JP2009261403A - 植物内の遺伝子発現のdsrna介在調節 - Google Patents
植物内の遺伝子発現のdsrna介在調節 Download PDFInfo
- Publication number
- JP2009261403A JP2009261403A JP2009148820A JP2009148820A JP2009261403A JP 2009261403 A JP2009261403 A JP 2009261403A JP 2009148820 A JP2009148820 A JP 2009148820A JP 2009148820 A JP2009148820 A JP 2009148820A JP 2009261403 A JP2009261403 A JP 2009261403A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- gene
- sense
- expression
- plant
- promoter
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8216—Methods for controlling, regulating or enhancing expression of transgenes in plant cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8216—Methods for controlling, regulating or enhancing expression of transgenes in plant cells
- C12N15/8218—Antisense, co-suppression, viral induced gene silencing [VIGS], post-transcriptional induced gene silencing [PTGS]
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Virology (AREA)
- Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Agricultural Chemicals And Associated Chemicals (AREA)
Abstract
【解決手段】標的遺伝子のセンスRNAフラグメントおよび該標的遺伝子のアンチセンスRNAフラグメントを植物細胞内に挿入することを含み、該センスRNAフラグメントおよび該アンチセンスRNAフラグメントが二本鎖RNA分子を形成でき、該標的遺伝子の該細胞内での発現が変えられる方法。該植物細胞内の該標的遺伝子の発現がRNAフラグメントにより変えられている、本発明のセンスおよびアンチセンスRNAフラグメントを含む植物細胞、その植物細胞に由来する植物およびその子孫、およびその植物に由来する種子。
【選択図】なし
Description
標的遺伝子のセンスRNAフラグメントおよび該標的遺伝子のアンチセンスRNAフラグメントを植物細胞内に挿入することを含み、該センスRNAフラグメントおよび該アンチセンスRNAフラグメントが二本鎖RNA分子を形成でき、該標的遺伝子の該細胞内での発現が変えられる方法。好ましい態様において、RNAフラグメントは二つの異なるRNA分子に含まれる。他の好ましい態様において、RNAフラグメントは該細胞に挿入する前に混合する。他の好ましい態様において、RNAフラグメントを二本鎖RNA分子を形成させる条件下で、該細胞に挿入前に混合する。他の好ましい態様において、RNAフラグメントを該細胞に連続的に挿入する。さらにまた別の好ましい態様において、RNAフラグメントは一つのRNA分子に含まれる。このような場合、RNA分子は、好ましくは、その中に包含されるRNAフラグメントが二本鎖RNA分子を形成するように折りたたまれることが可能である。
植物細胞内に、該細胞内で標的遺伝子のセンスRNAフラグメントを発現できる第1DNA配列、および該細胞内で標的遺伝子のアンチセンスRNAフラグメントを発現できる第2DNA配列を挿入することを含み、該センスRNAフラグメントおよび該アンチセンスRNAフラグメントは二本鎖RNA分子を形成でき、該標的遺伝子の該植物細胞内での発現が変更される。好ましい態様において、DNA配列は植物細胞のゲノムに安定に統合される。好ましい態様において、DNA分子は更に該第1または該第2DNA配列に操作可能に結合したプロモーターを含む。他の好ましい態様において、第1DNA配列および第2DNA配列は二つの異なるDNA分子内に包含される。
この場合、DNA分子は更に該第1DNA配列に操作可能に結合した第1プロモーターを含む。好ましい態様において、DNA分子は更に第1部位特異的組換え部位を該第1プロモーターと該第1DNA配列の間に、および第1部位特異的組換え部位を該DNA配列の3'末端に含み、部位特異的リコンビナーゼの存在下、該第1および第2部位特異的組換え部位は該第1および該第2部位特異的組換え部位の間の該第1DNA配列を逆にすることができ、好ましくは、互いに逆の配向である。植物細胞は、好ましくは、更に、該部位特異的組換え部位を認識することができる部位特異的リコンビナーゼを含む。
該植物細胞内の該標的遺伝子の発現がRNAフラグメントにより変えられている、本発明のセンスおよびアンチセンスRNAフラグメントを含む植物細胞、その植物細胞に由来する植物およびその子孫、およびその植物に由来する種子。
本発明の方法により得る植物細胞。
本発明のDNA分子を、慣用の組換えDNA法を使用して植物または細菌細胞に挿入する。一般に、本発明のDNA分子を形質転換ベクターに包含させる。プラスミド、バクテリオファージウイルスおよび他の修飾ウイルスのような、当分野で既知である多数のこのようなベクター系が使用されている。発現系の成分をまた修飾し、例えば、センスおよびアンチセンスRNAフラグメントの発現を増加させる。例えば、切断配列、ヌクレオチド置換または他の修飾を使用する。当分野で既知の発現系を使用して適当な条件下の事実上任意の植物細胞を形質転換する。本発明のDNA分子を含むトランスジーンを好ましくは安定に形質転換し、宿主細胞のゲノムに統合させる。他の好ましい態様において、本発明のDNA分子を含むトランスジーンを自己複製ベクター上に位置させる。自己複製ベクターの例はウイルス、特にジェミニウイルスである。形質転換細胞を好ましくは全植物に再生する。本発明に従って形質転換する植物は、単子葉植物および双子葉植物であり得、メイズ、小麦、大麦、ライ麦、甘藷、インゲンマメ、エンドウマメ、チコリ、レタス、キャベツ、カリフラワー、ブロッコリー、カブラ、ラディッシュ、ホウレンソウ、アスパラガス、タマネギ、ニンニク、コショウ、セロリ、スカッシュ、パンプキン、アサ、ズッキーニ、リンゴ、ナシ、マルメロ、メロン、プラム、サクランボ、モモ、ネクタリン、アプリコット、イチゴ、ブドウ、ラズベリー、ブラックベリー、パイナップル、アボガド、パパイヤ、マンゴー、バナナ、ダイズ、トマト、ソルガム、サトウキビ、サトウダイコン、ヒマワリ、ナタネ、クローバー、タバコ、ニンジン、ワタ、アルファルファ、コメ、ジャガイモ、ナス、キュウリ、アラビドプシス、および針葉樹および落葉樹のような樹木植物を含むが、これらに限定されない。望むヌクレオチド配列が特定の植物種に形質転換されたら、伝統的育種法を使用して、その種中で増殖させ得るか、または、特に商業品種を含む同じ種の他の変種に移動し得る。
トランスジェニック植物中での発現を意図する遺伝子配列を、最初に植物内で発現可能な適当なプロモーターの後ろに、発現カセットに集める。発現カセットはまた更にトランスジーンの発現に必要なまたは選ばれた更なる配列を含み得る。このような配列は、例えば、転写ターミネーター、イントロンのような発現を促進するための外来配列、核心配列(vital sequences)、および遺伝子産物の特異的細胞小器官および細胞区画への標的を意図した配列を含むが、これらに限定されない。これらの発現カセットを、次いで、植物形質転換ベクターに下記のように容易に移入する。以下は典型的発現カセットの種々の成分の記載である。
発現カセットに使用するプロモーターの選択は、トランスジェニック植物中のトランスジーンの空間的および時間的発現パターンを決める。選択したプロモーターは、トランスジーンを特異的細胞タイプ(葉表皮細胞、葉肉細胞、根皮層細胞など)または特異的組織または器官(例えば、根、葉または花)で発現させ、選択は遺伝子産物の蓄積の望ましい位置を反映する。あるいは、選択したプロモーターは、種々の誘導条件下で遺伝子の発現を駆動する。プロモーターは強度、即ち、転写を促進する能力を変える。使用する宿主系に依存して、当分野で既知の多くの適当なプロモーターの任意の一つを使用する。例えば、構造的発現のために、CaMV 35Sプロモーター、コメアクチンプロモーター、またはユビキチンプロモーターを使用する。例えば、調節可能発現のために、タバコまたはアラビドプシス由来の化学誘導性PR−1プロモーターを使用する(例えば、米国特許第5,689,044号参照)。
種々の転写ターミネーターが発現カセットでの使用に利用可能である。これらはトランスジーンを超えた転写の停止およびその正確なポリアデニル化を担う。適当な転写ターミネーターは、植物中で機能することが既知のものであり、CaMV 35Sターミネーター、tmlターミネーター、ノパリンシンターゼターミネーターおよびエンドウマメrbcS E9ターミネーターを含む。これらは単子葉植物および双子葉植物の両方で使用する。
多くの配列が、転写単位内からの遺伝子発現を促進し、トランスジェニック植物内のその発現を増加するために、本発明の遺伝子と組合わせて使用できることが判明している。例えば、メイズAdhI遺伝子のイントロンのような種々のイントロン配列が、特に単子葉植物細胞内で発現を促進することが示されている。加えて、ウイルス由来の多くの非翻訳リーダー配列がまた発現を促進することが既知であり、これらは双子葉植物細胞で特に有用である。
選択した遺伝子のコード配列は、目的の作物種での最適発現のためにコード配列を変えることにより、遺伝子操作し得る。特定の作物種における最適発現を達成するためのコード配列の修飾法は、既知である(例えば、Perlak et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:3324 (1991);およびKoziel et al., Bio/technol. 11:194 (1993))。
植物形質転換に利用可能な多くの形質転換ベクターが植物形質転換分野の技術者に既知であり、本発明に適当な遺伝子は任意のこのようなベクターと関連して使用できる。ベクターの選択は好ましい形質転換法および形質転換の標的種に依存する。ある標的種に関しては、種々の抗生物質または除草剤選択マーカーが好ましい。形質転換で慣用的に使用される選択マーカーは、カナマイシンおよび関連抗生物質に耐性を付与するnptII遺伝子(Messing & Vierra. Gene 19:259-268 (1982); Bevan et al., Nature 304:184-187 (1983))、除草剤ホスホイノスリシンに耐性を付与するbar遺伝子(White et all., Nucl. Acids Res 18: 1062 (1990), Spencer et al. Theor. Appl. Genet 79:625-631 (1990))、抗生物質ヒグロマイシンに耐性を付与するhph遺伝子(Blochinger & Diggelmann, Mol Cell Biol 4:2929-2931)、マンノース存在下での陽性選択を可能にするmamA遺伝子(Miles and Guest (1984) Gene, 32:41-48; 米国特許第5,767,378号)およびメトトレキサートに耐性を付与するdhfr遺伝子(Bourouis et al., EMBO J. 2(7): 1099-1104 (1983))、およびグリフォサートに耐性を付与するEPSPS遺伝子(米国特許第4,949,935号および第5,188,642号)を含む。
多くのベクターがAgrobacterium tumefaciensを使用した形質転換に利用可能である。これらは典型的に少なくとも一つのT−DNAボーダー配列を担持し、pBIN19のようなベクターを含む(Bevan, Nucl. Acids Res. (1984))。Agrobacterium形質転換に適した典型的なベクターはバイナリーベクターpCIB200およびpCIB2001、ならびにバイナリーベクターpCIB10およびそのヒグロマイシン選択誘導体を含む(例えば、米国特許第5,639,949号参照)。
Agrobacterium tumefaciensの使用なしの形質転換は、選択形質転換ベクターにおけるT−DNA配列に関する条件を回避し、結果として、これらの配列を欠くベクターがT−DNA配列を含む上記のようなベクターに加えて利用される。Agrobacteriumに頼らない形質転換法は、微粒子銃、プロトプラスト取り込み(例えば、PEGおよびエレクトロポレーション)およびマイクロインジェクションを含む。ベクターの選択は、形質転換する種の好ましい選択に大きく依存する。非Agrobacterium形質転換に適した典型的ベクターは、pCIB3064、pSOG19およびpSOG35を含む(例えば、米国特許第5,639,949号参照)。
目的のDNA配列が発現系にクローン化されたら、それを植物細胞内に形質転換する。植物の形質転換および再生法は当分野で既知である。例えば、Tiプラスミドベクターを外来DNAの輸送、および直接DNA取りこみ、リポソーム、エレクトロポレーション、マイクロインジェクションおよび微粒子銃に利用する。加えて、Agrobacterium属由来の細菌を利用して植物細胞を形質転換できる。
センスおよびアンチセンスルシフェラーゼRNAフラグメントをコードするキメラDNA分子の構築(センス/アンチセンス構築)
プラスミドpLuc+(Promega)由来のホタルルシフェラーゼ遺伝子の738bp“センス”配向フラグメントを、オリゴヌクレオチドプライマーds LuC1(5'-CGC GGA TCC TGG AAG ACG CCA AAA ACA-3'、配列番号1;BamHI制限部位下線)およびds Luc2(5'-CGG AAG CTT AGG CTC GCC TAA TCG CAG TAT CCG GAA TG-3'、配列番号2;HindIII制限部位下線)を使用して、pPH108プラスミドDNAから増幅する。TrboPfu熱安定制DNAポリメラーゼ(Stratagene)を、製造者のプロトコールに従って、50μl反応物中、95℃/1分、55℃/1.5分、72℃/2分の5サイクル、続いて95℃/1分、72℃/3.5分の25サイクルで使用する。同様の方法で、プラスミドpLuc+由来のホタルルシフェラーゼ遺伝子の737bp“アンチセンス”配向フラグメントを、オリゴヌクレオチドプライマーds Luc3(5'-CGG TCT AGA GGA AGA CGC CAA AAA CAT A-3'、配列番号3;XbaI制限部位下線)およびds Luc2(5'-CGG AAG CTT AGG CTC GCC TAA TCG CAG TAT CCG GAA TG-3'、配列番号4;HindIII制限部位下線)を使用して、pPH108プラスミドDNAから増幅する。得られるDNAフラグメントを、低融点アガロース(FMC)から製造した1%トリス−酢酸ゲルを通した電気泳動、続くPCR産物を含む摘出ゲル切片のフェノール−クロロホルム抽出により精製する。センス生産物(ds LuC1/2)をBamHIおよびHindIIIで消化し、アンチセンス生産物由来のDNA(ds Luc3/2)をXbaIおよびHindIIIで標準法に従って消化する(制限酵素はNew England Biolabsから得た)。得られる粘着末端DNAフラグメントを上記のようにゲル精製する。mas 1'プロモーター(Valten et al. (1984) EMBO J. 3:2723-2730)を含むDNAフラグメントを、プラスミドCSA104をEcoRIおよびHincIIで消化し、564bp DNAフラグメントを精製することにより得る。このフラグメントをBamHIで再消化し、mas 1'プロモーターを含む484bp EcoRI−BamHIサブフラグメントを単離し、ゲル精製する。プラスミドpPH169を構築するために、クローニングベクターpLitmus29(New England Biolabs)からのDNAをEcoRIおよびXbaIで消化し、単離フラグメントをT4 DNAリガーゼ(New England Biolabs)を使用して、4方向反応でmas 1'プロモーターEcoRI−BamHIフラグメントおよびセンス(BamHI−HindIII)およびアンチセンス(HindIII−XbaI)ds Lucルシフェラーゼ遺伝子フラグメントにライゲートする。
プラスミドpPH170をAgrobacterium tumefaciens GV3101にエレクトロポレーションにより挿入し、形質転換コロニーを選択し、増幅する。構造的に(UBQプロモーター(Norris et al. (1993) PMB 21:895-906)/UBQ + CaMV 35S 5' UTR/luc+; pPH108)または誘導性に(Arabidopsis PR-1プロモーター/luc;pPH135、ライン6E)発現するArabidopsis thaliana変異系の4から5週齢植物を、pPH170バイナリーT−DNAベクターを他にするAgrobacteriumクローンで真空浸潤する。形質転換植物をヒグロマイシンおよびカナマイシンで共選択し、ルシフェラーゼ活性測定のために制御されたファイトトロン条件下で生育させる。加えて、pPH135-6Eバックグラウンドのルシフェラーゼ活性をBTH(BTH処理は本質的にLawton et al. Plant J. 10: 71-82に記載の通り)導入後48時間に評価する。ルシフェラーゼ活性は、ルシフェリン基質添加後の組織抽出物における蛍光ベースアッセイを使用して定量する。ルシフェラーゼ活性はまた植物内でCCD−冷却ビデオ造影システムを使用してまた追跡する(Hamamatsu)。
GL1遺伝子は、正常突起様構造(葉毛)形成に必要なmyb−様転写因子をコードする(Oppenheimer et al. (1991) Cell 67: 483-493)。発育初期でのGL1発現のノックアウトは、突起様構造を欠く植物をもたらす。ノックアウト表現型は、若い苗木で容易に同定され、致死ではない。培養発現のための3つのベクターおよびGAL4/C1−調節発現のための3つのベクターを構築する。各プロモーターの試験のための3つの異なるベクターは、GL1遺伝子フラグメントのセンス(+)発現、アンチセンス(−)発現ならびにセンスおよびアンチセンス(+/−)RNA発現である。(+)および(−)ベクターは、GL1の発現への効果を比較するためにコントロールする。各場合において、GL1配列の塩基#739から#1781までの5'フラグメント(GenBank Accession M79448)をベクター構築に使用する。
GL1遺伝子フラグメントを交差誘導性ベクター構築物pJG304-1にNcoI−SacIフラグメントとしてクローン化する。プラスミドpJG304はpBSSK+由来である。プラスミドpBS SK+(Stratagene, LaJolla, CA)をSacIで直線化し、ヤエナリヌクレアーゼで処理してSacI部位を除去し、T4リガーゼで再ライゲートしてpJG201を作る。10XGAL4コンセンサス結合部位/CaMV 35S最小プロモーター/GUS遺伝子/CaMVターミネーターカセットをpAT71からKpnIで除去し、pJG201のKpnI部位にクローン化し、pJG304を作る。プラスミドpJG304を制限エンドヌクレアーゼAsp718で部分的に消化し、完全長直鎖状フラグメントを単離する。フラグメントを22塩基オリゴヌクレオチドJG-L(5'-GTA CCT CGA G TC TAG ACT CGA G-3'、配列番号5)のモル過剰とライゲートする。制限分析を使用して、このリンカーがGAL4 DNA結合部位の5'に挿入されたクローンを同定し、このプラスミドをpJG304DXhoIと名付ける。
双子葉植物で相対的に強く、構造的であるAgrobacterium由来のマンノピンシンダーゼのmas 1'プロモーター(Velten et al. (1984) EMBO Journal 3:2723-2730)を使用する。上記のように、GL1(+)、(−)、および(+/−)フラグメントをpBluescript中の1'プロモーターの後ろにライゲートする。3つの異なる発現カセットをpCIB200にEcoRI/SalIフラグメントとしてライゲートする(Uknes et al. (1993) Plant Cell 5:159-169)。
シスタチオニンベータ−リアーゼ(CBL)遺伝子はメチオニン生合成経路中の段階を行うタンパク質をコードする。CBLはシスタチオニンからホモシステインへの変換を触媒する(Ravanel et al. (1998) Proc. Natl. Acad, Sci, USA 95:7805-7812にレビュー)。Arabidopsis CBL遺伝子のcDNAは同定されている(Ravanel et al. (1995) Plant Mol. Biol. 29:875-772)。植物内のその発現の調節の効果を、RNA発現(センス構築物)、アンチセンスRNA発現(アンチセンス構築物)ならびにセンスおよびアンチセンスRNA発現(センス/アンチセンス構築物)の構築物を使用して試験する。
pJG304/aCBL:プラスミドpJG304DXhoIをNcoIおよびSacIで消化し、GUS遺伝子を切除する。pJG304DXhoI由来のGUSをまたNcoIおよびSacIで消化したCBL PCR生産物で置き換える。この生産物を、プライマーDG354(5'-GAT CGA GCT CCA CGA GAA CTG TCT CCG-3';配列番号6)およびDG357(5'-TCA GCC ATG GGA AGA CAA GTA CAT TGC-3';配列番号7)ならびにpFL61 Arabidopsis cDNAライブラリー(Minet et al. (1992) Plant J. 2:417-422)を鋳型として使用して作る。プラスミドpJG304/aCBLを、CBL PCR産物にライゲートしたpJG304DXhoI消化ベクターから構築する。
pJG261/aCBL:pJG304/aCBLをXhoIで切断し、GAL4 DNA結合部位/35S最小プロモーター/アンチセンスCBL/CaMVターミネーター融合を含むカセットを切除する。このカセットをXhoI消化pJG261にライゲートし(Guyer, et al, Genetics (1998), 149:633-639)、pJG261/aCBLを作る。
pJG304/sCBL:プラスミドpJG304DXhoIをNcoIおよびSacIで消化し、GUS遺伝子を切除する。pJG304DXhoI由来のGUS遺伝子をまたNcoIおよびSacIで消化したCBL PCR生産物で置き換える。この生産物をプライマーCBL1(5'-CTT GCC ATG GCA CGA GAA CTG TCT CCG-3';配列番号8)およびCBL2(5'-CAT GGA GCT CGA AGA CAA GTA CAT TGC A-3';配列番号9)ならびにpFL61 Arabidopsis cDNAライブラリーを鋳型として使用して作る。プラスミドpJG304/sCBLを、CBL PCR生産物にライゲートしたpJG304DXhoI消化ベクターから構築する。
pJG261/sCBL:pJG304/sCBLをXhoIで切断し、GAL4 DNA結合部位/35S最小プロモーター/センスCBL/CaMVターミネーター融合を含むカセットを切除する。このカセットをXhoI消化pJG261にライゲートし、pJG261/sCBLを作る。
pJG304/dsCBL:プラスミドpJG304/aCBLをSacIで消化する。またSacIで消化したCBL PCR生産物を、挿入CBL遺伝子がセンス配向で挿入されるように挿入する。この生産物はCBL2(5'-CAT GGA GCT CGA AGA CAA GTA CAT TGC A-3';配列番号9)およびCBL3(5'-CAT CGA GCT CCT CTG TTT AAA CCA CGA GAA CTG TCT CCG TCG C-3';配列番号10)ならびにpFL61 Arabidopsis cDNAライブラリーを鋳型として使用して作る。挿入DNAの所望の配向のプラスミド構築物を、HindIIIでの消化により同定する。プラスミドpJG304/dsCBLを、CBL PCR生産物にライゲートしたpJG304/aCBL消化ベクターから構築する。SURE2(Stratagene, LaJolla, CA)を、構築物を安定化するために細菌宿主として使用する。
pJG261/dsCBL:pJG304/dsCBLをXhoIで切断し、GAL4 DNA結合部位/35S最小プロモーター/アンチセンスCBL/センスCBL/CaMVターミネーター融合を含むカセットを切除する。このカセットをSpeI消化pJG261にライゲートし、pJG261/dsCBLを作る。XL1−BLUEMRF'(Stratagene, LaJolla, CA)を細菌宿主として使用し、構築物を部分的に安定化する。
3つの記載したpJG261/CBL構築物を、Agrobacterium tumefaciens recA−株AGL1(Lazo et al. (1991) Bio/Technology 9:963-967)に電子形質転換(electro-transformation)し、Arabidopsis植物(Ecotype Colimbia)を浸潤により形質転換する(Bechtold et al., (1993) C. R. Acad. Sci. Paris, 316:1188-1193)。浸潤植物由来の種子を、15mg/リットルのBastaを含む発芽培地(4.3g/リットルのMurashige-Skoog塩、0.5g/リットルのMes、1%スクロース、10μg/リットルのチアミン、5μg/リットルのピリドキシン、5μg/リットルのニコチン酸、1mg/リットルのミオイノシトール、pH5.8)で選択する。
GAL4結合部位/最小CaMV 35Sプロモーター/CBL構築物を含むトランスジェニック植物を土壌に移植し、温室で成熟するまで生育させる。各系におけるトランスジェニックCBLフラグメントの存在をPCRで確認する。アンチセンス構築物の試験のためにプライマーASV1(5'-TTT GGA GAG GAC AGA CCT GC-3';配列番号11)およびCBL3(5'-CAT CGA GCT CCT CTG TTT AAA CCA CGA GAA CTG TCT CCG TCG C-3';配列番号10)を使用して、約1200pb生産物の存在を確認する。6個のアンチセンス構築物を有するトランスジェニック系を同定する。センス構築物を試験するために、プライマーASV2(5'-GGA TTT TGG TTT TAG GAA TTA GAA-3';配列番号12)およびCBL3(5'-CAT CGA GCT CCT CTG TTT AAA CCA CGA GAA CTG TCT CCG TCG C-3';配列番号10)を使用して、約1200pb生産物の存在を確認する。13個のセンス構築物を有するトランスジェニック系を同定する。センス/アンチセンス構築物を試験するために、プライマーASV2(5'-GGA TTT TGG TTT TAG GAA TTA GAA-3';配列番号12)およびCBL3(5'-CAT CGA GCT CCT CTG TTT AAA CCA CGA GAA CTG TCT CCG TCG C-3';配列番号10)を使用して、約1200pb生産物の存在を確認する。加えて、センス/アンチセンス構築物を試験するために、プライマーASV1(5'-TTT GGA GAG GAC AGA CCT GC-3';配列番号11)およびCBL3(5'-CAT CGA GCT CCT CTG TTT AAA CCA CGA GAA CTG TCT CCG TCG C-3';配列番号10)を使用して、約1200pb生産物の存在を確認する。センス/アンチセンス構築物を有する11個のトランスジェニック系を同定する。
CBL遺伝子を二つのプロモーター −− 一つはセンス鎖の転写を引き起こし、他方はアンチセンスの転写を引き起こす −− の間に置く。この試みにおいて、両方のセンスおよびアンチセンスRNAが植物細胞内で作られ、二つのタイプの鎖が互いにハイブリダイズでき、二本鎖RNA分子の形成を導く。ACTIN2をCBL遺伝子の両方の側にフランキングなプロモーターとして使用する。全てのこれらの試みに関して、プロモーターの遠位側に転写ターミネーターを使用するか使用しない選択がある。転写ターミネーターを使用する場合、転写は一つのプロモーターの3'末端で開始し、一つの配向でCBL遺伝子を通って進み、第2プロモーターを3'末端から5'末端に通って進み、第2プロモーターの5'末端の転写ターミネーターで停止する。転写ターミネーターは転写されたRNAの安定化に働き得る。
センスおよびアンチセンスルシフェラーゼRNAフラグメントをコードするキメラDNA分子の構築(センス/アンチセンス構築物)
プラスミドpLuc+(PromegaベクターpGL3、Genbank Accession # U47295)からのホタルルシフェラーゼ遺伝子の670bp“センス”配向フラグメントをpPH108プラスミドDNAから、オリゴヌクレオチドプライマーds Luc1(5'-CGC GGA TCC AAG ATT CAA AGT GCG CTG CTG-3'、配列番号13;BamHI制限部位下線)およびds Luc2(5'-GCG AAG CTT GGC GAC GTA ATC CAC GAT CTC-3'、配列番号14;HindIII制限部位下線)を使用して増幅する。TurboPfu熱安定性DNAポリメラーゼ(Stratagene)を、製造者のプロトコールに従って、50μl反応物中、95℃/1分、55℃/1.5分、72℃/2分の5サイクル、続いて95℃/1分、72℃/3.5分の25サイクルで使用する。同様の方法で、プラスミドpLuc+由来のホタルルシフェラーゼ遺伝子の737bp“アンチセンス”配向フラグメントを、pPH108プラスミドDNAから、オリゴヌクレオチドプライマーds Luc3(5'-CGG TCT AGA AAG ATT CAA AGT GCG CTG CTG-3'、配列番号15;XbaI制限部位下線)およびds Luc2(5'-GCG AAG CTT GGC GAC GTA ATC CAC GAT CTC-3'、配列番号16;HindIII制限部位下線)を使用して増幅する。得られるDNAフラグメントを、低融点アガロース(FMC)から製造した1%トリス−酢酸ゲルを通した電気泳動、続くPCR産物を含む摘出ゲル切片のフェノール−クロロホルム抽出により精製する。センス生産物(ds LuC1/2)をBamHIおよびHindIIIで消化し、アンチセンス生産物由来のDNA(ds Luc3/2)をXbaIおよびHindIIIで標準法に従って消化する(制限酵素はNew England Biolabsから得た)。得られる粘着末端DNAフラグメントを上記のようにゲル精製する。センスBamHI−HindIIIフラグメントおよびアンチセンスHindIII−XbaIフラグメントを、次いで3方向ライゲーションで、BamHIおよびXbaITheで消化させたクローニングベクターpLitmus28(New England Biolabs)にクローン化し、得られる構築物をpAdF3と名付ける。bar遺伝子のオープン・リーディング・フレーム(D'Halluin et al. (1992) Methods in Enzymology 216:415-426)を含む563bp DNAフラグメントを、プラスミドCSA104 DNAから、オリゴヌクレオチドbar-1(5'-GCG AAG CTT GAT CCA TGA GCC CAG AAC GA-3'、配列番号17;HindIII制限部位太字)およびbar-2(5'-GCC AAG CTT CCT AGA ACG CGT GAT CTC-3'、配列番号18;HindIII制限部位太字)を使用して増幅する。Pfu熱安定性DNAポリメラーゼ(Stratagene)を、製造者のプロトコールに従って、100μl反応物中、94℃/1分、55℃/1分、72℃/1分の25サイクルで使用する。フェノール抽出およびエタノール沈殿の精製に続き、bar PCR生産物を、上記のようにHindIIIで消化し、2%アガロースゲルを通してゲル精製する。プラスミドpAdF1をHindIII bar DNAフラグメントの、HindIIIで消化されているプラスミドpAdF3へのライゲーションにより構築する。この非指向性クローニングの2つの可能性のある構築物のうち、pAdF1はbar遺伝子への配向により特徴付けられ、これはpAdF3に存在するルシフェラーゼ遺伝子の“センス”と同じである。Arabidopsis ACT2プロモーター(An et al., (1996) Plant J. 10:107-121)を含むBamHI-SalI 1.2kb DNAフラグメントを、pNOV1416(Scott Rabe; NB171 p.122; 8-17-98により作られた構築物)から切断し、BamHIおよびSalIで消化したpUB21にクローン化して、構築物pAct2を産生する。ACT2プロモーターを次いで、BamHIおよびSpeIでの消化によりpAct2から切断する。
プラスミドpAdF2およびpAdF4をAgrobacterium tumefaciens GV3101に、エレクトロポレーションにより挿入し、形質転換コロニーを選択および増幅する。ルシフェラーゼを構造的(UBQ3プロモーター(Norris et al. (1993) PMB 21:895-906)/UBQ3+CaMV 35S 5' UTR/luc+;pPH108)または誘導的(Arabidopsis PR-1プロモーター/luc+;pCIB200、系6E)に発現するArabidopsis thaliana変異系の4から5週齢植物を、pAdF2またはpAdF4バイナリーT-DNAベクターを担持するAgrobacteriumクローンで真空浸潤する。形質転換植物をヒグロマイシンおよびカナマイシンで共選択し、ルシフェラーゼ活性を測定するために制御されたファイトトロン条件下で生育させる。加えて、pCIB200-6Eバックグラウンドにおけるルシフェラーゼ活性を、BTH(本質的に、Lawton et al. (1996) Plant J. 10:71-82に記載のようなBTH処理)導入48時間後に評価する。ルシフェラーゼ活性を、ルシフェリン基質の添加に続く組織抽出物中のルミネッセンスベースアッセイを使用して定量する。スリフェラーゼ活性をまた植物内でCCD−冷却ビデオ造影システムを使用してまた追跡する(Hamamatsu)。pPH108中のルシフェラーゼ遺伝子はpGL3(Promega, Genbank Accession # U47295)由来である;そしてpCIB200-6E中のルシフェラーゼ遺伝子はpGL2(Promega, Genbank Accession # X65323)由来である。
親系pPH108の異なる植物を試験し、種々の植物内のルシフェラーゼの平均レベルを決定する。この系は同型接合ではなく、従ってルシフェラーゼの最大レベルを示す個々の植物(即ち、植物1、2および3)が同型接合であり得る。pPH108バックグラウンドでpAdF2構築物を含むダブルトランスジェニック植物pPH108(pAdF2)、またはpPH108バックグラウンドでpAdF4構築物を含むpPH108(pAdF4)の独立したT1系を分析する。ルシフェラーゼレベルは、恐らくセンス/アンチセンス構築物の発現レベルの範囲のために、系毎に異なる。独立したT1事象、pAdF2(Columbia(pAdF2))またはpAdF4(Columbia(pAdF4))で形質転換した野生型Arabidopsis Columbia植物をまたコントロールとして分析する。
親系pCIB200-6E由来の苗木を生育させ、独立したT1ダブルトランスジェニック系pCIB200-6E(pAdF4)と同様にサンプルにする。独立したT1事象、pAdF4で形質転換した野生型Arabidopsis Columbia植物をまたコントロールとして分析する。
本発明の他の態様において、センスおよびアンチセンスRNAフラグメントを、部位特異的組換え系を使用して産生する。部位特異的組換えは、DNA開裂および酵素リコンビナーゼにより介在される再ライゲーションの工程である。レコンビナーゼは非常に特異的DNA配列を認識する。ある部位特異的組換え系はその標的部位に作用するのに一つだけタンパク質を使用する。Cre/lox、FLP/FRT、R/RSおよびGin/gixのような数個の部位特異的組換え系が、植物内での部位特異的組換え系を介在することが既知である(Ow and Medberry, 1995, Critical Reviews in Plant Sciences 14:239-261)。組換え基質におけるリコンビナーゼ認識部位の配置に依存して、組換え工程はDNAは配列の欠失、逆転または統合をもたらす。この種の一つの特定の反応、即ち逆転が本発明に関連する。二つのリコンビナーゼ認識部位を、逆の配向で望ましい遺伝子発現カセットに置く。第1認識部位は、トランスジーンコード配列の非翻訳リーダー中または5'−遠位領域の中側に、プロモーターの下流に置く。第2部位は第1部位と逆の配向で、トランスジーンコード配列の3'非翻訳領域中または3'−遠位領域の中側に置く。望ましいDNA配列のコードまたは非コード領域はプロモーターと操作可能に結合する。リコンビナーゼの存在下、逆の配向で二つの認識部位に側面を接する配列が逆転する。組換え過程の結果として、望ましい遺伝子のコードまたは非コード鎖の両方がプロモーターに操作可能に結合し、センスおよびアンチセンス転写が同じ染色体環境において同じ遺伝子座からから産生され、dsRNA分子の形成が可能である。
トランスジェニック植物での発現を意図する遺伝子配列は、第1に適当なプロモーターの後ろおよび適当な転写ターミネーターの上流の発現カセットに集合する。植物発現カセットの構築の全ての要件は、本発明のDNA分子に適用され、当分野で既知の方法を使用する。
発現カセットで使用するプロモーターの選択は、トランスジェニック植物内のDNA分子の空間的および時間的発現パターンを決定する。選択したプロモーターはDNA分子を特異的細胞タイプ(葉表皮細胞、葉肉細胞、根皮層細胞など)または特異的組織または器官(例えば、根、葉または花)で発現させ、選択はDNA分子によりコードされるRNAフラグメントの生合成の望ましい位置を反映する。あるいは、選択したプロモーターは、光誘導または他の時間的調節プロモーター下でのDNA分子の発現を駆動し得る。更に別法は、選択プロモーターの化学的調節である。これは、望ましい、化学インデューサーでの処理によりもたらされる時のみのDNA分子の発現の誘導を可能する。
種々の転写ターミネーターは発現カセットでの使用に利用可能である。これらは転写の停止、および好ましくは、正確なポリアデニル化を担う。適当な転写ターミネーターは植物で機能することが既知のものであり、CaMV 35Sターミネーター、tmlターミネーター、ノパリンシンターゼターミネーター、エンドウマメrbcS E9ターミネーターを含む。これらは単子葉植物および双子葉植物の両方で使用できる。
多くの配列が、転写ユニットの中での遺伝子発現を促進させることが判明しており、これらの配列は本発明のDNA分子と組合わせて、トランスジェニック植物内でのその発現の増加のために使用できる。
本発明は、プロモーターの起源に拘らず、植物内で発現可能なプロモーターの制御下の本発明のDNA分子の発現を包含する。したがって、DNA分子を、当分野で既知の方法を使用して発現カセットに挿入する。これらの発現カセットは、次いで、下記のように植物形質転換ベクターに容易に移入できる。更に、本発明はまたDNA分子の発現に必要なまたはDNA分子のために選択した更なる配列と関連した植物発現可能プロモーターの使用も包含する。このような配列は、転写ターミネーター、発現を促進するための外来配列(イントロンのような[例えば、Adhイントロン1]、ウイルス配列[例えば、TMV-Ω]を含むが、これらに限定されない。
プラスミドpCGN1761の構築は、公開特許出願EP0392225に記載されている。pCGN1761は“ダブル”35Sプロモーターおよびtml転写ターミネーターを、プロモーターおよびターミネーターの間の独得なEcoRI部位と共に含み、pUCタイプ骨格を有する。NotIおよびXhoI部位を存在するEcoRI部位に加えて含む修飾ポリリンカーを含むpCGN1761の誘導体が構築される。この誘導体はpCGN1761ENXと名付ける。pCHN1761ENXは、トランスジェニック植物の35Sプロモーターの制御下の発現の目的での、cDNA配列または遺伝子配列(微生物ORF配列を含む)の、そのポリリンカー内でのクローニングに有用である。このような構築物の全35Sプロモーター遺伝子−遺伝子配列−tmlターミネーターカセットは、プロモーターの5'のHindIII、SphI、SalIおよびXbaI部位およびターミネーターの3'のXbaI、BamHIおよびBglI部位で、形質転換ベクターの移入のために切断できる。更に、ダブル35Sプロモーターフラグメントは、HindIII、SphI、SalI、XbaIまたはPstIでの5'切断およびポリリンカー制限部位(EcoRI、NotIまたはXhoI)での3'切断により、他のプロモーターとの置換のために除去できる。
この章は、pCGN1761ENX中のダブル35Sプロモーターの選択したプロモーターでの置換を記載する;例示のために、化学的調節PR-1aプロモーターを記載する。選択したプロモーターは、好ましくはその源から、制限酵素により切除されるが、別法として、適当な末端制限部位を担持するプライマーを使用してPCR増幅できる。PCR増幅を行ったなら、次いで、プロモーターを再配列させ、標的ベクター中の増幅プロモーターのクローニング後の増幅エラーをチェックする。化学的調節可能タバコPR-1aプロモーターをプラスミドpCIB1004から開裂し(EP0332104参照)、プラスミドoCGN1761ENXに移入する。pCIB1004をNcoIで開裂し、直線状プラスミドの得られる3'突出を、T4 DNAポリメラーゼでの処理により平滑とする。フラグメントを次いでHindIIIで切断し、フラグメントを含む得られるPR-1aプロモーターをゲル精製し、ダブル35Sプロモーターが除去されているpCGN1761ENXにクローン化する。これをXhoIで開裂し、T4ポリメラーゼで平滑にし、続いてHindIIIで開裂し、pCIB1004プロモーターフラグメントをクローン化するフラグメントを含む大ベクターターミネーターの単離により行う。これは、PR-1aプロモーターおよびtmlターミネーターおよび独得なEcoRIおよびNotI部位を有する介在ポリリンカーを有するpCGN1761ENX誘導体を産生する。
アクチンの数個のイソ形が、殆どの細胞タイプで発現し、素の結果アクチンプロモーターは構造的プロモーターの良い選択であることが知られている。特に、コメAct1遺伝子由来のプロモーターがクローン化され特徴付けされている(McElroy et al., Plant Cell 2:163-171 (1990))。プロモーターの1.3kbフラグメントは、コメプロトプラストの発現に必要な全ての調節エレメントを含むことが判明している。更に、Act1プロモーターに基づく多くの発現ベクターが、特に単子葉植物での使用のために構築されている(McElroy et al. Mol. Gen. Genet. 231:150-160 (1991))。これらはAct1−イントロン1、Adh1 5'フランキング配列およびAdh1−イントロン1(メイズアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子から)およびCaMV 35Sプロモーター由来の配列を含む。最大発現を示すベクターは35SとAct1イントロンまたはAct1 5'フランキング配列とAct1イントロンの融合である。McElroy et al. (Mol. Gen. Genet. 231:160-160 (1991))に記載のプロモーター発現カセットは、本発明のDNA分子の発現のために容易に修飾され、特に単子葉植物宿主での使用に適している。例えば、フラグメントを含むプロモーターをMcElroy構築物から除去し、pCGN1761ENX中のダブル35Sプロモーターの置換に使用し、それは次いで挿入または特異的遺伝子配列に利用可能である。このように構築した融合遺伝子を、適当な形質転換ベクターに移入する。別の報告で、大1イントロンを有するコメAct1プロモーターが培養大麦細胞における高発現を指示することも判明している(Chibbar et al. Plant Cell Rep. 12:506-509 (1993))。
ユビキチンは、多くの細胞タイプに蓄積されることが既知の他の遺伝子生産物であり、そのプロモーターはトランスジェニックでの使用のために数種からクローン化されている(例えば、ヒマワリ−Binet et al. Plant Science 79:87-94 (1991)、メイズ−Christensen et al. Plant Molec. Biol. 12:619-632 (1989))。メイズユビキチンプロモーターはトランスジェニック単子葉植物系およびその配列のために構築されており、単子葉植物形質転換のために構築されたベクターが特許公開EP0342926に記載されている。更に、Taylor et al. (Plant Cell Rep. 12:491-495 (1993))が、メイズユビキチンプロモーターおよびダウイ1イントロンを含むベクター(pAHC25)、および、微粒子銃を介して挿入したとき、多くの単子葉植物の細胞懸濁液中でのその高い活性を記載する。ユビキチンプロモーターは、トランスジェニック植物、特に単子葉植物における本発明のDNA分子の発現に明らかに適している。適当なベクターはpAHC25の誘導体または、適当なユビキチンプロモーターおよび/またはイントロン配列の挿入により修飾した本出願に記載の形質転換ベクターである。
本発明のDNA分子に関する発現の好ましいパターンは根発現である。ヌクレオチド配列の根組織のみへの発現は、その葉および花組織および種子中の発現の付随した変更なしに、根中のみの標的遺伝子の発現を変える利点を有する。適当な根プロモーターは、Framond(FEBS 290:103-106 (1991))におよびまた公開特許出願EP0452269に記載のものである。このプロモーターをpCGN1761ENXのような適当なベクターに移入し、DNA分子をこのようなベクターに挿入する。全プロモーター−遺伝子−ターミネーターカセットを続いて目的の形質転換ベクターに移入する。
多くのこのようなプロモーターが記載され(例えば、Xu et al. Plant Molec. Biol. 22:573-588 (1993), Logemann et al. Plant Cell 1:151-158 (1989), Rohrmeier & Lehle, Plant Molec. Biol. 22:783-792 (1993), Firek et al. Plant Molec. Biol 22:129-142 (1993), Warner et al. Plant J. 3:191-201 (1993))、全て本発明での使用に適している。Logemann et al.’(前掲)は双子葉植物ジャガイモwun1遺伝子の5'樹流配列を記載する。Xu et al.(前掲)は、双子葉植物ジャガイモ由来の傷誘導性プロモーター(pin2)が単子葉植物コメで活性であることを示す。更に、Rohrmeier & Lehle(前掲)は、傷誘導され、標準法を使用して同起源プロモーターの単離に使用できるメイズWip1 cDNAのクローニングを記載する。同様に、Firek et al.(前掲)およびWarner et al.(前掲)は、局所傷および病原体浸潤部位で発現される単子葉植物Asparagus officinalis由来の傷誘導遺伝子を記載する。当分野で既知のクローニング法を使用して、これらのプロモーターを適当なベクターに移入し、本発明のDNA分子に融合し、昆虫病原体河川の部位でのこれらの遺伝子の発現に使用する。
特許出願WO93/07278は、髄細胞で優先的に発現されるメイズtrpA遺伝子の単離を記載する。標準分子生物学的方法を使用して、このプロモーターまたはその一部を、pCGN1761のようなベクターに移入でき、そこでそれが35Sプロモーターを置換し、髄優先法で本発明のDNA分子の発現を駆動するのに使用することができる。実際、髄優先プロモーターまたはその一部を含むフラグメントをベクターに移入し、トランスジェニック植物での利用のために修飾する。DNA分子の髄優先発現は、このようなベクターへのDNAの挿入により達成される。
特許出願WO93/は、更に花粉細胞で発現されるメイズカルシウム依存的プロテインキナーゼ(CDPK)遺伝子の単離を記載する。遺伝子配列およびプロモーターは転写の開始からbpまで伸びる。標準分子生物学的方法を使用して、このプロモーターまたはその一部をpCGN1761のようなベクターに移入でき、そこでそれが35Sプロモーターを置換し、花粉優先法で本発明のDNA分子の発現を駆動するのに使用することができる。実際、花粉特異的プロモーターまたはその一部を含むフラグメントをベクターに移入し、トランスジェニック植物での利用のために修飾できる。
ホスフェノールカルボキシラーゼ(PEPC)をコードするメイズ遺伝子がHudspeth & Grula (Plant Molec Biol 12:579-589 (1989))に記載されている。標準生物学的方法を使用して、この遺伝子のプロモーターを、トランスジェニック植物中で葉特異的方法での本発明のDNA分子の発現の駆動のために使用する。
多くの形質転換ベクターが植物形質転換に利用可能であり、本発明のDNA分子を、適当な条件下で、望ましい細胞でDNA分子の発現をできるように寿樹の発現カセットに挿入する。ヌクレオチド配列含有発現カセットを、次いで下記の適当な形質転換ベクターに挿入する。使用のためのベクターの選択は、好ましい形質転換法および形質転換の標的種に依存する。ある標的種に関して、異なる抗生物質または除草剤選択マーカーが好ましいことがある。形質転換に慣用的に使用される選択マーカーは、カナマイシンおよび関連抗生物質に耐性を付与するnptII遺伝子(Messing & Vierra. Gene 19:259-268 (1982); Bevan et al., Nature 304:184-187 (1983))、除草剤ホスホイノスリシンに耐性を付与するbar遺伝子(White et all., Nucl. Acids Res 18: 1062 (1990), Spencer et al. Theor. Appl. Genet 79:625-631 (1990))、抗生物質ヒグロマイシンに耐性を付与するhph遺伝子(Blochinger & Diggelmann, Mol Cell Biol 4:2929-2931)およびメトトレキサートに耐性を付与するdhfr遺伝子(Bourouis et al., EMBO J. 2(7): 1099-1104 (1983))を含む。
多くのベクターがAgrobacterium tumefaciensを使用した形質転換に利用可能である。これらは典型的に少なくとも一つのT-DNAボーダー配列を担持し、およびpBIN19のようなベクターを含む(Bevan, Nucl. Acids Res. (1984)。以下に二つの典型的ベクターを記載する。
バイナリーベクターpCIB200およびpCIB2001を、Agrobacteriumでの使用のための組換えベクターの構築に使用し、以下の方法で構築する。pTJS75kanを、テトラサイクリン耐性遺伝子の切断を可能にするpTJS75(Schmidhauser & Helinski, J. Bacterio. 164: 446-455 (1985))のNarI消化、続いくNPTII(Messing & Vierra, Gene 19:259-268 (1982); Bevan et al., Nature 304:184-187 (1983); McBride et al., Plant Molecular Biology 14:266-276 (1990))を担持するpUC4K由来のAcclフラグメントの挿入により作る。XhoIリンカーを、左および右T-DNAボーダー配列、植物選択可能nos/nptIIキメラ遺伝子およびpUCポリリンカーを含むpCIB7のEcoRVフラグメントにライゲートし(Rothstein et al. Gene 53:163-161 (1987))、XhoI消化フラグメントをSalI消化pTJS75kanにクローン化し、pCIB200を作る(EP0332104をまた参照)。pCIB200は以下の独得なポリリンカー制限部位を含む:EcoRI、SstI、KpnI、BglII、XbaIおよびSalI。pCIB2001は、ポリリンカーに更なる制限部位を挿入することにより作ったpCIB200の誘導体である。pCIB2001のポリリンカー中の独得な制限部位は、EcoRI、SstI、KpnI、BglII、XbaI、SalI、MluI、BclI、AvrII、ApaI、HpaIおよびStuIである。pCIB2001は、これらの独得な制限部位の包含に加えて、また植物および細菌カナマイシン選択、Agrobacterium介在形質転換のための左および右T-DNAボーダー、E. coliと他の宿主の間の移動のためのRK2由来trfA機能、およびまたRK2由来のOriTおよびOriV機能を有する。pCIB2001ポリリンカーは、それ自体の調節シグナルを含む植物発現カセットのクローニングに適している。
バイナリーベクターpCIB10は、植物の選択のためのカナマイシン耐性遺伝子をコードする遺伝子、T-DNAボーダー配列を含み、E. coliおよびAgrobacteriumの両方での複製を可能にする広い宿主範囲プラスミドpRK252由来の配列を含む。その構築はRothstein et al. (Gene 53:153-161 (1987))に記載されている。Gritz et al. (Gene 25:179-188 (1983))に記載のヒグロマイシンBホスフォトランスフェラーゼの遺伝子を含むpCIB10の種々の誘導体が構築されている。これらの誘導体はヒグロマイシンのみ(pCIB743)またはヒグロマイシンとカナマイシン(pCIB715、pCIB717)上でのトランスジェニック細胞の選択が可能である。このベクターを本発明のDNA分子を含む発現カセットの形質転換に使用する。
Agrobacterium tumefaciensの使用なしの形質転換は、選択形質転換ベクターにおけるT-DNA配列の必要性を回避し、結果としてこれらの配列を欠くベクターが、T-DNA配列を含む上記のもののようなベクターに加えて利用できる。Agrobacteriumに頼らない形質転換法は、微粒子銃、プロトプラスト取り込み(例えば、PEGおよびエレクトロポレーション)、マイクロインジェクションまたは花粉形質転換(米国特許第5,629,183号)を含む。ベクターの選択は、形質転換する種の好ましい選択に大きく依存する。以下に、ある典型的ベクターの構築を記載する。
pCIB3064は除草剤バスタ(またはホスホイノスリシン)による選択と組合わせた直接遺伝子移入法に適したpUC由来ベクターである。プラスミドpCIB246は、E. coli GUS遺伝子およびCaMV 35S転写ターミネーターへの操作的融合でCaMV 35Sプロモーターを含み、PCT公開出願WO93/07278に記載されている。このベクターの35Sプロモーターは二つのATG配列を出発側の5'に含む。これらの側は、ATGを除去し、制限部位SspIおよびPvuIIを産生するような方法で標準PCR法を使用して変異させる。新規制限部位は独得なSalI部位から96および37bp離れ、実際の出発部位から101および42bp離れている。pCIB246の得られる誘導体をpCIB3025と名付ける。GUS遺伝子を次いで、SalIおよびSacIでの消化によりpCIB3025から切除し、末端を平滑にし、再ライゲートしてプラスミドpCIB3060を産生する。プラスミドpJIT82をJoh Innes Centre, Norwichから得、Streptomyces viridochromogenes由来のbar遺伝子を含む400bp SmaIフラグメントを切除し、pCIB3060のHpaI部位に挿入する(Thompson et al. EMBO J 6:2519-2523 (1987))。これはCaMV 35Sプロモーターおよびターミネーターの制御下の除草剤選択のためのbar遺伝子、アンピシリン耐性のための遺伝子(E. coliでの選択のため)および独得な制限部位SphI、PstI、HindIIIおよびBamHIを含むpCIB3064を作る。このベクターは、本発明のDNA分子の発現を指示するためのそれ自体の調節シグナルを含む植物発現カセットのクローニングに適する。
pSOG35は、メトトレキサートに対する耐性を付与する選択可能マーカーとしてE. coliジヒドロフォレートレダクターゼ(DHFR)を使用する形質転換ベクターである。PCRを使用して35Sプロモーター(〜800bp)、メイズAdh1遺伝子由来のイントロン6(〜550bp)およびpSOG10由来のGUS非翻訳リーダー配列の18bpを増幅する。E. coliジヒドロフォレートレダクターゼタイプII遺伝子をコードする250bpフラグメントをまたはPCRで増幅し、これら二つのPCRフラグメントを、pUC19バックボーンおよびノパリンシンターゼターミネーターを含むpBI221(Clontech)由来のSacI-PstIフラグメントと集合させる。これらのフラグメントの集合は、イントロン6配列と融合した35Sプロモーター、GUSリーダー、DHFR遺伝子およびノパリンシンターゼターミネーターを含む。pSOG19中のGUSリーダーのメイズクロロティックモットルウイルス(MCMV)での置換によりベクターpSOG35を産生する。pSOG19およびpSOG35は、アンピシリン耐性のためのpUC遺伝子を担持し、外来配列、特に本発明のDNA分子のクローニングに利用可能なHindIII、SphI、PstIおよびEcoRI部位を有する。
形質転換ベクター
植物プラスチド中での本発明のDNA分子の発現のために、プラスチド形質転換ベクターpPH143(WO97/32011、実施例36)を使用する。次いで、このベクターをpPH143に挿入し、それによりPROTOXコード配列を置換する。このベクターを、次いでプラスチド形質転換におよびスペクチノマイシン耐性に関する形質転換体の選択に使用する。あるいは、DNA分子をpPH143に挿入し、aadH遺伝子を置換させる。この場合、形質転換体はPROTOX阻害剤に対する耐性に関して選択する。
Nicotiana tabacum c.v. 'Xanthi nc'の種子を、T寒天培地上で1"環状配列でプレート当たり7つ発芽させ、種蒔き後12−14日に、本質的に記載のようなpPH143およびpPH145由来のDNAでコートした1μmタングステン粒子(M10、Biorad, Hercules, CA)で照射した(Svab, Z. and Maliga, P. (1993) PNAS 90, 913-917)。照射した苗をT培地上で2日間インキュベートし、その後葉を取り、500μg/mlスペクチノマイシンジヒドロクロライド(Sigma, St. Louis, MO)含有RMOP培地(Svab, Z., Hajdukiewicz, P. and Maliga, P. (1990) PNAS 87, 8526-8530)のプレート上に明るい光(350−500μmol光子/m2/s)の中、背軸側を上に置いた。照射後3から8週間に白色葉の下に現れる耐性の芽を、同じ培地上でサブクローン化し、カルスを形成させ、2次芽を単離しサブクローン化する。独立したサブクローンの形質転換プラスチドゲノムコピーの完全な隔離(ホモプラスミシティー)は、サザンブロット(Sambrook et al., (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor)の標準法で評価した。BamHI/EcoRI消化全細胞性DNA(Mettler, I. J. (1987) Plant Mol Biol Reporter 5, 346-349)を1%Tris−ボレート(TBE)アガロースゲルで分離し、ナイロン膜(Amersham)に移し、rps7/12プラスチド標的配列の部分を含むpC8由来の0.7kb BamHI/HindIII DNAフラグメントを含む32P標識した無作為にプライムしたDNA配列とプローブした。同原形質(homoplasmic)芽をスペクチノマイシン含有MS/IBA培地(McBride, K. E. et al. (1994) PNAS 91, 7301-7305)に無菌的に根付かせ、温室に移す。
Claims (9)
- 植物細胞における標的遺伝子の発現を減少させる方法であって、該標的遺伝子のセンスRNAフラグメントおよび該標的遺伝子のアンチセンスRNAフラグメントを植物細胞に導入することを特徴とし、該センスおよびアンチセンスRNAフラグメントが1つのRNA分子に含まれており、該センスRNAフラグメントおよび該アンチセンスRNAフラグメントが二本鎖RNA分子を形成しうるものであり、センスおよびアンチセンス両方のフラグメントが存在することが、センスまたはアンチセンスいずれかのフラグメントが存在することよりも標的遺伝子の活性を低下させることに効果的であり、センスフラグメントとアンチセンスフラグメントとの間にイントロンプロセッシングシグナルを含むリンカーが存在するものである、方法。
- 植物細胞における標的遺伝子の発現を減少させる方法であって、該細胞において該標的遺伝子のセンスRNAフラグメントおよび該標的遺伝子のアンチセンスRNAフラグメントを発現しうる1つのDNA配列を植物細胞に導入することを特徴とし、該DNA配列が該植物細胞のゲノム内に安定に組み込まれ、該センスおよびアンチセンスRNAフラグメントが1つのRNA分子に含まれており、該センスRNAフラグメントおよび該アンチセンスRNAフラグメントが二本鎖RNA分子を形成しうるものであり、センスおよびアンチセンス両方のフラグメントが存在することが、センスまたはアンチセンスいずれかのフラグメントが存在することよりも標的遺伝子の活性を低下させることに効果的であり、センスフラグメントとアンチセンスフラグメントとの間にイントロンプロセッシングシグナルを含むリンカーが存在するものである、方法。
- 該標的遺伝子が該植物細胞の必須遺伝子である、請求項2記載の方法。
- 該標的遺伝子が該植物細胞のゲノム内に安定に組み込まれた異種遺伝子である、請求項2記載の方法。
- 該異種遺伝子が染色体外分子として該植物細胞中に存在する、請求項2記載の方法。
- 該DNA分子が、該第1のDNA配列に作動可能に連結された第1のプロモーターおよび該第2のDNA配列に作動可能に連結された第2のプロモーターをさらに含む、請求項2記載の方法。
- 標的遺伝子のセンスRNAフラグメントおよび標的遺伝子のアンチセンスRNAフラグメントを発現しうる1つのDNA配列を含む植物細胞であって、該DNA配列が該植物細胞のゲノム内に安定に組み込まれており、該センスおよびアンチセンスRNAフラグメントが1つのRNA分子に含まれており、該センスRNAフラグメントおよび該アンチセンスRNAフラグメントが二本鎖RNA分子を形成しうるものであり、センスおよびアンチセンス両方のフラグメントが存在することが、センスまたはアンチセンスいずれかのフラグメントが存在することよりも標的遺伝子の活性を低下させることに効果的であり、センスフラグメントとアンチセンスフラグメントとの間にイントロンプロセッシングシグナルを含むリンカーが存在するものである、植物細胞。
- 請求項7記載の植物細胞に由来する植物およびその子孫。
- 請求項8記載の植物に由来する種子。
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US8494298A | 1998-05-26 | 1998-05-26 |
Related Parent Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2000551014A Division JP2002516112A (ja) | 1998-05-26 | 1999-05-25 | 植物内の遺伝子発現のdsrna介在調節 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2009261403A true JP2009261403A (ja) | 2009-11-12 |
Family
ID=22188183
Family Applications (2)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2000551014A Pending JP2002516112A (ja) | 1998-05-26 | 1999-05-25 | 植物内の遺伝子発現のdsrna介在調節 |
JP2009148820A Pending JP2009261403A (ja) | 1998-05-26 | 2009-06-23 | 植物内の遺伝子発現のdsrna介在調節 |
Family Applications Before (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2000551014A Pending JP2002516112A (ja) | 1998-05-26 | 1999-05-25 | 植物内の遺伝子発現のdsrna介在調節 |
Country Status (22)
Country | Link |
---|---|
EP (2) | EP1080208B1 (ja) |
JP (2) | JP2002516112A (ja) |
KR (1) | KR20010071315A (ja) |
CN (2) | CN101173298B (ja) |
AR (1) | AR020078A1 (ja) |
AT (2) | ATE292182T1 (ja) |
AU (1) | AU751409B2 (ja) |
BR (1) | BR9910729A (ja) |
CA (1) | CA2328058C (ja) |
CY (1) | CY1112420T1 (ja) |
DE (1) | DE69924484T2 (ja) |
DK (2) | DK1516931T3 (ja) |
ES (2) | ES2237107T3 (ja) |
HK (1) | HK1034999A1 (ja) |
HU (1) | HUP0102103A3 (ja) |
IL (2) | IL139374A0 (ja) |
MX (1) | MXPA00011583A (ja) |
PL (1) | PL344312A1 (ja) |
PT (1) | PT1516931E (ja) |
TR (1) | TR200003481T2 (ja) |
WO (1) | WO1999061631A1 (ja) |
ZA (1) | ZA200006594B (ja) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP2323133A2 (en) | 2009-11-16 | 2011-05-18 | Sony Corporation | Disc cartridge |
Families Citing this family (215)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US6506559B1 (en) | 1997-12-23 | 2003-01-14 | Carnegie Institute Of Washington | Genetic inhibition by double-stranded RNA |
AUPP249298A0 (en) | 1998-03-20 | 1998-04-23 | Ag-Gene Australia Limited | Synthetic genes and genetic constructs comprising same I |
ATE526406T1 (de) | 1998-03-20 | 2011-10-15 | Commw Scient Ind Res Org | Kontrolle der genexpression |
US8598332B1 (en) | 1998-04-08 | 2013-12-03 | Bayer Cropscience N.V. | Methods and means for obtaining modified phenotypes |
US20040214330A1 (en) | 1999-04-07 | 2004-10-28 | Waterhouse Peter Michael | Methods and means for obtaining modified phenotypes |
GB9827152D0 (en) * | 1998-07-03 | 1999-02-03 | Devgen Nv | Characterisation of gene function using double stranded rna inhibition |
US7005423B1 (en) | 1999-07-02 | 2006-02-28 | Devgen Nv | Characterization of gene function using double stranded RNA inhibition |
EP1147204A1 (en) * | 1999-01-28 | 2001-10-24 | Medical College Of Georgia Research Institute, Inc. | Composition and method for in vivo and in vitro attenuation of gene expression using double stranded rna |
DE19956568A1 (de) * | 1999-01-30 | 2000-08-17 | Roland Kreutzer | Verfahren und Medikament zur Hemmung der Expression eines vorgegebenen Gens |
AU2008202208C1 (en) * | 1999-01-30 | 2014-04-24 | Alnylam Pharmaceuticals, Inc. | Method and medicament for inhibiting the expression of a defined gene |
PL351385A1 (en) * | 1999-05-10 | 2003-04-07 | Syngenta Participations Ag | Regulation of viral gene expression |
US6423885B1 (en) | 1999-08-13 | 2002-07-23 | Commonwealth Scientific And Industrial Research Organization (Csiro) | Methods for obtaining modified phenotypes in plant cells |
BR0013607A (pt) | 1999-08-26 | 2002-04-30 | Calgene Llc | Sequências de ácidos nucléicos e processos de uso para a produção de plantas com ácidos graxos poliinsaturados modificados |
US7531718B2 (en) | 1999-08-26 | 2009-05-12 | Monsanto Technology, L.L.C. | Nucleic acid sequences and methods of use for the production of plants with modified polyunsaturated fatty acids |
US7067722B2 (en) | 1999-08-26 | 2006-06-27 | Monsanto Technology Llc | Nucleic acid sequences and methods of use for the production of plants with modified polyunsaturated fatty acids |
JP2003516124A (ja) | 1999-10-15 | 2003-05-13 | ユニバーシティー オブ マサチューセッツ | 標的とした遺伝的干渉の手段としてのrna干渉経路遺伝子 |
GB9925459D0 (en) | 1999-10-27 | 1999-12-29 | Plant Bioscience Ltd | Gene silencing |
US7829693B2 (en) | 1999-11-24 | 2010-11-09 | Alnylam Pharmaceuticals, Inc. | Compositions and methods for inhibiting expression of a target gene |
DE10100586C1 (de) | 2001-01-09 | 2002-04-11 | Ribopharma Ag | Verfahren zur Hemmung der Expression eines Ziegens |
WO2001049844A1 (en) * | 1999-12-30 | 2001-07-12 | Rutgers, The State University Of New Jersey | Compositions and methods for gene silencing |
US20070026394A1 (en) | 2000-02-11 | 2007-02-01 | Lawrence Blatt | Modulation of gene expression associated with inflammation proliferation and neurite outgrowth using nucleic acid based technologies |
US7491805B2 (en) | 2001-05-18 | 2009-02-17 | Sirna Therapeutics, Inc. | Conjugates and compositions for cellular delivery |
US8202979B2 (en) | 2002-02-20 | 2012-06-19 | Sirna Therapeutics, Inc. | RNA interference mediated inhibition of gene expression using chemically modified short interfering nucleic acid |
US7833992B2 (en) | 2001-05-18 | 2010-11-16 | Merck Sharpe & Dohme | Conjugates and compositions for cellular delivery |
US8273866B2 (en) | 2002-02-20 | 2012-09-25 | Merck Sharp & Dohme Corp. | RNA interference mediated inhibition of gene expression using chemically modified short interfering nucleic acid (SINA) |
AU2001249622B2 (en) | 2000-03-30 | 2007-06-07 | Massachusetts Institute Of Technology | RNA sequence-specific mediators of RNA interference |
AU2001272977A1 (en) * | 2000-06-23 | 2002-01-08 | E.I. Du Pont De Nemours And Company | Recombinant constructs and their use in reducing gene expression |
AU2001297906B2 (en) | 2000-10-31 | 2007-07-19 | Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation | Method and means for producing barley yellow dwarf virus resistant cereal plants |
CH695778A5 (de) * | 2000-11-29 | 2006-08-31 | Hoffmann La Roche | Hemmung der Transkription eines Zielgens in einer Zelle oder in Geweben. |
HU230458B1 (hu) | 2000-12-01 | 2016-07-28 | Europäisches Laboratorium für Molekularbiologie (EMBL) | Az RNS interferenciát közvetítő kis RNS molekulák |
JP2004532616A (ja) * | 2000-12-28 | 2004-10-28 | ジョンソン・アンド・ジョンソン・リサーチ・ピー・ティー・ワイ・リミテッド | 二本鎖rna仲介遺伝子抑制 |
AU2002246742B2 (en) * | 2000-12-28 | 2008-02-07 | J & J Research Pty Ltd | Double-stranded RNA-mediated gene suppression |
US8546143B2 (en) | 2001-01-09 | 2013-10-01 | Alnylam Pharmaceuticals, Inc. | Compositions and methods for inhibiting expression of a target gene |
US7423142B2 (en) | 2001-01-09 | 2008-09-09 | Alnylam Pharmaceuticals, Inc. | Compositions and methods for inhibiting expression of anti-apoptotic genes |
US7767802B2 (en) | 2001-01-09 | 2010-08-03 | Alnylam Pharmaceuticals, Inc. | Compositions and methods for inhibiting expression of anti-apoptotic genes |
AU2002224668B2 (en) | 2001-01-26 | 2007-09-20 | Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation | Methods and means for producing efficient silencing construct using recombinational cloning |
CA2369944A1 (en) | 2001-01-31 | 2002-07-31 | Nucleonics Inc. | Use of post-transcriptional gene silencing for identifying nucleic acid sequences that modulate the function of a cell |
US7109165B2 (en) | 2001-05-18 | 2006-09-19 | Sirna Therapeutics, Inc. | Conjugates and compositions for cellular delivery |
US20050148530A1 (en) | 2002-02-20 | 2005-07-07 | Sirna Therapeutics, Inc. | RNA interference mediated inhibition of vascular endothelial growth factor and vascular endothelial growth factor receptor gene expression using short interfering nucleic acid (siNA) |
US9994853B2 (en) | 2001-05-18 | 2018-06-12 | Sirna Therapeutics, Inc. | Chemically modified multifunctional short interfering nucleic acid molecules that mediate RNA interference |
ES2192945B1 (es) * | 2001-07-06 | 2005-03-01 | Consejo Superior De Investigaciones Cientificas | Un metodo para interferir con la infeccion de virus en plantas. |
ES2566561T3 (es) | 2001-07-12 | 2016-04-13 | University Of Massachusetts | Producción in vivo de ARN pequeños de interferencia que median el silenciamiento génico |
US7745418B2 (en) | 2001-10-12 | 2010-06-29 | Alnylam Pharmaceuticals, Inc. | Compositions and methods for inhibiting viral replication |
DE10163098B4 (de) | 2001-10-12 | 2005-06-02 | Alnylam Europe Ag | Verfahren zur Hemmung der Replikation von Viren |
DE10202419A1 (de) | 2002-01-22 | 2003-08-07 | Ribopharma Ag | Verfahren zur Hemmung der Expression eines durch eine Chromosomen-Aberration entstandenen Zielgens |
US9181551B2 (en) | 2002-02-20 | 2015-11-10 | Sirna Therapeutics, Inc. | RNA interference mediated inhibition of gene expression using chemically modified short interfering nucleic acid (siNA) |
US9657294B2 (en) | 2002-02-20 | 2017-05-23 | Sirna Therapeutics, Inc. | RNA interference mediated inhibition of gene expression using chemically modified short interfering nucleic acid (siNA) |
CN1643147B (zh) * | 2002-03-14 | 2010-04-14 | 联邦科学和工业研究组织 | 监测和调节基因沉默的方法和工具 |
US7566813B2 (en) | 2002-03-21 | 2009-07-28 | Monsanto Technology, L.L.C. | Nucleic acid constructs and methods for producing altered seed oil compositions |
US7166771B2 (en) | 2002-06-21 | 2007-01-23 | Monsanto Technology Llc | Coordinated decrease and increase of gene expression of more than one gene using transgenic constructs |
CA2479587A1 (en) | 2002-03-21 | 2003-10-02 | Monsanto Technology Llc | Nucleic acid constructs and methods for producing altered seed oil compositions |
US20040180438A1 (en) | 2002-04-26 | 2004-09-16 | Pachuk Catherine J. | Methods and compositions for silencing genes without inducing toxicity |
EP1516051A4 (en) * | 2002-06-21 | 2007-05-02 | Monsanto Technology Llc | INTRON DOUBLE-STRANDED RNA HYBRID GENES, AND USES THEREOF |
EP1539951A1 (en) * | 2002-06-21 | 2005-06-15 | Sinogenomax Co., Ltd. | Randomised dna libraries and double-stranded rna libraries, use and method of production thereof |
AU2003260370B2 (en) | 2002-08-05 | 2008-05-22 | Silence Therapeutics Gmbh | Further novel forms of interfering RNA molecules |
US7923547B2 (en) | 2002-09-05 | 2011-04-12 | Sirna Therapeutics, Inc. | RNA interference mediated inhibition of gene expression using chemically modified short interfering nucleic acid (siNA) |
US7365186B2 (en) | 2002-11-22 | 2008-04-29 | Arborgen, Llc | Vascular-preferred promoter sequences and uses thereof |
US20060253917A1 (en) | 2002-12-26 | 2006-11-09 | Bret Cooper | Cell proliferation-related polypeptides and uses therefor |
JP4909072B2 (ja) | 2003-06-06 | 2012-04-04 | アーバージェン インコーポレイテッド | 転写因子 |
US7858769B2 (en) | 2004-02-10 | 2010-12-28 | Sirna Therapeutics, Inc. | RNA interference mediated inhibition of gene expression using multifunctional short interfering nucleic acid (multifunctional siNA) |
AR047598A1 (es) * | 2004-02-10 | 2006-01-25 | Monsanto Technology Llc | Semilla de maiz transgenica con mayor contenido de aminoacidos |
US7855323B2 (en) | 2004-02-10 | 2010-12-21 | Monsanto Technology Llc | Recombinant DNA for gene suppression |
US7622301B2 (en) | 2004-02-24 | 2009-11-24 | Basf Plant Science Gmbh | Compositions and methods using RNA interference for control of nematodes |
ES2423060T3 (es) | 2004-03-12 | 2013-09-17 | Alnylam Pharmaceuticals, Inc. | Agentes iRNA que tienen como diana al VEGF |
US20060021087A1 (en) * | 2004-04-09 | 2006-01-26 | Baum James A | Compositions and methods for control of insect infestations in plants |
US10508277B2 (en) | 2004-05-24 | 2019-12-17 | Sirna Therapeutics, Inc. | Chemically modified multifunctional short interfering nucleic acid molecules that mediate RNA interference |
US7453025B2 (en) | 2004-09-22 | 2008-11-18 | Arborgen, Llc | Reproductive ablation constructs |
US8148604B2 (en) * | 2004-10-21 | 2012-04-03 | Venganza Inc. | Methods and materials for conferring resistance to pests and pathogens of plants |
US20060150286A1 (en) * | 2004-12-23 | 2006-07-06 | Shihshieh Huang | Gene suppression in transgenic plants using multiple constructs |
CA2592894C (en) | 2004-12-28 | 2013-08-27 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Improved grain quality through altered expression of gamma-zein protein |
CA2594572A1 (en) | 2005-01-14 | 2006-07-20 | University Of Guelph | Nitrogen-regulated sugar sensing gene and protein and modulation thereof |
WO2006091194A1 (en) | 2005-02-23 | 2006-08-31 | North Carolina State University | Alteration of tobacco alkaloid content through modification of specific cytochrome p450 genes |
EP2261361A3 (en) | 2005-05-25 | 2011-04-20 | Pioneer Hi-Bred International Inc. | Methods for improving crop plant architecture and yield |
CA2621874C (en) | 2005-09-08 | 2014-12-16 | Chromatin Inc. | Plants modified with mini-chromosomes |
US7320965B2 (en) | 2005-10-28 | 2008-01-22 | Alnylam Pharmaceuticals, Inc. | Compositions and methods for inhibiting expression of Huntingtin gene |
CA2626584A1 (en) | 2005-11-04 | 2007-05-18 | Alnylam Pharmaceuticals, Inc. | Compositions and methods for inhibiting expression of nav1.8 gene |
WO2007056331A2 (en) | 2005-11-09 | 2007-05-18 | Alnylam Pharmaceuticals, Inc. | Compositions and methods for inhibiting expression of factor v leiden mutant gene |
US8058509B2 (en) | 2005-12-21 | 2011-11-15 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Methods and compositions for in planta production of inverted repeats |
AU2007205935B2 (en) | 2006-01-17 | 2013-07-11 | Synthon Biopharmaceuticals B.V. | Compositions and methods for humanization and optimization of N-glycans in plants |
CA2895745A1 (en) | 2006-02-09 | 2007-08-16 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Genes for enhancing nitrogen utilization efficiency in crop plants |
CN101421406B (zh) | 2006-02-13 | 2016-08-31 | 孟山都技术有限公司 | 用于产生改变的种子油组成的核酸构建体和方法 |
US7718629B2 (en) | 2006-03-31 | 2010-05-18 | Alnylam Pharmaceuticals, Inc. | Compositions and methods for inhibiting expression of Eg5 gene |
MX2008013354A (es) | 2006-04-19 | 2008-11-10 | Pioneer Hi Bred Int | Moleculas de polinucleotidos aislados que corresponden a alelos mutantes y tipo salvaje del gen de maiz d9, y metodos para usarlas. |
US7691824B2 (en) | 2006-04-28 | 2010-04-06 | Alnylam Pharmaceuticals, Inc. | Compositions and methods for inhibiting expression of a gene from the JC virus |
JP5570806B2 (ja) | 2006-05-11 | 2014-08-13 | アルナイラム ファーマシューティカルズ, インコーポレイテッド | Pcsk9遺伝子の発現を阻害するための組成物および方法 |
US7812150B2 (en) | 2006-05-19 | 2010-10-12 | Alnylam Pharmaceuticals, Inc. | RNAi modulation of Aha and therapeutic uses thereof |
US7888498B2 (en) | 2006-05-22 | 2011-02-15 | Alnylam Pharmaceuticals, Inc. | Compositions and methods for inhibiting expression of IKK-B gene |
ES2655700T3 (es) | 2006-08-31 | 2018-02-21 | Monsanto Technology, Llc | ARN pequeños en fase |
EP2069510B1 (en) | 2006-08-31 | 2013-07-24 | Monsanto Technology, LLC | Methods for rapidly transforming monocots |
KR20090083338A (ko) | 2006-09-18 | 2009-08-03 | 알닐람 파마슈티칼스 인코포레이티드 | SCAP의 RNAi 조절 및 이들의 치료적 용도 |
AU2007299629C1 (en) | 2006-09-21 | 2012-05-10 | Alnylam Pharmaceuticals, Inc. | Compositions and methods for inhibiting expression of the HAMP gene |
WO2008067840A1 (en) | 2006-12-08 | 2008-06-12 | Swetree Technologies Ab | Plants having improved growth characteristics and method for making the same |
BRPI0809130A8 (pt) | 2007-03-21 | 2021-11-03 | Brookhaven Science Ass Llc | Composições combinadas hairpin-antissenso e métodos para modulação da expressão |
PE20090064A1 (es) | 2007-03-26 | 2009-03-02 | Novartis Ag | Acido ribonucleico de doble cadena para inhibir la expresion del gen e6ap humano y composicion farmaceutica que lo comprende |
US7759320B2 (en) | 2007-03-29 | 2010-07-20 | Alnylam Pharmaceuticals, Inc. | Compositions and methods for inhibiting expression of a gene from the Ebola |
CA2584934A1 (en) | 2007-04-17 | 2008-10-17 | University Of Guelph | Nitrogen-regulated sugar sensing gene and protein and modulation thereof |
CA2687760C (en) | 2007-05-23 | 2017-10-31 | Syngenta Participations Ag | Sugar beet polynucleotide markers |
EP2164863A4 (en) | 2007-06-15 | 2010-07-28 | Univ Arkansas | METHOD FOR THE ADMINISTRATION OF MOLECULES IN CELLS USING A RICIN SUB-UNIT AND RELATED COMPOSITIONS THEREOF |
EP2319926B1 (en) | 2007-07-05 | 2016-08-31 | Arrowhead Research Corporation | DSRNA for treating viral infection |
AU2008286701B2 (en) | 2007-08-14 | 2015-02-12 | Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation | Improved gene silencing methods |
US8097712B2 (en) | 2007-11-07 | 2012-01-17 | Beelogics Inc. | Compositions for conferring tolerance to viral disease in social insects, and the use thereof |
BRPI0820042B1 (pt) | 2007-11-12 | 2020-05-19 | North Carolina State University | método de obtenção de uma planta de tabaco, ou célula ou parte desta, tendo níveis reduzidos de nornicotina, produto de tabaco, método para fabricar um produto de tabaco, polinucleotídeo isolado, cassete de expressão, polipetpídeo isolado e método de obtenção de uma planta, ou parte de planta desta, do gênero nicotiana |
CN101932712B (zh) | 2007-11-20 | 2014-05-14 | 先锋国际良种公司 | 用于改善植物应激耐性的玉米乙烯信号转导基因及其调节 |
EP2848688A1 (en) | 2007-12-10 | 2015-03-18 | Alnylam Pharmaceuticals, Inc. | Compositions and methods for inhibiting expression of factor VII gene |
EP2554674B1 (en) | 2007-12-21 | 2014-11-05 | Keygene N.V. | Trichome specific promoters |
NZ601188A (en) | 2007-12-28 | 2014-03-28 | Swetree Technologies Ab | Woody plants having improved growth characteristics and method for making the same using transcription factors |
CN105267233B (zh) | 2008-03-05 | 2019-07-26 | 阿尔尼拉姆医药品有限公司 | 用于抑制Eg5和VEGF基因表达的组合物和方法 |
AU2009236270B2 (en) | 2008-04-15 | 2014-06-26 | Government Of The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health & Human Services | Compositions and methods for delivering inhibitory oligonucleotides |
US8536406B2 (en) | 2008-04-28 | 2013-09-17 | Michigan Technological University | COMT1 gene fiber-specific promoter elements from poplar |
EP2690175B1 (en) | 2008-09-02 | 2016-12-28 | Alnylam Pharmaceuticals, Inc. | Compositions and methods for combined inhibition of mutant EGFR gene and IL-6 expression |
JP5529142B2 (ja) | 2008-09-25 | 2014-06-25 | アルナイラム ファーマシューティカルズ, インコーポレイテッド | 血清アミロイドa遺伝子の発現を阻害するための脂質製剤組成物および方法 |
UY32145A (es) | 2008-09-29 | 2010-04-30 | Monsanto Technology Llc | Evento transgénico de soja mon87705 y métodos para detectar el mismo |
EA020312B1 (ru) | 2008-10-20 | 2014-10-30 | Элнилэм Фармасьютикалз, Инк. | Композиции и способы для ингибирования экспрессии транстиретина |
EP2344640A1 (en) | 2008-10-30 | 2011-07-20 | Pioneer Hi-Bred International Inc. | Manipulation of glutamine synthetases (gs) to improve nitrogen use efficiency and grain yield in higher plants |
EP2350291A4 (en) | 2008-11-03 | 2012-02-22 | Swetree Technologies Ab | PLANT MATERIAL, PLANTS AND METHOD FOR PRODUCING A PLANT WITH CHANGED LIGNIN PROPERTIES |
CA2743707A1 (en) | 2008-12-04 | 2010-06-10 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Methods and compositions for enhanced yield by targeted expression of knotted1 |
AU2009324534B2 (en) | 2008-12-10 | 2015-07-30 | Alnylam Pharmaceuticals, Inc. | GNAQ targeted dsRNA compositions and methods for inhibiting expression |
WO2010099341A1 (en) | 2009-02-26 | 2010-09-02 | Alnylam Pharmaceuticals, Inc. | Compositions and methods for inhibiting expression of mig-12 gene |
WO2010101818A1 (en) | 2009-03-02 | 2010-09-10 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Nac transcriptional activators involved in abiotic stress tolerance |
EP2406376A1 (en) | 2009-03-12 | 2012-01-18 | Alnylam Pharmaceuticals, Inc. | LIPID FORMULATED COMPOSITIONS AND METHODS FOR INHIBITING EXPRESSION OF Eg5 AND VEGF GENES |
WO2010120862A1 (en) | 2009-04-14 | 2010-10-21 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Modulation of acc synthase improves plant yield under low nitrogen conditions |
BRPI1010843A2 (pt) | 2009-06-08 | 2015-09-08 | Nunhems Bv | plantas tolerantes à seca |
NZ597504A (en) | 2009-06-15 | 2013-10-25 | Alnylam Pharmaceuticals Inc | Lipid formulated dsrna targeting the pcsk9 gene |
US9051567B2 (en) | 2009-06-15 | 2015-06-09 | Tekmira Pharmaceuticals Corporation | Methods for increasing efficacy of lipid formulated siRNA |
IN2012DN00531A (ja) | 2009-07-24 | 2015-08-21 | Pioneer Hi Bred Int | |
EP2810643A3 (en) | 2009-08-14 | 2015-03-11 | Alnylam Pharmaceuticals Inc. | Lipid formulated compositions and mehods for inhibiting expression of a gene from the ebola virus |
CA2775093A1 (en) | 2009-10-02 | 2011-04-07 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Down-regulation of acc synthase for improved plant performance |
US8962584B2 (en) | 2009-10-14 | 2015-02-24 | Yissum Research Development Company Of The Hebrew University Of Jerusalem, Ltd. | Compositions for controlling Varroa mites in bees |
WO2011067745A2 (en) | 2009-12-06 | 2011-06-09 | Rosetta Green Ltd. | Compositions and methods for enhancing plants resistance to abiotic stress |
US8710209B2 (en) | 2009-12-09 | 2014-04-29 | Nitto Denko Corporation | Modulation of HSP47 expression |
EP2521788A1 (en) | 2010-01-06 | 2012-11-14 | Pioneer Hi-Bred International Inc. | Identification of diurnal rhythms in photosynthetic and non-photosynthetic tissues from zea mays and use in improving crop plants |
US20130047297A1 (en) | 2010-03-08 | 2013-02-21 | Robert D. Sammons | Polynucleotide molecules for gene regulation in plants |
WO2011123468A1 (en) | 2010-03-29 | 2011-10-06 | Alnylam Pharmaceuticals, Inc. | Sirna therapy for transthyretin (ttr) related ocular amyloidosis |
EP4385568A2 (en) | 2010-04-06 | 2024-06-19 | Alnylam Pharmaceuticals, Inc. | Compositions and methods for inhibiting expression of cd274/pd-l1 gene |
MX344585B (es) | 2010-05-28 | 2016-12-20 | Nunhems Bv | Platas con un tamaño de fruto incrementado. |
CA2801066C (en) | 2010-06-02 | 2021-02-09 | Alnylam Pharmaceuticals, Inc. | Compositions and methods directed to treating liver fibrosis |
EP2593468B1 (en) | 2010-07-12 | 2020-06-10 | The State of Israel, Ministry of Agriculture and Rural Development, Agricultural Research Organization, (A.R.O.), Volcani Center | Isolated polynucleotides and methods and plants using same for regulating plant acidity |
US9260471B2 (en) | 2010-10-29 | 2016-02-16 | Sirna Therapeutics, Inc. | RNA interference mediated inhibition of gene expression using short interfering nucleic acids (siNA) |
US9339513B2 (en) | 2010-11-09 | 2016-05-17 | Alnylam Pharmaceuticals, Inc. | Lipid formulated compositions and methods for inhibiting expression of Eg5 and VEGF genes |
WO2012078536A2 (en) | 2010-12-06 | 2012-06-14 | Quark Pharmaceuticals, Inc. | Double stranded oligonucleotide compounds comprising positional modifications |
JP6000287B2 (ja) | 2011-03-03 | 2016-09-28 | クォーク ファーマシューティカルズ インコーポレーティッドQuark Pharmaceuticals,Inc. | 肺疾患および損傷を治療するための組成物および方法 |
EP2689019A2 (en) | 2011-03-23 | 2014-01-29 | Pioneer Hi-Bred International Inc. | Methods for producing a complex transgenic trait locus |
WO2012148835A1 (en) | 2011-04-29 | 2012-11-01 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Down-regulation of a homeodomain-leucine zipper i-class homeobox gene for improved plant performance |
US10196637B2 (en) | 2011-06-08 | 2019-02-05 | Nitto Denko Corporation | Retinoid-lipid drug carrier |
TWI658830B (zh) | 2011-06-08 | 2019-05-11 | 日東電工股份有限公司 | Hsp47表現調控強化用類視色素脂質體 |
US20140216118A1 (en) | 2011-06-14 | 2014-08-07 | Synthon Biopharmaceuticals B.V. | Compositions and Methods for Making and Biocontaining Auxotrophic Transgenic Plants |
US20140275211A1 (en) | 2011-06-21 | 2014-09-18 | Alnylam Pharmaceuticals, Inc. | Assays and methods for determining activity of a therapeutic agent in a subject |
CN104080914A (zh) | 2011-06-21 | 2014-10-01 | 先锋国际良种公司 | 产生雄性不育植物的组合物和方法 |
WO2012177949A2 (en) | 2011-06-21 | 2012-12-27 | Alnylam Pharmaceuticals, Inc. | Compositions and methods for inhibition of expression of protein c (proc) genes |
EP2723861A4 (en) | 2011-06-21 | 2014-12-10 | Alnylam Pharmaceuticals Inc | COMPOSITIONS AND METHODS FOR INHIBITING HEPCIDINE ANTIMICROBIAL PEPTIDE (HAMP) OR THE ASSOCIATED GENE EXPRESSION |
US9315813B2 (en) | 2011-06-21 | 2016-04-19 | Alnylam Pharmaceuticals, Inc | Compositions and methods for inhibition of expression of apolipoprotein C-III (APOC3) genes |
WO2012178033A2 (en) | 2011-06-23 | 2012-12-27 | Alnylam Pharmaceuticals, Inc. | Serpina1 sirnas: compositions of matter and methods of treatment |
MX343072B (es) | 2011-09-13 | 2016-10-21 | Monsanto Technology Llc | Metodos y composiciones para controlar malezas. |
MX362812B (es) | 2011-09-13 | 2019-02-13 | Monsanto Technology Llc | Metodos y composiciones para el control de malezas. |
US9840715B1 (en) | 2011-09-13 | 2017-12-12 | Monsanto Technology Llc | Methods and compositions for delaying senescence and improving disease tolerance and yield in plants |
US10760086B2 (en) | 2011-09-13 | 2020-09-01 | Monsanto Technology Llc | Methods and compositions for weed control |
US10829828B2 (en) | 2011-09-13 | 2020-11-10 | Monsanto Technology Llc | Methods and compositions for weed control |
US10806146B2 (en) | 2011-09-13 | 2020-10-20 | Monsanto Technology Llc | Methods and compositions for weed control |
AU2012308686B2 (en) | 2011-09-13 | 2018-05-10 | Monsanto Technology Llc | Methods and compositions for weed control |
CA2848689A1 (en) | 2011-09-13 | 2013-03-21 | Monsanto Technology Llc | Methods and compositions for weed control targeting pds |
US9920326B1 (en) | 2011-09-14 | 2018-03-20 | Monsanto Technology Llc | Methods and compositions for increasing invertase activity in plants |
WO2013066805A1 (en) | 2011-10-31 | 2013-05-10 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Improving plant drought tolerance, nitrogen use efficiency and yield |
JP6118331B2 (ja) | 2011-11-03 | 2017-04-19 | クォーク ファーマシューティカルズ インコーポレーティッドQuark Pharmaceuticals,Inc. | 神経保護のための方法および組成物 |
UA116097C2 (uk) | 2011-12-11 | 2018-02-12 | Зе Стейт Оф Ізраел, Міністрі Оф Агрікалче Енд Руерал Девелопмент, Агрікалчерал Рісьоч Організейшн, (А.Р.О.), Волкані Сентре | Спосіб модуляції провідності устячка рослини |
US10184131B2 (en) | 2012-02-06 | 2019-01-22 | A.B. Seeds Ltd. | Isolated polynucleotides expressing or modulating microRNAs or targets of same, transgenic plants comprising same and uses thereof |
WO2013138309A1 (en) | 2012-03-13 | 2013-09-19 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Genetic reduction of male fertility in plants |
EA201491670A1 (ru) | 2012-03-13 | 2015-07-30 | Пайонир Хай-Бред Интернэшнл, Инк. | Генетическое снижение мужской репродуктивной функции у растений |
EP3453762B1 (en) | 2012-05-02 | 2021-04-21 | Sirna Therapeutics, Inc. | Short interfering nucleic acid (sina) compositions |
IN2014MN02404A (ja) * | 2012-05-24 | 2015-08-21 | Seeds Ltd Ab | |
US10006041B2 (en) | 2012-08-16 | 2018-06-26 | Vib Vzw | Means and methods for altering the lignin pathway in plants |
BR112015008706A2 (pt) | 2012-10-18 | 2018-02-06 | Monsanto Technology Llc | métodos e composições para controle de praga de plantas |
CN103060374B (zh) * | 2012-10-30 | 2014-05-07 | 中国农业科学院兰州兽医研究所 | 一种基于位点特异性重组的rna干扰载体及其构建方法和应用 |
CN105358695B (zh) | 2013-01-01 | 2019-07-12 | A.B.种子有限公司 | 将dsRNA引入植物种子以调节基因表达的方法 |
US10683505B2 (en) | 2013-01-01 | 2020-06-16 | Monsanto Technology Llc | Methods of introducing dsRNA to plant seeds for modulating gene expression |
US10000767B2 (en) | 2013-01-28 | 2018-06-19 | Monsanto Technology Llc | Methods and compositions for plant pest control |
AU2014211570A1 (en) | 2013-01-29 | 2015-07-23 | The University Court Of The University Of Glasgow | Methods and means for increasing stress tolerance and biomass in plants |
US20160002648A1 (en) | 2013-03-11 | 2016-01-07 | Mei Guo | Genes for improving nutrient uptake and abiotic stress tolerance in plants |
CA2905027A1 (en) | 2013-03-13 | 2014-10-09 | Monsanto Technology Llc | Methods and compositions for weed control |
US20160010101A1 (en) | 2013-03-13 | 2016-01-14 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Enhanced nitrate uptake and nitrate translocation by over- expressing maize functional low-affinity nitrate transporters in transgenic maize |
EP3699592A1 (en) | 2013-03-13 | 2020-08-26 | Geneweave Biosciences Inc. | Non-replicative transduction particles and transduction particle-based reporter systems |
EP2967082A4 (en) | 2013-03-13 | 2016-11-02 | Monsanto Technology Llc | METHOD AND COMPOSITIONS FOR WEED CONTROL |
US20160017360A1 (en) | 2013-03-13 | 2016-01-21 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Functional expression of bacterial major facilitator superfamily mfs gene in maize to improve agronomic traits and grain yield |
US20140283211A1 (en) | 2013-03-14 | 2014-09-18 | Monsanto Technology Llc | Methods and Compositions for Plant Pest Control |
US20140304857A1 (en) | 2013-03-14 | 2014-10-09 | Pioneer Hi Bred International Inc | Maize stress related transcription factor 18 and uses thereof |
US10568328B2 (en) | 2013-03-15 | 2020-02-25 | Monsanto Technology Llc | Methods and compositions for weed control |
WO2014143996A2 (en) | 2013-03-15 | 2014-09-18 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Compositions and methods of use of acc oxidase polynucleotides and polypeptides |
WO2014147249A1 (en) | 2013-03-21 | 2014-09-25 | Vib Vzw | Means and methods for the reduction of photorespiration in crops |
AU2014278519B2 (en) | 2013-06-11 | 2020-09-10 | Syngenta Participations Ag | Methods for generating transgenic plants |
US9850496B2 (en) | 2013-07-19 | 2017-12-26 | Monsanto Technology Llc | Compositions and methods for controlling Leptinotarsa |
MX359191B (es) | 2013-07-19 | 2018-09-18 | Monsanto Technology Llc | Composiciones y métodos para controlar leptinotarsa. |
MX2016005778A (es) | 2013-11-04 | 2016-12-20 | Monsanto Technology Llc | Composiciones y metodos para controlar infestaciones de plagas y parasitos de los artropodos. |
UA119253C2 (uk) | 2013-12-10 | 2019-05-27 | Біолоджикс, Інк. | Спосіб боротьби із вірусом у кліща varroa та у бджіл |
AU2015206585A1 (en) | 2014-01-15 | 2016-07-21 | Monsanto Technology Llc | Methods and compositions for weed control using EPSPS polynucleotides |
WO2015116680A1 (en) | 2014-01-30 | 2015-08-06 | Two Blades Foundation | Plants with enhanced resistance to phytophthora |
AU2015230681A1 (en) * | 2014-03-12 | 2016-09-08 | The University Of Sydney | RNA production in higher plants |
EP3125676A4 (en) | 2014-04-01 | 2018-02-14 | Monsanto Technology LLC | Compositions and methods for controlling insect pests |
WO2015171603A1 (en) | 2014-05-06 | 2015-11-12 | Two Blades Foundation | Methods for producing plants with enhanced resistance to oomycete pathogens |
CA2953347A1 (en) | 2014-06-23 | 2015-12-30 | Monsanto Technology Llc | Compositions and methods for regulating gene expression via rna interference |
WO2015200539A1 (en) | 2014-06-25 | 2015-12-30 | Monsanto Technology Llc | Methods and compositions for delivering nucleic acids to plant cells and regulating gene expression |
CA2954201A1 (en) | 2014-07-08 | 2016-01-14 | Vib Vzw | Means and methods to increase plant yield |
EP3174982A4 (en) | 2014-07-29 | 2018-06-20 | Monsanto Technology LLC | Compositions and methods for controlling insect pests |
BR112017011076A2 (pt) | 2014-11-25 | 2018-08-07 | Integrated Plant Genetics Inc | métodos e composições para prevenir ou reduzir infecções de plantas cultivadas por agentes patogênicos fúngicos e bacterianos |
RU2723049C2 (ru) | 2015-01-22 | 2020-06-08 | Монсанто Текнолоджи Ллс | Композиции и способы борьбы с leptinotarsa |
UY36703A (es) | 2015-06-02 | 2016-12-30 | Monsanto Technology Llc | Composiciones y métodos para la administración de un polinucleótido en una planta |
CN108024517A (zh) | 2015-06-03 | 2018-05-11 | 孟山都技术公司 | 用于将核酸引入到植物中的方法和组合物 |
JP7028764B2 (ja) | 2015-09-02 | 2022-03-02 | アルナイラム ファーマシューティカルズ, インコーポレイテッド | プログラム細胞死1リガンド1(PD-L1)iRNA組成物およびその使用方法 |
JP6978152B2 (ja) | 2015-09-04 | 2021-12-08 | キージーン ナムローゼ フェンノートシャップ | 複相胞子生殖遺伝子 |
WO2017062790A1 (en) | 2015-10-09 | 2017-04-13 | Two Blades Foundation | Cold shock protein receptors and methods of use |
AU2017234920B2 (en) | 2016-03-18 | 2023-08-17 | E. I. Du Pont De Nemours And Company | Methods and compositions for producing clonal, non-reduced, non-recombined gametes |
US11155819B2 (en) | 2017-09-07 | 2021-10-26 | Beijing Tide Pharmaceutical Co., Ltd. | Double-stranded RNA molecule targeting CKIP-1 and use thereof |
US20220298522A1 (en) | 2019-07-30 | 2022-09-22 | The State Of Israel, Ministry Of Agriculture & Rural Development, Agricultural Research Organization | Methods of controlling cannabinoid synthesis in plants or cells and plants and cells produced thereby |
US20220290156A1 (en) | 2019-08-27 | 2022-09-15 | Sanofi | Compositions and methods for inhibiting pcsk9 |
WO2021100034A1 (en) | 2019-11-19 | 2021-05-27 | Protalix Ltd. | Removal of constructs from transformed cells |
CN116113421A (zh) | 2020-05-14 | 2023-05-12 | 阿莱兹精准医疗公司 | 使用siRNA调节PRDM2/RIZ蛋白表达的癌症治疗 |
WO2023012342A1 (en) | 2021-08-06 | 2023-02-09 | Kws Vegetables B.V. | Durable downy mildew resistance in spinach |
Citations (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO1995009920A1 (en) * | 1993-10-06 | 1995-04-13 | Sandoz Ltd. | Virus resistant or tolerant cells |
WO1998053083A1 (en) * | 1997-05-21 | 1998-11-26 | Zeneca Limited | Gene silencing |
WO1999032619A1 (en) * | 1997-12-23 | 1999-07-01 | The Carnegie Institution Of Washington | Genetic inhibition by double-stranded rna |
WO1999049029A1 (en) * | 1998-03-20 | 1999-09-30 | Benitec Australia Ltd | Control of gene expression |
WO1999053050A1 (en) * | 1998-04-08 | 1999-10-21 | Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation | Methods and means for obtaining modified phenotypes |
Family Cites Families (22)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
AU590597B2 (en) | 1985-08-07 | 1989-11-09 | Monsanto Technology Llc | Glyphosate-resistant plants |
IL81737A (en) * | 1986-03-28 | 1992-11-15 | Calgene Inc | Regulation of gene expression in plant cells |
US5107065A (en) | 1986-03-28 | 1992-04-21 | Calgene, Inc. | Anti-sense regulation of gene expression in plant cells |
US5614395A (en) | 1988-03-08 | 1997-03-25 | Ciba-Geigy Corporation | Chemically regulatable and anti-pathogenic DNA sequences and uses thereof |
EP0332104A3 (en) | 1988-03-08 | 1991-03-20 | Ciba-Geigy Ag | Chemically regulatable dna sequences and genes and uses thereof |
ATE112314T1 (de) | 1988-05-17 | 1994-10-15 | Lubrizol Genetics Inc | Pflanzliches ubiquitinpromotorsystem. |
ES2199931T3 (es) | 1989-03-24 | 2004-03-01 | Syngenta Participations Ag | Plantas transgenicas resistentes a enfermedades. |
US5231020A (en) | 1989-03-30 | 1993-07-27 | Dna Plant Technology Corporation | Genetic engineering of novel plant phenotypes |
US5034323A (en) | 1989-03-30 | 1991-07-23 | Dna Plant Technology Corporation | Genetic engineering of novel plant phenotypes |
US5629183A (en) | 1989-05-08 | 1997-05-13 | The United States Of America As Represented By The Secretary Of Agriculture | Plant transformation by gene transfer into pollen |
US4940935A (en) | 1989-08-28 | 1990-07-10 | Ried Ashman Manufacturing | Automatic SMD tester |
ATE225853T1 (de) | 1990-04-12 | 2002-10-15 | Syngenta Participations Ag | Gewebe-spezifische promotoren |
US5451513A (en) | 1990-05-01 | 1995-09-19 | The State University of New Jersey Rutgers | Method for stably transforming plastids of multicellular plants |
US5639949A (en) | 1990-08-20 | 1997-06-17 | Ciba-Geigy Corporation | Genes for the synthesis of antipathogenic substances |
GB9304200D0 (en) | 1993-03-02 | 1993-04-21 | Sandoz Ltd | Improvements in or relating to organic compounds |
UA48104C2 (uk) | 1991-10-04 | 2002-08-15 | Новартіс Аг | Фрагмент днк, який містить послідовність,що кодує інсектицидний протеїн, оптимізовану для кукурудзи,фрагмент днк, який забезпечує направлену бажану для серцевини стебла експресію зв'язаного з нею структурного гена в рослині, фрагмент днк, який забезпечує специфічну для пилку експресію зв`язаного з нею структурного гена в рослині, рекомбінантна молекула днк, спосіб одержання оптимізованої для кукурудзи кодуючої послідовності інсектицидного протеїну, спосіб захисту рослин кукурудзи щонайменше від однієї комахи-шкідника |
US5527695A (en) * | 1993-01-29 | 1996-06-18 | Purdue Research Foundation | Controlled modification of eukaryotic genomes |
US5576198A (en) | 1993-12-14 | 1996-11-19 | Calgene, Inc. | Controlled expression of transgenic constructs in plant plastids |
US5545818A (en) | 1994-03-11 | 1996-08-13 | Calgene Inc. | Expression of Bacillus thuringiensis cry proteins in plant plastids |
US5545817A (en) | 1994-03-11 | 1996-08-13 | Calgene, Inc. | Enhanced expression in a plant plastid |
UA70912C2 (uk) | 1996-02-28 | 2004-11-15 | Cінгента Партісіпейшнс Аг | Молекула днк, яка кодує стійку до дії інгібітора рослинну протопорфіриногеноксидазу, спосіб одержання стійких до гербіциду рослин, спосіб боротьби з ростом небажаних рослин |
GB9720148D0 (en) * | 1997-09-22 | 1997-11-26 | Innes John Centre Innov Ltd | Gene silencing materials and methods |
-
1999
- 1999-05-24 AR ARP990102457A patent/AR020078A1/es active IP Right Grant
- 1999-05-25 WO PCT/EP1999/003608 patent/WO1999061631A1/en active IP Right Grant
- 1999-05-25 CN CN200710180835XA patent/CN101173298B/zh not_active Expired - Fee Related
- 1999-05-25 AT AT99926414T patent/ATE292182T1/de active
- 1999-05-25 BR BR9910729-5A patent/BR9910729A/pt not_active Application Discontinuation
- 1999-05-25 EP EP99926414A patent/EP1080208B1/en not_active Revoked
- 1999-05-25 AU AU43683/99A patent/AU751409B2/en not_active Expired
- 1999-05-25 JP JP2000551014A patent/JP2002516112A/ja active Pending
- 1999-05-25 ES ES99926414T patent/ES2237107T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1999-05-25 IL IL13937499A patent/IL139374A0/xx active IP Right Grant
- 1999-05-25 PL PL99344312A patent/PL344312A1/xx not_active Application Discontinuation
- 1999-05-25 HU HU0102103A patent/HUP0102103A3/hu unknown
- 1999-05-25 TR TR2000/03481T patent/TR200003481T2/xx unknown
- 1999-05-25 DK DK04030122.8T patent/DK1516931T3/da active
- 1999-05-25 EP EP04030122A patent/EP1516931B1/en not_active Revoked
- 1999-05-25 DE DE69924484T patent/DE69924484T2/de not_active Revoked
- 1999-05-25 CA CA2328058A patent/CA2328058C/en not_active Expired - Fee Related
- 1999-05-25 PT PT04030122T patent/PT1516931E/pt unknown
- 1999-05-25 KR KR1020007013263A patent/KR20010071315A/ko not_active Application Discontinuation
- 1999-05-25 DK DK99926414T patent/DK1080208T3/da active
- 1999-05-25 AT AT04030122T patent/ATE528400T1/de active
- 1999-05-25 ES ES04030122T patent/ES2374521T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1999-05-25 CN CN99807888A patent/CN1307641A/zh active Pending
-
2000
- 2000-10-30 IL IL139374A patent/IL139374A/en not_active IP Right Cessation
- 2000-11-14 ZA ZA200006594A patent/ZA200006594B/xx unknown
- 2000-11-24 MX MXPA00011583 patent/MXPA00011583A/es unknown
-
2001
- 2001-08-16 HK HK01105777A patent/HK1034999A1/xx not_active IP Right Cessation
-
2009
- 2009-06-23 JP JP2009148820A patent/JP2009261403A/ja active Pending
-
2012
- 2012-01-11 CY CY20121100020T patent/CY1112420T1/el unknown
Patent Citations (9)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO1995009920A1 (en) * | 1993-10-06 | 1995-04-13 | Sandoz Ltd. | Virus resistant or tolerant cells |
WO1998053083A1 (en) * | 1997-05-21 | 1998-11-26 | Zeneca Limited | Gene silencing |
JP2001525680A (ja) * | 1997-05-21 | 2001-12-11 | ゼネカ リミテッド | 遺伝子のサイレンシング |
WO1999032619A1 (en) * | 1997-12-23 | 1999-07-01 | The Carnegie Institution Of Washington | Genetic inhibition by double-stranded rna |
JP2002516062A (ja) * | 1997-12-23 | 2002-06-04 | ザ カーネギー インスチチューション オブ ワシントン | 二本鎖rnaによる遺伝子阻害 |
WO1999049029A1 (en) * | 1998-03-20 | 1999-09-30 | Benitec Australia Ltd | Control of gene expression |
JP2002507416A (ja) * | 1998-03-20 | 2002-03-12 | ベニテック オーストラリア リミティッド | 遺伝子発現の制御 |
WO1999053050A1 (en) * | 1998-04-08 | 1999-10-21 | Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation | Methods and means for obtaining modified phenotypes |
JP2002511258A (ja) * | 1998-04-08 | 2002-04-16 | コモンウェルス サイエンティフィック アンド インダストリアル リサーチ オーガニゼーション | 改良表現型を得るための方法及び手段 |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP2323133A2 (en) | 2009-11-16 | 2011-05-18 | Sony Corporation | Disc cartridge |
Also Published As
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
EP1080208B1 (en) | Dsrna-mediated regulation of gene expression in plants | |
EP1801215B1 (en) | Regulation of viral gene expression | |
EP2811024B1 (en) | Plant expression vector | |
US7030294B2 (en) | Expression of trehalose 6-phosphate synthase and trehalose 6-phosphate phosphatase in plant plastids | |
US20020192813A1 (en) | Plant expression vectors | |
JP2002512775A (ja) | Mloタンパク質をコードし、植物に真菌耐性を付与する遺伝子 | |
JP2005514920A (ja) | 植物根における遺伝子発現調節のためのプロモーター | |
US20060143737A1 (en) | Method of controlling gene silencing using site specific recombination | |
US7019195B1 (en) | Method for conferring resistance or tolerance aganist furovirus, potyvirus, tospovirus, and cucomovirus to plant cells | |
WO2000078799A2 (en) | Mlo-genes controlling diseases | |
JP2000511427A (ja) | 線虫誘導性植物遺伝子プロモーター | |
MXPA00009108A (en) | Genes controlling diseases | |
MXPA00008809A (en) | Expression of trehalose biosynthetic genes in plants |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20090825 |
|
A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20091117 |
|
A602 | Written permission of extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602 Effective date: 20091120 |
|
A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20100121 |
|
A602 | Written permission of extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602 Effective date: 20100126 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20100225 |
|
A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20110208 |