CN105602961B - 突变的烤烟cyp82e4基因及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种突变的烤烟CYP82E4基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，与野生型的CYP82E4基因相比较，突变位点为：第116位的核苷酸由G突变为A。本发明还公开了该突变基因所编码的蛋白质，如SEQ ID NO.4所示。经研究表明，本发明的突变的烤烟CYP82E4基因，导致烟碱去甲基化酶的表达或功能降低，从而抑制了成熟叶片内烟碱去甲基酶的活性，使得含有该突变基因的烟草植株中的降烟碱含量显著降低。因此，该突变的烤烟CYP82E4基因可用于筛选降烟碱含量低的烟草品种的育种与选育工作：含有该突变基因的烟草植株自交，或与其他烤烟杂交进行常规选育，可获得降烟碱含量低的烟草品种。
Description
技术领域
本发明涉及一种突变的烤烟CYP82E4基因，及其所编码的蛋白质，以及其在导致烟碱去甲基化酶的表达或功能降低中的应用。
背景技术
烟草生物碱主要包括烟碱、降烟碱、新烟草碱、新烟碱，这些生物碱通过直接或者间接亚硝化后分别生成NNK、NNN、NAT、NAB。众多的动物试验研究表明NNK和NNN属于强致癌物质，NAB和NAT仅具有较弱甚至无明显致癌。烟草叶片在调制加工时，降烟碱发生亚硝化反应生成的烟草特有亚硝胺(TSNA)化合物N-亚硝基降烟碱(NNN)可能引起食管癌、口腔癌(Hecht SS Biochemistry,Biology,and Carcinogenicity of Tobacco-Specific N-Nitrosamines.Chemical Research in Toxicology 1998，11:559-603；Hecht SS.Tobaccocarcinogens,their biomarkers and tobacco-induced cancer.Nat Rev Cancer.2003，3:733-744)。而且，NNN不仅是传统烟草产品中已经明确了的有害物质，也是新型低温烟草制品中为数不多的已知强致癌物。
亚硝化过程可能由叶片上的微生物完成，也可能是烘烤过程中生物碱与NOx气体反应产生，但均需叶片提供生物碱作为前体物质，因此，有效降低烟草中的降烟碱含量，可降低NNN水平。
研究发现，降烟碱是由烟碱在烟碱去甲基酶的作用下合成的，虽然烟碱向降烟碱的转化在烟草正常生长阶段(绿叶时期)就开始了，但在收获前降烟碱含量非常低，降烟碱的突然大量积累发生在衰老以及采收后的调制过程。在此过程中，基因CYP82E4表达最强，是影响烟草制品最终降烟碱含量的主要因素。近期的研究也表明，用RNAi技术干涉CYP82E4在烟草中表达，显著降低了烟草降烟碱水平，NNN的含量也随之降低(Lewis RS,Jack AM,Morris JW,Robert VJ,Gavilano LB,Siminszky B,Bush LP,Hayes AJ,Dewey RE(2008)RNA interference(RNAi)-induced suppression of nicotine demethylase activityreduces levels of a key carcinogen in cured tobacco leaves.Plant Biotechnol J6:346-354)。虽然利用转基因技术可以大幅降低烟草中的降烟碱和NNN，但目前转基因烟草在中国尚未通过审批。
中国专利CN 102858983A用非转基因方法获得了白肋烟CYP82E4某些位点的突变，导致白肋烟降烟碱和NNN含量降低，由于我国目前烟叶生产上90％以上种植的是烤烟，该专利中 白肋烟CYP82E4的突变位点引入到烤烟可通过与烤烟品种杂交来完成，但白肋烟与烤烟杂交会导致烤烟品质低劣，因此目前除了创制新种质，在烤烟新品种培育过程中，要想使白肋烟的有益性状转移到烤烟上而没有其他连锁累赘，难度要大一些。因此，虽然在白肋烟上有一些CYP82E4突变体，但还需要在烤烟中获得更多其他类型的CYP82E4突变体，这些突变体来自于烤烟，具有低的降烟碱和NNN，可以实现在烤烟间低降烟碱和NNN的有效转移和直接的低降烟碱烤烟新品种培育。
发明内容
针对上述现有技术，本发明发现了一种突变的烤烟CYP82E4基因，该突变基因可导致烟碱去甲基化酶的表达或功能降低，从而使得含有该突变基因的烟草植株中的降烟碱含量显著降低，该突变基因可用于育种与选育工作：含有该突变基因的烟草植株自交，或与野生型烟草植株杂交，可获得降烟碱含量低的烟草品种。
本发明是通过以下技术方案实现的：
一种突变的烤烟CYP82E4基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，命名为CYP82E4-1，与野生型的CYP82E4基因(野生型的CYP82E4基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示)相比较，突变位点为：第116位的核苷酸由G突变为A。
上述突变的烤烟CYP82E4基因所编码的蛋白质，其氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示，与野生型的CYP82E4基因所编码的蛋白质(野生型的CYP82E4基因所编码的蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示)相比较，突变位点为：第39位由Gly突变为Glu。
经研究表明，本发明的突变的烤烟CYP82E4基因，导致烟碱去甲基化酶的表达或功能降低，从而抑制了成熟叶片内烟碱去甲基酶的活性，使得含有该突变基因的烟草植株中的降烟碱含量显著降低。因此，该突变的烤烟CYP82E4基因可用于筛选降烟碱含量低的烟草品种的育种与选育工作：含有该突变基因的烟草植株自交，或与野生型烟草植株杂交，可获得降烟碱含量低的烟草品种。
一种获得降烟碱含量低的烟草产品的方法，所述方法为：从烟草植物或其植物部分中制备烟草产品，所述烟草植物或其植物部分包含有上述突变的烤烟CYP82E4基因，该突变导致烟碱去甲基化酶的表达或功能降低。
一种降低烟草植物或其植物部分中降烟碱水平或降低烟碱向降烟碱转变率的方法，为：向所述植物基因组引入上述突变的烤烟CYP82E4基因。
一种鉴定具有低含量降烟碱的烟草植物的方法，所述方法为：从待鉴定的烟草植物中提取DNA样品，鉴别该DNA样品中是否含有上述突变的烤烟CYP82E4基因或上述突变的烤烟 CYP82E4基因所编码的蛋白质；若含有，则表明该待鉴定的烟草植物为具有低含量降烟碱的烟草植物。
优选的，所述具有低含量降烟碱的烟草植物中降烟碱的含量约占烟草植物干重的0.04％以下。
所述烟草植物为非转化体。
本发明的突变的烤烟CYP82E4基因，可导致烟碱去甲基化酶的表达或功能降低，从而使得含有该突变基因的烟草植株中的降烟碱含量显著降低，经研究表明，含有该突变基因的烟草植物中的降烟碱含量可降至0.04％，与野生型烟草植物(降烟碱含量0.08％)相比较，降低了50％左右。可以预料到，本发明的突变的烤烟CYP82E4基因在筛选降烟碱含量低的烟草品种的育种与选育工作中有着广阔的应用前景。
本发明中所涉及的术语“低含量”、“降低降烟碱水平”等是指降烟碱在本发明植物或其植物部分或烟草产品中的含量低于同品种烟草以相同方法加工(即培养和收获)的烟草属植物或植物部分或烟草产品(未经遗传改良)中发现的含量。降烟碱的含量可降低10％～50％，包括20％、30％、40％、50％。
本发明中所述烟草植物和品种适于常规生长和收获技术，如在富含肥料或不含肥料的土地上培养、花套袋或不套袋、或者去顶或不去顶。收获的叶和茎可用在任何传统烟草产品中，包括但不限于烟斗、雪茄烟和香烟烟草，以及任何形式的嚼烟包括叶烟、切碎烟丝(shredded tobacco)或生切烟丝(cut tobacco)。
本发明中所涉及的术语“烟草产品”包括但不限于吸烟材料(如任何香烟，包括小雪茄、非通气或通气式过滤嘴香烟、雪茄、烟斗烟)、无烟产品(如鼻烟、嚼烟、生物可降解嵌入物，如树胶、锭剂、溶解条)。参见例如美国专利第2005/0019448号，该文献通过引用纳入本文。
附图说明
图1：CELI酶切对异源双链的酶切。
图2：第二突变混合池的FA96检测。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的说明。
下述实施例中所涉及的仪器、试剂、材料等，若无特别说明，均为现有技术中已有的常规仪器、试剂、材料等，可通过正规商业途径获得。下述实施例中所涉及的实验方法，检测方法等，若无特别说明，均为现有技术中已有的常规实验方法，检测方法等。
实施例1 突变的烤烟CYP82E4基因的发现与分析
(1)烤烟品种中烟100突变二代(M2)群体构建
2012年山东诸城相州试验农场播种中烟100 M2代2700份，每份15个单株，常规管理至开花，每份突变材料单独取样，用DNA提取试剂盒提取DNA。用NONDROP测定DNA浓度并将每份DNA浓度均一化到40ng/L，每4份DNA等量混合，构建成一个包含675个样品的四倍混合池，用于CYP82E4突变体筛选。
(2)CYP82E4的PCR扩增
通过CODDLE软件评估突变活跃区域，在此区域内利用PRIMER 5.0设计CYP82E4特异引物5'-ATTATGCCCATCCTACAGTTACCTA-3'，5'-CATTACTCATTTTTGAAAGCACCAC-3'，进行PCR扩增，PCR体系为PreMix 10μl，Primer(10μM)各0.4μl，DNA模板(40ng/μl)1μl,ddH2O 8.2μl，扩增程序为94℃预变性5min；94℃变性30s，52℃退火30s，72℃延伸30s，运行35个循环；最后72℃延伸7min，99℃10min，70℃20s，每个循环下降0.3℃共70个循环。扩增片段长度为965bp。
(3)CEL酶切
EMS诱变会使基因组产生G-A或者C-T的突变，该突变引起了如图1所示的异源双链位点，CEL I能识别并切割该位点，首先构建酶异源双链酶切体系：10×buffer 1μl，PCR产物4μl，CEL I酶0.5μl,ddH2O 4.5μl混匀，45℃下酶切30min,0.25M EDTA(PH8.0)终止酶切反应。
(4)毛细管电泳检测突变体
利用毛细管电泳仪FA96(美国AATI公司)和配套试剂盒(DNF-910,35-1500bp)进行，运行条件为充入Marker injection 5sec，电压7.5kv；充入样品30sec,电压10kv,电压预电泳9kv，运行电泳9kv，运行时间80min，对675个四倍池混合DNA样品上样，筛选到21个突变体，图2是第二个混合池(共95个样品)筛选结果，该混合池含有5个突变。对所有21个突变体对应的84个单个DNA再进行分别上样，得到突变体的M2代单株。
(5)突变体分析
通过PROVEAN Protein(http://provean.jcvi.org/seq_submit.php)在线软件对突变位点的功能损失预测，PROVEAN得分小于-2.5被认为会影响基因功能，是有害的，大于-2.5被认为是中性的或者突变可忍耐。编号为4216的突变体在核苷酸从5'端第116位由G突变成A，Proven值为-6.671(表1)。
表1 CYP82E4突变体筛选与分析
(6)CYP82E4纯合突变体CYP82E4-1的降烟碱含量分析
突变体4216命名为CYP82E4-1，自交，收获并种植M3代，提取M3代DNA，检测突变位点，发现突变位点在M3代中表现稳定，并获得5个纯合突变体(表2)。纯合突变体分别自交，对CYP82E4-1的5个纯合突变材料和野生型中烟100、K326、NC82在温室生长，现蕾期打顶，打顶后45天取样，常规烤干，用气象色谱仪HP-6890测定降烟碱以及其他生物碱的含 量(结果如表3所示)，分析表明三个烤烟品种第三叶位的降烟碱含量占干重的0.9％以上,第九叶位占干重的0.7％以上,而突变体CYP82E4-1第三叶位的平均降烟碱含量为0.042％,第九叶位的降烟碱平均含量为0.037％,与对照(中烟100)相比，降烟碱含量降低了50％左右。
表2 4216突变体M3代遗传分析
表3 CYP82E4-1和其他烤烟的主要生物碱含量
主要生物碱百分比是指生物碱重量占干重的比例；
降烟碱转化百分比为降烟碱/(降烟碱+烟碱)×100。
中烟100为创制CYP82E4-1突变体的野生型对照。
CYP82E4-1的主要生物碱含量测定为5个纯合突变株系的混合取样，每个株系取3株，其他烤烟品种的生物碱含量为6个单株的平均值。
通过本发明，可以通过非转基因的方法降低烤烟中降烟碱含量，由于CYP82E4突变位点表现稳定，可在烤烟育种上通过杂交的方法实现低降烟碱的有效转移，而且，降低降烟碱可使NNN含量同等降低(Lewis RS，Jack AM,Morris JW,Robert VJM,Gavilano L,Siminszky B,Bush LP,Hayes AJ,Dewey RE.RNAi-induced suppression of nicotinedemethylase activity reduces levels of a key carcinogen in cured tobaccoleaves.Plant Biotech J.2008,6:346-354)。
上述虽然结合实施例对本发明的具体实施方式进行了描述，但并非对本发明保护范围的限制，所属领域技术人员应该明白，在本发明的技术方案的基础上，本领域技术人员不需要付出创造性劳动即可做出的各种修改或变形仍在本发明的保护范围以内。
Claims (9)
1.一种突变的烤烟CYP82E4基因，其特征在于：其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
2.权利要求1所述的突变的烤烟CYP82E4基因所编码的蛋白质，其特征在于：其氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。
3.权利要求1所述的突变的烤烟CYP82E4基因在筛选降烟碱含量低的烟草品种的育种与选育工作中的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：具体应用方式为：含有该突变基因的烟草植株自交，或与其他烤烟品种杂交进行常规选育，可获得降烟碱含量低的烟草品种。
5.一种获得烟草产品的方法，其特征在于：所述方法为：从烟草植物或其植物部分中制备烟草产品，所述烟草植物或其植物部分包含有权利要求1所述的突变的烤烟CYP82E4基因。
6.一种降低烟草植物或其植物部分中降烟碱水平或降低烟碱向降烟碱转变率的方法，其特征在于：所述方法为：向所述植物基因组引入权利要求1所述的突变的烤烟CYP82E4基因。
7.一种鉴定具有低含量降烟碱的烟草植物的方法，其特征在于：所述方法为：从待鉴定的烟草植物中提取DNA样品，鉴别该DNA样品中是否含有权利要求1所述的突变的烤烟CYP82E4基因或权利要求2所述的蛋白质；若含有，则表明该待鉴定的烟草植物为具有低含量降烟碱的烟草植物。
8.根据权利要求7所述的鉴定具有低含量降烟碱的烟草植物的方法，其特征在于：所述具有低含量降烟碱的烟草植物中降烟碱的含量占烟草植物干重的0.04％以下。
9.根据权利要求7或8所述的鉴定具有低含量降烟碱的烟草植物的方法，其特征在于：所述烟草植物为非转化体。
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