子对照植物相似的转化率。此类植物中产生的变异CYP82E4v2酶是完全(或几乎完全)无功能的。两株植物(#164和#761)展示高转化率并且对酶活性没有不利作用。植物#164的该结果令人惊讶，因为其在界定高度保守的富含Pro的铰链基序的残基中的一个残基内包含Pro至Leu的突变。在残基376上的Val至Met的改变部分地抑制了酶的功能，因为纯合突变植物(#610)显示中间的转化表型(41.5％)。
表7.对于CYP82E4v2基因中的突变是纯合的M1植物的生物碱含量(表示为百分比干重)
  植物   烟碱   降烟碱   新烟碱   新烟草碱   转化％*
  DH98-325-6 #101   2.17   0.0376   0.00514   0.0384   1.7％
  DH98-325-6 #121   2.5   0.0333   0.00557   0.043   1.3％
  DH98-325-6 #164   0.216   0.84   0.00499   0.0532   79.5％
  DH98-325-6 #610   0.214   0.152   0.00429   0.0121   41.5％
  DH98-325-6 #761   0.214   0.999   0.00429   0.0426   82.4％
  DH98-325-6 #775   0.505   0.0159   0.00417   0.0136   3.1％
  SC58 CtCt(对照)   0.206   0.565   0.00412   0.0197   73.3％
  TN90 LC(对照)   3.11   0.0647   0.00901   0.0487   2.0％
  TN90 LC(对照)   2.46   0.0521   0.00846   0.0417   2.1％
*[％ 降烟碱/(％烟碱+％降烟碱)]X100
烤烟基因型SC58的转换子植物用作强转换子对照；选自就低转换子(LC)进行筛选的批次的两株基因型TN90的植物用作非转换子对照。
植物#121的位点364上的Lys残基至Asn的置换不在P450酶间保守的任何基序中发生，也不在由Xu等人(Physiologia Plantarum129：307-319，2007)预测为底物识别部位的任何区域内发生。针对保存在GenBank中的蛋白质序列的BLAST比对显示几种在类似的位点上具有Asn残基的P450(例如豌豆的CYP82A1基因-登录号Q43068)。植物#121中的变异CYP82E4v2基因是完全失活的。植物#121的另一个异常在于EMS-诱导的突变的性质。EMS已知通过G残基的烷基化诱导突变(导致G至A或C至T的转换突变)(Anderson，Methods Cell Biol.48：31-58，1995)。EMS极少导致G至T的颠换突变例如植物#121中发现的颠换突变(参见，表3)。对于CYP82E4v2或CYP82E5v2基因所描述的所有其他突变是预期中的G至A或C至T的转换突变。
CYP82E5v2中的突变
将相似的高通量测序策略用于鉴定CYP82E5v2(烟草基因组中发现的另一种经验证的烟碱N-脱甲基酶基因)中的突变。768株M1植物的筛选显示11个在CYP82E5v2中具有突变的个体(参见，表8)。3株植物(#744、#561和#340)包含不改变预测的蛋白质序列的沉默核苷酸置换。在导致蛋白质序列发生变化的8个突变中，特别注意到2个。植物#1013包含导致使产物完全无功能的截断的产物的突变。位点1266上的G至A的突变将Trp密码子(TGG)变成未成熟终止密码子(TGA)。从该截断的阅读框产生的预测的CYP82E5v2蛋白缺少酶的最后96个氨基酸(包括必需的血红素结合结构域的区域)。不受机制限制，该截断的蛋白质可能不能催化烟碱的N′甲基的氧化消除(以形成降烟碱)。无论什么机制，#1013植物都具有无功能的CYP82E5v2等位基因。植物#680具有将位点449上的Pro残基变成Leu的突变。该Pro在植物P450中是非常保守的并且紧邻界定血红素结合区域的F-x-x-G-x-R-x-C-x-G基序。植物#680中发现的突变对酶的功能具有负面影响。
表8.在CYP82E5v2基因中具有突变的EMS处理的DH98-325-6植物的M1品系
  植物品系  核苷酸突变*   氨基酸变化**   突变等位基因的接合性
  DH98-325-6 #198  C703T   P235S   杂合的
  DH98-325-6 #680  C1346T   P449L   纯合的
  DH98-325-6 #744  G558A   无   纯合的
  DH98-325-6 #163  C521T   S174L   杂合的
  DH98-325-6 #561  G1458A   无   杂合的
  DH98-325-6 #154  C1229T   A410V   杂合的
  DH98-325-6 #340  G1248A   无   杂合的
  DH98-325-6 #780  G672A   M224I   杂合的
  DH98-325-6 #799  C215T   P72L   杂合的
  DH98-325-6 #540  C427T   L143F   杂合的
  DH98-325-6 #1013  G1266A   W422Stop   纯合的
*核苷酸位置以CYP82E5v2 cDNA(参见SEQ ID NO：1)的ATG起始密码子为参照。数字左边的核苷酸表示野生型残基，而右边的核苷酸表示突变残基(例如C703T表示位于位点703的C残基突变成T残基)。
**氨基酸位置以CYP82E5v2多肽(参见SEQ ID NO：2)的起始甲硫氨酸为参照。数字左边的氨基酸表示野生型残基，而右边的氨基酸表示由突变等位基因产生的残基(例如，P235S表示位于蛋白质序列的位点235上的脯氨酸残基已变成丝氨酸)。“Stop”表示未成熟终止密码子的导入。“无”表示导致不改变预测的氨基酸序列的沉默置换的突变。
在CYP82E4v2和CYP82E5v2中具有突变的植物
当将具有抑制CYP82E4v2的烟碱脱甲基酶活性的突变的植物与具有抑制CYP82E5v2的烟碱脱甲基酶活性的突变的植物杂交时，产生这样的烟草植物品系，其在环境影响的限度内对于烟碱至降烟碱的减少的转化(大约0.5％的水平)显示一致性和稳定性。
示例性杂交是CYP82E4v2突变植物(表9的)与CYP82E5v2突变植物(表9的)之间的杂交。
表9.在CYP82E5v2和CYP82E4v2基因中具有突变的DH98-325-6植物的示例性杂交。
本说明书中提及的所有公开案和专利申请表示本发明所属领域的技术人员的水平。所有公开案和专利申请通过引用合并入本文，其引用程度就如同已明确地且单独地将各个公开案或专利申请通过引用合并入本文。
虽然为了清楚理解的目的，已通过举例说明和实施例的方式对上述发明进行了相当详细的描述，但很明显可在所附权利要求的范围内实施某些改变和修饰。
序列表
<110>Dewey，Ralph E.
     Siminszky，Balazs
     Bowen，Steven W.
     Gavilano，Lily
<120>通过修饰特定细胞色素P450基因改变烟草生物碱含量
<130>035051/364220
<150>60/987,243
<151>2007-11-12
<160>50
<170>PatentIn version 3.5
<210>1
<211>1554
<212>DNA
<213>普通烟草(Nicotiana tabacum)
<400>1
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<210>2
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<212>PRT
<213>普通烟草
<400>2
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     50                  55                  60
Asp Leu Ala Asp Lys Tyr Gly Pro Val Phe Thr Phe Arg Leu Gly Leu
 65                  70                  75                  80
Pro Leu Val Leu Val Val Ser Ser Tyr Glu Ala Val Lys Asp Cys Phe
                 85                  90                  95
Ser Thr Asn Asp Ala Ile Phe Ser Asn Arg Pro Ala Phe Leu Tyr Gly
            100                 105                 110
Glu Tyr Leu Gly Tyr Ser Asn Ala Met Leu Phe Leu Thr Lys Tyr Gly
        115                 120                 125
Pro Tyr Trp Arg Lys Asn Arg Lys Leu Val Ile Gln Glu Val Leu Ser
    130                 135                 140
Ala Ser Arg Leu Glu Lys Leu Lys His Val Arg Phe Gly Lys Ile Gln
145                 150                 155                 160
Thr Ser Ile Lys Ser Leu Tyr Thr Arg Ile Asp Gly Asn Ser Ser Thr
                165                 170                 175
Ile Asn Leu Thr Asp Trp Leu Glu Glu Leu Asn Phe Gly Leu Ile Val
            180                 185                 190
Lys Met Ile Ala Gly Lys Asn Tyr Glu Ser Gly Lys Gly Asp Glu Gln
        195                 200                 205
Val Glu Arg Phe Arg Lys Ala Phe Lys Asp Phe Ile Ile Leu Ser Met
    210                 215                 220
Glu Phe Val Leu Trp Asp Ala Phe Pro Ile Pro Leu Phe Lys Trp Val
225                 230                 235                 240
Asp Phe Gln Gly His Val Lys Ala Met Lys Arg Thr Phe Lys Asp Ile
                245                 250                 255
Asp Ser Val Phe Gln Asn Trp Leu Glu Glu His Val Lys Lys Arg Glu
            260                 265                 270
Lys Met Glu Val Asn Ala Gln Gly Asn Glu Gln Asp Phe Ile Asp Val
         275                 280                 285
Val Leu Ser Lys Met Ser Asn Glu Tyr Leu Asp Glu Gly Tyr Ser Arg
    290                 295                 300
Asp Thr Val Ile Lys Ala Thr Val Phe Ser Leu Val Leu Asp Ala Ala
305                 310                 315                 320
Asp Thr Val Ala Leu His Met Asn Trp Gly Met Ala Leu Leu Ile Asn
                325                 330                 335
Asn Gln His Ala Leu Lys Lys Ala Gln Glu Glu Ile Asp Lys Lys Val
            340                 345                 350
Gly Lys Glu Arg Trp Val Glu Glu Ser Asp Ile Lys Asp Leu Val Tyr
        355                 360                 365
Leu Gln Ala Ile Val Lys Glu Val Leu Arg Leu Tyr Pro Pro Gly Pro
    370                 375                 380
Leu Leu Val Pro His Glu Asn Val Glu Asp Cys Val Val Ser Gly Tyr
385                 390                 395                 400
His Ile Pro Lys Gly Thr Arg Leu Phe Ala Asn Val Met Lys Leu Gln
                405                 410                 415
Arg Asp Pro Lys Leu Trp Ser Asn Pro Asp Lys Phe Asp Pro Glu Arg
            420                 425                 430
Phe Phe Ala Asp Asp Ile Asp Tyr Arg Gly Gln His Tyr Glu Phe Ile
        435                 440                 445
Leu Phe Gly Ser Gly Arg Arg Ser Cys Pro Gly Met Thr Tyr Ala Leu
    450                 455                 460
Gln Ala Glu His Leu Thr Ile Ala His Leu Ile Gln Gly Phe Asn Tyr
465                 470                 475                 480
Lys Thr Pro Asn Asp Glu Pro Leu Asp Met Lys Glu Gly Ala Gly Leu
                485                 490                 495
Thr Ile Arg Lys Val Asn Pro Val Glu Val Thr Ile Thr Ala Arg Leu
            500                 505                 510
Ala Pro Glu Leu Tyr
        515
<210>7
<211>517
<212>PRT
<213>普通烟草
<400>7
Met Val Ser Pro Val Glu Ala Ile Val Gly Leu Val Thr Leu Thr Leu
  1               5                  10                  15
Leu Phe Tyr Phe Leu Trp Pro Lys Lys Phe Gln Ile Pro Ser Lys Pro
             20                  25                  30
Leu Pro Pro Lys Ile Pro Gly Gly Trp Pro Val Ile Gly His Leu Phe
         35                  40                  45
Tyr Phe Asp Asp Asp Gly Asp Asp Arg Pro Leu Ala Arg Lys Leu Gly
     50                  55                  60
Asp Leu Ala Asp Lys Tyr Gly Pro Val Phe Thr Phe Arg Leu Gly Leu
 65                  70                  75                  80
Pro Leu Val Leu Val Val Ser Ser Tyr Glu Ala Val Lys Asp Cys Phe
                 85                  90                  95
Ser Thr Asn Asp Ala Ile Phe Ser Asn Arg Pro Ala Phe Leu Tyr Gly
            100                 105                 110
Glu Tyr Leu Gly Tyr Ser Asn Ala Met Leu Phe Leu Thr Lys Tyr Gly
        115                 120                 125
Pro Tyr Trp Arg Lys Asn Arg Lys Leu Val Ile Gln Glu Val Leu Ser
    130                 135                 140
Ala Ser Arg Leu Glu Lys Leu Lys His Val Arg Phe Gly Lys Ile Gln
145                 150                 155                 160
Thr Ser Ile Lys Ser Leu Tyr Thr Arg Ile Asp Gly Asn Leu Ser Thr
                165                 170                 175
Ile Asn Leu Thr Asp Trp Leu Glu Glu Leu Asn Phe Gly Leu Ile Val
            180                 185                 190
Lys Met Ile Ala Gly Lys Asn Tyr Glu Ser Gly Lys Gly Asp Glu Gln
        195                 200                 205
Val Glu Arg Phe Arg Lys Ala Phe Lys Asp Phe Ile Ile Leu Ser Met
    210                 215                 220
Glu Phe Val Leu Trp Asp Ala Phe Pro Ile Pro Leu Phe Lys Trp Val
225                 230                 235                 240
Asp Phe Gln Gly His Val Lys Ala Met Lys Arg Thr Phe Lys Asp Ile
                245                 250                 255
Asp Ser Val Phe Gln Asn Trp Leu Glu Glu His Val Lys Lys Arg Glu
            260                 265                 270
Lys Met Glu Val Asn Ala Gln Gly Asn Glu Gln Asp Phe Ile Asp Val
        275                 280                 285
Val Leu Ser Lys Met Ser Asn Glu Tyr Leu Asp Glu Gly Tyr Ser Arg
    290                 295                 300
Asp Thr Val Ile Lys Ala Thr Val Phe Ser Leu Val Leu Asp Ala Ala
305                 310                 315                 320
Asp Thr Val Ala Leu His Met Asn Trp Gly Met Ala Leu Leu Ile Asn
                325                 330                 335
Asn Gln His Ala Leu Lys Lys Ala Gln Glu Glu Ile Asp Lys Lys Val
            340                 345                 350
Gly Lys Glu Arg Trp Val Glu Glu Ser Asp Ile Lys Asp Leu Val Tyr
        355                 360                 365
Leu Gln Ala Ile Val Lys Glu Val Leu Arg Leu Tyr Pro Pro Gly Pro
    370                 375                 380
Leu Leu Val Pro His Glu Asn Val Glu Asp Cys Val Val Ser Gly Tyr
385                 390                 395                 400
His Ile Pro Lys Gly Thr Arg Leu Phe Ala Asn Val Met Lys Leu Gln
                405                 410                 415
Arg Asp Pro Lys Leu Trp Ser Asn Pro Asp Lys Phe Asp Pro Glu Arg
            420                 425                 430
Phe Phe Ala Asp Asp Ile Asp Tyr Arg Gly Gln His Tyr Glu Phe Ile
        435                 440                 445
Pro Phe Gly Ser Gly Arg Arg Ser Cys Pro Gly Met Thr Tyr Ala Leu
    450                 455                 460
Gln Ala Glu His Leu Thr Ile Ala His Leu Ile Gln Gly Phe Asn Tyr
465                 470                 475                 480
Lys Thr Pro Asn Asp Glu Pro Leu Asp Met Lys Glu Gly Ala Gly Leu
                485                 490                 495
Thr Ile Arg Lys Val Asn Pro Val Glu Val Thr Ile Thr Ala Arg Leu
            500                 505                 510
Ala Pro Glu Leu Tyr
        515
<210>8
<211>517
<212>PRT
<213>普通烟草
<400>8
Met Val Ser Pro Val Glu Ala Ile Val Gly Leu Val Thr Leu Thr Leu
  1               5                  10                  15
Leu Phe Tyr Phe Leu Trp Pro Lys Lys Phe Gln Ile Pro Ser Lys Pro
             20                  25                  30
Leu Pro Pro Lys Ile Pro Gly Gly Trp Pro Val Ile Gly His Leu Phe
         35                  40                  45
Tyr Phe Asp Asp Asp Gly Asp Asp Arg Pro Leu Ala Arg Lys Leu Gly
     50                  55                  60
Asp Leu Ala Asp Lys Tyr Gly Pro Val Phe Thr Phe Arg Leu Gly Leu
 65                  70                  75                  80
Pro Leu Val Leu Val Val Ser Ser Tyr Glu Ala Val Lys Asp Cys Phe
                 85                  90                  95
Ser Thr Asn Asp Ala Ile Phe Ser Asn Arg Pro Ala Phe Leu Tyr Gly
            100                 105                 110
Glu Tyr Leu Gly Tyr Ser Asn Ala Met Leu Phe Leu Thr Lys Tyr Gly
        115                 120                 125
Pro Tyr Trp Arg Lys Asn Arg Lys Leu Val Ile Gln Glu Val Leu Ser
    130                 135                 140
Ala Ser Arg Leu Glu Lys Leu Lys His Val Arg Phe Gly Lys Ile Gln
145                 150                 155                 160
Thr Ser Ile Lys Ser Leu Tyr Thr Arg Ile Asp Gly Asn Ser Ser Thr
                165                 170                 175
Ile Asn Leu Thr Asp Trp Leu Glu Glu Leu Asn Phe Gly Leu Ile Val
            180                 185                 190
Lys Met Ile Ala Gly Lys Asn Tyr Glu Ser Gly Lys Gly Asp Glu Gln
        195                 200                 205
Val Glu Arg Phe Arg Lys Ala Phe Lys Asp Phe Ile Ile Leu Ser Met
    210                 215                 220
Glu Phe Val Leu Trp Asp Ala Phe Pro Ile Pro Leu Phe Lys Trp Val
225                 230                 235                 240
Asp Phe Gln Gly His Val Lys Ala Met Lys Arg Thr Phe Lys Asp Ile
                245                 250                 255
Asp Ser Val Phe Gln Asn Trp Leu Glu Glu His Val Lys Lys Arg Glu
            260                 265                 270
Lys Met Glu Val Asn Ala Gln Gly Asn Glu Gln Asp Phe Ile Asp Val
        275                 280                 285
Val Leu Ser Lys Met Ser Asn Glu Tyr Leu Asp Glu Gly Tyr Ser Arg
    290                 295                 300
Asp Thr Val Ile Lys Ala Thr Val Phe Ser Leu Val Leu Asp Ala Ala
305                 310                 315                 320
Asp Thr Val Ala Leu His Met Asn Trp Gly Met Ala Leu Leu Ile Asn
                325                 330                 335
Asn Gln His Ala Leu Lys Lys Ala Gln Glu Glu Ile Asp Lys Lys Val
            340                 345                 350
Gly Lys Glu Arg Trp Val Glu Glu Ser Asp Ile Lys Asp Leu Val Tyr
        355                 360                 365
Leu Gln Ala Ile Val Lys Glu Val Leu Arg Leu Tyr Pro Pro Gly Pro
    370                 375                 380
Leu Leu Val Pro His Glu Asn Val Glu Asp Cys Val Val Ser Gly Tyr
385                 390                 395                 400
His Ile Pro Lys Gly Thr Arg Leu Phe Val Asn Val Met Lys Leu Gln
                405                 410                 415
Arg Asp Pro Lys Leu Trp Ser Asn Pro Asp Lys Phe Asp Pro Glu Arg
            420                 425                 430
Phe Phe Ala Asp Asp Ile Asp Tyr Arg Gly Gln His Tyr Glu Phe Ile
        435                 440                 445
Pro Phe Gly Ser Gly Arg Arg Ser Cys Pro Gly Met Thr Tyr Ala Leu
    450                 455                 460
Gln Ala Glu His Leu Thr Ile Ala His Leu Ile Gln Gly Phe Asn Tyr
465                 470                 475                 480
Lys Thr Pro Asn Asp Glu Pro Leu Asp Met Lys Glu Gly Ala Gly Leu
                485                 490                 495
Thr Ile Arg Lys Val Asn Pro Val Glu Val Thr Ile Thr Ala Arg Leu
            500                 505                 510
Ala Pro Glu Leu Tyr
        515
<210>9
<211>517
<212>PRT
<213>普通烟草
<400>9
Met Val Ser Pro Val Glu Ala Ile Val Gly Leu Val Thr Leu Thr Leu
  1               5                  10                  15
Leu Phe Tyr Phe Leu Trp Pro Lys Lys Phe Gln Ile Pro Ser Lys Pro
             20                  25                  30
Leu Pro Pro Lys Ile Pro Gly Gly Trp Pro Val Ile Gly His Leu Phe
         35                  40                  45
Tyr Phe Asp Asp Asp Gly Asp Asp Arg Pro Leu Ala Arg Lys Leu Gly
     50                  55                  60
Asp Leu Ala Asp Lys Tyr Gly Pro Val Phe Thr Phe Arg Leu Gly Leu
 65                  70                  75                  80
Pro Leu Val Leu Val Val Ser Ser Tyr Glu Ala Val Lys Asp Cys Phe
                 85                  90                  95
Ser Thr Asn Asp Ala Ile Phe Ser Asn Arg Pro Ala Phe Leu Tyr Gly
            100                 105                 110
Glu Tyr Leu Gly Tyr Ser Asn Ala Met Leu Phe Leu Thr Lys Tyr Gly
        115                 120                 125
Pro Tyr Trp Arg Lys Asn Arg Lys Leu Val Ile Gln Glu Val Leu Ser
    130                 135                 140
Ala Ser Arg Leu Glu Lys Leu Lys His Val Arg Phe Gly Lys Ile Gln
145                 150                 155                 160
Thr Ser Ile Lys Ser Leu Tyr Thr Arg Ile Asp Gly Asn Ser Ser Thr
                165                 170                 175
Ile Asn Leu Thr Asp Trp Leu Glu Glu Leu Asn Phe Gly Leu Ile Val
            180                 185                 190
Lys Met Ile Ala Gly Lys Asn Tyr Glu Ser Gly Lys Gly Asp Glu Gln
        195                 200                 205
Val Glu Arg Phe Arg Lys Ala Phe Lys Asp Phe Ile Ile Leu Ser Ile
    210                 215                 220
Glu Phe Val Leu Trp Asp Ala Phe Pro Ile Pro Leu Phe Lys Trp Val
225                 230                 235                 240
Asp Phe Gln Gly His Val Lys Ala Met Lys Arg Thr Phe Lys Asp Ile
                245                 250                 255
Asp Ser Val Phe Gln Asn Trp Leu Glu Glu His Val Lys Lys Arg Glu
            260                 265                 270
Lys Met Glu Val Asn Ala Gln Gly Asn Glu Gln Asp Phe Ile Asp Val
        275                 280                 285
Val Leu Ser Lys Met Ser Asn Glu Tyr Leu Asp Glu Gly Tyr Ser Arg
    290                 295                 300
Asp Thr Val Ile Lys Ala Thr Val Phe Ser Leu Val Leu Asp Ala Ala
305                 310                 315                 320
Asp Thr Val Ala Leu His Met Asn Trp Gly Met Ala Leu Leu Ile Asn
                325                 330                 335
Asn Gln His Ala Leu Lys Lys Ala Gln Glu Glu Ile Asp Lys Lys Val
            340                 345                 350
Gly Lys Glu Arg Trp Val Glu Glu Ser Asp Ile Lys Asp Leu Val Tyr
        355                 360                 365
Leu Gln Ala Ile Val Lys Glu Val Leu Arg Leu Tyr Pro Pro Gly Pro
    370                 375                 380
Leu Leu Val Pro His Glu Asn Val Glu Asp Cys Val Val Ser Gly Tyr
385                 390                 395                 400
His Ile Pro Lys Gly Thr Arg Leu Phe Ala Asn Val Met Lys Leu Gln
                405                 410                 415
Arg Asp Pro Lys Leu Trp Ser Asn Pro Asp Lys Phe Asp Pro Glu Arg
            420                 425                 430
Phe Phe Ala Asp Asp Ile Asp Tyr Arg Gly Gln His Tyr Glu Phe Ile
        435                 440                 445
Pro Phe Gly Ser Gly Arg Arg Ser Cys Pro Gly Met Thr Tyr Ala Leu
    450                 455                 460
Gln Ala Glu His Leu Thr Ile Ala His Leu Ile Gln Gly Phe Asn Tyr
465                 470                 475                 480
Lys Thr Pro Asn Asp Glu Pro Leu Asp Met Lys Glu Gly Ala Gly Leu
                485                 490                 495
Thr Ile Arg Lys Val Asn Pro Val Glu Val Thr Ile Thr Ala Arg Leu
            500                 505                 510
Ala Pro Glu Leu Tyr
        515
<210>10
<211>517
<212>PRT
<213>普通烟草
<400>10
Met Val Ser Pro Val Glu Ala Ile Val Gly Leu Val Thr Leu Thr Leu
  1               5                  10                  15
Leu Phe Tyr Phe Leu Trp Pro Lys Lys Phe Gln Ile Pro Ser Lys Pro
             20                  25                  30
Leu Pro Pro Lys Ile Pro Gly Gly Trp Pro Val Ile Gly His Leu Phe
         35                  40                  45
Tyr Phe Asp Asp Asp Gly Asp Asp Arg Pro Leu Ala Arg Lys Leu Gly
     50                  55                  60
Asp Leu Ala Asp Lys Tyr Gly Leu Val Phe Thr Phe Arg Leu Gly Leu
 65                  70                  75                  80
Pro Leu Val Leu Val Val Ser Ser Tyr Glu Ala Val Lys Asp Cys Phe
                 85                  90                  95
Ser Thr Asn Asp Ala Ile Phe Ser Asn Arg Pro Ala Phe Leu Tyr Gly
            100                 105                 110
Glu Tyr Leu Gly Tyr Ser Asn Ala Met Leu Phe Leu Thr Lys Tyr Gly
        115                 120                 125
Pro Tyr Trp Arg Lys Asn Arg Lys Leu Val Ile Gln Glu Val Leu Ser
    130                 135                 140
Ala Ser Arg Leu Glu Lys Leu Lys His Val Arg Phe Gly Lys Ile Gln
145                 150                 155                 160
Thr Ser Ile Lys Ser Leu Tyr Thr Arg Ile Asp Gly Asn Ser Ser Thr
                165                 170                 175
Ile Asn Leu Thr Asp Trp Leu Glu Glu Leu Asn Phe Gly Leu Ile Val
            180                 185                 190
Lys Met Ile Ala Gly Lys Asn Tyr Glu Ser Gly Lys Gly Asp Glu Gln
        195                 200                 205
Val Glu Arg Phe Arg Lys Ala Phe Lys Asp Phe Ile Ile Leu Ser Met
    210                 215                 220
Glu Phe Val Leu Trp Asp Ala Phe Pro Ile Pro Leu Phe Lys Trp Val
225                 230                 235                 240
Asp Phe Gln Gly His Val Lys Ala Met Lys Arg Thr Phe Lys Asp Ile
                245                 250                 255
Asp Ser Val Phe Gln Asn Trp Leu Glu Glu His Val Lys Lys Arg Glu
            260                 265                 270
Lys Met Glu Val Asn Ala Gln Gly Asn Glu Gln Asp Phe Ile Asp Val
        275                 280                 285
Val Leu Ser Lys Met Ser Asn Glu Tyr Leu Asp Glu Gly Tyr Ser Arg
    290                 295                 300
Asp Thr Val Ile Lys Ala Thr Val Phe Ser Leu Val Leu Asp Ala Ala
305                 310                 315                 320
Asp Thr Val Ala Leu His Met Asn Trp Gly Met Ala Leu Leu Ile Asn
                325                 330                 335
Asn Gln His Ala Leu Lys Lys Ala Gln Glu Glu Ile Asp Lys Lys Val
            340                 345                 350
Gly Lys Glu Arg Trp Val Glu Glu Ser Asp Ile Lys Asp Leu Val Tyr
        355                 360                 365
Leu Gln Ala Ile Val Lys Glu Val Leu Arg Leu Tyr Pro Pro Gly Pro
    370                 375                 380
Leu Leu Val Pro His Glu Asn Val Glu Asp Cys Val Val Ser Gly Tyr
385                 390                 395                 400
His Ile Pro Lys Gly Thr Arg Leu Phe Ala Asn Val Met Lys Leu Gln
                405                 410                 415
Arg Asp Pro Lys Leu Trp Ser Asn Pro Asp Lys Phe Asp Pro Glu Arg
            420                 425                 430
Phe Phe Ala Asp Asp Ile Asp Tyr Arg Gly Gln His Tyr Glu Phe Ile
        435                 440                 445
Pro Phe Gly Ser Gly Arg Arg Ser Cys Pro Gly Met Thr Tyr Ala Leu
    450                 455                 460
Gln Ala Glu His Leu Thr Ile Ala His Leu Ile Gln Gly Phe Asn Tyr
465                 470                 475                 480
Lys Thr Pro Asn Asp Glu Pro Leu Asp Met Lys Glu Gly Ala Gly Leu
                485                 490                 495
Thr Ile Arg Lys Val Asn Pro Val Glu Val Thr Ile Thr Ala Arg Leu
            500                 505                 510
Ala Pro Glu Leu Tyr
        515
<210>11
<211>517
<212>PRT
<213>普通烟草
<400>11
Met Val Ser Pro Val Glu Ala Ile Val Gly Leu Val Thr Leu Thr Leu
  1               5                  10                  15
Leu Phe Tyr Phe Leu Trp Pro Lys Lys Phe Gln Ile Pro Ser Lys Pro
             20                  25                  30
Leu Pro Pro Lys Ile Pro Gly Gly Trp Pro Val Ile Gly His Leu Phe
         35                  40                  45
Tyr Phe Asp Asp Asp Gly Asp Asp Arg Pro Leu Ala Arg Lys Leu Gly
     50                  55                  60
Asp Leu Ala Asp Lys Tyr Gly Pro Val Phe Thr Phe Arg Leu Gly Leu
 65                  70                  75                  80
Pro Leu Val Leu Val Val Ser Ser Tyr Glu Ala Val Lys Asp Cys Phe
                 85                  90                  95
Ser Thr Asn Asp Ala Ile Phe Ser Asn Arg Pro Ala Phe Leu Tyr Gly
            100                 105                 110
Glu Tyr Leu Gly Tyr Ser Asn Ala Met Leu Phe Leu Thr Lys Tyr Gly
        115                 120                 125
Pro Tyr Trp Arg Lys Asn Arg Lys Leu Val Ile Gln Glu Val Phe Ser
    130                 135                 140
Ala Ser Arg Leu Glu Lys Leu Lys His Val Arg Phe Gly Lys Ile Gln
145                 150                 155                 160
Thr Ser Ile Lys Ser Leu Tyr Thr Arg Ile Asp Gly Asn Ser Ser Thr
                165                 170                 175
Ile Asn Leu Thr Asp Trp Leu Glu Glu Leu Asn Phe Gly Leu Ile Val
            180                 185                 190
Lys Met Ile Ala Gly Lys Asn Tyr Glu Ser Gly Lys Gly Asp Glu Gln
        195                 200                 205
Val Glu Arg Phe Arg Lys Ala Phe Lys Asp Phe Ile Ile Leu Ser Met
    210                 215                 220
Glu Phe Val Leu Trp Asp Ala Phe Pro Ile Pro Leu Phe Lys Trp Val
225                 230                 235                 240
Asp Phe Gln Gly His Val Lys Ala Met Lys Arg Thr Phe Lys Asp Ile
                245                 250                 255
Asp Ser Val Phe Gln Asn Trp Leu Glu Glu His Val Lys Lys Arg Glu
            260                 265                 270
Lys Met Glu Val Asn Ala Gln Gly Asn Glu Gln Asp Phe Ile Asp Val
        275                 280                 285
Val Leu Ser Lys Met Ser Asn Glu Tyr Leu Asp Glu Gly Tyr Ser Arg
    290                 295                 300
Asp Thr Val Ile Lys Ala Thr Val Phe Ser Leu Val Leu Asp Ala Ala
305                 310                 315                 320
Asp Thr Val Ala Leu His Met Asn Trp Gly Met Ala Leu Leu Ile Asn
                325                 330                 335
Asn Gln His Ala Leu Lys Lys Ala Gln Glu Glu Ile Asp Lys Lys Val
            340                 345                 350
Gly Lys Glu Arg Trp Val Glu Glu Ser Asp Ile Lys Asp Leu Val Tyr
        355                 360                 365
Leu Gln Ala Ile Val Lys Glu Val Leu Arg Leu Tyr Pro Pro Gly Pro
    370                 375                 380
Leu Leu Val Pro His Glu Asn Val Glu Asp Cys Val Val Ser Gly Tyr
385                 390                 395                 400
His Ile Pro Lys Gly Thr Arg Leu Phe Ala Asn Val Met Lys Leu Gln
                405                 410                 415
Arg Asp Pro Lys Leu Trp Ser Asn Pro Asp Lys Phe Asp Pro Glu Arg
            420                 425                 430
Phe Phe Ala Asp Asp Ile Asp Tyr Arg Gly Gln His Tyr Glu Phe Ile
        435                 440                 445
Pro Phe Gly Ser Gly Arg Arg Ser Cys Pro Gly Met Thr Tyr Ala Leu
    450                 455                 460
Gln Ala Glu His Leu Thr Ile Ala His Leu Ile Gln Gly Phe Asn Tyr
465                 470                 475                 480
Lys Thr Pro Asn Asp Glu Pro Leu Asp Met Lys Glu Gly Ala Gly Leu
                485                 490                 495
Thr Ile Arg Lys Val Asn Pro Val Glu Val Thr Ile Thr Ala Arg Leu
            500                 505                 510
Ala Pro Glu Leu Tyr
        515
<210>12
<211>421
<212>PRT
<213>普通烟草
<400>12
Met Val Ser Pro Val Glu Ala Ile Val Gly Leu Val Thr Leu Thr Leu
  1               5                  10                  15
Leu Phe Tyr Phe Leu Trp Pro Lys Lys Phe Gln Ile Pro Ser Lys Pro
             20                  25                  30
Leu Pro Pro Lys Ile Pro Gly Gly Trp Pro Val Ile Gly His Leu Phe
         35                  40                  45
Tyr Phe Asp Asp Asp Gly Asp Asp Arg Pro Leu Ala Arg Lys Leu Gly
     50                  55                  60
Asp Leu Ala Asp Lys Tyr Gly Pro Val Phe Thr Phe Arg Leu Gly Leu
 65                  70                  75                  80
Pro Leu Val Leu Val Val Ser Ser Tyr Glu Ala Val Lys Asp Cys Phe
                 85                  90                  95
Ser Thr Asn Asp Ala Ile Phe Ser Asn Arg Pro Ala Phe Leu Tyr Gly
            100                 105                 110
Glu Tyr Leu Gly Tyr Ser Asn Ala Met Leu Phe Leu Thr Lys Tyr Gly
        115                 120                 125
Pro Tyr Trp Arg Lys Asn Arg Lys Leu Val Ile Gln Glu Val Leu Ser
    130                 135                 140
Ala Ser Arg Leu Glu Lys Leu Lys His Val Arg Phe Gly Lys Ile Gln
145                 150                 155                 160
Thr Ser Ile Lys Ser Leu Tyr Thr Arg Ile Asp Gly Asn Ser Ser Thr
                165                 170                 175
Ile Asn Leu Thr Asp Trp Leu Glu Glu Leu Asn Phe Gly Leu Ile Val
             180                 185                 190
Lys Met Ile Ala Gly Lys Asn Tyr Glu Ser Gly Lys Gly Asp Glu Gln
        195                 200                 205
Val Glu Arg Phe Arg Lys Ala Phe Lys Asp Phe Ile Ile Leu Ser Met
    210                 215                 220
Glu Phe Val Leu Trp Asp Ala Phe Pro Ile Pro Leu Phe Lys Trp Val
225                 230                 235                 240
Asp Phe Gln Gly His Val Lys Ala Met Lys Arg Thr Phe Lys Asp Ile
                245                 250                 255
Asp Ser Val Phe Gln Asn Trp Leu Glu Glu His Val Lys Lys Arg Glu
            260                 265                 270
Lys Met Glu Val Asn Ala Gln Gly Asn Glu Gln Asp Phe Ile Asp Val
        275                 280                 285
Val Leu Ser Lys Met Ser Asn Glu Tyr Leu Asp Glu Gly Tyr Ser Arg
    290                 295                 300
Asp Thr Val Ile Lys Ala Thr Val Phe Ser Leu Val Leu Asp Ala Ala
305                 310                 315                 320
Asp Thr Val Ala Leu His Met Asn Trp Gly Met Ala Leu Leu Ile Asn
                325                 330                 335
Asn Gln His Ala Leu Lys Lys Ala Gln Glu Glu Ile Asp Lys Lys Val
            340                 345                 350
Gly Lys Glu Arg Trp Val Glu Glu Ser Asp Ile Lys Asp Leu Val Tyr
        355                 360                 365
Leu Gln Ala Ile Val Lys Glu Val Leu Arg Leu Tyr Pro Pro Gly Pro
    370                 375                 380
Leu Leu Val Pro His Glu Asn Val Glu Asp Cys Val Val Ser Gly Tyr
385                 390                 395                 400
His Ile Pro Lys Gly Thr Arg Leu Phe Ala Asn Val Met Lys Leu Gln
                405                 410                 415
Arg Asp Pro Lys Leu
            420
<210>13
<211>517
<212>PRT
<213>普通烟草
<400>13
Met Leu Ser Pro Ile Glu Ala Ile Val Gly Leu Val Thr Phe Thr Phe
  1               5                  10                  15
Leu Phe Phe Phe Leu Trp Thr Lys Lys Ser Gln Lys Pro Ser Lys Pro
             20                  25                  30
Leu Pro Pro Lys Ile Pro Gly Gly Trp Pro Val Ile Gly His Leu Phe
         35                  40                  45
His Phe Asn Asp Asp Gly Asp Asp Arg Pro Leu Ala Arg Lys Leu Gly
     50                  55                  60
Asp Leu Ala Asp Lys Tyr Gly Pro Val Phe Thr Phe Arg Leu Gly Leu
 65                  70                  75                  80
Pro Leu Val Leu Val Val Ser Ser Tyr Glu Ala Val Lys Asp Cys Phe
                 85                  90                  95
Ser Thr Asn Asp Ala Ile Phe Ser Ash Arg Pro Ala Phe Leu Tyr Gly
            100                 105                 110
Asp Tyr Leu Gly Tyr Asn Asn Ala Met Leu Phe Leu Ala Asn Tyr Gly
        115                 120                 125
Pro Tyr Trp Arg Lys Asn Arg Lys Leu Val Ile Gln Glu Val Leu Ser
    130                 135                 140
Ala Ser Arg Leu Glu Lys Phe Lys His Val Arg Phe Ala Arg Ile Gln
145                 150                 155                 160
Ala Ser Ile Lys Asn Leu Tyr Thr Arg Ile Asp Gly Asn Ser Ser Thr
                165                 170                 175
Ile Asn Leu Thr Asp Trp Leu Glu Glu Leu Asn Phe Gly Leu Ile Val
            180                 185                 190
Lys Met Ile Ala Gly Lys Asn Tyr Glu Ser Gly Lys Gly Asp Glu Gln
        195                 200                 205
Val Glu Arg Phe Lys Lys Ala Phe Lys Asp Phe Met Ile Leu Ser Met
    210                 215                 220
Glu Phe Val Leu Trp Asp Ala Phe Pro Ile Pro Leu Phe Lys Trp Val
225                 230                 235                 240
Asp Phe Gln Gly His Val Lys Ala Met Lys Arg Thr Phe Lys Asp Ile
                245                 250                 255
Asp Ser Val Phe Gln Asn Trp Leu Glu Glu His Ile Asn Lys Arg Glu
            260                 265                 270
Lys Met Glu Val Asn Ala Glu Gly Asn Glu Gln Asp Phe Ile Asp Val
        275                 280                 285
Val Leu Ser Lys Met Ser Asn Glu Tyr Leu Gly Glu Gly Tyr Ser Arg
    290                 295                 300
Asp Thr Val Ile Lys Ala Thr Val Phe Ser Leu Val Leu Asp Ala Ala
305                 310                 315                 320
Asp Thr Val Ala Leu His Ile Asn Trp Gly Met Ala Leu Leu Ile Asn
                325                 330                 335
Asn Gln Lys Ala Leu Thr Lys Ala Gln Glu Glu Ile Asp Thr Lys Val
            340                 345                 350
Gly Lys Asp Arg Trp Val Glu Glu Ser Asp Ile Lys Asp Leu Val Tyr
        355                 360                 365
Leu Gln Ala Ile Val Lys Glu Val Leu Arg Leu Tyr Pro Pro Gly Pro
    370                 375                 380
Leu Leu Val Pro His Glu Asn Val Glu Asp Cys Val Val Ser Gly Tyr
385                 390                 395                 400
His Ile Pro Lys Gly Thr Arg Leu Phe Ala Asn Val Met Lys Leu Gln
                405                 410                 415
Arg Asp Pro Lys Leu Trp Ser Asp Pro Asp Thr Phe Asp Pro Glu Arg
            420                 425                 430
Phe Ile Ala Thr Asp Ile Asp Phe Arg Gly Gln Tyr Tyr Lys Tyr Ile
        435                 440                 445
Pro Phe Gly Ser Gly Arg Arg Ser Cys Pro Gly Met Thr Tyr Ala Leu
    450                 455                 460
Gln Val Glu His Leu Thr Met Ala His Leu Ile Gln Gly Phe Asn Tyr
465                 470                 475                 480
Arg Thr Pro Asn Asp Glu Pro Leu Asp Met Lys Glu Gly Ala Gly Ile
                485                 490                 495
Thr Ile Arg Lys Val Asn Pro Val Glu Leu Ile Ile Ala Pro Arg Leu
            500                 505                 510
Ala Pro Glu Leu Tyr
        515
<210>14
<211>517
<212>PRT
<213>普通烟草
<400>14
Met Leu Ser Pro Ile Glu Ala Ile Val Gly Leu Val Thr Phe Thr Phe
  1               5                  10                  15
Leu Phe Phe Phe Leu Trp Thr Lys Lys Ser Gln Lys Pro Ser Lys Pro
             20                  25                  30
Leu Pro Pro Lys Ile Pro Gly Gly Trp Pro Val Ile Gly His Leu Phe
         35                  40                  45
His Phe Asn Asp Asp Gly Asp Asp Arg Pro Leu Ala Arg Lys Leu Gly
     50                 55                  60
Asp Leu Ala Asp Lys Tyr Gly Pro Val Phe Thr Phe Arg Leu Gly Leu
 65                  70                  75                  80
Pro Leu Val Leu Val Val Ser Ser Tyr Glu Ala Val Lys Asp Cys Phe
                 85                  90                  95
Ser Thr Asn Asp Ala Ile Phe Ser Asn Arg Pro Ala Phe Leu Tyr Gly
            100                 105                 110
Asp Tyr Leu Gly Tyr Asn Asn Ala Met Leu Phe Leu Ala Asn Tyr Gly
        115                 120                 125
Pro Tyr Trp Arg Lys Asn Arg Lys Leu Val Ile Gln Glu Val Leu Ser
    130                 135                 140
Ala Ser Arg Leu Glu Lys Phe Lys His Val Arg Phe Ala Arg Ile Gln
145                 150                 155                 160
Ala Ser Ile Lys Asn Leu Tyr Thr Arg Ile Asp Gly Asn Ser Ser Thr
                165                 170                 175
Ile Asn Leu Thr Asp Trp Leu Glu Glu Leu Asn Phe Gly Leu Ile Val
            180                 185                 190
Lys Met Ile Ala Gly Lys Asn Tyr Glu Ser Gly Lys Gly Asp Glu Gln
        195                 200                 205
Val Glu Arg Phe Lys Lys Ala Phe Lys Asp Phe Met Ile Leu Ser Met
    210                 215                 220
Glu Phe Val Leu Trp Asp Ala Phe Pro Ile Pro Leu Phe Lys Trp Val
225                 230                 235                 240
Asp Phe Gln Gly His Val Lys Ala Met Lys Arg Thr Phe Lys Asp Ile
                245                 250                 255
Asp Ser Val Phe Gln Asn Trp Leu Glu Glu His Ile Asn Lys Arg Glu
            260                 265                 270
Lys Met Glu Val Asn Ala Glu Gly Asn Glu Gln Asp Phe Ile Asp Val
        275                 280                 285
Val Leu Ser Lys Met Ser Asn Glu Tyr Leu Gly Glu Gly Tyr Ser Arg
    290                 295                 300
Asp Thr Val Ile Lys Ala Thr Val Phe Ser Leu Val Leu Asp Ala Ala
305                 310                 315                 320
Asp Thr Val Ala Leu His Ile Asn Trp Gly Met Ala Leu Leu Ile Asn
                325                 330                 335
Asn Gln Lys Ala Leu Thr Lys Ala Gln Glu Glu Ile Asp Thr Lys Val
            340                 345                 350
Gly Lys Asp Arg Trp Val Glu Glu Ser Asp Ile Lys Asp Leu Val Tyr
        355                 360                 365
Leu Gln Ala Ile Val Lys Glu Val Leu Arg Leu Tyr Pro Pro Gly Pro
    370                 375                 380
Leu Leu Val Pro His Glu Asn Val Glu Asp Cys Val Val Ser Gly Tyr
385                 390                 395                 400
His Ile Pro Lys Gly Thr Arg Leu Phe Ala Asn Val Met Lys Leu Gln
                405                 410                 415
Arg Asp Pro Lys Leu Trp Ser Asp Pro Asp Thr Phe Asp Pro Glu Arg
            420                 425                 430
Phe Ile Ala Thr Asp Ile Asp Phe Arg Gly Gln Tyr Tyr Lys Tyr Ile
        435                 440                 445
Pro Phe Gly Ser Gly Arg Arg Ser Cys Ser Gly Met Thr Tyr Ala Leu
    450                 455                 460
Gln Val Glu His Leu Thr Met Ala His Leu Ile Gln Gly Phe Asn Tyr
465                 470                 475                 480
Arg Thr Pro Asn Asp Glu Pro Leu Asp Met Lys Glu Gly Ala Gly Ile
                485                 490                 495
Thr Ile Arg Lys Val Asn Pro Val Glu Leu Ile Ile Ala Pro Arg Leu
            500                 505                 510
Ala Pro Glu Leu Tyr
        515
<210>15
<211>517
<212>PRT
<213>普通烟草
<400>15
Met Leu Ser Pro Ile Glu Ala Ile Val Gly Leu Val Thr Phe Thr Phe
  1               5                  10                  15
Leu Phe Phe Phe Leu Trp Thr Lys Lys Ser Gln Lys Pro Ser Lys Pro
             20                  25                  30
Leu Pro Pro Lys Ile Pro Gly Gly Trp Pro Val Ile Gly His Leu Phe
         35                  40                  45
His Phe Asn Asp Asp Gly Asp Asp Arg Pro Leu Ala Arg Lys Leu Gly
     50                  55                  60
Asp Leu Ala Asp Lys Tyr Gly Pro Val Phe Thr Phe Arg Leu Gly Leu
 65                  70                  75                  80
Pro Leu Val Leu Val Val Ser Ser Tyr Glu Ala Val Lys Asp Cys Phe
                 85                  90                  95
Ser Thr Asn Asp Ala Ile Phe Ser Asn Arg Pro Ala Phe Leu Tyr Gly
            100                 105                 110
Asp Tyr Leu Gly Tyr Asn Asn Ala Met Leu Phe Leu Ala Asn Tyr Gly
        115                 120                 125
Pro Tyr Trp Arg Lys Asn Arg Lys Leu Val Ile Gln Glu Val Leu Ser
    130                 135                 140
Ala Ser Arg Leu Glu Lys Phe Lys His Val Arg Phe Ala Arg Ile Gln
145                 150                 155                 160
Ala Ser Ile Lys Asn Leu Tyr Thr Arg Ile Asp Gly Ash Ser Ser Thr
                165                 170                 175
Ile Asn Leu Thr Asp Trp Leu Glu Glu Leu Asn Phe Gly Leu Ile Val
            180                 185                 190
Lys Met Ile Ala Gly Lys Asn Tyr Glu Ser Gly Lys Gly Asp Glu Gln
        195                 200                 205
Val Glu Arg Phe Lys Lys Ala Phe Lys Asp Phe Met Ile Leu Ser Met
    210                 215                 220
Glu Phe Val Leu Trp Asp Ala Phe Pro Ile Pro Leu Phe Lys Trp Val
225                 230                 235                 240
Asp Phe Gln Gly His Val Lys Ala Met Lys Arg Thr Phe Lys Asp Ile
                245                 250                 255
Asp Ser Val Phe Gln Asn Trp Leu Glu Glu His Ile Asn Lys Arg Glu
            260                 265                 270
Lys Met Glu Val Asn Ala Glu Gly Asn Glu Gln Asp Phe Ile Asp Val
        275                 280                 285
Val Leu Ser Lys Met Ser Asn Glu Tyr Leu Gly Glu Gly Tyr Ser Arg
    290                 295                 300
Asp Thr Val Ile Lys Ala Thr Val Phe Ser Leu Val Leu Asp Ala Ala
305                 310                 315                 320
Asp Thr Val Ala Leu His Ile Asn Trp Gly Met Ala Leu Leu Ile Asn
                325                 330                 335
Asn Gln Lys Ala Leu Thr Lys Ala Gln Glu Glu Ile Asp Thr Lys Val
            340                 345                 350
Gly Lys Asp Arg Trp Val Glu Glu Ser Asp Ile Asn Asp Leu Val Tyr
        355                 360                 365
Leu Gln Ala Ile Val Lys Glu Val Leu Arg Leu Tyr Pro Pro Gly Pro
    370                 375                 380
Leu Leu Val Pro His Glu Asn Val Glu Asp Cys Val Val Ser Gly Tyr
385                 390                 395                 400
His Ile Pro Lys Gly Thr Arg Leu Phe Ala Asn Val Met Lys Leu Gln
                405                 410                 415
Arg Asp Pro Lys Leu Trp Ser Asp Pro Asp Thr Phe Asp Pro Glu Arg
            420                 425                 430
Phe Ile Ala Thr Asp Ile Asp Phe Arg Gly Gln Tyr Tyr Lys Tyr Ile
        435                 440                 445
Pro Phe Gly Ser Gly Arg Arg Ser Cys Pro Gly Met Thr Tyr Ala Leu
    450                 455                 460
Gln Val Glu His Leu Thr Met Ala His Leu Ile Gln Gly Phe Asn Tyr
465                 470                 475                 480
Arg Thr Pro Asn Asp Glu Pro Leu Asp Met Lys Glu Gly Ala Gly Ile
                485                 490                 495
Thr Ile Arg Lys Val Asn Pro Val Glu Leu Ile Ile Ala Pro Arg Leu
            500                 505                 510
Ala Pro Glu Leu Tyr
         515
<210>16
<211>517
<212>PRT
<213>普通烟草
<400>16
Met Leu Ser Pro Ile Glu Ala Ile Val Gly Leu Val Thr Phe Thr Phe
  1               5                  10                  15
Leu Phe Phe Phe Leu Trp Thr Lys Lys Ser Gln Lys Pro Ser Lys Pro
             20                  25                  30
Leu Pro Pro Lys Ile Leu Gly Gly Trp Pro Val Ile Gly His Leu Phe
         35                  40                  45
His Phe Asn Asp Asp Gly Asp Asp Arg Pro Leu Ala Arg Lys Leu Gly
     50                  55                  60
Asp Leu Ala Asp Lys Tyr Gly Pro Val Phe Thr Phe Arg Leu Gly Leu
 65                  70                  75                  80
Pro Leu Val Leu Val Val Ser Ser Tyr Glu Ala Val Lys Asp Cys Phe
                 85                  90                  95
Ser Thr Asn Asp Ala Ile Phe Ser Asn Arg Pro Ala Phe Leu Tyr Gly
            100                 105                 110
Asp Tyr Leu Gly Tyr Asn Asn Ala Met Leu Phe Leu Ala Asn Tyr Gly
        115                 120                 125
Pro Tyr Trp Arg Lys Asn Arg Lys Leu Val Ile Gln Glu Val Leu Ser
    130                 135                 140
Ala Ser Arg Leu Glu Lys Phe Lys His Val Arg Phe Ala Arg Ile Gln
145                 150                 155                 160
Ala Ser Ile Lys Asn Leu Tyr Thr Arg Ile Asp Gly Asn Ser Ser Thr
                165                 170                 175
Ile Asn Leu Thr Asp Trp Leu Glu Glu Leu Asn Phe Gly Leu Ile Val
            180                 185                 190
Lys Met Ile Ala Gly Lys Asn Tyr Glu Ser Gly Lys Gly Asp Glu Gln
        195                 200                 205
Val Glu Arg Phe Lys Lys Ala Phe Lys Asp Phe Met Ile Leu Ser Met
    210                 215                 220
Glu Phe Val Leu Trp Asp Ala Phe Pro Ile Pro Leu Phe Lys Trp Val
225                 230                 235                 240
Asp Phe Gln Gly His Val Lys Ala Met Lys Arg Thr Phe Lys Asp Ile
                245                 250                 255
Asp Ser Val Phe Gln Asn Trp Leu Glu Glu His Ile Asn Lys Arg Glu
            260                 265                 270
Lys Met Glu Val Asn Ala Glu Gly Asn Glu Gln Asp Phe Ile Asp Val
        275                 280                 285
Val Leu Ser Lys Met Ser Asn Glu Tyr Leu Gly Glu Gly Tyr Ser Arg
    290                 295                 300
Asp Thr Val Ile Lys Ala Thr Val Phe Ser Leu Val Leu Asp Ala Ala
305                 310                 315                 320
Asp Thr Val Ala Leu His Ile Asn Trp Gly Met Ala Leu Leu Ile Asn
                325                 330                 335
Asn Gln Lys Ala Leu Thr Lys Ala Gln Glu Glu Ile Asp Thr Lys Val
            340                 345                 350
Gly Lys Asp Arg Trp Val Glu Glu Ser Asp Ile Lys Asp Leu Val Tyr
        355                 360                 365
Leu Gln Ala Ile Val Lys Glu Val Leu Arg Leu Tyr Pro Pro Gly Pro
    370                 375                 380
Leu Leu Val Pro His Glu Asn Val Glu Asp Cys Val Val Ser Gly Tyr
385                 390                 395                 400
His Ile Pro Lys Gly Thr Arg Leu Phe Ala Asn Val Met Lys Leu Gln
                405                 410                 415
Arg Asp Pro Lys Leu Trp Ser Asp Pro Asp Thr Phe Asp Pro Glu Arg
            420                 425                 430
Phe Ile Ala Thr Asp Ile Asp Phe Arg Gly Gln Tyr Tyr Lys Tyr Ile
        435                 440                 445
Pro Phe Gly Ser Gly Arg Arg Ser Cys Pro Gly Met Thr Tyr Ala Leu
    450                 455                 460
Gln Val Glu His Leu Thr Met Ala His Leu Ile Gln Gly Phe Asn Tyr
465                 470                 475                 480
Arg Thr Pro Asn Asp Glu Pro Leu Asp Met Lys Glu Gly Ala Gly Ile
                485                 490                 495
Thr Ile Arg Lys Val Asn Pro Val Glu Leu Ile Ile Ala Pro Arg Leu
            500                 505                 510
Ala Pro Glu Leu Tyr
        515
<210>17
<211>517
<212>PRT
<213>普通烟草
<400>17
Met Leu Ser Pro Ile Glu Ala Ile Val Gly Leu Val Thr Phe Thr Phe
  1               5                  10                  15
Leu Phe Phe Phe Leu Trp Thr Lys Lys Ser Gln Lys Pro Ser Lys Pro
             20                  25                  30
Leu Pro Pro Lys Ile Pro Gly Gly Trp Pro Val Ile Gly His Leu Phe
         35                  40                  45
His Phe Asn Asp Asp Gly Asp Asp Arg Pro Leu Ala Arg Lys Leu Gly
     50                  55                  60
Asp Leu Ala Asp Lys Tyr Gly Pro Val Phe Thr Phe Arg Leu Gly Leu
 65                  70                  75                  80
Pro Leu Val Leu Val Val Ser Ser Tyr Glu Ala Val Lys Asp Cys Phe
                 85                  90                  95
Ser Thr Asn Asp Ala Ile Phe Ser Asn Arg Pro Ala Phe Leu Tyr Gly
            100                 105                 110
Asp Tyr Leu Gly Tyr Asn Asn Ala Met Leu Phe Leu Ala Asn Tyr Gly
        115                 120                 125
Pro Tyr Trp Arg Lys Asn Arg Lys Leu Val Ile Gln Glu Val Leu Ser
    130                 135                 140
Ala Ser Arg Leu Glu Lys Phe Lys His Val Arg Phe Ala Arg Ile Gln
145                 150                 155                 160
Ala Ser Ile Lys Asn Leu Tyr Thr Arg Ile Asp Gly Asn Ser Ser Thr
                165                 170                 175
Ile Asn Leu Thr Asp Trp Leu Glu Glu Leu Asn Phe Gly Leu Ile Val
            180                 185                 190
Lys Met Ile Ala Gly Lys Asn Tyr Lys Ser Gly Lys Gly Asp Glu Gln
        195                 200                 205
Val Glu Arg Phe Lys Lys Ala Phe Lys Asp Phe Met Ile Leu Ser Met
    210                 215                 220
Glu Phe Val Leu Trp Asp Ala Phe Pro Ile Pro Leu Phe Lys Trp Val
225                 230                 235                 240
Asp Phe Gln Gly His Val Lys Ala Met Lys Arg Thr Phe Lys Asp Ile
                245                 250                 255
Asp Ser Val Phe Gln Asn Trp Leu Glu Glu His Ile Asn Lys Arg Glu
            260                 265                 270
Lys Met Glu Val Asn Ala Glu Gly Asn Glu Gln Asp Phe Ile Asp Val
        275                 280                 285
Val Leu Ser Lys Met Ser Asn Glu Tyr Leu Gly Glu Gly Tyr Ser Arg
    290                 295                 300
Asp Thr Val Ile Lys Ala Thr Val Phe Ser Leu Val Leu Asp Ala Ala
305                 310                 315                 320
Asp Thr Val Ala Leu His Ile Asn Trp Gly Met Ala Leu Leu Ile Asn
                325                 330                 335
Asn Gln Lys Ala Leu Thr Lys Ala Gln Glu Glu Ile Asp Thr Lys Val
            340                 345                 350
Gly Lys Asp Arg Trp Val Glu Glu Ser Asp Ile Lys Asp Leu Val Tyr
        355                 360                 365
Leu Gln Ala Ile Val Lys Glu Val Leu Arg Leu Tyr Pro Pro Gly Pro
    370                 375                 380
Leu Leu Val Pro His Glu Asn Val Glu Asp Cys Val Val Ser Gly Tyr
385                 390                 395                 400
His Ile Pro Lys Gly Thr Arg Leu Phe Ala Asn Val Met Lys Leu Gln
                405                 410                 415
Arg Asp Pro Lys Leu Trp Ser Asp Pro Asp Thr Phe Asp Pro Glu Arg
            420                 425                 430
Phe Ile Ala Thr Asp Ile Asp Phe Arg Gly Gln Tyr Tyr Lys Tyr Ile
        435                 440                 445
Pro Phe Gly Ser Gly Arg Arg Ser Cys Pro Gly Met Thr Tyr Ala Leu
    450                 455                 460
Gln Val Glu His Leu Thr Met Ala His Leu Ile Gln Gly Phe Asn Tyr
465                 470                 475                 480
Arg Thr Pro Asn Asp Glu Pro Leu Asp Met Lys Glu Gly Ala Gly Ile
                485                 490                 495
Thr Ile Arg Lys Val Asn Pro Val Glu Leu Ile Ile Ala Pro Arg Leu
            500                 505                 510
Ala Pro Glu Leu Tyr
        515
<210>18
<211>517
<212>PRT
<213>普通烟草
<400>18
Met Leu Ser Pro Ile Glu Ala Ile Val Gly Leu Val Thr Phe Thr Phe
  1               5                  10                  15
Leu Phe Phe Phe Leu Trp Thr Lys Lys Ser Gln Lys Pro Ser Lys Pro
             20                 25                  30
Leu Pro Pro Lys Ile Pro Gly Gly Trp Pro Val Ile Gly His Leu Phe
         35                  40                  45
His Phe Asn Asp Asp Gly Asp Asp Arg Pro Leu Ala Arg Lys Leu Gly
     50                  55                  60
Asp Leu Ala Asp Lys Tyr Gly Pro Val Phe Thr Phe Arg Leu Gly Leu
 65                  70                  75                  80
Pro Leu Val Leu Val Val Ser Ser Tyr Glu Ala Val Lys Asp Cys Phe
                 85                  90                  95
Ser Thr Asn Asp Ala Ile Phe Ser Asn Arg Pro Ala Phe Leu Tyr Gly
            100                 105                 110
Asp Tyr Leu Gly Tyr Asn Asn Ala Met Leu Phe Leu Ala Asn Tyr Gly
        115                 120                 125
Pro Tyr Trp Arg Lys Asn Arg Lys Leu Val Ile Gln Glu Val Leu Ser
    130                 135                 140
Ala Ser Arg Leu Glu Lys Phe Lys His Val Arg Phe Ala Arg Ile Gln
145                 150                 155                 160
Ala Ser Ile Lys Asn Leu Tyr Thr Gln Ile Asp Gly Asn Ser Ser Thr
                165                 170                 175
Ile Asn Leu Thr Asp Trp Leu Glu Glu Leu Asn Phe Gly Leu Ile Val
            180                 185                 190
Lys Met Ile Ala Gly Lys Asn Tyr Glu Ser Gly Lys Gly Asp Glu Gln
        195                 200                 205
Val Glu Arg Phe Lys Lys Ala Phe Lys Asp Phe Met Ile Leu Ser Met
    210                 215                 220
Glu Phe Val Leu Trp Asp Ala Phe Pro Ile Pro Leu Phe Lys Trp Val
225                 230                 235                 240
Asp Phe Gln Gly His Val Lys Ala Met Lys Arg Thr Phe Lys Asp Ile
                245                 250                 255
Asp Ser Val Phe Gln Asn Trp Leu Glu Glu His Ile Asn Lys Arg Glu
            260                 265                 270
Lys Met Glu Val Asn Ala Glu Gly Asn Glu Gln Asp Phe Ile Asp Val
        275                 280                 285
Val Leu Ser Lys Met Ser Asn Glu Tyr Leu Gly Glu Gly Tyr Ser Arg
    290                 295                 300
Asp Thr Val Ile Lys Ala Thr Val Phe Ser Leu Val Leu Asp Ala Ala
305                 310                 315                 320
Asp Thr Val Ala Leu His Ile Asn Trp Gly Met Ala Leu Leu Ile Asn
                325                 330                 335
Asn Gln Lys Ala Leu Thr Lys Ala Gln Glu Glu Ile Asp Thr Lys Val
            340                 345                 350
Gly Lys Asp Arg Trp Val Glu Glu Ser Asp Ile Lys Asp Leu Val Tyr
        355                 360                 365
Leu Gln Ala Ile Val Lys Glu Val Leu Arg Leu Tyr Pro Pro Gly Pro
    370                 375                 380
Leu Leu Val Pro His Glu Ash Val Glu Asp Cys Val Val Ser Gly Tyr
385                 390                 395                 400
His Ile Pro Lys Gly Thr Arg Leu Phe Ala Asn Val Met Lys Leu Gln
                405                 410                 415
Arg Asp Pro Lys Leu Trp Ser Asp Pro Asp Thr Phe Asp Pro Glu Arg
            420                 425                 430
Phe Ile Ala Thr Asp Ile Asp Phe Arg Gly Gln Tyr Tyr Lys Tyr Ile
        435                 440                 445
Pro Phe Gly Ser Gly Arg Arg Ser Cys Pro Gly Met Thr Tyr Ala Leu
    450                 455                 460
Gln Val Glu His Leu Thr Met Ala His Leu Ile Gln Gly Phe Asn Tyr
465                 470                 475                 480
Arg Thr Pro Asn Asp Glu Pro Leu Asp Met Lys Glu Gly Ala Gly Ile
                485                 490                 495
Thr Ile Arg Lys Val Asn Pro Val Glu Leu Ile Ile Ala Pro Arg Leu
            500                 505                 510
Ala Pro Glu Leu Tyr
        515
<210>19
<211>517
<212>PRT
<213>普通烟草
<400>19
Met Leu Ser Pro Ile Glu Ala Ile Val Gly Leu Val Thr Phe Thr Phe
  1               5                  10                  15
Leu Phe Phe Phe Leu Trp Thr Lys Lys Ser Gln Lys Pro Ser Lys Pro
             20                  25                  30
Leu Pro Pro Lys Ile Pro Gly Gly Trp Pro Val Ile Gly His Leu Phe
         35                  40                  45
His Phe Asn Asp Asp Gly Asp Asp Arg Pro Leu Ala Arg Lys Leu Gly
     50                  55                  60
Asp Leu Ala Asp Lys Tyr Gly Pro Val Phe Thr Phe Arg Leu Gly Leu
 65                  70                  75                  80
Pro Leu Val Leu Val Val Ser Ser Tyr Glu Ala Val Lys Asp Cys Phe
                 85                  90                  95
Ser Thr Asn Asp Ala Ile Phe Ser Asn Arg Pro Ala Phe Leu Tyr Gly
            100                 105                 110
Asp Tyr Leu Gly Tyr Asn Asn Ala Met Leu Phe Leu Ala Asn Tyr Gly
        115                 120                 125
Pro Tyr Trp Arg Lys Asn Arg Lys Leu Val Ile Gln Glu Val Leu Ser
    130                 135                 140
Ala Ser Arg Leu Glu Lys Phe Lys His Val Arg Phe Ala Arg Ile Gln
145                 150                 155                 160
Ala Ser Ile Lys Asn Leu Tyr Thr Arg Ile Asp Gly Asn Ser Ser Thr
                165                 170                 175
Ile Asn Leu Thr Asp Trp Leu Glu Glu Leu Asn Phe Gly Leu Ile Val
            180                 185                 190
Lys Met Ile Ala Gly Lys Asn Tyr Glu Ser Gly Lys Gly Asp Glu Gln
        195                 200                 205
Val Glu Arg Phe Lys Lys Ala Phe Lys Asp Phe Met Ile Leu Ser Met
    210                 215                 220
Glu Phe Val Leu Trp Asp Ala Phe Pro Ile Pro Leu Phe Lys Trp Val
225                 230                 235                 240
Asp Phe Gln Gly His Val Lys Ala Met Lys Arg Thr Phe Lys Asp Ile
                245                 250                 255
Asp Ser Val Phe Gln Asn Trp Leu Glu Glu His Ile Asn Lys Arg Glu
            260                 265                 270
Lys Met Glu Val Asn Ala Glu Gly Asn Glu Gln Asp Phe Ile Asp Val
        275                 280                 285
Val Leu Ser Lys Met Ser Asn Glu Tyr Leu Gly Glu Gly Tyr Ser Arg
    290                 295                 300
Asp Thr Val Ile Lys Ala Thr Val Phe Ser Leu Val Leu Asp Ala Ala
305                 310                 315                 320
Asp Thr Val Ala Leu His Ile Asn Trp Gly Met Ala Leu Leu Ile Asn
                325                 330                 335
Asn Gln Lys Ala Leu Thr Lys Ala Gln Glu Glu Ile Asp Thr Lys Val
            340                 345                 350
Gly Lys Asp Arg Trp Val Glu Glu Ser Asp Ile Lys Asp Leu Val Tyr
        355                 360                 365
Leu Gln Ala Ile Val Lys Glu Val Leu Arg Leu Tyr Pro Pro Gly Pro
    370                 375                 380
Leu Leu Val Pro His Glu Asn Val Glu Asp Cys Val Val Ser Gly Tyr
385                 390                 395                 400
His Ile Pro Lys Gly Thr Arg Leu Phe Ala Asn Val Met Lys Leu Gln
                405                 410                 415
Arg Asp Pro Lys Leu Trp Ser Asp Pro Asp Thr Phe Asp Pro Glu Arg
            420                 425                 430
Phe Ile Ala Thr Asp Ile Asp Phe Arg Gly Gln Tyr Tyr Lys Tyr Ile
        435                 440                 445
Pro Phe Gly Ser Gly Arg Arg Ser Cys Pro Arg Met Thr Tyr Ala Leu
    450                 455                 460
Gln Val Glu His Leu Thr Met Ala His Leu Ile Gln Gly Phe Asn Tyr
465                 470                 475                 480
Arg Thr Pro Asn Asp Glu Pro Leu Asp Met Lys Glu Gly Ala Gly Ile
                485                 490                 495
Thr Ile Arg Lys Val Asn Pro Val Glu Leu Ile Ile Ala Pro Arg Leu
            500                 505                 510
Ala Pro Glu Leu Tyr
        515
<210>20
<211>517
<212>PRT
<213>普通烟草
<400>20
Met Leu Ser Pro Ile Glu Ala Ile Val Gly Leu Val Thr Phe Thr Phe
  1               5                  10                  15
Leu Phe Phe Phe Leu Trp Thr Lys Lys Ser Gln Lys Pro Ser Lys Pro
             20                 25                  30
Leu Pro Pro Lys Ile Pro Gly Gly Trp Pro Val Ile Gly His Leu Phe
         35                  40                  45
His Phe Asn Asp Asp Gly Asp Asp Arg Pro Leu Ala Arg Lys Leu Gly
     50                  55                  60
Asp Leu Ala Asp Lys Tyr Gly Pro Val Phe Thr Phe Arg Leu Gly Leu
 65                  70                  75                  80
Pro Leu Val Leu Val Val Ser Ser Tyr Glu Ala Val Lys Asp Cys Phe
                 85                  90                  95
Ser Thr Asn Asp Ala Ile Phe Ser Asn Arg Pro Ala Phe Leu Tyr Gly
            100                 105                 110
Asp Tyr Leu Gly Tyr Asn Asn Ala Met Leu Phe Leu Ala Asn Tyr Gly
        115                 120                 125
Pro Tyr Trp Arg Lys Asn Arg Lys Leu Val Ile Gln Glu Val Leu Ser
    130                 135                 140
Ala Ser Arg Leu Glu Lys Phe Lys His Val Arg Phe Ala Arg Ile Gln
145                 150                 155                 160
Ala Ser Ile Lys Asn Leu Tyr Thr Arg Ile Asp Gly Asn Ser Ser Thr
                165                 170                 175
Ile Asn Leu Thr Asp Trp Leu Glu Glu Leu Asn Phe Gly Leu Ile Val
            180                 185                 190
Lys Met Ile Ala Gly Lys Asn Tyr Glu Ser Gly Lys Gly Asp Glu Gln
        195                 200                 205
Val Glu Arg Phe Lys Lys Ala Phe Lys Asp Phe Met Ile Leu Ser Met
    210                 215                 220
Glu Phe Val Leu Trp Asp Ala Phe Pro Ile Pro Leu Phe Lys Trp Val
225                 230                 235                 240
Asp Phe Gln Gly His Val Lys Ala Met Lys Arg Thr Phe Lys Asp Ile
                245                 250                 255
Asp Ser Val Phe Gln Asn Trp Leu Glu Glu His Ile Asn Lys Arg Glu
            260                 265                 270
Lys Met Glu Val Asn Ala Glu Gly Asn Glu Gln Asp Phe Ile Asp Val
        275                 280                 285
Val Leu Ser Lys Met Ser Asn Lys Tyr Leu Gly Glu Gly Tyr Ser Arg
    290                 295                 300
Asp Thr Val Ile Lys Ala Thr Val Phe Ser Leu Val Leu Asp Ala Ala
305                 310                 315                 320
Asp Thr Val Ala Leu His Ile Asn Trp Gly Met Ala Leu Leu Ile Asn
                325                 330                 335
Asn Gln Lys Ala Leu Thr Lys Ala Gln Glu Glu Ile Asp Thr Lys Val
            340                 345                 350
Gly Lys Asp Arg Trp Val Glu Glu Ser Asp Ile Lys Asp Leu Val Tyr
        355                 360                 365
Leu Gln Ala Ile Val Lys Glu Val Leu Arg Leu Tyr Pro Pro Gly Pro
    370                 375                 380
Leu Leu Val Pro His Glu Asn Val Glu Asp Cys Val Val Ser Gly Tyr
385                 390                 395                 400
His Ile Pro Lys Gly Thr Arg Leu Phe Ala Asn Val Met Lys Leu Gln
                405                 410                 415
Arg Asp Pro Lys Leu Trp Ser Asp Pro Asp Thr Phe Asp Pro Glu Arg
            420                 425                 430
Phe Ile Ala Thr Asp Ile Asp Phe Arg Gly Gln Tyr Tyr Lys Tyr Ile
        435                 440                 445
Pro Phe Gly Ser Gly Arg Arg Ser Cys Pro Gly Met Thr Tyr Ala Leu
    450                 455                 460
Gln Val Glu His Leu Thr Met Ala His Leu Ile Gln Gly Phe Asn Tyr
465                 470                 475                 480
Arg Thr Pro Asn Asp Glu Pro Leu Asp Met Lys Glu Gly Ala Gly Ile
                485                 490                 495
Thr Ile Arg Lys Val Asn Pro Val Glu Leu Ile Ile Ala Pro Arg Leu
            500                 505                 510
Ala Pro Glu Leu Tyr
        515
<210>21
<211>517
<212>PRT
<213>普通烟草
<400>21
Met Leu Ser Pro Ile Glu Ala Ile Val Gly Leu Val Thr Phe Thr Phe
  1               5                  10                  15
Leu Phe Phe Phe Leu Trp Thr Lys Lys Ser Gln Lys Pro Ser Lys Pro
             20                  25                  30
Leu Pro Pro Lys Ile Pro Gly Gly Trp Pro Val Ile Gly His Leu Phe
         35                  40                  45
His Phe Asn Asp Asp Gly Asp Asp Arg Pro Leu Ala Arg Lys Leu Gly
     50                  55                  60
Asp Leu Ala Asp Lys Tyr Gly Pro Val Phe Thr Phe Arg Leu Gly Leu
 65                  70                  75                  80
Pro Leu Val Leu Val Val Ser Ser Tyr Glu Ala Val Lys Asp Cys Phe
                 85                  90                  95
Ser Thr Asn Asp Ala Ile Phe Ser Asn Arg Pro Ala Phe Leu Tyr Gly
            100                 105                 110
Asp Tyr Leu Gly Tyr Asn Asn Ala Met Leu Phe Leu Ala Asn Tyr Gly
        115                 120                 125
Pro Tyr Trp Arg Lys Asn Arg Lys Leu Val Ile Gln Glu Val Leu Ser
    130                 135                 140
Ala Ser Arg Leu Glu Lys Phe Lys His Val Arg Phe Ala Arg Ile Gln
145                 150                 155                 160
Ala Ser Ile Lys Asn Leu Tyr Thr Arg Ile Asp Gly Asn Ser Ser Thr
                165                 170                 175
Ile Asn Leu Thr Asp Trp Leu Glu Glu Leu Asn Phe Gly Leu Ile Val
            180                 185                 190
Lys Met Ile Ala Gly Lys Asn Tyr Glu Ser Gly Lys Gly Asp Glu Gln
        195                 200                 205
Val Glu Arg Phe Lys Lys Ala Phe Lys Asp Phe Met Ile Leu Ser Met
    210                 215                 220
Glu Phe Val Leu Trp Asp Ala Phe Pro Ile Pro Leu Phe Lys Trp Val
225                 230                 235                 240
Asp Phe Gln Gly His Val Lys Ala Met Lys Arg Thr Phe Lys Asp Ile
                245                 250                 255
Asp Ser Val Phe Gln Asn Trp Leu Glu Glu His Ile Asn Lys Arg Glu
            260                 265                 270
Lys Met Glu Val Asn Ala Glu Gly Asn Glu Gln Asp Phe Ile Asp Val
        275                 280                 285
Val Leu Ser Lys Met Ser Asn Glu Tyr Leu Gly Glu Gly Tyr Ser Arg
    290                 295                 300
Asp Thr Val Ile Lys Ala Thr Val Phe Ser Leu Val Leu Asp Ala Ala
305                 310                 315                 320
Asp Thr Val Ala Leu His Ile Asn Trp Gly Met Ala Leu Leu Ile Asn
                325                 330                 335
Asn Gln Lys Ala Leu Thr Lys Ala Gln Glu Glu Ile Asp Thr Lys Val
            340                 345                 350
Gly Lys Asp Arg Trp Val Glu Glu Ser Asp Ile Lys Asp Leu Val Tyr
        355                 360                 365
Leu Gln Ala Ile Val Lys Glu Val Leu Arg Leu Tyr Pro Pro Gly Pro
    370                 375                 380
Leu Leu Val Pro His Glu Asn Val Glu Asp Cys Val Val Ser Gly Tyr
385                 390                 395                 400
His Ile Pro Lys Gly Thr Arg Leu Phe Ala Asn Val Met Lys Leu Gln
                405                 410                 415
Arg Asp Pro Lys Leu Trp Ser Asp Pro Asp Ile Phe Asp Pro Glu Arg
            420                 425                 430
Phe Ile Ala Thr Asp Ile Asp Phe Arg Gly Gln Tyr Tyr Lys Tyr Ile
        435                 440                 445
Pro Phe Gly Ser Gly Arg Arg Ser Cys Pro Gly Met Thr Tyr Ala Leu
    450                 455                 460
Gln Val Glu His Leu Thr Met Ala His Leu Ile Gln Gly Phe Asn Tyr
465                 470                 475                 480
Arg Thr Pro Asn Asp Glu Pro Leu Asp Met Lys Glu Gly Ala Gly Ile
                485                 490                 495
Thr Ile Arg Lys Val Asn Pro Val Glu Leu Ile Ile Ala Pro Arg Leu
            500                 505                 510
Ala Pro Glu Leu Tyr
        515
<210>22
<211>328
<212>PRT
<213>普通烟草
<400>22
Met Leu Ser Pro Ile Glu Ala Ile Val Gly Leu Val Thr Phe Thr Phe
  1               5                  10                  15
Leu Phe Phe Phe Leu Trp Thr Lys Lys Ser Gln Lys Pro Ser Lys Pro
             20                  25                  30
Leu Pro Pro Lys Ile Pro Gly Gly Trp Pro Val Ile Gly His Leu Phe
         35                  40                  45
His Phe Asn Asp Asp Gly Asp Asp Arg Pro Leu Ala Arg Lys Leu Gly
     50                  55                  60
Asp Leu Ala Asp Lys Tyr Gly Pro Val Phe Thr Phe Arg Leu Gly Leu
 65                  70                  75                  80
Pro Leu Val Leu Val Val Ser Ser Tyr Glu Ala Val Lys Asp Cys Phe
                 85                  90                  95
Ser Thr Asn Asp Ala Ile Phe Ser Asn Arg Pro Ala Phe Leu Tyr Gly
            100                 105                 110
Asp Tyr Leu Gly Tyr Asn Asn Ala Met Leu Phe Leu Ala Asn Tyr Gly
        115                 120                 125
Pro Tyr Trp Arg Lys Asn Arg Lys Leu Val Ile Gln Glu Val Leu Ser
    130                 135                 140
Ala Ser Arg Leu Glu Lys Phe Lys His Val Arg Phe Ala Arg Ile Gln
145                 150                 155                 160
Ala Ser Ile Lys Asn Leu Tyr Thr Arg Ile Asp Gly Asn Ser Ser Thr
                165                 170                 175
Ile Asn Leu Thr Asp Trp Leu Glu Glu Leu Asn Phe Gly Leu Ile Val
            180                 185                 190
Lys Met Ile Ala Gly Lys Asn Tyr Glu Ser Gly Lys Gly Asp Glu Gln
        195                 200                 205
Val Glu Arg Phe Lys Lys Ala Phe Lys Asp Phe Met Ile Leu Ser Met
    210                 215                 220
Glu Phe Val Leu Trp Asp Ala Phe Pro Ile Pro Leu Phe Lys Trp Val
225                 230                 235                 240
Asp Phe Gln Gly His Val Lys Ala Met Lys Arg Thr Phe Lys Asp Ile
                245                 250                 255
Asp Ser Val Phe Gln Asn Trp Leu Glu Glu His Ile Asn Lys Arg Glu
            260                 265                 270
Lys Met Glu Val Asn Ala Glu Gly Asn Glu Gln Asp Phe Ile Asp Val
        275                 280                 285
Val Leu Ser Lys Met Ser Asn Glu Tyr Leu Gly Glu Gly Tyr Ser Arg
    290                 295                 300
Asp Thr Val Ile Lys Ala Thr Val Phe Ser Leu Val Leu Asp Ala Ala
305                 310                 315                 320
Asp Thr Val Ala Leu His Ile Asn
                325
<210>23
<211>517
<212>PRT
<213>普通烟草
<400>23
Met Leu Ser Pro Ile Glu Ala Ile Val Gly Leu Val Thr Phe Thr Phe
  1               5                  10                  15
Leu Phe Phe Phe Leu Trp Thr Lys Lys Ser Gln Lys Pro Ser Lys Pro
             20                  25                  30
Leu Pro Pro Lys Ile Pro Gly Gly Trp Pro Val Ile Gly His Leu Phe
         35                  40                  45
His Phe Asn Asp Asp Gly Asp Asp Arg Pro Leu Ala Arg Lys Leu Gly
     50                  55                  60
Asp Leu Ala Asp Lys Tyr Gly Pro Val Phe Thr Phe Arg Leu Gly Leu
 65                  70                  75                  80
Pro Leu Val Leu Val Val Ser Ser Tyr Glu Ala Val Lys Asp Cys Phe
                 85                  90                  95
Ser Thr Asn Asp Ala Ile Phe Ser Asn Arg Pro Ala Phe Leu Tyr Gly
            100                 105                 110
Asp Tyr Leu Gly Tyr Asn Asn Ala Met Leu Phe Leu Ala Asn Tyr Gly
        115                 120                 125
Pro Tyr Trp Arg Lys Asn Arg Lys Leu Val Ile Gln Glu Val Leu Ser
    130                 135                 140
Ala Ser Arg Leu Glu Lys Phe Lys His Val Arg Phe Ala Arg Ile Gln
145                 150                 155                 160
Ala Ser Ile Lys Asn Leu Tyr Thr Arg Ile Asp Gly Asn Ser Ser Thr
                165                 170                 175
Ile Asn Leu Thr Asp Trp Leu Glu Glu Leu Asn Phe Gly Leu Ile Val
            180                 185                 190
Lys Met Ile Ala Gly Lys Asn Tyr Glu Ser Gly Lys Gly Asp Glu Gln
        195                 200                 205
Val Glu Arg Phe Lys Lys Ala Phe Lys Asp Phe Met Ile Leu Ser Met
    210                 215                 220
Glu Phe Val Leu Trp Asp Ala Phe Pro Ile Pro Leu Phe Lys Trp Val
225                 230                 235                 240
Asp Phe Gln Gly His Val Lys Ala Met Lys Arg Thr Phe Lys Asp Ile
                245                 250                 255
Asp Ser Val Phe Gln Asn Trp Leu Glu Glu His Ile Asn Lys Arg Glu
            260                 265                 270
Lys Met Glu Val Asn Ala Glu Gly Asn Glu Gln Asp Phe Ile Asp Val
        275                 280                 285
Val Leu Ser Lys Met Ser Asn Glu Tyr Leu Gly Glu Gly Tyr Ser Arg
    290                 295                 300
Asp Thr Val Ile Lys Ala Thr Val Phe Ser Leu Val Leu Asp Ala Ala
305                 310                 315                 320
Asp Thr Val Ala Leu His Ile Asn Trp Gly Met Ala Leu Leu Ile Asn
                325                 330                 335
Asn Gln Lys Ala Leu Thr Lys Ala Gln Glu Glu Ile Asp Thr Lys Val
            340                 345                 350
Gly Lys Asp Arg Trp Val Glu Glu Ser Asp Ile Lys Asp Leu Val Tyr
        355                 360                 365
Leu Gln Ala Ile Val Lys Glu Met Leu Arg Leu Tyr Pro Pro Gly Pro
    370                 375                 380
Leu Leu Val Pro His Glu Asn Val Glu Asp Cys Val Val Ser Gly Tyr
385                 390                 395                 400
His Ile Pro Lys Gly Thr Arg Leu Phe Ala Asn Val Met Lys Leu Gln
                405                 410                 415
Arg Asp Pro Lys Leu Trp Ser Asp Pro Asp Thr Phe Asp Pro Glu Arg
            420                 425                 430
Phe Ile Ala Thr Asp Ile Asp Phe Arg Gly Gln Tyr Tyr Lys Tyr Ile
        435                 440                 445
Pro Phe Gly Ser Gly Arg Arg Ser Cys Pro Gly Met Thr Tyr Ala Leu
    450                 455                 460
Gln Val Glu His Leu Thr Met Ala His Leu Ile Gln Gly Phe Asn Tyr
465                 470                 475                 480
Arg Thr Pro Asn Asp Glu Pro Leu Asp Met Lys Glu Gly Ala Gly Ile
                485                 490                 495
Thr Ile Arg Lys Val Asn Pro Val Glu Leu Ile Ile Ala Pro Arg Leu
            500                 505                 510
Ala Pro Glu Leu Tyr
        515
<210>24
<211>517
<212>PRT
<213>普通烟草
<400>24
Met Leu Ser Pro Ile Glu Ala Ile Val Gly Leu Val Thr Phe Thr Phe
  1               5                  10                  15
Leu Phe Phe Phe Leu Trp Thr Lys Lys Ser Gln Lys Pro Ser Lys Pro
             20                  25                  30
Leu Pro Pro Lys Ile Pro Gly Gly Trp Pro Val Ile Gly His Leu Phe
         35                  40                  45
His Phe Asn Asp Asp Gly Asp Asp Arg Pro Leu Ala Arg Lys Leu Gly
     50                  55                  60
Asp Leu Ala Asp Lys Tyr Gly Pro Val Phe Thr Phe Arg Leu Gly Leu
 65                  70                  75                  80
Pro Leu Val Leu Val Val Ser Ser Tyr Glu Ala Val Lys Asp Cys Phe
                 85                  90                  95
Ser Thr Asn Asp Ala Ile Phe Ser Asn Arg Pro Ala Phe Leu Tyr Gly
            100                 105                 110
Asp Tyr Leu Gly Tyr Asn Asn Ala Met Leu Phe Leu Ala Asn Tyr Gly
        115                 120                 125
Pro Tyr Trp Arg Lys Asn Arg Lys Leu Val Ile Gln Glu Val Leu Ser
    130                 135                 140
Ala Ser Arg Leu Glu Lys Phe Lys His Val Arg Phe Ala Arg Ile Gln
145                 150                 155                 160
Ala Ser Ile Lys Asn Leu Tyr Thr Arg Ile Asn Gly Asn Ser Ser Thr
                165                 170                 175
Ile Asn Leu Thr Asp Trp Leu Glu Glu Leu Asn Phe Gly Leu Ile Val
            180                 185                 190
Lys Met Ile Ala Gly Lys Asn Tyr Glu Ser Gly Lys Gly Asp Glu Gln
        195                 200                 205
Val Glu Arg Phe Lys Lys Ala Phe Lys Asp Phe Met Ile Leu Ser Met
    210                 215                 220
Glu Phe Val Leu Trp Asp Ala Phe Pro Ile Pro Leu Phe Lys Trp Val
225                 230                 235                 240
Asp Phe Gln Gly His Val Lys Ala Met Lys Arg Thr Phe Lys Asp Ile
                245                 250                 255
Asp Ser Val Phe Gln Asn Trp Leu Glu Glu His Ile Asn Lys Arg Glu
            260                 265                 270
Lys Met Glu Val Asn Ala Glu Gly Asn Glu Gln Asp Phe Ile Asp Val
        275                 280                 285
Val Leu Ser Lys Met Ser Asn Glu Tyr Leu Gly Glu Gly Tyr Ser Arg
    290                 295                 300
Asp Thr Val Ile Lys Ala Thr Val Phe Ser Leu Val Leu Asp Ala Ala
305                 310                 315                 320
Asp Thr Val Ala Leu His Ile Asn Trp Gly Met Ala Leu Leu Ile Asn
                325                 330                 335
Asn Gln Lys Ala Leu Thr Lys Ala Gln Glu Glu Ile Asp Thr Lys Val
            340                 345                 350
Gly Lys Asp Arg Trp Val Glu Glu Ser Asp Ile Lys Asp Leu Val Tyr
        355                 360                 365
Leu Gln Ala Ile Val Lys Glu Val Leu Arg Leu Tyr Pro Pro Gly Pro
    370                 375                 380
Leu Leu Val Pro His Glu Asn Val Glu Asp Cys Val Val Ser Gly Tyr
385                 390                 395                 400
His Ile Pro Lys Gly Thr Arg Leu Phe Ala Asn Val Met Lys Leu Gln
                405                 410                 415
Arg Asp Pro Lys Leu Trp Ser Asp Pro Asp Thr Phe Asp Pro Glu Arg
            420                 425                 430
Phe Ile Ala Thr Asp Ile Asp Phe Arg Gly Gln Tyr Tyr Lys Tyr Ile
        435                 440                 445
Pro Phe Gly Ser Gly Arg Arg Ser Cys Pro Gly Met Thr Tyr Ala Leu
    450                 455                 460
Gln Val Glu His Leu Thr Met Ala His Leu Ile Gln Gly Phe Asn Tyr
465                 470                 475                 480
Arg Thr Pro Asn Asp Glu Pro Leu Asp Met Lys Glu Gly Ala Gly Ile
                485                 490                 495
Thr Ile Arg Lys Val Asn Pro Val Glu Leu Ile Ile Ala Pro Arg Leu
            500                 505                 510
Ala Pro Glu Leu Tyr
        515
<210>25
<211>517
<212>PRT
<213>普通烟草
<400>25
Met Leu Ser Pro Ile Glu Ala Ile Val Gly Leu Val Thr Phe Thr Phe
  1               5                  10                  15
Leu Phe Phe Phe Leu Trp Thr Lys Lys Ser Gln Lys Pro Ser Lys Pro
             20                  25                  30
Leu Pro Pro Lys Ile Pro Gly Gly Trp Pro Val Ile Gly His Leu Phe
         35                  40                  45
His Phe Asn Asp Asp Gly Asp Asp Arg Pro Leu Ala Arg Lys Leu Gly
     50                  55                  60
Asp Leu Ala Asp Lys Tyr Gly Pro Val Phe Thr Phe Arg Leu Gly Leu
 65                  70                  75                  80
Pro Leu Val Leu Val Val Ser Ser Tyr Glu Ala Val Lys Asp Cys Phe
                 85                  90                  95
Ser Thr Asn Asp Ala Ile Phe Ser Asn Arg Pro Ala Phe Leu Tyr Gly
            100                 105                 110
Asp Tyr Leu Gly Tyr Asn Asn Ala Met Leu Phe Leu Ala Asn Tyr Gly
        115                 120                 125
Pro Tyr Trp Arg Lys Asn Arg Lys Leu Val Ile Gln Glu Val Leu Ser
    130                 135                 140
Ala Ser Arg Leu Glu Lys Phe Lys His Val Arg Phe Ala Arg Ile Gln
145                 150                 155                 160
Ala Ser Ile Lys Asn Leu Tyr Thr Arg Ile Asp Gly Asn Ser Ser Thr
                165                 170                 175
Ile Asn Leu Thr Asp Trp Leu Glu Glu Leu Asn Phe Gly Leu Ile Val
            180                 185                 190
Lys Met Ile Ala Gly Lys Asn Tyr Glu Ser Gly Lys Gly Asp Glu Gln
        195                 200                 205
Val Glu Arg Phe Lys Lys Ala Phe Lys Asp Phe Met Ile Leu Ser Met
    210                 215                 220
Glu Phe Val Leu Trp Asp Ala Phe Pro Ile Pro Leu Phe Lys Trp Val
225                 230                 235                 240
Asp Phe Gln Gly His Val Lys Ala Met Lys Arg Thr Phe Lys Asp Ile
                245                 250                 255
Asp Ser Val Phe Gln Asn Trp Leu Glu Glu His Ile Asn Lys Arg Glu
            260                 265                 270
Lys Met Glu Val Asn Ala Glu Gly Asn Glu Gln Asp Phe Ile Asp Val
        275                 280                 285
Val Leu Ser Lys Met Ser Asn Glu Tyr Leu Gly Glu Gly Tyr Ser Arg
    290                 295                 300
Asp Thr Val Ile Lys Ala Thr Val Phe Ser Leu Val Leu Asp Ala Ala
305                 310                 315                 320
Asp Thr Val Ala Leu His Ile Asn Trp Gly Met Ala Leu Leu Ile Asn
                325                 330                 335
Asn Gln Lys Ala Leu Thr Lys Ala Gln Glu Glu Ile Asp Thr Lys Val
            340                 345                 350
Gly Lys Asp Arg Trp Val Glu Glu Ser Asp Ile Lys Asp Leu Val Tyr
        355                 360                 365
Leu Gln Ala Ile Val Lys Glu Val Leu Arg Leu Tyr Pro Pro Gly Pro
    370                 375                 380
Leu Leu Val Pro His Glu Asn Val Glu Asp Cys Val Val Ser Gly Tyr
385                 390                 395                 400
His Ile Pro Lys Gly Thr Arg Leu Phe Ala Asn Val Met Lys Leu Gln
                405                 410                 415
Arg Asp Pro Lys Leu Trp Ser Asp Pro Asp Thr Phe Asp Pro Glu Arg
            420                 425                 430
Phe Ile Ala Thr Asp Ile Asp Phe Arg Gly Gln Tyr Tyr Lys Tyr Ile
        435                 440                 445
Pro Phe Gly Ser Gly Arg Arg Ser Cys Pro Gly Met Thr Tyr Ala Leu
    450                 455                 460
Gln Val Glu His Leu Thr Met Ala His Leu Ile Gln Gly Phe Asn Tyr
465                 470                 475                 480
Arg Thr Pro Asn Asp Glu Pro Leu Asp Met Lys Glu Gly Ala Gly Ile
                485                 490                 495
Thr Ile Arg Lys Val Asn Pro Val Glu Leu Ile Ile Ala Pro Arg Leu
            500                 505                 510
Ala Pro Glu Leu Tyr
        515
<210>26
<211>517
<212>PRT
<213>普通烟草
<400>26
Met Leu Ser Pro Ile Glu Ala Ile Val Gly Leu Val Thr Phe Thr Phe
  1               5                  10                  15
Leu Phe Phe Phe Leu Trp Thr Lys Lys Ser Gln Lys Pro Ser Lys Pro
             20                  25                  30
Leu Pro Pro Lys Ile Pro Gly Gly Trp Pro Val Ile Gly His Leu Phe
         35                  40                  45
His Phe Asn Asp Asp Gly Asp Asp Arg Pro Leu Ala Arg Lys Leu Gly
     50                  55                  60
Asp Leu Ala Asp Lys Tyr Gly Pro Val Phe Thr Phe Arg Leu Gly Leu
 65                  70                  75                  80
Pro Leu Val Leu Val Val Ser Ser Tyr Glu Ala Val Lys Asp Cys Phe
                 85                  90                  95
Ser Thr Asn Asp Ala Ile Phe Ser Asn Arg Pro Ala Phe Leu Tyr Gly
            100                 105                 110
Asp Tyr Leu Gly Tyr Asn Asn Ala Met Leu Phe Leu Ala Asn Tyr Gly
        115                 120                 125
Pro Tyr Trp Arg Lys Asn Arg Lys Leu Val Ile Gln Glu Val Leu Ser
    130                 135                 140
Ala Ser Arg Leu Glu Lys Phe Lys His Val Arg Phe Ala Arg Ile Gln
145                 150                 155                 160
Ala Ser Ile Lys Asn Leu Tyr Thr Arg Ile Asp Gly Asn Ser Ser Thr
                165                 170                 175
Ile Asn Leu Thr Asp Trp Leu Glu Glu Leu Asn Phe Gly Leu Ile Val
            180                 185                 190
Lys Met Ile Ala Gly Lys Asn Tyr Glu Ser Gly Lys Gly Asp Glu Gln
        195                 200                 205
Val Glu Arg Phe Lys Lys Ala Phe Lys Asp Phe Met Ile Leu Ser Met
    210                 215                 220
Glu Phe Val Leu Trp Asp Ala Phe Pro Ile Pro Leu Phe Lys Trp Val
225                 230                 235                 240
Asp Phe Gln Gly His Val Lys Ala Met Lys Arg Thr Phe Lys Asp Ile
                245                 250                 255
Asp Ser Val Phe Gln Asn Trp Leu Glu Glu His Ile Asn Lys Arg Glu
            260                 265                 270
Lys Met Glu Val Asn Ala Glu Gly Asn Glu Gln Asp Phe Ile Asp Val
        275                 280                 285
Val Leu Ser Lys Met Ser Asn Glu Tyr Leu Gly Glu Gly Tyr Ser Arg
    290                 295                 300
Asp Thr Val Ile Lys Ala Thr Val Phe Ser Leu Val Leu Asp Ala Ala
305                 310                 315                 320
Asp Thr Val Ala Leu His Ile Asn Trp Gly Met Ala Leu Leu Ile Asn
                325                 330                 335
Asn Gln Lys Ala Leu Thr Lys Ala Gln Glu Glu Ile Asp Thr Lys Val
            340                 345                 350
Gly Lys Asp Arg Trp Val Glu Glu Ser Asp Ile Lys Asp Leu Val Tyr
        355                 360                 365
Leu Gln Ala Ile Val Lys Glu Val Leu Arg Leu Tyr Pro Pro Gly Pro
    370                 375                 380
Leu Leu Val Pro His Glu Asn Val Glu Asp Cys Val Val Ser Gly Tyr
385                 390                 395                 400
His Ile Pro Lys Gly Thr Arg Leu Phe Ala Asn Val Met Lys Leu Leu
                405                 410                 415
Arg Asp Pro Lys Leu Trp Pro Asp Pro Asp Thr Phe Asp Pro Glu Arg
            420                 425                 430
Phe Ile Ala Thr Asp Ile Asp Phe Arg Gly Gln Tyr Tyr Lys Tyr Ile
        435                 440                 445
Pro Phe Gly Ser Gly Arg Arg Ser Cys Pro Gly Met Thr Tyr Ala Leu
    450                 455                 460
Gln Val Glu His Leu Thr Met Ala His Leu Ile Gln Gly Phe Asn Tyr
465                 470                 475                 480
Arg Thr Pro Asn Asp Glu Pro Leu Asp Met Lys Glu Gly Ala Gly Ile
                485                 490                 495
Thr Ile Arg Lys Val Asn Pro Val Glu Leu Ile Ile Ala Pro Arg Leu
            500                 505                 510
Ala Pro Glu Leu Tyr
        515
<210>27
<211>517
<212>PRT
<213>普通烟草
<400>27
Met Leu Ser Pro Ile Glu Ala Ile Val Gly Leu Val Thr Phe Thr Phe
  1               5                  10                  15
Leu Phe Phe Phe Leu Trp Thr Lys Lys Ser Gln Lys Pro Ser Lys Pro
             20                  25                  30
Leu Pro Pro Lys Ile Pro Gly Gly Trp Pro Val Ile Gly His Leu Phe
         35                  40                   45
His Phe Asn Asp Asp Gly Asp Asp Arg Pro Leu Ala Arg Lys Leu Gly
     50                  55                  60
Asp Leu Ala Asp Lys Tyr Gly Pro Val Phe Thr Phe Arg Leu Gly Leu
 65                  70                  75                  80
Pro Leu Val Leu Val Val Ser Ser Tyr Glu Ala Val Lys Asp Cys Phe
                 85                  90                  95
Ser Thr Asn Asp Ala Ile Phe Ser Asn Arg Pro Ala Phe Leu Tyr Gly
            100                 105                 110
Asp Tyr Leu Gly Tyr Asn Asn Ala Met Leu Phe Leu Ala Asn Tyr Gly
        115                 120                 125
Pro Tyr Trp Arg Lys Asn Arg Lys Leu Val Ile Gln Glu Val Leu Ser
    130                 135                 140
Ala Ser Arg Leu Glu Lys Phe Lys His Val Arg Phe Ala Arg Ile Gln
145                 150                 155                 160
Ala Ser Ile Lys Asn Leu Tyr Thr Arg Ile Asp Gly Asn Ser Ser Thr
                165                 170                 175
Ile Asn Leu Thr Asp Trp Leu Glu Glu Leu Asn Phe Gly Leu Ile Val
            180                 185                 190
Lys Met Ile Ala Gly Lys Asn Tyr Glu Ser Gly Lys Gly Asp Glu Gln
        195                 200                 205
Val Glu Arg Phe Lys Lys Ala Phe Lys Asp Phe Met Ile Leu Ser Met
    210                 215                 220
Glu Phe Val Leu Trp Asp Ala Phe Pro Ile Pro Leu Phe Lys Trp Val
225                 230                 235                 240
Asp Phe Gln Gly His Val Lys Ala Met Lys Arg Thr Phe Lys Asp Ile
                245                 250                 255
Asp Ser Val Phe Gln Asn Trp Leu Glu Glu His Ile Asn Lys Arg Glu
            260                 265                 270
Lys Met Glu Val Asn Ala Glu Gly Asn Glu Gln Asp Phe Ile Asp Val
        275                 280                 285
Val Leu Ser Lys Met Ser Asn Glu Tyr Leu Gly Glu Gly Tyr Ser Arg
    290                 295                 300
Asp Thr Val Ile Glu Ala Thr Val Phe Ser Leu Val Leu Asp Ala Ala
305                 310                 315                 320
Asp Thr Val Ala Leu His Ile Asn Trp Gly Met Ala Leu Leu Ile Asn
                325                 330                 335
Asn Gln Lys Ala Leu Thr Lys Ala Gln Glu Glu Ile Asp Thr Lys Val
            340                 345                 350
Cys Lys Asp Arg Trp Val Glu Glu Ser Asp Ile Lys Asp Leu Val Tyr
        355                 360                 365
Leu Gln Ala Ile Val Lys Glu Val Leu Arg Leu Tyr Pro Pro Gly Pro
    370                 375                 380
Leu Leu Val Pro His Glu Asn Val Glu Asp Cys Val Val Ser Gly Tyr
385                 390                 395                 400
His Ile Pro Lys Gly Thr Arg Leu Phe Ala Asn Val Met Lys Leu Gln
                405                 410                 415
Arg Asp Pro Lys Leu Trp Ser Asp Pro Asp Thr Phe Asp Pro Glu Arg
            420                 425                 430
Phe Ile Ala Thr Asp Ile Asp Phe Arg Gly Gln Tyr Tyr Lys Tyr Ile
        435                 440                 445
Pro Phe Gly Pro Gly Arg Arg Ser Cys Pro Gly Met Thr Tyr Ala Leu
    450                 455                 460
Gln Val Glu His Leu Thr Met Ala His Leu Ile Gln Gly Phe Asn Tyr
465                 470                 475                 480
Arg Thr Pro Asn Asp Glu Pro Leu Asp Met Lys Glu Gly Ala Gly Ile
                485                 490                 495
Thr IIe Arg Lys Val Asn Pro Val Glu Leu Ile Ile Ala Pro Arg Leu
            500                 505                 510
Ala Pro Glu Leu Tyr
        515
<210>28
<211>517
<212>PRT
<213>普通烟草
<400>28
Met Val Phe Pro Ile Glu Ala Ile Val Gly Leu Val Thr Phe Thr Phe
  1               5                  10                  15
Leu Phe Tyr Phe Leu Trp Thr Lys Lys Ser Gln Lys Pro Ser Lys Pro
             20                  25                  30
Leu Pro Pro Lys Ile Pro Gly Gly Trp Pro Val Ile Gly His Leu Phe
         35                  40                  45
His Phe Asn Asp Asp Gly Asn Asp Arg Pro Leu Ala Arg Lys Leu Gly
     50                  55                  60
Asp Leu Ala Asp Lys Tyr Gly Pro Val Phe Thr Phe Arg Leu Gly Leu
 65                  70                  75                  80
Pro Leu Val Leu Val Val Ser Ser Tyr Glu Ala Ile Lys Asp Cys Phe
                 85                  90                  95
Ser Thr Asn Asp Ala Ile Phe Ser Asn Arg Pro Ala Phe Leu Tyr Gly
            100                 105                 110
Glu Tyr Leu Gly Tyr Asn Asn Ala Met Leu Phe Leu Ala Asn Tyr Gly
        115                 120                 125
Pro Tyr Trp Arg Lys Asn Arg Lys Leu Val Ile Gln Glu Val Leu Ser
    130                 135                 140
Ala Ser Arg Leu Lys Lys Phe Lys His Val Arg Phe Ala Arg Ile Gln
145                 150                 155                 160
Thr Ser Ile Lys Asn Leu Tyr Thr Arg Ile Asp Arg Asn Ser Ser Thr
                165                 170                 175
Ile Asn Leu Thr Asp Trp Leu Glu Glu Leu Asn Phe Gly Leu Ile Val
            180                 185                 190
Lys Met Ile Ala Gly Lys Asn Tyr Glu Ser Gly Lys Gly Asp Glu Gln
        195                 200                 205
Val Glu Arg Phe Lys Lys Ala Phe Lys Asp Phe Met Ile Ile Ser Met
    210                 215                 220
Glu Phe Val Leu Trp Asp Ala Phe Pro Ile Pro Leu Phe Lys Trp Val
225                 230                 235                 240
Asp Phe Gln Gly His Val Lys Ala Met Lys Arg Thr Phe Lys Asp Ile
                245                 250                 255
Asp Ser Val Phe Gln Asn Trp Leu Glu Glu His Ile Asn Lys Arg Glu
            260                 265                 270
Lys Met Glu Val Asn Ala Glu Gly Asn Glu Gln Asp Phe Ile Asp Val
        275                 280                 285
Val Leu Ser Lys Met Ser Asn Glu Tyr Leu Gly Glu Gly Tyr Ser Arg
    290                 295                 300
Asp Thr Val Ile Lys Ala Thr Val Phe Ser Leu Val Leu Asp Ala Ala
305                 310                 315                 320
Asp Thr Val Ala Leu His Ile Asn Trp Gly Met Ala Leu Leu Ile Asn
                325                 330                 335
Asn Gln Asn Ala Leu Lys Lys Ala Gln Glu Glu Ile Asp Thr Ile Val
            340                 345                 350
Gly Lys Asp Arg Trp Val Glu Glu Ser Asp Ile Lys Asp Leu Val Tyr
        355                 360                 365
Leu Gln Ala Ile Val Lys Glu Val Leu Arg Leu Tyr Pro Pro Gly Pro
    370                 375                 380
Leu Leu Val Pro His Glu Asn Ile Glu Asp Cys Val Val Ser Gly Tyr
385                 390                 395                 400
Tyr Ile Ser Lys Gly Thr Arg Leu Phe Ala Asn Val Met Lys Leu Gln
                405                 410                 415
Arg Asp Pro Lys Leu Trp Pro Asn Pro Asp Asn Phe Asp Pro Glu Arg
            420                 425                 430
Phe Val Ala Ala Gly Ile Asp Phe Arg Gly Gln His Tyr Glu Tyr Ile
        435                 440                 445
Pro Phe Gly Ser Gly Arg Arg Ser Cys Pro Gly Met Thr Tyr Ala Leu
    450                 455                 460
Gln Val Glu His Leu Thr Met Ala His Leu Ile Gln Gly Phe Asn Tyr
465                 470                 475                 480
Ser Thr Pro Asn Asp Glu Pro Leu Asp Met Lys Glu Gly Ala Gly Ile
                485                 490                 495
Thr Ile Arg Lys Val Asn Pro Val Glu Val Ile Ile Met Pro Arg Leu
            500                 505                 510
Ala Pro Glu Leu Tyr
        515
<210>29
<211>518
<212>PRT
<213>普通烟草
<400>29
Met Val Phe Pro Val Glu Ala Ile Val Gly Leu Val Thr Phe Thr Phe
  1               5                  10                  15
Leu Phe Tyr Phe Leu Trp Thr Lys Lys Ser Gln Lys Pro Ser Lys Pro
             20                  25                  30
Leu Pro Pro Lys Ile Pro Gly Gly Trp Pro Val Ile Gly His Leu Phe
         35                  40                  45
Tyr Phe Asp Asp Asp Gly Asp Asp Arg Pro Leu Ala Arg Lys Leu Gly
     50                 55                  60
Asp Leu Ala Asp Lys Tyr Gly Pro Val Phe Thr Phe Arg Leu Gly Leu
 65                  70                  75                  80
Pro Leu Val Leu Val Val Ser Ser Tyr Glu Ala Ile Lys Asp Cys Phe
                 85                  90                  95
Ser Thr Asn Asp Ala Ile Phe Ser Asn Arg Pro Ala Phe Leu Tyr Gly
            100                 105                 110
Glu Tyr Leu Gly Tyr Lys Asn Ala Met Leu Phe Leu Ala Asn Tyr Gly
        115                 120                 125
Ser Tyr Trp Arg Lys Asn Arg Lys Leu Ile Ile Gln Glu Val Leu Ser
    130                 135                 140
Ala Ser Arg Leu Glu Lys Phe Lys His Val Arg Phe Ala Arg Ile Gln
145                 150                 155                 160
Thr Ser Ile Lys Asn Leu Tyr Thr Arg Ile Asp Gly Asn Ser Ser Thr
                165                 170                 175
Ile Asn Leu Thr Asp Trp Leu Glu Glu Leu Asn Phe Gly Leu Ile Val
            180                 185                 190
Lys Met Ile Ala Gly Lys Asn Tyr Glu Ser Gly Lys Gly Asp Glu Gln
        195                 200                 205
Val Glu Arg Phe Lys Lys Ala Phe Lys Asp Phe Met Ile Leu Ser Met
    210                 215                 220
Glu Phe Val Leu Trp Asp Ala Phe Pro Ile Pro Leu Phe Lys Trp Val
225                 230                 235                 240
Asp Phe Gln Gly His Val Lys Ala Met Lys Arg Thr Phe Lys Asp Ile
                245                 250                 255
Asp Ser Val Phe Gln Asn Trp Leu Glu Glu His Ile Lys Lys Arg Glu
            260                 265                 270
Lys Ile Met Glu Val Gly Thr Glu Gly Asn Glu Gln Asp Phe Ile Asp
        275                 280                 285
Val Val Leu Ser Lys Met Ser Asn Glu Tyr Leu Gly Glu Gly Tyr Ser
    290                 295                 300
Arg Asp Thr Val Ile Lys Ala Thr Val Phe Ser Leu Val Leu Asp Ala
305                 310                 315                 320
Ala Asp Thr Val Ala Leu His Ile Asn Cys Gly Met Ala Leu Leu Ile
                325                 330                 335
Asn Asn Gln Asn Ala Leu Lys Lys Ala Gln Glu Glu Ile Asp Thr Lys
            340                 345                 350
Val Gly Lys Asp Arg Trp Val Glu Glu Ser Asp Ile Lys Asp Leu Val
        355                 360                 365
Tyr Leu Gln Ala Ile Val Lys Glu Val Leu Arg Leu Tyr Pro Pro Gly
    370                 375                 380
Pro Leu Leu Val Pro His Glu Asn Val Glu Asp Cys Val Val Ser Gly
385                 390                 395                 400
Tyr His Ile Pro Lys Gly Thr Arg Leu Phe Ala Asn Val Met Lys Leu
                405                 410                 415
Gln Arg Asp Pro Lys Leu Trp Ser Asn Pro Asp Lys Phe Asn Pro Glu
            420                 425                 430
Arg Phe Ile Ala Arg Asp Ile Asp Phe His Gly Gln His Tyr Glu Tyr
        435                 440                 445
Ile Pro Phe Gly Ser Gly Arg Arg Ser Cys Pro Gly Met Thr Tyr Ala
    450                 455                 460
Leu Gln Val Glu His Leu Thr Met Ala His Leu Ile Gln Gly Phe Asn
465                 470                 475                 480
Tyr Arg Thr Pro Thr Asp Glu Pro Leu Asp Met Lys Glu Gly Ala Gly
                485                 490                 495
Ile Thr Ile Arg Lys Val Asn Pro Val Lys Val Ile Ile Thr Pro Arg
            500                 505                 510
Leu Ala Pro Glu Leu Tyr
        515
<210>30
<211>517
<212>PRT
<213>普通烟草
<400>30
Met Val Phe Pro Ile Glu Ala Phe Val Gly Leu Val Thr Phe Thr Phe
  1               5                  10                  15
Leu Leu Tyr Phe Leu Trp Thr Lys Lys Ser Gln Lys Leu Pro Lys Pro
             20                  25                  30
Leu Pro Pro Lys Ile Pro Gly Gly Trp Pro Val Ile Gly His Leu Phe
         35                  40                  45
His Phe Asn Asn Asp Gly Asp Asp Arg Pro Leu Ala Arg Lys Leu Gly
     50                  55                  60
Asp Leu Ala Asp Lys Tyr Gly Pro Val Phe Thr Phe Arg Leu Gly Leu
 65                  70                  75                  80
Pro Leu Val Leu Val Val Ser Ser Tyr Glu Ala Ile Lys Asp Cys Phe
                 85                  90                  95
Ser Thr Asn Asp Ala Ile Phe Ser Asn Arg Pro Ala Phe Leu Tyr Gly
            100                 105                 110
Glu Tyr Leu Gly Tyr Asn Asn Thr Met Leu Phe Leu Ala Asn Tyr Gly
        115                 120                 125
Pro Tyr Trp Arg Lys Asn Arg Lys Leu Val Ile Gln Glu Val Leu Ser
    130                 135                 140
Ala Ser Arg Leu Glu Lys Phe Lys Gln Val Arg Phe Thr Arg Ile Gln
145                 150                 155                 160
Thr Ser Ile Lys Asn Leu Tyr Thr Arg Ile Asn Gly Asn Ser Ser Thr
                165                 170                 175
Ile Asn Leu Thr Asp Trp Leu Glu Glu Leu Asn Phe Gly Leu Ile Val
            180                 185                 190
Lys Met Ile Ala Gly Lys Asn Tyr Glu Ser Gly Lys Gly Asp Glu Gln
        195                 200                 205
Val Glu Arg Phe Lys Asn Ala Phe Lys Asp Phe Met Val Leu Ser Met
    210                 215                 220
Glu Phe Val Leu Trp Asp Ala Phe Pro Ile Pro Leu Phe Lys Trp Val
225                 230                 235                 240
Asp Phe Gln Gly His Ile Lys Ala Met Lys Arg Thr Phe Lys Asp Ile
                245                 250                 255
Asp Ser Val Phe Gln Asn Trp Leu Glu Glu His Ile Asn Lys Arg Glu
            260                 265                 270
Lys Met Glu Val Gly Ala Glu Gly Asn Glu Gln Asp Phe Ile Asp Val
        275                 280                 285
Val Leu Ser Lys Leu Ser Lys Glu Tyr Leu Asp Glu Gly Tyr Ser Arg
    290                 295                 300
Asp Thr Val Ile Lys Ala Thr Val Phe Ser Leu Val Leu Asp Ala Ala
305                 310                 315                 320
Asp Thr Val Ala Leu His Ile Asn Trp Gly Met Thr Leu Leu Ile Asn
                325                 330                 335
Asn Gln Asn Ala Leu Met Lys Ala Gln Glu Glu Ile Asp Thr Lys Val
            340                 345                 350
Gly Lys Asp Arg Trp Val Glu Glu Ser Asp Ile Lys Asp Leu Val Tyr
        355                 360                 365
Leu Gln Ala Ile Val Lys Lys Val Leu Arg Leu Tyr Pro Pro Gly Pro
    370                 375                 380
Leu Leu Val Pro His Glu Asn Val Lys Asp Cys Val Val Ser Gly Tyr
385                 390                 395                 400
His Ile Pro Lys Gly Thr Arg Leu Phe Ala Asn Val Met Lys Leu Gln
                405                 410                 415
Arg Asp Pro Lys Leu Leu Ser Asn Pro Asp Lys Phe Asp Pro Glu Arg
            420                 425                 430
Phe Ile Ala Gly Asp Ile Asp Phe Arg Gly His His Tyr Glu Phe Ile
        435                 440                 445
Pro Phe Gly Ser Gly Arg Arg Ser Cys Pro Gly Met Thr Tyr Ala Leu
    450                 455                 460
Gln Val Glu His Leu Thr Met Ala His Leu Ile Gln Gly Phe Asn Tyr
465                 470                 475                 480
Lys Thr Pro Asn Asp Glu Ala Leu Asp Met Lys Glu Gly Ala Gly Ile
                485                 490                 495
Thr Ile Arg Lys Val Asn Pro ValGlu Leu Ile Ile Thr Pro Arg Leu
            500                 505                 510
Ala Pro Glu Leu Tyr
         515
<210>31
<211>517
<212>PRT
<213>普通烟草
<400>31
Met Leu Ser Pro Ile Glu Ala Phe Val Gly Leu Val Thr Phe Thr Phe
  1               5                  10                  15
Leu Leu Tyr Phe Leu Trp Thr Lys Lys Ser Gln Lys Leu Pro Lys Pro
             20                  25                  30
Leu Pro Pro Lys Ile Pro Gly Gly Trp Pro Val Ile Gly His Leu Phe
         35                  40                  45
His Phe Asn Asn Asp Gly Asp Asp Arg Pro Leu Ala Arg Lys Leu Gly
     50                  55                  60
Asp Leu Ala Asp Lys Tyr Gly Pro Val Phe Thr Phe Arg Leu Gly Leu
 65                  70                  75                  80
Pro Leu Val Leu Val Val Ser Ser Tyr Glu Ala Ile Lys Asp Cys Phe
                 85                  90                  95
Ser Thr Asn Asp Ala Ile Phe Ser Asn Arg Pro Ala Leu Leu Tyr Gly
            100                 105                 110
Glu Tyr Leu Gly Tyr Asn Asn Thr Met Leu Phe Leu Ala Asn Tyr Gly
        115                 120                 125
Pro Tyr Trp Arg Lys Asn Arg Lys Leu Val Ile Gln Glu Val Leu Ser
    130                 135                 140
Ala Ser Arg Leu Glu Lys Phe Lys Gln Val Arg Phe Thr Arg Ile Gln
145                 150                 155                 160
Thr Ser Ile Lys Asn Leu Tyr Thr Arg Ile Asn Gly Asn Ser Ser Thr
                165                 170                 175
Ile Asn Leu Thr Asp Trp Leu Glu Glu Leu Asn Phe Gly Leu Ile Val
            180                 185                 190
Lys Met Ile Ala Gly Lys Asn Tyr Glu Ser Gly Lys Gly Asp Glu Gln
        195                 200                 205
Val Glu Arg Phe Lys Asn Ala Phe Lys Asp Phe Met Val Leu Ser Met
    210                 215                 220
Glu Phe Val Leu Trp Asp Ala Phe Pro Ile Pro Leu Phe Lys Trp Val
225                 230                 235                 240
Asp Phe Gln Gly His Ile Lys Ala Met Lys Arg Thr Phe Lys Asp Ile
                245                 250                 255
Asp Ser Val Phe Gln Asn Trp Leu Glu Glu His Ile Asn Lys Arg Glu
            260                 265                 270
Lys Ile Glu Val Gly Ala Glu Gly Asn Glu Gln Asp Phe Ile Asp Val
        275                 280                 285
Val Leu Ser Lys Leu Ser Lys Glu Tyr Leu Asp Glu Gly Tyr Ser Arg
    290                 295                 300
Asp Thr Val Ile Lys Ala Thr Val Phe Ser Leu Val Leu Asp Ala Ala
305                 310                 315                 320
Asp Thr Val Ala Leu His Ile Asn Trp Gly Met Thr Leu Leu Ile Asn
                325                 330                 335
Asn Gln Asn Ala Leu Met Lys Ala Gln Glu Glu Ile Asp Thr Lys Val
            340                 345                 350
Gly Lys Asp Arg Trp Val Glu Glu Ser Asp Ile Lys Asp Leu Val Tyr
        355                 360                 365
Leu Gln Ala Ile Val Lys Lys Val Leu Arg Leu Tyr Pro Pro Gly Pro
    370                 375                 380
Leu Leu Val Pro His Glu Asn Val Lys Asp Cys Val Val Ser Gly Tyr
385                 390                 395                 400
His Ile Pro Lys Gly Thr Arg Leu Phe Ala Asn Val Met Lys Leu Gln
                405                 410                 415
Arg Asp Pro Lys Leu Leu Ser Asn Pro Asp Lys Phe Asp Pro Glu Arg
            420                 425                 430
Phe Ile Ala Gly Asp Ile Asp Phe Arg Gly His His Tyr Glu Phe Ile
        435                 440                 445
Pro Phe Gly Ser Gly Arg Arg Ser Cys Pro Gly Met Thr Tyr Ala Leu
    450                 455                 460
Gln Val Glu His Leu Thr Met Ala His Leu Ile Gln Gly Phe Asn Tyr
465                 470                 475                 480
Lys Thr Pro Asn Asp Glu Ala Leu Asp Met Lys Glu Gly Ala Gly Ile
                485                 490                 495
Thr Ile Arg Lys Val Asn Pro Val Glu Leu Ile Ile Thr Pro Arg Leu
            500                 505                 510
Ala Pro Glu Leu Tyr
        515
<210>32
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：合成的引物
<400>32
tggaattatg cccatcctac a                                      21
<210>33
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：合成的引物
<400>33
cattagtggt tgcacctgag g                                      21
<210>34
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：合成的引物
<400>34
gatgagatgt gtgcatactt g                                      21
<210>35
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：合成的引物
<400>35
ccaaattaga aaaactcgta ctg                                              23
<210>36
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：合成的引物
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attgtaggac tagtaaccct tacac                                            25
<210>37
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：合成的引物
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gaggcacaaa gaattctcat c                                                21
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<220>
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<223>人工序列的描述：合成的引物
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gtacaatcaa gataaaacat ctaagg                                     26
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<212>DNA
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<220>
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<220>
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<212>DNA
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<220>
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acgtgatcct aaactctggt ctg                                         23
<210>45
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<220>
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gcctgcacct tccttcatg                                              19
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<211>23
<212>DNA
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<220>
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gggatgactt atgcattaca agc                                           23
<210>47
<211>25
<212>DNA
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<220>
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aattgtcact tctacaggat ttact                                         25
<210>48
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<212>DNA
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<220>
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<210>49
<211>20
<212>DNA
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<220>
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<400>49
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<210>50
<211>1733
<212>DNA
<213>烟草属物种
<220>
<221>CDS
<222>(1)...(1551)
<400>3
atg ctt tct ccc ata gaa gcc att gta gga cta gta acc ttc aca ttt   48
Met Leu Ser Pro Ile Glu Ala Ile Val Gly Leu Val Thr Phe Thr Phe
 1               5                   10                  15
ctc ttc ttc ttc cta tgg aca aaa aaa tct caa aaa cct tca aaa ccc   96
Leu Phe Phe Phe Leu Trp Thr Lys Lys Ser Gln Lys Pro Ser Lys Pro
             20                  25                  30
tta cca ccg aaa atc ccc gga gga tgg ccg gta atc ggc cat ctt ttc  144
Leu Pro Pro Lys Ile Pro Gly Gly Trp Pro Val Ile Gly His Leu Phe
         35                  40                  45
cac ttc aat gac gac ggc gac gac cgt cca tta gct cga aaa ctc gga  192
His Phe Asn Asp Asp Gly Asp Asp Arg Pro Leu Ala Arg Lys Leu Gly
     50                  55                  60
gac tta gct gac aaa tac ggc ccc gtt ttc act ttt cgg cta ggc ctt  240
Asp Leu Ala Asp Lys Tyr Gly Pro Val Phe Thr Phe Arg Leu Gly Leu
 65                  70                  75                  80
ccc ctt gtc tta gtt gta agc agt tac gaa gct gta aaa gac tgt ttc  288
Pro Leu Val Leu Val Val Ser Ser Tyr Glu Ala Val Lys Asp Cys Phe
                 85                  90                  95
tct aca aat gac gcc att ttt tcc aat cgt cca gct ttt ctt tac ggc  336
Ser Thr Asn Asp Ala Ile Phe Ser Asn Arg Pro Ala Phe Leu Tyr Gly
            100                 105                 110
gat tac ctt ggc tac aat aat gcc atg cta ttt ttg gcc aat tac gga  384
Asp Tyr Leu Gly Tyr Asn Asn Ala Met Leu Phe Leu Ala Asn Tyr Gly
        115                 120                 125
cct tac tgg cga aaa aat cga aaa tta gtt att cag gaa gtt ctc tcc    432
Pro Tyr Trp Arg Lys Asn Arg Lys Leu Val Ile Gln Glu Val Leu Ser
    130                 135                 140
gct agt cgt ctc gaa aaa ttc aaa cac gtg aga ttt gca aga att caa    480
Ala Ser Arg Leu Glu Lys Phe Lys His Val Arg Phe Ala Arg Ile Gln
145                 150                 155                 160
gcg agc att aag aat tta tat act cga att gat gga aat tcg agt acg    528
Ala Ser Ile Lys Asn Leu Tyr Thr Arg Ile Asp Gly Asn Ser Ser Thr
                165                 170                 175
ata aat tta act gat tgg tta gaa gaa ttg aat ttt ggt ctg atc gtg    576
Ile Asn Leu Thr Asp Trp Leu Glu Glu Leu Asn Phe Gly Leu Ile Val
            180                 185                 190
aag atg atc gct gga aaa aat tat gaa tcc ggt aaa gga gat gaa caa    624
Lys Met Ile Ala Gly Lys Asn Tyr Glu Ser Gly Lys Gly Asp Glu Gln
        195                 200                 205
gtg gag aga ttt aag aaa gcg ttt aag gat ttt atg att tta tca atg    672
Val Glu Arg Phe Lys Lys Ala Phe Lys Asp Phe MetIle Leu Ser Met
    210                 215                 220
gag ttt gtg tta tgg gat gca ttt cca att cca tta ttt aaa tgg gtg    720
Glu Phe Val Leu Trp Asp Ala Phe Pro Ile Pro Leu Phe Lys Trp Val
225                 230                 235                 240
gat ttt caa ggg cat gtt aag gct atg aaa agg act ttt aaa gat ata    768
Asp Phe Gln Gly His Val Lys Ala Met Lys Arg Thr Phe Lys Asp Ile
                245                 250                 255
gat tct gtt ttt cag aat tgg tta gag gaa cat att aat aaa aga gaa    816
Asp Ser Val Phe Gln Asn Trp Leu Glu Glu His Ile Asn Lys Arg Glu
            260                 265                 270
aaa atg gag gtt aat gca gaa ggg aat gaa caa gat ttc att gat gtg    864
Lys Met Glu Val Asn Ala Glu Gly Asn Glu Gln Asp Phe Ile Asp Val
        275                 280                 285
gtg ctt tca aaa atg agt aat gaa tat ctt ggt gaa ggt tac tct cgt    912
Val Leu Ser Lys Met Ser Asn Glu Tyr Leu Gly Glu Gly Tyr Ser Arg
    290                 295                 300
gat act gtc att aaa gca acg gtg ttt agt ttg gtc ttg gat gca gca     960
Asp Thr Val Ile Lys Ala Thr Val Phe Ser Leu Val Leu Asp Ala Ala
305                 310                 315                 320
gac aca gtt gct ctt cac ata aat tgg gga atg gca tta ttg ata aac    1008
Asp Thr Val Ala Leu His Ile Asn Trp Gly Met Ala Leu Leu Ile Asn
                325                 330                 335
aat caa aag gcc ttg acg aaa gca caa gaa gag ata gac aca aaa gtt    1056
Asn Gln Lys Ala Leu Thr Lys Ala Gln Glu Glu Ile Asp Thr Lys Val
            340                 345                 350
ggt aag gac aga tgg gta gaa gag agt gat att aag gat ttg gta tac    1104
Gly Lys Asp Arg Trp Val Glu Glu Ser AspIle Lys Asp Leu Val Tyr
        355                 360                 365
ctc caa gct att gtt aaa gaa gtg tta cga tta tat cca cca gga cct    1152
Leu Gln Ala Ile Val Lys Glu Val Leu Arg Leu Tyr Pro Pro Gly Pro
    370                 375                 380
ttg tta gta cca cac gaa aat gta gaa gat tgt gtt gtt agt gga tat    1200
Leu Leu Val Pro His Glu Asn Val Glu Asp Cys Val Val Ser Gly Tyr
385                 390                 395                 400
cac att cct aaa ggg aca aga tta ttc gca aac gtc atg aaa ctg caa    1248
His Ile Pro Lys Gly Thr Arg Leu Phe Ala Asn Val Met Lys Leu Gln
                405                 410                 415
cgt gat cct aaa ctc tgg tct gat cct gat act ttc gat cca gag aga    1296
Arg Asp Pro Lys Leu Trp Ser Asp Pro Asp Thr Phe Asp Pro Glu Arg
            420                 425                 430
ttc att gct act gat att gac ttt cgt ggt cag tac tat aag tat atc    1344
Phe Ile Ala Thr Asp Ile Asp Phe Arg Gly Gln Tyr Tyr Lys Tyr Ile
        435                 440                 445
ccg ttt ggt tct gga aga cga tct tgt cca ggg atg act tat gca ttg    1392
Pro Phe Gly Ser Gly Arg Arg Ser Cys Pro Gly Met Thr Tyr Ala Leu
    450                 455                 460
caa gtg gaa cac tta aca atg gca cat ttg atc caa ggt ttc aat tac    1440
Gln Val Glu His Leu Thr Met Ala His Leu Ile Gln Gly Phe Asn Tyr
465                 470                 475                 480
aga act cca aat gac gag ccc ttg gat atg aag gaa ggt gca ggc ata    1488
Arg Thr Pro Asn Asp Glu Pro Leu Asp Met Lys Glu Gly Ala Gly Ile
                485                 490                 495
act ata cgt aag gta aat cct gtg gaa ctg ata ata gcg cct cgc ctg    1536
Thr Ile Arg Lys Val Asn Pro Val Glu Leu Ile Ile Ala Pro Arg Leu
            500                 505                 510
gca cct gag ctt tat taaaacctaa gatctttcat cttggttgat cattgtataa    1591
Ala Pro Glu Leu Tyr
        515
tactcctaaa tggatattca tttacctttt atcaattaat tgtcagtacg agtttttcta  1651
atttggtaca tttgtaataa taagtaaaga ataattgtgc taatatataa aggtttgtag  1711
aagataattg actgattgtc cc                                           1733

Claims (26)

1.用于获得具有降低水平的降烟碱的烟草植物或其细胞或部分的方法，其中所述烟草植物或其细胞或部分是烟草属的，并且所述植物的部分选自植物原生质体、植物细胞组织培养物，植物愈伤组织和植物团块，并且其中所述方法的特征在于其包括步骤：
a)修饰烟草植物细胞的功能性CYP82E5v2等位基因以将等位基因变成无功能的CYP82E5v2，其中所述无功能的CYP82E5v2的氨基酸序列在对应于SEQ ID NO：2的位点422的氨基酸残基上具有W至终止密码子的置换；
b)在植物细胞生长条件下培养所述烟草植物细胞；和
c)从所述烟草植物细胞再生烟草植物或其细胞或部分。
2.权利要求1的方法，其中所述修饰包括定点诱变。
3.权利要求1的方法，其中所述烟草植物或其细胞或部分还在CYP82E4v2烟碱脱甲基酶基因中包含突变，所述基因编码选自SEQ ID NO：13-24的衰老诱导的烟碱脱甲基酶。
4.权利要求3的方法，其中所述烟草植物或其细胞或部分包含在选自残基458、364、329和其组合的位点上具有突变的SEQ ID NO：13的氨基酸序列。
5.权利要求4的方法，其中所述突变选自P458S、K364N和W329Stop。
6.权利要求5的方法，其中所述编码衰老诱导的烟碱脱甲基酶的基因包含核酸序列，所述核酸序列由具有选自C1372T、G1092T和G986A的核苷酸突变的SEQ ID NO：50中所示的序列组成。
7.从通过权利要求1-6任一项的方法获得的烟草植物或其细胞或部分制备的烟草制品。
8.权利要求7的烟草制品，其中所述烟草制品是发烟材料或无烟烟草制品。
9.权利要求8的烟草制品，其中所述无烟烟草制品是鼻烟、嚼烟、溶解性条、树胶或片剂。
10.权利要求8的烟草制品，其中所述发烟材料是香烟。
11.权利要求8的烟草制品，其中所述发烟材料是小雪茄。
12.权利要求8的烟草制品，其中所述发烟材料是雪茄、烟斗烟或不透气或透气嵌入式过滤嘴香烟。
13.制备烟草制品的方法，所述方法包括从通过权利要求1-6任一项的方法获得的烟草植物或其细胞或部分制备所述烟草制品。
14.权利要求13的方法，其中所述烟草制品是发烟材料或无烟烟草制品。
15.权利要求14的方法，其中所述无烟烟草制品是鼻烟、嚼烟、溶解性条、树胶或片剂。
16.权利要求14的方法，其中所述发烟材料是香烟。
17.权利要求14的方法，其中所述发烟材料是小雪茄。
18.权利要求14的方法，其中所述发烟材料是雪茄、烟斗烟或不透气或透气嵌入式过滤嘴香烟。
19.筛选绿叶烟碱脱甲基酶序列的方法，其包括步骤：
a)获得由SEQ ID NO：1的至少200个连续核苷酸组成的核酸序列，其中所述核酸序列在SEQ ID NO：1的核苷酸1266处具有G至A的突变；和
b)鉴定密码子序列，其中所述密码子序列在对应于SEQ ID NO：2的位点422的位置上编码终止密码子。
20.分离的多核苷酸，其由选自下列的核苷酸序列组成：
a)编码SEQ ID NO：12的氨基酸序列的核苷酸序列，或其互补序列；
b)编码绿叶烟碱脱甲基酶的核苷酸序列，其中所述烟碱脱甲基酶在对应于SEQ ID NO：2的位点422的氨基酸残基上具有W至终止密码子的置换；和
c)由SEQ ID NO：1组成的核苷酸序列或其互补序列，其中所述核苷酸序列在所述SEQ ID NO：1的位点1266上具有G至A的核苷酸置换。
21.包含启动子的表达盒，所述启动子在植物细胞中具有功能，且与根据权利要求20的核苷酸序列有效连接。
22.权利要求21的表达盒，其中所述启动子选自诱导型、组成型、或细胞或组织特异性启动子。
23.权利要求22的表达盒，其中所述诱导型启动子是病原体或创伤诱导的启动子。
24.权利要求21的表达盒，其中所述启动子是受环境或发育调控的启动子。
25.分离的多肽，其由SEQ ID NO：12中所示的氨基酸序列组成。
26.用于获得烟草属的植物或其植物部分的方法，其中所述植物的部分选自植物原生质体、植物细胞组织培养物，植物愈伤组织和植物团块，并且所述方法的特征在于其包括：
a)用权利要求21的所述表达盒转化植物细胞；
b)在植物细胞生长条件下培养所述经转化的植物细胞；和
c)从所述经培养的植物细胞再生植物或其植物部分，其中所述植物或其植物部分包含所述表达盒。
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