PT1516931E - Regulação mediada por dsarn de expressão de genes em plantas - Google Patents

Description

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DESCRIÇÃO

"REGULAÇÃO DA EXPRESSÃO GENICA EM PLANTAS MEDIADA POR dsARN" A presente invenção refere-se a métodos de alteração da expressão de genes em plantas, em particular utilizando fragmentos de ARN senso e antissenso dos ditos genes, e a plantas com expressão génica alterada obtidas utilizando os métodos da presente invenção.

Desenvolvimentos nas técnicas de biologia molecular e transformação vegetal têm permitido a produção de plantas transgénicas com diversas caracteristicas desejáveis, tais como, por exemplo, resistência a insectos e patogénios fúngicos ou microbianos, tolerância a herbicidas ou caracteristicas de valor acrescentado. Estas caracteristicas desejáveis são obtidas principalmente por meio da sobre-expressão de um transgene na planta. No entanto, em alguns casos, também é desejável modificar as plantas de modo a que a expressão de um gene particular seja alterada para criar plantas com fenótipos desejados ou com propriedades de interesse comercial. Os actuais métodos para alterar a expressão de um gene baseiam-se principalmente em técnicas de supressão senso ou antissenso. Por exemplo, a supressão senso de um gene chalcona sintase em Petúnias tem como resultado flores com pigmentação alterada e a supressão antissenso de um gene poligalacturonidase em tomates tem como resultado uma maturação retardada do fruto. Infelizmente, estes métodos são com frequência variáveis e imprevisíveis na sua capacidade de alterar a expressão do gene e, em muitos casos, uma completa disrupção da actividade génica particular não é alcançada. Outros métodos para alterar a expressão génica incluem a utilização de ribonucleótidos catalíticos ou ribozimas, que podem ser tecnicamente 2 desafiantes ou a disrupção génica homóloga, que, embora seja a mais desejada geneticamente, infelizmente não é o suficientemente eficaz com as técnicas disponíveis actualmente para ser utilizada de forma rotineira para tais propósitos. Existe portanto um grande sentimento de necessidade não preenchida de métodos novos que permitam uma alteração eficaz e previsível da expressão de um gene em células vegetais para obter plantas com propriedades melhoradas e comercialmente importantes. 0 documento EP0458367A1 descreve estudos de prova de conceito de supressão de gene mediada por antissenso. Especificamente, o gene aroA da bactéria Salmonella typhimurium foi utilizado como um gene exógeno alvo expresso em plantas. Redução na expressão do gene exógeno alvo aroA foi demonstrada após a expressão da sequência alvo como um ARN alvo senso positivo (ARN senso) , que foi então neutralizado pelo correspondente ARN senso negativo (sequência aroA antissenso).

Fire, A. et al (Nature, 1998, Vol. 391, pp 806-811) descrevem a expressão reduzida de um gene alvo em vermes nematoides após a micro-injecção de um ARN de cadeia dupla correspondente ao gene alvo. A espécie de ARN foi fabricada in vitro antes da injecção no verme.

Wassenegger, M. e Pelissier, T. (Plant Molecular Biology, 1998, Vol. 37, pp349-362) descrevem várias teorias de supressão de genes em plantas. Em particular propõe-se um mecanismo unificado que explica anteriores observações de supressão de genes. No mecanismo unificado, uma polimerase de ARN dependente de ARN cria uma espécie de ARN antissenso curta a partir de um molde de ARN senso. Estas espécies de ARN antissenso vão então mediar a supressão do gene alvo.

Ambos os documentos WO 99/32619 e WO 99/49029 são relevantes para os propósitos de novidade somente sob Artigo 54(3) EPC. 3 0 documento WO 99/32619 descreve a expressão reduzida de um gene alvo utilizando ARN de cadeia dupla desenhado especificamente correspondente ao gene alvo. 0 documento WO 99/49029 descreve um método de modulação da expressão de um gene alvo utilizando uma ou mais moléculas de ácido nucleico dispersas ou moléculas de ácido nucleico exógenas que são introduzidas numa célula, tecido ou órgão. As moléculas introduzidas compreendem cópias múltiplas de uma sequência de nucleótidos que é substancialmente idêntica à sequência de nucleótidos do dito gene alvo ou uma região da mesma durante um tempo e sob condições suficientes para tradução do produto ARNm do dito gene alvo a ser modificado. Alternativamente, as cópias múltiplas são complementares em sequência à sequência de nucleótidos do gene alvo. Os métodos estão submetidos à condição de que a transcrição do dito produto ARNm não é exclusivamente reprimida ou reduzida. A presente invenção refere-se à produção de plantas com propriedades e caracteristicas melhoradas utilizando técnicas moleculares e transformação génica. Em particular, a invenção refere-se aos métodos de alteração da expressão de um gene numa célula vegetal utilizando fragmentos de ARN senso e antissenso do gene. De modo importante, tais fragmentos de ARN senso e antissenso são capazes de formar uma molécula de ARN de cadeia dupla. A invenção também se refere a células vegetais obtidas utilizando tais métodos, a plantas derivadas de tais células, à progénie de tais plantas e a sementes derivadas de tais plantas. Em tais células vegetais ou plantas, a alteração da expressão génica de um gene particular é mais eficaz, selectiva e mais previsível que a alteração da expressão génica de um gene particular obtida utilizando os métodos actuais conhecidos na técnica. A invenção refere-se portanto a: 4

Um método que compreende introduzir numa célula vegetal um fragmento de ARN senso de um gene alvo e um fragmento de ARN antissenso do dito gene alvo, em que o dito fragmento de ARN senso e o dito fragmento de ARN antissenso são capazes de formar uma molécula de ARN de cadeia dupla, em que a expressão do dito gene alvo na dita célula é alterada.

Em particular, a invenção proporciona um método para reduzir a expressão de um gene alvo numa célula vegetal que compreende introduzir numa célula vegetal uma primeira sequência de ADN capaz de expressar um fragmento de ARN senso de um gene alvo e uma segunda sequência de ADN capaz de expressar um fragmento de ARN antissenso do dito gene alvo, em que as ditas primeira e segunda sequências de ADN estão compreendidas numa molécula de ADN, em que os ditos fragmentos de ARN senso e antissenso são capazes de formar uma molécula de ARN de cadeia dupla, em que a dita molécula de ADN compreende ainda uma sequência de ADN que compreende um ligante (linker) que compreende sinais de processamento de intrões entre as ditas primeira e segunda sequências de ADN, em que a expressão do dito gene alvo na dita célula vegetal é reduzida quando os ditos fragmentos de ARN senso e antissenso são expressos a partir das ditas primeira e segunda sequências de ADN e os ditos fragmentos de ARN formam uma molécula de ARN de cadeia dupla. A invenção refere-se consequentemente a:

Um método que compreende introduzir numa célula vegetal uma primeira sequência de ADN capaz de expressar na dita célula um fragmento de ARN senso de um gene alvo, e uma segunda sequência de ADN capaz de expressar na dita célula um fragmento de ARN antissenso do dito gene alvo, em que a dita primeira sequência de ADN e a dita segunda sequência de ADN são capazes de formar uma molécula de ARN de cadeia dupla; em que a expressão do dito gene alvo na dita célula é alterada. As sequências de ADN estão 5 compreendidas em uma molécula de ADN que é integrada preferivelmente de modo estável no genoma da dita célula vegetal. A molécula de ADN compreende ainda preferivelmente um promotor ligado operativamente à dita primeira ou à dita segunda sequência de ADN. Como foi indicado acima, a dita primeira sequência de ADN e a dita segunda sequência de ADN estão compreendidas em uma molécula de ADN. A dita primeira sequência de ADN e a segunda sequência de ADN estão compreendidas preferivelmente na mesma cadeia de ADN da dita molécula de ADN, e preferivelmente, o fragmento de ARN senso e o fragmento de ARN antissenso estão compreendidos numa molécula de ARN. A molécula de ARN é capaz de dobrar tal que os ditos fragmentos de ARN compreendidos na mesma formam uma região de cadeia dupla. Em outra forma de realização preferida, o fragmento de ARN senso e o fragmento de ARN antissenso estão compreendidos em ou expressos como duas moléculas de ARN. Neste caso, a primeira sequência de ADN e a segunda sequência de ADN são ligadas operativamente preferivelmente a um promotor bidireccional ou, alternativamente, a primeira sequência de ADN é ligada operativamente a um primeiro promotor e a segunda sequência de ADN é ligada operativamente a um segundo promotor, em que o primeiro promotor e o segundo promotor são o mesmo promotor ou promotores diferentes. Em outra forma de realização preferida, a primeira sequência de ADN e a segunda sequência de ADN estão compreendidas em cadeias complementares da dita molécula de ADN. Em ainda outra forma de realização preferida, a molécula de ADN compreende ainda um primeiro promotor ligado operativamente à dita primeira sequência de ADN e um segundo promotor ligado operativamente à dita segunda sequência de ADN, em que o primeiro promotor e o segundo promotor compreendem o mesmo promotor ou compreendem promotores diferentes. Em outra forma de realização preferida, o gene alvo é um gene nativo da dita célula vegetal, preferivelmente um gene 6 essencial da dita célula vegetal. Em ainda outra forma de realização preferida, um promotor na molécula de ADN compreende o promotor nativo do dito gene alvo nativo. Numa forma de realização preferida adicional, o promotor é um promotor heterólogo, por exemplo um promotor específico de tecido, um promotor regulado durante o desenvolvimento, um promotor constitutivo ou um promotor induzível. Opcionalmente, o promotor é um promotor divergente capaz de iniciar a transcrição de sequências de ADN em cada lado do promotor. Em outra forma de realização preferida, o gene é um gene heterólogo na dita célula vegetal, preferivelmente integrado de modo estável no genoma da dita célula vegetal ou, alternativamente, presente na dita célula vegetal como uma molécula extracromossómica. A sequência de ADN compreende ainda um ligante entre as sequências de ADN que codificam os ditos fragmentos de ARN senso e antissenso. 0 ligante compreende sequências reguladoras, em que as ditas sequências reguladoras compreendem sinais de processamento de intrões. A invenção também proporciona além disso:

Uma célula vegetal que compreende os fragmentos de ARN senso e antissenso da presente invenção, que são introduzidos numa célula vegetal via a expressão das ditas primeira e segunda sequências de ADN, como foi descrito acima; em que a expressão do dito gene alvo na dita célula vegetal é alterada pelos ditos fragmentos de ARN, uma planta e a progénie da mesma derivada da célula vegetal e sementes derivadas da planta. A invenção também proporciona além disso:

Uma célula vegetal obtida por meio de um método da presente invenção.

Em particular, a invenção proporciona uma célula vegetal que compreende uma primeira sequência de ADN capaz de expressar um fragmento de ARN senso de um gene alvo e uma segunda sequência de ADN capaz de expressar um 7 fragmento de ARN antissenso do dito gene alvo, em que os ditos fragmentos de ARN senso e antissenso são capazes de formar uma molécula de ARN de cadeia dupla, em que as ditas primeira e segunda sequências de ADN estão compreendidas numa molécula de ADN que é integrada de modo estável no genoma da dita célula vegetal, em que a dita célula vegetal compreende ainda uma sequência de ADN que compreende um ligante que compreende sinais de processamento de intrões entre a dita primeira sequência de ADN e a dita segunda sequência de ADN, em que a expressão do dito gene alvo na dita célula vegetal é reduzida quando os ditos fragmentos de ARN senso e antissenso são expressos a partir das ditas primeira e segunda sequências de ADN e os ditos fragmentos de ARN formam uma molécula de ARN de cadeia dupla. A invenção também proporciona uma planta que compreende a célula vegetal mencionada anteriormente, e a invenção também proporciona a progénie da planta mencionada anteriormente em que a dita progénie compreende a célula vegetal mencionada anteriormente.

Uma molécula de "ARN de cadeia dupla (dsARN)" compreende um fragmento de ARN senso de um gene alvo e um fragmento de ARN antissenso do mesmo gene alvo, ambos os quais compreendem sequências de nucleótidos complementares entre si, permitindo desse modo que os fragmentos de ARN senso e antissenso se emparelhem e formem uma molécula de ARN de cadeia dupla. "Complementar" refere-se a duas sequências de nucleótidos que compreendem sequências de nucleótidos antiparalelas capazes de emparelhar-se entre si após a formação de ligações de hidrogénio entre os resíduos de bases complementares nas sequências de nucleótidos antiparalelas. "Antiparalela" refere-se no presente documento a duas sequências de nucleótidos emparelhadas através de ligações de hidrogénio entre os resíduos de bases complementares com numa ligações fosfodiéster que vão na direcção 5'-3' sequência de nucleótidos e na direcção 3'-5' na outra sequência de nucleótidos.

Um "gene alvo" é qualquer gene numa célula vegetal. Por exemplo, um gene alvo é um gene de função conhecida ou é um gene cuja função é desconhecida, mas cuja sequência de nucleótidos total ou parcial é conhecida. Alternativamente, a função de um gene alvo e a sua sequência de nucleótidos são ambas desconhecidas. Um gene alvo é um gene nativo da célula vegetal ou é um gene heterólogo que tinha sido previamente introduzido na célula vegetal ou numa célula parental da dita célula vegetal, por exemplo por meio de transformação génica. Um gene alvo heterólogo está integrado de modo estável no genoma da célula vegetal ou está presente na célula vegetal como uma molécula extracromossómica, por exemplo, como uma molécula extracromossómica autonomamente replicativa.

Um gene "nativo" refere-se a um gene que está presente no genoma da célula vegetal sem transformar.

Um gene "essencial" é um gene que codifica uma proteína tal como por exemplo uma enzima biosintética, um receptor, uma proteína de transdução de sinais, um produto génico estrutural, ou uma proteína de transporte que é essencial para o crescimento ou sobrevivência da planta. "Alterar" a expressão de um gene alvo numa célula vegetal significa que o nível de expressão do gene alvo numa célula vegetal depois de aplicar um método da presente invenção é diferente da sua expressão na célula antes de aplicar o método. Alterar a expressão génica significa preferivelmente que a expressão do gene alvo na planta está reduzida, preferivelmente muito reduzida, mais preferivelmente a expressão do gene não é detectável. A alteração da expressão de um gene essencial pode ter como resultado um fenótipo mutante de silenciamento em células vegetais ou plantas derivadas das mesmas. 9 "Isolado" é, no contexto da presente invenção, uma molécula de ácido nucleico isolada que, pela acção do homem, existe fora do seu ambiente nativo e não é portanto um produto da natureza. Uma molécula de ácido nucleico isolada pode existir na forma purificada ou pode existir num ambiente não nativo tal como, por exemplo, uma célula hospedeira transgénica. "Cassete de Expressão" como é utilizado no presente documento significa uma sequência de ADN capaz de direccionar a expressão de uma sequência de nucleótidos particular numa célula hospedeira apropriada, que compreende um promotor ligado operativamente à sequência de nucleótidos de interesse que está ligada operativamente a sinais de terminação. Também compreende tipicamente sequências requeridas para a própria tradução da sequência de nucleótidos. A região codificante geralmente codifica uma proteina de interesse, mas pode também codificar um ARN funcional de interesse, por exemplo ARN antissenso ou um ARN não traduzido, na direcção senso ou antissenso. A cassete de expressão que compreende a sequência de nucleótidos de interesse pode ser quimérica, o que significa que pelo menos um dos seus componentes é heterólogo com respeito a pelo menos um dos seus outros componentes. A cassete de expressão pode ser também uma que seja de ocorrência natural, mas que tinha sido obtida numa forma recombinante útil para a expressão heteróloga. Tipicamente, no entanto, a cassete de expressão é heteróloga com respeito ao hospedeiro, isto é, a sequência de ADN particular da cassete de expressão não é de ocorrência natural na célula hospedeira e deve ter sido introduzida na célula hospedeira ou num ascendente da célula hospedeira por meio de um evento de transformação. A expressão da sequência de nucleótidos na cassete de expressão pode estar sob o controlo de um promotor constitutivo ou de um promotor induzivel que inicia uma 10 transcrição somente quando a célula hospedeira está exposta a alguns estímulos particulares externos. No caso de um organismo multicelular, tal como uma planta, o promotor pode ser também específico a um tecido ou um órgão ou um estágio de desenvolvimento particulares. "Heterólogo" como é utilizado no presente documento significa "de origem natural diferente" ou representa um estado não natural. Por exemplo, se uma célula hospedeira é transformada com uma sequência de ácido nucleico derivada de outro organismo, particularmente de outra espécie, essa sequência de ácido nucleico é heteróloga com respeito a essa célula hospedeira e também com respeito aos descendentes da célula hospedeira que portam essa sequência de ácido nucleico. De maneira similar, heterólogo refere-se a uma sequência de nucleótidos derivada de e inserida no mesmo tipo celular natural, original, mas que está presente num estado não natural, por exemplo um número de cópia diferente, ou sob o controlo de elementos reguladores diferentes.

No sentido mais amplo, o termo "substancialmente similar", quando se utiliza no presente documento com respeito a uma sequência de nucleótidos, significa uma sequência de nucleótidos correspondente a uma sequência de nucleótidos de referência, em que a sequência correspondente codifica um polipéptido que tem substancialmente a mesma estrutura e função que o polipéptido codificado pela sequência de nucleótidos de referência, por exemplo em que somente ocorrem mudanças em aminoácidos que não afectam a função do polipéptido. De modo desejável a sequência de nucleótidos substancialmente similar codifica o polipéptido codificado pela sequência de nucleótidos de referência. A percentagem de identidade entre a sequência de nucleótidos substancialmente similar e a sequência de nucleótidos de referência (número de bases complementares na sequência complementar dividido pelo 11 número total de bases na sequência complementar) é, de modo desejável, pelo menos de 80%, mais desejável de 85%, preferivelmente pelo menos de 90%, mais preferivelmente pelo menos de 95% e ainda mais preferível de pelo menos 99%.

Os "elementos reguladores" referem-se às sequências envolvidas em conferir a expressão de uma sequência de nucleótidos. Os elementos reguladores compreendem um promotor ligado operativamente à sequência de nucleótidos de interesse e sinais de terminação. Também abrangem tipicamente sequências requeridas para a tradução apropriada da sequência de nucleótidos.

Uma "planta" refere-se a qualquer planta ou parte de uma planta em qualquer estágio de desenvolvimento. Incluem-se também cortes, culturas de células ou de tecidos e sementes. Como é utilizado em conjunto com a presente invenção, o termo "tecido vegetal" inclui, mas não está limitado a, plantas completas, células vegetais, órgãos vegetais, sementes vegetais, protoplastos, calos, culturas celulares e quaisquer grupos de células vegetais organizados em unidades estruturais e/ou funcionais. A presente invenção refere-se a métodos para regular a expressão génica em células vegetais. Os métodos comummente disponíveis para regular a expressão de um gene em células vegetais não possuem previsibilidade e mostram variabilidade dependendo de qual gene é para ser regulado. O presente método alivia estes problemas e trata da regulação eficaz e reproduzível de um gene em células vegetais. A presente invenção utiliza um fragmento de ARN senso e um fragmento de ARN antissenso de um gene alvo para alterar a expressão do gene numa célula vegetal. A invenção proporciona assim um método para alterar a expressão de um gene alvo numa célula vegetal que compreende introduzir numa célula vegetal um fragmento de ARN senso de um gene 12 alvo e um fragmento de ARN antissenso do dito gene alvo, em que o dito fragmento de ARN senso e o dito fragmento de ARN antissenso são capazes de formar uma molécula de ARN de cadeia dupla, em que se altera a expressão do dito gene alvo na dita célula, e em que os ditos fragmentos de ARN são introduzidos nas células vegetais via a expressão das ditas primeira e segunda sequências de ADN, como foi descrito acima. Como foi indicado acima, a presente invenção refere-se a um método que compreende introduzir numa célula vegetal uma primeira sequência de ADN capaz de expressar na dita célula um fragmento de ARN senso de um gene alvo e uma segunda sequência de ADN capaz de expressar na dita célula um fragmento de ARN antissenso do dito gene alvo, em que o dito fragmento de ARN senso e o dito fragmento de ARN antissenso são capazes de formar uma molécula de ARN de cadeia dupla, em que a expressão do dito gene alvo na dita célula é alterada. Numa forma de realização preferida, a primeira sequência de ADN e a segunda sequência de ADN estão integradas de modo estável no genoma da dita célula vegetal. Em outra forma de realização preferida, a primeira sequência de ADN e a segunda sequência de ADN estão presentes numa célula vegetal numa molécula extracromossómica, por exemplo, numa molécula auto-replicante. Como foi indicado acima, as sequências de ADN estão compreendidas em uma molécula de ADN. Preferivelmente, as primeira e segunda sequências de ADN estão compreendidas na mesma cadeia de ADN da dita molécula de ADN, e preferivelmente, o fragmento de ARN senso e o fragmento de ARN antissenso estão compreendidos em ou são expressos como uma molécula de ARN codificada pela molécula de ADN. Neste caso, a molécula de ADN compreende ainda um promotor ligado operativamente à primeira ou segunda sequência de ADN, em que o promotor é capaz de transcrever as primeira e segunda sequências de ADN. 0 promotor é ligado operativamente preferivelmente à 13 sequência de ADN que codifica o fragmento antissenso que é por si mesmo ligado operativamente à sequência de ADN que codifica o fragmento senso. Alternativamente, promotor é ligado operativamente à sequência de ADN que codifica o fragmento senso que é por si mesmo ligado operativamente à sequência de ADN que codifica o fragmento antissenso. Pela utilização de uma única molécula de ARN, os dois fragmentos de ARN complementares estão em proximidade imediata tal que o se favorecem o emparelhamento e a formação de cadeia dupla. Alternativamente, quando as sequências de ADN estão compreendidas na mesma cadeia de ADN, duas moléculas de ARN separadas são produzidas, por exemplo, uma molécula de ARN que compreende um fragmento de ARN senso e uma molécula de ARN que compreende um fragmento de ARN antissenso. Neste caso, a molécula de ADN preferivelmente compreende ainda elementos reguladores capazes de expressar os fragmentos de ARN. Numa forma de realização preferida, tais elementos reguladores compreendem um promotor bidireccional divergente que é colocado entre a sequência de ADN que codifica o fragmento de ARN senso e a sequência de ADN que codifica o fragmento de ARN antissenso. Em outra forma de realização preferida, dois promotores distintos, que compreendem o mesmo promotor ou, alternativamente, promotores diferentes, são colocados entre as duas sequências de ADN. Em ainda outra forma de realização preferida, a molécula de ADN compreende um primeiro promotor ligado operativamente à primeira sequência de ADN e um segundo promotor ligado operativamente à segunda sequência de ADN, em que as sequências de ADN são colocadas entre os dois promotores e os dois promotores são capazes de direccionar a transcrição em direcções opostas. A sequência de ADN compreende ainda um ligante entre as sequências de ADN que codificam os ditos dois fragmentos de ARN complementares. 0 ligante compreende sequências 14 reguladoras, em que as ditas sequências reguladoras compreendem sinais de processamento de intrões.

Nas moléculas de ADN da presente invenção, as sequências de ADN são preferivelmente ligadas operativamente aos promotores. Numa forma de realização preferida, um promotor na molécula de ADN compreende um promotor nativo do dito gene alvo nativo a ser inactivado, com a finalidade de assegurar que o ARN de cadeia dupla esteja presente nos mesmos tecidos e ao mesmo tempo no desenvolvimento à medida que o gene alvo é expresso. Em outra forma de realização, o promotor é um promotor heterólogo, por exemplo um promotor especifico de tecido, um promotor regulado durante o desenvolvimento, um promotor constitutivo, divergente ou um promotor induzível. Em outra forma de realização preferida, o gene é um gene heterólogo na dita célula vegetal. Os sinais de terminação estão também incluídos opcionalmente nas moléculas de ADN. A molécula de ARN única ou as duas moléculas distintas de ARN são capazes de formar uma região de cadeia dupla, em que as partes complementares dos fragmentos de ARN reconhecem uma à outra, emparelham-se entre si e formam a molécula de ARN de cadeia dupla. As moléculas de ADN da presente invenção são transformadas em células vegetais utilizando métodos bem conhecidos na técnica ou descritos a seguir. Por exemplo, utiliza-se o bombardeamento com micropartículas, a micro-injecção ou a transformação mediada por Agrobacterium. Também se utiliza a transformação de protoplastos com moléculas de ADN da presente invenção utilizando electroporação ou tratamento químico (por exemplo, tratamento com PEG).

Alternativamente, utilizam-se vectores virais para introduzir moléculas de ADN da presente invenção em células vegetais, por exemplo através da assim chamada agroinfecção. Em outra forma de realização preferida, as moléculas de ADN da presente invenção são introduzidas em 15 células vegetais por meio de infiltração a vácuo ou por meio de raspagem sobre a superficie da folha. Os métodos podem ter como resultado células vegetais que compreendem fragmentos de ARN senso e antissenso da presente invenção, em que a expressão do dito gene alvo na dita célula vegetal é alterada pelos ditos fragmentos de ARN, uma planta e a progénie da mesma derivada da célula vegetal, e sementes derivadas da planta.

Na presente invenção, o tamanho da região complementar entre os fragmentos de ARN senso e antissenso compreende de modo desejável pelo menos 15 nucleótidos de comprimento, de modo mais desejável pelo menos 50 nucleótidos de comprimento, preferivelmente pelo menos 500 pb de comprimento. Preferivelmente, a região complementar é menor de 5 kb, mais preferivelmente menor de 2 kb. Opcionalmente, a região complementar entre os fragmentos de ARN senso e antissenso compreende a região codificante do gene alvo. Em outra forma de realização preferida, a região complementar compreende regiões não traduzidas (UTR) do gene alvo, por exemplo 5' UTR ou 3' UTR. Em outra forma de realização preferida, uma sequência de ADN que codifica um fragmento de ARN senso ou antissenso da presente invenção é derivada da molécula de ADNc. Em outra forma de realização, as sequências complementares compreendem elementos reguladores do gene alvo em que a expressão é alterada, tal como o promotor ou os sinais de terminação.

Em outra forma de realização preferida, a região complementar entre os fragmentos de ARN senso e antissenso é idêntica à sequência correspondente do gene cuja expressão é alterada. Em outra forma de realização preferida, a região complementar entre os fragmentos de ARN senso e antissenso é substancialmente similar à sequência correspondente do gene cuja expressão é alterada e é ainda capaz de alterar a expressão do gene. Neste caso, a região complementar é de modo desejável pelo menos 50 % idêntica à 16 sequência correspondente do gene cuja expressão é alterada de modo mais desejável pelo menos 70 % idêntica, preferivelmente pelo menos 90 % idêntica, mais preferivelmente pelo menos 95 % idêntica. Desse modo, a utilização de uma molécula de ARN única de cadeia dupla permite alterar a expressão de um gene único ou de uma pluralidade de genes, o gene único compreende sequências idênticas ao ARN de cadeia dupla ou que é substancialmente similar ao ARN de cadeia dupla.

Em outra forma de realização preferida, a região complementar entre os fragmentos de ARN senso e antissenso não contém nenhum erro de emparelhamento entre os fragmentos de ARN senso e antissenso. Em outra forma de realização preferida, a região complementar entre os fragmentos de ARN senso e antissenso compreende pelo menos um erro de emparelhamento entre os fragmentos de ARN senso e antissenso, e os dois fragmentos de ARN são ainda capazes de emparelhar-se e formar uma molécula de ARN de cadeia dupla, alterando deste modo a expressão do gene. De modo desejável, há menos de 50 % de erros de emparelhamento entre os fragmentos de ARN senso e antissenso na região complementar, de modo mais desejável menos de 30 % de erros de emparelhamento, preferivelmente menos de 20 % de erros de emparelhamento, mais preferivelmente menos de 10 % de erros de emparelhamento, ainda mais preferente menos de 5 % de erros de emparelhamento.

Um método da presente invenção é utilizado por exemplo para alterar a expressão de um gene envolvido numa via metabólica de uma célula vegetal, na resistência ou susceptibilidade de uma planta a doenças ou em diferenciação celular. Tais alterações têm como resultado plantas com caracteristicas importantes comercialmente melhorados, tais como modificações da via metabólica particular, resistência a doenças ou mudanças em diferenciação celular. Outros exemplos de genes alvo estão 17 descritos por exemplo nas patentes US N° 5.107.065, 5.283.184 e 5.034.323, incorporadas no presente documento por meio de referência. Um método da presente invenção também se utiliza para alterar a expressão de um gene com a finalidade de esclarecer a sua função. Neste caso, por exemplo, as sequências de ADN capazes de expressar fragmentos de ARN senso e antissenso do gene são introduzidas numa célula vegetal por meio de um método de transformação bem conhecido na técnica ou descrito a seguir. As sequências de ADN estão, por exemplo, integradas de forma estável no genoma da célula vegetal. A célula vegetal é em seguida examinada, por exemplo, no que se refere a mudanças fenotípicas ou metabólicas. Alternativamente, uma planta é regenerada a partir de uma célula vegetal e a planta ou a sua progénie é examinada, por exemplo, no que se refere a mudanças fenotípicas ou metabólicas. Por exemplo, descobriram-se genes essenciais que utilizam tal método e rastreiam as plantas transformadas no que se refere a por exemplo letalidade embrionária, planta no estágio de plântula ou outros fenótipos relevantes. Utiliza-se então o conhecimento da função do gene para produzir culturas com propriedades melhoradas por meio de transformação génica ou para rastrear novos compostos químicos. Em particular, os genes essenciais são bons candidatos como alvos para compostos herbicidas. As sequências de genes essenciais, são por exemplo sobre-expressas numa planta para conferir resistência à planta a um composto herbicida que inibe a função da enzima de ocorrência natural codificada pelo gene. As variantes mutadas do gene essencial são produzidas também e são rastreadas no que se refere à tolerância ao composto herbicida ou aos compostos relacionados. Tais variantes mutadas são produzidas por meio de vários métodos conhecidos na técnica. A enzima codificada pelo gene essencial também se utiliza para rastrear compostos que 18 inibem a sua função, por exemplo num rastreio de alto rendimento ín vitro. Os compostos inibidores são testadas depois no que se refere à actividade herbicida.

Um método da presente invenção também se utiliza para alterar de maneira aleatória a expressão dos genes sem conhecimento prévio da sua sequência de nucleótidos. Neste caso, uma biblioteca de fragmentos aleatórios de ARN

capazes de emparelhar-se e de formar moléculas de ARN de cadeia dupla ou uma biblioteca de sequências de ADN aleatórias que codificam fragmentos de ARN capazes de emparelhar-se e de formar uma molécula de ARN de cadeia dupla é preparada e introduzida nas células vegetais utilizando métodos bem conhecidos na técnica ou descritos a seguir. As células vegetais ou plantas transformadas são rastreadas no que se refere à uma propriedade ou fenótipo particulares. Por exemplo, genes essenciais como foram descritos anteriormente são descobertos utilizando tal rastreio. Outro exemplo de um rastreio é referente ao crescimento não impedido, ou crescimento menos impedido que as células não transformadas em diversas condições, tais como uma maior salinidade ou pressão osmótica, maior temperatura, presença de substâncias tóxicas ou

prejudiciais, por exemplo compostos herbicidas. Depois de tal rastreio, o ARN de cadeia dupla ou a molécula de ADN que codifica o ARN de cadeia dupla é recuperado e é determinada a sequência dos fragmentos de ARN complementares, permitindo assim isolar o gene cuja alteração da expressão é responsável pela propriedade ou fenótipo particulares. Tal gene é em seguida utilizado, por exemplo, para melhorar as culturas por meio de transformação génica ou para rastrear novos compostos quimicos.

Tecnologia de Transformação Vegetal

As moléculas de ADN da presente invenção são incorporadas nas células vegetais ou bacterianas utilizando 19 tecnologia de ADN recombinante convencional. Geralmente, uma molécula de ADN da presente invenção está compreendida num vector de transformação. Utiliza-se um grande número de tais sistemas de vectores conhecidos na técnica, tais como plasmideos, virus bacteriófagos e outros virus modificados. Os componentes do sistema de expressão estão também modificados, por exemplo, para aumentar a expressão de fragmentos de ARN senso e antissenso. Por exemplo, utilizam-se sequências truncadas, substituições de nucleótidos e outras modificações. Os sistemas de expressão conhecidos na técnica utilizam-se para transformar virtualmente qualquer cultura de célula vegetal em condições adequadas. Um transgene que compreende uma molécula de ADN da presente invenção é preferivelmente transformado de forma estável e integrado no genoma das células hospedeiras. Em outra forma de realização preferida, o transgene que compreende uma molécula de ADN da presente invenção está localizado num vector auto-replicativo. Os exemplos de vectores auto-replicativos são os vírus, em particular os geminivírus. As células transformadas são regeneradas preferivelmente em plantas completas.

As plantas transformadas de acordo com a presente invenção podem ser monocotiledóneas ou dicotiledóneas e incluem, mas não são limitadas a, milho, trigo, cevada, centeio, batata-doce, feijão, ervilha, chicória, alface, repolho, couve-flor, brócolos, nabo, rabanete, espinafre, espargo, cebola, alho, pimenta, aipo, abóbora, abóbora-menina, cânhamo, curgete, maça, pera, marmelo, melão, ameixa, cereja, pêssego, nectarina, albaricoque, morango, uva, framboesa, amora silvestre, ananás, aguacate, papaia, manga, banana, soja, tomate, sorgo, cana-de-açúcar, beterraba, girassol, semente de colza, trevo, tabaco, cenoura, algodão, alfalfa, arroz, batata, beringela, pepino, Arabldopsis, e árvores tais como coníferas e 20 árvores de folhas caducas. Uma vez que uma sequência de nucleótidos desejada tenha sido transformada numa espécie vegetal particular, pode ser propagada nessa espécie ou movida em outras variedades da mesma espécie, que incluem particularmente variedades comerciais, utilizando técnicas de cruzamento tradicionais. A. Requerimentos para a construção de cassetes de expressão vegetais

As sequências génicas previstas para a expressão em plantas transgénicas são primeiro ensambladas em cassetes de expressão detrás de um promotor adequado que pode ser expresso em plantas. As cassetes de expressão podem compreender também quaisquer sequências adicionais requeridas ou seleccionadas para a expressão do transgene. Tais sequências incluem, por exemplo, mas não são limitadas a, terminadores da transcrição, sequências externas para potenciar a expressão tal como intrões, sequências vitais e sequências previstas para direccionar o produto génico a organitos específicos e compartimentos celulares. Estas cassetes de expressão podem ser em seguida facilmente transferidas aos vectores de transformação vegetal descritos infra. O seguinte é uma descrição de diversos componentes de cassetes de expressão típicos. 1. Promotores A selecção do promotor utilizado nas cassetes de expressão determina o padrão de expressão espacial e temporal do transgene na planta transgénica. Os promotores seleccionados expressam transgenes em tipos celulares específicos (tais como células epidérmicas da folha, células mesofílicas, células do córtex da raiz) ou em tecidos ou órgãos específicos (por exemplo, raízes, folhas ou flores) e a selecção reflecte a localização desejada da acumulação do produto génico. Alternativamente, o promotor seleccionado dirige a expressão do gene em diversas condições de indução. Os promotores variam em sua força, 21 isto é, sua capacidade para promover a transcrição. Dependendo do sistema celular hospedeiro utilizado, utiliza-se qualquer um de entre um número de promotores adequados conhecidos na técnica. Por exemplo, para a expressão constitutiva, utiliza-se o promotor CaMV 35S, o promotor de actina do arroz, ou o promotor de ubiquitina. Por exemplo, para a expressão regulável, utiliza-se o promotor quimicamente induzivel PR-1 do tabaco ou Arabidopse (veja-se, por exemplo, a Patente US N° 5.689.044) .

Uma categoria preferida de promotores é aquela que é induzida por feridas. Numerosos promotores foram descritos como que estão expressos em lugares de feridas. Os promotores preferidos deste tipo incluem aqueles descritos por Stanford et al Mol. Gene. Genet. 215: 200-208 (1989), Xu et al Plant Molec. Biol. 22: 573-588 (1993), Logemann e outros Plant Cell J_: 151-158 (1989), Rohrmeier & Lehle, Plant Molec. Biol. 22: 783-792 (1993), Firek et al Plant Molec. Biol. 22: 129-142 (1993), e Warner et al Plant J 3: 191-201 (1993) .

Os padrões de expressão especifica de tecido preferidos incluem especifico de tecido verde, especifico de raiz, especifico de caule e especifico de flor. Os promotores adequados para a sua expressão em tecido verde incluem muitos que regulam genes envolvidos na fotossintese, e muitos destes foram clonados tanto em monocotiledóneas como dicotiledóneas. Um promotor preferido é o promotor PEPC do milho do gene fosfoenolcarboxilase (Hudspeth & Gruia, Plant Molec. Biol. 12: 579-589 (1989)). Um promotor preferido para a expressão especifica de raiz é o descrito por de Framond (EEBS 290: 103-106 (1991); 0 documento EP 0 452 269 e um promotor especifico de raiz preferido adicional é o do gene T-l proporcionado por esta invenção. Um promotor especifico de caule preferido é 22 aquele descrito na Patente US N° 5.625.136 e que dirige a expressão do gene trpA do milho.

As formas de realização preferidas da invenção são plantas transgénicas que expressam sequências de nucleótidos numa forma especifica de raiz. Formas de realização preferidas adicionais são plantas transgénicas que expressam a sequência de nucleótidos numa maneira induzivel por feridas ou induzivel por infecção de patogénios. 2. Terminadores transcripcionais

Uma variedade de terminadores transcripcionais estão disponíveis para a utilização em cassetes de expressão. Estes são responsáveis pela terminação da transcrição além do transgene e de sua correcta poliadenilação. Os terminadores transcripcionais apropriados são aqueles que se sabe que funcionam em plantas e incluem o terminador CaMV 35S, o terminador tml, o terminador nopalina sintase e o terminador rbcS E9 da ervilha. Estes utilizam-se tanto nas plantas monocotiledóneas como dicotiledóneas. 3. Sequências para o potenciamiento da regulação da expressão

Foram encontradas numerosas sequências que potenciam a expressão génica desde dentro da unidade transcripcional e estas sequências podem ser utilizadas em conjunto com os genes desta invenção para aumentar a sua expressão em plantas transgénicas. Por exemplo, diversas sequências intrónicas tais como intrões do gene Adhl do milho foi demonstrado que potenciam a expressão, particularmente em células monocotiledóneas. Além disso, um número de sequências lider não traduzidas derivadas de virus são também conhecidas que potenciam a expressão, e estas são particularmente eficazes em células dicotiledóneas. 4. Optimização da sequência codificante A sequência codificante do gene seleccionado pode ser manipulada por meio de ingenieria génica alterando a 23 sequência codificante para a expressão óptima nas especies de interesse em cultura. Os métodos para modificar as sequências codificantes para conseguir uma expressão óptima numa espécie em cultura particular são bem conhecidos (veja-se, por exemplo, Perlak e outros, Proc. Nati. Acad. Sei. USA 88: 3324 (1991); e Koziel e outros, Bio/technol. 11: 194 (1993)) .

Em outra forma de realização preferida, uma molécula de ADN da presente invenção é transformada directamente no ge- noma cloroplástico. A tecnologia de transformação cloroplástica é descrita extensamente nos documentos de patentes US Nos. 5.451.513, 5.545.817 e 5.545.818, na solicitud de patente N° . WO 95/16783, e em McBride e outros (1994) Proc. Nati. Acad. Sei. USA 91. 7301-7305. A técnica básica para a transformação cloro- plástica implica introduzir regiões de ADN cloroplástico clonado flanqueando um marcador seleccionable junto com o gene de interesse num tecido alvo adequado, por exemplo, utilizando biolistica ou transformação protoplástica (por exemplo, cloruro cálcico ou transformação mediada por PEG). As regiões flanqueantes de 1 a 1,5 kb, chamadas sequências alvo, facilitan a recombinação homóloga com o genoma plástico e permiten assim a substituição ou modificação das regiões especificas do plastoma. Inicialmente, mutações puntuais no rARN 16S cloroplástico e genes rpsl2 que confieren resistência à espectomicina e/ou estreptomicina se utilizan como marcadores seleccionables para transformação (Svab, Z., Hajdukiewicz, P, e Maliga, P. (1990) Proc. Nati. Acad. Sei. USA 87, 8526-8530; Staub, J. M., e Maliga, P. (1992) Plant Cell 4. 39-45) . A presença de lugares de clonagem entre estas marcadores permitieron a creação de um vector dirigido a plastos para a introducção de moléculas extranas de ADN (Staub, J.M., e Maliga, P. (1993) EMBO J. 12. 601-606). Aumentos sustanciais na frequência de transformação são obtidos por meio de reemplazo do rARN recesivo ou de genes de resistência ao antibiótico r-proteina com um marcador seleccionable dominante, o gene bacteriano aadA que codifica a enzima detoxificadora de espectinomicina, a aminoglicósido-3'- adeniltransferasa (Svab, Z., e Maliga P. (1993) Proc. Nati. Acad. Sei USA 90, 913-917). Previamente, este marcador tinha sido utilizado com êxito para a transformação de alta frequência do genoma plástico do alga verde Chlamydomo- nas reinhardtii (Goldschmidt-Clermont, M. (1991) Nucl. Acids Res. 19: 4083-4089). Outros marcadores seleccionables útiles para a transformação plástica são conhecidos na técnica e estão abarcados dentro do alcance da invenção. A expressão plástica, em que os genes são introduzidas por meio de recombinação homóloga em vários miles de cópias do genoma plástico circular presente em cada célula vegetal. Numa forma de realização preferida, um ADN da presente invenção é inserido num vector dirigido hacia os plastos e é transformado no genoma plástico do hospedeiro vegetal desejado. Se obtienen plantas homoplásmicas para genomas plásticos que contienen a molécula de ADN da presente invenção e são preferivelmente capazes de uma alta expressão da molécula de ADN. Preferivelmente, os fragmentos de ARN senso e antissenso codificados por a molécula de ADN são capazes de emparejar e de formar moléculas de ARN de cadeia dupla em plastos vegetais para alterar a expressão de genes plásticos. Numa forma de realização preferida, os fragmentos senso e antissenso não compreendem nenhum erro de emparelhamento na região complementar. Em outra forma de realização preferida, os fragmentos senso e antissenso compreendem pelo menos um erro de emparelhamento na região complementar. Neste caso, as sequências de ADN na molécula de ADN que codificam os fragmentos de ARN não são capazes de recombinar entre si. B. Construção de vectores de transformação de planta 25

Numerosos vectores de transformação disponíveis para a transformação vegetal são conhecidos por aqueles com conhecimento ordinário nas técnicas de transformação vegetal, e os genes pertinentes a esta invenção podem ser utilizados em conjunto com qualquer de tais vectores. A selecção de vectores depende da técnica de transformação preferida e as espécies alvo para a transformação. Para certas espécies alvo, preferem-se diferentes marcadores de selecção de antibióticos ou herbicidas. Os marcadores de selecção utilizados rotineiramente em transformação incluem o gene nptll, que confere resistência à kanamicina e antibióticos relacionados (Messing & Vierra. Gene J_9: 259-268 (1982); Bevan et al, Nature 304:184-187 (1983)), o gene bar, que confere resistência ao herbicida fosfinotricina (White et al, Nucl. Acids Res _18: 1062 (1990), Spencer et al Theor. Appl. Genet 79: 625-631 (1990)), o gene hph, que confere resistência ao antibiótico higromicina (Blochinger & Diggelmann, Mol Cell Biol 4: 2929-2931), o gene manA, que permite a selecção positiva em presença de manose (Miles e Guest (1984) Gene, 32: 41-48; Patente US No. 5.767.378), e o gene dhfr, que confere resistência ao metotrexato (Bourouis et al, EMBO J. 2(7): 1099-1104 (1983)), e o gene EPSPS, que confere resistência ao glifosato (documentos de patentes US Nos. 4.940.935 e 5.188.642). 1. Vectores adequados para a transformação por

Agrobacterium

Muitos vectores estão disponíveis para transformação utilizando Agrobacterium tumefaciens. Estes levam tipicamente pelo menos uma sequência de extremidade do T-ADN e incluem vectores tais como pBIN19 (Bevan, Nucl. Acids Res. (1984). Os vectores típicos adequados para a transformação de Agrobacterium incluem os vectores binários pCIB200 e pCIB2001, assim como o vector binário pCIBlO e os derivados do mesmo de selecção por higromicina (Veja-se, por exemplo, a Patente US No. 5.639.949). 26 2. Vectores adequados para transformação sem a utilização de Agrobacterium A transformação sem a utilização de Agrobacterium tumefaciens evita o requerimento das sequências T-ADN no vector de transformação escolhido e por conseguinte os vectores que não possuem estas sequências são utilizados adicionalmente a vectores tais como os descritos anteriormente que contêm sequências de T-ADN. As técnicas de transformação que não se baseiam na utilização de Agrobacterium incluem a transformação via bombardeamento de partículas, captação de protoplastos (por exemplo, PEG e electroporação) e micro-injecção. A escolha do vector depende em grande medida da selecção preferida para a espécie a ser transformada. Os vectores típicos adequados para a transformação sem a utilização de Agrobacterium incluem pCIB3064, pS0G19, e pSOG35. (Veja-se, por exemplo, a Patente US No. 5.639.949). 3. Técnicas de transformação

Uma vez que a sequência de ADN de interesse é clonada num sistema de expressão, é transformada numa célula vegetal. Os métodos para a transformação e regeneração de plantas são bem conhecidos na técnica. Por exemplo, os vectores de plasmídeo Ti foram utilizados para a distribuição de ADN exógeno, assim como para a captação directa de ADN, lipossomas, electroporação, micro-injecção, e microprojécteis. Além disso, as bactérias do género Agrobacterium podem ser utilizadas para transformar células vegetais. As técnicas de transformação para dicotiledóneas são bem conhecidas na técnica e incluem técnicas com base em Agrobacterium e técnicas que não requerem Agrobacterium. As técnicas que não requerem Agrobacterium envolvem a captação do material genético exógeno directamente pelos protoplastos ou as células. Isto se consegue por meio de captação mediada por PEG ou electroporação, distribuição mediada por bombardeamento de 27 partículas, ou micro-in jecção. Em cada caso as células transformadas são regeneradas para dar plantas completas utilizando técnicas padrão conhecidas na técnica. A transformação da maioria das espécies monocotiledóneas se tornou agora também em rotina. As técnicas preferidas incluem a transferência génica directa em protoplastos utilizando técnicas de PEG ou electroparação, bombardeamento de partículas em tecido caloso, assim como transformação mediada por Agrobacterium.

As plantas dos eventos de transformação são feitas crescer, propagadas e entrecruzadas para dar progénies com a característica desejada, e as sementes são obtidas com a característica desejada, utilizando processos bem conhecidos na técnica. A invenção será descrita adicionalmente por meio de referência aos seguintes exemplos detalhados. Estes exemplos são proporcionados somente com um propósito ilustrativo, e não se pretende que sejam limitativos a menos que se especifique de outra maneira.

EXEMPLOS

As técnicas de ADN recombinante e de clonagem molecular padrão utilizadas no presente documento são bem conhecidas na técnica e estão descritas por Sambrook et al, Molecular Cloning, eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (1989) e por T.J. Silhavy, M.L. Berman, e L.W. Enquist, Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1984) e por Ausubel, F.M. et al, Current Protocols in Molecular Biology, pub. por Greene Publishing Assoe, e Wiley-Interscience (1987).

Exemplo 1: Regulação da expressão de um gene luciferase

Construção de uma molécula de ADN quimérica que codifica os fragmentos de ARN luciferase senso e antissenso (construções senso/antissenso) 28

Um fragmento de 738 pb orientado "senso" do gene luciferase de pirilampos a partir do plasmideo pLuc+ (Promega) é amplificado a partir do ADN de plasmideo pPH108 utilizando iniciadores de oligonucleotideo ds_Lucl (5'-CGC GGA TCC TGG AAG ACG CCA AAA ACA-3' , SEQ ID No: 1; lugar de restrição BamHI sublinhado) e ds_Luc2 (5'- CGG AAG CTT AGG CTC GCC TAA TCG CAG TAT CCG GAA TG-3', SEQ ID No: 2; lugar de restrição HindIII sublinhado). A ADN polimerase termoestável turboPfu (Stratagene) utiliza-se em reacções de 50 μΐ de acordo com o protocolo dos fabricantes com cinco ciclos de 95 °C / 1 min, 55 °C / 1,5 min, 72 °C / 2 min seguido de vinte e cinco ciclos de 95 °C / 1 min, 72 °C / 3,5 min. De maneira similar um fragmento de 737 pb orientado "antissenso" do gene luciferase de pirilampo a partir de um plasmideo pLuc+ é amplificado por PCR de um ADN de plasmideo pPH108 utilizando iniciadores de oligonucleotideo ds_Luc3 (5'-CGG TCT AGA GGA AGA CGC CAA AAA CAT A-3\ SEQ ID No: 3; lugar de restrição Xbal sublinhado) e ds_Luc2 (5'-CGG AAG CTT AGG CTC GCC TAA TCG CAG TAT CCG GAA TG-3', SEQ ID No: 4; lugar de restrição HindIII sublinhado). Os fragmentos de ADN resultantes são purificados por meio de electroforese através de um de gel Tris-acetato a 1 % feito de agarose de baixo ponto de fusão (FMC) seguido de extracção por fenol-clorofórmio de lâminas de gel cortadas que contêm os produtos de PCR. O ADN do produto senso (ds_Lucl/2) é digerido com BamHI e HindIII e o ADN do produto antissenso (ds_Luc3/2) é digerido com Xbal e HindIII de acordo com os métodos padrão (as enzimas de restrição foram obtidas de New England Biolabs). Os fragmentos de ADN de extremidades coesivas resultantes são purificados em gel como foi descrito anteriormente. Um fragmento de ADN que contém o promotor mas 1' (Velten et al (1984) EMBO J. 3: 2723- 2730) é obtido por meio de digestão do plasmideo CSA104 com EcoRI e Hincll e purificação de um fragmento de ADN de 564 pb. Este fragmento é redigerido com 29

BamHI e o sub-fragmento EcoRI- BamHI de 484 pb que contém o promotor mas 1' é isolado e purificado em gel. Com a finalidade de construir o plasmideo pPH169, o ADN do vector clonado pLitmus29 (New England Biolabs) é digerido com EcoRI e Xbal, e o fragmento isolado é ligado numa reacção de quatro direcções utilizando a ADN ligase T4 (New England Biolabs) ao fragmento EcoRI - BamHI do promotor mas 1' e aos fragmentos do gene da luciferase ds_Luc senso (BamHI -HindIII) e antissenso (HindIII - Xbal).

Com a finalidade de construir um vector binário pPH170 para transformação vegetal mediada por Agrobacterium com a construção ds_Luc 1/2/3 senso/antissenso, o ADN do plasmideo binário pSGCHCl que porta um gene de resistência a kanamicina para a selecção bacteriana e um gene de resistência a higromicina para a selecção de plantas transgénicas é digerido com EcoRI e Xbal. 0 fragmento isolado de 11,6 kb resultante do pSGCHCl é ligado numa reacção de quatro direcções utilizando a ADN ligase T4 (New England Biolabs) ao fragmento EcoRI - BamHI do promotor mas 1' e aos fragmentos do gene luciferase ds_Luc senso (BamHI - HindIII) e antissenso (HindIII - Xbal).

Transformação de Agrobacterium e infiltração a vácuo de plantas Arabidopse 0 plasmideo pPH170 é introduzido em Agrobacterium tumefaciens GV3101 por meio de electroporação e é transformado em colónias, seleccionado e amplificado. As plantas de linhas mutantes de Arabidopse thaliana de quatro a cinco semanas que expressam luciferase ou constitutivamente (promotor UBQ3 (Norris et al (1993) PMB 21: 895-906) /UBQ3 + CaMV 35S 5' UTR/luc+; pPH108) ou, de maneira induzível (promotor PR-1 de Arabidopse /luc+; pPH135, Une 6E) são infiltradas a vácuo com clones de Agrobacterium que portam o vector T-ADN binário pPH170. As plantas transformadas são co-seleccionadas em higromicina e kanamicina e feitas crescer em condições de fitotron 30 controladas para a determinação da actividade luciferase. Além disso, a actividade luciferase no fundo de pPH135-6E é avaliada 48 horas depois da indução com BTH (tratamento com BTH essencialmente como é descrito em Lawton et al Plant J. 10: 71-82). A actividade luciferase é quantificada utilizando um ensaio com base em luminiscencia em extractos tissulares após a adição do substrato luciferina. A actividade de luciferase é monitorizada também in planta utilizando um sistema de obtenção de imagem por vídeo arrefecido com OCD (Hamamatsu).

Exemplo 2: Regulação da expressão do Gene GL1 de

Arabi dopsis 0 gene GL1 codifica um factor de transcrição similar a myb que é requerido para a iniciação da formação do tricoma (pelos da folha) normal (Oppenheimer et al (1991) Cell 67: 483-493) . A eliminação da expressão precoce de GL1 no desenvolvimento tem como resultado plantas que não possuem tricomas. O fenótipo de deleção é fácil de identificar em plântulas jovens e não é letal. São construídos três vectores para a expressão constitutiva e três vectores para a expressão regulada por GAL4/C1. Os três vectores diferentes para testar cada promotor são de expressão senso ( + ) , expressão antissenso (-) e expressão de ARN senso e antissenso (+/-) de um fragmento do gene GL1. Os vectores ( + ) e (-) são controlos para comparar no que se refere a seu efeito na expressão de GL1. Em cada caso utiliza-se um fragmento 5' das bases n° 739 a n° 1781 da sequência GL1 (Número de acesso do GenBank M79448) para a construção do vector.

Expressão regulada por GAL4/C1

Os fragmentos do gene GL1 são clonados na construção de vector induzível por entrecruzamento pJG304-l como os fragmentos Ncol-Sacl. O plasmídeo pJG304 é derivado de pBSSK+. O plasmídeo pBS SK+ (Stratagene, LaJolla, CA) é linearizado com Saci, é tratado com nuclease de feijão- 31 mungo para eliminar o lugar Saci, e é religado com ligase T4 para fazer pJG201. 0 lugar de união consenso 10XGAL4/ promotor mínimo 35S CaMV / gene GUS / cassete terminador CaMV é retirado de pAT71 com Kpnl e clonado no lugar Kpnl de pJG201 para fazer pJG304. 0 plasmídeo pJG304 é digerido parcialmente com a endonuclease de restrição Asp718 para isolar um fragmento linear de tamanho completo. Este fragmento é ligado com um excesso molar do oligonucleótido de 22 bases JG-L (5'-GTA CCT CGA G TC TAG ACT CGA G-3', SEQ ID No: 5) . Utiliza-se a análise de restrição para identificar um clone com este lugar de união inserido 5' ao lugar de união ao ADN GAL4 e este plasmídeo é designado pJG3 0 4DXhol.

Os lugares Ncol e Saci são adicionados às extremidades dos fragmentos (+) e (-) sintetizando os iniciadores de PCR com os lugares de restrição apropriados às extremidades 5' terminais. 0 fragmento GL1 (+/-) é produzindo produzindo em primeiro lugar dois fragmentos: um fragmento (+) com o lugar Ncol na extremidade 5' terminal e um lugar HindIII na extremidade 3' terminal e um fragmento (-) com um lugar HindIII na extremidade 5' terminal e um lugar Saci na extremidade 3' terminal. A unidade (+/-) é produzida por meio de ligação dos fragmentos resultantes no lugar EcoRI. A unidade de expressão contém o domínio de união ao ADN GAL4, seguido da sequência TATA mínima, e o fragmento do gene GL1 orientado bem ( + ) , (-) ou ( + /-) (Guyer et al (1998) Genetics, 149: 633-639).

Expressão constitutiva

Utiliza-se o promotor mas 1' da manopina sintase de Agrobacterium (Velten et al (1984) EMBO Journal 3: 2723-2730), um relativamente forte e constitutivo em plantas dicotiledóneas. Como antes, os fragmentos ( + ), (-) , e ( + /-) de GL1 são ligados atrás do promotor 1' em pBluescript. As três cassetes de expressão diferentes são ligadas em 32 pCIB200 como fragmentos EcoRl/Sall (Uknes et al (1993) Plant Cell 5: 159-169) .

Exemplo 3: Regulação da Expressão do gene Cistationlna Beta-Liase 0 gene Cistationina Beta-Liase (CBL) codifica uma proteína que leva a cabo uma etapa na via biossintética da metionina. 0 CBL catalisa a conversão de cistationina a homocisteína (revisado em Ravanel et al (1998) Proc. Nati. Acad, Sei, USA 95: 7805-7812). A sequência de um ADNc para o gene CBL de Arabidopse tinha sido identificada (Ravanel et al (1995) Plant Mol. Biol. 29: 875-882) . O efeito da regulação da sua expressão em plantas é testada utilizando construções para a expressão de ARN senso (construção senso), expressão de ARN antissenso (construção antissenso) e expressão de ARN senso e antissenso (construção senso/antissenso). A. Construção antissenso: utiliza-se o vector

binário BASTA pJG261 que contém um fragmento do vector pJG304 DXhol com uma inserção de parte do gene CBL numa orientação antissenso (nucleótidos n° 13-1159, Número de acesso do Genbank n° L40511). pJG304/aCBL: O plasmídeo pJG304DXhol é digerido com Ncol e Saci para cortar o gene GUS. O gene GUS do pJG304DXhol é substituído com um produto de PCR de CBL digerido também com Ncol e Saci. Este produto é gerado utilizando iniciadores DG354 (5'-GAT CGA GCT CCA CGA GAA CTG TCT CCG-3 ' ; SEQ ID No: 6) e DG357 (5' -TCA GCC ATG GGA AGA CAA GTA CAT TGC-3 ' ; SEQ ID No: 7) e a biblioteca de ADNc de Arabidopse pFL61 (Minet et al (1992) Plant J. 2: 417-422) como um molde. O plasmídeo pJG304/aCBL é construído a partir do vector digerido pJG304DXhol ligado ao produto de PCR de CBL.

pJG261/aCBL: O pJG304/aCBL é cortado com Xhol para cortar a cassete que contém o lugar de união ao ADN 33 GAL4/promotor mínimo 35S /CBL antissenso / terminador de fusão CaMV. Esta cassete é ligada ao pJG261 digerido com Xhol (Guyer, et al Genetics (1998), 149: 633-639), produzindo pJG261/aCBL). B. Construção senso: igual que a construção antissenso, excepto que o fragmento CBL está na orientação oposta. Este construção contém o codão de iniciação ATG e a maioria dos ORF de CBL e serve como um controlo para a regulação da expressão do gene CBL. pJG304/sCBL: 0 plasmídeo pJG304DXhol é digerido com Ncol e Saci para cortar o gene GUS. 0 gene GUS do pJG304DXhol é substituído com um produto de PCR de CBL digerido também com Ncol e Saci. Este produto é gerado utilizando iniciadores CBL1 (5'-CTT GCC ATG GCA CGA GAA CTG TCT CCG-3'; SEQ ID No: 8) e CBL2 (5'-CAT GGA GCT CGA AGA CAA GTA CAT TGC A-3'; SEQ ID No: 9) e a biblioteca de ADNc de Arabidopse pFL61 como um molde. 0 plasmídeo pJG304/sCBL é construído a partir do vector pJG304DXhol digerido ligado ao produto de PCR de CBL. pJG261/sCBL: 0 pJG304/sCBL é cortado com Xhol para cortar a cassete que contém o lugar de união ao ADN GAL4 /promotor minimo 35S /CBL senso / terminador de fusão CaMV. Esta cassete é ligada ao pJG261 digerido com Xhol, produzindo pJG261/sCBL. C. Construção senso/antissenso: um fragmento do gene CBL (n° 13-1159) na orientação senso é inserido no lugar Sall do vector pJG304DXhoI a jusante da versão com orientação antissenso do gene CBL. Um lugar de união de aproximadamente 10 pb está presente entre as duas cópias de CBL. pJG304/dsCBL: o plasmídeo pJG304/aCBL é digerido com Saci. Um produto de PCR de CBL também digerido com Saci é inserido de modo que o gene CBL inserido 34 esteja na orientação senso. Este produto é gerado utilizando CBL2 (5'-CAT GGA GCT CGA AGA CAA GTA CAT TGC A-3 ' ; SEQ ID No: 9) e CBL3 (5'-CAT CGA GCT CCT CTG TTT AAA CCA CGA GAA CTG TCT CCG TCG C-3 ' ; SEQ ID No: 10) e a biblioteca de ADNc de Arabidopse pFL61 como um molde. A construção de plasmídeo com a orientação desejada do ADN inserido é identificada por meio da digestão com HindIII. O plasmídeo pJG304/dsCBL é construído a partir do vector pJG304/aCBL digerido ligado ao produto de PCR de CBL. SURE2 (Stratagene, LaJolla, CA) utiliza-se como hospedeiro bacteriano para estabilizar a construção. pJG261/dsCBL: pJG304/dsCBL é cortado com Xbal para cortar a cassete que contém o lugar de união ao ADN GAL4 / promotor mínimo 35S /CBL antissenso /CBL senso / terminador de fusão CaMV. Esta cassete é ligada ao pJG261 digerido com Spel, produzindo pJG261/dsCBL. XL1-BLUE MRF' (Stratagene, LaJolla, CA) utiliza-se como hospedeiro bacteriano para estabilizar parcialmente a construção. O ADN sem reordenar para esta Construção é isolado por meio de purificação em gel de agarose.

D. Produção plantas transgénicas com o lugar de união GAL4 /CaMV mínimo 35S/CBL

As três construções descritas pJG261/CBL são electrotransformadas (Laboratorios Bio-Rad, Hercules, CA) na estirpe recA" de Agrobacterium tumefaciens AGL1 (Lazo et al (1991) Bio/Technology 9: 963-967), e plantas Arabidopse (Ecotype Columbia) são transformadas por meio de infiltração (Bechtold et al, (1993) C.R. Acad. Sei. Paris, 316: 1188-1193). As sementes das plantas infiltradas são seleccionadas em meio de germinação (sais Murashige-Skoog a 4,3 g/litro, Mes a 0,5 g/litro, sacarose a 1 %, tiamina a 10 ug/litro, piridoxina a 5 ug/litro, ácido 35 nicotínico a 5 ug/litro, mioinositol a 1 mg/litro, pH 5,8) que contém Basta a 15 mg/litro.

E. Comparação da inibição de CBL utilizando um Transactivador GAL4/C1 e um lugar de união GAL4/promotor mínimo 35S

As plantas transgénicas que contêm um lugar de união GAL4/ promotor mínimo CaMV 35S /construção CBL são transplantadas ao solo e feitas crescer até sua maduração na estufa. A presença de um fragmento de CBL transgénico em cada linha é confirmado por meio de PCR. Para testar a construção antissenso, utilizam-se os iniciadores ASV1 (5'-TTT GGA GAG GAC AGA CCT GC-3'; SEQ ID No: 11) e CBL3 (5'-CAT CGA GCT CCT CTG TXT AAA CCA CGA GAA CTG TCT CCG TCG C-3'; SEQ ID No: 10) para verificar a presença de um produto de aproximadamente 1200 pb. Seis linhas transgénicas são identificadas com a construção antissenso. Para testar a construção senso, utilizam-se os iniciadores ASV2 (5'-GGA TTT TGG TTT TAG GAA TTA GAA- 3'; SEQ ID No: 12) e CBL3 (5'-CAT CGA GCT CCT CTG TTT AAA CCA CGA GAA CTG TCT CCG TCG C- 3'; SEQ ID No: 10) para verificar a presença de um produto de aproximadamente 1200 pb. Foram identificadas treze linhas transgénicas com a construção senso. Para testar a construção senso/antissenso, utilizam-se os iniciadores ASV2 (5'-GGA TTT TGG TTT TAG GAA TTA GAA-3'; SEQ ID No: 12) e CBL3 (5'-CAT CGA GCT CCT CTG TTT AAA CCA CGA GAA CTG TCT CCG TCG C-3'/ SEQ ID No: 10) para verificar a presença de um produto de aproximadamente 1200 pb. Além disso, para testar a construção senso/antissenso, utilizam-se os iniciadores ASV1 (5'-TTT GGA GAG GAC AGA CCT GC-3'; SEQ ID No: 11) e CBL3 (5'- CAT CGA GCT CCT CTG TTT AAA CCA CGA GAA CTG TCT CCG TCG C-3'; SEQ ID No: 10) para verificar a presença de um produto de 36 aproximadamente 1200 pb. Foram identificadas onze linhas transgénicas com a construção senso/ antissenso.

As flores nascidas nos transformantes primários são entrecruzadas para polinizar a partir da linha transactivadora GAL4/C1 homozigota pAT53-103 (Guyer et al, Genetics (1998) 149: 633-649). As sementes F1 são semeadas em placas sobre meio MS + sacarose a 2 % (sais Murashige-Skoog a 4,3 g/litro, Mes a 0,5 g/litro, sacarose a 2 %) . Nenhuma das linhas que compreendem a construção antissenso mostram um fenótipo anormal para a progénie F1 nas placas. Dois das treze linhas que compreendem a construção senso mostram um fenótipo débil em aproximadamente a metade da progénie F1 em cada placa. As outras onze das treze linhas que compreendem a construção senso não mostram um fenótipo anormal para a progénie F1 nas placas. Dez das onze linhas que compreendem a construção senso/antissenso mostram fenótipos que variam desde fracos a fortes em aproximadamente a metade da progénie F1 em cada placa. As plantas com um fenótipo forte não sobrevivem e têm um aumento na coloração púrpura, perdem pigmentação verde e não podem formar folhas depois de catorze dias nas placas. As plantas com fenótipos mais fracos têm algo de coloração púrpura, são de um verde mais pálido do que o normal e formam folhas mas pequenas depois de catorze dias nas placas. Assim, uma construção senso/antissenso é mais eficaz em diminuir a actividade de um gene endógeno essencial que uma construção tanto antissenso como senso. F. Regulação da expressão de CBL utilizando dois promotores O gene CBL é colocado entre dois promotores- um que produz transcrição da cadeia senso e outro que 37 produz transcrição da cadeia antissenso. Neste enfoque tanto o ARN senso como antissenso são produzidos numa célula vegetal e os dois tipos de cadeias são capazes de hibridar entre si levando à formação de moléculas de ARN de cadeia dupla. 0 ACTIN2 utiliza-se como o promotor que flanqueia ambos os lados do gene CBL. Para todas estas aproximações, existe a opção de utilizar ou não utilizar terminadores trancripcionais no lado distai dos promotores. Se for utilizado um terminador transcripcional, o transcrito começaria na extremidade 3' de um promotor, avançaria através do gene CBL numa orientação, seguiria através do segundo promotor desde a extremidade 3' até a extremidade 5', e terminaria no terminador transcripcional na extremidade 5' do segundo promotor. A utilização de um terminador transcripcional pode servir para estabilizar o ARN transcrito.

Exemplo 4: Regulação da expressão do gene luciferase Construção de uma molécula de ADN quimérica que codifica fragmentos de ARN senso e antissenso (construção senso/antissenso)

Um fragmento de 670 pb orientado "senso" do gene luciferase de pirilampo do plasmídeo pLuc+ (Promega vector pGL3, número de acesso do Genbank n° U47295) é amplificado a partir do ADN de plasmídeo pPH108 utilizando iniciadores de oligonocleotídeos ds_Lucl (5' -CGC GGA TCC AAG ATT CAA AGT GCG CTG CTG-3', SEQ ID No: 13; lugar de restrição BamHI sublinhado) e ds_Luc2 (5'-GCG AAG CTT GGC GAC GTA ATC CAC GAT CTC-3 ' , SEQ ID No: 14; lugar de restrição HindIII sublinhado). A ADN polimerase TurboPfu termoestável (Stratagene) utiliza-se em reacções de 50 μΐ de acordo com o protocolo dos fabricantes com cinco ciclos de 95 °C / 1 min, 55 °C / 1,5 min, 72 °C / 2 min seguido de vinte e cinco ciclos de 95 °C / 1 min, 72 °C / 3,5 min. De maneira 38 similar um fragmento de 669 pb orientado "antissenso" do gene luciferase de pirilampo do plasmídeo pLuc+ é amplificado por meio de PCR a partir do ADN de plasmídeo de pPHl0 8 utilizando iniciadores de oligonucleotideo ds_Luc3 (5 ' -CGG TCT AGA AAG ATT CAA AGT GCG CTG CTG-3 ' , SEQ ID No: 15; lugar de restrição Xbal sublinhado) e ds_Luc2 (5'-GCG AAG CTT GGC GAC GTA ATC CAC GAT CTC-3 ' , SEQ ID No: 16; lugar de restrição HindIII sublinhado). Os fragmentos de ADN resultantes são purificados por meio de electroforese através de um gel Tris-acetato a 1 % feito a partir de agarose de baixo ponto de fusão (FMC) seguido por uma extracção de fenol-clorofórmio das lâminas de gel cortadas que contêm os produtos de PCR. 0 ADN do produto senso (ds_Lucl/2) é digerido com BamHI e HindIII e o ADN do produto antissenso (ds_Luc3/2) é digerido com Xbal e HindIII de acordo com os métodos padrão (as enzimas de restrição foram obtidas de New England Biolabs). Os fragmentos de ADN de extremidades coesivas resultantes são purificados em gel como foram descritos anteriormente. 0 fragmento senso BamHI-HindIII e o fragmento antissenso HindIII-Xbal são em seguida clonados numa ligação de três direcções no vector de clonagem pLitmus28 (New England Biolabs) que tinha sido digerido com BamHI e Xbal. A construção resultante é denominada pAdF3. Um fragmento de ADN de 563 pb que contém a grelha de leitura aberta do gene bar (D'Halluin et al (1992) Methods in Enzymology 216:415-426) é amplificado a partir do ADN de plasmídeo CSA104 utilizando oligonucleótidos bar-1 (5'-GCG AAG CTT GAT CCA TGA GCC CAG AAC GA-3 ' , SEQ ID No: 17; lugar de restrição HindIII em negrito) e bar-2 (5'-GCC AAG CTT CCT AGA ACG CGT GAT CTC-3', SEQ ID No: 18; lugar de restrição HindIII em negrito). A ADN polimerase termoestável pfu (Stratagene) utiliza-se numa reacção de 100 μΐ de acordo com o protocolo dos fabricantes com 25 ciclos de 94 °C / 1 min, 55 °C / 1 min, 72 °C / 1 min. Seguindo uma purificação por meio de 39 extracção com fenol e precipitação com etanol, o produto de PCR bar é digerido com HindIII e purificado em gel através de um gel de agarose a 2 % como foi descrito anteriormente. 0 plasmideo pAdFl é construído por meio de ligação do fragmento de ADN HindIII bar no plasmideo pAdF3 que tinha sido digerido com HindIII. Uma das duas possíveis construções resultantes desta clonagem não direccional, o pAdFl é caracterizado pela orientação do gene bar, que é a mesma que a do fragmento "senso" do gene luciferase presente em pAdF3. Um fragmento de ADN BamHI- Sall de 1,2 kb que contêm o promotor ACT2 de Arabidopse (An et al, (1996) Plant J. 10:107-121) é cortado do pNOV1416 (construção feito por Scott Rabe; NB171 p. 122; 8-17-98) e clonado em pUC21 digerido com BamHI e Sall para gerar a construção pAct2. 0 promotor ACT2 é cortado em seguida do pAct2 por meio de digestão com BamHI e Spel.

Com a finalidade de construir o vector binário pAdF4 para transformação vegetal mediada por Agrobacterium com a construção de ARN senso/antissenso ds_Luc 1/2/3, o ADN do plasmideo binário pSGCHCl que porta um gene resistente a kanamicina para selecção bacteriana e um gene de resistência à higromicina para selecção da planta transgénica, é digerida com Spel e Saci. O fragmento isolado de 11,6 kb resultante de pSGCHCl é ligado numa reacção de três direcções utilizando ADN ligase T4 (New England Biolabs) ao fragmento BamHI-Spel do promotor Act2 e ao fragmento BamHI-SacI do pAdF3 que contém ambos fragmentos do gene luciferase senso e antissenso. De maneira similar, o vector binário pAdF2 foi contruído numa ligação de três vias que incluía o vector pSGCHC 1 de 11,6 kb digerido com Spel e Saci descrito anteriormente, o fragmento Spel-BamHI porta o promotor Act2 e o fragmento BamHI-SacI do pAdFl que contém os fragmentos de gene luciferase senso e antissenso rodeia ao gene bar. 40

Transformação de Agrobacterium e infiltração a vácuo de plantas Arabidopsis

Os plasmídeos pAdF2 e pAdF4 são introduzidos em Agrobacterium tumafaciens GV3101 por electroporação e as colónias transformadas são seleccionadas e amplificadas. As plantas adultas de quatro a cinco semanas de linhas mutantes de Arabidopsis thaliana que expressam luciferase ou constitutivamente (promotor UBQ3 (Norris et al (1993) PMB 21: 895-906) / UBQ3 + CaMV 35S 5' UTR/luc+; pPH108) ou de maneira induzivel (promotor PR-1 de Arabidopse /\uc+-,pCIB200, Une 6E) são infiltradas a vácuo com clones de Agrobacterium que portam os vectores T- ADN binários pAdF2 ou pAdF4. As plantas transformadas são coseleccionadas em higromicina e kanamicina e feitas crescer em condições de fitotron controlado para a determinação da actividade luciferase. Além disso, a actividade luciferase no fundo pCIB200-6E é avaliada 48 h depois da indução com BTH (tratamento BTH essencialmente como é descrito em Lawton et al (1996) Plant J. 10: 71-82). A actividade luciferase é quantificada utilizando um ensaio com base em luminescência em extractos tissulares após a adição de substrato luciferina. A actividade luciferase também é motorizada in planta utilizando um sistema de obtenção de imagem por vídeo arrefecido com CCD (Hamamatsu). Observe-se que o gene luciferase em pPH108 é do pGL3 (Promega, Número de acesso do Genbank n° U47295); e o gene luciferase em pCIB200-6E é do pGL2 (Promega, Número de acesso do Genbank n° X65323).

Os ensaios de luciferase são levados a cabo com um reagente de ensaio de luciferase (Promega, número de catálogo E1501). Os pedaços de folhas são moídos em tampão KP04 0,1 M pH 7,8 a 4 °C e centrifugados brevemente. Uma alíquota do sobrenadante é misturada com o reagente de ensaio de luciferase, e a actividade luciferase é quantificada num luminómetro Monolight 2010 (Becton Dickinson Microbiology System). Os resultados do análise de 41 plantas transformadas pPH108 com construções pAdF2 e pAdF4 senso/antissenso são apresentados no Quadro 1, assim como os resultados das plantas transformadas pCIB200-6E com a construção pAdF4 senso/antissenso são mostrados na Quadro 2.

Quadro 1: Unidades de luz relativa para actividade luciferase em plantas

Diferentes plantas da linha parental pPH108 são testadas para determinar o nivel médio de luciferase em diversas plantas. Esta linha não é homozigótica, portanto plantas individuais que mostram os níveis mais altos de luciferase (isto é, plantas 1, 2 e 3) podem ser homozigóticas.

Planta na pPH108 pPH108 (pAdF2) ρΡΗΙΟδ (pAdF4) Columbia (pAdF2) Columbia (pAdF4) 1 449102 108452 338274 390 425 2 381191 85301 116609 282 339 3 338480 21013 90545 231 273 4 199141 9669 81241 160 242 5 190187 8098 54457 150 226 6 137125 7349 32361 144 214 7 134421 6197 23929 133 213 8 124596 4944 18780 133 192 9 121062 4482 16637 129 179 10 121047 3975 15008 127 161

As linhas TI independentes de plantas duplamente transgénicas pPHl08(pAdF2) , que compreendem a construção pAdF2 num fundo pPH108, ou pPH108(pAdF4), que compreendem a construção pAdF4 num fundo pPH108, são analisadas. Os níveis de luciferase variam de linha para linha provavelmente devido a um intervalo de níveis de expressão do construção senso/antissenso. Os eventos TI independentes, plantas Arabidopse Columbia tipo selvagem transformadas com, ou pAdF2 (Columbia (pAdF2)) ou pAdF4 (Columbia (pAdF4)), são também analisados como controlos. 42 42 11 115430 3697 14901 127 12 114916 3244 13342 123 13 106007 3146 13111 122 14 104298 2516 12198 121 15 92455 2449 9538 118 16 2315 8316 107 17 1850 8301 18 1689 5957 19 1578 5110 20 1282 4941 21 859 4904 22 202 4754 23 155 4642 24 4147 25 3296 26 3286 27 2885 28 2800 29 2423 30 1703 Quadro 2: Unidades de luz relativa para a actividade luciferase em plantas individuais testadas 161 156 156 151 138 131

As plântulas da linha parental pCIB200-6E são feitas crescer e são colhidas amostras assim como das linhas duplamente transgénicas TI independentes pCIB200-6E(pAdF4). Os eventos TI independentes, Arabidopse Columbia tipo selvagem transformada com a construção pAdF4, são também analisados como controlos.

Planta n2 PCIB200-6E pCIB200-6E (pAdF4) Columbia (pAdF4) 1 17983 19990 214 2 7662 5157 217 3 6657 4753 233 4 5608 3334 263 5 3340 1370 186 43 6 2850 736 7 2461 484 8 2445 478 9 2349 476 10 2301 373 291 239 227 274

Exemplo 5: Regulação da expressão de um gene de interesse utilizando um sistema de recombinação especifica de lugar

Em outra forma de realização da invenção, os fragmentos de ARN senso e antissenso são produzidos utilizando um sistema de recombinação especifica de lugar. A recombinação especifica de lugar é um processo de corte do ADN e religação mediado por uma enzima recombinase. A recombinase reconhece uma sequência de ADN altamente especifica. Alguns dos sistemas de recombinação específica de lugar utilizam somente uma proteína para actuar em seu lugar alvo. Alguns sistemas de recombinação específica de lugar tais como Cre/lox, FLP/FTR, R/RS e Gin/gix sabe-se que mediam processos de recombinação específica de lugar em plantas (Ow and Medberry, 1995, Criticai Reviews in Plant Sciences 14: 239-261). Dependendo da configuração dos lugares de reconhecimento da recombinase nos substratos de recombinação o processo de recombinação tem como resultado a deleção, inversão ou integração das sequências de ADN. Uma reacção particular deste tipo, isto é, inversão, está relacionada com esta invenção. Dois lugares de reconhecimento da recombinase são postos na cassete de expressão desejável em orientações opostas. 0 primeiro lugar de reconhecimento é colocado a jusante do promotor, bem na sequência líder não traduzida, bem dentro da região 5' proximal da sequência codificante do transgene. 0 segundo lugar é colocado na região 3' não traduzida ou na região 3' proximal da sequência codificante do transgene na orientação oposta ao primeiro lugar. A cadeia codificante ou não codificante da sequência de ADN desejada está operativamente unida a um promotor. Em presença da 44 recombinase, as sequências flanqueadas são invertidas pelos dois lugares de reconhecimento em orientação oposta. Como consequência do processo de recombinação, ambas cadeias codificante e não codificante dos genes desejados estão operativamente unidas ao promotor e ambos transcritos senso e antissenso sejam produzidas a partir do mesmo loci genético no mesmo ambiente cromosómico e são capazes de formar moléculas de dsRNA. A expressão constitutiva de níveis altos da recombinase específica lugar tal como Cre pode causar fenótipos anormais em algumas plantas (Que et al, 1998, Plant J. 13: 401-409). Preferivelmente a expressão da recombinase está sob o controlo de um promotor induzível. Numa forma de realização da invenção, a cassete de expressão da recombinase é colocada no mesmo vector de transformação utilizado para introduzir as sequências transgénicas desejáveis flanqueadas por dois lugares de reconhecimento da recombinase em orientação oposta. Em outra forma de realização da invenção, as plantas transgénicas que contêm o transgene flanqueado pelos lugares de reconhecimento de recombinase são entrecruzados com linhas que expressam recombinase ou são retransformados com um vector que expressa recombinase. Em outra forma de realização da invenção, um vírus ARN ou ADN recombinante que contém a cassete de expressão da recombinase é utilizado para infectar plantas que contêm a construção transgénica desejável. O vírus recombinante é preferivelmente defeituoso no que se refere a causar fenótipos anormais. Nas formas de realização anteriores a recombinase causa a inversão da cópia cromossómica das sequências desejáveis, produzindo desse modo o dsRNA desejado.

Em ainda outra forma de realização da invenção, um vírus de ADN de planta recombinante é utilizado para produzir fragmentos de ARN senso e antissenso capazes de 45 formar um dsRNA. Tipicamente os vírus ADN de plantas replicam epicromosomalmente. Numa forma de realização preferida, uma construção que contém uma cassete que compreende uma sequência de ADN capaz de expressar um fragmento ARN de um gene alvo flanqueado por dois lugares de reconhecimento da recombinase invertidos é introduzida em células vegetais juntamente com um segundo vírus recombinante que expressa uma recombinase.

Alternativamente, tanto a cassete de expressão da recombinase como a sequência de ADN flanqueada pelos lugares de reconhecimento invertidos estão unidos no mesmo vector ADN virai. Depois de que os vectores ADN virais são introduzidos nas plantas, o gene da recombinase é expresso. A expressão do gene recombinase produz a inversão das sequências de ADN virai flanqueadas pelos lugares de reconhecimento da recombinase e tem como resultado a produção de grande quantidade de dsRNA a partir das sequências de ADN desejadas devido ao grande número de cópias do genoma virai na célula. Os sistemas de recombinase preferidos são Cre/lox, FLP/FRT, R/RS e Gin/gix e sabe-se que mediam processos de recombinação específica de lugar em plantas (Ow e Medberry, 1995, Criticai Reviews in Plant Sciences 14:239-261, incorporados no presente documento por meio de referência).

Exemplo 6: Requerimentos para a Construção de cassetes de expressão vegetal

As sequências génicas previstas para a expressão em plantas transgénicas são primeiramente montadas na cassete de expressão atrás de um promotor adequado e a montante de um terminador de transcrição adequado. Todo os requerimentos para as construções das cassetes de expressão vegetais são aplicadas às moléculas de ADN da presente invenção e são levadas a cabo utilizando técnicas bem conhecidas na técnica.

Selecção do promotor 46 A selecção do promotor utilizado na cassete de expressão determina o padrão de expressão espacial e temporal da molécula de ADN na planta transgénica. Os promotores seleccionados expressam moléculas de ADN em tipos celulares específicos (tais como células epidérmicas da folha, células mesófilas, células do córtex da raiz) ou em tecidos ou órgãos específicos (por exemplo, raízes, folhas ou flores) e esta selecção reflecte a localização desejada da biossíntese de um fragmento de ARN codificado pela molécula de ADN. Alternativamente, o promotor seleccionado pode dirigir a expressão da molécula de ADN sov um promotor induzido pela luz ou outro regulado temporalmente. Uma alternativa adicional, é que o promotor seleccionado seja quimicamente regulado. Isto proporciona a possibilidade de induzir a expressão da molécula de ADN somente quando é desejada e é causada por tratamento com um indutor químico.

Terminadores transcripcionais

Uma variedade de terminadores transcripcionais estão disponíveis para utilizar em cassetes de expressão. Estes são responsáveis pela terminação da transcrição e, preferivelmente, por uma correcta poliadenilação. Os terminadores transcripcionais apropriados e aqueles que se sabe que funcionam em plantas e incluem o terminador CaMV 35S, o terminador tml, o terminador nopalina sintase, o terminador rbcS E9 da ervilha. Estes podem ser utilizados tanto em monocotiledóneas como dicotiledóneas.

Sequências para o potenciamento ou regulação da expressão

Descobriram-se numerosas sequências que potenciam a expressão génica desde dentro da unidade transcripcional e estas sequências podem ser utilizadas conjuntamente com a molécula de ADN desta invenção para incrementar a sua expressão em plantas transgénicas.

Foi demonstrado que diversas sequências intrónicas potenciam a expressão, particularmente nas células 47 monocotiledóneas. Por exemplo, foi descoberto que os intrões do gene Adhl do milho potenciam significativamente a expressão do gene selvagem sob seu promotor associado quando é introduzido nas células do milho. Foi descoberto que o intrão 1 é particularmente eficaz e potência a expressão nas construções de fusão com o gene cloranfenicol acetiltransferase (Callis et al, Genes Develep J_: 1183-1200 (1987)). No mesmo sistema experimental, o intrão do gene bronzel do milho tinha um efeito similar em potenciar a expressão (Callis et al, supra). As sequências intrónicas foram rotineiramente incorporadas nos vectores de transformação de plantas, tipicamente dentro da sequência lider não traduzida.

Um número de sequências lider não traduzidas derivadas de vírus sabe-se também que potenciam a expressão, e estas são particularmente eficazes em células dicotiledóneas. Especificamente, as sequências lider do virus do mosaico do Tabaco (TMV, a "sequência Q"), Vírus das pintas cloróticas do Milho (MCMV), e Vírus do Mosaico da Alfalfa (AMV) foi demonstrado que são eficazes em potenciar a expressão (por exemplo Gallie et al Nucl. Acids Res. 15: 8693-8711 (1987); Skuzeski et al Plant Molec. Biol 15; 65-79 (1990)).

Exemplo 7: Exemplos de Construção de cassete de expressão A presente invenção abrange a expressão de uma molécula de ADN da presente invenção sob a regulação de qualquer promotor que se expressa nas plantas, sem levar em consideração a origem do promotor, portanto, a molécula de ADN é inserida em qualquer das cassetes de expressão utilizando técnicas bem conhecidas na técnica. Estas cassetes de expressão podem ser em seguida facilmente transferidas aos vectores de transformação vegetal descritos a seguir.

Adicionalmente, a invenção também abrange a utilização de qualquer promotor que pode ser expresso em plantas conjuntamente com quaisquer sequências adicionais 48

requeridas ou seleccionadas para a expressão da molécula de ADN. Tais sequências incluem, mas não estão limitadas a, terminadores transcripcionais, sequências externas que potenciam a expressão (tal como intrões [por exemplo, intrão 1 Adh], sequências virais [por exemplo, TMV-Q] ) . Expressão constitutiva: o Promotor CaMV 35S A Construção do plasmideo pCGN1761 é descrita no pedido de patente publicada EP 0 392 225. 0 pCGN1761 contém o promotor "duplo" 35S e o terminador transcripcional tml com um lugar único EcoRI entre o promotor e o terminador e tem um esqueleto tipo pUC. É construído um derivado do pCGN1761, que tem um lugar de clonagem múltiplo modificado que inclui lugares Notl e Xhol além do lugar EcoRI já existente. Este derivado é designado pCGNl76lENX. 0

pCGN1761ENX é útil para a clonagem de sequências de ADNc ou de sequências génicas (que incluem sequências ORF microbianas) dentro de seu lugar de clonagem múltiplo para os propósitos da sua expressão sob o controlo do promotor 35S em plantas transgénicas. A cassete inteira do promotor 35S-sequência génica-terminador tml de tal construção pode ser cortada pelos lugares HindIII, Sphl, Sall, e Xbal 5' do promotor e os lugares Xbal, BamHI e Bgll 3' do terminador para ser transferidos aos vectores de transformação. Adicionalmente, o fragmento do promotor duplo 35S pode ser eliminado por meio de excisão 5' com HindIII, Sphl, Sall, Xbal, ou Pstl, e excisão 3' com qualquer dos lugares de restrição do lugar de clonagem múltiplo [EcoRI, Notl ou Xhol) para substituição com outro promotor.

Por conseguinte, uma molécula de ADN da presente invenção é inserida em pCGN1761ENX para a expressão constitutiva sob o controlo do promotor CaMV 35S.

Expressão sob um promotor quimicamente regulável

Esta secção descreve a substituição do promotor duplo 35S em pCGN1761ENX com qualquer promotor de escolha; por meio de um exemplo, é descrito o promotor PR-a quimicamente 49 regulado. 0 promotor de escolha é preferivelmente cortado de sua fonte por meio de enzimas de restrição, mas pode alternativamente ser amplificado por PCR utilizando iniciadores que portam os lugares de restrição terminais apropriados. Uma amplificação por PCR deveria ser realizada, em seguida o promotor deveria ser ressequenciado para comprovar os erros de amplificação depois da clonagem do promotor amplificado no vector alvo. 0 promotor de tabaco PR-a quimicamente regulável é cortado do plasmideo pCIBl004 (veja-se o documento d EP 0 332 104) e transferido ao plasmideo pCGNl761ENX. O pCIB1004 é clivado com Ncol e 3' protuberante resultante do fragmento linearizado se torna obtusp por tratamento com ADN polimerase T4. O fragmento é em seguida clivado com HindIII e o promotor PR-1 resultante que contém o fragmento é purificado em gel e clonado em pCGNl761ENX a partir do qual o promotor duplo 35S tinha sido retirado. Isto é feito por clivagem com Xhol e se torna obtuso com polimerase T4, seguido por clivagem com HindIII e isolamento do terminador do vector mais amplo que contém um fragmento em que o fragmento do promotor pCIBl004 é clonado. Isto gera um derivado pCGN1761ENX com o promotor PR-1 e o terminador tml e um lugar de clonagem múltiplo intermediário com lugares únicos EcoRI e Notl.

Uma molécula de ADN da presente invenção é inserida neste vector e o produto de fusão (isto é, promotor- gene-terminador) é transferido subsequentemente a qualquer vector de transformação seleccionado, incluindo os descritos neste pedido de patente, proporcionando assim a expressão quimicamente induzivel da molécula de ADN. Expressão constitutiva: o promotor de Actina

Varias isoformas de actina sabe-se que se expressam na maioria dos tipos celulares e por conseguinte, o promotor de actina numa boa escolha para um promotor constitutivo. Em particular, o promotor do gene Actl do arroz tinha sido clonado e caracterizado (McÉlroy et al Plant Cell 2: 163- 50 171 (1990)). Foi encontrado que um fragmento de 1,3 kb do promotor continha todos os elementos reguladores requeridos para a expressão nos protoplastos do arroz. Além disso, numerosos vectores de expressão com base no promotor Actl foram construídos especificamente para a utilização em monocotiledóneas (McElroy et al Mol. Gene. Genet. 231: 150-160 (1991)). Estas incorporam o Actl- intrão 1, a sequência flanqueante em 5' Actl e o Adhl-intrão 1 (do gene álcool desidrogenase do milho) e sequência do promotor CaMV 35S. Os vectores que mostram a expressão mais alta são fusões de 35S e o intrão Actl ou a sequência flanqueante 5' Actl e o intrão Actl. As cassetes de expressão do promotor descritas por McElroy et al (Mol. Gene. Genet. 231: 150-160 (1991)) são modificadas facilmente para a expressão de uma molécula de ADN da presente invenção e são particularmente adequadas para a utilização em monocotiledóneas hospedeiras. Por exemplo, os promotores que contêm fragmentos são retirados das construções McElroy e utilizam-se para substituir o promotor duplo 35S em pCGN1761ENX, que está em seguida disponível para a inserção de sequências génicas específicas. Os genes de fusão assim construídos são transferidos a vectores de transformação apropriados. Num informe separado foi descoberto também que o promotor Actl do arroz com seu primeiro intrão levam a uma alta expressão em células de cevada cultivadas (Chibbar et al Plant Cell Rep. 12: 506-509 (1993)). Uma molécula de ADN da presente invenção é inserida a jusante de tal promotor, e os produtos de fusão (isto é, promotor-gene-terminador) são transferidos subsequentemente a qualquer vector de transformação seleccionado, incluindo os descritos neste pedido de patente.

Expressão constitutiva: o promotor de Ubiguitina A ubiquitina é outro produto génico que sabe-se que se acumula em muitos tipos celulares e seu promotor tinha sido clonado a partir de diversas espécies para utilizar em 51 plantas transgénicas (por exemplo, girassol - Binet et al Plant Science 79: 87-94 (1991), milho - Christensen et al Plant Molec. Biol 12: 619-632 (1989)). 0 promotor de ubiquitina do milho tinha sido desenvolvido em sistemas monocotiledóneos transgénicos e a sua sequência e vectores, construídos para transformação monocotiledónea estão descritos na publicação da patente EP 0 342 926 . Além disso, Taylor et al (Plant Cell Rep. 12: 491-495 (1993)) descreve um vector (pAHC25) que compreende o promotor de ubiquitina do milho e o primeiro intrão e sua alta actividade em suspensões celulares de numerosas monocotiledóneas quando são introduzidas via bombardeamento com microparticulas. 0 promotor de ubiquitina é claramente adequado para a expressão da molécula de ADN da presente invenção em plantas transgénicas, especialmente monocotiledóneas. Os vectores adequados são derivados de pAHC25 ou de qualquer dos vectores de transformação descritos neste pedido de patente, modificados por meio da introdução do promotor de ubiquitina apropriado e/ou de sequências intrónicas.

Uma molécula de ADN da presente invenção é portanto inserida em qualquer destes vectores, e os produtos de fusão (isto é, promotor-gene-terminador) utilizam-se para transformação de plantas, dando como resultado uma expressão constitutiva da molécula de ADN.

Expressão específica de raiz

Um padrão de expressão preferido para uma molécula de ADN da presente invenção é a expressão em raiz. A expressão da sequência de nucleótidos somente no tecido radicular tem a vantagem de alterar a expressão de um gene alvo somente em raizes, sem uma alteração concomitante da sua expressão em tecidos de folhas e flores e sementes. Um promotor de raiz adequado é o descrito por de Framond (EEBS 290: 103-106 (1991)) e também no pedido de patente publicada EP 0 452 269. Este promotor é transferido a um vector adequado 52 tal como pCGN1761ENX e a molécula de ADN é inserida em dito vector. A cassete promotor-gene-terminador inteiro é transferido posteriormente a um vector de transformação de interesse.

Promotores induzíveis por feridas

Numerosos promotores deste tipo foram descritos (por exemplo, Xu et al Plant Molec. Biol. 22: 573-588 (1993),

Logemann et al Plant Cell J_: 151-158 (1989), Rohrmeier &

Lehle, Plant Molec. Biol 22: 783-792 (1993), Firek et al

Plant Molec. Biol 22: 129-142 (1993), Warner et al Plant J. 3: 191-201 (1993)) e todos são adequados para utilizar com a presente invenção. Logemann et al (supra) descrevem as sequências 5' a montante do gene wunl da batata dicotiledónea. Xu et al (supra) mostram que um promotor induzivel por ferida da batata dicotiledónea (pin2) é activo no arroz monocotiledóneo. Além disso, Rohmeier & Lehle (supra) descrevem a clonagem do ADNc do Wipl do milho que é induzivel por ferida e que pode ser utilizado para isolar o promotor associado utilizando técnicas padrão. De maneira similar, Firek et al (supra) e Warner et al (supra) descreveram um gene induzivel por ferida do Asparagus officinalis monocotiledóneo que se expressa em feridas locais e em lugares de invasão patogénica. Utilizando técnicas de clonagem bem conhecidas na técnica, estes promotores podem ser transferidos a vectores adequados, fusionar a uma molécula de ADN desta invenção e ser utilizados para expressar estas genes nos lugares de infecção por praga de insectos.

Expressão preferida de medula 0 pedido de patente WO 93/07278 descreve o isolamento do gene trpA do milho que se expressa preferivelmente em células da medula. Utilizando técnicas de biologia molecular padrão, este promotor ou partes do mesmo, podem ser transferidos a um vector tal como pCGN1761 em que pode substituir ao promotor 35S e ser utilizado para direccionar 53 a expressão de uma molécula de ADN da presente invenção numa maneira preferida de medula. De facto, os fragmentos que contêm o promotor preferido de medula ou partes do mesmo são transferidos a qualquer vector e são modificados para sua utilidade em plantas transgénicas. A expressão preferida de medula da molécula de ADN é conseguida inserindo a molécula de ADN em tal vector.

Expressão específica de pólen 0 pedido de patente WO 93/07278 descreve além disso o isolamento da proteína quinase dependente de cálcio (CDPK) do gene milho que se expressa nas células do pólen. A sequência do gene e o promotor se estendem até 1400 pb a partir do começo da transcrição. Utilizando técnicas de biologia molecular padrão, este promotor ou partes do mesmo, é transferido a um vector tal como pCGN1761 em que substitui o promotor 35S e utiliza-se para direccionar a expressão de uma molécula de ADN da presente invenção numa maneira específica de pólen. De facto, os fragmentos que contêm o promotor específico de pólen ou partes do mesmo podem ser transferidos a qualquer vector e ser modificados para utilidade em plantas transgénicas.

Expressão específica de folha

Um gene do milho que codifica a fosfoenolcarboxilase (PEPC) tinha sido descrito por Hudspeth & Gruía (Plant Molec Biol 12: 579-589 (1989)). Utilizando técnicas de biologia molecular padrão o promotor para este gene utiliza-se para direccionar a expressão de uma molécula de ADN da presente invenção numa maneira especifica de folhas em plantas transgénicas.

Exemplo 8: Construção de vectores de transformação vegetal

Numerosos vectores de transformação estão disponíveis para transformação vegetal, e uma molécula de ADN desta invenção é inserida em qualquer das cassetes de expressão descritas anteriormente, de modo que sejam capazes de expressar a molécula de ADN nas células desejáveis, em 54 condições apropriadas. Uma cassete de expressão que contém uma sequência de nucleótidos é incorporada em seguida em qualquer vector de transformação apropriado descrito a seguir. A selecção do vector a utilizar dependerá da técnica de transformação preferida e das espécies alvo para transformação. Para certas espécies alvo, diferentes antibióticos ou marcadores de selecção a herbicidas podem ser preferidos. Os marcadores de selecção utilizados rotineiramente em transformação incluem o gene nptll que confere resistência a kanamicina e antibióticos relacionados (Messing & Vierra, Gene 19: 259-268 (1982);

Bevan et al, Nature 304: 184-187 (1983)), o gene bar que confere resistência ao herbicida fosfinotricina (While et al, Nuci Acids Res J_8 : 1062 (1990), Spencer et al Theor

Appl Genet 79: 625-631 (1990)), o gene hph que confere resistência ao antibiótico higromicina (Blochinger &

Diggelmann, Mol Cell Biol 4: 2929-2931) e o gene dhfr, que confere resistência ao metotrexato (Bourouis et al, EMBO J. 2(7): 1099-1104 (1983)) . (1) Construção de vectores adequados para transformação por Agrobacterium

Muitos vectores estão disponíveis para transformação utilizando Agrobacterlum tumefaciens. Estes portam tipicamente pelo menos uma sequência de extremidade de T-ADN e incluem vectores tal como pBIN19 (Bevan, Nucl. Acids Res. (1984). A seguir é descrita a construção de dois vectores típicos.

Construção de pCIB200 e pCIB2001

Os vectores binários pCIB200 e pCIB2001 utilizam-se para a Construção de vectores recombinantes para utilizar com Agrobacterlum e são construídos da seguinte maneira. 0 pTJS75kan é criado por digestão Narl do pTJS75 (Schmidhauser &Helinski, J Bacteriol. 164: 446-455 (1985)) permitindo o corte do gene de resistência a tetraciclina, 55 seguido pela inserção de um fragmento Accl do pUC4K que lleva um NPTII (Messing & Vierra, Gene J_9: 259-268 (1982); Bevan et al, Nature 304: 184-187 (1983); McBride et al, Plant Molecular Biology _I4: 266-276 (1990)). Os ligantes Xhol são ligados ao fragmento EcoRV de pCIB7 que contém as extremidades esquerda e direita de T-ADN, um gene quimérico vegetal nos/nptll seleccionável e poliligante pUC (Rothstein et al, gene 53: 153-161 (1987)), e o fragmento digerido por Xhol é clonado no pTJS75kan digerido com Sall para criar pCIB200 (veja-se também o documento EP 0 332 104) . O pCIB200 contém os seguintes lugar de restrição no lugares de restricção de poliligantes únicos: EcoRI, Sstl, Kpnl, BglII, Xbal e Sall. O pCIB2001 é um derivado do pCIB200 criado por meio da inserção no poliligante de lugares de restrição adicionais. Os lugares de restrição únicos no poliligante de pCIB2001 são EcoRI, Sstl, Kpnl, BglII, Xbal, Sali, Mlul, Bell, Avrll, Apal, Hpal e Stul. 0 pCIB2001, além de conter estes lugares de restrição únicos também têm selecção vegetal e bacteriana a kanamicina, extremidades esquerda e direita de T-ADN para transformação mediada por Agrobacterium, a função trfA derivada do RK2 para mobilização entre E. coli e outros hospedeiros, e as funções OriT e OriV também do RK2. O poliligante pCIB2001 é adequado para a clonagem da cassete de expressão vegetal que contém seus próprios sinais reguladores.

Qualquer uma das cassetes de expressão descritas anteriormente e que compreendem uma molécula de ADN da presente invenção é inserida em pCIB2001, utilizando preferivelmente o poliligante.

Construção de pCIBlO e derivados do mesmo com selecção por higromicina O vector binário pCIBlO contém um gene que codifica resistência a kanamicina para a selecção em plantas, sequências de T-ADN de extremidades esquerda e direita e incorpora as sequências do plasmideo pRK252 de amplo 56 intervalo de hospedeiros permitindo que replique tanto em E. coli como em Agrobacterium. Sua construção está descrita por Rothstein et al (Gene 53: 153-161 (1987)). Diversos derivados depCIBIO foram construídos para que incorporem o gene para a higromicina B fosfotransferase descrito por Gritz et al (Gene 25: 179-188 (1983)). Estes derivados somente permitem a selecção de células vegetais transgénicas em higromicina (pCIB743), ou higromicina e kanamicina (pCIB715, pCIB717). Este vector utiliza-se para transformar uma cassete de expressão que compreende uma molécula de ADN da presente invenção. (2) Construção de vectores adequados para transformação sem Agrobacterium A transformação sem a utilização de Agrobacterium tumefaciens evita o requerimento para as sequências T-ADN no vector de transformação elegido e por conseguinte os vectores que não possuem estas sequências podem ser utilizados juntamente com vectores tais como os descritos anteriormente que contêm sequências T-ADN. As técnicas de transformação que não dependem de Agrobacterium incluem transformação via o bombardeamento de partículas, captação de protoplastos (por exemplo, PEG e electroporação), micro-injecção ou transformação de pólen (Patente US N° 5.629.183). A escolha do vector depende em grande medida da selecção preferida das espécies a ser transformadas. A seguir, é descrita a construção de alguns vectores típicos. Construção de pCIB3064 0 pCIB3064 é um vector derivado do pUC adequado para técnicas de transferência génica directa em combinação com a selecção pelo herbicida basta (ou fosfinotricina). 0 plasmídeo pCIB246 compreende o promotor CaMV 35S em fusão operativa com o gene GUS de E. coli e o terminador transcripcional CaMV 35S e é descrito no pedido de patente PCT publicad WO 93/07278. O promotor 35S deste vector 57 contém duas sequências ATG 5' do lugar de inicio. Estes lugares são mutados utilizando técnicas de PCR padrão de tal modo que são eliminados os ATGs e são gerados os lugares de restrição Sspl e Pvull. Os novos lugares de restrição estão 96 e 37 pb longes do lugar Sall único e a 101 e 42 pb do lugar de inicio real. O derivado resultante de pCIB246 é designado pCIB3025. O gene GUS é em seguida cortado do pCIB3025 por meio de digestão com Sall e Saci, as extremidades terminais se tornam obtusas e são religadas para gerar o plasmídeo pCIB3060. O plasmideo pJIT82 é obtido do centro John Innes, Norwich e o fragmento Smal de 400 pb que contém o gene bar de Streptomyces viridochromogenes é cortado e é inserida no lugar Hpal do pCIB3060 (Thompson et al EMBO J 6: 2519-2523 (1987)). Este pCIB3064 gerado que compreende o gene bar sob o controlo do promotor CaMV 35S e o terminador para selecção por herbicida, um gene para resistência a ampicilina (para selecção em E. coli) e um poliligante com os lugares únicos Sphl, Pstl, HindIII, e BamHI. Este vector é adequado para a clonagem de cassetes de expressão vegetal que contêm seus próprios sinais reguladores para direccionar a expressão de uma molécula de ADN da presente invenção.

Construção de pSOG19 e pSOG35 O pSOG35 é um vector de transformação que utiliza o gene dihidrof olato reductase (DHFR) de E. coli como um marcador seleccionável que confere resistência ao metotrexato. Utiliza-se PCR para amplificar o promotor 35S (-800 pb), intrão 6 do gene Adhl do milho (-550 pb) e 18 pb da sequência lider sem traduzir GUS do pSOGlO. Um fragmento de 250 pb que codifica o gene dihidrofolato reductase tipo II de E. coli é amplificado também por PCR e estes dois fragmentos PCR são montados com um fragmento Sacl-Pstl do pBl221 (Clontech) que compreende o esqueleto do vector pUC19 e o terminador nopalina sintase. A montagem destes fragmentos gerou o pSOG19 que contém o promotor 35S em 58 fusão com a sequência do intrão 6, a sequência lider GUS, o gene DHFR e o terminador nopalina sintase. A substituição da sequência lider GUS em pS0G19 com a sequência lider do virus das pintas clorótico do milho (MCMV) gerou o vector pSOG35. 0 pS0G19 e o pSOG35 portam o gene pUC para resistência a ampicilina e têm os lugares HindIII, Sphl, Pstl e EcoRI disponíveis para a clonagem de sequências externas, em particular uma molécula de ADN da presente invenção.

Exemplo 9: Transformação de cloroplasto

Vectores de transformação

Para a expressão de uma molécula de ADN da presente invenção nos plastídeos vegetais, utiliza-se o vector de transformação de plastídeos pPHl43 (documento de patente 0 97/32011, exemplo 36). A molécula de ADN é inserida no pPH143 de modo que substitui a sequência codificante PROTOX. Este vector utiliza-se em seguida para transformação de plastídeos e selecção de transformantes para resistência a espectinomicina. Alternativamente, a molécula de ADN é inserida em pPH143 de modo que substitui o gene aadH. Neste caso, os transformantes são seleccionados para resistência aos inibidores PROTOX. Transformação cloroplástica

As sementes de Nicotiana tabacum c.v. "Xanthi nc" foram germinadas sete por placa numa disposição de sequenciação (array) circular de 1 polegada (2,54 cm) em meio agar T e foram borbardeadas 12-14 dias depois da sementeira com partículas de tungsténio de 1 pm (MIO,

Biorad, Hercules, CA) revestidas com ADN dos plasmídeos pPH143 e pPH145 essencialmente como está descrito (Svab, Z. e Maliga, P. (1993) PNAS 90, 913-917). As plântulas bombardeadas foram incubadas em meio T durante dois dias depois do qual as folhas foram cortadas e colocadas com a parte abaxial para cima em luz brilhante (350-500 pmol fotões/m2/s) em placas de meio RMOP (Svab, Z., Hajdukie- 59 wicz, P. E Maliga, P. (1990) PNAS 87, 8526-8530) que contêm 500 pg/ml dicloridrato de espectinomicina (Sigma, St. Louis, MO) . Os brotos resistentes que apareceram sob as folhas alvejadas entre três e oito semanas depois do bombardeamento foram subclonados no mesmo meio selectivo, permitindo formar calos, e os brotos secundários foram isolados e subclonados. A segregação completa de cópias do genoma plástico transformado (homoplasmicidade) em subclones independentes foi avaliada por meio de técnicas padrão de Southern blotting (Sambrook et al, (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor). O ADN celular total digerido com BamHI/EcoRI (Mettler, I. J. (1987) Plant Mol Biol Repórter 5, 346-349) foi separado em géis de agarose Tris-borato (TBE) 1 %, transferido a membranas de nylon (Amersham) e testado com sondas com sequências de ADN geradas aleatoriamente marcadas com 32P correspondentes a fragmentos BamHI/HindIII de ADN de 0,7 kb a partir de pC8 que contêm uma porção da sequência de plastideo rps 7/12 de alvo. Os brotos homoplásmicos são arraigados de maneira asséptica em espectinomicina, que contém meio MS/IBA (McBride, K.E, et al (1994) PNAS 91, 7301-7305) e são transferidas à estufa. 60

LISTA DE SEQUÊNCIAS

<110> Syngenta Participations AG <120> Regulação Mediada por dsARN de Expressão de genes em Plantas <13 0> S-30496/EP DIV <150> US 09/084.942 <151> 26-05-1998 <16 0> 18 <17 0> Patentln versão 3.1 <210> 1 <211> 27 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> oligonucleótido <400> 1 cgcggatcct ggaagacgcc aaaaaca 27 <210>2 <211> 38 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> oligonucleótido <400> 2 61 cggaagctta ggctcgccta atcgcagtat ccggaatg 38

<210>3 <211> 28 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> oligonucleótido <400> 3 cggtctagag gaagacgcca aaaacata 28

<210>4 <211> 38 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> oligonucleótido <400> 4 cggaagctta ggctcgccta atcgcagtat ccggaatg 38

<210>5 <211> 22 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> oligonucleótido <400> 5 gtacctcgag tctagactcg ag 22 62

<210>6 <211> 27 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> oligonucleótido < 4 0 0 > 6

gatcgagctc cacgagaact gtctccg 27 <210>7 <211> 27 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> oligonucleótido <400> 7 tcagccatgg gaagacaagt acattgc 27

<210>8 <211> 27 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> oligonucleótido <400> 8 cttgccatgg cacgagaact gtctccg 27

<210>9 <211> 28 <212> ADN 63 <213> Sequência Artificial <220> <223> oligonucleótido <400> 9 catggagctc gaagacaagt acattgca 28

<210> 10 <211> 43 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> oligonucleótido <400> 10 catcgagctc ctctgtttaa accacgagaa ctgtctccgt cgc 43

<210> 11 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> oligonucleótido <400> 11 tttggagagg acagacctgc 20

<210> 12 <211> 24 <212> ADN <213> Sequência Artificial 64 <220> <223> oligonucleótido <400> 12 ggattttggt tttaggaatt agaa 24

<210> 13 <211> 30 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> oligonucleótido <400> 13 cgcggatcca agattcaaag tgcgctgctg 30

<210> 14 <211> 30 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> oligonucleótido <400> 14 gcgaagcttg gcgacgtaat ccacgatctc 30

<210> 15 <211> 30 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> oligonucleótido 65 <400> 15 cggtctagaa agattcaaag tgcgctgctg 30

<210> 16 <211> 30 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> oligonucleótido <400> 16 gcgaagcttg gcgacgtaat ccacgatctc 30

<210> 17 <211> 29 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> oligonucleótido <400> 17 gcgaagcttg atccatgagc ccagaacga 29

<210> 18 <211> 27 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> oligonucleótido <400> 18 gccaagcttc ctagaacgcg tgatctc 27 66

DOCUMENTOS REFERIDOS NA DESCRIÇÃO

Esta lista de documentos referidos pelo autor da presente solicitação de patente foi elaborada apenas para informação do leitor. Não é parte integrante do documento de patente europeia. Não obstante o cuidado na sua elaboração, o IEP não assume qualquer responsabilidade por eventuais erros ou omissões.

Documentos de patente referidos na descrição EP 0458367 AI [0003] WO 9932619 A [0006] [0007] WO 9949029 A [0006] [0008] US 5107065 A [0030] US 5283184 A [0030] US 5034323 A [0030] US 5689044 A [0033] EP 0452269 A [0033] [0068] US 5625136 A [0033] US 5451513 A [0037] US 5545817 A [0037] US 5545818 A [0037] WO 9516783 A [0037] US 5767378 A [0038] US 4940935 A [0038] US 5188642 A [0038] US 5639949 A [0039] [0040] EP 0392225 A [0064] EP 0332104 A [0065] [0075] EP 0342926 A [0067] WO 9307278 A [0070] [0071] [0078] US 5629183 A [0077] WO 9732011 A [0080] US 09084942 B [0082] 67

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Claims (11)

1 REIVINDICAÇÕES 1. Um método para reduzir a expressão de um gene alvo numa célula vegetal que compreende introduzir na célula vegetal uma primeira sequência de ADN capaz de expressar um fragmento de ARN senso de um gene alvo e uma segunda sequência de ADN capaz de expressar um fragmento de ARN antissenso do dito gene alvo, em que as ditas primeira e segunda sequências de ADN estão compreendidas numa molécula de ADN, em que os ditos fragmentos de ARN senso e antissenso são capazes de formar uma molécula de ARN de cadeia dupla, em que a dita molécula de ADN compreende ainda uma sequência de ADN que compreende um ligante (linker) que compreende sinais de processamento de intrões entre as ditas primeira e segunda sequências de ADN, em que a expressão do dito gene alvo na dita célula vegetal é reduzida quando os ditos fragmentos de ARN senso e antissenso são expressos a partir das ditas primeira e segunda sequências de ADN e os ditos fragmentos de ARN formam uma molécula de ARN de cadeia dupla. 2. 0 método de acordo com a reivindicação 1, em que a dita uma molécula de ADN que compreende as ditas primeira e segunda sequências de ADN é introduzida na dita célula vegetal por um vector de transformação de plantas. 3. 0 método de acordo com a reivindicação 2, em que o dito vector de transformação de plantas compreende ainda um gene de marcador seleccionável, opcionalmente em que o dito gene de marcador seleccionável é EPSPS ou DHFR. 4. 0 método de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 3, em que o dito gene alvo é um gene essencial da dita célula vegetal. 2 5. 0 método de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 4, em que o dito gene alvo é um gene heterólogo, preferivelmente integrado estavelmente no genoma da dita célula vegetal. 6. 0 método de acordo com qualquer reivindicação anterior em que a molécula de ARN de cadeia dupla tem um comprimento de 50 nucleótidos ou mais. 7. 0 método de acordo com qualquer reivindicação anterior em que as ditas sequências de ADN que codificam os ditos fragmentos de ARN senso e antissenso são ligadas operativamente a um promotor, preferivelmente em que o dito promotor é o promotor nativo de um gene alvo nativo, um promotor heterólogo, um promotor constitutivo, um promotor induzivel, por exemplo, um promotor induzivel por feridas, um promotor especifico para tecidos ou um promotor regulado durante o desenvolvimento. 8. 0 método de acordo com a reivindicação 1 ou reivindicação 2 em que a dita uma molécula de ADN que compreende as ditas primeira e segunda sequências de ADN é integrada estavelmente no genoma da célula vegetal.

9. O método de acordo com a reivindicação 8, ainda caracterizado por as caracteristicas de acordo com qualquer das reivindicações 4 a 7.

10. O método de acordo com qualquer das reivindicações 3 a 7, em que a dita uma molécula de ADN que compreende as ditas primeira e segunda sequências de ADN é integrada estavelmente no genoma da célula vegetal e em que o dito gene de marcador seleccionável é também integrado estavelmente no genoma da célula vegetal. 3

11. Uma célula vegetal que compreende uma primeira sequência de ADN capaz de expressar um fragmento de ARN senso de um gene alvo e uma segunda sequência de ADN capaz de expressar um fragmento de ARN antissenso do dito gene alvo, em que os ditos fragmentos de ARN senso e antissenso são capazes de formar uma molécula de ARN de cadeia dupla, em que as ditas primeira e segunda sequências de ADN estão compreendidas numa molécula de ADN que é integrada estavelmente no genoma da dita célula vegetal, em que a dita célula vegetal compreende ainda uma sequência de ADN que compreende um ligante (linker) que compreende sinais de processamento de intrões entre a dita primeira sequência de ADN e a dita segunda sequência de ADN, em que a expressão do dito gene alvo na dita célula vegetal é reduzida quando os ditos fragmentos de ARN senso e antissenso são expressos a partir das ditas primeira e segunda sequências de ADN e os ditos fragmentos de ARN formam uma molécula de ARN de cadeia dupla.

12. Uma célula vegetal de acordo com a reivindicação 11, em que a dita célula vegetal compreende ainda um gene de marcador seleccionável que é integrado estavelmente no genoma da dita célula vegetal, opcionalmente em que o dito gene de marcador seleccionável é DHFR ou EPSPS.

13. Uma célula vegetal de acordo com a reivindicação 11 ou reivindicação 12, ainda caracterizada por as caracteristicas de acordo com qualquer das reivindicações 4 a 7.

14. Uma planta que compreende uma célula vegetal de acordo com a reivindicação 12 ou reivindicação 13; ou a progénie da dita planta em que a dita progénie compreende uma célula vegetal de acordo com as reivindicações 12 ou 13. 4

15. Uma semente que compreende uma célula vegetal de acordo com a reivindicação 12 ou reivindicação 13.

16. Um vector de transformação de plantas para utilização na redução da expressão de um gene alvo numa célula vegetal, sendo que a dita transformação de plantas compreende uma primeira sequência de ADN capaz de expressar um fragmento de ARN senso de um gene alvo e uma segunda sequência de ADN capaz de expressar um fragmento de ARN antissenso do dito gene alvo, sendo que os ditos fragmentos de ARN senso e antissenso são capazes de formar uma molécula de ARN de cadeia dupla, o dito vector de transformação de plantas compreende ainda uma sequência de ADN que compreende um ligante (linker) que compreende sinais de processamento de intrões entre a dita primeira sequência de ADN que codifica o dito fragmento de ARN senso e a dita segunda sequência de ADN que codifica o dito fragmento de ARN antissenso. 17. 0 vector de transformação de plantas de acordo com a reivindicação 16 que compreende ainda um gene de marcador seleccionável, opcionalmente em que o dito gene de marcador seleccionável é EPSPS ou DHFR. 18. 0 vector de transformação de plantas de acordo com a reivindicação 16 ou reivindicação 17, ainda caracterizado por as caracteristicas de acordo com qualquer das reivindicações 4 a 7.

19. A utilização de um vector de transformação de plantas de acordo com qualquer das reivindicações 16, 17 ou 18 na redução da expressão de um gene alvo numa célula vegetal; em que a expressão do dito gene alvo na dita célula vegetal é reduzida quando os ditos fragmentos de ARN senso e antissenso são expressos a partir das ditas primeira e 5 segunda sequências de ADN e os ditos fragmentos de ARN formam uma molécula de ARN de cadeia dupla.

20. Um método de produção de uma planta transformada geneticamente que compreende as etapas de: i) introduzir numa célula vegetal uma primeira sequência de ADN capaz de expressar um fragmento de ARN senso de um gene alvo e uma segunda sequência de ADN capaz de expressar um fragmento de ARN antissenso do dito gene alvo, em que as ditas primeira e segunda sequências de ADN estão compreendidas numa molécula de ADN, em que os ditos fragmentos de ARN senso e antissenso são capazes de formar uma molécula de ARN de cadeia dupla, em que a dita uma molécula de ADN compreende um ligante (linker) que compreende sinais de processamento de intrões entre ADN que codifica os ditos fragmentos de ARN senso e antissenso, em que a dita uma molécula de ADN que compreende as ditas primeira e segunda sequências de ADN é introduzida na dita célula vegetal por um vector de transformação de plantas, sendo que o dito vector compreende ainda um gene de marcador seleccionável, opcionalmente DHFR ou EPSPS; e em que uma célula vegetal é seleccionada em que a dita uma molécula de ADN e o dito gene de marcador seleccionável são integrados estavelmente no genoma da célula vegetal, e em que a expressão do dito gene alvo na dita célula vegetal é reduzida quando os ditos fragmentos de ARN senso e antissenso são expressos a partir das ditas primeira e segunda sequências de ADN e os ditos fragmentos de ARN formam uma molécula de ARN de cadeia dupla; e ii) regenerar uma planta transformada geneticamente que compreende a dita uma molécula de ADN e o dito gene de marcador seleccionável. 6 21. 0 método de acordo com a reivindicação 20, ainda caracterizado por as características de acordo com qualquer das reivindicações 4 a 7.