CN106459973B - 高等植物中的rna生成 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及高等植物的质体中的RNA生成和加工。

Description

高等植物中的RNA生成
发明领域
本发明涉及高等植物中的RNA生成和加工，包括高等植物中的RNA干扰，并且涉及高等植物的叶绿体和相关质体中的基因表达。
发明背景
在说明书中对任何现有技术的提述均不等于承认或提示该项现有技术构成任何司法管辖区中的公知常识的一部分，也不等于承认或提示可以合理预期本领域技术人员可以了解此项现有技术，认为其具有相关性、和/或将其与现有技术的其它部分组合。
利用宿主RNA沉默关联有害生物的必需基因是用于有害生物控制的新兴方法。此方法可以称为“跨界(transkingdom)RNA干扰”或“跨界RNAi”。一般认为，当由宿主生成的双链RNA(dsRNA)被有害生物摄取时，有害生物 RNA干扰(RNAi)机制将摄取的dsRNA转化为siRNA或者其它RNA形式， siRNA或者其它RNA形式能够在有害生物中诱导必需基因的沉默或可影响有害生物存活的相关事件。关于可适用于鳞翅目(Lepidoptera)的这种方法的例子，见：Terenius O.et al.2011 J.Insect Physiol.57:231-245。RNA干扰(RNAi) 是一种利用内源细胞途径的方法，其中对靶基因序列的全部或足够大小的任何部分的特异性的干扰性RNA(iRNA)分子(例如，dsRNA分子)导致由靶基因序列编码的mRNA的降解。在近年中，已经使用RNAi实现了许多物种和实验系统中的基因“敲低”；例如，漂亮新小杆线虫(Caenorhabditis elegans)、植物、昆虫胚胎、和组织培养物中的细胞。见例如，Fire etal.(1998)Nature 391:806-811；Waterhouse et al(1998)Proc Natl Acad Sci USA 95:13959-139； Wesley V et al(2001)Plant J.27:581-590；Martinez et al.(2002)Cell110:563-574；McManus and Sharp(2002)Nature Rev.Genetics 3:737-747。
已经充分证明，高水平的dsRNA是获得有害生物基因，包括鳞翅目基因的沉默所需要的(Terenius Osupra；Mao Y.et al.2007Nat.Biotechnol.25:1307-1313；Kumar P.et al.2012PLoS ONE7:e31347)。
WO2012/054919是一项用含有蚊子存活的必需基因的构建体转化低等植物(衣藻(Chlamydomonas))的叶绿体和核的研究。然后，给蚊子喂养经转化的衣藻，证明可以使用饲料控制蚊子群体。
WO2012/054919发现了低等植物的叶绿体转化和核转化均可提供用于控制蚊子群体的有用饲料。具体地说，根据WO2012/054919，结果显示，转基因衣藻表达从叶绿体或核基因组表达的3HKT反向重复，喂养这样的转基因衣藻可有效抑制蚊子幼虫的生长，并且最终引起其死亡(WO2012/054919，在[00219])。
在另外的出处，有人根据核转化体的研究提出假说，认为必须在昆虫以宿主为食时将dsRNA投递到昆虫以诱导跨界RNAi。见Mao and Kumar,上文。这意味着为了有效地控制有害生物，需要宿主产生并且维持稳态水平的 dsRNA，从而当有害生物在特定时间以宿主为食时，有dsRNA可供投喂有害生物。如何在高等或低等植物中最佳地生成和维持稳态水平的dsRNA仍然是不清楚的。
在低等植物中，WO2012/054919在[00220]提出假说认为，叶绿体中的沉默RNA的表达对于跨界RNAi的诱导可能是重要的。然而，WO2012/054919没有推断这是因为叶绿体表达使得沉默RNA得以保持稳态水平，还是因为叶绿体的质体包装在沉默RNA被摄取时保护了沉默RNA。其他人已经提出质体包装的意义。见Bogarad L.2000TIBTECH18:257-263；McBride K et al.,1995 Nature Biotechnology13:362-365；Verma D and Daniell H 2007 Am Soc Plant Biol.145:1129-1143。
从WO2012/054919看来仍然不清楚由低等植物叶绿体转化体表达的 RNA是否由dsRNA组成。具体地说，WO2012/054919没有测量衣藻叶绿体转化体中、或者摄取转化体的昆虫中的dsRNA或siRNA。因此，WO2012/054919没有显示dsRNA能够以足以促进跨界RNAi的量在衣藻或其它低等植物的叶绿体中生成。
此外，从WO2012/054919看，似乎dsRNA在衣藻核转化体中生成，因为根据WO2012/ 054919，这种转化体对跨界RNAi诱导而言看起来与叶绿体转化体一样有用。由于dsRNA对于跨界RNAi是必需的，可能意味着dsRNA能够在低等植物的核中比在高等植物的核中更好地积累。这可能会指向高等和低等植物的RNA加工途径中的趋异。高等和低等植物中的RNA加工间的差异有许多实例。具体参见：Casas-Mollano J.et al.2008Genetics179:69-81。基于叶绿体和核转化体相等积累dsRNA的认识，似乎叶绿体和核转化体在诱导跨界RNAi的效力上的略微差异可能是由于叶绿体所特有的质体包装，而不是由于沉默RNA在质体中的积累更好。事实上，这是WO2012/054919在 [00220]中提出的假说。
重要地，质体包装本身不是实现稳态水平的dsRNA的生成和维持的机制。包装仅仅保护摄取后已经生成的东西。因此应当理解，质体包装自身不足以生成已知诱导跨界RNAi所需要的高水平的dsRNA。
低等和高等植物的叶绿体RNA加工途径之间的另一个重要差异是低等植物，例如衣藻，没有RNA编辑系统，而高等植物的叶绿体RNA加工途径中存在此系统。参见Stern et al.2010Annu.Rev.Plant Biol.61:125-55。因此，低等植物叶绿体中生成的、与关联有害生物的靶基因对应的RNA被认为具有相关有害生物靶基因相同的序列，进而增加有害生物中形成近似于序列特异性 siRNA和诱导跨界RNAi的可能性。高等植物叶绿体中存在RNA编辑系统，因此使用高等植物的叶绿体转化体是否可能会有此类结果就有疑问。
如上面讨论的，难以在高等生物体中维持稳态水平的dsRNA，因为 dsRNA会被快速分解。认为在高等植物中此降解牵涉siRNA，但是可能牵涉其它尚未明确的RNAi相关的机制，或其它机制。
我们对高等植物的叶绿体中的RNA加工途径的理解已经有一些进展。然而，未知之处仍然有许多。研究人员经常疑惑为何如此少的基因——在典型的叶绿体基因组中的少于100个——的表达如此复杂。参见Stern见上文。
人们理解，高等植物叶绿体的RNA加工途径不同于高等植物细胞核和胞质溶胶中的RNA加工途径。这是因为质体是原核起源的，而植物细胞核和胞质溶胶是真核起源的。一些人认为叶绿体——其源自蓝细菌祖先——的基因表达兼具原核和真核特征，并且受到许多核编码蛋白调节。见Stern见上文。然而，这些途径差异的程度，以及这些差异与RNA加工的相关性，是未知的。
有人已经提出，鉴于原核生物和真核生物之间的差异，那些被发现在真核细胞中运作而不在原核细胞不运作的机制在叶绿体中应该不会运作。 RNAi是一种具体的机制。同时，其他人已经观察到来源于叶绿体中积累的 RNA的siRNA的存在，这指向叶绿体中运作的RNAi机制。参见Martinez de Alba A.E.et al.2002Am.Soc Microbiol.76:13094-13096。此外，RNA酶III 的一种叶绿体同源物也可能参与mRNA加工。RNA酶III是dsRNA依赖性内切核糖核酸酶的大家族的成员，包括与RNA沉默相关的酶，如切丁酶(Dicer)。参见：Stern见上 文。鉴于在叶绿体中已发现了许多核编码的反式作用因子，包括RNA编辑和剪接因子，在叶绿体中观察到核衍生的因子可能并不令人惊讶。
一般而言，不知道高等植物的叶绿体中的内源基因的RNA的稳态水平是如何被控制的。也不知道相关机制是否会同样地适用于高等植物的叶绿体中的内源基因表达。此外，叶绿体中的转基因的过表达对RNA的稳态水平的影响是未知的。可能正是出于这些原因，许多人已经开始尝试基于核转化在高等植物中实现跨界RNAi的办法，因为核的RNA加工机制在高等植物中了解得更清楚，并且结果是可预测的。
这些研究最初聚焦于使用缺乏dsRNA加工机制的细胞，以避免dsRNA的降解。对缺乏dsRNA加工机制的植物的生长性能的影响一直是问题。已经通过提供经修饰的构建体，在高等植物的核中实现dsRNA的形成和保护，来改善这个问题。参见例如US20090263364, US20070011775,US20090263364,US20080194504；US20060095987.Fenner B.et al.2006J.Virol.80:6822-6833；及Salomon W.et al 2010 Nucl.Acids.Res.38:3771- 3779。RNAi诱导构建体的这些改善和开发已经明显证明核转化是跨界RNAi的dsRNA生成的优选方法。
对在高等植物中生成和积累dsRNA的备选方法或改善的方法仍然存在需要。
发明概述
本发明寻求解决上文提及的需要，并且在一个实施方案中，提供了维管植物的质体，所述质体包含：
-核酸构建体，其包含：
-编码区，用于编码双链RNA(dsRNA)分子；
-在所述质体中能运作的启动子，用于使所述dsRNA分子能够生成；
-其中所述dsRNA具有使siRNA能够从该dsRNA生成的序列。
在另一个实施方案中，提供了维管植物的质体，所述质体包含：
-核酸构建体，其包含：
-编码区，用于编码双链RNA(dsRNA)分子；
-在所述质体中能运作的启动子，用于使所述dsRNA分子能够生成；
-其中所述编码区具有不见于所述植物的基因组中的核苷酸序列。
在另一个实施方案中，提供了维管植物的质体，所述质体包含：
-核酸构建体，其包含：
-编码区，用于编码双链RNA(dsRNA)分子；
-在所述质体中能运作的启动子，用于使所述dsRNA分子能够生成；
-其中所述质体不包含包括dsRNA的序列的siRNA分子。
在另一个实施方案中，提供了维管植物的质体，所述质体包含：
-核酸构建体，其包含：
-编码区，用于编码双链RNA(dsRNA)分子；
-在所述质体中能运作的启动子，用于使所述dsRNA分子能够生成；
-dsRNA
-其中所述dsRNA含有基本上整个由所述编码区编码的核苷酸序列。
在别的实施方案中，提供了用于转化维管植物的核酸构建体，其包含：
-编码区，用于编码双链RNA(dsRNA)分子；
-在所述质体中能运作的启动子，用于使所述dsRNA分子能够生成；
-一个或多个整合位点，这些位点对于所述构建体向维管植物质体基因组中的整合是选择性的；
-其中所述dsRNA具有使siRNA能够从该dsRNA生成的序列。
在别的实施方案中，提供了用于转化维管植物的核酸构建体，其包含：
-编码区，用于编码双链RNA(dsRNA)分子；
-在所述质体中能运作的启动子，用于使所述dsRNA分子能够生成；
-一个或多个整合位点，这些位点对于所述构建体向维管植物质体基因组中的整合是选择性的；
-其中所述编码区具有不见于所述植物的基因组中的核苷酸序列。
在别的实施方案中，提供了含有如上文描述的质体或构建体的植物、或从其衍生的繁殖材料。
在别的实施方案中，提供了在维管植物的细胞中积累dsRNA的方法，所述方法包括：
-用上文描述的实施方案中任一项的核酸构建体转化维管植物质体；
-对所述细胞提供条件以在所述质体中从所述核酸构建体生成dsRNA，
从而在维管植物的细胞中积累dsRNA。
本发明的其它方面和前述段落中描述的方面的其它实施方案根据以下描述会不言自明，以下参考附图进行示例性的说明。
附图简述
图1A：从对核或叶绿体基因组的整合生成dsRNA或发夹(hpRNA)的方式的示意图。
图1A-1：两个独立的转录单元，其中一个生成有义转录物，另一个生成反义转录物(如首次记载于Waterhouse PM et al.1998Proc Natl Acad Sci USA 95:13959-139者)。各转录单元可以共定位于基因组中(诸如由导入在同一 T-DNA上的单元生成)或无关位置中(诸如在不同染色体上)。有义和反义RNA 需要会合并且杂交以形成dsRNA。
图1A-2：一个“编码区”序列位于两个“向内指向/会聚”启动子之间(如首次由Timmons L and Fire A.1998Nature 395:854描述的)，使得一个启动子会引起一条DNA链转录生成有义RNA，且另一个启动子会指导另一条DNA 链直接转录生成反义RNA。两条RNA需要会合并且杂交以形成dsRNA。
图1A-3：由一个启动子驱动的一个转录单元产生单一RNA，单一RNA 具有折回(fold-back)并自身杂交以生成发夹(hp)RNA的能力，发夹RNA具有类似于dsRNA的双链体结构的茎(如首次记载于Waterhouse et al.1998Proc Natl Acad Sci USA 95:13959-139)。转录物的第一个区相对于转录物的最后一个区可以采取有义取向(或反之)。重要的是有“间隔”区来分开有义区和反义区，以稳定DNA构建体。在此情况中，间隔区会作为hpRNA转录物的一部分被转录，并且会形成环。
图1A-4：由一个启动子驱动的一个转录单元产生单一RNA，该单一RNA 具有折回(fold-back)和自身杂交以生成发夹(hp)RNA的能力，发夹RNA具有类似于dsRNA的双链体结构的茎。转录物的第一个区相对于转录物的最后一个区可以采取有义取向(或反之)。重要的是有“间隔”区来分开有义区和反义区，以稳定DNA构建体。在此情况中，间隔物区编码内含子，该内含子会被转录，但然后被剪接掉，生成具有非常小的环的hpRNA转录物(如首次记载于Smith NA et al 2000Nature 407:319-320)。
图1B：核整合构建体整合到核基因组中时的示意图。v153核转化构建体以其整合形式描绘。此构建体设计为从CaMV 35s启动子表达 Ha-HpAce1236-189发夹。主链是标准二元土壤杆菌转化载体pORE-03的衍生物。宿主核基因组中的整合位点会随土壤杆菌介导的转化的标准整合动力学而变化。描绘了用于后续cDNA合成步骤(301r、216f/r、和寡聚物dT)，和 RT-PCR检测步骤(217f/r+216f/r，和25f+216f/r)的引物，对后组标示了预期的产物大小(e＝..)。显示了预期的RNA产物和结构，包括那些将被产生并且在内含子剪接后会保留的种类，和在通过已知对可作用于标准核/细胞质 RNA的标准RNAi类型途径加工后的那些种类。
图1C：叶绿体表达构建体(具有核内含子)在整合入叶绿体基因组中时的示意图。v206叶绿体转化构建体以其整合形式描绘。此构建体设计为从Prrn 启动子表达Ha-HpAce1236-189发夹。主链是标准叶绿体转化载体 pPRV323Clox的衍生物。宿主叶绿体基因组中的整合位点是精确的，以trnI/ trnA处包括的重组区限定。描绘了用于后续cDNA合成步骤(301r，216f/r，276r， 280r，和寡聚物dT)和RT-PCR检测步骤(217f/r+216f/r，和25f+216f/r)的引物，对后面的组标示了预期的产物大小(e＝..)。显示了预期的RNA产物的生成。在此情况中，其中包含的核/细胞质内含子不会被剪接，因为标准的剪接机制在叶绿体中不运作。进一步在缺少RNAi加工机制的条件下，剩余的产物会包含最初包括的序列的相当大部分乃至全部，从而覆盖设计的发夹的预期靶标。在此情况中，如果转录可以从天然上游转录单元继续进行下来(“通读”)，那么可以能有额外的更长的RNA种类形成，如已知许多叶绿体转录物通常发生的那样。
图1D：在整合入叶绿体基因组中时叶绿体表达构建体(具有叶绿体内含子)的示意图。v301叶绿体转化构建体以其整合形式描绘。此构建体设计为从Prrn启动子表达Ha-HpAce1236-189发夹。主链是标准叶绿体转化载体 pPRV323Clox的衍生物。宿主叶绿体基因组中的整合位点是精确的，由trnI/ trnA处包含的重组区所界定。描绘了用于后续cDNA合成步骤(301r，216f/r， 276r，280r，和寡聚物dT)和RT-PCR检测步骤(217f/r+216f/r，和25f+216f/r) 的引物，对后组标示了预期的产物大小(e＝..)。显示了预期的RNA产物和结构的生成。在此情况中，包含的叶绿体内含子会在叶绿体中被剪接掉。在缺乏 RNAi加工机制的条件下，剩余的产物会包含如最初包括的序列的相当大部分乃至全部，从而覆盖设计的发夹的预期靶标但不覆盖内含子序列。剪接的结果是，RNA结构很可能形成在一个末端具有小环的杆状RNA双链体。在此情况中，如果转录可以从天然上游转录单元继续进行下去(“通读”)，那么可能形成额外的更长的RNA种类，如已知许多叶绿体转录物通常发生的那样。
图2：，来自显示转基因表达的转化体的RNA提取物的RT-PCR。从本氏烟草(Nicotiana benthamiana)叶绿体转化植物组织(v206样品#1-9)、本氏烟草核转化组织(v153核对照样品#17)、和未转化的本氏烟草组织(未转化对照样品#24)提取的RNA样品的6个不同逆转录(RT)测定的结果显示于其中。对每种样品，使用2种不同模板条件，以cDNA合成前提取的RNA作为模板(以测试样品中的DNA污染的可能性)，和相应的cDNA样品组，用3种不同引物组进行了扩增。预期的产物大小标示为e＝.。所用的标志物是MBI Fermentas 100bp标志物，条带以100bp为间隔，从100bp直至1kb。(A-B)第一PCR引物组设计为跨内含子和后茎接合部(junction)扩增，以测试含有内含子环以及反义 (AS)茎二者的大RNA种类的存在(引物g25f和g216f/r)。加框的区域表示当有特异性扩增时会出现产物的区域。(C-D)第二组在dsRNA茎区内部，但是在茎的末端结合，以便不依赖于环序列地测试全长有义(SE)或反义(AS)茎的存在(引物g216f/r和g217f/r)。(E-F)第三组是对照反应，以便测试eIF4E的遍在的持家序列的存在(引物g165f和g166r)。
不在此组中分析叶绿体样品#9。不过，该样品已经在较早的PCR测定法中确认呈阳性。
图3：叶绿体转化体和对照中的dsRNA的基于Northern的定量。
将叶绿体转化样品进行高分子量(MW)或“大RNA”Northern分析。(A) 对样品#1-9、17和24分别再制备RNA提取物(在甲酰胺中重悬每个样品)。每条泳道上样约10μl每种样品+6μl甲酰胺RNA上样染料(除了样品7外，因为仅有4μl样品可用)到1.4％TBE琼脂糖凝胶上，以100V运行，直至适当分开2 个较低的染料前沿。用溴化乙啶(EtBr)染色凝胶，然后可视化以测量相对上样量。(B)将凝胶过夜毛细管转移到Hybond N+(Amersham)上，然后将样品与膜进行UV交联。膜在65℃用PerfectHyb预杂交和杂交。探针(538nt的总长度，其中与HaAce有约357nt的连续匹配)是来自反向插入HaAce1236pGEM载体(v158)的部分长度SE链UTPp32核糖探针SP6脱落片段(riboprobe run off)。将膜曝光1小时。(C)使用ImageJ确定RNA量，并相对于上样量标准化(使用 EtBr图像)。相对表达水平以相对于本氏烟草未转化对照(设置为1)的条带强度的标准化变化倍数计算。
在此实例组中略去了样品#6，因为剩余的材料不够额外的RNA提取。
图4：叶绿体转化体和对照中的siRNA的基于Northern的定量。对叶绿体转化样品进行低分子量(MW)或“小RNA”Northern分析以检测和相对定量 siRNA尺寸的加工产物。在这里使用与实施例4中使用的相同的RNA提取物。 (A)每条泳道上样约25μl的每种样品+25μl甲酰胺RNA上样染料到17％ PAGE凝胶上。由此所致的上样量估计在约18-42ug的范围。在上样前，PAGE 凝胶在150V/40min预运行。一旦上样，在150V/～30min.+200V/～4-5小时运行凝胶(直至染料前沿迁移合适的距离)。用溴化乙啶(EtBr)染色凝胶，并且可视化以测量相对上样量。(B)将凝胶以45V/60min.电转移到Hybond N+ (Amersham)上，并且将样品与膜进行UV交联。膜在42℃用PerfectHyb进行预杂交和杂交。探针的制备与先前的描述一样，只是还通过标准方法将探针“碳酸化”以将它分级成多个约50nt的片段。将膜曝光1小时和60小时，2个时间点之间的检测限没有差异(本文中显示了1小时时间点)。(C)使用ImageJ定量RNA，并且相对于上样的量标准化(使用EtBr图像)。相对表达水平以相对于本氏烟草未转化对照(设置为1)的条带强度的标准化变化倍数计算。
在此实例组中略去了样品#6和7，因为剩余的材料不够。
图5A ：棉铃虫(Helicoverpa armigera)幼虫在转基因和非转基因幼苗上的生长速率。
在塑料培养皿中以清洗过的6-10日龄幼苗喂养4日后的棉铃虫 (Helicoverpa)幼虫的平均重量(n＝4-13；在实验开始时原始n＝20/处理)。含有被幼虫侵染的幼苗的培养皿保持在受控环境条件(28℃，～60％相对湿度， 16:8[光照:黑暗])下。此数据显示了在所有四个用v206转化的独立系(在叶绿体中表达hpRNA)中，与那些以野生型本氏烟草幼苗为食的幼虫相比，幼虫的生长速率显著降低(p<0.005n＝7–13)。以用v153转化的两个系(在核/细胞质中表达hpRNA)为食的幼虫的生长速率与那些以wt为食的幼虫没有显著差异(p>0.9；n＝4-7)。
图5B ：本文中参考的载体的关系路径的示意图。实施例1中装配的叶绿体转化构建体是几种先前存在的载体：pPRV323Clox、pORE-03、和 pRNAi-GG的衍生物。首先修改了pPRV323Clox以除去错误的Kpn I RE位点。对其插入叶绿体启动子、5'UTR、MCS和3'UTR，以创建pR1。首先通过插入CaMV 35s启动子，并除去主链中存在的Bsa I位点来修饰pORe-03，以创建 p32c。使用pRNAi-GG作为Golden Gate(GG)克隆盒的来源。将GG盒拷贝到 p32c中以创建p32c-GG。然后，在GG反应中使用p32c-GG以创建针对棉铃虫乙酰胆碱酯酶靶基因(Ha-Ace1236-189)的发夹构建体v153。v153是核转化实施例中使用的构建体。进一步使用此构建体将GG Ha-HpAce1236-189元件转移到pR1中，从而创建v206。v206是在叶绿体转化实施例中使用的构建体。
图6：例示性序列。(A)来自棉铃虫(Ha)的乙酰胆碱酯酶(Ac)基因(对应于 Genbank登录号：AF369793(靶基因))的mRNA序列。(B)Ha-Ace1236-189，衍生自来自Ha的Ac基因的序列(靶序列)。(C)Ha-HpAce1236-189，序列 Ha-Ace1236-189的发夹，使用如pRNAi-GG中存在的内含子间隔区。显示的序列是其在DNA构建体中(剪接前)出现的形式，来自靶序列的末端。
图7：v153的质粒图。
图8：v153的核苷酸序列。
图9：修饰的v206的质粒图。
图10：修饰的v206的核苷酸序列。
图11：v301的质粒图。
图12：v301的核苷酸序列。
发明详述
跨界RNAi在近年来已经作为用于抑制农业植物的有害生物和病原体的生长的有效手段崭露头角。此方法利用许多真核生物体中存在的RNA加工途径，借助细胞RNA酶III类(例如，切丁酶或切丁酶样蛋白，如DCL1、DCL2、 DCL3、和DCL4)将内源dsRNA加工成小干扰(siRNA)分子。切丁酶将长的 dsRNA分子切割成长度一般为约19-24个核苷酸的siRNA，而后这些siRNA被解开为两个单链RNA：乘客链和引导链。乘客链被降解，而引导链被掺入RNA 诱导的沉默复合物(RISC)中。当引导链特异性结合mRNA分子的互补序列并且诱导Argonaut(RISC复合物的催化组分)切割时，转录后基因沉默就发生了。
跨界RNAi通过对靶生物体提供dsRNA分子来利用此内源RNA加工途径，其中不在靶生物体中生成dsRNA分子，而是在另一种生物体，例如靶生物体会食用的生物体中生成dsRNA分子。图1A中描绘了生成dsRNA或hpRNA分子的一些方式。此方法的一个例子是在植物中提供dsRNA分子，其中dsRNA 分子与靶生物体中的特定靶基因同源。人们知道，当由植物生成的dsRNA被有害生物摄取时，有害生物RNA干扰(RNAi)机制将摄取的dsRNA转化为siRNA，或者转化为其它能够在有害生物中诱导必需基因沉默或影响有害生物存活的相关事件的RNA形式。此方法又称为“非细胞自主RNAi”，并且与 dsRNA分子的生成、加工和发挥沉默效应均在一个细胞中的情况区分开来。
在宿主细胞中提供dsRNA分子的一种方法是将构建体导入宿主的细胞核中，构建体在宿主核基因组中表达时编码dsRNA分子。还已经认识到，在宿主生物体中提供dsRNA分子的过程中，宿主生物体的自身RNA加工机制可以降解dsRNA分子为siRNA。这样，可以在植物中生成能够在有害生物中诱导基因沉默的siRNA。然而，现在公认的是，跨界RNAi要获得成功，必须对靶生物体提供高水平的dsRNA。因而，最近关于跨界RNAi方法的工作聚焦于用于稳定宿主细胞核中生成的dsRNA分子、以防止对siRNA的此类加工的手段。例如，有人建议提供RNA结合分子以防止降解。另外有人建议需要在宿主细胞核中提高dsRNA表达的水平，以补偿任何由于对siRNA的加工所致的损失。另外有人建议dsRNA分子进行化学修饰。可以了解的是，所有试图克服现状的努力都是围绕着改良现有的核转化方法学而进行的。
发明人采取了一种不同途径来解决dsRNA降解的问题，并且令人惊讶地已经发现了在维管植物的质体中，例如叶绿体中生成的dsRNA，不易受到与同一细胞的核中生成的dsRNA相同的降解或加工。重要的是，发明人已经发现了可能通过选择性转化维管植物的叶绿体而在维管植物中积累dsRNA。此外，发明人发现，根据本发明产生的叶绿体基本上不含siRNA，这对于将本发明应用于跨界RNAi应用是有利的。此外，发明人发现，叶绿体中积累的dsRNA基本上不被其它叶绿体RNA加工途径加工。此外，发明人发现，用在叶绿体中表达靶向针对幼虫必需基因的hpRNA的转基因植物喂养幼虫，对幼虫的生长具有强烈抑制效应。
发明人的发现是令人惊讶的，因为迄今为止不知道质体是否使用切丁酶样酶类将dsRNA分子降解为siRNA。例如，一些人已经推测，植物细胞中与叶绿体复制型类病毒对应的siRNA的存在提示高等植物的叶绿体中有切丁酶样加工机制。然而，本发明人已经发现了高等植物的质体中生成的dsRNA分子在质体内不被加工成siRNA。因而，发明人已经发现了维管植物的质体可提供适合于生成高水平的dsRNA的环境。
因而，在第一个实施方案中，本发明提供了维管植物的质体，其包含：
-核酸构建体，所述核酸构建体包含：
-编码区，用于编码双链RNA(dsRNA)分子；
-在所述质体中能运作的启动子，用于使所述dsRNA分子能够生成；
-其中所述dsRNA具有使siRNA能够从该dsRNA生成的序列。
一般地，siRNA由细胞RNA酶III酶(例如切丁酶)从dsRNA分子生成，所述细胞RNA酶III酶将长的dsRNA分子切割成长度一般为约19-24个核苷酸的 siRNA。一般地，具有长度小于19至24个核苷酸的双链结构的dsRNA序列没能使siRNA从其中生成。
因此，根据本发明生成的dsRNA分子保留实质性比例的其初生特性，其一般对于从dsRNA生成siRNA是需要的。换言之，dsRNA分子保留使靶生物体的RNA酶III机制能够结合dsRNA分子并且从其中生成siRNA分子的特性。根据本发明生成的dsRNA具有使siRNA能够从该dsRNA生成的序列正是在此背景中。这在下文进一步解释，尽管在转向这点前，有用的是进一步讨论 dsRNA的性质。
具体地，dsRNA一般包含RNA的第一和第二链，它们在链间具有足够的序列互补性以使第一和第二链能够通过Watson-Crick碱基配对彼此结合，从而形成“茎”。在一些实施方案中，dsRNA的茎由第一和第二链之间的100％互补性组成。在一些实施方案中，形成茎的第一和第二链之间可以有一个或多个错配，使得茎的链之间的互补性可以小于100％。一般地，茎的第一和第二链之间的互补性水平大于80％，优选85％，优选90％，优选95，96，97，98或99％。一般地，错配发生在不超过约3个核苷酸，优选约2个核苷酸的连续序列上。优选地，错配仅限于茎的第一和第二链上分隔的位置上的单个核苷酸之间。
鉴于上文，应当理解限定长度的dsRNA的茎实际上可以包含一个或多个错配的区域或位置。例如，当第一链和第二链在某一30个核苷酸的区域上除了该区域内的一个或两个错配之外具有完全互补性时，可称第一和第二链构成dsRNA的一个30个核苷酸的茎。
dsRNA可以包含一个或多个茎。有超过一个茎存在的情况下，这些茎可以连续或成簇排列，以形成串联或重复反向重复，其形成类似“锤头”、“杠铃”、或“狗骨”的dsRNA结构，例如类似“锤头”、“杠铃”、或“狗骨”的二茎结构，或含有3个或更多个类似于“苜蓿叶形(cloverleaf)”的茎的结构，或者具有假结体样形状的结构。这些构建体中的任一种可以进一步包含间隔区段，间隔区段存在于双链茎内(例如，作为多个反义或有义核苷酸序列区段之间的间隔，或者作为碱基配对反义核苷酸序列区段和有义核苷酸序列区段之间的间隔)，或在双链茎之外(例如，作为有义序列或反义序列或无关RNA 序列的环区，将一对反向重复分开)。在碱基配对的反义和有义核苷酸序列区段长度不等的情况下，较长的区段可以充当间隔。
dsRNA可以源自(arise from)具有反向重复序列的单RNA链，所述反向重复序列使该单RNA链能够形成茎结构。或者，dsRNA可以源自2个或更多个 RNA分子，它们对齐并且彼此碱基配对以形成dsRNA分子的茎。
如上文讨论的，在一个实施方案中，正是dsRNA的长度，尤其是dsRNA 的茎的长度，使得siRNA能够从该dsRNA生成。通常，dsRNA的茎的长度为至少30个核苷酸。长度短于30个核苷酸时，有害生物的RNA聚合酶III系统从 dsRNA生成siRNA的能力可能受限。在多个实施方案中，dsRNA的茎可以由至少约50，至少约75，至少约100，至少约150，至少约200，至少约250，至少约300，或甚至更多个碱基对组成。在一个优选的实施方案中，dsRNA包含至少约100个碱基对。在另一个优选的实施方案中，dsRNA的茎包含至少约250个碱基对，或者甚至更多，例如500或1000个碱基对。
dsRNA由编码区编码。编码区是外源核酸序列。在一些实施方案中，编码区可以编码转基因。在一些例子中，转基因可以是编码dsRNA分子的一条或两条链的序列，所述dsRNA分子包含的核苷酸序列与包含靶基因序列的生物体中找到的核酸分子互补。在别的例子中，转基因可以是基因序列(例如，除草剂耐受性基因)，编码与疾病的作用机制相关的生物标志物，药学有用的化合物的基因，或编码期望的农业性状的基因。
在这些和其它例子中，转基因可以含有与转基因的编码序列可操作连接的调节序列(例如，启动子)。下文进一步描述了例子。
在一些实施方案中，编码区可以基本上编码单一双链RNA，并且包含与靶基因的至少一个区段为反义的多个连续反义核苷酸序列区段和与靶基因的至少一个区段为有义的多个连续有义核苷酸序列区段；多个连续反义和多个连续有义区段可以形成单一双链RNA茎或连续排列的多个双链茎(具有或没有分开多个双链茎的非碱基配对间隔DNA)。
在另一个实施方案中，编码区编码RNA的多个dsRNA茎，并且包含与靶基因的至少一个区段为反义的多个反义核苷酸序列区段和与靶基因的至少一个区段为有义的多个有义核苷酸序列区段，并且其中所述多个反义核苷酸序列区段和多个有义核苷酸序列区段以一系列的双链茎排列。
在某些实施方案中，dsRNA可以指dsRNA和hpRNA之任一或两者。
由编码区编码的dsRNA分子可以具有使siRNA分子能够生成的序列，所述siRNA分子靶向维管植物的特定有害生物或病原体。因此，编码区的核苷酸序列会与靶生物体的靶基因互补，并且不会对应于宿主植物的核苷酸序列。
因而，在另一个实施方案中，提供了维管植物的质体，所述质体包含：
-核酸构建体，其包含：
-用于编码dsRNA分子的编码区；
-在所述质体中能运作的启动子，用于使所述dsRNA分子能够生成；
-其中编码区具有不见于植物的基因组中的核苷酸序列。
通常，编码区具有靶基因的核苷酸序列。优选的靶基因是相关有害生物的存活所必需的基因。有害生物可以是植物、动物、细菌、病毒或真菌界的生物。在这些实施方案中，dsRNA实现siRNA分子的生成，所述siRNA分子切割靶基因的mRNA，或者阻抑靶基因的mRNA的翻译。有害生物和靶基因的例子如下：
·鞘翅目有害生物，包括例如玉米根萤叶甲(Diabroticavirgifera virgiferaLeConte)(西方玉米根虫(western corn rootworm)，“WCR”)， Diabroticabarberi Smithand Lawrence(北方玉米根虫(northern corn rootworm)，“NCR”)，黄瓜十一星叶甲食根亚种(Diabroticaundecimpunctata howardi Barber)(南方玉米根虫(southern cornrootworm)，“SCR”)，Diabroticavirgifera zeae Krysan and Smith(墨西哥玉米根虫(Mexican corn rootworm)，“MCR”)，带斑黄瓜叶甲(Diabrotica balteata LeConte)；Diabroticaundecimpunctata tenella， D.speciosa Germar，和Diabroticaundecimpunctata undecimpunctata Mannerheim；
·半翅目有害生物，包括例如Euschistusheros(Fabr.)(Neotropical BrownStink Bug,“BSB”)，稻绿蝽(Nezara viridula(L.))(南方绿色九香虫 (Southern GreenStink Bug))，Piezodorus guildinii(Westwood)(Red-banded Stink Bug)，茶翅蝽(Halyomorpha halys)
Figure BDA0001149577020000141
(Brown Marmorated Stink Bug)， Chinavia hilare(Say)(绿色九香虫)，褐臭蝽(Euschistus servus)(Say)(Brown Stink Bug)，Dichelopsmelacanthus(Dallas)，Dichelops furcatus(F.)，Edessa meditabunda(F.)，Thyantaperditor(F.)(Neotropical Red Shouldered Stink Bug)， Chinavia marginatum(Palisot de Beauvois)，Horcias nobilellus(Berg)(Cotton Bug)，Taedia stigmosa(Berg)，Dysdercus peruvianus(Guérin-Méneville)， Neomegalotomus parvus(Westwood)，Leptoglossus zonatus(Dallas)，Niesthrea sidae(F.)，豆荚草盲蝽(LygusHesperus)(Knight)(Western Tarnished Plant Bug)，和美洲牧草盲蝽(Lyguslineolaris)(Palisot de Beauvois)；
·鳞翅目有害生物，包括但不限于欧洲玉米螟(Ostrinia nubilalis, Europeancorn borer)，草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)(草地夜蛾(Fall army worm))，甜菜夜蛾(Spodoptera exigua)(甜菜粘虫(Beet armyworm))，Spodoptera ornithogalli(Yellowstriped armyworm)，玉米穗虫(Helicoverpa zea,Corn earworm)，小地老虎(Agrotis ipsilon)(黑色切根虫(Black cutworm))，棉铃虫(棉铃虫(Cotton bollworm))，小蔗螟(Diatraea saccharalis)(甘蔗螟(Sugar cane borer))，巨座玉米螟(Diatraeagrandiosella)(西南玉米螟(Southwestern corn borer))，小玉米螟(Elasmopalpuslignosellus)(小玉米茎螟(小玉米茎蛀虫))， Papaipema nebris(条螟(Stalk borer))，棉红铃虫(Pectinophora gossypiella,Pink bollworm)，苜蓿绿夜蛾(Plathypenascabra)(Green cloverworm)，纹黄豆粉蝶 (Colias eurytheme)(苜蓿粉蝶(Alfalfacaterpillar))，大豆夜蛾(Anticarsia gemmatalis)(天鹅绒豆毛虫(Velvet beancaterpillar))，大豆尺夜蛾(Pseudoplusia includes)(大豆尺蠖Soybean looper)，小菜蛾(Plutella xylostella,Diamondback moth)，Agromyza parvicornis(玉米点潜叶虫(Corn blot leafminer))，小蜡螟 (Achoroia grisella)，西部黑头长翅卷蛾(Aclerisgloverana)，黑头长翅卷蛾 (Acleris variana)，棉褐带卷蛾(Adoxophyes orana)，木棉虫(Alabama argillacea)，秋星尺蠖(Alsophila pometaria)，柑橘卷叶蛾(Amyeloistransitella)，地中海粉斑螟(Anagasta kuehniella)，桃条麦蛾(Anarsia lineatella)，Anisota senatoria，柞蚕(Antheraea pernyi)，黄卷蛾属物种(Archips sp.)，带卷蛾属物种 (Argyrotaenia sp.)，Athetis mindara，家蚕(Bombyx mori)，棉潜蛾(Bucculatrixthurberiella)，干果斑螟(Cadra cautella)，色卷蛾属(Choristoneura sp.)，Cochyllshospes，米蛾(Corcyra cephalonica)，Cydia latiferreanus，苹果蠹蛾(Cydiapomonella)，Datana integerrima，落叶松毛虫(Dendrolimus sibericus)，Desmiafeneralis，甜瓜绢野螟(Diaphania hyalinata)，黄瓜绢野螟(Diaphania nitidalis)，白尺蠖蛾(Ennomos subsignaria)，Eoreuma loftini，烟草粉螟(Esphestia elutella)，Erannis tilaria，盐泽枝灯蛾(Estigmene acrea)，Eulia salubricola，Eupocoelliaambiguella，Eupoecilia ambiguella，黄毒蛾(Euproctis chrysorrhoea)，暗缘地老虎(Euxoa messoria)，蜡螟(Galleria mellonella)，梨小食心虫(Grapholita molesta)，黑拟蛉蛾(Harrisina Americana)，亚曲夜蛾(Helicoverpa subflexa)，行列大蚕蛾(Hemileuca oliviae)，向日葵同斑螟(Homoeosoma electellum)，美国白蛾(Hyphantiacunea)，Keiferia lycopersicella，Lambdina fiscellaria fiscellaria，Lambdinafiscellaria lugubrosa，雪毒蛾(Leucoma salicis)，葡萄浆果小卷蛾(Lobesiabotrana)，草地螟(Loxostege sticticalis)，舞毒蛾(Lymantria dispar)，Macallathyrisalis，天幕毛虫属物种(Malacosoma sp.)，甘蓝灯蛾 (Mamestra brassicae)，蓓带夜蛾(Mamestra configurata)，Manduca quinquemaculata，烟草天蛾(Manduca sexta)，豆野螟(Maruca testulalis)， Melanchra picta，秋尺蛾(Operophtera brumata)，古毒蛾属物种(Orgyia sp.)， Paleacrita vernata，Papilio cresphontes，Phryganidiacalifornica，Phyllonorycter blancardella，暗脉菜粉蝶(Pieris napi)，油菜菜粉蝶(Pieris rapae)，Platynota flouendana，Platynota stultana，Platyptiliacarduidactyla，印度谷螟(Plodia interpunctella)，Pontia protodice，一点粘虫(Pseudaletia unipuncta)，Sabulodes aegrotata，Schizura concinna，麦蛾(Sitotrogacerealella)，苹白小卷蛾(Spilonta ocellana)，Thaurnstopoea pityocampa，Ensolabisselliella，Trichoplusia hi，Udea rubigalis，Xylomyges curiails，苹果巢蛾(Yponomeuta padella)，和烟芽夜蛾 (Heliothis virescens)(烟草蚜虫(Tobaccobudworm))；和
·线虫有害生物，包括例如滑刃线虫属物种物种(Aphelenchoides spp.)，Belonolaimus spp.，Criconemella spp.，茎线虫属物种(Ditylenchus spp.)，球异皮线虫属物种(Globodera spp.)，异皮线虫属物种(Heterodera spp.)，潜根属物种(Hirschmanniella spp.)，纽带属物种(Hoplolaimus spp.)，根结线虫属物种(Meloidogyne spp.)，短体线虫属(Pratylenchus spp.)，和穿孔线虫属(Radopholusspp.)，非穷举的一批具体物种包括但不限于犬恶丝虫(Dirofilaria immitis)，马铃薯白线虫(Globodera pallid)，囊线虫病(Heterodera glycines)，Heterodera zeae，南方根结线虫(Meloidogyne incognita)，爪哇根结线虫(Meloidogyne javanica)，盘尾丝虫(Onchocerca volvulus)，穿刺根腐线虫(Pratylenchus penetrans)，香蕉穿孔线虫(Radopholus similis)，和肾形线虫(Rotylenchulus reniformis)。
在具体的例子中，公开了例示性的核酸分子，其可以与鞘翅目、半翅目、和/或鳞翅目有害生物，或与昆虫类有害生物之外的生物(例如，植物寄生性线虫)中的一种或多种天然核酸序列的至少一部分同源，所述天然核酸序列包括但不限于Caf1-180(美国专利申请公开文本No.2012/0174258)，VatpaseC (美国专利申请公开文本No.2012/0174259)，Rho1(美国专利申请公开文本No. 2012/0174260)，VatpaseH(美国专利申请公开文本No.2012/0198586)， PPI-87B(美国专利申请公开文本No.2013/0091600)，RPA70(美国专利申请公开文本No.2013/0091601)，RPS6(美国专利申请公开文本No.2013/0097730)， ROP(美国专利申请公开文本No.14/577811)，RNAPII(美国专利申请公开文本No.14/577854)，和/或如披露于美国专利申请公开文本No.2012/0164205， 2011/0054007，和2009/0265818，美国专利No.6,326,193，欧洲专利申请No. EP1210875和EP2633048，以及PCT国际专利申请No.WO2011153418， WO2007080126，WO2012143542，WO2005110068，和WO2006047495；或转录dsRNA分子的转基因事件，所述dsRNA分子靶向鞘翅目、半翅目、和/ 或鳞翅目有害生物，或与昆虫有害生物不同的生物体(例如，植物寄生性线虫，诸如例如如披露于美国专利申请公开文本No.2005/0188438， 2006/0080749，2009/0300796，和PCT国际专利申请No.WO2003052110， WO2004066183，WO2004005485，WO2005019408，WO2006046148，WO2007087153，WO2007095496，和WO2009133126)中的基因。
在某些实施方案中，核酸构建体可以包含超过一个编码dsRNA的编码区。例如，核酸构建体可以包含用于编码第一昆虫靶基因的第一dsRNA的第一编码区，和用于编码其他针对昆虫靶基因的dsRNA的另一编码区。
在别的实施方案中，根据本发明的质体或叶绿体可以包含超过一类核酸构建体。例如，根据本发明的质体或叶绿体可以包含：
-第一核酸构建体，其包含用于编码针对第一昆虫靶基因的第一dsRNA 的第一编码区；
-另一核酸构建体，其包含用于编码另一针对昆虫靶基因的dsRNA的另一编码区。
第一编码区和另一编码区、以及和从第一编码区和另一编码区分别生成的dsRNA，可以是相同或不同的。
此外，第一编码区和另一编码区可以在相同启动子或调节序列，或不同启动子或调节序列的控制下。在一个实施方案中，第一编码区可以在组成性启动子的控制下，而另一编码区可以在诱导型启动子的控制下。
在其它实施方案中，第一编码区和另一编码区两者都在组成性启动子的控制下，或者在诱导型启动子的控制下。下文描述了可用于在叶绿体和质体中表达dsRNA的具体启动子的例子。
预期具有沉默效应的最小程度的识别发生在如下所述的发夹的茎中的序列与靶mRNA中的序列之间：二者在19个核苷酸的连续序列区块中有至少一个大于16或更多个核苷酸的具备完全同一性的区块。
在其它实施方案中，靶基因是需要基因沉默或RNAi的基因。此类基因可以是在疾病的病理学中表达的基因。在另一个例子中，基因可以是在产业过程中表达的基因。
已知当在维管植物的细胞质中提供dsRNA分子时(无论是通过在核中表达DNA构建体或其他方式)，dsRNA分子被细胞质中的切丁酶识别，并且加工成siRNA。然而，发明人已经发现了在这些相同植物的质体中提供的dsRNA 不接受相同加工。因而，根据本发明生成的dsRNA分子不被加工成siRNA，并且质体不包含源自这些dsRNA分子序列的siRNA分子。
因而，在另一个实施方案中，提供了维管植物的质体，所述质体包含：
-核酸构建体，其包含：
-编码区，用于编码双链RNA(dsRNA)分子；
-在所述质体中能运作的启动子，用于使所述dsRNA分子能够生成；
-其中质体基本上不包含包括所述dsRNA的序列的siRNA分子。
一般地，质体不包含包括dsRNA的序列的siRNA分子，但应当理解，在一些实施方案中，质体可能包含源自RNA分解或代谢的降解产物，在其它情况下，可能包含对质体中的dsRNA生成或积累没有影响的量的特定siRNA。
有人推测，维管植物的质体可能包含已知的细胞质RNA酶III(“切丁酶”) 酶的同源物。此外，已知叶绿体RNA经常受到显著的RNA编辑。因而，维管植物的质体中提供的dsRNA是否会保留由DNA构建体编码的靶基因的基本上整个核苷酸序列，迄今为止尚不知晓。令人惊讶地，发明人已经发现了高等植物叶绿体基本上不编辑从靶基因的编码区转录的dsRNA，从编码区转录的dsRNA也没有实质性截短或剪接。
因而，在另一个实施方案中，提供了维管植物的质体，所述质体包含：
-核酸构建体，其包含：
-编码区，用于编码双链RNA(dsRNA)分子；
-在所述质体中能运作的启动子，用于使所述dsRNA分子能够生成；
-dsRNA
-其中dsRNA含有基本上整个由编码区编码的核苷酸序列。
一般地，“dsRNA未被加工”的意思是它尚未经历除去形成茎结构所必需的dsRNA区的转录后修饰。在一些实施方案中，dsRNA已经被修饰而除去 5’或3’非翻译区，或多聚A尾部。在一些实施方案中，dsRNA已经被修饰而除去非互补性的区域，诸如那些据观察可形成环结构(如在RNA发夹中一样) 的区域。
本发明在提供在跨界RNAi应用中使用的高水平的dsRNA分子中特别有用。如先前讨论的，现在共认为了使跨界RNAi获得成功，必须对靶生物体提供大量的dsRNA。本发明的一个特别重要的发现是，质体中生成的dsRNA 不能从质体通入胞质溶胶。这在两个方面中是重要的。第一，通过在质体中保留，dsRNA能够在质体中得到大量积累。第二，由于dsRNA被质体阻止与胞质溶胶的相互作用，dsRNA不能诱导最终可以影响质体中生成的dsRNA，或者在其它情况下影响植物生长和生成的胞质溶胶RNAi。实际上，质体为在原本会诱导RNAi的条件下实现dsRNA的生成提供了可能。
因此，根据本发明应当理解，dsRNA在维管植物的质体中积累，并且被质体保留，从而阻止dsRNA从质体外流到胞质溶胶中，并且因此防止在胞质溶胶中诱导RNAi。
在上文描述的实施方案中，质体可以是叶绿体，色质体，白色体，或前质体。通常，质体是叶绿体。线粒体是非质体细胞器，其也可以包含根据本发明的核酸构建体。
在别的实施方案中，提供了由如上文描述的质体或叶绿体生成时的 dsRNA。
B.核酸构建体
在一个实施方案中，本发明提供了用于转化维管植物的核酸构建体，其包含：
-编码区，用于编码双链RNA(dsRNA)分子；
-在质体中可运作的启动子，其用于使所述dsRNA分子能够在质体中生成；
-对于所述构建体向维管植物的质体基因组中的整合为选择性的一个或多个整合位点；
-其中dsRNA具有使siRNA能够从该dsRNA生成的序列。
具体地，构建体可以被转化到植物的质体中。该构建体包含编码区，所述编码区在表达成RNA后可形成或生成dsRNA分子，该dsRNA分子可以用于抑制另一种生物体中的靶基因表达。为了启动或增强表达，此类核酸构建体可以包含一种或多种调节序列，该调节序列可以与能够表达为dsRNA的核酸序列可操作连接。
在具体的实施方案中，本发明的核酸构建体可以包含编码dsRNA分子的核酸序列。在许多实施方案中，转录的dsRNA分子可以以稳定化的形式，例如，作为发夹和茎和环结构提供。
编码dsRNA分子的核酸构建体可以包含至少两个核苷酸序列，其中编码序列的安排使得相对于至少一个启动子，一个核苷酸序列为有义取向，另一个核苷酸序列为反义取向；其中有义核苷酸序列和反义核苷酸序列通过约五 (～5)至约一千(1000)个核苷酸的间隔序列连接或相连。间隔序列可以在有义序列与反义序列之间形成环。有义核苷酸序列或反义核苷酸序列可以与靶基因或其片段的核苷酸序列基本上同源。然而，在一些实施方案中，核酸构建体分子可以编码没有间隔序列的dsRNA分子。在实施方案中，有义编码序列和反义编码序列可以是不同长度。
对于被认为可以用来帮助进行跨界RNAi的序列，可以通过在本发明的核酸构建体中创建合适的表达盒来将它们容易地整合到表达的dsRNA分子中。例如，可以如下所述地将此类序列表达为具有茎和环结构的发夹：取与靶基因序列对应的第一区段；将此该列与第二区段间隔区连接，所述第二区段间隔区与第一区段不同源亦不互补；然后与第三区段连接，其中第三区段的至少一部分与第一区段基本上互补。这样的构建体通过第一区段与第三区段的杂交形成茎和环结构，其中形成包含第二区段的环结构。参见例如，美国专利公开文本No.US 2002/0048814和US 2003/0018993；和国际PCT公开文本No.WO94/01550和WO98/05770。
在一个优选的实施方案中，上文提及的间隔序列可以具有内含子序列，尤其是叶绿体或质体基因组的基因的内含子的序列。表1中显示了例子。
表1：陆生植折叶绿体的蛋白质编码基因中存在的内含子
Figure BDA0001149577020000211
来自Introns in chloroplast protein-coding genes of land plants.AINEL. PLANT & JOHN C.GRAY Photosynthesis Research 16:23-39(1988)
被叶绿体或质体加工的叶绿体或质体内含子在本发明的某些实施方案中可以具有特别的优势，因为它们可以使叶绿体或质体能够生成具有较小的环的发夹RNA，这样的发夹RNA可能是昆虫切丁酶和与昆虫RNAi有关的相关酶的更好的底物。
在另一个优选的实施方案中，间隔序列可以具有用于将内含子从质体的初级RNA转录物剪接除去的共有剪接信号的序列。在此实施方案中，共有剪接信号可能位于自身没有叶绿体内含子的序列的间隔序列的侧翼。
本发明的实施方案包括将本发明的构建体导入质体中(即转化)以实现一种或多种dsRNA分子的稳态表达水平。例如，核酸构建体可以是载体，诸如线性或闭合环状质粒。载体系统可以是单一载体或质粒，或者两个或更多个载体或质粒，其一起含有要导入宿主的质体基因组中的总DNA。另外，载体可以是表达载体。例如，可以在合适的启动子的控制下将本发明的编码区适当插入载体中，所述启动子可在一种或多种宿主中发挥功能以驱动与之连接的编码序列或其它DNA序列的表达。许多载体可用于此目的，并且合适的载体的选择主要将取决于要插入载体中的核酸的大小和要用载体转化的特定质体。每种载体含有不同的组分，这取决于其功能(例如，DNA的扩增或DNA 的表达)和与它相容的特定的宿主细胞或亚细胞细胞器。
载体是是核酸分子，它被导入细胞中，例如以生成经转化的细胞。载体可以包括允许它在宿主细胞中复制的核酸序列，诸如复制起点。载体的例子包括但不限于：质粒；粘粒；噬菌体；或携带外源DNA进入细胞的病毒。载体还可以包含一种或多种基因、反义序列和/或选择标志物基因，和本领域中已知的其它遗传元件。载体可以转导，转化或感染细胞，从而使细胞表达由载体编码的核酸分子和/或蛋白质。任选地，载体包含有助于实现核酸分子进入细胞的材料(例如，脂质体，蛋白质包层材料等)。
载体可以包括允许其在宿主细胞的质体中复制的核酸序列。优选地，序列使载体能够在宿主细胞的质体中复制，而不在宿主细胞的胞质溶胶或核中复制。
在一个实施方案中，核酸构建体包含允许其包含的转基因整合到宿主细胞的质体基因组中的核酸序列。优选地，核酸构建体经过调适，使得转基因选择性地整合入或至少优先整合入质体基因组，而不是核基因组。因此，在一个实施方案中，核酸构建体含有一定的序列，使其能够整合入宿主细胞的质体的基因组中，但不整合到宿主细胞核的基因组中。整合区域的例子是 trnV-3’-rps12，trnI-trnA和trnfM-trnG。具体整合位点的例子是：trnH/pbA， trnG/trnfM，ycf3/trnS，rbcL/accD，petA/psbJ，5’rps12/clpP，petD/rpoA， ndhB/rps7，3’rps12/trnV，trnV/rrn16，rrn16/trnI，trnI/trnA，trnN/trnR 和rpl32/trnL。
为了能够在质体中表达(即转录)dsRNA分子，核酸构建体可以包含编码 dsRNA分子的区域，其可操作连接到一个或多个调节序列，比如可在要表达核酸构建体的质体中发挥功能的异源启动子序列。
当第一核酸序列与第二核酸序列处于功能关系时，第一核苷酸序列与第二核酸序列是可操作连接的。如果可操作连接的核酸序列是重组生成的，可操作连接的核酸序列通常是连续的，并且在必要时在相同的阅读框中(例如，在多顺反子ORF中)连接两个蛋白质编码区。然而，可操作连接的核酸不需要是连续的。
当用于调节序列和编码序列时，术语“可操作连接”是指调节序列影响连接的编码序列的表达。“调节序列”或“控制元件”是指影响转录、RNA 加工或稳定性的时机和水平/量、或相关编码序列的翻译的核苷酸序列。调节序列可以包括：启动子；翻译前导序列；内含子；增强子；茎环结构；阻遏物结合序列；终止序列；多聚腺苷酸化识别序列；等。特定的调节序列可以位于与其可操作连接的编码序列的上游和/或下游。还有，与编码序列可操作连接的特定调节序列可以位于双链核酸分子的相关的互补链上。
如本文中使用，术语“启动子”是指可以在转录起始上游、且可以参与 RNA聚合酶和其它蛋白质识别和结合以启动转录的DNA区域。启动子可以与在细胞中表达的编码序列可操作连接，或者启动子可以与编码信号序列的核苷酸序列可操作连接，所述信号序列可以与在细胞中表达的编码序列可操作连接。“植物启动子”可以是能够在植物细胞中启动转录的启动子。在发育控制下的启动子的例子包括优先在某些组织，如叶，根，种子，纤维，木质部导管，管胞或厚壁组织中启动转录的启动子。此类启动子称为“组织优选的”。仅在某些组织中启动转录的启动子称为“组织特异性的”。
“细胞类型特异性”启动子主要驱动在一个或多个器官，例如根或叶中的维管细胞中的某些细胞类型中的表达。仅在某些亚细胞细胞器(例如，如线粒体或叶绿体或其它质体)中启动转录的启动子依情况称为“质体特异性”，“叶绿体特异性”或“线粒体特异性”启动子。应当理解，一些启动子可以在多于一种亚细胞位置启动转录。
在一个特别优选的实施方案中，核酸构建体包含在质体中可运作的启动子或调节元件，并且不含有在宿主细胞的细胞核或胞质溶胶或其它细胞器中可运作的启动子或调节元件。
“诱导型”启动子可以是可以在环境控制下的启动子。可以通过诱导型启动子启动转录的环境条件的例子包括厌氧条件和光的存在。组织特异性，组织优选性，细胞类型特异性和诱导型启动子构成“非组成性”启动子类别。“组成性”启动子是可以在大多数环境条件下或在大多数细胞或组织类型中有活性的启动子。
在本发明的一些实施方案中可以使用任何诱导型启动子。参见Ward et al.(1993)Plant Mol.Biol.22:361-366。凭借诱导型启动子，转录速率响应诱导剂而增加。示例性的诱导型启动子包括但不限于：响应铜的来自ACEI系统的启动子；响应苯磺酰胺除草剂安全剂的来自玉米的In2基因；来自Tn10的Tet 阻遏物；和来自类固醇激素基因的诱导型启动子，其转录活性可以由糖皮质激素激素诱导(Schena et al.(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88:0421)。
示例性的组成性启动子包括但不限于：来自植物病毒的启动子，如来自花椰菜花叶病毒(CaMV)的35S启动子；来自稻肌动蛋白基因的启动子；泛素启动子；pEMU；MAS；玉米H3组蛋白启动子；和ALS启动子，芸苔(Brassica napus)ALS3结构基因5’的XbaI/NcoI片段(或与所述Xbal Ncol片段的核苷酸序列相似性)(国际PCT公开文本No.WO 96/30530)。
另外，在本发明的一些实施方案中可以利用任何组织特异性或组织优选性启动子。用包含与组织特异性启动子可操作连接的编码序列的核酸分子转化的植物可以专门在或优先在特定组织中产生编码序列的产物。示例性的组织特异性或组织优选性启动子包括但不限于：根优选启动子，例如来自菜豆蛋白基因的启动子；叶特异性和光诱导启动子，例如来自cab或rubisco的启动子；花药特异性启动子，如来自LAT52的启动子；花粉特异性启动子，如来自ZmJ3的启动子；和小孢子优选性启动子，如来自apg的启动子。
适合于在本发明的构建体中使用的启动子包括诱导型，病毒的，合成的或组成性的启动子，它们都是本领域中公知的。描述这类启动子的非限制性例子包括美国专利No.6,437,217(玉米RS81启动子)；5,641,876(稻肌动蛋白启动子)；6,426,446(玉米RS324启动子)；6,429,362(玉米PR-1启动子)； 6,232,526(玉米A3启动子)；6,177,611(组成性玉米启动子)；5,322,938， 5,352,605，5,359,142，和5,530,196(35S启动子)；6,433,252(玉米L3油质蛋白启动子)；6,429,357(稻肌动蛋白2启动子和稻肌动蛋白2内含子)；6,294,714(光诱导型启动子)；6,140,078(盐诱导型启动子)；6,252,138(病原体诱导型启动子)；6,175,060(磷缺乏诱导型启动子)；6,388,170(双向启动子)；6,635,806(γ- 薏苡醇溶蛋白(coixin)启动子)；和美国专利申请系列号09/757,089(玉米叶绿体醛缩酶启动子)。另外的启动子包括胭脂碱合酶(NOS)启动子(Ebert et al. (1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84(16):5745-9)和章鱼碱合酶(OCS)启动子 (两者都携带在根癌土壤杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)的肿瘤诱导质粒上)；花椰菜花叶病毒组(caulimovirus)启动子，如花椰菜花叶病毒(CaMV)19S启动子(Lawton et al.(1987)Plant Mol.Biol.9:315-24)；CaMV 35S启动子(Odell etal. (1985)Nature 313:810-2)；玄参花叶病毒35S-启动子(Walker et al.(1987)Proc. Natl.Acad.Sci.USA 84(19):6624-8)；蔗糖合酶启动子(Yang and Russell(1990) Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87:4144-8)；R基因复合物启动子(Chandler et al.(1989)Plant Cell 1:1175-83)；叶绿素a/b结合蛋白基因启动子；CaMV35S(美国专利号5,322,938，5,352,605，5,359,142，和5,530,196)；FMV35S(美国专利号6,051,753和5,378,619)；PC1SV启动子(美国专利号5,850,019)；SCP1启动子 (美国专利号6,677,503)；和AGRtu.nos启动子(GenBank登录号V00087； Depicker et al.(1982)J.Mol.Appl.Genet.1:561-73；Bevan et al.(1983)Nature 304:184-7)。
在具体实施方案中，本发明的核酸构建体包含组织特异性启动子，如根特异性启动子。根特异性启动子专门在或优先在根组织中驱动可操作连接的序列的表达。根特异性启动子的例子是本领域中已知的。参见例如美国专利 5,110,732；5,459,252和5,837,848；和Opperman et al.(1994)Science 263:221-3；及Hirel et al.(1992)PlantMol.Biol.20:207-18。在一些实施方案中，编码 dsRNA分子的区域可以克隆在两个根特异性启动子之间，所述根特异性启动子在转基因植物细胞中可运作，并在其中表达以在转基因植物细胞和/或质体中产生dsRNA分子。
其它可以任选与感兴趣的核酸分子可操作连接的调节序列包括位于启动子序列和编码序列之间的发挥翻译前导序列功能的5'UTR。翻译前导序列存在于经过完全加工的mRNA中，可以影响初级转录物的加工，和/或RNA 稳定性。翻译前导序列的例子包括玉米和牵牛花热休克蛋白前导序列(美国专利号5,362,865)，植物病毒外壳蛋白前导序列，植物rubisco前导序列等。参见，例如，Turner and Foster(1995)Molecular Biotech.3(3):225-36。5'UTR的非限制性例子包括GmHsp(美国专利号5,659,122)；PhDnaK(美国专利号 5,362,865)；AtAnt1；TEV(Carrington and Freed(1990)J.Virol.64:1590-7)；和AGRtunos(GenBank登录号V00087；和Bevan et al.(1983)Nature 304:184-7)。
在一些实施方案中，启动子区源自叶绿体基因，例如来自菠菜或豌豆的 psbA基因，来自玉米的rbcL和atpB启动子区和rRNA启动子(来自质体rrn操纵子)。启动子的例子描述于Verma&Daniell(2007)Plant Physiol.145:1129-43； Rasala et al.(2011)PlantBiotech.J.9:674-83,Hanley-Bowdoin and Chua,TIBS (1987)12:67-70；Mullet et al.,Plant Molec.Biol.(1985)4:39-54； Hanley-Bowdoin(1986)PhD.Dissertation,TheRockefeller University；Krebbers et al.,Nucleic Acids Res.(1982)10:4985-5002；Zurawski et al.,Nucleic Acids Res.(1981)9:3251-3270；及Zurawski et al.,Proc.Nat'l Acad Sci.U.S.A.(1982) 79:7699-7703。可以鉴定其它启动子，并且如下所述地评估如此鉴定的启动子的相对强度：将感兴趣的启动子置于无启动子标志物基因的5’，并观察其相对于例如psbA基因来源的启动子(至今鉴定的最强的叶绿体启动子)获得的转录效率。另外，可以通过多种技术增强编码区表达的效率。这些技术包括使用在感兴趣的DNA序列的5’串联插入的多个启动子，例如双重psbA启动子，添加增强子序列等。在一个实施方案中，启动子区源自叶绿体基因，如下表 2所示。
Figure BDA0001149577020000261
Figure BDA0001149577020000271
Figure BDA0001149577020000281
Figure BDA0001149577020000291
通常，在叶绿体中有功能的启动子是组成性而不是诱导型。然而，如果期望提供感兴趣的dsRNA分子的诱导型表达，则可以提供可调节的启动子 (regulatable promoter)和/或含有如下所述的序列的5’非翻译区(5’UTR)：所述序列为转录和/或翻译水平上的调节(在3’末端)提供条件。转录和RNA稳定性似乎是叶绿体基因表达的重要决定因素。例如，可以使用来自其表达可被光调节的基因的5’非翻译区。类似地，3'反向重复区可用于稳定外源基因的RNA。可以通过响应于感兴趣的特定刺激的表达增强、以及在缺乏刺激时的低表达或不表达，来鉴定可调节的基因。例如，如果用光照射期间表达增强，而在光照可忽略时表达实质降低或无表达，则可以鉴定为光可调节基因。可根据本发明使用的5’UTR包括GGAGG，psbA，rbcL，atpB，Cry2A和T7基因10。
其它可以任选与感兴趣的核酸分子可操作连接的调节序列还包括3’非翻译区(3’UTR)，3’转录终止区或多聚腺苷酸化区。这些区域是位于核苷酸序列下游的遗传元件，包括提供多聚腺苷酸化信号的多核苷酸和/或能够影响转录或mRNA加工的其它调节信号。多聚腺苷酸化信号在植物中发挥功能，导致多聚腺苷酸核苷酸添加到mRNA前体的3’末端。多聚腺苷酸化序列可以衍生自多种植物基因或T-DNA基因。3’转录终止区的非限制性例子是胭脂碱合酶3’区(nos 3'；Fraley et al.(1983)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 80:4803-7)。在Ingelbrecht et al,(1989)Plant Cell 1:671-80中提供了使用不同3’非翻译区的例子。多聚腺苷酸化信号的非限制性例子包括来自豌豆(Pisum sativum)RbcS2 基因(Ps.RbcS2-E9；Coruzzi et al.(1984)EMBO J.3:1671-9)和AGRtu.nos (GenBank登录号E01312)的信号。可根据本发明使用的3’UTR包括rps16，rbcL， psbA和petD。
在一些实施方案中，转化载体可以含有与超过一个靶序列特异性互补的序列，从而允许产生超过一种dsRNA，以抑制靶生物的一个或多个群体或物种的细胞中两种或更多种基因的表达。与存在于不同基因中的核苷酸序列特异性互补的核苷酸序列的区段可以组合成单个复合核酸分子，用于在转基因植物中表达。此类区段可以是连续的或由间隔物序列分开。
本发明的核酸构建体或载体可以包含对经转化的细胞赋予可选择表型的选择标志物。标志物可以编码杀生物剂抗性，抗生素抗性(例如，卡那霉素，遗传霉素(G418)，博来霉素，潮霉素等)或除草剂耐受性(例如，草甘膦等)。
选择标志物的例子包括但不限于：编码卡那霉素抗性的neo基因，并且可以为了使用卡那霉素，G418等而选择；编码双丙氨膦抗性的bar基因；编码草甘膦耐受性的突变EPSP合酶基因；赋予对溴苯腈的抗性的腈水解酶基因；赋予咪唑啉酮或磺酰脲抗性的突变体乙酰乳酸合酶基因(ALS)；和甲氨蝶呤抗性DHFR基因。多种选择标志物是可用的，它们赋予对氨苄青霉素，博来霉素，氯霉素，庆大霉素，潮霉素，卡那霉素，林可霉素，甲氨蝶呤，草胺膦，嘌呤霉素，壮观霉素，利福平，链霉素和四环素等的抗性。此类选择标志物的例子示出在例如美国专利No.5,550,318；5,633,435；5,780,708；和 6,118,047中。
本发明的重组核酸构建体或载体还可以包括可筛选标志物。可筛选标志物可用于监测表达。示例性的可筛选标记包括β-葡糖醛酸糖苷酶或uidA基因 (GUS)，其编码已知各种生色底物的酶(Jefferson et al.(1987)Plant Mol.Biol. Rep.5:387-405)；R基因座基因，其编码调节植物组织中花色素苷色素(红色) 产生的产物(Dellaporta et al.(1988)"Molecular cloning of the maize R-nj allele by transposon tagging with Ac."In18th Stadler Genetics Symposium.P. Gustafson and R.Appels,eds.(New York:Plenum),pp.263-82)；β-内酰胺酶基因(Sutcliffe et al.(1978)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 75:3737-41)；编码已知其各种生色底物的酶的基因(例如，PADAC，生色头孢菌素)；萤光素酶基因(Ow et al.(1986)Science 234:856-9)；编码可以转化生色儿茶酚的儿茶酚双加氧酶的 xylE基因(Zukowski et al.(1983)Gene 46(2-3):247-55)；淀粉酶基因(Ikatu et al. (1990)Bio Technol.8:241-2)；编码能够将酪氨酸氧化为DOPA和多巴醌(其继而被缩合成黑色素)的酶的酪氨酸酶基因(Katz et al.(1983)J.Gen.Microbiol. 129:2703-14)；和α-半乳糖苷酶。
在一个实施方案中，核酸构建体还可以包含用于生成杀虫多肽的编码区。
杀虫多肽可以是对于鞘翅目、鳞翅目或半翅目有害生物而言杀虫性的。
杀虫多肽可以是具有苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)中找到的多肽的序列的杀虫多肽。
杀虫性的苏云金芽孢杆菌多肽可以选自下组：Cry1(例如Cry1Ab，Cry1 Ac，Cry1A.105，Cry1Ca，Cry1Da)，Cry2(例如，Cry2Ab)，Cry3(例如，Cr y3Bb；Cry3A)，Cry6，Vip3(例如，Vip3Ab1)，Cry34，Cry35及其修饰，包括但不限于添加和缺失。http:// www.lifesci.sussex.ac.uk/home/Neil_Crickmore/Bt/intro.html有维护并经常更新的Bt扩展列表。目前有超过73个主要的“Cry”毒素组(Cry1-Cry73)，还有其他Cyt毒素和植物杀虫蛋白(VIP)毒素等。许多数字组有大写字母的亚组，且大写字母亚组有小写字母亚组。(例如，Cry1具有A-L，并且Cry1A具有a-i)。
杀虫多肽可以是PIP-1多肽。
在一个实施方案中，苏云金芽孢杆菌杀虫多肽可以与含有dsRNA的构建体一起使用，所述dsRNA对于CPB(科罗拉多马铃薯甲虫(Colorado potato beetle))，玉米根虫或其它昆虫有害生物中的必需基因是杀虫性的。此类靶基因包括例如CPB中的ATP酶编码基因。其它此类靶基因包括例如玉米根虫中的液泡ATP酶，ARF-1，Act42A，CHD3，EF-1α，ROP，RNAPII和TFIIB。合适的靶基因的例子是液泡ATP酶，如WO2007035650中所公开的。
在一些实施方案中，如上所述的重组核酸构建体可以在用于创建转基因植物和在植物质体中特异性表达异源核酸的方法中使用，为产生稳态水平的 dsRNA分子提供条件。植物转化载体可以通过例如将编码dsRNA分子的核酸构建体插入植物转化载体，特别是质体转化载体，然后引入质体(例如，叶绿体)中来制备。
如果期望含有表达盒的质粒在叶绿体中复制，可以在表达构建体中使用任何叶绿体复制起点。
在一个实施方案中，调适核酸构建体以防止由其产生的dsRNA在宿主细胞核或其它可以从dsRNA生成siRNA的宿主细胞区室中表达。这为生成含有未被植物衍生的siRNA或相关的Argonaute蛋白污染、并且因此具有增强的杀虫效力的杀虫dsRNA的植物材料提供了可能。根据该实施方案，提供了用于转化维管植物的核酸构建体，其包括：
-编码区，用于编码双链RNA(dsRNA)分子；
-在质体中能运作的启动子，用于使所述dsRNA分子能够在质体中生成，优选选自表2中显示的启动子或调节元件；
-一个或多个对于构建体向维管植物质体基因组中的整合为选择性的整合位点；优选选自下组的整合位点：trnH/pbA，trnG/trnfM，ycf3/trnS， rbcL/accD，petA/psbJ，5'rps12/clpP，petD/rpoA，ndhB/rps7，3'rps12/trnV， trnV/rrn16，rrn16/trnI，trnI/trnA，trnN/trnR，和rpl32/trnL。
根据此实施方案，通过使用仅在叶绿体中激活的启动子，并且使用仅能够实现对叶绿体基因组的整合的整合位点，可防止形成在叶绿体外部表达针对相关转基因的dsRNA的植物，并且防止形成表达针对相关转基因的siRNA 的植物。一个优点是，能够基于叶绿体转化的存在来选择转化体，而不必进一步选择既是质体转化体又是核转化体的细胞，因为使用该构建体不会产生后一种细胞群体。
在一个特别优选的实施方案中，提供了用于转化维管植物的核酸构建体，其包含：
-编码RNA分子的编码区，所述RNA分子具有第一区和第二区，二者被间隔区分开，其中第一区与第二区有部分或完全序列互补性，并且其中所述间隔与表1中显示的内含子的序列相同或同源；
-在质体中能运作的启动子，用于使RNA分子能够在质体中生成，优选选自表2中显示的启动子或调节元件；
-一个或多个对于构建体在维管植物的质体基因组中的整合为选择性的整合位点；优选选自下组的整合位点：trnH/pbA，trnG/trnfM，ycf3/trnS， rbcL/accD，petA/psbJ，5'rps12/clpP，petD/rpoA，ndhB/rps7，3'rps12/trnV， trnV/rrn16，rrn16/trnI，trnI/trnA，trnN/trnR，和rpl32/trnL。
C.质体转化
可以通过多种方法中的任一种将本发明的核酸构建体转化到感兴趣的植物细胞中。这些方法包括例如生物射弹装置(见例如Sanford,Trends In Biotech.(1988)6:299-302；美国专利No.4,945,050)；电穿孔(Fromm et al.,Proc. Nat'l.Acad.Sci.(USA)(1985)82:5824-5828)；使用激光束，电穿孔，显微注射或任何其它能够将DNA导入叶绿体中的方法。这些技术的使用允许将本文所述的发明应用于极其多种的单子叶植物和双子叶植物细胞中。
如本文中使用，术语“转化”或“转导”是指将一个或多个核酸分子转移到细胞中。当核酸分子通过核酸分子向细胞基因组中的组入，或通过附加体复制而被细胞稳定复制时，细胞被转导到细胞中的核酸分子“转化”。如本文中使用的，术语“转化”涵盖可以将核酸分子导入此类细胞中的所有技术。实例包括但不限于：用病毒载体转染；用质粒载体转化；电穿孔(Fromm et al.(1986)Nature 319:791-3)；脂转染(Feigner et al.(1987)Proc.Natl.Acad. Sci.USA 84:7413-7)；显微注射(Mueller et al.(1978)Cell 15:579-85)；土壤杆菌介导的转移(Fraley et al.(1983)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 80:4803-7)；直接 DNA摄取；和微粒轰击(Klein et al.(1987)Nature 327:70)。
为了用于轰击转化技术，将核酸构建体吸附到轰击颗粒上，轰击颗粒通常由平均尺寸为约0.7μm的钨颗粒组成。也可以使用由密度与钨近似的其它金属，例如金，铂等组成的颗粒。通常，每μg钨吸附约2-5μg的DNA，通常每μg钨为约2μg DNA。在将DNA吸附到颗粒上之后，分散任何颗粒团，例如通过超声处理来分散。任何将DNA固定在金属轰击颗粒的外表面上的方法都是可接受的，并且是本领域技术人员已知的。(参见，例如，Sanford et al.(1988) 同上和Klein et al.同上)。DNA必须固定于颗粒以便递送，但不以阻碍DNA 释放到细胞中的方式来固定。
为了转化，根据制造商的使用说明，将约100-500μg，通常约200μg的已经吸附有表达盒的轰击颗粒装载到粒子枪(例如可从Biolistics,Inc.和DuPont 获得的那些)中。将分离的细胞[一般每个培养板(5cm直径)为100-300μg鲜重] 放置在生长表面上，例如培养皿或含有例如具有生长培养基的Whatman#1 滤纸的组织培养皿，以将细胞粘附到固体表面。细胞不必成单细胞层，而是可以是几个层厚。将固定的细胞置于粒子枪的轰击室中并置于尽可能高的真空下，通常为约0.07至0.3大气压，优选0.07。然后，在轰击之前将样品室中的压力降低到约0.07大气压。优选地，与粒子枪的桶末端相距约10cm轰击细胞(在DuPont因枪中的第四级水平)。激活粒子枪的开火机制，并且将细胞轰击1-3次，通常两次以增加经转化的细胞的数量。然后释放真空，并将轰击的细胞置于约26℃的新鲜生长培养基中，优选在生长室中的光照下。其它射弹装置包括使用“飞盘”，如由塑料膜制成的那些或由例如尼龙网(94μm) (“氦夹带”方法)制成的盘。
当在转化过程中使用的宿主细胞拥有全能性时，可以产生含有转基因质体(例如，叶绿体)的植物。用于从经转化的细胞或组织再生转基因植物的规程通常是相似的，本领域技术人员在其能力范围内可做适当的修改。双子叶植物，如甜菜，Freytag et al.PlantCell Rep.(1988)7:30-34；烟草，Svab et al. Proc.Nat'l Acad.Sci.U.S.A.(1990)8526-8530，或单子叶植物，如来自花药或胚胎的小麦(见下文)的再生按常规已经获得成功。
如果期望在其它植物材料(例如花药培养衍生的植物或胚胎衍生的愈伤组织)中转化质体，那么将植物材料置于方便的容器中，例如如上文针对分离的细胞所描述的培养皿。(还可见US 6,680,426；Hanson et al(2012)Journal of Experimental Botany,64:753-768；和Golds et al.,(1993)Nature Biotechnology 11,95–97)。
一旦证明质体已经被转化，植物的细胞可以重复地用于组织培养，然后视需要培养愈伤组织或再生植物。因此，可以通过使用细胞和组织培养物重复再生经修饰的植物细胞。在一些情况下，可以从种子维持适当的繁殖。为了改善鉴定经转化的细胞的能力，建议用于产生转化体的转化载体采用如前文所述的可选择或可筛选标志物基因。在使用选择标志物的情况下，通过将细胞暴露于一种或多种选择剂来在潜在转化的细胞群内鉴定经转化的细胞。在使用可筛选标志物的情况下，可以对细胞筛选期望的标志物基因性状。
对于在暴露于选择剂后存活的细胞或在筛选测定中已经评分为阳性的细胞，可以在支持植物再生的培养基中培养。在一些实施方案中，可以通过包括其它物质，如生长调节剂来修饰任何合适的植物组织培养基(例如，MS 和N6培养基)。可以将组织维持在具有生长调节剂的基础培养基上，直到足够的组织可用于开始植物再生努力，或者在重复的多轮手动选择之后，直到组织的形态适合于再生(例如，至少2周)，然后转移到有利于枝条形成的培养基。定期转移培养物，直到发生足够的枝条形成。一旦形成枝条，将它们转移到有利于根形成的培养基中。一旦形成足够的根，可以将植物转移到土壤中用于进一步生长和成熟。
为了证实在再生植物中dsRNA分子的存在，可以进行多种测定。这样的测定包括例如：分子生物测定，如Southern和Northern印迹法，PCR和核酸测序；植物部分测定，如叶或根测定。
取决于转化方法，转化体可能包含既是质体转化体又是核转化体的细胞，因此选择与质体转化关联的标志物也可能导致既是质体转化体又是核转化体的细胞被选择，从而有可能产生可以在叶绿体外表达dsRNA和/或形成 siRNA的细胞，可能影响由这些细胞产生的植物的杀虫效力。这个问题可以通过利用上文描述的本发明的优选构建体，以及使用仅在叶绿体中有活性的启动子来解决，所述构建体包含同源重组区(在本文中也描述为整合位点)，使得整合能够在质体基因组中而不是在核基因组中实现。由此，选择方法能够选择在质体中产生dsRNA并且不产生质体外的dsRNA，或siRNA的细胞或植物。
整合事件可以例如PCR扩增来分析，PCR扩增使用例如对感兴趣的核酸分子或dsRNA特异的寡核苷酸引物。PCR基因型分型应理解为包括，但不限于源自分离的宿主植物愈伤组织(其预测为含有整合到基因组中的感兴趣的核酸分子)的基因组DNA的聚合酶链反应(PCR)扩增，接着进行标准克隆，和 PCR扩增产物的序列分析。PCR基因型分型的方法前人多有描述(例如，Rios, Q.et al.(2002)Plant J.32:243-53)，可以应用于源自任何植物物种(例如，玉蜀黍(Z.mays)或大豆(G.max))或组织类型，包括细胞培养物的基因组DNA。
在具体的实施方案中，在植物细胞中产生至少2、3、4、5、6、7、8、9 或10个或更多个不同的dsRNA分子。dsRNA分子可以从在不同转化事件中引入的多个核酸构建体或在单个转化事件中引入的单个核酸构建体表达。在一些实施方案中，多个dsRNA分子在单个启动子的控制下表达。在其它实施方案中，多个dsRNA分子在多个启动子的控制下表达。可以表达单个dsRNA分子，其包含多个核酸序列，这些核酸序列各自与一种或多种生物体内的具有靶基因序列的不同基因座同源。
除了用核酸构建体直接转化植物外，可以通过使具有至少一种转基因事件的第一植物与缺少此种事件的第二植物杂交来制备转基因植物。例如，可以将包含编码dsRNA分子的核苷酸序列的核酸构建体导入适合于转化的第一植物系以产生转基因植物，该转基因植物可以与第二植物系杂交以将编码 dsRNA分子的核苷酸序列渐渗入第二植物系的遗传背景中。
可以根据上述方法转化许多维管植物之任一种。
也可以用与由本发明的质体和核酸构建体产生的dsRNA靶向有害生物中相同或不同的生物学作用途径的杀虫构建体转化质体。这些构建体的例子包括编码如上文提及的杀虫蛋白的那些构建体，特别是苏云金芽孢杆菌杀虫蛋白，优选Cry蛋白。这些构建体的相关编码区可以在本发明的核酸构建体 (即产生dsRNA的那些)中提供，或者它们可以在单独的构建体中。关于后者，例如，在一个实施方案中，质体可以包括第一核酸构建体，其包括：
-编码区，用于编码双链RNA(dsRNA)分子；
-在质体中可运作的启动子，用于使dsRNA分子能够在质体中生成；
-对于所述构建体向维管植物的质体基因组中的整合为选择性的一个或多个整合位点；
-其中dsRNA具有使siRNA能够从该dsRNA生成的序列；和另一核酸构建体，其包含：
用于编码杀虫剂，优选杀虫蛋白的编码区。
在一个实施方案中，质体具有超过2种不同的核酸构建体，其中之一是编码或产生如本文中公开的杀虫dsRNA的核酸构建体。在其它实施方案中，质体具有多于3、4、5、6、7、8、9、10或更多种不同构建体，其中至少一种是用于编码或产生如本文中公开的杀虫dsRNA的核酸。
D.植物
维管植物也称为导管植物，并且也称为高等植物。维管植物是陆地植物，具有用于在整个植物中引导水和矿物质的木质化组织(木质部)。它们还具有专门的非木质化组织(韧皮部)以传导光合作用的产物。因而，本发明的植物可以是选自下组的植物：石松(clubmosses)，马尾(horsetails)，蕨类植物(ferns)，裸子植物(gymnosperms)(包括松柏植物(conifers))和被子植物(angiosperm)(开花植物)，以及来自导管植物门(Tracheophyta)和Tracheobionta的植物。
在一个优选的实施方案中，植物是选自下组的双子叶植物：芸苔(canola)，棉，马铃薯，昆诺阿藜(quinoa)，苋属植物(amaranth)，荞麦(buckwheat)，红花，大豆，甜菜，向日葵，油菜，烟草，拟南芥，芸苔属物种(例如芸苔(B.napus), 芜菁(B.rapa)，芥菜(B.juncea)，埃塞俄比亚芥(B.carinata)，黑芥(B.nigra)，甘蓝(B.oleracea)，白芥(B.alba)等)，棉，苜蓿和三叶草(clover)。
在一个优选的实施方案中，植物是选自下组的单子叶植物：玉米，稻，黑麦，高粱，小米，小麦，甘蔗，燕麦，大麦，菠萝，香蕉，棕榈，观赏植物和禾本科植物(例如，臂形草属(Brachiaria)，黑麦草属(Lolium)和羊茅属 (fescue))。
因此，在别的实施方案中，本发明提供了包含质体的植物，所述质体包含：
-核酸构建体，其包含：
-编码区，用于编码双链RNA(dsRNA)分子；
-在所述质体中能运作的启动子，用于使所述dsRNA分子能够生成；
-其中dsRNA具有使siRNA能够从该dsRNA生成的序列。
在又一个实施方案中，本发明提供了含有用于转化维管植物的核酸构建体的植物，所述核酸构建体包含：
-编码区，用于编码双链RNA(dsRNA)分子；
-在质体中能运作的启动子，用于使所述dsRNA分子能够在质体中生成；
-对于构建体在维管植物的质体基因组中的整合为选择性的一个或多个整合位点；
-其中dsRNA具有使siRNA能够从该dsRNA生成的序列。
在一个优选的实施方案中，植物可以不含用于与由核酸构建体编码的 dsRNA杂交的siRNA。在另一个优选的实施方案中，植物可以在与质体不同的区室中不含由核酸构建体编码的dsRNA。在这些实施方案中，植物可以在该植物的质体中含有dsRNA，但是在该植物中的另一种细胞器、胞质溶胶、核或其它地方中不含有该核酸构建体产生的dsRNA所衍生的siRNA、或其他与该核酸构建体产生的dsRNA的具有序列同源性或互补性的siRNA。
应当理解，虽然本发明的植物通常不含所述核酸构建体产生的dsRNA的siRNA，或其他与由该核酸构建体产生的dsRNA具有序列同源性或互补性的 siRNA，而且叶绿体外部也不含与由叶绿体内部的所述核酸构建体产生的 dsRNA具有序列同源性或互补性的dsRNA，但是在一个实施方案中，本发明的植物可以具有与由叶绿体内部的核酸构建体产生的dsRNA没有序列同源性或互补性的dsRNA或siRNA。在此实施方案中，根据本发明的植物可以进一步包括使得dsRNA或siRNA能够在植物的核中产生或表达的核转化事件，条件是上述dsRNA或siRNA与叶绿体内部产生的dsRNA没有序列同源性或互补性。在一个例子中，可以进一步工程化改造植物以提供基因沉默，从而形成期望的农艺学性状或杀虫性质。杀虫性质可以是由于形成了siRNA，siRNA 导致植物产生杀虫化合物。
在一个实施方案中，植物可以包括除了叶绿体或质体之外的细胞器，其含有用于编码杀虫剂(例如RNA或蛋白质)的核酸构建体或杀虫剂自身。在一个实施方案中，核或细胞质含有至少一种用于编码杀虫剂(例如RNA或蛋白质)的核酸构建体，或杀虫剂自身，优选超过3、4、5、6、7、8、9、10或更多不同的构建体或由所述构建体编码的基因产物。
本发明的植物对于本发明的实施方案的核酸构建体可以是异质性的(heteroplasmic)(其中只转化每个细胞的叶绿体总数的一部分)，或同质性(homoplasmic)的(其中转化每个细胞中的大部分或全部叶绿体)。优选地，植物是同质性的。更优选地，植物是T1之后的世代，并且是同质性的。
本发明的植物可以包括编码RNAi途径的功能所需要的基因产物的基因中的突变。此类基因产物的一个例子是切丁酶样4。其它者包括DRB4及其直向同源物。这些植物可以通过提供含有突变(例如源自敲除或同源重组的突变)的植物细胞或营养组织并用本文中所述的本发明的实施方案的核酸构建体转化那些细胞来产生。或者，用本文中所述的本发明的实施方案的核酸构建体转化的植物可以与这样的植物杂交：在编码RNAi途径功能所需要的基因产物的基因中具有突变的植物。
本发明的植物还可以包括编码对除草剂(如含羧酸的除草剂，包括苯氧基生长素)的耐受性的基因。
在一个实施方案中，本发明提供了种子、插枝或其它营养材料，其源自或以其它方式获自根据本发明的植物，特别是含有质体的植物，所述质体包含：
-核酸构建体，其包含：
-编码区，用于编码双链RNA(dsRNA)分子；
-在所述质体中能运作的启动子，用于使所述dsRNA分子能够生成；
-其中dsRNA具有使siRNA能够从该dsRNA生成的序列。
如上文描述的种子可以含有杀虫dsRNA，并且可以包含含有上文描述的编码区和启动子的核酸构建体。或者，种子可以不含杀虫dsRNA(例如因为启动子在种子中不被活化)，并且可以仅包含含有上文描述的编码区和启动子的核酸构建体，其然后能被活化以在质体或叶绿体中形成杀虫dsRNA，例如当种子萌发和/或产生叶子时。
可以包被种子，并且在一种形式中，可以用杀虫RNA，包括任何形式的沉默RNA，优选dsRNA包被种子。其它包层可包括其它杀虫剂，包括杀虫蛋白或如本领域中已知的化学品。
在其它实施方案中，提供了由根据上文描述的实施方案的植物生成的商品。
E.杀虫组合物
本发明还涉及利用源自根据本发明的植物，优选为同质性的植物的材料，用于在叶绿体或相关质体中产生杀虫dsRNA。这些材料可以以本发明植物的质体或叶绿体中产生的杀虫dsRNA的特定纯度等级的形式提供。
在一些实施方案中，材料可以是已经经过简单物理处理(例如切碎，切割，研磨)而不是化学处理的经加工的植物材料。
在其它实施方案中，材料可以已经经过化学处理，例如以提取和/或分离和/或保存材料的一种或多种组分。
此外，材料可以以活细胞培养物的形式提供。
在某些实施方案中，这些材料可以在一种或多种应用中用作杀虫组合物，包括作为用于包被种子的种子包层材料，包括尚未用杀虫dsRNA转化的种子。
在另一个实施方案中，所述材料可以用作杀虫诱饵。诱饵可以吸引有害生物进入特定位置或防止有害生物进入特定位置。
杀虫组合物可以采用用于喷雾种子，植物或作物的可喷雾液体或者固体诸如粉末，颗粒，团粒等的形式。
F.方法
在一个实施方案中，提供了控制昆虫有害生物的方法，包括向所述有害生物或所述有害生物的环境提呈或提供包含上文描述的质体或核酸构建体的植物。通常，植物的叶绿体或质体中含有的dsRNA在与有害生物或昆虫接触时，优选在与有害生物或昆虫的胃肠道接触时发挥功能，以抑制有害生物或昆虫中的生物学功能，或者引发有害生物或昆虫中的RNAi途径，导致对必需昆虫或害虫基因的功能的干扰。优选地，需要控制昆虫有害生物的环境是植物作物或田间。
通常，相对于不含具有本发明的核酸或质体的植物的环境中的有害生物群体，昆虫有害生物的控制导致有害生物群体减少。
在一个实施方案中，相对于未消耗具有本发明的核酸构建体或质体的植物的有害生物群体，对有害生物的控制导致抑制或最小化害虫有害生物的生长。在此实施方案中，有害生物可以是，也可以不是通过其食用具有本发明的核酸构建体或质体的植物而被杀使得。在此实施方案中，抑制或最小化昆虫有害生物的生长可以导致作物损伤最小化，并且可以导致产率改善。
在某些实施方案中，本发明的植物和质体以及含有它们的dsRNA的杀虫性达到了这样的程度，使得它们可诱导死亡和/或降低生长速率和/或降低繁殖力。
植物的茬(crop)或田地可以由包括如上文所述的质体或核酸构建体的植物组成，或者可以包括这些植物并且含有不含如上文描述的质体或核酸构建体的植物形式的非叶绿体转化体避难所植物。在茬或田地含有非叶绿体转化避难所植物的情况下，优选茬或田地含有小于30％，优选小于20％，优选小于10％，更优选小于5％的作为非叶绿体转化体避难所植物的植物。
优选地，对有害生物的控制导致对植物的叶，根，繁殖组织或叶的损伤最小化或减少。优选地，损伤的减少量是在非转化对照中观察到的损伤的至少50％，优选60％，70％，80％，90％，95％或大于95％。因此，本发明提供了用于改善植物茬或田的产率的方法，包括在茬或田中向有害生物或病原体提呈包含上文描述的质体或核酸构建体的植物，优选以降低植物或其部分被有害生物或病原体的损伤。
在另一个实施方案中，提供了改善茬产率的方法，包括：
提供植物或来自植物的繁殖材料，其包括根据本发明的核酸构建体或质体；
栽培植物以允许所述核酸构建体在栽培的植物中表达，其中核酸产物表达形成dsRNA，抑制植物中或植物上的有害生物存活力或生长。
在一个实施方案中，提供了控制昆虫有害生物或防止昆虫有害生物引起的侵染或损伤或杀死玉米中的昆虫有害生物的方法，包括向所述有害生物提呈包括上文描述的质体或核酸构建体的玉米植株。优选地，昆虫有害生物选自下表。
玉米：
Figure BDA0001149577020000401
Figure BDA0001149577020000411
Figure BDA0001149577020000421
在另一个实施方案中，提供了在高粱中控制昆虫有害生物，或防止由昆虫有害生物引起的侵染或损伤，或杀死昆虫有害生物的方法，包括向所述有害生物提呈包括上文描述的质体或核酸构建体的高粱植株。优选地，昆虫有害生物选自下表。
高粱：
Figure BDA0001149577020000422
在一个实施方案中，提供了在向日葵中控制昆虫有害生物，或防止由昆虫有害生物引起的侵染或损伤，或杀死昆虫有害生物的方法，包括向所述有害生物提呈包括上文描述的质体或核酸构建体的向日葵植株。优选地，昆虫有害生物选自下表。
向日葵：
Figure BDA0001149577020000431
在一个实施方案中，提供了在稻中控制昆虫有害生物，或防止由昆虫有害生物引起的侵染或损伤，或杀死昆虫有害生物的方法，包括向所述有害生物提呈包括上文描述的质体或核酸构建体的稻植株。优选地，昆虫有害生物选自下表。
稻：
Figure BDA0001149577020000432
在一个实施方案中，提供了在小麦中控制昆虫有害生物，或防止由昆虫有害生物引起的侵染或损伤，或杀死昆虫有害生物的方法，包括向所述有害生物提呈包括上文描述的质体或核酸构建体的小麦植株。优选地，昆虫有害生物选自下表。
小麦：
Figure BDA0001149577020000441
在一个实施方案中，提供了在棉中控制昆虫有害生物，或防止由昆虫有害生物引起的侵染或损伤，或杀死昆虫有害生物的方法，包括向所述有害生物提呈包括上文描述的质体或核酸构建体的棉植株。优选地，昆虫有害生物选自下表。
棉：
Figure BDA0001149577020000442
Figure BDA0001149577020000451
在一个实施方案中，提供了在大麦中控制昆虫有害生物，或防止由昆虫有害生物引起的侵染或损伤，或杀死昆虫有害生物的方法，包括向所述有害生物提呈包括上文描述的质体或核酸构建体的大麦植株。优选地，昆虫有害生物选自下表。
大麦：
Figure BDA0001149577020000452
Figure BDA0001149577020000461
在一个实施方案中，提供了在油菜(oil seed rape)中控制昆虫有害生物，或防止由昆虫有害生物引起的侵染或损伤，或杀死昆虫有害生物的方法，包括向所述有害生物提呈包括上文描述的质体或核酸构建体的含油种子植株。优选地，昆虫有害生物选自下表。
油菜
Figure BDA0001149577020000462
在一个实施方案中，提供了在大豆中控制昆虫有害生物，或防止由昆虫有害生物引起的侵染或损伤，或杀死昆虫有害生物的方法，包括向所述有害生物提呈包括上文描述的质体或核酸构建体的大豆植物。优选地，昆虫有害生物选自下表。
大豆：
Figure BDA0001149577020000463
Figure BDA0001149577020000471
Figure BDA0001149577020000481
包含如本文中描述的质体或核酸构建体的植物可用于昆虫抗性管理 (IRM)策略。
IRM策略通常涉及在特定结构中种植转化和非转化(所谓的“避难所”植物)。在这些结构中，避难所植物源源不断地提供没有受到杀虫压力，因此不太可能针对杀虫抗性等位基因被选择的昆虫。这些昆虫在田间与那些已经针对形成杀虫抗性等位基因的突变被选择的昆虫杂交更有可能产生杂合子基因型，从而降低形成抗杀虫性的可能性，或者抗性形成前的时间。IRM的示例性方法在www.epa.gov/oppbppd1/biopesticides/pips/bt_corn_refuge_2006. htm中示出。
可以如下增强IRM策略，即将构建体“堆叠”(stacking)到植物中以便靶向昆虫的多个途径，从而进一步降低杀虫抗性单倍型遗传的可能性。参见例如Roush等人，例如，概述了用于管理杀虫转基因作物的双毒素策略，也称为“聚合(pyramiding)”或“聚合”(TheRoyal Society.Phil.Trans.R.Soc.Lond. B.(1998)353,1777-1786)。具体地，通过堆叠或聚合两种或更多种相似(例如两种或更多种不同的dsRNA靶标)或不同的杀虫活性(例如Bt或质体RNAi)，它们各自对目标有害生物有效且较少或没有交叉抗性，可以使用较小的避难所。Roush提出，对于成功的堆叠，低于10％避难所的避难所大小即可以为单个(非聚合)性状提供相当于约50％避难所的抗性管理。对于当前可用的聚合型Bt玉米产品，美国环境保护局要求非Bt玉米种植的结构化避难所(通常 5％)显著低于要求单一性状产品种植的结构化避难所(通常为20％)。
提供避难所的IRM效应的方式有很多，包括田地中的各种几何种植图案 (如上文提及的)和袋中种子混合(in-bag seed mixture)等，如Roush等人(同上) 和美国专利号6,551,962进一步讨论的。
上述的百分比，或类似的避难所比率，可用于含有2、3或更多种杀虫活性的主题堆叠或聚合。对于具备针对单一目标有害生物的三个作用位点的三重堆叠而言，维持一定的易感个体的避难所，例如5％的避难所，可能是一个目标。对于商业面积，例如超过10英亩的商业面积，尤其如此。
剂量可影响抗性管理的效力和可靠性，确保随时间推移有致死剂量可用于有害生物。在本发明的一个实施方案中，当位于质体中时，可用的dsRNA 的表达更大，导致更高的可用于靶标有害生物的剂量。质体内的dsRNA在转基因植物的整个生长和发育过程中保持稳定，随时间维持剂量对靶标有害生物的可用度。
可以与其它用于控制有害生物的损伤的方法和组合物组合使用本文中公开的组合物和方法。例如，本文中描述的植物，质体和核酸构建体可以用于下述方法，所述方法包括另外使用一种或多种对鞘翅目，鳞翅目和/或半翅目有害生物有效的化学剂，作物轮作，或展现出与本发明的RNAi介导的方法和RNAi组合物的特征不同的特征(例如，在植物中重组生成对鞘翅目，鳞翅目和/或半翅目有害生物有害的蛋白质(例如，Bt毒素))的重组遗传技术。
如本文中使用，除非上下文另有要求，术语“包括”和该术语的变型不意图排除其它添加剂，组分，整体或步骤。
除非特别指出或暗示，术语“一个”，“一种”和“该/所述”表示“至少一个/种”，如本文中使用的。
应当理解，在本说明书中公开和定义的本发明延伸到从文本或图提及或明显的两个或更多个单独特征的所有替代组合。所有这些不同的组合构成本发明的各种替代方面。
实施例
实施例1：核酸构建体
叶绿体转化载体pR1的构建
叶绿体转化构建体是叶绿体转化载体pPRV23Clox(先前为pPRV312L； NCBI登录号DQ489715.1)(Chakrabarti et al.,2006和Lutz et al.,2007)的衍生物。此载体原本设计用于转化烟草，与烟草叶绿体基因组的trnI和trnA序列重组。它也已经用于成功地转化近缘的本氏烟草，因为烟草和本氏烟草重组区域 99.52％相似(2076bp中仅10处差异)(Davarpanah et al.,2009)。载体最初设计用于自上游核糖体RNA启动子(rrn16)通读表达(感兴趣的序列)，或用于在aadA 选择标志物上游插入完整表达盒。在本实施例中使用后一种背景。
首先如下修饰pPRV323Clox：使用“突变PCR”校正错误地存在于5’同源重组臂中并且接近3’同源重组臂的一个未定位的Kpn I限制性酶识别位点，该位点会将干扰后文描述的构想的装配计划。如序列改变为如下所示：...ATG(G>C)(TACCdel)GCT…以创建载体pPRV323Clox(k-fix)，其中载体的初始序列ATGGTACCGCT被修改为ATGCGCT。合成了人工dsDNA插入序列，其包括编码Asc I的序列、rrn启动子(Prrn)、本氏烟草叶绿体rubisco大亚基基因转录物的5’非翻译区(rbcL 5’UTR)、多克隆位点(MCS)、和rbcL 3’UTR 和Not I(Genscript)。插入序列在pUC57载体中生成，用Asc I和Not I切割并亚克隆到已经用Asc I和Not I消化的pPRV323Clox(k-fix)中，以创建新载体pR1。
构建“Golden Gate”dsRNA装配载体，p32c-GG
首先在二级“装配”载体中装配大的dsRNA表达单元，之后将其作为完整的单位转移到pR1中。dsRNA表达单位的制备方法是在前人调适用于反向重复(又称为发夹)装配的“Golden Gate”(GG)法(Yan et al.,2012)的基础上进一步修改的版本。为了设置用于装配的此方法的组分，使用引物g187f和g188r (参见表3)从其初始载体pRNAi-GG(NCBI登录号JQ085427.1；可购自 Arabidopsis Biological Resource Center(ARBC)，#CD3-1786)扩增GG克隆盒。将PCR产物用Xho I和Kpn I限制酶消化，并插入已经相似消化的二元载体 p32c中。p32c是内部制备pORE-03二元载体衍生物，预先已被修饰从而包括 CaMV 35s启动子(-343至+1形式)和改变的多克隆位点(MCS)。p32c还通过突变PCR预修饰而除去了BsaI RE识别位点GGTCTCN|NNNN(最初存在于膦丝菌素乙酰转移酶II，PPT，选择标志物基因中)，序列改变方式如下：…GAGAG(G>A)AG(A>G)CC…，因为此BsaI位点会干扰随后的GG发夹装配。换言之，将载体中的序列GAGAGGAGACC修饰为GAGAGAAGGCC。这些变化导致沉默突变，使得核苷酸序列被改变，但是翻译的PPT序列保持不变。所得的GG载体p32c-GG在大肠杆菌DB3.1细胞中维持，这是因为GG 表达载体编码cddB基因，在其它大肠杆菌实验室菌株(例如DH5α)中该基因会导致细菌细胞死亡。
使用Golden Gate法的p32c-GG载体中的大dsRNA表达单元装配
在p32c-GG装配载体中制备大dsRNA表达单元，其典型地编码具有长度达多个百碱基对的茎的发夹，制备遵循如最初由Yan等人就类似的载体 pRNAi-GG描述的方法(Yan etal.,2012)进行，但有如下不同之处。连接反应在补充了PEG的连接缓冲液(例如2x快速连接缓冲液)中进行2小时，相应地增加总连接反应体积，省略最终的80℃温育(其与含PEG的连接缓冲液不相容)，并且使用GT116细胞(Invivogen)代替DH5α(DH5α细胞可以工作，但与GT116 细胞相比回收到的菌落较少)。我们发现基于PEG的缓冲液是一处重要的修改，因为在没有它的情况下回收到的菌落很少或没有回收到菌落。简言之，装配过程包括以下步骤。使用KOD聚合酶(Toyobo)根据制造商的方案进行的PCR 扩增靶标茎，使用的引物设计为具有以下布置：
正向引物布置＝ACCA_GGTCTCA(GGAG)_bind，其中：序列“ACCA”是5’末端限制性酶结合位点。(这是添加到末端5’端的额外的4个碱基，以当试图在相邻的下游位置处切割时，为限制酶提供一些额外的“着手点”以便“抓住”序列)；“_”只是除法符号，用于在写出该简写序列时分隔其中的不同功能单元，并且在实际序列中没有物理表示；“GGTCTCA(GGAG)”是Bsa I限制酶(RE)位点。与大多数RE位点不同，它将识别GGTCTCA，但是在该序列之外3’邻近处的4个核苷酸(NNNN)中切割。这4个核苷酸可以是任何序列，在此实施例中使用序列“(GGAG)”，并与前面的Bsa I识别序列一起称为“蓝色”型Bsa I序列(例如GGTCTCAGGAG)；“bind”是通用的占位符，表示任何为了“结合”后续PCR中扩增的特定靶序列而需要添加到每个引物的3’端的特定序列，即，此序列依每种靶标而改变(参见例如表3中的SEQ ID No:3)。
反向引物布置＝ACCA_GGTCTCA(TCGT)_bind(参见例如表3中的SEQ ID No:4)。
在PCR后，将反应体系进行柱纯化(Qiagen)，并在30μl洗脱缓冲液中洗脱。然后，如下设置GG反应体系：50ng经纯化的PCR反应体系，200ng载体，5U Bsa I，10U T4连接酶，2xRAPID LIG缓冲液(New England Biolabs)、和H2O 至20μl。将GG反应体系在37℃温育2小时+在50℃5分钟。将3μl反应体系电穿孔到约50μl根据标准规程制备的GT116电感受态细胞混合物中。将整个转化混合物涂布在合适的选择培养基上，所述选择培养基包括卡那霉素(以选择载体)和氯霉素(以选择内含子纳入)。典型地回收约50-100个菌落。
核dsRNA表达对照载体v153的构建
制备图1中显示的核dsRNA表达对照载体v153(源自p32c二元载体)作为相应的叶绿体转化载体v206的装配过程中的中间载体。这两种载体均编码 dsRNA表达单元Ha-AceHp1236-189，其被设计成具有自身互补的189nt有义 (SE)/反义(AS)茎构型，其中茎与茎之间由一段约1599nt的基于核/胞内含子质的间隔或“环”所分隔。上述的189nt茎序列被选择为与来自一种鳞翅目的蛾类——棉铃虫(Ha)的乙酰胆碱酯酶基因(Ace；NCBI登录号AF369793)同源，从nt位置1236(相对于CDS的第一个nt)开始，在5’方向上延伸189nt的总长度。装配中的第一步是使用如前述的方法构建载体p32c-GG中的hp1236-189的 dsRNA表达单元。对于实施例1中的特定装配体，通过使用棉铃虫cDNA和引物g216f/r和g217f/r的PCR扩增对应于Ace1236-189的序列。将所得的载体 p32c-Ha-AceHp1236-189重命名为v153，用作核dsRNA表达对照载体。使用本领域技术人员通常已知的标准土壤杆菌转化方法和选择方法将其转化到本氏烟草中。图1.A中描述了v153，显示在总体线性化的背景中(预期其在整合到本氏烟草的核基因组中之后将会形成这样的背景)。显示了来自此载体的预期dsRNA产生和RNAi型加工的简化示意图，且图示了后续在植物中确定此载体构建体的整合或表达的PCR测定所用的引物。
dsRNA叶绿体转化和表达载体v206的构建
使用上文列出的其他载体和方法从v153制备图1中所示的叶绿体转化载体v206。如下所述从v153装配v206，也称为pR1-Ha-AceHp1236-189：使用v153 作为供体将dsRNA表达单元转移入pR1中。该转移是通过用Xho I和Kpn I切除 dsRNA表达单元，并将其亚克隆到已经用Sal I(与Xho I的相容粘性末端)和 Kpn I消化的pR1中。将得到的载体v206描绘在图1CB中，其背景是该载体精确整合到本氏烟草的叶绿体基因组中之后的叶绿体基因组周围序列。显示了来自该载体的预期dsRNA产生和RNAi加工的简化示意图，以及用于使用该载体的随后PCR测定的引物的图示。
dsRNA叶绿体转化和表达载体v301的构建
使用上文列出的其他载体和方法从v206制备图1中所示的叶绿体转化载体v301。v301是从v206通过用795bp叶绿体内含子序列(atpF内含子)和小侧翼区替换PDK内含子+CMr区而装配而来。替换序列是使用引物BEN0002F和 BEN0003R从本氏烟草中扩增的。得到的载体v301描绘在图1.D中，其背景是该载体精确整合到本氏烟草的叶绿体基因组中之后的周围叶绿体基因组序列。显示了来自此载体的预期dsRNA生成和RNAi加工的简化示意图，以及用于用此载体的随后PCR测定法的引物的图示。
实施例2：宿主细胞和叶绿体的转化
本氏烟草组织培养方法
如下将本氏烟草植物导入组织培养物中：首先用氯气对小体积的种子 (相当于约50μl体积)灭菌。将打开的种子管在密封的玻璃室中新鲜气体处理约1-4小时，该室中放有一块打开的装有100ml次氯酸盐(4％可用)的平皿，其中加入有1N HCl。将种子散布在具有3％(w/v)蔗糖和5％(w/v)诺布尔琼脂 (noble agar)的Murashige-Skoog培养基(MSN)(Murashige等，1962)上。植株维持在15x 6cm盆中，并每2-3周或根据需要转移到新培养基上。
金微载体制备(用于轰击)
根据用于生物射弹PDS-1000/He颗粒递送系统的制造商规程制备0.6微米金微载体(Biorad)，该规程遵循Sanford等人(Sanford et al.,1993)的方法。简言之，称取30mg微载体到1.5ml微量离心管中，加入1ml 70％乙醇，并将混合物涡旋振荡3-5分钟。让金沉降15分钟，然后离心5秒(高达约20,000rcf)。弃去上清液。向金中添加1ml无菌水，涡旋振荡1分钟并允许沉降1分钟。通过旋转5秒使金沉淀，并除去上清液。重复水清洗步骤两次，总共3次。向最终离心沉淀中加入500μl无菌的50％甘油(制备物在4℃下贮存，并且可以使用长达约2周)。此体积可制成10个标准制备物。
金微载体的DNA包被
在轰击当天，用DNA包被金微载体。将以上制备的微载体涡旋振荡>＝5 分钟以重悬金。对于每种构建体，将50μl(约3mg)金悬浮液移至一根新管中，同时涡旋振荡以避免沉降。每等份的金添加5μlDNA(理想地为1ug/μl)，50μl 2.5M CaCl2和20μl 0.1M亚精胺(spermadine)。如果DNA浓度不够高，则加入足够体积的DNA(>5ul)直到5ug，并且相应地放大剩余组分的体积。将每个样品涡旋振荡3分钟，允许沉降10分钟(长于制造商规定的1分钟)，并离心5 秒。除去上清液，向离心沉淀加入140μl 70％乙醇，并且将混合物涡旋振荡，直到重悬浮(约1分钟)。让微载体沉降1分钟，再离心5秒，并且弃去上清液。重复该步骤，但使用140μl的100％乙醇。将微载体的最终离心沉淀重悬于48μl 的100％乙醇中，并在冰上贮存，直至轰击(在同一天)。此体积产生>6次“射击”，用于转化叶绿体。
使用粒子轰击法转化叶绿体
将生物射弹PDS-1000/He仪(Biorad)移入层流室中，用70％乙醇严格表面灭菌，并且根据制造商的方案准备好。根据推荐，氦气为“高等级”(4.5；> 99.995％纯度)，因为更低的等级可能堵塞仪器和或污染样品。将终止屏、大载体支持物和大载体盘短暂浸入100％乙醇中，之后在无菌滤纸衬里皿上风干将它们灭菌。将1100psi破裂盘浸入70％异丙醇中，并且在仍然湿润(但不过度湿润)时，上样到射击喷嘴中(为了合适的密封，少许异丙醇是必需的)。每次运行的第一次“射击”仅用破裂盘(即，没有样品)，以便清除管线中的空气并且给管线充满He。将每个金微载体制备物超声处理>1分钟，并将6ul/ 射击均匀地散布在大载体的中心上，首先放置在大载体支持物中并且让其风干(约1-5分钟)。在约25-28inHg的真空中在6cm(距喷嘴)轰击。在MSN平板上轰击叶时，叶的远轴侧(底侧)向上。叶提前最长24小时准备，将来自组织培养植物的单片2-3cm2的叶(或数片更小的叶)放置在标准100x 20mm培养皿的中心。
外植体、愈伤组织和小植株选择(异质性)
轰击后，立即用微孔胶带(3M)缠绕板2层加以密封，并且在黑暗中保持约48-72小时。此后，将每片叶切成约0.5-1cm2的小区段，并近轴侧向上(上侧向上)无菌转移至含有500mg/L壮观霉素，2mg/L BAP和0.5mg/L NAA的 MSN选择培养基(以诱导愈伤组织和芽形成)。每2-3周将组织移至新鲜培养基上。未转化的组织在约2-4周后变成浅黄色，并且从约4-8周后开始出现愈伤组织。当愈伤组织达约0.5-1cm3时，将愈伤组织与外植体材料分离，并移至单独的培养基上。将萌发的芽尽可能早地从愈伤组织分离出来，并维持在相同的培养基上。当芽已经发出1-2片约0.5-1cm2的叶时，将芽移至含有500mg /L壮观霉素(但没有激素)的MSN培养基以诱导生根。在合适的根形成后，将小植株移到土壤。
经转化的细胞可以是异质性的(其中每个细胞的叶绿体总数中只有一部分被转化)，或同质性的(其中每个细胞中的大多数或全部叶绿体被转化)。认为从经轰击的叶经单轮选择(例如，愈伤组织形成，芽形成和分离，和诱导生根)之后再生的烟草枝条总是嵌合的(异质性的)(Maliga et al.,2012和Maliga et al.,2004)。通常认为通过重复将新形成的芽分成小块，并再次诱导愈伤组织形成，连续进行2轮或更多轮选择后，可实现同质性(homoplasmy)或至少遗传上稳定的植物。可以通过跨越插入接合部的合适PCR反应来测定“质性”水平。
从愈伤组织或小植株提取DNA
通过取出约2-3mm3的小部分对单个愈伤组织取样，以进行DNA提取。将要用于DNA提取的萌发的小植株培养到具有至少2片各约0.5-1cm2的叶的阶段，之后收获一片叶以进行提取。DNA提取用基本的“盐析”方法进行。将每个组织样品置于具有一个无菌不锈钢小球和约180-200μl DNA提取缓冲液(0.5M NaCl和1％SDS)的200μl PCR条管中。将管在混磨机(mixer-mill)中以约30转/秒剧烈震摇约2分钟。通过颠倒和翻转使样品板重新定向，并再次震摇该板。使用平板离心机以3800rpm离心该管1小时。将100μl上清液转移到具有200μl100％乙醇的新平板中。如前所述再次离心样品板。稳稳地颠倒样品板以弃去上清液。以约300rpm将样品板顶面朝下离心约20秒。向每个孔添加200μl 70％乙醇(快速清洗)，并通过稳稳地倒置样品板再次弃去上清液。以约300rpm顶面朝下将样品板再次离心约20秒。将样品板在室温下风干约20 分钟，并将离心沉淀重悬于100μl T.E.缓冲液中并在4℃贮存。
叶绿体系的生成
使用v206叶绿体转化产生了9个本氏烟草植物株系(样品#1至9)。每个选定的品系来自独立的转化事件。每个株系对壮观霉素有抗性，并且通过PCR 证实了v206对叶绿体基因组中的掺入。将未转化的本氏烟草作为阴性，或未转化的对照维持(样品#24)，并如先前指示创建v153的核转化品系，并且为阳性核转化对照加以维持(样品#17)。
实施例3.使用RT-PCR确认转基因表达
RNA提取和DNA酶处理
使用Trizol(Life Technologies)根据制造商的方案提取总RNA。如先前描述的DNA提取相似地收获用于RNA提取的组织。将组织速冻并用研钵和研杵在液氮中研磨。将约1.5ml Trizol添加到约0.5-1ml体积当量的精细粉末化组织。对标准方法中的所有其它体积进行相应地缩放(相对于所使用的1.5ml Trizol)。包括了任选的分离步骤，其中将初始匀浆(刚刚均化后的)在约4℃以12,000x g离心10分钟。弃去离心沉淀，并且根据规程进一步处理经清洁的匀浆。将每个样品重悬于约30-50μl的无RNA酶的水(例如经DEPC处理的)中。提取后，根据制造商规程(New England Biolabs)对RNA样品进行DNA酶处理，以降低在随后的逆转录测试中假阳性扩增的可能性。简言之，将8μl RNA样品与1μl DNA酶缓冲液和1μl RQ1 DNA酶(NEB)组合。在37℃将反应体系温育约30分钟，在此时添加1μl终止溶液，并将混合物在65℃进一步温育约10分钟，以使DNA酶完全失活。
RT-PCR
对每份样品进行逆转录PCR(RT-PCR)以测试长dsRNA种类的存在。使用的RT-PCR是2步RT-PCR，其中首先进行合成单一cDNA的步骤，接着对不同的RNA种类分别进行PCR反应。根据制造商的规程，用Superscript III第一链合成试剂盒(Invitrogen)进行每个cDNA合成反应。具体的使用者添加组分 (user included components)是5μl混合引物(g280r、g276r、g216f/r、g301r和寡聚物dT各1μl)，1μl dNTP和7μl经DNA酶处理的RNA样品到总使用者输入体积13μl。在cDNA合成后，将1μl的每种样品用作标准20μl PCR反应体系中的模板。对样品v206叶绿体样品#1-9，v153核对照#17和未转化的本氏烟草对照#24进行PCR。每个样品用3种不同的引物组进行扩增，使用2种不同的模板条件：1)cDNA合成前的提取RNA作为模板(以测试样品中DNA污染的可能性)，和2)相应的cDNA样品组。第一PCR引物组设计为跨越内含子和后茎接合部进行扩增，以测试在AS茎处含有两个内含子环的大RNA种类的存在(引物g25f和g216f/r)。第二组位于dsRNA茎区域内部，但结合在茎的末端，以测试不依赖于环序列的全长SE或AS茎的存在(引物g216f/r和g217f/r)。第三组是对照反应，以测试eIF4E的遍在的持家序列的存在(引物g165f和g166r)。如图2中显示，所有9个叶绿体cDNA样品对于内含子至后茎PCR(intron to rear stem PCR)均为阳性，证明了至少含有这两个区段的RNA种类的表达(图2A和B)。由于内含子和AS茎段在SE茎的下游，此结果指示形成全长dsRNA的区域的存在。含有来自用v153核表达对照载体转化的本氏烟草的cDNA的 PCR反应没有扩增子。这种现象在内含子在植物中转录期间或之后立即从 RNA中被高效地剪接掉的情况下预期就会出现。包含来自对照——未转化的本氏烟草的cDNA的PCR反应没有扩增子。这也是预料之中的，因为本氏烟草不表达Ha-AceHp1236-189dsRNA序列。“无RT”PCR反应(即在cDNA合成之前仅使用RNA作为模板的反应)没有显示扩增子，这确认了没有影响cDNA 样品组中所见的特定产物的形成的可检测的DNA污染水平。
所有9份叶绿体cDNA样品对于茎区域特异的dsRNA/hpPCR也呈阳性 (图2C和D)，进一步证实对于每个样品，至少SE和或AS茎完整存在。叶绿体转化样品v206#8在无RT对照反应中展现出少量产物，尽管这比在相应的 cDNA反应中观察到的低得多。含有来自v153核表达对照的cDNA的PCR反应没有扩增子，这种现象在下述情况下预期会出现：在植物中核表达的dsRNA 区/发夹在转录后立即高效地被加工变小为约19-24bp的siRNA尺寸的种类，并且与此同时，表达的长dsRNA的量被减少到低于可检测的水平。如预期的那样，含有来自本氏烟草未转化对照的cDNA的PCR反应没有扩增子。
叶绿体cDNA样品和2个对照cDNA样品对于eIF4E持家序列都呈阳性(图2E和F)。此结果确认所有cDNA样品都是适合用于PCR的模板，并且因此支持了如下解释：v153样品没有可检测的长dsRNA，因为其最有可能通过RNAi 途径被高效地加工变小。“无RT”对照反应在任何样品中均无可检测的产物，进一步显示样品没有显著的DNA污染。
实施例4：使用Northern印迹法定量叶绿体转化体和对照中的dsRNA
将叶绿体转化样品进一步进行高分子量(MW)或“大RNA”Northern印迹分析，以检测和定量叶绿体转化样品中存在的大dsRNA相对于相应的核表达的对照样品(和未转化的对照)的相对量。根据先前描述的方法对样品#1-9、 17和24中的分别重新制备RNA提取物，只是将每个样品重悬于甲酰胺而不是无RNA酶的水中(在该实施例组中省略了样品#6，因为剩余的材料不够进行额外的RNA提取)。每条泳道上样约10μl的每种样品+6μl甲酰胺RNA上样染料 (除了样品7外，其中仅4μl的样品可用)到1.4％TBE琼脂糖凝胶上，在100V下运行，直到2条下部的染料前沿适当分离。用溴化乙啶(EtBr)染色凝胶并可视化，以测量相对上样量(图3.A)。将凝胶过夜毛细管转移到Hybond N +(Amersham)上，并且将样品与膜UV交联。在65℃将膜与PerfectHyb预杂交和杂交。探针是是来自反向插入HaAce1236pGEM载体(v158)的部分长度SE 链UTPp32核糖探针SP6脱落片段；换言之，探针用于检测靶序列的反义，或 dsRNA的AS茎。探针长度为538nt，其中与HaAce有约357nt的同源，跨越了整合入叶绿体和核转化植物的整个189nt的靶标。将膜曝光1小时。
从图3.B中可以看出，许多叶绿体转化的样品拥有大量的特定高分子量 RNA，这些RNA的大小对应于HaAce1236-189dsRNA序列(若它们保持不被 RNAi型机制加工)的预期大小。相应的核表达对照，样品#17，没有显示未加工的长dsRNA的证据，其中背景信号水平与未转化的对照相似。使用 ImageJ定量了RNA量，并相对于上样量标准化(利用EtBr图像)。相对表达水平作为相对于本氏烟草未转化对照的条带强度(设置为1)的标准化倍数变化来计算。如图3.C中所示，所有v206叶绿体样品都具有可检测量的特定dsRNA。在株系之间有一些变异，鉴于每个株系的独立性质，这不是出乎意料的。此实施例中的许多独立株系，特别是1、2、4、5、8和9，展现出相当高水平的 dsRNA生成和积累。当标准化时明显可见，v153核表达对照样品未保留可检测的dsRNA量，该结果与先前的RT-PCR数据一致。
实施例5：使用Northern印迹法定量叶绿体转化体和对照中的siRNA
对叶绿体转化样品进一步进行低分子量(MW)或“小RNA”Northern分析，以检测和定量siRNA尺寸的加工产物(如果样品中的dsRNA暴露于RNAi型加工机制，则预期会存在)的相对量。使用与实施例4中使用的相同的RNA提取 (在此实施例中省略了样品#6和7，因为剩余的材料不够)。每条泳道将约25μl 每份样品+25μl的甲酰胺RNA上样染料上样到17％PAGE凝胶上。这样，上样量的估计范围为约18-42μg。在上样前，PAGE凝胶在150V/40分钟预运行。一旦上样，凝胶在150V/约30分钟+200V/约4-5小时运行(直到染料前沿迁移适当的距离)。用溴化乙啶(EtBr)染色凝胶并可视化，以测量相对上样量(图4.A)。将凝胶以45V/60分钟电转移到Hybond N+(Amersham)上，并将样品与膜进行UV交联。在42℃将膜与PerfectHyb预杂交和杂交。与先前描述一样制备探针，但进一步通过标准方法将其“碳酸化”以将其分级成约50nt片段。将膜曝光1小时和60小时，检测限在这两个时间点(本文中显示的1小时时间点)之间没有差异。
图4.B显示叶绿体转化的样品均未显示对探针特异的小RNA种类的任何迹象。然而，v153核表达对照样品(#17)显示出对应于约19-24nt的预期尺寸范围的强而清晰的产物。未转化的本氏烟草对照没有显示在小RNA尺寸范围中的特异性结合，正如预期。使用ImageJ定量RNA量，图4.C，并相对于上样量进行标准化(利用EtBr图像)。相对表达水平作为相对于本氏烟草未转化对照的条带强度(设置为1)的标准化倍数变化计算。定量进一步验证了对 Northern图像的解读：没有证据表明叶绿体样品有小RNA种类生成，而v153 核表达对照样品具有高水平的小RNA。
实施例6：作物物种的叶绿体转化
一般如本文中和美国专利申请号20080289063A1中描述的那样转化玉米。一般如本文中和Verma and Danielle(2007)Plant Physiol.145(4):1129-1143中描述的那样进行烟草，胡萝卜，棉，大豆和可食用叶性作物(例如莴苣)转化。可以遵循如Maliga(2014)Chloroplast Biotechnology,Humana Press中找到的方案转化小麦，高粱，向日葵，芸苔，甜菜和大麦。植物转化领域的技术人员可以基于作物物种对方案做出修改。
实施例7a：杀虫活性
通过用新生棉铃虫幼虫在转基因和野生型本氏烟草的幼苗上进行的生物测定法，测试具有表达dsRNA的叶绿体的转质(transplastomic)植物的杀虫活性。依靠人工食饵从卵(从由商业昆虫饲养所维持的集落获得；AgBiTech， Toowoomba，QLD)孵出棉铃虫幼虫，并在破壳的几小时内，用湿润的骆驼毛刷挑取幼虫个体，并放置到塑料培养皿中的清洗过的6天龄幼苗上(20条/ 培养皿)。然后，用允许气体交换的盖子封闭盛放有带幼虫的幼苗的培养皿。将培养皿在受控环境条件(28℃，约60％相对湿度，16:8[光照:黑暗])下保持4 天，而后记录存活的幼虫的重量(图5A)。在4天喂养期期间，每天向培养皿添加适当基因型的新鲜幼苗。此数据显示，在用v206(在叶绿体中表达hpRNA) 转化的所有四个独立株系中，幼虫的生长速率相比于以野生型本氏烟草幼苗为食的幼虫显著降低(p<0.005n＝7–13)。以用v153(在核/细胞质中表达 hpRNA)转化的两个株系为食的幼虫的生长速率与那些以野生型为食的幼虫没有显著差异(p>0.9；n＝4-7)。
实施例7b：杀虫活性
可以通过如本领域技术人员已知的各种生物测定法，包括但不限于下文描述的生物测定法测量杀虫活性。鳞翅目昆虫有害生物包括但不限于铃夜蛾属物种(Helicoverpasp.)，Agromyza parvicornis，小地老虎，杆草螟属物种 (Diatraea sp.)，小玉米螟，欧洲玉米螟，斜纹夜蛾属物种(Spodoptera sp.)， Papaipema nebris，实夜蛾属物种(Heliothis sp.)，棉红铃虫，小菜蛾，蓓带夜蛾，大豆尺夜蛾，苜蓿绿夜蛾，大豆夜蛾，纹黄豆粉蝶，小蜡螟，西部黑头长翅卷蛾，黑头长翅卷蛾，棉褐带卷蛾，木棉虫，秋星尺蠖，柑橘卷叶蛾，地中海粉斑螟，桃条麦蛾，Anisota senatoria，柞蚕，黄卷蛾属物种(Archips sp.)，带卷蛾属物种(Argyrotaenia sp.)，Athetis mindara，家蚕(Bombyx mori)，棉潜蛾(Bucculatrix thurberiella)，干果斑螟(Cadra cautella)，色卷蛾属(Choristoneurasp.)，Cochylls hospes，米蛾(Corcyra cephalonica)，Cydia latiferreanus，苹果蠹蛾(Cydia pomonella)，Datana integerrima，落叶松毛虫(Dendrolimus sibericus)，Desmiafeneralis，甜瓜绢野螟(Diaphania hyalinata)，黄瓜绢野螟 (Diaphania nitidalis)，白尺蠖蛾(Ennomos subsignaria)，Eoreuma loftini，烟草粉螟(Esphestia elutella)，Erannis tilaria，盐泽枝灯蛾(Estigmene acrea)，Eulia salubricola，Eupocoelliaambiguella，Eupoecilia ambiguella，黄毒蛾(Euproctis chrysorrhoea)，暗缘地老虎(Euxoa messoria)，蜡螟(Galleria mellonella)，梨小食心虫(Grapholita molesta)，黑拟蛉蛾(Harrisina Americana)，行列大蚕蛾，向日葵同斑螟，美国白蛾，Keiferialycopersicella，Lambdina fiscellaria fiscellaria， Lambdina fiscellarialugubrosa，雪毒蛾(Leucoma salicis)，葡萄浆果小卷蛾 (Lobesia botrana)，草地螟(Loxostege sticticalis)，舞毒蛾(Lymantria dispar)， Macalla thyrisalis，天幕毛虫属物种(Malacosoma sp.)，甘蓝灯蛾(Mamestra brassicae)，Manduca quinquemaculata，烟草天蛾(Manduca sexta)，豆野螟 (Maruca testulalis)，Melanchra picta，秋尺蛾(Operophtera brumata)，古毒蛾属物种(Orgyia sp.)，Paleacrita vernata，Papiliocresphontes，Phryganidia californica， Phyllonorycter blancardella，暗脉菜粉蝶(Pieris napi)，油菜菜粉蝶(Pieris rapae)， Platynota flouendana，Platynotastultana，Platyptilia carduidactyla，印度谷螟 (Plodia interpunctella)，Pontiaprotodice，一点粘虫(Pseudaletia unipuncta)， Sabulodes aegrotata，Schizuraconcinna，麦蛾(Sitotroga cerealella)，苹白小卷蛾(Spilonta ocellana)，Thaurnstopoea pityocampa，Ensola bisselliella， Trichoplusia hi，Udea rubigalis，Xylomyges curiails和苹果巢蛾(Yponomeuta padella)。
在用依靠人工昆虫食饵的新生鳞翅目幼虫进行的生物测定法中测试具有表达dsRNA的叶绿体的转质植物的杀虫活性。从由商业昆虫饲养所 (Benzon Research Inc.,Carlisle,PA)维持的集落获得的卵孵出鳞翅目幼虫。
这些生物测定法在特别为昆虫生物测定法设计的128孔塑料盘(C-DInternational,Pitman,NJ)中进行。每个孔含有多物种鳞翅目饮食(Southland Products,Lake Village,AR)。将来自转质事件的浸软的植物材料掺入饮食中。
在破壳几个小时内，用湿润的骆驼毛刷挑取幼虫个体并且放置经处理的食饵上，每孔1个幼虫。然后，用透明塑料的粘合片密封带虫的孔，通气以允许气体交换(C-DInternational,Pitman,NJ)。将生物测定盘在受控的环境条件(28℃，约60％相对湿度，16:8[光照:黑暗])下保持5天，之后记录暴露于每个样品的昆虫总数，死亡昆虫的数目、和存活昆虫的重量。计算每个处理的百分比死亡率和百分比生长抑制。如下计算生长抑制(GI)：
GI＝[1–(TWIT/TNIT)/(TWIBC/TNIBC)]
其中TWIT是处理中的昆虫的总重量，
TNIT是处理中的昆虫的总数，
TWIBC是背景检查(缓冲液对照)中的昆虫的总重量，并且
TNIBC是背景检查(缓冲液对照)中的昆虫的总数量。
GI50(生长抑制)定义为测试昆虫的平均生长(例如，活重量)为在背景检查样品中所见的平均值之50％时的剂量。使用JMPTM软件(SAS,Cary,NC)进行统计学分析。LC50(致死浓度)定义为50％的测试昆虫被杀死时的剂量。
对于一些物种，生物测定法在32孔测试托盘中进行。对每孔施加约5mL 的2％水-琼脂溶液，然后允许琼脂完全凝固。
植物是约3周龄的，并且在T1代时测试。完成T1叶材料的三个重复。切下一片叶片(2.54cm X 1.27cm矩形)，并放置在托盘的单个孔中。每孔侵染 10只昆虫幼虫。
用透明塑料的粘合片密封带虫的孔，通气以允许气体交换(C-D International,Pitman,NJ)。将盘放置在Conviron培养箱中，并在28℃(16:8h 光照:黑暗，60％RH)维持3天，之后记录对每个叶块的损伤的总量(0、5、10、 15、25、50％，75％损伤等，直至100％)。
实施例8：转基因植物的生物测定法。
通过本领域技术人员已知的方法演示转质植物细胞中产生的dsRNA的生物活性(参见例如Huang et al.,2006Econ.Entomol.99:194-202)。可以通过在受控喂养环境中将源自生成dsRNA的植物的各种植物组织或组织碎片喂给靶标昆虫来演示效力。或者，可以从源自生成dsRNA的植物的各种植物组织制备dsRNA提取物，再掺入如本文中先前描述的人工食饵生物测定法中。应当理解，此类喂养测定法的结果要与采用不生成dsRNA的宿主植物的合适的对照组织或其它对照样品类似地进行的生物测定进行比较。
对构建体在植物中产生的不同事件，测试其防止由鳞翅目昆虫的摄食活动导致的叶损伤的生物活性。
从V5(在玉米的情况下)T0转基因植物的V3或V4叶中一式两份采集1.0 X 0.5平方英寸的叶切片。对于每个测试，首先取样野生型植物叶组织以防止叶边缘上的交叉污染，接着取样转化植物。在每个生物测定托盘孔(32孔托盘带盖，CD International，Pitman，NJ)中，将1片叶切片置于2％水-琼脂(Fisher Scientific,Fair Lawn,NJ)上，并且每个昆虫物种、每个事件和每个构建体重复2次。每孔侵染10条鳞翅目新生虫。并用塑料带孔盖密封以允许空气交换。将托盘置于28℃(16:8hr光照:黑暗，40％RH)，并且在3天后，对它们的百分比叶损伤分级。当使用
Figure BDA0001149577020000622
Pro 9.0.1(2010SAS Institute Inc.,Cary,NC)的方差均匀时，用ANOVA分析百分比叶损伤数据，并且用Tukey-Kramer检验分析均值分离。
表3：此工作中使用的载体构建体
Figure BDA0001149577020000621
Figure BDA0001149577020000631
表4：此工作中使用的寡核苷酸序列
Figure BDA0001149577020000632
Figure BDA0001149577020000641
序列表
<110> 悉尼大学
<120> 高等植物中的RNA生成
<130> 50089244TPG
<150> US 61/951,569
<151> 2014-03-12
<160> 18
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸g187f
<400> 1
cgctcgagcg gagtgagacc aattctcg 28
<210> 2
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸g188r
<400> 2
cgggtacccg gagtgagacc ctgtgtat 28
<210> 3
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸g216f/r
<400> 3
accaggtctc aggagcatgg agttggatga cagga 35
<210> 4
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸g217f/r
<400> 4
accaggtctc ctcgagctga cgggaatccc aatatg 36
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸g25f
<400> 5
tgatagatca tgtcattgtg 20
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸g165f
<400> 6
tgaagtagag aaaccggcgt 20
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸g166r
<400> 7
ccaagcagcc tgtttcgatt 20
<210> 8
<211> 87
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸g280r
<400> 8
aacgacccaa ttgcaagagc ggagctctac caactgagct atatcccccc gagccaagtg 60
gagcgcattt aaatagtgta ccataac 87
<210> 9
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸g276r
<400> 9
cgaaggataa ttacttgagt tc 22
<210> 10
<211> 72
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸g301r
<400> 10
tactcctact cataatgttt tgttactact cataactgtt tcttactctt tgatattatt 60
tgttacttta gc 72
<210> 11
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸BEN0002F
<400> 11
gcatgcaaat ctaagtgtag tgct 24
<210> 12
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸BEN0003R
<400> 12
catatgtcga atagtattca agatcct 27
<210> 13
<211> 2580
<212> DNA
<213> Helicoverpa armigera
<400> 13
acgcggggag tctactctgt cacgtcgatg gagacgcatc gcggtcggcc tctctctcaa 60
tattattact ttattaccat acaaaacgtg agtgagtgtc tgtgaactta tttcaacttg 120
agtgacggtt gctccggacc atacagcgag ctgacagttc agccaaggtc atcgatcagc 180
aatttgacac cagttgtgtt tatatactat atgtacgacc acaacagaat accgtgtgcc 240
cctagaaatg tgttttaaca agtatctcat taagctggcg gattacttca gatcagtttc 300
tgatacgtct cgttaatgcc cgtgcgaaca acaacattcg aaatgatcag caacacgaag 360
atcgtgttca ccaagctcct gctgtgctgc ttcgtgtcag gcgccgtcgc gaggtcgtgg 420
gccaaccatc acgacaccac cacgtcaacc acgcagacca cccccaccac tagtcctgtg 480
cctaagaact tccataatga tccactcatc gtcgaaacta aaagtggcct cgtcaaaggc 540
tacgctaaga cagttatggg cagggaagta cacatcttca ccggtattcc gtttgcgaag 600
ccccctctag gaccgttaag attccgcaaa ccggtaccca tcgacccgtg gcatggagta 660
cttgaagcca ctgcgatgcc aaatagctgt tatcaagaac ggtatgagta cttccccggt 720
tttgagggag aggaaatgtg gaatccaaac acaaatatat cagaggactg tctctatcta 780
aacatttggg ttccccagca cttacgagtc cgtcatcatc aagataagcc tcttgcggag 840
aggcccaaag tgccgatact agtgtggatt tacggtggcg gctatatgag tggcacggca 900
acactcaacc tatataaagc agacataatg gcttcttcca gtgatgtaat agtagcatct 960
atgcaatata gggttggggc gttcggattt ttatacttga ataaatattt ctcgccgggc 1020
agtgaagagg cgccgggaaa tatgggctta tgggatcaac aactcgctat tcgttggatt 1080
aaagataatg ctcgtgcttt tggtggtgac ccagaattga taactttgtt tggagagtcg 1140
gcaggcgggg gaagcgtgag tttgcatatg ctttcaccag agatgaaggg attattcaaa 1200
cgaggcatct tgcaatctgg aacgttaaac gctccatgga gttggatgac aggagagaga 1260
gcacaagaca taggaaaagt gttagtagat gactgtaatt gcaatagcag cctactagct 1320
gccgatccga gcttagtgat ggactgtatg cgcggagtcg atgcaaaaac tatatcagta 1380
cagcagtgga attcctatac tggcatattg ggattcccgt cagctcccac ggttgacggc 1440
gtgtttttgc ccaaagaccc ggacacaatg atgaaagaag gcaatttcca taataccgag 1500
gtgcttcttg gaagtaatca agacgaagga acctatttct tactatacga tttccttgac 1560
tacttcgaga aagacgggcc cagcttcttg cagcgggaga aatttctaga aattgtcgac 1620
accatattca aggatttctc caaaataaag agggaagcta tcgtattcca atatacggac 1680
tgggaggaaa ttaccgatgg ctatctgaac cagaaaatga tagctgacgt ggtgggcgac 1740
tatttcttcg tgtgccctac taactacttc gcagaagtgc tggccgattc aggagttgat 1800
gtttactact attacttcac acatcgcacc agcacaagtc tctggggtga atggatgggc 1860
gtgatgcacg gcgatgagat ggagtacgtc ttcgggcacc cgctgaacat gtcccttcaa 1920
taccacacca gggagaggga ccttgctgca catatcatgc agtcttttac gagattcgct 1980
ttgactggca aacctcacaa gccggacgag aaatggccgc tgtactctcg cacgtcgccc 2040
cactactaca cttacaccgc ggacggggct agcgggccag ccggaccgcg cgggcctagg 2100
gcctccgctt gcgctttctg gaatgatttc cttaacaagc tgaatgagct ggagcacatg 2160
ccatgtgacg gggccgtgac cggcctttac agcagcgtcg ccggcaccac cctgccgata 2220
gtgctgctga ccacgctcgc caccaccgtc gcactctaag cgaccgacat tcactcgtag 2280
caaacagtag acaaattatt tatacaaact agaaaaatac cgatgcaaat aaatgttttc 2340
acttcatcta taaccataaa gtcaaaaatc ttatctgaaa tgaactttat gattgtcaat 2400
gaagatctag agtacgcaaa tcgtatttcg aattttaata tcggctacta aagtactaga 2460
agtaaattgt tgtattaatt aaatatattt tatcacaatc ttacatatca agcgtgtgga 2520
aagaaaacgg gacagtgaca aggaacgtta caaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 2580
<210> 14
<211> 189
<212> DNA
<213> Helicoverpa armigera
<400> 14
catggagttg gatgacagga gagagagcac aagacatagg aaaagtgtta gtagatgact 60
gtaattgcaa tagcagccta ctagctgccg atccgagctt agtgatggac tgtatgcgcg 120
gagtcgatgc aaaaactata tcagtacagc agtggaattc ctatactggc atattgggat 180
tcccgtcag 189
<210> 15
<211> 2011
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Inverted repeat nucleotide sequence derived from Helicoverpa
armigera
<400> 15
catggagttg gatgacagga gagagagcac aagacatagg aaaagtgtta gtagatgact 60
gtaattgcaa tagcagccta ctagctgccg atccgagctt agtgatggac tgtatgcgcg 120
gagtcgatgc aaaaactata tcagtacagc agtggaattc ctatactggc atattgggat 180
tcccgtcaga cgagcccttg gtaaggaaat aattattttc ttttttcctt ttagtataaa 240
atagttaagt gatgttaatt agtatgatta taataatata gttgttataa ttgtgaaaaa 300
ataatttata aatatattgt ttacataaac aacatagtaa tgtaaaaaaa tatgacaagt 360
gatgtgtaag acgaagaaga taaaagttga gagtaagtat attattttta atgaatttga 420
tcgaacatgt aagatgatat acggccggta agaggttcca actttcacca taatgaaata 480
agatcactac cgggcgtatt ttttgagtta tcgagatttt caggagctaa ggaagctaaa 540
atggagaaaa aaatcactgg atataccacc gttgatatat cccaatggca tcgtaaagaa 600
cattttgagg catttcagtc agttgctcaa tgtacctata accagaccgt tcagctggat 660
attacggcct ttttaaagac cgtaaagaaa aataagcaca agttttatcc ggcctttatt 720
cacattcttg cccgcctgat gaatgctcat ccggaattcc gtatggcaat gaaagacggt 780
gagctggtga tatgggatag tgttcaccct tgttacaccg ttttccatga gcaaactgaa 840
acgttttcat cgctctggag tgaataccac gacgatttcc ggcagtttct acacatatat 900
tcgcaagatg tggcgtgtta cggtgaaaac ctggcctatt tccctaaagg gtttattgag 960
aatatgtttt tcgtctcagc caatccctgg gtgagtttca ccagttttga tttaaacgtg 1020
gccaatatgg acaacttctt cgcccccgtt ttcaccatgg gcaaatatta tacgcaaggc 1080
gacaaggtgc tgatgccgct ggcgattcag gttcatcatg ccgtctgtga tggcttccat 1140
gtcggcagaa tgcttaatga attacaacag tactgcgatg agtggcaggg cggggcgtaa 1200
tcgcgtggat ccggcttact aaaagccaga taacagtatg cgtatttgcg cgctgatttt 1260
tgcggtataa gaatatatac tgatatgtcg gtcccataat agtaattcta gctggtttga 1320
tgaattaaat atcaatgata aaatactata gtaaaaataa gaataaataa attaaaataa 1380
tattttttta tgattaatag tttattatat aattaaatat ctataccatt actaaatatt 1440
ttagtttaaa agttaataaa tattttgtta gaaattccaa tctgcttgta atttatcaat 1500
aaacaaaata ttaaataaca agctaaagta acaaataata tcaaactaat agaaacagta 1560
atctaatgta acaaaacata atctaatgct aatataacaa agcgcaagat ctatcatttt 1620
atatagtatt attttcaatc aacattctta ttaatttcta aataatactt gtagttttat 1680
taacttctaa atggattgac tattaattaa atgaattagt cgaacatgaa taaacaaggt 1740
aacatgatag atcatgtcat tgtgttatca ttgatcttac atttggattg attacagttg 1800
gtctagagat ttcgtctaga tcgtctgacg ggaatcccaa tatgccagta taggaattcc 1860
actgctgtac tgatatagtt tttgcatcga ctccgcgcat acagtccatc actaagctcg 1920
gatcggcagc tagtaggctg ctattgcaat tacagtcatc tactaacact tttcctatgt 1980
cttgtgctct ctctcctgtc atccaactcc a 2011
<210> 16
<211> 8610
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> V153 载体序列
<400> 16
gatcgttcaa acatttggca ataaagtttc ttaagattga atcctgttgc cggtcttgcg 60
atgattatca tataatttct gttgaattac gttaagcatg taataattaa catgtaatgc 120
atgacgttat ttatgagatg ggtttttatg attagagtcc cgcaattata catttaatac 180
gcgatagaaa acaaaatata gcgcgcaaac taggataaat tatcgcgcgc ggtgtcatct 240
atgttactag atccctaggg aagttcctat tccgaagttc ctattctctg aaaagtatag 300
gaacttcttt gcgtattggg cgctcttggc ctttttggcc accggtcgta cggttaaaac 360
caccccagta cattaaaaac gtccgcaatg tgttattaag ttgtctaagc gtcaatttgt 420
ttacaccaca atatatcctg ccaccagcca gccaacagct ccccgaccgg cagctcggca 480
caaaatcacc actcgataca ggcagcccat cagtccacta gacgctcacc gggctggttg 540
ccctcgccgc tgggctggcg gccgtctatg gccctgcaaa cgcgccagaa acgccgtcga 600
agccgtgtgc gagacaccgc agccgccggc gttgtggata cctcgcggaa aacttggccc 660
tcactgacag atgaggggcg gacgttgaca cttgaggggc cgactcaccc ggcgcggcgt 720
tgacagatga ggggcaggct cgatttcggc cggcgacgtg gagctggcca gcctcgcaaa 780
tcggcgaaaa cgcctgattt tacgcgagtt tcccacagat gatgtggaca agcctgggga 840
taagtgccct gcggtattga cacttgaggg gcgcgactac tgacagatga ggggcgcgat 900
ccttgacact tgaggggcag agtgctgaca gatgaggggc gcacctattg acatttgagg 960
ggctgtccac aggcagaaaa tccagcattt gcaagggttt ccgcccgttt ttcggccacc 1020
gctaacctgt cttttaacct gcttttaaac caatatttat aaaccttgtt tttaaccagg 1080
gctgcgccct gtgcgcgtga ccgcgcacgc cgaagggggg tgccccccct tctcgaaccc 1140
tcccggcccg ctctcgcgtt ggcagcatca cccataattg tggtttcaaa atcggctccg 1200
tcgatactat gttatacgcc aactttgaaa acaactttga aaaagctgtt ttctggtatt 1260
taaggtttta gaatgcaagg aacagtgaat tggagttcgt cttgttataa ttagcttctt 1320
ggggtatctt taaatactgt agaaaagagg aaggaaataa taaatggcta aaatgagaat 1380
atcaccggaa ttgaaaaaac tgatcgaaaa ataccgctgc gtaaaagata cggaaggaat 1440
gtctcctgct aaggtatata agctggtggg agaaaatgaa aacctatatt taaaaatgac 1500
ggacagccgg tataaaggga ccacctatga tgtggaacgg gaaaaggaca tgatgctatg 1560
gctggaagga aagctgcctg ttccaaaggt cctgcacttt gaacggcatg atggctggag 1620
caatctgctc atgagtgagg ccgatggcgt cctttgctcg gaagagtatg aagatgaaca 1680
aagccctgaa aagattatcg agctgtatgc ggagtgcatc aggctctttc actccatcga 1740
catatcggat tgtccctata cgaatagctt agacagccgc ttagccgaat tggattactt 1800
actgaataac gatctggccg atgtggattg cgaaaactgg gaagaagaca ctccatttaa 1860
agatccgcgc gagctgtatg attttttaaa gacggaaaag cccgaagagg aacttgtctt 1920
ttcccacggc gacctgggag acagcaacat ctttgtgaaa gatggcaaag taagtggctt 1980
tattgatctt gggagaagcg gcagggcgga caagtggtat gacattgcct tctgcgtccg 2040
gtcgatcagg gaggatattg gggaagaaca gtatgtcgag ctattttttg acttactggg 2100
gatcaagcct gattgggaga aaataaaata ttatatttta ctggatgaat tgttttagta 2160
cctagatgtg gcgcaacgat gccggcgaca agcaggagcg caccgacttc ttccgcatca 2220
agtgttttgg ctctcaggcc gaggcccacg gcaagtattt gggcaagggg tcgctggtat 2280
tcgtgcaggg caagattcgg aataccaagt acgagaagga cggccagacg gtctacggga 2340
ccgacttcat tgccgataag gtggattatc tggacaccaa ggcaccaggc gggtcaaatc 2400
aggaataagg gcacattgcc ccggcgtgag tcggggcaat cccgcaagga gggtgaatga 2460
atcggacgtt tgaccggaag gcatacaggc aagaactgat cgacgcgggg ttttccgccg 2520
aggatgccga aaccatcgca agccgcaccg tcatgcgtgc gccccgcgaa accttccagt 2580
ccgtcggctc gatggtccag caagctacgg ccaagatcga gcgcgacagc gtgcaactgg 2640
ctccccctgc cctgcccgcg ccatcggccg ccgtggagcg ttcgcgtcgt ctcgaacagg 2700
aggcggcagg tttggcgaag tcgatgacca tcgacacgcg aggaactatg acgaccaaga 2760
agcgaaaaac cgccggcgag gacctggcaa aacaggtcag cgaggccaag caagccgcgt 2820
tgctgaaaca cacgaagcag cagatcaagg aaatgcagct ttccttgttc gatattgcgc 2880
cgtggccgga cacgatgcga gcgatgccaa acgacacggc ccgctctgcc ctgttcacca 2940
cgcgcaacaa gaaaatcccg cgcgaggcgc tgcaaaacaa ggtcattttc cacgtcaaca 3000
aggacgtgaa gatcacctac accggcgtcg agctgcgggc cgacgatgac gaactggtgt 3060
ggcagcaggt gttggagtac gcgaagcgca cccctatcgg cgagccgatc accttcacgt 3120
tctacgagct ttgccaggac ctgggctggt cgatcaatgg ccggtattac acgaaggccg 3180
aggaatgcct gtcgcgccta caggcgacgg cgatgggctt cacgtccgac cgcgttgggc 3240
acctggaatc ggtgtcgctg ctgcaccgct tccgcgtcct ggaccgtggc aagaaaacgt 3300
cccgttgcca ggtcctgatc gacgaggaaa tcgtcgtgct gtttgctggc gaccactaca 3360
cgaaattcat atgggagaag taccgcaagc tgtcgccgac ggcccgacgg atgttcgact 3420
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gatcggattc cacccgcgtg aagaagtggc gcgagcaggt cggcgaagcc tgcgaagagt 3540
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cctcttccgc ttcctcgctc actgactcgc tgcgctcggt cgttcggctg cggcgagcgg 3720
tatcagctca ctcaaaggcg gtaatacggt tatccacaga atcaggggat aacgcaggaa 3780
agaacatgtg agcaaaaggc cagcaaaagg ccaggaaccg taaaaaggcc gcgttgctgg 3840
cgtttttcca taggctccgc ccccctgacg agcatcacaa aaatcgacgc tcaagtcaga 3900
ggtggcgaaa cccgacagga ctataaagat accaggcgtt tccccctgga agctccctcg 3960
tgcgctctcc tgttccgacc ctgccgctta ccggatacct gtccgccttt ctcccttcgg 4020
gaagcgtggc gctttctcat agctcacgct gtaggtatct cagttcggtg taggtcgttc 4080
gctccaagct gggctgtgtg cacgaacccc ccgttcagcc cgaccgctgc gccttatccg 4140
gtaactatcg tcttgagtcc aacccggtaa gacacgactt atcgccactg gcagcagcca 4200
ctggtaacag gattagcaga gcgaggtatg taggcggtgc tacagagttc ttgaagtggt 4260
ggcctaacta cggctacact agaagaacag tatttggtat ctgcgctctg ctgaagccag 4320
ttaccttcgg aaaaagagtt ggtagctctt gatccggcaa acaaaccacc gctggtagcg 4380
gtggtttttt tgtttgcaag cagcagatta cgcgcagaaa aaaaggatct caagaagatc 4440
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catgcacata caaatggacg aacggataaa ccttttcacg cccttttaaa tatccgatta 4620
ttctaataaa cgctcttttc tcttaggttt acccgccaat atatcctgtc aaacactgat 4680
agtttaaact gaaggcggga aacgacaatc tgctagtgga tctcccagtc acgacgttgt 4740
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ataataatat agttgttata attgtgaaaa aataatttat aaatatattg tttacataaa 5460
caacatagta atgtaaaaaa atatgacaag tgatgtgtaa gacgaagaag ataaaagttg 5520
agagtaagta tattattttt aatgaatttg atcgaacatg taagatgata tacggccggt 5580
aagaggttcc aactttcacc ataatgaaat aagatcacta ccgggcgtat tttttgagtt 5640
atcgagattt tcaggagcta aggaagctaa aatggagaaa aaaatcactg gatataccac 5700
cgttgatata tcccaatggc atcgtaaaga acattttgag gcatttcagt cagttgctca 5760
atgtacctat aaccagaccg ttcagctgga tattacggcc tttttaaaga ccgtaaagaa 5820
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tccggaattc cgtatggcaa tgaaagacgg tgagctggtg atatgggata gtgttcaccc 5940
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cgacgatttc cggcagtttc tacacatata ttcgcaagat gtggcgtgtt acggtgaaaa 6060
cctggcctat ttccctaaag ggtttattga gaatatgttt ttcgtctcag ccaatccctg 6120
ggtgagtttc accagttttg atttaaacgt ggccaatatg gacaacttct tcgcccccgt 6180
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gtactgcgat gagtggcagg gcggggcgta atcgcgtgga tccggcttac taaaagccag 6360
ataacagtat gcgtatttgc gcgctgattt ttgcggtata agaatatata ctgatatgtc 6420
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agtaaaaata agaataaata aattaaaata atattttttt atgattaata gtttattata 6540
taattaaata tctataccat tactaaatat tttagtttaa aagttaataa atattttgtt 6600
agaaattcca atctgcttgt aatttatcaa taaacaaaat attaaataac aagctaaagt 6660
aacaaataat atcaaactaa tagaaacagt aatctaatgt aacaaaacat aatctaatgc 6720
taatataaca aagcgcaaga tctatcattt tatatagtat tattttcaat caacattctt 6780
attaatttct aaataatact tgtagtttta ttaacttcta aatggattga ctattaatta 6840
aatgaattag tcgaacatga ataaacaagg taacatgata gatcatgtca ttgtgttatc 6900
attgatctta catttggatt gattacagtt ggtctagaga tttcgtctag atcgtctgac 6960
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ttttgatcca tgcagtcaac gcccagaatt tccctatata attttttaat tcccaaacac 7920
ccctaactct atcccatttc tcaccaaccg ccacatagat ctatcctctt atctctcaaa 7980
ctctctcgaa ccttccccta accctagcag cctctcatca tcctcacctc aaaacccacc 8040
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tgaggctttg ggatacacag ccaggggtac attgcgcgca gctggataca agcatggtgg 8520
atggcatgat gttggttttt ggcaaaggga ttttgagttg ccagctcctc caaggccagt 8580
tagaccagtt acccagatct gaggcgcgcc 8610
<210> 17
<211> 8855
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> V206(修饰的) 载体序列
<400> 17
gggccttgta cacaccgccc gtcacactat gggagctggc catgcccgaa gtcgttacct 60
taaccgcaag gagggggatg ccgaaggcag ggctagtgac tggagtgaag tcgtaacaag 120
gtagccgtac tggaaggtgc ggctggatca cctccttttc agggagagct aatgcttgtt 180
gggtattttg gtttgacact gcttcacacc cccaaaaaaa agaagggagc tacgtctgag 240
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agttcaatgt gctcatcggc gcctgaccct gagatgtgga tcatccaagg cacattagca 600
tggcgtactc ctcctgttcg aaccggggtt tgaaaccaaa ctcctcctca ggaggataga 660
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gcggtccggg ggggaccacc acggctcctc tcttctcgag aatccataca tcccttatca 780
gtgtatggac agctatctct cgagcacagg tttagcaatg ggaaaataaa atggagcacc 840
taacaacgca tcttcacaga ccaagaacta cgagatcgcc cctttcattc tggggtgacg 900
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aggatcttag agtgtctagg gttgggccag gagggtctct taacgccttc ttttttcttc 1020
tcatcggagt tatttcacaa agacttgcca gggtaaggaa gaagggggga acaagcacac 1080
ttggagagcg cagtacaacg gagagttgta tgctgcgttc gggaaggatg aatcgctccc 1140
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aaaaataatt tataaatata ttgtttacat aaacaacata gtaatgtaaa aaaatatgac 1920
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tattttagtt taaaagttaa taaatatttt gttagaaatt ccaatctgct tgtaatttat 3060
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agaattaacc gatcgacgtg caagcggaca tttattttaa attcgataat ttttgcaaaa 4020
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tgtttgccgg atcaagagct accaactctt tttccgaagg taactggctt cagcagagcg 8160
cagataccaa atactgtcct tctagtgtag ccgtagttag gccaccactt caagaactct 8220
gtagcaccgc ctacatacct cgctctgcta atcctgttac cagtggctgc tgccagtggc 8280
gataagtcgt gtcttaccgg gttggactca agacgatagt taccggataa ggcgcagcgg 8340
tcgggctgaa cggggggttc gtgcacacag cccagcttgg agcgaacgac ctacaccgaa 8400
ctgagatacc tacagcgtga gctatgagaa agcgccacgc ttcccgaagg gagaaaggcg 8460
gacaggtatc cggtaagcgg cagggtcgga acaggagagc gcacgaggga gcttccaggg 8520
ggaaacgcct ggtatcttta tagtcctgtc gggtttcgcc acctctgact tgagcgtcga 8580
tttttgtgat gctcgtcagg ggggcggagc ctatggaaaa acgccagcaa cgcggccttt 8640
ttacggttcc tggccttttg ctggcctttt gctcacatgt tctttcctgc gttatcccct 8700
gattctgtgg ataaccgtat taccgccttt gagtgagctg ataccgctcg ccgcagccga 8760
acgaccgagc gcagcgagtc agtgagcgag gaagcggaag agcgcccaat acgcaaaccg 8820
cctctccccg cgcgttggcc gattcattaa tgcag 8855
<210> 18
<211> 7997
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> v301 载体序列
<400> 18
gtacacaccg cccgtcacac tatgggagct ggccatgccc gaagtcgtta ccttaaccgc 60
aaggaggggg atgccgaagg cagggctagt gactggagtg aagtcgtaac aaggtagccg 120
tactggaagg tgcggctgga tcacctcctt ttcagggaga gctaatgctt gttgggtatt 180
ttggtttgac actgcttcac acccccaaaa aaaagaaggg agctacgtct gagttaaact 240
tggagatgga agtcttcttt cctttctcga cggtgaagta agaccaagct catgagctta 300
ttatcctagg tcggaacaag ttgataggac cccctttttt acgtccccat gttccccccg 360
tgtggcgaca tgggggcgaa aaaaggaaag agagggatgg ggtttctctc gcttttggca 420
tagcgggccc ccagtgggag gctcgcacga cgggctatta gctcagtggt agagcgcgcc 480
cctgataatt gcgtcgttgt gcctgggctg tgagggctct cagccacatg gatagttcaa 540
tgtgctcatc ggcgcctgac cctgagatgt ggatcatcca aggcacatta gcatggcgta 600
ctcctcctgt tcgaaccggg gtttgaaacc aaactcctcc tcaggaggat agatggggcg 660
attcgggtga gatccaatgt agatccaact ttcgattcac tcgtgggatc cgggcggtcc 720
gggggggacc accacggctc ctctcttctc gagaatccat acatccctta tcagtgtatg 780
gacagctatc tctcgagcac aggtttagca atgggaaaat aaaatggagc acctaacaac 840
gcatcttcac agaccaagaa ctacgagatc gcccctttca ttctggggtg acggagggat 900
cgtaccattc gagccgtttt tttcttgact cgaaatggga gcaggtttga aaaaggatct 960
tagagtgtct agggttgggc caggagggtc tcttaacgcc ttcttttttc ttctcatcgg 1020
agttatttca caaagacttg ccagggtaag gaagaagggg ggaacaagca cacttggaga 1080
gcgcagtaca acggagagtt gtatgctgcg ttcgggaagg atgaatcgct cccgaaaagg 1140
aatctattga ttctctccca attggttgga ccgtaggtgc gatgatttac ttcacgggcg 1200
aggtctctgg ttcaagtcca ggatggccca gctgcattta aatggcgcgc cgctcccccg 1260
ccgtcgttca atgagaatgg ataagaggct cgtgggattg acgtgagggg gcagggatgg 1320
ctatatttct gggagacgcg tatgtatttg gcaaatcaaa taccatggtc taataatcaa 1380
acattctgat tagttgataa tattagtatt agttggaaat tttgtgaaag attcctgtga 1440
aaagtttcat taacacggaa ttcgtgtcga gtagaccttg ttgttgtgag aattcttaat 1500
tcatgagttg tagggaggga tttcttaagc tcgagggatc cgtcgacctg cagtctcgaa 1560
gagcggagca tggagttgga tgacaggaga gagagcacaa gacataggaa aagtgttagt 1620
agatgactgt aattgcaata gcagcctact agctgccgat ccgagcttag tgatggactg 1680
tatgcgcgga gtcgatgcaa aaactatatc agtacagcag tggaattcct atactggcat 1740
attgggattc ccgtcagcac gagctcttcg cacgcatgca aatctaagtg tagtgcttgg 1800
tgtattgatt ttttttggaa agggagtgtg tgcgagttgt ttatttcaag aataggctgg 1860
accacccagc tgtacccttt tccgttataa ctaggaaaga gaggtgcatg atctcgcgaa 1920
ttacttctga ataaattcag aaattatatg taagaaccat agcatttcgc gattcattgg 1980
taaatcaatt ttgattctct attaaccaat aatgtggaac tattaacatg gttaaaacaa 2040
actgtttgaa gtctagacgc agcatggtac tctttctacc actatgttaa tatagaggtg 2100
gtttcaaaat aaatatttta tcgatatagg atactcatat tgataaaatg atttgaaccg 2160
cttattgtaa attgtaaaaa cggggatttt acccccttta tctaatgctg aatcgacgac 2220
ctattctaag taagaagagc tttttggatt tgaaaaaaaa aaaaagaaac aactttgctg 2280
acaattacat attttttatt ttgtcagaag agtcctccga atattttggt cttacattag 2340
tttcgatatc tttttggaat atgaacaaag aagagaagat aggctcatta cattcataaa 2400
aaaagatatg agaatttacc ttaagtaatt gagcgtgaga gccaaatgaa tcgaaagatt 2460
catgtttggt tcgggaaggg attatggaat tttggaaagg aatggaaaaa taatctactt 2520
tcattaagtg atttattaga taatcgaaaa cagaggatct tgaatactat tcgacatatg 2580
tgtgcgaaga gctcgagctg acgggaatcc caatatgcca gtataggaat tccactgctg 2640
tactgatata gtttttgcat cgactccgcg catacagtcc atcactaagc tcggatcggc 2700
agctagtagg ctgctattgc aattacagtc atctactaac acttttccta tgtcttgtgc 2760
tctctctcct gtcatccaac tccatgctcc gctcttcgag aaagcttaga cattagcaga 2820
taaattagca ggaaataaag aaggataagg agaaagaact caagtaatta tccttcgttc 2880
tcttaattga attgcaatta aactcggccc aatcttttac taaaaggatt gagccgaata 2940
caacaaagat tctattgcat atattttgac taagtatata cttacctaga tatacaagat 3000
ttgaaataca aaatctagtc tagagcggcc gcagtagctt ataacttcgt atagcataca 3060
ttatacgaag ttatagatcc gctcccccgc cgtcgttcaa tgagaatgga taagaggctc 3120
gtgggattga cgtgaggggg cagggatggc tatatttctg ggagaattaa ccgatcgacg 3180
tgcaagcgga catttatttt aaattcgata atttttgcaa aaacatttcg acatatttat 3240
ttattttatt attatgagaa tcaatcctac tacttctggt tctggggttt ccacggctag 3300
tagcgaagcg gtgatcgccg aagtatcgac tcaactatca gaggtagttg gcgtcatcga 3360
gcgccatctc gaaccgacgt tgctggccgt acatttgtac ggctccgcag tggatggcgg 3420
cctgaagcca cacagtgata ttgatttgct ggttacggtg accgtaaggc ttgatgaaac 3480
aacgcggcga gctttgatca acgacctttt ggaaacttcg gcttcccctg gagagagcga 3540
gattctccgc gctgtagaag tcaccattgt tgtgcacgac gacatcattc cgtggcgtta 3600
tccagctaag cgcgaactgc aatttggaga atggcagcgc aatgacattc ttgcaggtat 3660
cttcgagcca gccacgatcg acattgatct ggctatcttg ctgacaaaag caagagaaca 3720
tagcgttgcc ttggtaggtc cagcggcgga ggaactcttt gatccggttc ctgaacagga 3780
tctatttgag gcgctaaatg aaaccttaac gctatggaac tcgccgcccg actgggctgg 3840
cgatgagcga aatgtagtgc ttacgttgtc ccgcatttgg tacagcgcag taaccggcaa 3900
aatcgcgccg aaggatgtcg ctgccgactg ggcaatggag cgcctgccgg cccagtatca 3960
gcccgtcata cttgaagcta gacaggctta tcttggacaa gaagaagatc gcttggcctc 4020
gcgcgcagat cagttggaag aatttgtcca ctacgtgaaa ggcgagatca ccaaggtagt 4080
gggcaaagaa caaaaactca tttctgaaga agacttgtga gtctagctag agcgatcctg 4140
gcctagtcta taggaggttt tgaaaagaaa ggagcaataa tcattttctt gttctatcaa 4200
gagggtgcta ttgctccttt ctttttttct ttttatttat ttactagtat tttacttaca 4260
tagacttttt tgtttacatt atagaaaaag aaggagaggt tattttcttg catttattca 4320
tgggggatca aagctgatct ataacttcgt atagcataca ttatacgaag ttatggtaca 4380
ctatttaaat gcgctccact tggctcgggg ggatatagct cagttggtag agctccgctc 4440
ttgcaattgg gtcgttgcga ttacgggttg gatgtctaat tgtccaggcg gtaatgatag 4500
tatcttgtac ctgaaccggt ggctcacttt ttctaagtaa tggggaagag gaccgaaacg 4560
tgccactgaa agactctact gagacaaaga tgggctgtca agaacgtaga ggaggtagga 4620
tgggcagttg gtcagatcta gtatggatcg tacatggacg gtagttggag tcggcggctc 4680
tcccagggtt ccctcatctg agatctctgg ggaagaggat caagttggcc cttgcgaaca 4740
gcttgatgca ctatctccct tcaacccttt gagcgaaatg cggcaaaaga aaaggaagga 4800
aaatccatgg accgacccca tcatctccac cccgtaggaa ctacgagatc accccaagga 4860
cgccttcggc atccaggggt cacggaccga ccatagaacc ctgttcaata agtggaacgc 4920
attagctgtc cgctctcagg ttgggcagtc agggtcggag aagggcaatg actcattctt 4980
agttagaatg ggattccaac tcagcacctt ttgagtgaga ttttgagaag agttgctctt 5040
tggagagcac agtacgatga aagttgtaag ctgtgttcgg gggggagtta ttgtctatcg 5100
ttggcctcta tggtagaatc agtcggggga cctgagaggc ggtggtttac cctgcggcgg 5160
atgtcagcgg ttcgagtccg cttatctcca actcgtgaac ttagccgata caaagctctg 5220
gcgtaatagc gaagaggccc gcaccgatcg cccttcccaa cagttgcgca gcctgaatgg 5280
cgaatggcgc ctgatgcggt attttctcct tacgcatctg tgcggtattt cacaccgcat 5340
acgtcaaagc aaccatagta cgcgccctgt agcggcgcat taagcgcggc gggtgtggtg 5400
gttacgcgca gcgtgaccgc tacacttgcc agcgccctag cgcccgctcc tttcgctttc 5460
ttcccttcct ttctcgccac gttcgccggc tttccccgtc aagctctaaa tcgggggctc 5520
cctttagggt tccgatttag tgctttacgg cacctcgacc ccaaaaaact tgatttgggt 5580
gatggttcac gtagtgggcc atcgccctga tagacggttt ttcgcccttt gacgttggag 5640
tccacgttct ttaatagtgg actcttgttc caaactggaa caacactcaa ccctatctcg 5700
ggctattctt ttgatttata agggattttg ccgatttcgg cctattggtt aaaaaatgag 5760
ctgatttaac aaaaatttaa cgcgaatttt aacaaaatat taacgtttac aattttatgg 5820
tgcactctca gtacaatctg ctctgatgcc gcatagttaa gccagccccg acacccgcca 5880
acacccgctg acgcgccctg acgggcttgt ctgctcccgg catccgctta cagacaagct 5940
gtgaccgtct ccgggagctg catgtgtcag aggttttcac cgtcatcacc gaaacgcgcg 6000
agacgaaagg gcctcgtgat acgcctattt ttataggtta atgtcatgat aataatggtt 6060
tcttagacgt caggtggcac ttttcgggga aatgtgcgcg gaacccctat ttgtttattt 6120
ttctaaatac attcaaatat gtatccgctc atgagacaat aaccctgata aatgcttcaa 6180
taatattgaa aaaggaagag tatgagtatt caacatttcc gtgtcgccct tattcccttt 6240
tttgcggcat tttgccttcc tgtttttgct cacccagaaa cgctggtgaa agtaaaagat 6300
gctgaagatc agttgggtgc acgagtgggt tacatcgaac tggatctcaa cagcggtaag 6360
atccttgaga gttttcgccc cgaagaacgt tttccaatga tgagcacttt taaagttctg 6420
ctatgtggcg cggtattatc ccgtattgac gccgggcaag agcaactcgg tcgccgcata 6480
cactattctc agaatgactt ggttgagtat tcaccagtca cagaaaagca tcttacggat 6540
ggcatgacag taagagaatt atgcagtgct gccataacca tgagtgataa cactgcggcc 6600
aacttacttc tgacaacgat cggaggaccg aaggagctaa ccgctttttt gcacaacatg 6660
ggggatcatg taactcgcct tgatcgttgg gaaccggagc tgaatgaagc cataccaaac 6720
gacgagcgtg acaccacgat gcctgtagca atggcaacaa cgttgcgcaa actattaact 6780
ggcgaactac ttactctagc ttcccggcaa caattaatag actggatgga ggcggataaa 6840
gttgcaggac cacttctgcg ctcggccctt ccggctggct ggtttattgc tgataaatct 6900
ggagccggtg agcgtgggtc tcgcggtatc attgcagcac tggggccaga tggtaagccc 6960
tcccgtatcg tagttatcta cacgacgggg agtcaggcaa ctatggatga acgaaataga 7020
cagatcgctg agataggtgc ctcactgatt aagcattggt aactgtcaga ccaagtttac 7080
tcatatatac tttagattga tttaaaactt catttttaat ttaaaaggat ctaggtgaag 7140
atcctttttg ataatctcat gaccaaaatc ccttaacgtg agttttcgtt ccactgagcg 7200
tcagaccccg tagaaaagat caaaggatct tcttgagatc ctttttttct gcgcgtaatc 7260
tgctgcttgc aaacaaaaaa accaccgcta ccagcggtgg tttgtttgcc ggatcaagag 7320
ctaccaactc tttttccgaa ggtaactggc ttcagcagag cgcagatacc aaatactgtc 7380
cttctagtgt agccgtagtt aggccaccac ttcaagaact ctgtagcacc gcctacatac 7440
ctcgctctgc taatcctgtt accagtggct gctgccagtg gcgataagtc gtgtcttacc 7500
gggttggact caagacgata gttaccggat aaggcgcagc ggtcgggctg aacggggggt 7560
tcgtgcacac agcccagctt ggagcgaacg acctacaccg aactgagata cctacagcgt 7620
gagctatgag aaagcgccac gcttcccgaa gggagaaagg cggacaggta tccggtaagc 7680
ggcagggtcg gaacaggaga gcgcacgagg gagcttccag ggggaaacgc ctggtatctt 7740
tatagtcctg tcgggtttcg ccacctctga cttgagcgtc gatttttgtg atgctcgtca 7800
ggggggcgga gcctatggaa aaacgccagc aacgcggcct ttttacggtt cctggccttt 7860
tgctggcctt ttgctcacat gttctttcct gcgttatccc ctgattctgt ggataaccgt 7920
attaccgcct ttgagtgagc tgataccgct cgccgcagcc gaacgaccga gcgcagcgag 7980
tcagtgagcg aggaagc 7997

Claims (20)

1.维管植物的质体，所述质体包含：
-核酸构建体，其包括：
-编码区，用于编码双链RNA(dsRNA)分子；
-在所述质体中能运作的启动子，用于使所述dsRNA分子能够生成；
-其中由所述编码区编码的dsRNA包含在质体中，从而不能与所述维管植物的细胞的胞质溶胶相互作用；
-其中所述编码区编码的dsRNA倘若与维管植物的细胞的胞质溶胶相互作用，则能够在该胞质溶胶中诱导RNAi；-其中所述dsRNA具有使siRNA能够从该dsRNA生成的序列。
2.权利要求1的质体，其进一步包含这样的dsRNA，该dsRNA具有使siRNA能够从该dsRNA生成的序列，其中该dsRNA由所述编码区编码。
3.权利要求1或2的质体，其中所述编码区具有不见于所述植物的基因组中的核苷酸序列。
4.权利要求3的质体，其中所述编码区具有所述植物的有害生物或病原体的核苷酸序列。
5.权利要求1的质体，其中siRNA分子不在所述质体内部形成。
6.权利要求1的质体，其中所述dsRNA含有整个由所述编码区编码的核苷酸序列。
7.权利要求6的质体，其中所述dsRNA受到所述质体的编辑、剪接或加帽。
8.权利要求1-2或4-7中任一项的质体，其还包括至少一种其他编码区，用于编码至少一种杀虫剂。
9.权利要求8的质体，其中所述杀虫剂是杀虫多肽。
10.一种用于转化维管植物的核酸构建体，其包含：
-编码区，用于编码双链RNA(dsRNA)分子；
-在所述植物的质体中能运作的启动子，用于使所述dsRNA分子能够生成；
-对于所述构建体向所述维管植物的质体基因组中的整合为选择性的一个或多个整合位点；
-其中所述dsRNA具有使siRNA能够从该dsRNA生成的序列，
-其中由所述编码区编码的dsRNA包含在质体中，从而不能与所述维管植物的细胞的胞质溶胶相互作用；
-其中所述编码区编码的dsRNA倘若与维管植物的细胞的胞质溶胶相互作用，则能够在该胞质溶胶中诱导RNAi。
11.权利要求10的构建体，其中所述编码区具有不见于所述植物的基因组中的核苷酸序列。
12.权利要求10的构建体，其中所述编码区具有所述植物的有害生物或病原体的核苷酸序列。
13.权利要求10至12中任一项的构建体，其中所述构建体包括至少一种其他编码区，用于编码至少一种杀虫剂。
14.权利要求13的构建体，其中所述杀虫剂是杀虫多肽。
15.一种在维管植物的细胞中积累dsRNA的方法，所述方法包括：
-用前述权利要求中任一项的核酸构建体转化维管植物的质体；
-对所述细胞提供条件，以在所述质体中从所述核酸构建体生成dsRNA。
16.权利要求15的方法，其中所述dsRNA分子稳定整合到所述植物细胞的叶绿体的基因组中。
17.权利要求15的方法，其中所述核酸构建体包含选择标志物。
18.权利要求15的方法，其进一步包括使用所述核酸构建体的选择标志物来选择就编码dsRNA分子的核酸构建体而言为同质性的植物细胞或植物。
19.一种控制昆虫有害生物的方法，其包括将包含权利要求1-2、4-7、9-12或14中任一项的质体或核酸构建体的植物呈现给所述有害生物或所述有害生物的环境。
20.权利要求19的方法，其中需要昆虫有害生物控制的所述环境是植物的茬或田地。
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