KR20010071315A - 식물에서의 이본쇄 ｒｎａ-매개된 유전자 발현 조절 - Google Patents

식물에서의 이본쇄 ｒｎａ-매개된 유전자 발현 조절 Download PDF

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KR20010071315A
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큐뎅 퀘
프라몽 앙릭 쟌느 드
마타 엠 던
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한스 루돌프 하우스, 헨리테 브룬너, 베아트리체 귄터
노파르티스 아게
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Abstract

본 발명은 유전자의 센스와 안티센스 RNA 단편을 사용하여 식물에서 표적 유전자의 발현을 변경시키는 방법에 관한 것이다. 센스와 안티센스 RNA 단편은 쌍을 형성하여 이본쇄 RNA 분자를 형성함으로써, 유전자의 발현을 변경시킬 수 있다. 또한, 본 발명은 본 발명의 방법을 사용하여 수득한 식물, 이로 부터 유래된 이의 자손 및 종자에 관한 것이다.

Description

식물에서의 이본쇄 ＲＮＡ-매개된 유전자 발현 조절{DSRNA-mediated regulation of gene expression in plants}
본 발명은, 식물 유전자의 센스 및 안티센스 RNA 단편을 사용하여, 식물에서 유전자 발현을 변경시키는 방법, 및 본 발명의 방법을 사용하여 수득된, 유전자 발현이 변경된 식물에 관한 것이다.
분자 생물학 기술 및 식물 형질전환 기술이 발전함에 따라, 다양한 바람직한 특성, 예를 들면 해충 및 진균 또는 미생물 병원체에 대한 내성, 제초제에 대한 내성, 또는 부가가치 특징을 갖는 유전자전이된(transgenic) 식물을 생산할 수 있게 되었다. 이러한 바람직한 특성은 주로 식물에서 전이유전자(transgene)의 과발현에 의해 수득된다. 그러나, 어떤 경우에는, 특정 유전자의 발현을 변경시켜 상업적으로 유용한 바람직한 표현형 또는 특성을 갖는 식물이 수득되도록 식물을 개질시키는 것이 바람직할 수 있다. 유전자의 발현을 변경시키는 현재의 방법은 통상적으로 센스 또는 안티센스 억제 기술에 의존한다. 예를 들면, 페튜니아(Petunia)에서 칼콘 신타제 유전자의 센스 억제에 의해 꽃의 착색이 변경되며, 토마토에서 폴리갈락투로니다제 유전자의 안티센스 억제에 의해 과실의 숙성이 지연된다. 불행하게도, 이러한 방법은 종종 유전자 발현을 변경시키는 능력이 일정하지 않고 예측불가능하며, 많은 경우에 특정 유전자 활성이 완전히 붕괴되지 않는다. 유전자 발현을 변경시키기 위한 다른 방법으로는, 기술적으로 해볼만한, 촉매성 리보뉴클레오티드 또는 리보자임의 이용, 또는 유전공학적으로 가장 바람직할지라도, 상기 목적을 위해 통용되는 현재 이용 가능한 기술로는 안타깝게도 충분히 효율적이지 못한 상동 유전자의 파괴, 등이 있다. 따라서, 식물 세포중의 유전자를 효율적으로, 예측가능하게 변경시켜, 상업적으로 중요한 개량된 특성을 지닌 식물을 수득할 수 있는 새로운 방법에 대한 필요성을 오랫 동안 느껴왔지만 실현되지 못하였다.
본 발명은 분자 생물학 기술 및 유전자 형질전환을 사용하여 개선된 특성 및 특질을 지닌 식물을 제조하는 방법에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 식물 세포 유전자의 센스 및 안티센스 RNA 단편을 사용하여, 식물 세포내의 유전자의 발현을 변경시키는 방법에 관한 것이다. 중요하게도, 이러한 센스와 안티센스 RNA 단편은 이본쇄 RNA 분자를 형성할 수 있다. 또한, 본 발명은 이러한 방법을 사용하여 수득된 식물 세포, 이로한 세포로 부터 유래된 식물, 이러한 식물의 자손, 및 이러한 식물로 부터 유래된 종자에 관한 것이다. 이러한 식물 세포 또는 식물에서 특정 유전자의 발현을 변경시키는 것이 현재 당업계에서 공지된 방법을 사용하여 수득된 특정 유전자의 발현을 발현을 변경시키는 것 보다 더욱 효과적이고, 선택적이고, 예측가능하다.
따라서, 본 발명은 다음을 제공한다:
이본쇄 RNA 분자를 형성할 수 있는, 표적 유전자의 센스 RNA 단편 및 표적 유전자의 안티센스 RNA 단편을 식물 세포내로 도입함을 특징으로 하여, 식물 세포내에서 이들 표적 유전자의 발현을 변경시키는 방법. 바람직한 태양에서, 이들 RNA 단편은 두개의 상이한 RNA 분자로 이루어진다. 또 다른 바람직한 태양에서, 이들 RNA 단편은 상기 세포내로 도입되기 전에 혼합된다. 또 다른 바람직한 태양에서, 이들 RNA 단편은 상기 세포내로 도입되기 전에, 이본쇄 RNA 분자를 형성할 수 있는 조건하에서 혼합된다. 또 다른 바람직한 태양에서, 이들 RNA 분자는 상기 세포내로 연속적으로 도입된다. 또 다른 바람직한 태양에서, 이들 RNA 단편은 하나의 RNA 분자로 이루어진다. 이 경우에, 바람직하게는, 이 RNA 분자는, 이중에 포함된 RNA 단편이 이본쇄 RNA 분자를 형성하도록 폴딩(folding)될 수 있다.
추가로 본 발명은 다음을 제공한다:
표적 유전자의 센스 RNA 단편을 식물 세포에서 발현시킬 수 있는 제1 DNA 서열 및 표적 유전자의 안티센스 RNA 단편을 식물 세포에서 발현시킬 수 있는 제2 DNA 서열(여기서, 센스 RNA 단편과 안티센스 RNA 단편은 이본쇄 RNA 분자를 형성할 수 있다)을 식물 세포내로 도입함을 특징으로 하여, 상기 식물 세포내에서 이들 표적 유전자의 발현을 변경시킬 수 있는 방법. 바람직한 태양에서, 이들 DNA 서열은 식물 세포의 게놈내에 안정하게 통합된다. 바람직한 태양에서, 이들 DNA 분자는 상기 제1 및 제2 DNA 서열에 작동적으로 연결된 프로모터를 추가로 포함한다. 또 다른 바람직한 태양에서, 제1 DNA 및 제2 DNA는 두 개의 상이한 DNA 분자로 이루어진다.
달리, 제1 DNA 서열 및 제2 DNA 서열은 하나의 DNA 분자로 이루어진다. 이 경우에, 제1 DNA 서열 및 제2 DNA 서열은 바람직하게는 상기 DNA 분자의 동일한DNA 쇄로 이루어지며, 센스 RNA 단편 및 안티센스 RNA 단편은 바람직하게는 하나의 RNA 분자로 이루어진다. 바람직하게는, 이 RNA 분자는 이중에 포함된 RNA 단편이 이본쇄 영역을 형성하도록 폴딩될 수 있다. 또 다른 바람직한 태양에서, 이들 센스 RNA 단편 및 안티센스 RNA 단편은 두개의 RNA 분자로 이루어지거나, 두개의 RNA 분자로서 발현된다. 이 경우에, 바람직하게는, 제1 DNA 서열 및 제2 DNA 서열은 양방향성 프로모터에 작동적으로 연결되거나, 또는 달리 제1 DNA 서열 및 제2 DNA 서열은, 각각 제1 프로모터 및 제2 프로모터(제1 프로모터 및 제2 프로모터는 동일하거나 상이한 프로모터이다)에 작동적으로 연결된다. 또 다른 바람직한 태양에서, 제1 DNA 서열 및 제2 DNA 서열은 상기 DNA 분자의 상보적 쇄로 이루어진다.
또 다른 바람직한 태양에서, 제1 DNA 서열은 상기 DNA 분자중의 제2 DNA 서열의 상보적 DNA 쇄이다. 이 경우에, 이 DNA 분자는 제1 DNA 서열에 작동적으로 연결된 제1 프로모터를 추가로 포함한다. 바람직한 태양에서, 이 DNA 분자는 제1 프로모터와 제1 DNA 서열사이에 제1 부위-특이적 재조합 부위를 포함하고, 제1 DNA 서열의 3'-말단에 제2 부위-특이적 재조합 부위를 포함하는데, 이 제1 및 제2 부위-특이적 재조합 부위는 부위-특이적 재조합효소(recombinase)의 존재하에 제1 및 제2 부위-특이적 재조합 부위사이의 상기 제1 DNA 서열을 역전시킬 수 있으며, 바람직하게는 서로에 대해 역전된 방향일 수 있다. 또 다른 바람직한 태양에서, 상기 제1 프로모터를 역전시킨 결과로서, 상기 제2 DNA 서열이 발현될 수 있다. 식물 세포는 바람직하게는 상기 부위-특이적 재조합 부위를 인식할 수 있는 부위-특이적 재조합효소를 추가로 포함한다.
또 다른 바람직한 태양에서, 상기 DNA 분자는, 제1 DNA 서열 및 제2 DNA 서열에 각각 작동적으로 연결된 제1 프로모터 및 제2 프로모터(제1 프로모터 및 제2 프로모터는 동일하거나 상이한 프로모터이다)를 추가로 포함한다.
또 다른 바람직한 태양에서, 상기 표적 유전자는 상기 식물 세포의 고유 유전자, 바람직하게는 상기 식물 세포의 필수 유전자이다. 또 다른 바람직한 태양에서, DNA 분자중의 프로모터는 상기 고유 표적 유전자의 고유 프로모터를 포함한다. 또 다른 바람직한 태양에서, 프로모터는 이종성 프로모터, 예를 들면 조직 특이적 프로모터, 발생 단계상 조절되는 프로모터, 구성적(constitutive) 프로모터 또는 유도성 프로모터이다. 임의로, 프로모터는, DNA 서열의 전사를 당해 프로모터의 각 측면에서 개시시킬 수 있는 분기성 프로모터이다. 또 다른 바람직한 태양에서, 상기 유전자는, 바람직하게는 식물 세포의 게놈내에 안정하게 통합되거나, 또는 달리 염색체외 분자로서 식물 세포내에 존재하는 상기 식물 세포중의 이종성 유전자이다.
또 다른 바람직한 태양에서, 상기 DNA 서열은 상기 센스와 안티센스 RNA 단편을 암호화하는 DNA 서열사이의 링커를 포함한다. 당해 링커는 예컨대 기능 유전자(예: 선별가능한 마커 유전자) 또는 조절 서열(예: 인트론 프로세싱 시그날)을 포함하는 발현 카세트를 포함한다.
또한, 본 발명은 다음을 추가로 제공한다:
본 발명의 센스 및 안티센스 RNA 단편을 포함함으로써, 이 RNA 단편에 의해 식물 세포내에서 상기 표적 유전자의 발현이 변경된 식물 세포, 이러한 식물 세포로 부터 유래된 식물과 이의 자손, 및 이러한 식물로 부터 유래된 종자.
본 발명은 또한 다음을 제공한다:
본 발명의 방법에 의해 수득된 식물 세포.
"이본쇄 RNA(dsRNA)" 분자는 표적 유전자의 센스 RNA 단편 및 표적 유전자의 안티센스 RNA 단편을 포함하며, 이 두 단편은 서로에 상보적인 뉴클레오티드 서열을 포함하기 때문에, 센스와 안티센스 RNA 단편들이 쌍을 이루어 이본쇄 RNA 분자가 형성될 수 있는 것이다.
"상보적"이란 역평행의 뉴클레오티드 서열중의 상보적 염기 잔기간의 수소 결합의 형성시 서로와 쌍을 형성할 수 있는 역평행의 뉴클레오티드 서열을 의미한다.
본원에서 "역평행"이란 상보적인 염기 잔기간의 수소 결합을 통하여 쌍을 형성하는 두 개의 뉴클레오티드 서열이 하나의 뉴클레오티드 서열에서는 5'-3' 방향으로, 다른 뉴클레오티드 서열에서는 3'-5' 방향으로 포스포디에스테르 결합에 의해 연결된 것을 의미한다.
"표적 유전자"는 식물 세포중의 임의의 유전자이다. 예를 들면, 표적 유전자는 공지된 기능을 갖는 유전자이거나, 또는 기능이 공지되지는 않았으나 전체 또는 일부 뉴클레오티드 서열이 공지된 유전자이다. 달리, 표적 유전자의 기능 및 이의 뉴클레오티드 서열이 모두 공지되지 않은 것이다. 표적 유전자는 식물 세포의 고유 유전자이거나, 또는 식물 세포 또는 당해 식물 세포의 모(母)세포내로 예컨대 유전자 형질전환에 의해 사전에 도입되어진 이종성 유전자이다. 이종 표적유전자는 식물 세포의 게놈내에 안정하게 통합되거나, 또는 식물 세포내에서 염색체외 분자(예: 자가복제형 염색체외 분자)로서 존재한다.
"고유" 유전자는 형질전환되지 않은 식물 세포의 게놈내에 존재하는 유전자이다.
"필수" 유전자는 생합성 효소, 수용체, 시그날 전달 단백질, 구조 유전자 단백질, 또는 식물의 성장 및 생존에 필수적인 수송 단백질과 같은 단백질을 암호화하는 유전자이다.
식물 세포중의 표적 유전자의 발현을 "변경"시킨다는 것은, 본 발명의 방법을 적용한 후 식물 세포중의 표적 유전자의 발현 수준이 본 방법을 적용하기 전의 세포에서의 발현과는 상이한 것을 의미한다. 유전자 발현을 변경시킨다는 것은 아마도 식물내의 표적 유전자의 발현이 감소되는 것, 바람직하게는 강하게 감소되는 것, 보다 바람직하게는 유전자 발현이 검출될 수 없는 것을 의미한다. 필수 유전자의 발현이 변경됨으로써 식물 세포 또는 이로부터 유래된 식물에서 녹아웃(knockout) 돌연변이 표현형이 나타날 수 있다.
본 발명과 관련하여, "분리된"이란 자연 환경으로 부터 인공적으로 분리되어 존재하므로, 천연 생성물이 아닌 분리된 핵산 분자이다. 분리된 핵산 분자는 정제된 형으로 존재할 수 있거나, 또는 비-자연 환경, 예를 들어 유전자전이된 숙주 세포내에 존재할 수 있다.
본원에서 사용된 "발현 카세트"란 프로모터 및 종결 시그날에 작동적으로 연결된 목적 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 적당한 숙주 세포내에서 특정 뉴클레오티드 서열의 발현을 지시할 수 있는 DNA 서열을 의미한다. 또한, 이는 뉴클레오티드 서열의 적절한 해독에 요구되는 서열을 포함하는 것이 통상적이다. 암호 염역은 통상적으로 해당 단백질을 암호화하지만, 기능성 RNA(예: 안티센스 RNA 또는 해독되지 않는 RNA)를 센스 또는 안티센스 방향으로 암호화할 수도 있다. 목적하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 발현 카세트는 키메라성일 수 있다, 즉 이의 성분의 하나 이상이 이의 다른 성분의 하나 이상과 이종성일 수 있다. 또한, 발현 카세트는 천연적으로 존재하는 것일 수 있으나, 이종성 발현에 유용한 재조합 형태로 수득되어 왔다. 그러나, 전형적으로 발현 카세트는 숙주의 관점에서는 이종성이다, 즉 발현 카세트의 특정 DNA 서열은 숙주 세포내에 천연적으로 존재하지 않으며, 숙주 세포 또는 숙주 세포의 조상내로 형질전환에 의해 도입되어져야 한다. 발현 카세트중의 뉴클레오티드 서열의 발현은, 구성적 프로모터하, 또는 숙주 세포가 어떤 특정한 외부 자극에 노출되는 경우에만 전사를 개시시키는 유도성 프로모터하에 일어날 수 있다. 다세포 생명체, 예를 들면 식물의 경우에, 프로모터는 특정 조직이나 기관, 또는 특정 발생 단계에 특이적일 수 있다.
본원에서 사용된 "이종성"은 "발생 기원이 상이한" 것을 의미하고, 비-자연 상태를 가리킨다. 예를 들면, 숙주 세포가 다른 생명체, 특히 다른 종으로 부터 유래된 핵산 서열로 형질전환되는 경우, 당해 핵산 서열은 숙주 세포의 관점에서 이종성이고, 또한 이러한 핵산 서열을 수반하는 숙주 세포의 후손의 관점에서도 이종성이다. 유사하게, 이종성이란, 뉴클레오티드 서열이 동일한 천연의 고유 세포 유형으로 부터 유래되고 삽입되더라도, 비-천연 상태(예: 상이한 복사체 수)로 존재하거나 상이한 조절 요소의 조절하에 존재하는 것을 의미한다.
뉴클레오티드 서열에 관하여 본원에서 사용된 "실질적으로 유사한"이란, 가장 넓은 의미로, 기준 뉴클레오티드 서열에 상응하는 뉴클레오티드 서열이 기준 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화되는 폴리펩티드와 실질적으로 동일한 구조 및 기능을 갖는 폴리펩티드(예컨대, 폴리펩티드의 기능에 영향을 주지 않는 아미노산의 변화만이 존재)를 암호화하는 것을 의미한다. 바람직하게는, 실질적으로 유사한 뉴클레오티드 서열은 기준 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화되는 폴리펩티드를 암호화한다. 실질절으로 유사한 뉴클레오티드 서열과 기준 뉴클레오티드 서열간의 동일성의 %(상보적 서열중의 염기의 총수로 나눈 상보적 서열중의 상보적 염기의 수)는 적절하게는 80%이상, 보다 적절하게는 85%이상, 바람직하게는 90%이상, 보다 바람직하게는 95%이상, 보다 더 바람직하게는 99%이상이다.
"조절 서열"이란 뉴클레오티드 서열의 발현과 관련된 서열을 의미한다. 조절 서열은 목적 뉴클레오티드 서열에 작동적으로 연결된 프로모터 및 종결 시그날을 포함한다. 이들은 또한 통상적으로 뉴클레오티드 서열의 적절한 해독에 요구되는 서열을 포함한다.
"식물"이란 임의의 발생 단계에 있는 임의의 식물 또는 이의 일부를 의미한다. 또한, 이들에는 삽수(cuttings), 세포 또는 조직 배양물 및 종자가 포함된다. 본 발명과 관련하여 사용된, 용어 "식물 조직"에는 식물 전체, 식물 세포, 식물 기관, 식물 종자, 원형질, 칼루스, 세포 배양물, 및 구조 및/또는 기능 단위로 조직화된 임의의 식물 세포 그룹이 포함되지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명은 식물 세포에서 유전자 발현을 조절하는 방법에 관한 것이다. 식물 세포에서 유전자 발현을 조절하는데 통상적으로 이용가능한 방법은 예견가능성이 부족하고, 조절될 유전자에 따라 달라질 수 있는 가변성을 보여준다. 본 발명의 방법은 이러한 문제점을 감소시키며, 식물 세포중의 유전자를 재현가능하고 효율적으로 조절하는 방법을 제공한다.
본 발명은, 표적 유전자의 센스 RNA 단편과 안티센스 RNA 단편을 이용하여 식물 세포중의 유전자의 발현을 변경시킨다. 제1 태양에서, 본 발명은, 식물 세포내로 표적 유전자의 센스 RNA 단편과 표적 유전자의 안티센스 RNA 단편(이들 센스 RNA 단편과 안티센스 RNA 단편은 이본쇄 RNA 분자를 형성할 수 있다)을 도입하여 상기 세포에서 상기 표적 유전자의 발현을 변경시킴을 특징으로 하여, 식물 세포에서 표적 유전자의 발현을 변경시키는 방법에 관한 것이다. 바람직한 태양에서, RNA 단편은 상이한 형질전환 방법에 의하여 식물 세포내로 도입된다. 예를 들면, RNA 단편은, 공동계류중인 제08/717,676호에 기술된 바와 같이, 입자 폭격(particle bombardment)에 의해 숙주 세포내로 전달된다. 또 다른 바람직한 태양에서, RNA 단편은 PEG-매개된 형질전환[참조: Lebel et al.(1995) Theor. Appl. Genet. 91: 899-906] 또는 전기천공에 의해 원형질체 또는 기타 유형의 세포내로 도입된다. 또 다른 바람직한 태양에서, 다른 기술, 예를 들면 RNA 단편의 미세주입이 사용된다.
또 다른 바람직한 태양에서, RNA 단편은 두 개의 상이한 RNA 분자로 이루어진다. 이 경우에, RNA 단편을 상기 세포내로 도입하기 전에, 예컨대 이들이 이본쇄 RNA 분자를 형성할 수 있는 조건하에서 혼합한다. 또 다른 바람직한 태양에서, RNA 단편을 상기 세포내로 연속적으로 도입한다. 바람직하게는, 각각의 RNA 분자의 도입사이의 시간 간격은 짧으며, 바람직하게는 1시간 미만이다. 또 다른 태양에서, RNA 단편은 하나의 RNA 분자로 이루어진다. 하나의 단일 RNA 분자를 사용하여, 두 개의 상보적인 RNA 단편이 쌍을 형성하여 이본쇄를 형성하기에 알맞도록 매우 근접하게 위치시킨다. 이러한 경우에, 바람직하게는, RNA 분자는 이중에 포함된 RNA 단편이 이본쇄 영역을 형성하도록 폴딩될 수 있다. 이 경우에, RNA 단편의 상보적 부분은 서로를 인식하고, 서로 쌍을 형성하여 이본쇄 RNA 분자를 형성한다. 바람직한 태양에서, RNA 단편을, 세포내로 도입하기 전에 이들이 이본쇄 RNA 분자를 형성할 수 있는 조건하에서 항온처리한다. 또 다른 태양에서, RNA 분자는 센스 RNA 단편과 안티센스 RNA 단편사이에 링커를 포함한다. 이 링커는 바람직하게는 기능성 유전자(예: 선별가능한 마커 유전자)를 포함하는 발현 카세트에 의해 암호화되는 RNA 서열을 포함한다. 또 다른 태양에서, 이 링커는, 예를 들면 인트론 프로세싱 시그날을 포함하는 조절 서열에 의해 암호화되는 RNA 서열을 포함한다.
또 다른 바람직한 태양에서, 본 발명은, 표적 유전자의 센스 RNA 단편을 식물 세포에서 발현시킬 수 있는 제1 DNA 서열 및 표적 유전자의 안티센스 RNA 단편을 식물 세포에서 발현시킬 수 있는 제2 DNA 서열(여기서, 센스 RNA 단편과 안티센스 RNA 단편은 이본쇄 RNA 분자를 형성할 수 있다)을 식물 세포내로 도입함을 특징으로 하여, 상기 세포에서 상기 표적 유전자의 발현을 변경시키는 방법을 제공한다. 바람직한 태양에서, 제1 DNA 서열 및 제2 DNA 서열은 식물 세포의 게놈내에안정하게 통합된다. 또 다른 바람직한 태양에서, 제1 DNA 서열 및 제2 DNA 서열은 염색체외 분자(예: 자가 복제형 분자)로서 식물 세포내에 존재한다. 달리, 제1 DNA 서열은 식물 세포의 게놈내에 안정하게 통합되고 제2 DNA 서열은 염색체외 분자로서 식물 세포내에 존재한다.
또 다른 바람직한 태양에서, DNA 서열은 두 개의 상이한 DNA 분자로 이루어진다. 이 경우에, 제1 DNA 서열은 제1 프로모터에 작동적으로 연결되고, 제2 DNA 서열은 제2 프로모터에 작동적으로 연결된다. 바람직한 태양에서, 두 개의 프로모터는 동일한 프로모터를 포함하거나, 또는 달리 상이한 프로모터를 포함한다. 또한, 종결 시그날은 임의로 상기 DNA 분자중에 포함될 수 있다.
또 다른 바람직한 태양에서, 상기 DNA 서열은 하나의 DNA 분자로 이루어진다. 바람직하게는, 제1 및 제2 DNA 서열은 DNA 분자의 동일한 DNA 쇄로 이루어지고, 바람직하게는 센스 RNA 단편 및 안티센스 RNA 단편은 상기 DNA 분자에 의해 암호화된 하나의 RNA 분자로 이루어지거나, 하나의 RHA 분자로서 발현된다. 이 경우에, DNA 분자는 제1 또는 제2 DAN 서열에 작동적으로 연결되어, 제1 및 제2 DNA 서열을 전사시킬 수 있는 프로모터를 추가로 포함한다. 프로모터는, 센스 단편을 암호화하는 DNA 서열에 작동적으로 연결된 안티센스 단편을 암호화하는 DNA 서열에 작동적으로 연결된다. 달리, 프로모터는, 안티센스 단편을 암호화하는 DNA 서열에 작동적으로 연결된 센스 단편을 암호화하는 DNA 서열에 작동적으로 연결된다. 하나의 단일 RNA 분자를 사용하여, 두 개의 상보적 RNA 단편이 쌍을 형성하여 이본쇄를 형성하기에 알맞도록 매우 근접하게 위치시킨다.
달리, DNA 서열이 동일한 DNA 쇄로 이루어지는 경우, 두 개의 별개의 RNA 분자가 생성되는데, 이중 하나는 센스 RNA 단편을 포함하고, 다른 하나는 안티센스 RNA 단편을 포함한다. 이 경우에, 바람직하게는, DNA 분자는 RNA 단편을 발현시킬 수 있는 조절 요소를 추가로 포함한다. 바람직한 태양에서, 이러한 조절 요소는 센스 RNA 단편을 암호화하는 DNA 서열 및 안티센스 RNA 단편을 암호화하는 DNA 서열사이에 위치한 분기성, 양방향성 프로모터를 포함한다. 또 다른 바람직한 태양에서, 동일한 프로모터 또는 달리 상이한 프로모터를 포함하는 두 개의 별개의 프로모터가 상기 두개의 DNA 서열사이에 위치한다. 또 다른 바람직한 태양에서, 상기 DNA 분자는 제1 DNA 서열에 작동적으로 연결된 제1 프로모터 및 제2 DNA 서열에 작동적으로 연결된 제2 프로모터를 포함하며, 이 DNA 서열은 상기 두 개의 프로모터사이에 위치하며 이 두 개의 프로모터는 반대 방향으로 전사를 지시할 수 있다. 또 다른 태양에서, DNA 서열은 상기 두 개의 상보적인 RNA 단편을 암호화하는 DNA 서열사이에 링커를 추가로 포함할 수 있다. 링커는 바람직하게는 기능성 유전자(예: 선별가능한 마커 유전자)를 포함하는 발현 카세트를 포함한다. 또 다른 태양에서, 링커는 예컨대 인트론 프로세싱 시그날을 포함하는 조절 서열을 포함한다.
또 다른 바람직한 태양에서, 제1 및 제2 DNA 서열은 DNA 분자의 상보적인 DNA 쇄로 이루어진다. 보다 바람직하게는, 제1 DNA 서열은 DAN 분자중의 제2 DNA 서열의 상보적 쇄이다. 예를 들면, 이 경우에, 제1 DNA 서열은 표적 유전자의 단편의 암호 쇄에 상응하고 센스 RNA 단편을 발현시킬 수 있으며, 제2 DNA 서열은 표적 유전자의 상보적 비-암호화 쇄에 상응하고 안티센스 RNA 단편을 발현시킬 수 있다. 따라서, 이 경우에, 두 개의 상이한 RNA 분자가 바람직하게 생성된다. 따라서, 본원에서 DAN 분자는 제1 DNA 서열의 5' 말단에 작동적으로 연결되고 제1 DNA 서열을 발현시킬 수 있는 제1 프로모터, 및 제1 DNA 서열의 3'말단에 작동적으로 연결되고 제1 DNA 서열의 상보적 쇄인 제2 DNA 서열을 발현시킬 수 있는 제2 프로모터를 포함한다. 바람직한 태양에서, 두 개의 상이한 프로모터가 사용되며, 또는 달리 동일한 프로모터를 사용하여 두 개의 DNA 서열을 발현시킨다. 또 다른 바람직한 태양에서, DNA 분자는 프로모터의 말단 부위에 전사 터미네이터를 추가로 포함한다. 바람직하게는, 이 경우에, 하나의 프로모터의 3'말단에서 전사가 개시되어, DNA 서열을 통해 일방향으로 진행되며, 제2 프로모터를 통해 3'말단으로 부터 5'말단으로 진행되어, 제2 프로모터의 5'말단상의 전사 터미네이터에서 종결된다. 전사 터미네이터의 용도는 전사된 RNA를 안정화시키는 것이다.
또 다른 바람직한 태양에서, DNA 분자는 제1 DNA 서열에 작동적으로 연결된 프로모터를 추가로 포함하고, 이 프로모터와 제1 DNA 서열사이에 제1 부위-특이적 재조합 부위를 포함하고, 제1 DNA 서열의 3'-말단에 제2 부위-특이적 재조합 부위를 포함하는데, 이 제1 및 제2 부위-특이적 재조합 부위는 부위-특이적 인식 부위를 인식할 수 있는 부위-특이적 재조합효소의 존재하에 제1 및 제2 부위-특이적 재조합 부위사이의 상기 제1 DNA 서열을 역전시킬 수 있다. 재조합효소의 부재하에서, 제1 DNA 서열에 의해 암호화된 센스 RNA 단편만이 생성될 수 있다. 상응하는 재조합효소의 존재하에서, 부위-특이적 재조합 부위사이의 DNA 서열이 역전되고 제2 DNA 서열이 프로모터에 작동적으로 연결되어 안티센스 단편이 발현된다. 지속적인 재조합효소의 존재하에서, DNA 서열의 추가적 역전이 일어나고, 센스와 안티센스 RNA 단편이 축적된다. 따라서, 본 발명은 상기 부위-특이적 재조합 부위를 인식할 수 있는 부위-특이적 재조합효소를 추가로 포함하는 식물 세포를 또한 제공한다. 본 발명의 이러한 태양은 실시예 5에서 상세히 설명된다.
본 발명의 DNA 분자에서, 바람직하게는 DNA 서열은 프로모터에 작동적으로 연결된다. 바람직한 태양에서, 이본쇄 RNA가 표적 유전자가 발현되는 것과 동일한 조직 및 동일한 발생 단계에 존재하도록 하기 위하여, DNA 분자중의 프로모터가 불활성화될 고유 표적 유전자의 고유 프로모터를 포함한다. 또 다른 태양에서, 프로모터는 이종성 프로모터, 예를 들면 조직 특이적 프로모터, 발생단계상 조절되는 포로모터, 구성적 프로모터, 분기성 또는 유도성 프로모터이다. 또 다른 바람직한 태양에서, 유전자는 상기 식물 세포중의 이종성 유전자이다. 종결 시그날도 또한 임의로 DNA 분자내에 포함된다.
단일 RNA 분자 또는 두 개의 별개의 RNA 분자는 바람직하게는 이본쇄 영역을 형성할 수 있으며, 이 영역중 RNA 단편의 상보적 부분이 서로를 인식하고 서로 쌍을 형성하여 이본쇄 RNA 분자를 형성한다. 본 발명의 DNA 분자를 당업계에서 익히 공지된 방법 또는 후술된 방법을 사용하여 식물 세포내로 도입하여 형질전환시킨다. 예를 들면, 미세투사체 폭격(microprojectile bombardment), 미세주입 또는 아가로박테리움-매개된 형질전환이 사용된다. 또한, 전기천공 또는 화학적 처리(예: PEG 처리)를 사용하는, 본 발명의 DNA 분자에 의한 원형질체의 형질전환이 사용된다.
달리, 바이러스 벡터를 사용하여, 본 발명의 DNA 분자 또는 RNA 단편을 식물 세포내로 도입하며, 이는 소위 아그로인펜셕(agroinfection)이라 불린다. 또 다른 바람직한 태양에서, 본 발명의 DNA 분자 또는 RNA 단편을 진공 침투 또는 잎 표면상에서의 마찰에 의해 식물 세포내로 도입한다. 상기 방법에 의해, 본 발명의 센스와 안티센스 RNA 단편을 포함함으로써, 식물 세포에서의 표적 유전자의 발현이 상기 RNA 단편에 의해 변경되어진 식물 세포, 이 식물 세포로 부터 유래된 식물과 이의 자손, 및 이 식물로 부터 유래된 종자가 수득될 수 있다.
본 발명에서, 센스와 안티센스 RNA 단편간의 상보적 영역의 길이는 적절하게는 15개 이상의 뉴클레오티드 길이, 보다 적절하게는 50개 이상의 뉴클레오티드 길이, 바람직하게는 500bp 길이를 포함한다. 바람직하게는, 상보적 영역은 5kb미만이고, 보다 바람직하게는 2kb 미만이다. 임의로, 센스와 안티센스 RNA 단편간의 상보적 영역은 표적 유전자의 암호 영역을 포함한다. 다른 바람직한 태양에서, 상보적 영역은 표적 유전자의 해독되지 않는 영역(UTR), 예를 들면 5'UTR 또는 3'UTR을 포함한다. 또 다른 바람직한 태양에서, 본 발명의 센스 또는 안티센스 RNA 단편을 암호화하는 DNA 서열은 c-DNA 분자로 부터 유래된다. 또 다른 태양에서, 상보적 서열은, 발현이 변경되는 표적 유전자의 조절 요소, 예를 들면 프로모터 또는종결 시그날을 포함한다.
또 다른 바람직한 태양에서, 센스와 안티센스 RNA 단편간의 상보적 영역은 발현이 변경되는 유전자의 상응하는 서열과 동일하다. 또 다른 바람직한 태양에서, 센스와 안티센스 RNA 단편간의 상보적 영역은 발현이 변경되는 유전자의 상응하는 서열과 실질적으로 유사하고, 또한 유전자의 발현을 변경시킬 수 있다. 이 경우에, 상보적 영역은, 발현이 변경되는 유전자의 상응하는 서열과 적절하게는 50% 이상 동일하고, 보다 적절하게는 70%이상 동일하고, 바람직하게는 90%이상 동일하고, 보다 바람직하게는 95%이상 동일하다. 이 때문에, 단일 이본쇄 RNA 분자를 사용하는 경우, 단일 유전자 또는 다수 유전자의 발현을 변경시킬 수 있으며, 이 때의 단일 유전자는 이본쇄 RNA와 동일한 서열을 포함하거나, 또는 이본쇄 RNA와 실질적으로 유사하다.
또 다른 바람직한 태양에서, 센스와 안티센스 RNA 단편간의 상보적 영역은 센스와 안티센스 RNA 단편간의 어떠한 불합치도 포함하지 않는다. 또 다른 바람직한 태양에서, 센스와 안티센스 RNA 단편간의 상보적 영역은 센스와 안티센스 RNA 단편간의 하나 이상의 불합치를 포함하고, 두 개의 RNA 단편은 여전히 쌍을 형성하여 이본쇄 RNA 분자를 형성할 수 있으므로, 유전자의 발현이 변경될 수 있다. 적절하게는, 상보적 영역중의 센스와 안티센스 RNA 단편간의 불합치는 50% 미만이고, 보다 적절하게는 불합치가 30% 미만이고, 바람직하게는 불합치가 20% 미만이고, 보다 바람직하게는 불합치가 10% 미만이고, 보다 더 바람직하게는 불합치가 5% 미만이다.
본 발명의 방법을 사용하여, 예를 들어 식물의 대사 경로, 질환에 대한 식물의 내성 또는 민감성, 또는 세포 분화에 관련된 유전자의 발현을 변경시킬 수 있다. 이러한 변경의 결과로서, 상업적으로 중요한 개선된 특성, 예를 들면 특정 대사 경로의 변형, 질환에 대한 내성, 또는 세포 분화의 변화를 갖는 식물이 수득된다. 표적 유전자의 다른 예는, 본원에 참조로서 인용된 미국 특허 제5,107,065호, 제5,283,184호, 및 제5,034,323호에 기술되어 있다. 본 발명의 방법은, 유전자의 기능을 밝히기 위하여, 유전자의 발현을 변경시키는데 사용된다. 이 경우에, 예를 들면, 유전자의 센스와 안티센스 RNA 단편을 발현시킬 수 있는 DNA 서열을, 당업계에 공지된 또는 후술된 형질전환 방법을 사용하여 식물 세포내로 도입한다. DNA 서열은, 예를 들면 식물 세포의 게놈내로 안정하게 통합된다. 이어서, 식물 세포를 표현형 변화 또는 대사 변화에 대하여 검사한다. 달리, 식물을 상기 식물 세포로 부터 재생시키고, 이 식물 또는 이의 후손을 표현형 변화 또는 대사 변화에 대해 검사한다. 예를 들면, 상기 방법을 사용하고, 형질전환된 식물을, 예컨대 배아 치사성, 묘목 치사성 또는 기타 관련 표현형에 대해 스크리닝하여 필수 유전자를 발견한다. 이어서, 유전자의 기능에 대한 지식을 이용하여, 유전자 형질전환에 의해 개선된 특성을 갖는 작물을 생산하거나 또는 신규 화합물에 대해 스크리닝한다. 특히, 필수 유전자는 제초제 화합물에 대한 표적으로서 우수한 후보이다. 필수 유전자 서열은, 예를 들면 식물에서 과발현되어, 당해 유전자에 의해 암호화되는 천연 효소의 기능을 억제하는 제초제 화합물에 대해 식물에 내성을 부여한다. 필수 유전자의 돌연변이체가 또한 생산되며, 제초제 화합물 또는 관련 화합물에 대한 내성에 대해 스크리닝한다. 이러한 돌연변이체는 당업계에서 공지된 다양한 방법에 의해 생산된다. 또한, 필수 유전자에 의해 암호화된 효소를 사용하여, 이의 기능을 억제하는 화합물에 대해, 예를 들어 시험관내 고 효율 스크닌으로 스크리닝한다. 이어서, 억제 화합물을 제초제 활성에 대해 시험한다.
또한, 본 발명의 방법을 사용하여, 유전자의 뉴클레오티드 서열에 대한 사전 지식없이 유전자의 발현을 무작위로 변경시킨다. 이 경우에, 쌍을 형성하여 이본쇄 RNA 분자를 형성할 수 있는 무작위적 RNA 단편의 라이브러리, 또는 쌍을 형성하여 이본쇄 RNA 분자를 형성할 수 있는 RNA 단편을 암호화하는 무작위적 DNA 서열의 라이브러리를 제조하여, 당업계에서 공지된 또는 후술된 방법을 사용하여 식물 세포내로 도입한다. 형질전환된 식물 세포 또는 식물을 특정 성질 또는 표현형에 대해 스크리닝한다. 예를 들면, 상기한 바와 같은 필수 유전자는 이러한 스크린을 사용하여 발견할 수 있다. 스크린의 또 다른 예는 다양한 조건, 예를 들면 높은 염분압 또는 삼투압, 고온, 독성 또는 유해한 물질(예: 제초제 화합물)의 존재하에서 형질전환되지 않은 세포에 비해 덜 제한되는 성장, 또는 제한되지 않는 성장에 관한 것이다. 이러한 스크린 후, 이본쇄 RNA, 또는 이본쇄 RNA를 암호화하는 DNA 분자를 회수하고 상보적 RNA 단편의 서열을 측정함으로써, 발현의 변경이 특정 성질 또는 표현형과 관련이 있는 유전자를 분리할 수 있다. 이어서, 이러한 유전자를 사용하여, 예를 들어 유전자 형질전환에 의해 작물을 개량하거나 또는 신규 화합물을 스크리닝한다.
식물 형질전환 기술
본 발명의 DNA 분자를, 종래의 재조합 DNA 기술을 사용하여 식물 또는 박테리아 세포내에 도입한다. 일반적으로, 본 발명의 DNA 분자는 형질전환 벡터내에 포함된다. 당업계에서 공지된 다수의 벡터 시스템, 예를 들면 플라스미드, 박테리오파아지 바이러스 및 기타 개질된 바이러스가 사용된다. 발현 시스템의 성분도 또한 센스와 안티센스 RNA 단편의 발현을 증가시키도록 변형된다. 예를 들면, 절두된(truncated) 서열, 뉴클레오티드 치환체 또는 기타 변형체가 사용된다. 당업계에서 공지된 발현 시스템을 사용하여 적당한 조건하에서 임의의 작물 세포를 실질적으로 형질전환시킨다. 본 발명의 DNA 분자를 포함하는 전이유전자는 바람직하게는 안정하게 형질전환되어 숙주 세포의 게놈내에 통합된다. 또 다른 바람직한 태양에서, 본 발명의 DNA 분자를 포함하는 전이유전자는 자가-복제형 벡터상에 위치한다. 자가-복제형 벡터는 바이러스, 특히 쌍생(gemini) 바이러스이다. 형질전환된 세포는 바람직하게는 완전한 식물체로 재생된다.
본 발명에 따라 형질전환된 식물은 단자엽 또는 쌍자엽일 수 있으며, 옥수수, 밀, 보리, 호밀, 고구마, 콩, 완두콩, 치코리, 상추, 양배추, 꽃양배추, 브로콜리, 순무, 무, 시금치, 아스파라거스, 양파, 마늘, 후추, 셀러리, 호박속 과실, 펌프킨, 삼, 주키니, 사과, 배, 마르멜로, 멜론, 서양자두, 버찌, 복숭아, 유도, 살구, 딸기, 포도, 나무딸기, 검은딸기, 파인애플, 아보카도, 파파야, 망고, 바나나, 대두, 토마토, 수수, 사탕수수, 사탕무, 해바라기, 평지, 클로버, 담배, 당근, 목화, 자주개자리, 벼, 감자, 가지, 오이, 아라비돕시스(Arabidopsis), 및 침엽수 및 낙엽수와 같은 수목이 포함되나, 이에 한정되는 것은 아니다. 일단 목적하는 뉴클레오티드 서열이 특정 식물 종으로 도입되어 이를 형질전환시켜면, 이 뉴클레오티드 서열은 그 식물 종에서 유전되거나, 전통적 육종 기술을 사용하여, 동일한 종의 다른 변종, 특히 상업용 변종으로 번식시킬 수 있다.
A. 식물 발현 카세트의 작제를 위한 요건
먼저, 유전자전이된 식물에서 발현시키고자 하는 유전자 서열을, 발현 카세트중 식물에서 발현될 수 있는 적당한 프로모터 하부에 조립시킨다. 또한, 발현 카세트는 전이유전자의 발현을 위해 요구되거나 선택된 임의의 서열을 추가로 포함할 수 있다. 이러한 서열로는, 전사 터미네이터, 발현을 증가시키기 위한 부수서열(예: 인트론), 필수 서열, 및 유전자 생성물을 특정 소기관 및 세포 구획으로 표적화하기 위한 서열이 포함되나, 이에 한정되는 것은 아니다. 이들 발현 카세트는 이하 문헌에 기술된 식물 형질전환 벡터내로 용이하게 전달될 수 있다. 전형적인 발현 카세트의 각종 성분에 관한 기술은 다음과 같다.
1. 프로모터
발현 카세트에 사용된 프로모터의 선택에 따라, 유전자전이된 식물에서 전이유전자의 공간적 및 시간적 발현 패턴이 결정된다. 선택된 프로모터는 특정 세포 유형(예: 잎의 표피 세포, 엽육 세포, 뿌리 피층 세포) 또는 특정 조직 또는 기관(예: 뿌리, 잎 또는 꽃)에서 전이유전자를 발현시키며, 이러한 선택에 의해 유전자 생성물이 목적하는 위치에 축적될 수 있다. 달리, 선택된 프로모터는 각종 조건하에서 유전자의 발현을 유도한다. 프로모터는 이의 세기, 즉 전사를 촉진하는 능력면에서 다양하다. 이용된 숙주 세포 시스템에 따라, 당업계에서 공지된 다수의 적합한 프로모터중 하나가 사용된다. 예를 들면, 구성적 발현을 위하여는, CaMV 35S 프로모터, 벼 액틴 프로모터, 또는 우비퀴틴 프로모터가 사용된다. 예를 들면, 조절적 발현을 위하여는, 담배 또는 아라비돕시스로 부터 수득된 화학적 유도성 PR-1프로모터가 사용된다[참조: 미국 특허 제5,689,044호).
프로모터의 바람직한 종류는 상처 유도성인 프로모터이다. 상처 부위에 발현된 수 많은 프로모터가 기술되어 있다. 이러한 종류의 바람직한 프로모터는 문헌[Stanford et al., Mol. Gen. Genet. 215: 200-208 (1989), Xu et al. Plant Molec. Biol. 22: 573-588 (1993), Logemann et al. Plant Cell 1: 151-158 (1989), Rohrmeier & Lehle, Plant Molec. Biol. 22: 783-792 (1993), Firek et al., Plant Molec. Biol. 22: 129-142 (1993), and Warner et al. Plant J. 3: 191-201 (1993)]에 기술되어 있다.
바람직한 조직 특이적 발현 패턴에는 녹색 조직-특이적, 뿌리-특이적, 줄기-특이적, 및 꽃-특이적 발현이 포함된다. 녹색 조직에서의 발현에 적합한 프로모터에는 광합성에 관련된 유전자를 조절하는 여러 유전자가 포함되며, 이들중 대부분은 단자엽 식물 및 쌍자엽 식물로부터 클로닝되어 왔다. 바람직한 프로모터는 포스포엔올 카복실라제 유전자로 부터 유래된 옥수수 PEPC 프로모터이다[참조: Hudspeth & Grula, Plant Molec. Biol. 12: 579-589 (1989)]. 뿌리-특이적 발현에 바람직한 프로모터는 문헌[de Framond, FEBS 290: 103-106 (1991); EP 0 452 269]에 기술되어 있으며, 보다 바람직한 뿌리-특이적 프로모터는 본 발명에 의해 제공된 T-1 유전자로 부터 유래된 프로모터이다. 바람직한 줄기-특이적 프로모터는 미국 특허 제5,625,136호에 기술되어 있으며, 이는 옥수수 trpA 유전자의 발현을 유도한다.
본 발명의 바람직한 태양은 뿌리-특이적 방식으로 뉴클레오티드 서열을 발현하는 유전자전이된 식물이다. 또한 바람직한 태양은 상처-유도성 또는 병원균 감염-유도성 방식으로 뉴클레오티드 서열을 발현하는 유전자전이된 식물이다.
2. 전사 터미네이터
다양한 전사 터미네이터가 발현 카세트중에 사용될 수 있다. 이들은 전이유전자 이후의 전사의 종결 및 이의 정확한 폴리아데닐화에 관여한다. 적당한 전사 터미네이터는 식물에서의 기능이 공지된 것들이며, 이들에는 CaMV 35S 터미네이터, tml 터미네이터, 노팔린 신타제 터미네이터 및 완두콩 rbcS E9 터미네이터가 포함된다. 이들은 단자엽 식물 및 쌍자엽 식물 모두에서 사용될 수 있다.
3. 발현의 증진 또는 조절을 위한 서열
다수의 서열이 전사 단위내로 부터 유전자 발현을 증진시킨다는 것이 밝혀졌고, 이들 서열을 본 발명의 유전자와 함께 사용하여 유전자전이된 식물에서 이들의 발현을 증가시킬 수 있다. 예를 들면, 옥수수 Adhl 유전자의 인트론과 같은 각종 인트론 서열이, 특히 단자엽 식물 세포에서 발현을 증진시킨다는 것이 밝혀졌다. 또한, 바이러스로 부터 유래된 다수의 해독되지 않는 리더 서열도 또한 발현을 증진시킨다는 것이 공지되었으며, 이들은 특히 쌍자엽 식물 세포에서 효과적이다.
4. 암호 서열 최적화
선택된 유전자의 암호 서열은 목적하는 작물 종에서 최적으로 발현되도록 암호 서열을 변경하는 방법으로 유전자 조작될 수 있다. 특정 작물 종에서 최적으로발현되도록 암호 서열을 변형시키는 방법은 익히 공지되어 있다[참조: Perlak et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 3324 (1991); and Koziel et al., Bio/technol. 11: 194 (1993)]
또 다른 바람직한 태양에서, 본 발명의 DNA 분자는 유색체 게놈내로 직접 도입되어 형질전환을 일으킬 수 있다. 유색체 형질전환 기술은 문헌[미국 특허 제5,451,513호, 제5,545,817호 및 제5,545,818호 및 국제출원 제WO95/16783호, 및 McBride et al., (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 7301-7305]에 상세히 기술되어 있다. 엽록체 형질전환을 위한 기본 기술은, 선별가능한 마커에 플랭킹된 클로닝된 유색체 DNA 영역을 목적 유전자와 함께 적당한 표적 조직내로, 예를 들어 바이오리스틱(biolistics) 또는 원형질체 형질전환(예: 염화칼슘 또는 PEG 매개된 형질전환)을 사용하여 도입하는 단계를 포함한다. 표적화 서열로 명명된, 1 내지 1.5kb 플랭킹 영역은 유색체 게놈과의 상동 재조합을 용이하게 하므로, 플래스톰(plastom)의 특이적 영역의 대체 또는 변경을 일으킬 수 있다. 초기에는, 스펙티노마이신 및/또는 스펙토마이신에 대한 내성을 부여하는 염색체 16S rRNA 및 rps12 유전자에서의 점(point) 돌연변이가 형질전환에 대한 선별가능한 마커로서 이용된다[참조: Svab, Z., Hajdukiewicz, P., and Maliga, P. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 8526-8530; Staub, J. M., and Maliga, P. (1992) Plant Cell 4, 39-45]. 이들 마커사이에 클로닝 부위가 존재함에 따라, 외래 DNA 분자의 도입을 위한 유색체 표적화 벡터를 제조할 수 있다[참조: Staub, J.M., and Maliga, P. (1993) EMBO J. 12, 601-606]. 형질전환 빈도의 실질적 증가는, 열성 rRNA 또는r-단백질 항생제 내성 유전자를 우성 선별가능한 마커, 즉 스펙티노마이신-독성제거 효소인 아미노글리코시드-3'-아데노트랜스러라제를 암호화하는 박테리아 aadA 유전자로 대체함으로써 달성된다[참조: Svab, Z., and Maliga, P. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 913-917]. 이전에는, 이들 마커가 녹조류인 클라미도모나스 레인하르드티(Chlamydomonas reinhardtii)의 유색체 게놈의 고빈도 형질전환에 성공적으로 사용되어 왔다[참조: Goldschmidt-Clermont, M, (1991) Nucl. Acids Res, 19: 4083-4089]. 유색체 형질전환에 유용한 다른 선별가능한 마커가 당업계에 공지되어 있으며, 본 발명의 범위내에 포함된다.
유색체 발현에서, 유전자는 상동 재조합에 의해 각각의 식물 세포중에 존재하는 수천개의 환상 유색체 게놈의 복사체내로 삽입된다. 바람직한 태양에서, 본 발명의 DNA는 유색체 표적화 벡터내로 삽입되고, 목적하는 식물 숙주의 유색체 게놈내로 도입되어 이를 형질전환시킨다. 본 발명의 DNA 분자를 포함하는 유색체 게놈을 위한 식물 호모플라즘(homoplasm)이 수득되며, 이는 우선적으로 상기 DNA 분자를 고발현시킬 수 있다. 바람직하게는, 상기 DNA 분자에 의해 암호화되는 센스와 안티센스 RNA 단편은 식물 유색체내에서 쌍을 형성하여 이본쇄 RNA 분자를 형성할 수 있으므로, 유색채 유전자의 발현을 변경시킬 수 있다. 바람직한 태양에서, 센스와 안티센스 단편은 상보적 영역내에 어떠한 불합치도 포함하지 않는다. 또 다른 바람직한 태양에서, 센스와 안티센스 단편은 상보적 영역내에 하나 이상의 불합치를 포함한다. 이 경우에, RNA 단편을 암호화하는 DNA 분자중의 DNA 서열은 서로 재조합될 수 없다.
B. 식물 형질전환 벡터의 작제
식물 형질전환에 이용가능한 수 많은 형질전환 벡터가 식물 형질전환 분야의 숙련인에게 공지되어 있으며, 본 발명에 속하는 유전자가 이러한 벡터와 함께 사용될 수 있다. 벡터의 선택은 바람직한 형질전환 기술 및 형질전환하고자하는 표적 종에 따라 달라질 수 있다. 특정 표적 중의 경우, 상이한 항생제 또는 제초제 선별 마커가 바람직하다. 형질전환에 통상적으로 사용되는 선별 마커로는 카나마이신 및 관련 항생제에 대한 내성을 부여하는 nptII 유전자[참조: Messing & Vierra. Gene 19: 259-268 (1982); Bevan et al., Nature 304: 184-187 (1983)], 제초제인 포스피노트리신에 대한 내성을 부여하는 bar 유전자[참조: White et al., Nucl. Acids Res 18: 1062 (1990), Spencer et al. Theor. Appl. Genet 79: 625-631 (1990)], 항생제 히그로마이신에 대한 내성을 부여하는 hph 유전자[참조: Blochinger & Diggelmann, Mol Cell Biol 4: 2929-2931)], 만노즈의 존재하에서 양성 선별을 가능케하는 manA 유전자[참조: Miles and Guest (1984) Gene, 32: 41-48; 미국 특허 제5,767,378호], 및 메토트렉세이트에 대한 내성을 부여하는 dhfr 유전자[참조: Bourouis et al., EMBO J. 2(7); 1099-1104 (1983)], 및 글리포스세이트에 대한 내성을 부여하는 EPSPS 유전자[참조: 미국 특허 제4,940,935호 및 제5,188,642호]이 포함된다.
1. 아그로박테리움(Agrobacterium) 형질전환에 적합한 벡터
다수의 벡터가 아그로벡테리움 투메파시엔스(tumefaciens)를 사용한 형질전환에 이용가능하다. 이들은 전형적으로 하나 이상의 T-DNA 보더(border) 서열을 수반하고, 이에는 pBIN19와 같은 벡터가 포함된다[참조: Bevan, nucl. Acids Res. (1984)]. 아그로박테리움 형질전환에 적합한 전형적인 벡터로는 이원성 벡터 pCIB200 및 pCIB2001은 물론 이원성 벡터 pCIB10 및 이의 히그로마이신 선별 유도체가 포함된다[참조: 미국 특허 제5,639,949호]
2. 비-아그로박테리움 형질전환에 적합한 벡터
아그로박테리움 튜메파시엔스를 사용하지 않는 형질전환의 경우, 선택된 형질전환 벡터중에 T-DNA 서열이 요구되지 않으므로, 결과적으로 이들 서열이 결핍된 벡터는 T-DNA 서열을 포함하는 상기와 같은 벡터와 함께 사용된다. 아그로박테리움에 의존하지 않는 형질전환 기술에는 입자 폭격, 원형질체 흡수(예: PEG 및 전기천공), 및 미세주입을 통한 형질전환이 포함된다. 벡터의 선택은 형질전환되는 종을 위한 바람직한 선별법에 주로 의존한다. 비-아그로박테리움 형질전환에 적합한 벡터로는 pCIB3064, PSOG19, 및 pSOG35가 포함된다[참조: 미국 특허 제5,639,949호].
C. 형질전환 기술
일단 목적하는 DNA 서열을 발현 시스템내로 클로닝시킨 후, 이를 식물 세포내로 도입하여 식물 세포를 형질전환시킨다. 형질전환 방법 및 식물의 재생 방법은 당업계에 익히 공지되어 있다. 예를 들면, 외래 DNA를 전달하는데 Ti 플라스미드 벡터를 사용하는외에, 직접적 DNA 흡수, 리포좀, 전기천공, 미세주입, 및 미세투사를 이용한다. 또한, 아그로박테리움 속의 박테리아를 이용하여 식물 세포를 형질전환시킬 수 있다.
쌍자엽 식물을 형질전환시키는 방법이 당업계에 익히 공지되어 있으며, 이러한 방법으로는 아그로박테리움에 의한 기술 및 아그로박테리움을 요구하지 않는 기술이 포함된다. 비-아그로박테리움 기술은 외인성 유전 물질을 원형질체 또는 세포에 의해 직접 흡수하는 단계를 포함한다. 이는 PEG 또는 전기천공-매개된 흡수, 입자 폭격-매개된 전달, 또는 미세주입에 의해 달성된다. 이 경우에, 형질전환된 세포를 당업계에서 공지된 표준 기술을 사용하여 완전한 식물체로 재생시킨다. 또한, 현재 대부분의 단자엽 식물의 형질전환도 통상적인 것이 되었다. 바람직한 기술로는 PEG 또는 전기천공 기술을 사용한 원형질체로의 직접적 유전자 전달, 입자 폭격에 의한 칼루스 조직으로의 유전자 전달, 및 아그로박테리움-매개된 형질전환이 포함된다.
형질전환이 이루어진 식물을 성장시키고, 번식시키고, 교배하여 목적하는 특성을 지닌 자손을 수득하고, 당업계에서 공지된 방법을 사용하여 목적하는 특성을 지닌 종자를 수득한다.
본 발명은 후술되는 상세한 실시예를 참조로 하여 추가로 기술될 것이다. 이들 실시예는 단지 설명을 위한 목적으로 제공된 것이며, 다른 특별한 언급이 없는한 제한적인 것으로 고려해서는 안된다.
실시예
본원에서 사용된 표준 재조합 DNA 기술 및 분자 클로닝 기술은 당업계에 익히 공지되어 있으며 문헌[Sambrook, et al., Molecular Cloning, eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (1989); T.J. Shilhavy, M.L. Berman; L.W. Enquist, Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1984); and Ausubel, F.M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, pub., Greene Assoc. and Wiley-interscience (1987)]에 기술되어 있다.
실시예 1: 루시페라제 유전자의 발현 조절
센스와 안티센스 루시페라제 RNA 단편을 암호화하는 키메라성 DNA 분자의 작제(센스/안티센스 작제물)
플라스미드 pLuc+(Promega)로 부터 유래된 반딧불이 루시페라제 유전자의 "센스" 배향 단편(738bp)을 올리고뉴클레오티드 프라이머, 즉 ds_Luc1 (5'-CGCGGA TCCTGG AAG ACG CCA AAA ACA-3' : 서열 1; BamHI 제한 부위에는 밑줄이 있음) 및 ds_Luc2 (5'-CGG AAGCTT AGGCTC GCC TAA TCG CAG TAT CCG GAA TG-3' : 서열 2; HindIII 제한 부위에는 밑줄이 있음)을 사용하여 pPH108 플라스미드 DNA로 부터 증폭시킨다. TurboPfu 열안정 DNA 폴리머라제(Stratagene)를 50㎕ 반응물중에 사용하여, 제조업자의 프로토콜에 따라 95℃/1분, 55℃/1.5분, 72℃/2분의 5회 사이클 후, 95℃/1분, 72℃/3.5분의 25회 사이클을 수행한다. 유사한 방법으로, 플라스미드 pLuc+로 부터 유래된 반딧불이 루시페라제 유전자의 "안티센스" 배향 단편(737bp)을 올리고뉴클레오티드 프라이머, 즉 ds_Luc3 (5'-CGG TCT AGAGGA AGACGC CAA AAA CAT A-3' : 서열 3; XbaI 제한 부위에는 밑줄이 있음) 및 ds_Luc2 (5'-CGG AAGCTT AGGCTC GCC TAA TCG CAG TAT CCG GAA TG-3' : 서열 4; HindIII 제한 부위에는 밑줄이 있음)을 사용하여 pPH108 플라스미드로 부터 PCR-증폭시킨다. 생성된 DNA 단편을 저융점 아가로즈(FMC)로 제조된 1% 트리스-아세테이트 겔을 통해 전기영동을 수행한 후, PCR 생성물을 함유하는 잘라낸 겔 박편을 페놀-클로로포름으로 추출하여 정제한다. 표준 방법에 따라, 센스 생성물(ds_Luc1/2)로 부터의 DNA를 BamHI 및 HindIII로 분해하고, 안티센스 생성물(ds_Luc3/2)로 부터의 DNA를 XbaI 및 HindIII로 분해한다[제한 효소는 New England Biolabs로 부터 수득]. 생성된 점착-말단의 DNA 단편을 상기한 바와 같이 겔 정제한다. mas 1' 프로모터(Velten et al., (1984) EMBO J. 3: 2723-2730)을 포함하는 DNA 단편을, 플라스미드 CSA104를 EcoRI 및 HincII로 분해하고 564bp의 DNA 단편을 정제하여 수득한다. 이 단편을 BamHI으로 재분해한 후, mas 1' 프로모터를 포함하는 484bp의 EcoRI-BamHI 아단편을 분리하고, 겔 정제한다. 플라스미드 pPH169를 작제하기 위하여, 클로닝 벡터 pLitmus29(New England Biolabs)로 부터 유래된 DNA를 EcoRI 및 XbaI으로 분해한 후, 분리된 단편을 T4 DNA 리가제(New England Biolabs)를 사용하여 4가지 방식의 반응으로 mas 1' 프로모터 EcoRI-BamHI 단편 및 센스(BamHI-HindIII)와 안티센스(HindIII-XbaI)ds_Luc 루시페라제 유전자 단편에 결합시킨다.
ds_Luc1/2/3 센스/안티센스 작제물을 사용하여 아그로박테리움-매개된 식물형질전환용 이원성 벡터 pPH170을 작제하기 위하여, 박테리아 선별을 위한 카나마이신 내성 유전자 및 유전자전이된 식물 선별을 위한 히그로마이신 내성 유전자를 수반하는 이원성 플라스미드 pSGCHC1으로부터 유래된 DNA를 EcoRI 및 XbaI으로 분해한다. 이와같이 pSGCHC1로 부터 분리된 단편(11.6kb)을 T4 DNA 리가제(New England Biolabs)를 사용하여 4가지 방식의 반응으로 mas 1' 프로모터 EcoRI-BamHI 단편 및 센스(BamHI-HindIII)와 안티센스(HindIII-XbaI)ds_Luc 루시페라제 유전자 단편에 결합시킨다.
아그로박테리움의 형질전환 및 아라비돕시스 식물의 진공-침투
플라스미드 pH170을 전기천공에 의해 아그로박테리움 튜메파시엔스 GV3101내로 도입하고, 형질전환된 콜로니를 선별하고 증폭시킨다. 루시페라제를 구성적으로 발현[UBQ3 프로모터 (Norris et al. (1993) PMB 21: 895-906)/UBQ + CaMV 35S 5'UTR/luc+; pPH108]하거나 유도적으로 발현[아라비돕시스 PR-1 프로모터/luc+; pPH135, line 6E]하는 아라비돕시스 탈리아나(thaliana) 돌연변이 계열의 4 내지 5주령의 식물에 pPH170 이원성 T-DNA 벡터를 수반하는 아그로박테리움 클론을 진공-침투시킨다. 형질전환된 식물을 히그로마이신과 카나마이신에 대해 동시-선별하고, 통제된 피토트론 상태하에 성장시켜, 루시페라제 활성을 측정한다. 또한, pPH135-6E 백그라운드에서의 루시페라제 활성을 BTH로 유도한지 4시간 후에 산정한다[BTH 처리는 문헌(Lawton et al., Plant J. 10: 71-82)에 실질적으로 기술되어 있다]. 루시페라제 활성을, 루시페린 기질을 첨가한 후 조직 추출물에서 발광계분석을 사용하여 정량화한다. 또한, 루시페라제 활성을 CCD-냉각된 비디오 영상화 시스템(Hamamatsu)을 사용하여 플란타(planta)에서 모니터링한다.
실시예 2: 아라비돕시스 GL1 유전자의 발현 조절
GL1 유전자는 정상적 모상체(엽모) 형성의 개시에 요구되는 myb형 전사인자를 암호화한다[참조: Oppenheimer et al. (1991) Cell 67: 483-493]. 발생 초기에 GL1 발현이 녹아웃되는 경우, 식물에서 모상체가 결핍된다. 녹아웃 표현형은 묘목에서 동정하기 용이하며, 치명적이지는 않다. 구성적 발현을 위한 3개의 벡터와 GAL4/C1-조절된 발현을 위한 3개의 벡터를 작제한다. 각각의 프로모터를 시험하기 위한 3개의 상이한 벡터는 GL1 유전자 단편의 센스(+) 발현, 안티센스(-) 발현, 및 센스와 안티센스(+/-) 발현이다. (+) 및 (-) 벡터는 GL1의 발현에 대한 이들의 효과를 비교하기 위한 대조군이다. 이 경우에, GL1 서열(GenBank 수탁번호 제M79448호)의 염기 #739 내지 #1781로 부터의 5'단편을 벡터 작제에 사용한다.
GAL4/C1-조절된 발현
GL1 유전자 단편을 NcoI-SacI 단편으로서 교차-유도성 벡터 작제물 pJG304-1내에 클로닝한다. 플라스미드 pJG304는 pBSSK+로 부터 유래된다. 플라스미드 pBS SK+(Stratagene, LaJolla, CA)를 SacI으로 선상화하고, 녹두 뉴클리아제로 처리하여 SacI 부위를 제거한 후, T4 리가제로 재결합시켜 pJG201을 제조한다. 10XGAL4 컨센수스(consensus) 결합 부위/CaMV 35S 최소 프로모터/GUS 유전자/CaMV 터미네이터 카세트를 KpnI으로 pAT71로 부터 제거하고, pJG201의 KpnI 부위내로 클로닝하여 pJG304를 제조한다. 플라스미드 pJG304를 제한 엔도뉴클리아제 Asp718로 부분적으로 분해하여 완전한 길이의 선상 단편을 분리한다. 이 단편을 몰 과량의 22개 염기의 올리고뉴클레오티드 JG-L(5'-GTA CCT CGA GTC TAG ACT CGA G-3', 서열 5)과 결합시킨다. 제한 분석을 사용하여 GAL4 DNA 결합 부위에 5'로 삽입된 이 링커를 지닌 클론을 동정하고, 이 플라스미드를 pJG304DXhol이라 명명한다.
5'말단에 적당한 제한 부위를 지닌 PCR 프라이머를 합성하여, (+) 및 (-) 단편의 말단에 NcoI 및 SacI 부위를 첨가한다. 먼저, 두 개의 단편, 즉 5'말단의 NcoI 부위 및 3'말단의 HindIII 부위를 갖는 (+) 단편, 및 5'말단의 HindIII 부위 및 3'말단의 SacI 부위를 갖는 (-) 단편를 제조하여 (+/-) GL1 단편을 제조한다. EcoRI 부위에서 생성된 단편을 결합시켜 (+/-) 단위를 제조한다. 발현 단위는 GAL4 DNA 결합 도메인에 이어 최소 TATA 서열, 및 (+), (-) 또는 (+/-)로 배향된 GL1 유전자를 포함한다[참조: Guyer et al.(1998) Genetics, 149: 633-639].
구성적 발현
쌍자엽 식물중에서 비교적 강력하고 구성적인, 아가로박테리움으로 부터 유래된 만노핀 신타제의 mas 1' 프로모터[참조: Velten et al. (1984) EMBO Journal 3: 2723-2730]를 사용한다. 상기한 바와 같이, GL1 (+), (-) 및 (+/-) 단편을 pBluescript중의 상기 1' 프로모터 후방에 결합시킨다. 3개의 상이한 발현 카세트를 EcoRI/SalI 단편으로서 pCIB200내에 결합시킨다[참조: Uknes et al. (1993)Plant Cell 5: 159-169].
실시예 3: 시스타티오닌 베타-리아제 유전자의 발현 조절
시스타티오닌 베타-리아제(CBL) 유전자는 메티오닌 생합성 경로의 단계를 수행하는 단백질을 암호화한다. CBL은 시스타티온의 호모시스타티온으로의 전환을 촉매화한다[참조: Ravanel et al. (1998) Proc. Natl. Acad, Sci, USA 95: 7805-7812]. 아라비돕시스 CBL 유전자에 대한 cDNA 서열이 동정되었다[참조: Ravanel et al. (1995) Plant Mol. Biol. 29: 875-882]. 식물에서의 이의 발현의 조절 효과를 센스 RNA 발현을 위한 작제물(센스 작제물), 안티센스 RNA 발현을 위한 작제물(안티센스 작제물) 및 센스와 안티센스 RNA 발현을 위한 작제물(센스/안티센스 작제물)을 사용하여 시험한다.
A. 안티센스 작제물: 안티센스 배향으로 CBL 유전자의 일부[뉴클레오티드 #13-1159, Genbank 수탁번호 #L40511]가 삽입된 pJG304DXhoI 벡터로 부터의 단편을 포함하는 이원성 BASTA 벡타 pJG261를 사용한다.
pJG304/aCBL: 플라스미드 pJG304DXhoI을 NcoI 및 SacI으로 분해하여 GUS 유전자를 잘라낸다. pJG304DXhoI으로 부터의 GUS 유전자를, 역시 NcoI 및 SacI으로 분해한 CBL PCR 생성물로 대체한다. DG354(5'-GAT CGA GCT CCA CGA GAA CTG TCT CCG-3', 서열 6) 및 DG357(5'-TCA GCC ATG GGA AGA CAA GTA CAT TGC-3', 서열 7)을 프라이머로 사용하고, pFL61 아라비돕시스 cDNA 라이브러리[Minet et al. (1992)Plant J. 2: 417-422]를 주형으로서 사용하여, 상기 생성물을 제조한다. CBL PCR 생성물에 결합된 pJG304DXhoI-분해된 벡터로 부터 플라스미드 pJG304/aCBL를 작제한다.
pJG261/aCBL: pJG304/aCBL을 XhoI로 절단하여 GAL4 DNA 결합 부위/35S 최소 프로모터/안티센스 CBL/CaMV 터미네이터 융합체를 포함하는 카세트를 잘라낸다. 이 카세트를 XhoI-분해된 pJG261[참조: Guyer, et al. Genetics (1998), 149: 633-639]내에 결합시켜 pJG261/aCBL을 제조한다.
B. 센스 작제물: 이는 CBL 단편이 반대 배향인 점을 제외하고는 안티센스 작제물과 동일하다. 이 작제물은 ATG 개시 코돈 및 대부분의 CBL ORF를 포함하고, CBL 유전자의 발현 조절에 대한 대조군으로서 사용된다.
pJG304/sCBL: 플라스미드 pJG304DXhoI을 NcoI 및 SacI으로 분해하여 GUS 유전자를 잘라낸다. pJG304DXhoI으로 부터의 GUS 유전자를, 역시 NcoI 및 SacI으로 분해한 CBL PCR 생성물로 대체한다. CBL1(5'-CTT GCC ATG GCA CGA GAA CTG TCT CCG-3', 서열 8) 및 CBL2(5'-CAT GGA GCT CGA AGA CAA GTA CAT TGC A-3', 서열 9)를 프라이머로 사용하고, pFL61 아라비돕시스 cDNA 라이브러리를 주형으로서 사용하여, 상기 생성물을 제조한다. CBL PCR 생성물에 결합된 pJG304DXhoI-분해된 벡터로 부터 플라스미드 pJG304/sCBL을 작제한다.
pJG261/sCBL: pJG304/sCBL을 XhoI로 절단하여 GAL4 DNA 결합 부위/35S 최소 프로모터/센스 CBL/CaMV 터미네이터 융합체를 포함하는 카세트를 잘라낸다. 이 카세트를 XhoI-분해된 pJG261내에 결합시켜 pJG261/sCBL을 제조한다.
C. 센스/안티센스 작제물: 센스 배향의 CBL 유전자 단편(#13-1159)을, 안티센스 배향형의 CBL 유전자의 하부의 벡터 pJG304DXhoI의 SalI부위내에 삽입한다. 약 10bp의 링커가 두개의 CBL 복사체사이에 존재한다.
pJG304/dsCBL: 플라스미드 pJG304/aCBL을 SacI으로 분해한다. 역시 SacI으로 분해한 CBL PCR 생성물을 삽입된 CBL 유전자가 센스 배향이 되도록 삽입한다. CBL2(5'-CAT GGA GCT CGA AGA CAA GTA CAT TGC A-3', 서열 9) 및 CBL3(5'-CAT CGA GCT CCT CTG TTT AAA CCA CGA GAA CTG TCT CCG TCG C-3', 서열 10)를 프라이머로 사용하고, pFL61 아라비돕시스 cDNA 라이브러리를 주형으로서 사용하여, 상기 생성물을 제조한다. 목적하는 배향으로 삽입된 DNA를 지닌 이 플라스미드 작제물을 HindIII로 분해하여 동정한다. 플라스미드 pJG304/dsCBL를 CBL PCR 생성물에 결합된 pJG304/aCBL-분해된 벡터로 부터 작제한다. SURE2(Stratagene, LaJolla, CA)를 박테리아 숙주로서 사용하여 작제물을 안정화시킨다.
pJG261/dsCBL: pJG304/dsCBL을 XbaI으로 절단하여 GAL4 DNA 결합 부위/35S 최소 프로모터/안티센스 CBL/센스 CBL/CaMV 터미네이터 융합체를 포함하는 카세트를 잘라낸다. 이 카세트를 SpeI-분해된 pJG261내에 결합시켜 pJG261/dsCBL을 제조한다. XL1-BLUEMRF'(Stratagene, LaJolla, CA)를 박테리아 숙주로서 사용하여 작제물을 부분적으로 안정화시킨다. 이 작제물에 대해 재배열되지 않은 DNA를 아가로즈 겔 정제로 분리한다.
D. GAL4 결합 부위/최소 CaMV 35S/CBL 유전자전이된 식물의 제조
상기한 3개의 pJG261/CBL 작제물을 전기-형질전환법[Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA]으로 아가로박테리움 튜메파시엔스 recA-균주 AGL1[Lazo et al. (1991)]을 형질전환시키고, 아라비돕시스 식물(Ecotype Columbia)를 침윤을 이용하여 형질전환시킨다[Bechtold et al., (1993) C. R. Acad. Sci. Paris, 316: 1188-1193]. 침윤된 식물의 종자를, 15mg/l의 바스타(Basta)를 함유하는 발아 배지[4.3g/l의 무라시게-스코그(Murashige-Skoog) 염, 0.5g/l의 메스(Mes), 1% 슈크로즈, 10㎍/l의 티아민, 5㎍/l의 피리독신, 5㎍/l의 니코틴산, 1mg/l의 미오-이노시톨, pH 5.8]상에서 선밸한다.
E. GAL4/C1 트랜스활성인자 및 GAL4 결합 부위/최소 35S 프로모터를 사용한 CBL 억제의 비교
GAL4 결합 부위/최소 CaMV 35S 프로모터/CBL 작제물을 포함하는 유전자전이된 식물을 토양에 이식하고 온실내에서 성숙할 때까지 성장시킨다. 각 계열의 유전자전이된 CBL 단편의 존재를 PCR로 확인한다. 안티센스 작제물을 시험하기 위해, 프라이머 ASV1 (5'-TTT GGA GAG GAC AGA CCT GC-3', 서열 11) 및 CBL3(5'-CAT CGA GCT CCT CTG TTT AAA CCA CGA GAA CTG TCT CCG TCG C'-3, 서열 10)을 사용하여 약 1200bp의 생성물의 존재를 확인한다. 상기 안티센스 작제물을 지닌 6개의 유전자전이된 계열을 동정한다. 센스 작제물을 시험하기 위해, 프라이머 ASV2 (5'-GGATTT TGG TTT TAG GAA TTA GAA-3', 서열 12) 및 CBL3(5'-CAT CGA GCT CCT CTG TTT AAA CCA CGA GAA CTG TCT CCG TCG C'-3, 서열 10)을 사용하여 약 1200bp의 생성물의 존재를 확인한다. 상기 센스 작제물을 지닌 13개의 유전자전이된 계열을 동정한다. 또한, 센스/안티센스 작제물을 시험하기 위해, 프라이머 ASV1 (5'-TTT GGA GAG GAC AGA CCT GC-3', 서열 11) 및 CBL3(5'-CAT CGA GCT CCT CTG TTT AAA CCA CGA GAA CTG TCT CCG TCG C'-3, 서열 10)을 사용하여 약 1200bp의 생성물의 존재를 확인한다. 상기 센스/안티센스 작제물을 지닌 11개의 유전자전이된 계열을 동정한다.
1차 형질전환체에서 발생한 꽃에 동형접합성 GAL4/C1 트랜스활성인자 계열 pAT53-103[Guyer et al, Genetics (1998) 149: 633-649]로 부터 수득된 화분을 수분시킨다. F1 종자를 MS+2% 슈크로즈 배지[4.3g/l의 무라시게-스코그 염, 0.5g/l의 메스, 2% 슈크로즈]상에 플레이팅한다. 안티센스 작제물을 포함하는 어떠한 계열도 플레이트상의 F1 자손에 대해 비정상적 표현형을 나타내지 않는다. 센스 작제물을 포함하는 13개 계열중 두 개는 각 플레이트상의 F1 자손의 약 절반에 대해 약한 표현형을 나타낸다. 센스 작제물을 포함하는 13개 계열중 다른 11개는 플레이트상의 F1 자손에 대해 비정상적 표현형을 나타내지 않는다. 센스/안티센스 작제물을 포함하는 11개 계열중 10개는 각 플레이트상의 F1 자손의 약 절반에 대해 약에서 강에 이르는 표현형을 나타낸다. 강한 표현형을 갖는 식물은 생존하지 못하며, 자주색 색조가 증가하고, 녹색 색소가 상실되고, 플레이트상에서 14일 후 잎을 형성하지 못한다. 약한 표현형을 갖는 식물은 약간의 자주색 색조를 가지며,정상 보다 녹색이 희미해지고, 플레이트상에서 14일 후 더 작은 잎을 형성한다. 따라서, 센스/안티센스 작제물은 안티센스 또는 센스 작제물에 비해 내인성 필수 유전자의 활성을 감소시키는데 있어 더 효과적이다.
F. 두 개의 프로모터를 사용한 CBL의 발현 조절
CBL 유전자를 두 개의 프로모터(하나는 센스 쇄의 전사를 개시하고, 다른 것은 안티센스 쇄의 전사를 개신한다)사이에 위치시킨다. 이 경우에, 센스와 안티센스 RNA 둘 모두가 식물 세포에서 생산되고, 두 유형의 쇄는 서로 하이브리드를 형성하여 이본쇄 RNA 분자의 형성할 수 있다. ACTIN2를 CBL 유전자의 양측면에 플랭킹된 프로모터로서 사용한다. 이 경우에, 프로모터의 말단부에 터미네이터를 사용하거나 사용하지 않는 것은 선택 사항이다. 전사 터미네이터를 사용하는 경우, 전사는 프로모터의 3'말단에서 시작하여, 일방향으로 CBL 유전자를 통해 진행되고, 제2 프로모터를 통해 3'말단으로 부터 5'말단으로 진행되어, 제2 프로모터의 5'말단상의 전사 터미네이터에서 종결된다. 전사 터미네이터를 사용하는 것은 전사된 RNA를 안정화시키기 위한 것이다.
실시예 4: 루시페라제 유전자 발현의 조절
센스와 안티센스 루시페라제 RNA 단편을 암호화하는 키메라성 DNA 분자의 작제(센스/안티센스 작제물)
플라스미드 pLuc+(Promega 벡터 pGL3, GenBnk 수탁번호 #U47295)로 부터 유래된 반딧불이 루시페라제 유전자의 "센스" 배향 단편(670bp)을 올리고뉴클레오티드 프라이머, 즉 ds_Luc1 (5'-CGCGGA TCCAAG ATT CAA AGT GCG CTG CTG-3' : 서열 13; BamHI 제한 부위에는 밑줄이 있음) 및 ds_Luc2 (5'-GCGAAG CTT GGC GAC GTA ATC CAC GAT CTC-3' : 서열 14; HindIII 제한 부위에는 밑줄이 있음)을 사용하여 pPH108 플라스미드로 부터 증폭시킨다. TurboPfu 열안정성 DNA 폴리머라제(Stratagene)를 50㎕ 반응물중에 사용하여, 제조업자의 프로토콜에 따라 95℃/1분, 55℃/1.5분, 72℃/2분의 5회 사이클 후, 95℃/1분, 72℃/3.5분의 25회 사이클을 수행한다. 유사한 방법으로, 플라스미드 pLuc+로 부터 유래된 반딧불이 루시페라제 유전자의 "안티센스" 배향 단편(669bp)을 올리고뉴클레오티드 프라이머, 즉 ds_Luc3 (5'-CGGTCT AGAAAG ATT CAA AGT GCG CTG CTG-3' : 서열 15; XbaI 제한 부위에는 밑줄이 있음) 및 ds_Luc2 (5'-GCGAAG CTT GGC GAC GTA ATC CAC GAT CTC-3' : 서열 16; HindIII 제한 부위에는 밑줄이 있음)을 사용하여 pPH108 플라스미드로 부터 PCR-증폭시킨다. 생성된 DNA 단편을 저융점 아가로즈(FMC)로 제조된 1% 트리스-아세테이트 겔을 통해 전기영동을 수행한 후, PCR 생성물을 함유하는 잘라낸 겔 박편을 페놀-클로로포름으로 추출하여 정제한다. 표준 방법에 따라, 센스 생성물(ds_Luc1/2)로 부터의 DNA를 BamHI 및 HindIII로 분해하고, 안티센스 생성물(ds_Luc3/2)로 부터의 DNA를 XbaI 및 HindIII로 분해한다[제한 효소는 New England Biolabs로 부터 수득]. 생성된 점착-말단의 DNA 단편을 상기한 바와 같이 겔 정제한다. 이어서, 센스 BamHI-HindIII 단편 및 안티센스 HindIII-XbaI 단편을, BamHI 및 XbaI으로 이미 분해한 클로닝 벡터 pLitmus28(New England Biolabs)내에 3가지 방식의 결합으로 클로닝한다. 생성된 작제물은 pAdF3으로 명명한다. bar 유전자[D'Halluin et al. (1992) Methods in Enzymology 216:415-426]의 개방형 판독 프레임을 포함하는 563bp의 DNA 단편을, 올리고뉴클레오티드, 즉 bar-1 (5'-GCGAAG CTTGAT CCA TGA GCC CAG AAC GA-3' : 서열 17; HindIII 제한 부위는 고딕체) 및 bar-2 (5'-GCCAAG CTTCCT AGA ACG CGT GAT CTC-3' : 서열 18; HindIII 제한 부위는 고딕체)을 사용하여 플라스미드 CSA104 DNA로 부터 증폭시킨다. Pfu 열안정성 DNA 폴리머라제(Stratagene)를 100㎕ 반응물중에 사용하여, 제조업자의 프로토콜에 따라 94℃/1분, 55℃/1분, 72℃/1분의 25회 사이클을 수행한다. 페놀 추출 및 에탄올 침전에 의한 정제 후, bar PCR 생성물을 HindIII로 분해하고, 상기한 바와 같이 2% 아가로즈 겔을 통해 정제한다. HindIII로 이미 분해한 플라스미드 pAdF3내에 HindIII bar DNA 단편을 결합시켜, 플라스미드 pAdF1을 작제한다. 이러한 비-방향성 클로닝으로 부터 생성된 두 개의 가능한 작제물중, pAdF1은 bar 유전자의 배향이 pAdF3내에 존재하는 루시페라제 유전자의 "센스" 단편의 배향과 동일하다는 특징을 갖는다. 아라비돕시스 ACT2 프로모터[An et al., (1996) Plant J. 10:107-121]을 포함하는 BamHI-SalI 1.2kb DNA 단편을 pNOV1416[Scott Rabe; NB171 p.122;8-17-98에서 제조된 작제물]로 부터 잘라내고, BamHI 및 SalI으로 분해한 pUC21내로 클로닝하여 pAct2 작제물을 제조한다. 이어서, ACT2 프로모터를 BamHI 및 SpeI으로 분해하여 pAct2로 부터 잘라낸다.
ds_Luc1/2/3 센스/안티센스 작제물을 사용하여 아그로박테리움-매개된 식물 형질전환용 이원성 벡터 pAdF4를 작제하기 위하여, 박테리아 선별을 위한 카나마이신 내성 유전자 및 유전자전이된 식물 선별을 위한 히그로마이신 내성 유전자를 수반하는 이원성 플라스미드 pSGCHC1으로부터 유래된 DNA를 SpeI 및 SacI으로 분해한다. 이와같이 pSGCHC1로 부터 분리된 단편(11.6kb)을 T4 DNA 리가제(New England Biolabs)를 사용하여 3가지 방식의 반응으로 Act2 프로모터 BamHI-SpeI 단편, 및 센스와 안티센스 루시페라제 유전자 단편을 둘다 포함하는 pAdF3로 부터의 BamHI-SacI 단편에 결합시킨다.
유사하게, 이원성 벡터 pAdF2를, 상기한 바와 같이 SpeI 및 SacI으로 분해한 11.6kb의 pSGCH1 벡터, Act2 프로모터를 수반하는 SpeI-BamHI 단편, 및 bar 유전자 주변에 센스와 안티센스 루시페라제 유전자 단편을 둘다 포함하는 pAdF1으로 부터의 BamHI-SacI 단편을 포함하는 3가지-방식의 결합으로 작제한다.
아그로박테리움의 형질전환 및 아라비돕시스 식물의 진공-침투
플라스미드 pAdF2 및 pAdF4를 전기천공에 의해 아그로박테리움 튜메파시엔스 GV3101내로 도입하고, 형질전환된 콜로니를 선별하고 증폭시킨다. 루시페라제를 구성적으로 발현[UBQ3 프로모터 (Norris et al. (1993) PMB 21: 895-906)/UBQ + CaMV 35S 5'UTR/luc+; pPH108]하거나 유도적으로 발현[아라비돕시스 PR-1 프로모터/luc+; pCIB200, line 6E]하는 아라비돕시스 탈리아나 돌연변이 계열의 4 내지 5주령의 식물에 pAdF2 또는 pAdF4 이원성 T-DNA 벡터를 수반하는 아그로박테리움 클론을 진공-침투시킨다. 형질전환된 식물을 히그로마이신과 카나마이신에 대해 동시-선별하고, 통제된 피토트론 상태하에 성장시켜, 루시페라제 활성을 측정한다. 또한, pCIB200-6E 백그라운드에서의 루시페라제 활성을 BTH로 유도한지 48시간 후에 산정한다[BTH 처리는 문헌(Lawton et al., Plant J. 10: 71-82)에 실질적으로 기술되어 있다]. 루시페라제 활성을, 루시페린 기질을 첨가한 후 조직 추출물에서 발광계 분석을 사용하여 정량화한다. 또한, 루시페라제 활성을 CCD-냉각된 비디오 영상화 시스템(Hamamatsu)을 사용하여 플란타(planta)에서 모니터링한다. pPH108중의 루시페라제 유전자는 pGL3(Promega, Genbank 수탁번호 #U47295)로 부터 유래된 것이고, pCIB200-6E중의 루시페라제 유전자는 pGL2(Promega, Genbank 수탁번호 #X65323)로 부터 유래된 것이라는 점에 유념한다.
루시페라제 분석 시약(Promega, 카달로그 제E1501호)을 사용하여 루시페라제 분석을 수행한다. 잎 펀치를 0.1M KPO4pH7.8 완충액(4℃)중에서 분쇄하고, 잠시 회전시킨다. 상층액의 분액을 루시페라제 분석 시약과 혼합하고, 루시페라제 활성을 Monolight 2010 광도계(Becton Dickinson Microbiology System)로 정량화한다. 센스/안티센스 작제물 pAdF2 및 pAdF4로 형질전환된 pPH108 식물의 분석 결과가 표 1에 제시되어 있으며, 또한 센스/안티센스 작제물 pAdF4로 형질전환된 pCIB200-6E 식물의 분석 결과가 표 2에 제시되어 있다.
표 1: 식물에서 루시페라제 활성에 대한 상대적 광단위
모 계열 pPH108의 상이한 식물을 시험하여 각종 식물에서의 루시페라제의 평균 수준을 측정한다. 이러한 계열은 동형접합성이 아니므로, 루시페라제 수준이가장 높은 각 식물(즉, 식물 1, 2 및 3)은 동형접합성일 수 있다. 이중(double) 유전자전이된 식물 pPH108(pAdF2)[pPH108 백그라운드중에 pAdF2 작제물을 포함], 및 pPH108(pAdF4)[pPH108 백그라운드중에 pAdF4 작제물을 포함]의 독립적인 T1 계열을 분석한다. 루시페라제 수준은, 아마도 센스/안티센스 작제물의 발현 수준의 범위로 인해, 계열에 따라 달라질 수 있다. 독립적인 T1 경우, pAdF2(콜룸비아(pAdF2)) 또는 pAdF4(콜롬비아(pAdF4))로 형질전환된 야생형 아라비돕시스 콜룸비아(Arabidopsis Columbia)를 대조군으로서 분석한다.
표 2: 시험된 각각의 식물에서 루시페라제 활성에 대한 상대적 광단위
모 계열 pCIB200-6E로 부터의 식물, 및 독립적인 T1 이중 유전자전이된 계열 pCIB200-6E(pAdF4)을 성장시켜 샘플을 채취한다. 독립적인 T1 발생시, pAdF4 작제물로 형질전환된 야생형 아라비돕시스 콜룸비아를 대조군으로서 분석한다.
실시예 5: 부위-특이적 재조합 시스템을 사용하는, 목적 유전자의 발현 조절
본 발명의 또 다른 태양에서, 센스와 안티센스 RNA 단편을 부위-특이적 재조합 시스템을 사용하여 제조한다. 부위-특이적 재조합은 재조합효소에 의해 매개된DNA 절단 및 재결합의 과정이다. 재조합효소는 고도의 특이적 DNA 서열을 인식한다. 일부 부위-특이적 재조합 시스템은 단지 하나의 단백질만을 사용하여 이의 표적 부위상에 작용한다. 몇몇 부위-특이적 재조합 시스템, 예를 들면 Cre/lox, FLP/FRT, R/RS 및 Gin/gix는 식물에서 부위-특이적 재조합 과정을 매개하는 것으로 공지되어있다[Ow and Medberry, 1995, Critical Reviews in Plant Sciences 14:239-261]. 재조합 기질내의 재조합효소 인식 부위의 형태에 따라, 재조합 과정은 DNA 서열의 결실, 역전 또는 통합을 유발한다. 두 개의 재조합효소 인식 부위는 반대 배향으로, 적절한 유전자 발현 카세트내에 위치한다. 제1 인식 부위는 프로모터의 하부중, 해독되지 않는 리더내 또는 전이유전자 암호 서열의 5'-말단 영역 내부에 위치한다. 제2 부위는 제1 부위와는 반대 배향으로 3'-해독되지 않는 영역내 또는 전이유전자 암호 서열의 3'-말단 영역내에 위치한다. 목적하는 DNA 서열의 암호 쇄 또는 비-암호 쇄가 프로모터에 작동적으로 연결된다. 재조합효소의 존재하에서, 반대 배향인 상기 두 개의 인식 부위가 플랭킹된 서열은 역전된다. 재조합 과정의 결과로서, 목적하는 유전자의 암호 쇄 또는 비-암호 쇄 모두가 프로모터에 작동적으로 연결되고, 센스와 안티센스 전사체가 둘다 동일한 염색체 환경중의 동일한 유전자 좌에서 생성되며, dsRNA 분자를 형성할 수 있다.
부위-특이적 재조합효소(예: Cre)의 고수준의 구성적 발현은 일부 식물에서 비정상적 표현형을 유발할 수 있다[참조: Que et al., 1998, Plant J. 13:401-409] 바람직하게는, 재조합효소의 발현은 유도성 프로모터의 통제하에 있다. 본 발명의 일 태양에서, 재조합효소 발현 카세트는 반대 방향의 두 개의 재조합효소 인식 부위가 플랭킹된 적절한 전이유전자 서열을 도입하는데 사용된 동일한 형질전환 벡터내에 위치한다. 본 발명의 또 다른 태양에서, 재조합효소 인식 부위가 플랭킹된 전이유전자를 포함하는 유전자전이된 식물을 재조합효소를 발현하는 계열에 교배시키거나, 또는 재조합효소-발현 벡터로 재형질전환시킨다. 본 발명의 또 다른 태양에서, 유도성 재조합효소 발현 카세트를 포함하는 재조합 RNA 또는 DNA 바이러스를 사용하여 적절한 전이유전자 작제물을 포함하는 식물을 감염시킨다. 재조합 바이러스는 바람직하게는 비정상 표현형을 유발시키는데 결함이 있다. 상기 태양에서, 재조합효소는 바람직한 서열의 염색체 복사체의 역전을 유발하여, 목적하는 dsRNA가 제조될 수 있다.
본 발명의 또 다른 태양에서, 재조합 식물 DNA 바이러스을 사용하여 dsRNA를 형성할 수 있는 센스와 안티센스 RNA 단편을 제조한다. 전형적으로, 식물 DNA 바이러스는 염색체 외적으로 복제된다. 바람직한 태양에서, 역전된 두 개의 재조합효소 인식 부위가 플랭킹된 표적 유전자의 RNA 단편을 발현할 수 있는 DNA 서열을 포함하는 카세트를 함유하는 작제물을, 재조합효소를 발현하는 제2 재조합 바이러스와 함께 식물 세포내로 도입한다. 달리, 재조합효소 발현 카세트와 역전된 인식 부위가 플랭킹된 DNA 서열이 둘다 동일한 바이러스 DNA 벡터내에 연결된다. 바이러스 DNA 벡터가 식물에 도입된 후, 재조합효소 유전자가 발현된다. 재조합효소 유전자의 발현은 재조합효소 인식 부위가 플랭킹된 바이러스 DNA 서열의 역전을 유발하며, 세포중의 바이러스 게놈의 고 복사체 수로 인해, 목적하는 DNA 서열로 부터 다량의 dsRNA가 생성된다. 바람직한 재조합효소 시스템은 Cre/lox, FLP/FRT,R/RS 및 Gin/gix이며, 이들은 식물에서 부위-특이적 재조합 과정을 매개하는 것으로 공지되어 있다[본원에서 참조로 인용된 OW and Medberry, 1995, Critical Reviews in Plant Sciences 14:239-261].
실시예 6: 식물 발현 카세트의 작제를 위한 요건
먼저, 유전자전이된 식물에서 발현시키고자 하는 유전자 서열을, 발현 카세트중 적당한 프로모터 하부와 적당한 전사 터미네이터 상부사이내에 조립시킨다. 식물 발현 카세트의 작제에 대한 모든 요건은 본 발명의 DNA 분자에 적용되며, 이는 당업계에서 익히 공지된 기술을 사용하여 수행한다.
프로모터 선택
발현 카세트에 사용된 프로모터의 선택에 따라, 유전자전이된 식물에서 DNA 분자의 공간적 및 시간적 발현 패턴이 결정된다. 선택된 프로모터는 특정 세포 유형(예: 잎의 표피 세포, 엽육 세포, 뿌리 피층 세포) 또는 특정 조직 또는 기관(예: 뿌리, 잎 또는 꽃)에서 DNA 분자를 발현시키며, 이러한 선택에 의해 DNA 분자에 의해 암호화된 RNA 단편의 합성이 목적하는 위치에서 발생할 수 있다. 달리, 선택된 프로모터는 광-유도되는 또는 기타 시적으로 조절되는 프로모터하에서 DNA 분자의 발현을 유도한다. 또한, 달리 선택된 프로모터는 화학적으로 조절된다. 이는 필요한 경우 화학적 유도인자로 처리하여, DNA 분자의 발현을 유도할 수 있는 가능성을 제공한다.
전사 터미네이터
다양한 전사 터미네이터가 발현 카세트중에 사용될 수 있다. 이들은 전사의 종결 및 바람직하게는 정확한 폴리아데닐화에 관여한다. 적당한 전사 터미네이터는 식물에서의 기능이 공지된 것들이며, 이들에는 CaMV 35S 터미네이터, tml 터미네이터, 노팔린 신타제 터미네이터 및 완두콩 rbcS E9 터미네이터가 포함된다. 이들은 단자엽 식물 및 쌍자엽 식물 모두에서 사용될 수 있다.
발현의 증진 또는 조절을 위한 서열
다수의 서열이 전사 단위내로 부터 유전자 발현을 증진시킨다는 것이 밝혀졌고, 이들 서열을 본 발명의 유전자와 함께 사용하여 유전자전이된 식물에서 이들의 발현을 증가시킬 수 있다. 각종 인트론 서열이, 특히 단자엽 식물 세포에서 발현을 증진시킨다는 것이 밝혀졌다. 예를 들면, 옥수수 Adh1 유전자의 인트론이, 옥수수 세포내로 도입되는 경우, 이의 동족 프로모터하에서 야생형 유전자의 발현을 상당히 증진시킨다는 것이 밝혀졌다. 인트론 1은 클로로암페니콜 아세틸트랜스퍼라제 유전자와의 융합 작제물에서 특히 효과적이며, 발현을 증진시키는 것으로 밝혀졌다[참조: Callis et al., Genes Develep 1: 1183-1200 (1987)]. 동일한 실험 시스템에서, 옥수수 bronze1 유전자로 부터의 인트론은 발현을 증진시키는데 유사한 효과를 갖는다[Callis et al., supra]. 인트론 서열이 식물 형질전환 벡터중, 전형적으로 해독되지 않는 리더내에 삽입되는 것이 통상적이었다.
바이러스로 부터 유래되는 수 많은 해독되지 않는 리더 서열도 또한 발현을증진시키는 것으로 공지되어 있으며, 이들은 특히 쌍자엽 식물 세포에서 효과적이다. 구체적으로, 담배 모자이크 바이러스(TMV: Tobacco Mosaic Virus), "Ω-서열"), 옥수수 클로로틱 모틀 바이러스(MCMV: Maize Chlorotic Mottle Virus), 및 알파파 모자이크 바이러스(AMV: Alfafa Mosaic Virus)로 부터 유래된 리더 서열이 발현을 증진시키는데 효과적인 것으로 밝혀졌다[참조: Gallie et al., Nucl. Acids Res. 15: 8693-8711 (1987); Skuzeski et al., Plant Molec. Biol. 15; 65-79 (1990)].
실시예 7: 발현 카세트 작제의 실시예
본 발명은, 프로모터의 기원에 상관없이, 식물에서 발현가능한 임의의 프로로모터의 조절하에 본 발명의 DNA 분자를 발현시키는 것을 포함한다. 따라서, DNA 분자를 당업계에서 익히 공지된 기술을 사용하여 임의의 발현 카세트중에 삽입시킨다. 이어서, 이들 발현 카세트를 후술되는 식물 형질전환 벡터로 용이하게 전달할 수 있다. 또한, 본 발명은 DNA 분자의 발현을 위해 요구되거나 선택된 임의의 추가적 서열과 함께 식물-발현가능한 프로모터를 사용하는 것을 포함한다. 이러한 서열로는 전사 터미네이터, 발현을 증지시키기 위한 외인성 서열[예컨대, 인트론(Adh 인트론 1) 및 바이러스 서열(예: TMV-Ω)]이 포함되나, 이에 한정되는 것은 아니다.
구성적 발현: CaMV 35S 프로모터
플라스미드 pCGN1761의 작제는 공개된 특허원 EP 0 392 225에 기술되어 있다. pCGN1761은 "이중(double)" 35S 프로모터 및 tml 전사 터미네이터와 함께 프로모터와 터미네이터사이에 특유의 EcoRI 부위를 포함하며, pUC-형의 주쇄를 갖는다. 이미 존재하는 EcoRI 부위외에 NotI 및 XhoI 부위를 포함하는 변형된 폴리링커를 갖는 pCGN1761의 유도체를 작제한다. 이 유도체를 pCGN176ENX로 명명한다. pCGN176ENX는, 유전자전이된 식물에서 35S 프로모터의 통제하에 이들을 발현시킬 목적으로, 이의 폴리링커내에 cDNA 서열 또는 유전자 서열(미생물 ORF 서열 포함)을 클로닝시키는데 유용하다. 형질전환 벡터로 전달하기 위하여, HindIII, SphI, SalI 및 XabI으로 프로모터의 5' 부위를 절단하고, XbaI, BamHI 및 BglI으로 터미네이터의 3' 부위를 절단하여, 상기와 같은 작제물의 전체 35S 프로모터-유전자 서열-tml 터미네이터 카세트를 잘라낸다. 또한, 또 다른 프로모터와 대체하기 위하여, 이중 35S 프로모터 단편을, HindIII, SphI, SalI, XabI 또는 PstI에 의한 5' 절단 및 임의의 폴리링커 제한 부위(EcoRI, NotI 또는 Xhol)에 의한 3' 절단으로 제거할 수 있다.
따라서, 본 발명의 DNA 분자는 CaMV 35S 프로모터의 통제하의 구성적 발현을 위하여 pCGN1761ENX내에 삽입된다.
화학적으로 조절가능한 프로모터하의 발현
이 섹션은 pCGN1761ENX내의 이중 35S 프로모터를 선택된 임의의 프로모터로 대체하는 것에 대해 기술한다; 예로써, 화학적으로 조절되는 PR-1a 프로모터가 기술된다. 선택된 프로모터는 바람직하게는 제한효소를 이용하여 이의 공급원으로 부터 잘라내거나, 달리 적당한 말단 제한 부위를 수반하는 프라이머를 사용하여 PCR-증폭시킬 수 있다. PCR-증폭을 수행하는 경우, 표적 벡터내에 증폭된 프로모터를 클로닝한 후, 증폭 오류를 점검하기 위하여 프로모터를 재차 서열분석하여야 한다. 화학적으로 조절가능한 담배 PR-1a 프로모터를 플라스미드 pCIB1004(참조: EP 0 332 104)로 부터 잘라내어, 플라스미드 pCGN1761ENX로 전달한다. pCIB1004를 NcoI으로 절단하고, 생성된 선상화된 단편의 3' 돌출부를 T4 DNA 폴리머라제로 처리하여 평활하게 만든다. 이 후, 이 단편을 HindIII로 절단하고, 생성된 PR-1a 프로모터를 함유하는 단편을 겔 정제하여, 이미 이중 35S 프로모터가 제거되어진 pCGN1761ENX내로 클로닝한다. 이는, XhoI에 의한 절단 및 T4 폴리머라제에 의한 평활화 후, HindIII에 의한 절단, 및 pCIB1004 프로모터 단편이 클로닝되어진 대형 벡터-터미네이터-함유 단편의 분리를 통해 수행된다. 이로써, PR-1a 프로모터, tml 터미네이터, 및 특유의 EcoRI 및 NotI 부위를 갖는 개재 폴리링커를 포함하는 pCGN1761ENX가 생성된다.
본 발명의 DNA 분자는 상기 벡터내에 삽입되며, 융합 생성물(즉, 프로모터-유전자-터미네이터)이, 본원에서 기술된 것을 포함하는 임의의 선택된 형질전환 벡터로 실질적으로 전달되므로, DNA 분자의 화학적 유도성 발현이 제공된다.
구성적 발현: 액틴 프로모터
액틴의 몇몇 동형(isofoam)이 대부분의 세포 유형에서 발현된다는 것이 공지되어 있으므로, 액틴 프로모터를 구성적 프로모터로서 선택하는 것이 좋다. 특히, 벼 Act1 유전자로 부터의 프로모터가 클로닝되어, 특성이 분석되었다[참조: McElroy et al., Plant Cell 2: 163-171 (1990)]. 프로모터의 1.3kb 단편이 벼 원형질체에서의 발현에 요구되는 모든 조절 요소를 포함한다는 것이 밝혀졌다. 게다가, Act1 프로모터를 기본으로 하는 수 많은 발현 벡터가 특히 단자엽 식물에서 사용하기 위해 작제되었다[참조: McElroy et al., Mol. Gen. Genet. 231: 150-160 (1991)]. 이들은 Act1-인트론 1, Adh1 5'플랭킹 서열 및 Adh1-인트론 1(옥수수 알코올 디하이드로게나제 유전자로 부터 수득) 및 CaMV 35S 프로모터로 부터의 서열을 포함한다. 최고 수준의 발현을 나타내는 벡터는 35S 및 Act1 인트론 또는 Act1 5'플랭킹 서열 및 Act1 인트론의 융합체이다. 문헌[McElroy et al., Mol. Gen. Genet. 231: 150-160 (1991)]에 기술된 프로모터 발현 카세트를 본 발명의 DNA 분자를 발현시키기 위해 용이하게 변형시킬 수 있으며, 이는 단자엽 식물에서 사용하기에 특히 적합하다. 예를 들면, 프로모터-함유 단편을 McElroy 작제물로 부터 제거하여 pCGN176ENX내의 이중 35S 프로모터를 대체하는데 사용하며, 이 후 이는 특정 유전자 서열의 삽입에 이용될 수 있다. 이와 같이 작제된 융합 유전자를 적당한 형질전환 벡터로 전달한다. 별도의 보고서에 의하면, 제1 인트론을 지닌 벼 Act1 프로모터가 배양된 보리 세포에서 고수준의 발현을 지시한다는 것이 밝혀졌다[Chibbar et al. Plant Cell Rep. 12: 506-509(1993)].
본 발명의 DNA 분자를 이러한 프로모터의 하부에 삽입하고, 이어서, 융합 생성물(즉, 프로모터-유전자-터미네이터)을 본원에 기술된 것들을 포함하여 임의로선택된 형질전환 벡터로 전달한다.
구성적 발현: 우비퀴틴 프로모터
우비퀴틴은 다수의 세포 유형에서 축적되는 것으로 공지된 또 다른 유전자 생성물이며, 이의 프로모터가 유전자전이된 식물에서 사용하기 위하여 여러 종으로 부터 클로닝되었다[참조: 해바라기-Binet et al. Plant Science 79: 87-94(1991), 옥수수-Christensen et al. Plant Molec. Biol. 12:619-632 (1989)]. 옥수수 우비퀴틴 프로모터는 유전자전이된 단자엽 식물 시스템에서 개발되었으며 단자엽 식물 형질전환을 위해 작제된 이의 서열 및 벡터가 특허 공보 EP 0 342 926에 기술되어 있다. 문헌[Taylor et al., Plant Cell Rep. 12: 491-495 (1993)]에는 옥수수 우비퀴틴 프로모터 및 제1 인트론을 포함하고 미세투사체 폭격을 통해 도입시 수 많은 단자엽 식물의 세포 현탁액에서 이의 고활성을 나타내는 벡터(pAHC25)가 기술되어 있다. 우비퀴틴 프로모터는 유전자전이된 식물, 특히 단자엽 식물에서 본 발명의 DNA 분자를 발현시키기에 특히 적합하다. 적당한 우비퀴틴 프로모터 및/또는 인트론 서열의 도입에 의해 변형된, 본원에서 기술된 임의의 형질전환 벡터 또는 pAHC25의 유도체가 적합한 벡터이다.
따라서, 본 발명의 DNA 분자를 이들 벡터중 하나에 삽입하고, 융합 생성물(즉, 프로모터-유전자-터미네이터)을 식물의 형질전환에 사용하여, DNA 분자의 구성적 발현을 달성한다.
뿌리 특이적 발현
본 발명의 DNA 분자를 위한 바람직한 발현 패턴은 뿌리 발현이다. 단지 뿌리 조직에서의 뉴클레오티드 서열의 발현은, 잎과 꽃 조직 및 종자에서의 발현을 변경시키지 않으면서, 단지 뿌리의 표적 유전자의 발현을 변경시키는 이점을 갖는다. 적당한 뿌리 프로모터는 문헌[de Framond, FEBS 290: 103-106 (1991) 및 공개된 특허원 EP 0 452 269]에 기술되어 있다. 이 프로모터를 적합한 벡터(예: pCGN1761ENX)로 전달하고, DNA 분자를 이러한 벡터에 삽입시킨다. 이어서, 전체 프로모터-유전자-터미네이터 카세트를 목적하는 형질전환 벡터로 전달한다.
상처 유도성 프로모터
수 많은 이러한 프로모터가 문헌[Xu et al., Plant Molec. Biol. 22: 573-588 (1993), Logemann et al., Plant Cell 1: 151-158 (1989), Rohrmeier & Lehle, Plant Molec. Biol. 22: 783-792 (1993), Frik et al., Plant Molec. Biol. 22: 129-142 (1993), Warner et al., Plant J. 3: 191-201 (1993)]에 기술되어 있으며, 이들은 모두 본 발명에 사용하기에 적합하다. 문헌[Logemann et al. (supra)]에는 쌍자엽식물인 감자 wun1 유전자 5' 상부 서열이 기술되어 있다. 문헌[Xu et al. (supra)]에는 쌍자엽식물인 감자 (pin2)로 부터의 상처 유도성 프로모터가 단자엽식물인 벼에서 활성임이 나타나 있다. 또한, 문헌[Rohrmeier & Lehle (supra)]에는, 상처에 의해 유도되고 표준 기술로 동족 프로모터를 분리하는데 사용될 수 있는 옥수수 Wip1 cDNA의 클로닝이 기술되어 있다. 유사하게, 문헌[Firek et al. (supra) and Warner et al. (supra)]에는, 국소 상처 및 병원균 침입 부위에서 발현되는, 단자엽식물 아스파라구스 오피시날리스(Asparagus officinalis)로 부터의 상처-유도 유전자가 기술되어 있다. 당업계에서 익히 공지된 클로닝 기술을 사용하여, 이들 프로머터를 적합한 벡터로 전달하고, 본 발명의 DNA 분자에 융합시키고, 해충 감염 부위에서 이들 유전자를 발현시키는데 사용할 수 있다.
수(pith)-우선적 발현
특허원 WO 93/07278에는, 수 세포에서 우선적으로 발현되는 옥수수 trpA 유전자의 분리가 기술되어있다. 표준 분자 생물학적 기술을 사용하여, 이 프로모터 또는 이의 부분을 벡터(예: pCGN1761)로 전달할 수 있으며, 이 경우에 이는 35S 프로모터를 대체할 수 있으며 수-우선적 방식으로 본 발명의 DNA 분자의 발현을 유도하는데 사용될 수 있다. 실제로, 수-우선적 프로모터 또는 이의 부분을 포함하는 단편을 임의의 벡터로 전달할 수 있으며, 유전자전이된 식물에서 이용하기 위해 변형시킬 수 있다. DNA 분자의 수-우선적 발현은 상기와 같은 벡터내에 상기 DNA 분자를 삽입함으로써 달성된다.
화분-특이적 발현
또한, 특허원 WO 93/07278에는, 화분 세포에서 발현되는 옥수수 칼슘-의존형 단백질 키나제(CDPK)의 분리가 기술되어 있다. 당해 유전자 서열 및 프로모터는 전사의 개시부 부터 1400bp에 이른다. 표준 분자 생물학 기술을 사용하여, 이 프로모터 또는 이의 부분을 벡터(예: pCGN1761)로 전달할 수 있으며, 이 경우에 이는35S 프로모터를 대체할 수 있으며 화분-특이적 방식으로 본 발명의 DNA 분자의 발현을 유도하는데 사용될 수 있다. 실제로, 화분-특이적 프로모터 또는 이의 부분을 포함하는 단편을 임의의 벡터로 전달할 수 있으며, 유전자전이된 식물에서 이용하기 위해 변형시킬 수 있다.
잎-특이적 발현
포스포엔올 카복실라제(PEPC)를 암호화하는 옥수수 유전자가 문헌[Hudspeth & Grula, Plant Molec. Biol. 12: 579-589 (1989)]에 기술되어 있다. 표준 분자 생물학 기술을 사용하여, 이 유전자의 프로모터를 유전자전이된 식물에서 잎-특이적 방식으로 본 발명의 DNA 분자의 발현을 유도하는데 사용한다.
실시예 8: 식물 형질전환 벡터의 작제
수 많은 형질전환 벡터가 식물 형질전환에 이용될 수 있으며, 본 발명의 DNA 분자가 상기한 임의의 발현 카세트내에 삽입되어, 이들은 적당한 조건하, 적절한 세포에서 DNA 분자를 발현할 수 있다. 이어서, 발현 카세트-함유 뉴클레오티드 서열을 상기한 임의의 적당한 형질전환 벡터내에 삽입한다.
사용하고자 하는 벡터의 선택은 바람직한 형질전환 기술 및 형질전환하고자하는 표적 종에 따라 달라질 수 있다. 특정 표적 종의 경우, 상이한 항생제 또는 제초제 선별 마커가 바람직할 수 있다. 형질전환에 통상적으로 사용되는 선별 마커로는 카나마이신 및 관련 항생제에 대한 내성을 부여하는 nptII 유전자[참조:Messing & Vierra. Gene 19: 259-268 (1982); Bevan et al., Nature 304: 184-187 (1983)], 제초제인 포스피노트리신에 대한 내성을 부여하는 bar 유전자[참조: White et al., Nucl. Acids Res 18: 1062 (1990), Spencer et al. Theor. Appl. Genet 79: 625-631 (1990)], 항생제 히그로마이신에 대한 내성을 부여하는 hph 유전자[참조: Blochinger & Diggelmann, Mol Cell Biol 4: 2929-2931)], 및 메토트렉세이트에 대한 내성을 부여하는 dhfr 유전자[참조: Bourouis et al., EMBO J. 2(7); 1099-1104 (1983)]가 포함된다.
(1) 아그로박테리움 형질전환에 적합한 벡터의 작제
다수의 벡터가 아그로벡테리움 투메파시엔스를 사용한 형질전환에 이용가능하다. 이들은 전형적으로 하나 이상의 T-DNA 보더(border) 서열을 수반하고, 이에는 pBIN19와 같은 벡터가 포함된다[참조: Bevan, nucl. Acids Res. (1984)]. 두 개의 전형적 벡터가 후술된다.
pCIB200 및 pCIB2001의 작제
이원성 벡터 pCIB200 및 pCIB2001를, 아그로박테리움과 사용하기 위한 재조합 벡터를 작제하는데 사용하고, 다음과 같은 방법으로 작제한다. pTJS75[참조: Schmidhauser & Helinski, J Bacteriol. 164: 446-455 (1985)]를 NarI으로 분해하여 테트라사이클린-내성 유전자를 잘라낸 후, NPTII[참조: Messing & Vierra, Gene 19: 259-268 (1982); Bevan et al., Nature 304: 184-187 (1983); McBride et al.,Plant Molecular Biology 14: 266-276 (1990)]을 수반하는 pUC4K로 부터의 AccI 단편을 삽입하여, pTJS75kan을 제조한다. 좌우 T-DNA 보더, 식물 선별가능한 nos/nptII 키메라성 유전자 및 pUC 폴리링커[참조: Rothstein et al., Gene 53: 153-161 (1987)]을 포함하는 pCIB7의 EcoRV 단편에 XhoI 링커를 결합시키고, XhoI-분해된 단편을 SalI-분해된 pTJS75kan내로 클로닝시켜 pCIB200를 제조한다[참조: EP 0 332 104]. pCIB200은 다음과 같은 특유의 폴리링커 제한 부위를 포함한다: EcoRI, SstI, KpnI, BglII, XbaI, 및 SalI. pCIB2001은 부가적 제한 부위를 폴리링커로 삽입함으로써 제조된 pCIB200의 유도체이다. pCIB2001의 폴리링커내의 특유의 제한 부위는 EcoRI, SstI, KpnI, BglII, XbaI, SalI, MluI, BclI AvrII, HpaI 및 StuI이다. pCIB2001은, 이러한 특유의 제한 부위를 포함하는 것 외에, 식물과 박테리아 선별성, 아그로박테리움-매개된 형질전환을 위한 좌우 T-DNA 보더, 이. 콜라이와 다른 숙주간의 이동을 위한 RK2-유도된 trfA 기능, 및 RK2로 부터의 OriT와 OriV 기능을 갖는다. pCIB2001 폴리링커는 자신의 조절 시그날을 포함하는 식물 발현 카세트를 클로닝하는데 적합하다.
상기한 바와 같이 본 발명의 DNA 분자를 포함하는 식물 발현 카세트중 임의의 하나를, 바람직하게는 폴리링커를 사용하여 pCIB2001내로 삽입한다.
pCIB10 및 이의 히그로마이신 선별 유도체의 작제
이원성 벡터 pCIB10은 식물에서 선별하기 위한 카나마이신 내성을 암호화하는 유전자, 및 T-DNA 좌우 보더를 포함하며, 숙주 범위가 광범위한 플라스미드pRK252로 부터의 서열이 삽입되어 이.콜라이와 아그로박테리움 둘다에서 복제될 수 있다. 이의 작제법은 문헌[Rothstein et al., Gene 53: 153-161 (1987)]에 기술되어 있다. 히그로마이신 B 포스포트랜스퍼라제에 대한 유전자가 삽입된 다양한 pCIB10 유도체가 작제되었다[참조: Gritz et al., Gene 25: 179-188 (1983)]. 이들 유도체를 통해, 단지 히그로마이신(pCIB743)에 대해, 또는 히그로마이신과 카나마이신(pCIB715, pCIB717)에 대해 유전자전이된 식물 세포를 선별할 수 있다. 이러한 벡터는 본 발명의 DNA 분자를 포함하는 발현 카세트를 형질전환하는데 사용된다.
(2) 비-아그로박테리움 형질전환에 적합한 벡터의 작제
아그로박테리움 튜메파시엔스를 사용하지 않는 형질전환의 경우, 선택된 형질전환 벡터내에 T-DNA 서열이 요구되지 않으며, 따라서 이들 서열이 결핍된 벡터는 T-DNA 서열을 포함하는 상기와 같은 벡터와 함께 사용된다. 아그로박테리움에 의존하지 않는 형질전환 기술에는 입자 폭격, 원형질체 흡수(예: PEG 및 전기천공), 미세주입 또는 화분 형질전환(미국 특허 제5,629,183호)을 통한 형질전환이 포함된다. 벡터의 선택은 형질전환되는 종을 위한 바람직한 선별법에 주로 의존한다. 전형적인 몇몇 벡터의 작제법이 후술된다.
pCIB3064의 작제
pCIB3064는 제초제 바스타(basta)(또는 포스피노트리신)에 의한 선별과 함께직접적 유전자 전달에 적합한 pUC-유도된 벡터이다. 플라스미드 pCIB246은 이.콜라이 GUS 유전자에 작동적으로 융합된 CaMV 35S 프로모터 및 CaMV 35S 터미네이터를 포함하며, 국제출원 제WO 93/07278호에 기술되어 있다. 이 벡터의 35S 프로모터는 개시 부위의 5'에 두 개의 ATG를 포함한다. 이들 부위를 표준 PCR 기술을 사용하여 돌연변이화하여 ATG를 제거하고 제한 부위 SspI 및 PvuII를 제조한다. 새로운 제한 부위는 특유의 SalI 부위로 부터 96bp 및 37bp만큼 떨어져 있으며, 실제 개시 부위로 부터 101bp 및 42bp만큼 떨어져 있다. 생성된 pCIB246 유도체를 pCIB3025로 명명한다. 이어서, SalI 및 SacI으로 분해하여 pCIB3025로 부터 GUS 유전자를 잘라내고, 말단을 평활화한 다음 재결합시켜 플라스미드 pCIB3060을 제조한다. 플라스미드 pJIT82는 노리지 소재의 존 인 센타(John Innes Centre)로 부터 수득하고, 스트렙토마이세스 비리도크로모게네스(Streptomyces viridochromogenes)로 부터의 bar 유전자를 포함하는 400bp의 SmaI 단편을 잘라내고 pCIB3060의 HpaI 부위내로 삽입한다[참조: Thompson et al., EMBO J 6: 2519-2523 (1987)]. 이로써, 제초제 선별을 위한 CaMV 35S 프로모터 및 터미네이터의 통제하의 bar 유전자, 앰피실린 내성을 위한 유전자(이.콜라이에서의 선별용), 및 특유의 SphI, PstI, HindIII 및 BamHI 부위를 갖는 폴리링커를 포함하는 pCIB3064가 제조된다. 이 벡터는, 본 발명의 DNA 분자의 발현을 지시하는 자신의 조절 시그날을 포함하는 식물 발현 카세트를 클로닝하는데 적합하다.
pSOG19 및 pSOG35의 작제
pSOG35는 이.콜라이 유전자 디하이드로폴레이트 리덕타제(DHFR)를 메토트렉세이트에 대한 내성을 부여하는 선별 마커로서 이용하는 형질전환 벡터이다. PCR을 사용하여 35S 프로모터(~800bp), 옥수수 Adh1 유전자로 부터의 인트론 6(~550bp) 및 pSOG10으로 부터의 GUS 해독되지 않는 리더 서열(18bp)를 증폭시킨다. 이.콜라이 디하이드로폴레이트 리덕타제 제II형 유전자를 암호화하는 250bp의 단편을 또한 PCR로 증폭시키고, 이들 두 개의 PCR 단편을 pUC 벡터 주쇄와 노팔린 신타제 터미네이터를 포함하는 pBI221(Clontech)로 부터의 SacI-PstI 단편과 조립한다. 이들 단편을 조립함으로써, 인트론 6 서열, GUS 리더, DHFR 유전자 및 노팔린 신타제 터미네이터와 융합된 35S 프로모터를 포함하는 pSOG19가 제조된다. pSOG19내의 GUS 리더를 옥수수 클로로틱 모틀 바이러스(MCMV)로 부터의 리더 서열로 대체함으로써, pSOG35가 제조된다. pSOG19 및 pSOG35는 앰피실린 내성을 위한 pUC 유전자를 수반하고, 외래 서열, 특히 본 발명의 DNA 분자를 클로닝하는데 이용될 수 있는 HindIII, SphI, PstI 및 EcoRI 부위를 갖는다.
실시예 9: 엽록체 형질전환
형질전환 벡터
식물 유색체에서 본 발명의 DNA 분자를 발현시키기 위하여, 유색체 형질전환 벡터 pPH143(참조: WO 97/32011, 실시예 36)을 사용한다. DNA 분자를 pPH143내로 삽입하여, PROTOX 암호 서열을 대체한다. 이어서, 이 벡터를 유색체 형질전환, 및 스펙티노마이신 내성에 대한 형질전환체의 선별에 사용한다. 달리, 상기 DNA 분자를 pPH143내에 삽입하여, aadH 유전자를 대체한다. 이 경우에, 형질전환체는 PROTOX 억제제에 대한 내성을 기준으로 선별한다.
엽록체 형질전환
니코티아나 타바쿰(Nicotiana tabacum) c.v. 'Xanthi nc'의 종자를 T 아가 배지상에 1" 환상 배열로 플레이트당 7개를 발아시키고, 파종한지 12 내지 14일 후, 문헌[Svab, Z and Maliga, P. (1993) PNAS 90, 913-917]에 기술된 바와 같이 플라스미드 pPH145 및 pPH143로 부터의 DNA로 피복된 1㎛ 텅스텐 입자[M10, Biorad, Hercules, CA]로 폭격한다. 폭격된 묘목을 T 배지에서 2일간 배양한 후, 잎을 잘라내어, 500㎍/ml 스펙티노마이신 디하이드로클로라이드(Sigma, St Louis MO)을 함유하는 RMOP 배지[Svab, Z., Hajdukiewicz, P. and Maliga, P. (1990) PNAS 87, 8526-8530]의 플레이트 상에 배축면을 위로 하여 전조등(350 내지 500μmol 광자/m2/s)하에 둔다. 폭격한지 3 내지 8주 후, 탈색된 잎 아래에 보이는 내성을 지닌 발아를 동일한 선택 배지상에서 서브클로닝하고, 칼루스가 형성되도록 하며, 제2 발아를 분리하여, 서브클로닝한다. 독립적 서브클론중의 형질전환된 유색체 게놈 복사체의 완전한 분리를 서던 블롯팅의 표준 기술을 사용하여 평가한다[참조: Sambrook et al., (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor]. BamHI/EcoRI-분해된 전체 세포 DNA[참조: Mettler, I. J. (1987) Plant Mol Biol Reporter 5, 346-349]를 1% 트리스-보레이트(TBE) 아가로즈 겔상에서 분리하고, 나일론 막(Amersham)으로 옮기고, rps7/12 유색체 표적화 서열 부분을 포함하는 pC8로 부터의 0.7kb BamHI/HindIII DNA 단편에 상응하는,32P-표지화된 무작위적 프라이밍된 DNA 서열로 탐지한다. 호모플라즘 발아가 스펙티노마이신-함유 MS/IBA 배지[McBride, K.E. et al. (1994) PNAS 91, 7301-7305]상에서 무균적으로 뿌리를 내리면, 온실로 옮긴다.

Claims (34)

  1. 이본쇄 RNA 분자를 형성할 수 있는, 표적 유전자의 센스 RNA 단편과 표적 유전자의 안티센스 RNA 단편을 식물 세포내로 도입함을 특징으로 하여, 식물 세포에서 표적 유전자의 발현을 변경시키는 방법.
  2. 제1항에 있어서, RNA 단편들이 상이한 RNA 분자로 이루어진 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 제1항에 있어서, RNA 단편들이 하나의 RNA 분자로 이루어진 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제3항에 있어서, RNA 분자가, 이 RNA 분자중에 포함된 RNA 단편이 이본쇄 영역을 형성하도록 폴딩될 수 있는 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 표적 유전자의 센스 RNA 단편을 식물 세포에서 발현시킬 수 있는 제1 DNA 서열 및 표적 유전자의 안티센스 RNA 단편을 식물 세포에서 발현시킬 수 있는 제2 DNA 서열(여기서, 센스 RNA 단편과 안티센스 RNA 단편은 이본쇄 RNA 분자를 형성할 수 있다)을 식물 세포내로 도입함을 특징으로 하여, 식물 세포에서 표적 유전자의 발현을 변경시키는 방법.
  6. 제5항에 있어서, 표적 유전자가 식물 세포의 필수 유전자인 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 제5항에 있어서, 표적 유전자가 식물 세포의 게놈내에 안정하게 통합된 이종성 유전자인 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 제7항에 있어서, 이종성 유전자가 염색체외 분자로서 식물 세포에 존재하는 방법.
  9. 제5항에 있어서, 제1 DNA 서열 및 제2 DNA 서열이 식물 세포의 게놈내에 안정하게 통합되는 것을 특징으로 하는 방법.
  10. 제5항에 있어서, 제1 DNA 서열 및 제2 DNA 서열이 두 개의 상이한 DNA 분자로 이루어진 것을 특징으로 하는 방법.
  11. 제10항에 있어서, DNA 분자가 제1 DNA 서열에 작동적으로 연결된 제1 프로모터 및 제2 DNA 서열에 작동적으로 연결된 제2 프로모터를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  12. 제5항에 있어서, 제1 DNA 서열 및 제2 DNA 서열이 하나의 DNA 분자로 이루어진 것을 특징으로 하는 방법.
  13. 제12항에 있어서, 제1 DNA 서열 및 제2 DNA 서열이 DNA 분자의 동일한 DNA쇄로 이루어진 것을 특징으로 하는 방법.
  14. 제13항에 있어서, 센스 RNA 단편과 안티센스 RNA 단편이 하나의 RNA 분자로서 발현되는 것을 특징으로 하는 방법.
  15. 제14항에 있어서, RNA 분자가, 이 RNA 분자중에 포함된 RNA 단편이 이본쇄 영역을 형성하도록 폴딩될 수 있는 것을 특징으로 하는 방법.
  16. 제14항에 있어서, DNA 분자가 제1 또는 제2 DNA 서열에 작동적으로 연결된 프로모터를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  17. 제16항에 있어서, 프로모터가 고유 표적 유전자의 고유 프로모터, 이종성 프로모터, 구성적 프로모터, 유도성 프로모터, 조직-특이적 프로모터 또는 발생단계상 조절되는 프로모터인 것을 특징으로 하는 방법.
  18. 제12항에 있어서, DNA 분자가 센스 RNA 단편과 안티센스 RNA 단편을 암호화하는 DNA 서열사이에 링커를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  19. 제18항에 있어서, 링커가 선별가능한 마커 유전자와 같은 기능 유전자를 포함하는 발현 카세트를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  20. 제18항에 있어서, 링커가 인트론 프로세싱 시그날과 같은 조절 서열을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  21. 제13항에 있어서, 센스 RNA 단편과 안티센스 RNA 단편이 두 개의 RNA 분자로서 발현되는 것을 특징으로 하는 방법.
  22. 제21항에 있어서, 제1 DNA 서열이 제1 프로모터에 작동적으로 연결되고, 제2 DNA 서열이 제2 프로모터에 작동적으로 연결되는 것을 특징으로 하는 방법.
  23. 제21항에 있어서, 제1 DNA 서열 및 제2 DNA 서열이 이방향성 프로모터에 작동적으로 연결되는 것을 특징으로 하는 방법.
  24. 제12항에 있어서, 제1 DNA 서열 및 제2 DNA 서열이 DNA 분자의 상보적 쇄로 이루어진 것을 특징으로 하는 방법.
  25. 제24항에 있어서, 제1 DNA 서열이 DNA 분자중의 제2 DNA 서열의 상보적 DNA 쇄인 것을 특징으로 하는 방법.
  26. 제24항에 있어서, DNA 분자가 제1 DNA 분자에 작동적으로 연결된 제1 프로모터를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  27. 제26항에 있어서, DNA 분자가 제1 프로모터와 제1 DNA 서열사이의 제1 부위-특이적 재조합 부위 및 제1 DNA 서열의 3'말단에 제2 부위-특이적 재조합 부위를 포함하고, 제1 및 제2 부위-특이적 재조합 부위가 부위-특이적 재조합효소의 존재하에서 제1 및 제2 부위-특이적 재조합 부위사이의 제1 DNA 서열을 역전시킬 수 있는 것을 특징으로 하는 방법.
  28. 제27항에 있어서, 제1 DNA 서열이 역전됨으로써 제1 프로모터가 제2 DNA 서열을 발현시킬 수 있는 것을 특징으로 하는 방법.
  29. 제27항에 있어서, 식물 세포가 부위-특이적 재조합 부위를 인식할 수 있는 부위-특이적 재조합효소를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  30. 제26항에 있어서, DNA 분자가 제2 DNA 서열에 작동적으로 연결된 제2 프로모터를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  31. 표적 유전자의 센스 RNA 단편을 발현시킬 수 있는 제1 DNA 서열 및 표적 유전자의 안티센스 RNA 단편을 발현시킬 수 있는 제2 DNA 서열(여기서, 센스 RNA 단편과 안티센스 RNA 단편은 이본쇄 RNA 분자를 형성할 수 있다)을 포함하고, 이들 DNA 서열이 발현되는 경우, 식물에서 표적 유전자의 발현이 변경되는 식물 세포.
  32. 제31항의 식물 세포로 부터 유래된 식물 및 이의 자손.
  33. 제32항의 식물로 부터 유래된 종자.
  34. 표적 유전자의 센스 RNA 단편을 식물 세포에서 발현시킬 수 있는 제1 DNA 서열 및 표적 유전자의 안티센스 RNA 단편을 식물세포에서 발현시킬 수 있는 제2 DNA 서열(여기서, 센스 RNA 단편과 안티센스 RNA 단편은 이본쇄 RNA 분자를 형성할 수 있다)을 식물 세포내로 도입함으로써 수득되는 식물 세포.
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Families Citing this family (215)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6506559B1 (en) 1997-12-23 2003-01-14 Carnegie Institute Of Washington Genetic inhibition by double-stranded RNA
AUPP249298A0 (en) 1998-03-20 1998-04-23 Ag-Gene Australia Limited Synthetic genes and genetic constructs comprising same I
SK287538B6 (sk) 1998-03-20 2011-01-04 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation Syntetický gén obsahujúci dispergovanú alebo cudzorodú deoxyribonukleovú molekulu, génový konštrukt obsahujúci tento syntetický gén a prípravok obsahujúci tento syntetický gén
US8598332B1 (en) 1998-04-08 2013-12-03 Bayer Cropscience N.V. Methods and means for obtaining modified phenotypes
US20040214330A1 (en) 1999-04-07 2004-10-28 Waterhouse Peter Michael Methods and means for obtaining modified phenotypes
GB9827152D0 (en) * 1998-07-03 1999-02-03 Devgen Nv Characterisation of gene function using double stranded rna inhibition
US7005423B1 (en) 1999-07-02 2006-02-28 Devgen Nv Characterization of gene function using double stranded RNA inhibition
AU776150B2 (en) * 1999-01-28 2004-08-26 Medical College Of Georgia Research Institute, Inc. Composition and method for (in vivo) and (in vitro) attenuation of gene expression using double stranded RNA
DE19956568A1 (de) 1999-01-30 2000-08-17 Roland Kreutzer Verfahren und Medikament zur Hemmung der Expression eines vorgegebenen Gens
AU2008202208C1 (en) * 1999-01-30 2014-04-24 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Method and medicament for inhibiting the expression of a defined gene
EA200101186A1 (ru) * 1999-05-10 2002-04-25 Зингента Партисипейшнс Аг Регуляция экспрессии вирусных генов
US6423885B1 (en) 1999-08-13 2002-07-23 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organization (Csiro) Methods for obtaining modified phenotypes in plant cells
US7531718B2 (en) 1999-08-26 2009-05-12 Monsanto Technology, L.L.C. Nucleic acid sequences and methods of use for the production of plants with modified polyunsaturated fatty acids
US7067722B2 (en) 1999-08-26 2006-06-27 Monsanto Technology Llc Nucleic acid sequences and methods of use for the production of plants with modified polyunsaturated fatty acids
CA2382693C (en) 1999-08-26 2013-10-01 Calgene Llc Nucleic acid sequences and methods of use for the production of plants with modified polyunsaturated fatty acids
WO2001029058A1 (en) 1999-10-15 2001-04-26 University Of Massachusetts Rna interference pathway genes as tools for targeted genetic interference
GB9925459D0 (en) 1999-10-27 1999-12-29 Plant Bioscience Ltd Gene silencing
DE10100586C1 (de) 2001-01-09 2002-04-11 Ribopharma Ag Verfahren zur Hemmung der Expression eines Ziegens
US7829693B2 (en) 1999-11-24 2010-11-09 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for inhibiting expression of a target gene
WO2001049844A1 (en) * 1999-12-30 2001-07-12 Rutgers, The State University Of New Jersey Compositions and methods for gene silencing
US8202979B2 (en) 2002-02-20 2012-06-19 Sirna Therapeutics, Inc. RNA interference mediated inhibition of gene expression using chemically modified short interfering nucleic acid
US7491805B2 (en) 2001-05-18 2009-02-17 Sirna Therapeutics, Inc. Conjugates and compositions for cellular delivery
US8273866B2 (en) 2002-02-20 2012-09-25 Merck Sharp & Dohme Corp. RNA interference mediated inhibition of gene expression using chemically modified short interfering nucleic acid (SINA)
US7833992B2 (en) 2001-05-18 2010-11-16 Merck Sharpe & Dohme Conjugates and compositions for cellular delivery
WO2001075164A2 (en) 2000-03-30 2001-10-11 Whitehead Institute For Biomedical Research Rna sequence-specific mediators of rna interference
HUP0302320A3 (en) * 2000-06-23 2005-11-28 Pioneer Hi Bred Int Recombinant constructs and their use in reducing gene expression
WO2002059257A2 (en) 2000-10-31 2002-08-01 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation Method and means for producing barley yellow dwarf virus resistant cereal plants
CH695778A5 (de) * 2000-11-29 2006-08-31 Hoffmann La Roche Hemmung der Transkription eines Zielgens in einer Zelle oder in Geweben.
TR200401292T3 (tr) 2000-12-01 2004-07-21 Max@Planck@Gesellschaft�Zur�F�Rderung�Der�Wissenschaften RNAÁgirişimineÁyolÁaçanÁküçükÁRNAÁmolekülleri
WO2002059300A2 (en) * 2000-12-28 2002-08-01 J & J Research Pty Ltd Double-stranded rna-mediated gene suppression
AU2002246742B2 (en) * 2000-12-28 2008-02-07 J & J Research Pty Ltd Double-stranded RNA-mediated gene suppression
US7423142B2 (en) 2001-01-09 2008-09-09 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for inhibiting expression of anti-apoptotic genes
US8546143B2 (en) 2001-01-09 2013-10-01 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for inhibiting expression of a target gene
US7767802B2 (en) 2001-01-09 2010-08-03 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for inhibiting expression of anti-apoptotic genes
NZ526507A (en) 2001-01-26 2005-07-29 Commw Scient Ind Res Org Methods and means for producing efficient silencing construct using recombinational cloning
EP1229134A3 (en) 2001-01-31 2004-01-28 Nucleonics, Inc Use of post-transcriptional gene silencing for identifying nucleic acid sequences that modulate the function of a cell
EP1386004A4 (en) 2001-04-05 2005-02-16 Ribozyme Pharm Inc MODULATION OF GENE EXPRESSION ASSOCIATED WITH INFLAMMATORY PROLIFERATION AND GROWTH OF NEURITIES BY METHODS INVOLVING NUCLEIC ACID
US20050148530A1 (en) 2002-02-20 2005-07-07 Sirna Therapeutics, Inc. RNA interference mediated inhibition of vascular endothelial growth factor and vascular endothelial growth factor receptor gene expression using short interfering nucleic acid (siNA)
US7109165B2 (en) 2001-05-18 2006-09-19 Sirna Therapeutics, Inc. Conjugates and compositions for cellular delivery
US9994853B2 (en) 2001-05-18 2018-06-12 Sirna Therapeutics, Inc. Chemically modified multifunctional short interfering nucleic acid molecules that mediate RNA interference
ES2192945B1 (es) * 2001-07-06 2005-03-01 Consejo Superior De Investigaciones Cientificas Un metodo para interferir con la infeccion de virus en plantas.
CA2921821A1 (en) 2001-07-12 2003-01-23 University Of Massachusetts In vivo production of small interfering rnas that mediate gene silencing
DE10163098B4 (de) 2001-10-12 2005-06-02 Alnylam Europe Ag Verfahren zur Hemmung der Replikation von Viren
US7745418B2 (en) 2001-10-12 2010-06-29 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for inhibiting viral replication
DE10202419A1 (de) 2002-01-22 2003-08-07 Ribopharma Ag Verfahren zur Hemmung der Expression eines durch eine Chromosomen-Aberration entstandenen Zielgens
US9657294B2 (en) 2002-02-20 2017-05-23 Sirna Therapeutics, Inc. RNA interference mediated inhibition of gene expression using chemically modified short interfering nucleic acid (siNA)
US9181551B2 (en) 2002-02-20 2015-11-10 Sirna Therapeutics, Inc. RNA interference mediated inhibition of gene expression using chemically modified short interfering nucleic acid (siNA)
JP2006503548A (ja) * 2002-03-14 2006-02-02 コモンウェルス　サイエンティフィック　アンド　インダストリアル　リサーチ　オーガニゼーション 遺伝子サイレンシングをモニタリングおよび調節するための方法および手段
US7566813B2 (en) 2002-03-21 2009-07-28 Monsanto Technology, L.L.C. Nucleic acid constructs and methods for producing altered seed oil compositions
US7166771B2 (en) 2002-06-21 2007-01-23 Monsanto Technology Llc Coordinated decrease and increase of gene expression of more than one gene using transgenic constructs
CA2479587A1 (en) 2002-03-21 2003-10-02 Monsanto Technology Llc Nucleic acid constructs and methods for producing altered seed oil compositions
US20040180438A1 (en) 2002-04-26 2004-09-16 Pachuk Catherine J. Methods and compositions for silencing genes without inducing toxicity
AU2003251579B2 (en) * 2002-06-21 2008-04-03 Monsanto Technology Llc Intron double stranded RNA constructs and uses thereof
WO2004001044A1 (en) * 2002-06-21 2003-12-31 Sinogenomax Company Ltd. Randomised dna libraries and double-stranded rna libraries, use and method of production thereof
AU2003260370B2 (en) 2002-08-05 2008-05-22 Silence Therapeutics Gmbh Further novel forms of interfering RNA molecules
US7923547B2 (en) 2002-09-05 2011-04-12 Sirna Therapeutics, Inc. RNA interference mediated inhibition of gene expression using chemically modified short interfering nucleic acid (siNA)
US7365186B2 (en) 2002-11-22 2008-04-29 Arborgen, Llc Vascular-preferred promoter sequences and uses thereof
WO2004061122A2 (en) 2002-12-26 2004-07-22 Syngenta Participations Ag Cell proliferation-related polypeptides and uses therefor
BRPI0411002A (pt) 2003-06-06 2006-05-23 Arborgen Llc polinucleotìdios isolados, fator de transcrição de planta, seqüências de nucleotìdios isolados, construções de dna, células de planta, plantas transgênicas, polpa de madeira, combinações de detecção de expressão de um ou mais polinucleotìdios, microconjunto e kit e métodos de produção de planta transgênica, de rastreamento de promotor, de correlação da expressão de polinucleotìdio em duas amostras diferentes e da posse de um fenótipo de planta com o nìvel de expressão de polinucleotìdio na planta de um ou mais polinucleotìdios e da detecção de um ou mais polinucleotìdios numa amostra
AR047598A1 (es) * 2004-02-10 2006-01-25 Monsanto Technology Llc Semilla de maiz transgenica con mayor contenido de aminoacidos
US7858769B2 (en) 2004-02-10 2010-12-28 Sirna Therapeutics, Inc. RNA interference mediated inhibition of gene expression using multifunctional short interfering nucleic acid (multifunctional siNA)
US7855323B2 (en) 2004-02-10 2010-12-21 Monsanto Technology Llc Recombinant DNA for gene suppression
US7622301B2 (en) 2004-02-24 2009-11-24 Basf Plant Science Gmbh Compositions and methods using RNA interference for control of nematodes
AU2005222902B2 (en) 2004-03-12 2010-06-10 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. iRNA agents targeting VEGF
AU2005244258B2 (en) 2004-04-09 2010-07-01 Monsanto Technology Llc Compositions and methods for control of insect infestations in plants
US10508277B2 (en) 2004-05-24 2019-12-17 Sirna Therapeutics, Inc. Chemically modified multifunctional short interfering nucleic acid molecules that mediate RNA interference
US7453025B2 (en) 2004-09-22 2008-11-18 Arborgen, Llc Reproductive ablation constructs
EP2336333A1 (en) 2004-10-21 2011-06-22 Venganza Inc. Methods and materials for conferring resistance to pests and pathogens of plants
US20060150286A1 (en) * 2004-12-23 2006-07-06 Shihshieh Huang Gene suppression in transgenic plants using multiple constructs
AU2004326206B2 (en) 2004-12-28 2011-03-17 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Improved grain quality through altered expression of seed proteins
MX2007008568A (es) 2005-01-14 2008-01-11 Univ Guelph Gen y proteina de deteccion de azucar regulados por nitrogeno y modulacion de los mismos.
ATE530656T1 (de) 2005-02-23 2011-11-15 Univ North Carolina State Veränderung des alkaloidgehaltes in tabak durch modifikation spezifischer cytochrome p450 gene.
US20060272057A1 (en) 2005-05-25 2006-11-30 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Methods for improving crop plant architecture and yield
US8222028B2 (en) 2005-09-08 2012-07-17 Chromatin, Inc. Plants modified with mini-chromosomes
CN101365801B (zh) 2005-10-28 2013-03-27 阿尔尼拉姆医药品有限公司 抑制亨廷顿基因表达的组合物和方法
WO2007056326A2 (en) 2005-11-04 2007-05-18 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for inhibiting expression of nav1.8 gene
CA2626690A1 (en) 2005-11-09 2007-05-18 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for inhibiting expression of factor v leiden mutant gene
US8058509B2 (en) 2005-12-21 2011-11-15 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Methods and compositions for in planta production of inverted repeats
KR20080094064A (ko) 2006-01-17 2008-10-22 바이오렉스 쎄라퓨틱스, 인코포레이티드 식물에서 ｎ-글리칸의 인간화 및 최적화 조성물 및 방법
CA2821436A1 (en) 2006-02-09 2007-08-16 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Genes for enhancing nitrogen utilization efficiency in crop plants
CN101421406B (zh) 2006-02-13 2016-08-31 孟山都技术有限公司 用于产生改变的种子油组成的核酸构建体和方法
NZ571568A (en) 2006-03-31 2010-11-26 Alnylam Pharmaceuticals Inc Double-stranded RNA molecule compositions and methods for inhibiting expression of Eg5 gene
AR060523A1 (es) 2006-04-19 2008-06-25 Pioneer Hi Bred Int Moleculas de polinucleotidos aislados que corresponden a alelos mutantes y tipo salvaje del gen de maiz d9 y metodos para usarlas
WO2007127919A2 (en) 2006-04-28 2007-11-08 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for inhibiting expression of a gene from the jc virus
CN103614375A (zh) 2006-05-11 2014-03-05 阿尔尼拉姆医药品有限公司 抑制pcsk9基因表达的组合物和方法
CA2652770A1 (en) 2006-05-19 2007-11-29 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Rnai modulation of aha and therapeutic uses thereof
WO2007137220A2 (en) 2006-05-22 2007-11-29 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for inhibiting expression of ikk-b gene
ATE497008T1 (de) 2006-08-31 2011-02-15 Monsanto Technology Llc Verfahren zur herstellung transgener pflanzen
ES2655700T3 (es) 2006-08-31 2018-02-21 Monsanto Technology, Llc ARN pequeños en fase
JP5431940B2 (ja) 2006-09-18 2014-03-05 アルナイラム ファーマシューティカルズ， インコーポレイテッド ＳＣＡＰのＲＮＡｉ調節およびその治療的使用
AU2007299629C1 (en) 2006-09-21 2012-05-10 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for inhibiting expression of the HAMP gene
WO2008067840A1 (en) 2006-12-08 2008-06-12 Swetree Technologies Ab Plants having improved growth characteristics and method for making the same
JP5759673B2 (ja) 2007-03-21 2015-08-05 ブルックヘブン サイエンス アソシエイツ，エルエルシー 組み合わされたヘアピン−アンチセンス組成物および発現を調節するための方法
PE20090064A1 (es) 2007-03-26 2009-03-02 Novartis Ag Acido ribonucleico de doble cadena para inhibir la expresion del gen e6ap humano y composicion farmaceutica que lo comprende
AP3018A (en) 2007-03-29 2014-10-31 Alnylam Pharmaceuticals Inc Compositions and methods for inhibiting expressionof a gene from the ebola
CA2584934A1 (en) 2007-04-17 2008-10-17 University Of Guelph Nitrogen-regulated sugar sensing gene and protein and modulation thereof
EP1995320A3 (en) 2007-05-23 2009-01-07 Syngeta Participations AG Polynucleotide markers
EP2164863A4 (en) 2007-06-15 2010-07-28 Univ Arkansas METHOD FOR THE ADMINISTRATION OF MOLECULES IN CELLS USING A RICIN SUB-UNIT AND RELATED COMPOSITIONS THEREOF
US20100184823A1 (en) 2007-07-05 2010-07-22 Mark Aron Labow dsRNA For Treating Viral Infection
ES2651911T3 (es) 2007-08-14 2018-01-30 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation Métodos mejorados de silenciamiento génico
US8097712B2 (en) 2007-11-07 2012-01-17 Beelogics Inc. Compositions for conferring tolerance to viral disease in social insects, and the use thereof
CN101939431B (zh) 2007-11-12 2015-01-28 北卡罗来纳州立大学 通过修饰特定细胞色素p450基因改变烟草生物碱含量
BRPI0819743A2 (pt) 2007-11-20 2014-10-07 Pioneer Hi Bred Int Ácido nucléico isolado, cassete de expressão, célula hospedeira, planta transgênica, semente transgênica, método para modular a resposta de etileno em uma planta, proteína isolada
EP2245159A2 (en) 2007-12-10 2010-11-03 Alnylam Pharmaceuticals Inc. Compositions and methods for inhibiting expression of factor vii gene
US8809626B2 (en) 2007-12-21 2014-08-19 Keygene N.V. Trichome specific promoters
US8937219B2 (en) 2007-12-28 2015-01-20 Sweetree Technologies Ab Woody plants having improved growth characteristics and method for making the same using transcription factors
CA2716793A1 (en) 2008-03-05 2009-09-11 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for inhibiting expression of eg5 and vegf genes
EP2276511A2 (en) 2008-04-15 2011-01-26 Government of the United States of America, as represented by the Secretary, Department of Health and Human Services Compositions and methods for delivering inhibitory oligonucleotides
BRPI0910848A2 (pt) 2008-04-28 2015-08-18 Univ Michigan Tech Elementos de promotores específicos da fibra
EP3208337A1 (en) 2008-09-02 2017-08-23 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Compositions for combined inhibition of mutant egfr and il-6 expression
JP5529142B2 (ja) 2008-09-25 2014-06-25 アルナイラム ファーマシューティカルズ， インコーポレイテッド 血清アミロイドａ遺伝子の発現を阻害するための脂質製剤組成物および方法
CN102164476A (zh) 2008-09-29 2011-08-24 孟山都技术公司 大豆转基因事件mon87705及其检测方法
US8168775B2 (en) 2008-10-20 2012-05-01 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for inhibiting expression of transthyretin
EP2344640A1 (en) 2008-10-30 2011-07-20 Pioneer Hi-Bred International Inc. Manipulation of glutamine synthetases (gs) to improve nitrogen use efficiency and grain yield in higher plants
WO2010062240A1 (en) 2008-11-03 2010-06-03 Swetree Technologies Ab Vegetabile material, plants and a method of producing a plant having altered lignin properties
CA2743707A1 (en) 2008-12-04 2010-06-10 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Methods and compositions for enhanced yield by targeted expression of knotted1
AU2009324534B2 (en) 2008-12-10 2015-07-30 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. GNAQ targeted dsRNA compositions and methods for inhibiting expression
WO2010099341A1 (en) 2009-02-26 2010-09-02 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for inhibiting expression of mig-12 gene
WO2010101818A1 (en) 2009-03-02 2010-09-10 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Nac transcriptional activators involved in abiotic stress tolerance
US20100267806A1 (en) 2009-03-12 2010-10-21 David Bumcrot LIPID FORMULATED COMPOSITIONS AND METHODS FOR INHIBITING EXPRESSION OF Eg5 AND VEGF GENES
BRPI1014658A2 (pt) 2009-04-14 2019-09-24 Pioneer Hi Bred Int "método para aperfeiçoar a tolerância ao estresse de intrôgenio em uma planta, método para aperfeiçoar a tolerância ao estresse de nitrogênio sob condições com pouco nitrogênio, cassete de expressão, construto, célula vegetal, planta e método de inibição da produção de etileno em uma planta."
CA2764528A1 (en) 2009-06-08 2010-12-16 Nunhems B.V. Drought tolerant plants
EA201270019A1 (ru) 2009-06-15 2012-06-29 Элнилэм Фармасьютикалз, Инк. Двуцепочечная рнк, включенная в липидный состав и мишенью которой является ген pcsk9
US9051567B2 (en) 2009-06-15 2015-06-09 Tekmira Pharmaceuticals Corporation Methods for increasing efficacy of lipid formulated siRNA
EA201200177A1 (ru) 2009-07-24 2012-06-29 Пайонир Хай-Бред Интернэшнл, Инк. Применение связок компонентов домена димеризации для регулирования архитектуры растения
WO2011020023A2 (en) 2009-08-14 2011-02-17 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Lipid formulated compositions and methods for inhibiting expression of a gene from the ebola virus
WO2011041796A1 (en) 2009-10-02 2011-04-07 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Down-regulation of acc synthase for improved plant performance
US8962584B2 (en) 2009-10-14 2015-02-24 Yissum Research Development Company Of The Hebrew University Of Jerusalem, Ltd. Compositions for controlling Varroa mites in bees
TWI412027B (zh) 2009-11-16 2013-10-11 Sony Corp 碟片匣
WO2011067745A2 (en) 2009-12-06 2011-06-09 Rosetta Green Ltd. Compositions and methods for enhancing plants resistance to abiotic stress
TWI465238B (zh) 2009-12-09 2014-12-21 Nitto Denko Corp Ｈｓｐ４７表現之調節
WO2011085062A1 (en) 2010-01-06 2011-07-14 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Identification of diurnal rhythms in photosynthetic and non-photosynthetic tissues from zea mays and use in improving crop plants
US9121022B2 (en) 2010-03-08 2015-09-01 Monsanto Technology Llc Method for controlling herbicide-resistant plants
ES2893199T3 (es) 2010-03-29 2022-02-08 Alnylam Pharmaceuticals Inc Terapia de ARNbc para amiloidosis ocular relacionada con transtiretina (TTR)
EP3578657B1 (en) 2010-04-06 2024-03-20 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for inhibiting expression of cd274/pd-l1 gene
MX344585B (es) 2010-05-28 2016-12-20 Nunhems Bv Platas con un tamaño de fruto incrementado.
WO2011153323A2 (en) 2010-06-02 2011-12-08 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods directed to treating liver fibrosis
US9512188B2 (en) 2010-07-12 2016-12-06 The State Of Israel, Ministry Of Agriculture & Rural Development, Agricultural Research Organization (Aro) (Volcani Center) Isolated polynucleotides and methods and plants using same for regulating plant acidity
WO2012058210A1 (en) 2010-10-29 2012-05-03 Merck Sharp & Dohme Corp. RNA INTERFERENCE MEDIATED INHIBITION OF GENE EXPRESSION USING SHORT INTERFERING NUCLEIC ACIDS (siNA)
CN103370054A (zh) 2010-11-09 2013-10-23 阿尔尼拉姆医药品有限公司 用于抑制Eg5和VEGF基因的表达的脂质配制的组合物和方法
CA2818024C (en) 2010-12-06 2019-09-24 Quark Pharmaceuticals, Inc. Double stranded oligonucleotide compounds comprising positional modifications
EP2681314B1 (en) 2011-03-03 2017-11-01 Quark Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for treating lung disease and injury
MX2013010911A (es) 2011-03-23 2015-03-03 Pioneer Hi Bred Int Metodos para producir un locus de rasgo transgenico complejo.
CA2833876A1 (en) 2011-04-29 2012-11-01 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Down-regulation of a homeodomain-leucine zipper i-class homeobox gene for improved plant performance
TWI658830B (zh) 2011-06-08 2019-05-11 日東電工股份有限公司 Ｈｓｐ47表現調控強化用類視色素脂質體
US10196637B2 (en) 2011-06-08 2019-02-05 Nitto Denko Corporation Retinoid-lipid drug carrier
US20140216118A1 (en) 2011-06-14 2014-08-07 Synthon Biopharmaceuticals B.V. Compositions and Methods for Making and Biocontaining Auxotrophic Transgenic Plants
MX2013015174A (es) 2011-06-21 2014-09-22 Pioneer Hi Bred Int Metodos y composiciones para producir plantas esteriles masculinas.
EP2723861A4 (en) 2011-06-21 2014-12-10 Alnylam Pharmaceuticals Inc COMPOSITIONS AND METHODS FOR INHIBITING HEPCIDINE ANTIMICROBIAL PEPTIDE (HAMP) OR THE ASSOCIATED GENE EXPRESSION
CA2839896A1 (en) 2011-06-21 2012-12-27 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Assays and methods for determining activity of a therapeutic agent in a subject
KR102540778B1 (ko) 2011-06-21 2023-06-07 알닐람 파마슈티칼스 인코포레이티드 아포리포단백질 c-iii(apoc3) 유전자의 발현 억제를 위한 조성물 및 방법
US9068184B2 (en) 2011-06-21 2015-06-30 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for inhibition of expression of protein C (PROC) genes
EP3597750B1 (en) 2011-06-23 2022-05-04 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Serpina1 sirnas: compositions of matter and methods of treatment
AU2012308694B2 (en) 2011-09-13 2018-06-14 Monsanto Technology Llc Methods and compositions for weed control
AU2012308659B2 (en) 2011-09-13 2017-05-04 Monsanto Technology Llc Methods and compositions for weed control
US10806146B2 (en) 2011-09-13 2020-10-20 Monsanto Technology Llc Methods and compositions for weed control
UA116090C2 (uk) 2011-09-13 2018-02-12 Монсанто Текнолоджи Ллс Спосіб та композиція для боротьби з бур'янами (варіанти)
US9840715B1 (en) 2011-09-13 2017-12-12 Monsanto Technology Llc Methods and compositions for delaying senescence and improving disease tolerance and yield in plants
US10760086B2 (en) 2011-09-13 2020-09-01 Monsanto Technology Llc Methods and compositions for weed control
AU2012308686B2 (en) 2011-09-13 2018-05-10 Monsanto Technology Llc Methods and compositions for weed control
US10829828B2 (en) 2011-09-13 2020-11-10 Monsanto Technology Llc Methods and compositions for weed control
US9920326B1 (en) 2011-09-14 2018-03-20 Monsanto Technology Llc Methods and compositions for increasing invertase activity in plants
BR112014010537A2 (pt) 2011-10-31 2017-05-02 Pioneer Hi Bred Int método para modular a sensibilidade ao etileno, planta transgênica, proteína isolada, sequência de polinucleotídeos isolada, polipeptídeo com atividade regulatória de etileno, método para aumentar o rendimento em uma planta, método para melhorar um parâmetro agronômico de uma planta, método de seleção assistida por marcador de uma planta
CN103917647B (zh) 2011-11-03 2020-07-10 夸克制药公司 用于神经保护的方法和组合物
UA116097C2 (uk) 2011-12-11 2018-02-12 Зе Стейт Оф Ізраел, Міністрі Оф Агрікалче Енд Руерал Девелопмент, Агрікалчерал Рісьоч Організейшн, (А.Р.О.), Волкані Сентре Спосіб модуляції провідності устячка рослини
WO2013118120A2 (en) 2012-02-06 2013-08-15 Rosetta Green Ltd. Isolated polynucleotides expressing or modulating micrornas or targets of same, transgenic plants comprising same and uses thereof in improving nitrogen use efficiency, abiotic stress tolerance, biomass, vigor or yield of a plant
MX2014011038A (es) 2012-03-13 2015-06-02 Pioneer Hi Bred Int Reduccion genetica de la fertilidad masculina en plantas.
WO2013138309A1 (en) 2012-03-13 2013-09-19 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Genetic reduction of male fertility in plants
US20150299696A1 (en) 2012-05-02 2015-10-22 Sirna Therapeutics, Inc. SHORT INTERFERING NUCLEIC ACID (siNA) COMPOSITIONS
AR091143A1 (es) 2012-05-24 2015-01-14 Seeds Ltd Ab Composiciones y metodos para silenciar la expresion genetica
EP2885411B1 (en) 2012-08-16 2018-12-05 VIB vzw Means and methods for altering the lignin pathway in plants
MX364070B (es) 2012-10-18 2019-04-10 Monsanto Technology Llc Métodos y composiciones para el control de plagas vegetales.
CN103060374B (zh) * 2012-10-30 2014-05-07 中国农业科学院兰州兽医研究所 一种基于位点特异性重组的rna干扰载体及其构建方法和应用
US10683505B2 (en) 2013-01-01 2020-06-16 Monsanto Technology Llc Methods of introducing dsRNA to plant seeds for modulating gene expression
BR112015015975A2 (pt) 2013-01-01 2018-11-06 A. B. Seeds Ltd. moléculas de dsrna isoladas e métodos de uso das mesmas para silenciamento das moléculas alvo de interesse.
US10000767B2 (en) 2013-01-28 2018-06-19 Monsanto Technology Llc Methods and compositions for plant pest control
CN104955947A (zh) 2013-01-29 2015-09-30 格拉斯哥大学董事会 用于增加植物中胁迫耐受性和生物量的方法和工具
US20160002648A1 (en) 2013-03-11 2016-01-07 Mei Guo Genes for improving nutrient uptake and abiotic stress tolerance in plants
WO2014164116A1 (en) 2013-03-13 2014-10-09 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Functional expression of bacterial major facilitator superfamily (sfm) gene in maize to improve agronomic traits and grain yield
UY35385A (es) 2013-03-13 2014-09-30 Monsanto Technology Llc ?métodos y composiciones para el control de malezas?.
WO2014160418A2 (en) 2013-03-13 2014-10-02 GeneWeave Biosciences, Inc. Non-replicative transduction particles and transduction particle-based reporter systems
AU2014249015B2 (en) 2013-03-13 2020-04-16 Monsanto Technology Llc Methods and compositions for weed control
US20160010101A1 (en) 2013-03-13 2016-01-14 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Enhanced nitrate uptake and nitrate translocation by over- expressing maize functional low-affinity nitrate transporters in transgenic maize
WO2014160122A1 (en) 2013-03-14 2014-10-02 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Maize stress related transcription factor 18 and uses thereof
US20140283211A1 (en) 2013-03-14 2014-09-18 Monsanto Technology Llc Methods and Compositions for Plant Pest Control
CA2903555A1 (en) 2013-03-15 2014-09-18 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Compositions and methods of use of acc oxidase polynucleotides and polypeptides
US10568328B2 (en) 2013-03-15 2020-02-25 Monsanto Technology Llc Methods and compositions for weed control
AU2014234265B2 (en) 2013-03-21 2020-01-30 Universiteit Gent Means and methods for the reduction of photorespiration in crops
AU2014278519B2 (en) 2013-06-11 2020-09-10 Syngenta Participations Ag Methods for generating transgenic plants
RU2703498C2 (ru) 2013-07-19 2019-10-17 Монсанто Текнолоджи Ллс Композиции и способы борьбы с leptinotarsa
US9850496B2 (en) 2013-07-19 2017-12-26 Monsanto Technology Llc Compositions and methods for controlling Leptinotarsa
AU2014341879B2 (en) 2013-11-04 2020-07-23 Beeologics, Inc. Compositions and methods for controlling arthropod parasite and pest infestations
UA119253C2 (uk) 2013-12-10 2019-05-27 Біолоджикс, Інк. Спосіб боротьби із вірусом у кліща varroa та у бджіл
AU2015206585A1 (en) 2014-01-15 2016-07-21 Monsanto Technology Llc Methods and compositions for weed control using EPSPS polynucleotides
US20170166920A1 (en) 2014-01-30 2017-06-15 Two Blades Foundation Plants with enhanced resistance to phytophthora
CN106459973B (zh) * 2014-03-12 2020-08-25 悉尼大学 高等植物中的rna生成
WO2015153339A2 (en) 2014-04-01 2015-10-08 Monsanto Technology Llc Compositions and methods for controlling insect pests
WO2015171603A1 (en) 2014-05-06 2015-11-12 Two Blades Foundation Methods for producing plants with enhanced resistance to oomycete pathogens
AU2015280252A1 (en) 2014-06-23 2017-01-12 Monsanto Technology Llc Compositions and methods for regulating gene expression via RNA interference
US11807857B2 (en) 2014-06-25 2023-11-07 Monsanto Technology Llc Methods and compositions for delivering nucleic acids to plant cells and regulating gene expression
EP3166964A1 (en) 2014-07-08 2017-05-17 Vib Vzw Means and methods to increase plant yield
RU2021123470A (ru) 2014-07-29 2021-09-06 Монсанто Текнолоджи Ллс Композиции и способы борьбы с насекомыми-вредителями
WO2016086142A1 (en) 2014-11-25 2016-06-02 University Of Florida Research Foundation, Inc. Methods and compositions for preventing or reducing infections of crop plants by bacterial and fungal pathogens
WO2016118762A1 (en) 2015-01-22 2016-07-28 Monsanto Technology Llc Compositions and methods for controlling leptinotarsa
UY36703A (es) 2015-06-02 2016-12-30 Monsanto Technology Llc Composiciones y métodos para la administración de un polinucleótido en una planta
WO2016196782A1 (en) 2015-06-03 2016-12-08 Monsanto Technology Llc Methods and compositions for introducing nucleic acids into plants
WO2017040078A1 (en) 2015-09-02 2017-03-09 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. PROGRAMMED CELL DEATH 1 LIGAND 1 (PD-L1) iRNA COMPOSITIONS AND METHODS OF USE THEREOF
US11236346B2 (en) 2015-09-04 2022-02-01 Keygene N.V. Diplospory gene
WO2017062790A1 (en) 2015-10-09 2017-04-13 Two Blades Foundation Cold shock protein receptors and methods of use
US20190098858A1 (en) 2016-03-18 2019-04-04 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Methods and compositions for producing clonal, non-reduced, non-recombined gametes
EP3680334A4 (en) 2017-09-07 2021-09-22 Beijing Tide Pharmaceutical Co., Ltd. DOUBLE STRANDED RNA MOLECULE DIRECTED AGAINST CKIP-1 AND ITS USES
US20220298522A1 (en) 2019-07-30 2022-09-22 The State Of Israel, Ministry Of Agriculture & Rural Development, Agricultural Research Organization Methods of controlling cannabinoid synthesis in plants or cells and plants and cells produced thereby
CN115176011A (zh) 2019-08-27 2022-10-11 赛诺菲 用于抑制pcsk9的组合物和方法
WO2021100034A1 (en) 2019-11-19 2021-05-27 Protalix Ltd. Removal of constructs from transformed cells
WO2023012342A1 (en) 2021-08-06 2023-02-09 Kws Vegetables B.V. Durable downy mildew resistance in spinach

Family Cites Families (27)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE3687682T2 (de) 1985-08-07 1993-08-19 Monsanto Co Glyphosat resistente pflanzen.
IL81737A (en) * 1986-03-28 1992-11-15 Calgene Inc Regulation of gene expression in plant cells
US5107065A (en) 1986-03-28 1992-04-21 Calgene, Inc. Anti-sense regulation of gene expression in plant cells
EP0332104A3 (en) 1988-03-08 1991-03-20 Ciba-Geigy Ag Chemically regulatable dna sequences and genes and uses thereof
US5614395A (en) 1988-03-08 1997-03-25 Ciba-Geigy Corporation Chemically regulatable and anti-pathogenic DNA sequences and uses thereof
CA1339684C (en) 1988-05-17 1998-02-24 Peter H. Quail Plant ubquitin promoter system
ATE241699T1 (de) 1989-03-24 2003-06-15 Syngenta Participations Ag Krankheitsresistente transgene pflanze
US5231020A (en) 1989-03-30 1993-07-27 Dna Plant Technology Corporation Genetic engineering of novel plant phenotypes
US5034323A (en) 1989-03-30 1991-07-23 Dna Plant Technology Corporation Genetic engineering of novel plant phenotypes
US5629183A (en) 1989-05-08 1997-05-13 The United States Of America As Represented By The Secretary Of Agriculture Plant transformation by gene transfer into pollen
US4940935A (en) 1989-08-28 1990-07-10 Ried Ashman Manufacturing Automatic SMD tester
ATE225853T1 (de) 1990-04-12 2002-10-15 Syngenta Participations Ag Gewebe-spezifische promotoren
US5451513A (en) 1990-05-01 1995-09-19 The State University of New Jersey Rutgers Method for stably transforming plastids of multicellular plants
US5639949A (en) 1990-08-20 1997-06-17 Ciba-Geigy Corporation Genes for the synthesis of antipathogenic substances
GB9304200D0 (en) 1993-03-02 1993-04-21 Sandoz Ltd Improvements in or relating to organic compounds
UA48104C2 (uk) 1991-10-04 2002-08-15 Новартіс Аг Фрагмент днк, який містить послідовність,що кодує інсектицидний протеїн, оптимізовану для кукурудзи,фрагмент днк, який забезпечує направлену бажану для серцевини стебла експресію зв'язаного з нею структурного гена в рослині, фрагмент днк, який забезпечує специфічну для пилку експресію зв`язаного з нею структурного гена в рослині, рекомбінантна молекула днк, спосіб одержання оптимізованої для кукурудзи кодуючої послідовності інсектицидного протеїну, спосіб захисту рослин кукурудзи щонайменше від однієї комахи-шкідника
US5527695A (en) * 1993-01-29 1996-06-18 Purdue Research Foundation Controlled modification of eukaryotic genomes
GB9320548D0 (en) * 1993-10-06 1993-11-24 Sandoz Ltd Improvements in or relating to organic compounds
US5576198A (en) 1993-12-14 1996-11-19 Calgene, Inc. Controlled expression of transgenic constructs in plant plastids
US5545818A (en) 1994-03-11 1996-08-13 Calgene Inc. Expression of Bacillus thuringiensis cry proteins in plant plastids
US5545817A (en) 1994-03-11 1996-08-13 Calgene, Inc. Enhanced expression in a plant plastid
CN1212725A (zh) 1996-02-28 1999-03-31 诺瓦提斯公司 来源于植物原卟啉原氧化酶基因的启动子
GB9710475D0 (en) * 1997-05-21 1997-07-16 Zeneca Ltd Gene silencing
GB9720148D0 (en) * 1997-09-22 1997-11-26 Innes John Centre Innov Ltd Gene silencing materials and methods
US6506559B1 (en) * 1997-12-23 2003-01-14 Carnegie Institute Of Washington Genetic inhibition by double-stranded RNA
SK287538B6 (sk) * 1998-03-20 2011-01-04 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation Syntetický gén obsahujúci dispergovanú alebo cudzorodú deoxyribonukleovú molekulu, génový konštrukt obsahujúci tento syntetický gén a prípravok obsahujúci tento syntetický gén
ATE507299T1 (de) * 1998-04-08 2011-05-15 Commw Scient Ind Res Org Verfahren und mittel zum erhalt von veränderten phänotypen

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