CN103269579A

CN103269579A - 对病原体和寄生体的控制

Info

Publication number: CN103269579A
Application number: CN2011800625619A
Authority: CN
Inventors: 理查德·塞利; 安尼尔·库马
Original assignee: Donald Danforth Plant Science Center
Current assignee: Donald Danforth Plant Science Center
Priority date: 2010-10-22
Filing date: 2011-10-24
Publication date: 2013-08-28
Also published as: WO2012054919A3; EP2629599A4; AU2011316776A1; CL2013001102A1; WO2012054919A2; US20130315883A1; EP2629599A2; CA2820536A1; MX2013004522A

Abstract

本发明涉及通过在转基因植物(包括微藻)中表达沉默性RNA而遗传地控制寄生体和病原体。在一个方面，本发明利用摄入后，植物在被高效采食的叶绿体内部以某种形式表达沉默性RNA的能力，其中所述沉默性RNA可以发挥作用以抑制病原体或寄生体内部靶基因的表达。

Description

对病原体和寄生体的控制

相关申请的交叉引用

本申请要求2010年10月22日提交的美国临时申请号61/405,770的优先权益，所述专利的公开内容通过引用的方式如其中所书写那样完整并入。

关于联邦赞助研究和开发的声明

N/A

背景技术

发明领域

本发明涉及通过在转基因植物(包括微藻)中表达沉默性RNA而遗传地控制寄生体和病原体。在一个方面，本发明利用由各种病原体或寄生体、侵入性物种或宿主或所述病原体或寄生体的媒介摄入后，植物在被高效采食的叶绿体内部以某种形式表达沉默性RNA的能力，其中所述沉默性RNA可以发挥作用以抑制病原体、寄生体或侵入性物种内部靶基因的表达。

病原体和寄生体广泛地分布于环境中并且对人和动物健康具有直接影响。尽管化学杀虫剂总体上在控制病原体和寄生体引起的扩散和损伤方面已经十分有效，但是这些化学物质不是选择性的，经常损害其他生物，并且在许多情况下持续存在于环境中并且在食物链中积累。因此，仍需要环境友好的用于控制病原体或寄生体并且保护宿主生物免遭这类病原体和寄生体影响的方法。

具体而言，对于控制感染人和动物并且已经显著影响食品生产或人类健康的病原体和寄生体的安全、廉价及有效策略存在特殊需要。例如，鱼类的水产养殖产量在2004年占约32％的世界渔业总产量。另外，世界范围的水产养殖增长速率已经是持久和迅猛的，在30年范围内平均每年约8％，而来自野生鱼类的捕获量已经在过去十年基本上持平。水产养殖市场在2009年达到860亿美元。

实际上，存在商业重要的水产养殖物种的类型广泛的病原体和寄生体，并且它们对水产养殖场造成严重损害。这些商业重要的物种中许多(包括各种鱼类、甲壳类和虾)直接消费植物和微藻并且是因此轻易地适用于植物介导的RNAi方案以控制这类寄生体和病原体。

另外，携带病原体和寄生体的几种昆虫媒介(包括蚊子)代表针对人类健康的显著威胁，在它们的幼虫阶段期间消费微藻并且因此是轻易地适用于微藻介导的RNAi方案。

对于人类健康益处而言，控制蚊子群体的重要性是广泛已知的并且在世界范围被接受。蚊子传播许多致命的寄生性疾病和病毒病，包括疟疾(按蚊属(Anopheles sps)、丝虫病(库蚊属(Culex)、曼蚊属(Mansonia)和按蚊属(Anopheles sps))、黄热病(埃及伊蚊(Aedes aegypti))和登革热(埃及伊蚊)。在2008年，单独从非洲报道了约2.47亿个疟疾病例，在非洲导致几乎100万例死亡并且占几乎20％的儿童死亡率。

在过去100年，已经尝试了控制蚊子群体的各种策略，包括使用化学杀虫剂和生物控制剂(食肉性细菌、真菌、病毒、寄生体和捕食者)。除影响人类健康和对环境造成有害影响之外，不加区分地使用化学杀虫剂已经导致蚊子群体中形成抵抗性(Poopathi，S.和B.K.Tyagi(2006)Biotechnology and MolecularBiology Review(生物技术和分子生物学概览)1：51-65)。

尽管生物控制剂是安全的、环境友好的和宿主特异性的，但是它们不是十分有效，这归因于它们的群体在蚊子天然栖息地中维持和繁殖相关的难题(Poopathi，S.和B.K.Tyagi(2006)Biotechnology and Molecular BiologyReview(生物技术和分子生物学概览)1：51-65)。因此正在评价涉及应用重组DNA技术的各种新策略。这些策略包括形成绝育或不能传播寄生体或携带自私基因如Medea元件和归巢核酸内切酶基因的转基因蚊子(Chen等人，(2007)Science316：597-600.，Ito等人，(2002)Nature(自然)417：452-5；Marshall，J.M.和C.E.Taylor.(2009)PLoS Med(科学公共图书馆-医学)6：e20)。

这些策略基于以下前提：释放转基因蚊子群体至蚊子的天然繁殖地中将在转基因蚊子和野生型蚊子之间交配几个世代后导致野生型群体被转基因群体替换。然而，关于释放转基因蚊子至环境中的影响或这些策略的有效性，数据不可获得。

苏云金芽孢杆菌以色列亚种(Bacillus thuringiensis ssp.israelensis)(Bti)和球形芽孢杆菌(Bacillus sphaericus)(Bs)是芽孢杆菌属(Bacillus)的两个物种，其中所述物种已知产生对蚊子幼虫有毒的类芽孢晶态包涵体(Baumann等人，(1991)Microbiol Rev(微生物概览)55：425-36)，并且是十分流行的生物控制剂。Bti和Bs的孢子制备物作为商品制剂可用于控制蚊子(Poopathi，S.和B.K.Tyagi(2006)Biotechnology and Molecular Biology Review(生物技术和分子生物学概览)1：51-65)。然而，这些孢子的应用具有一些局限性，如孢子沉降于幼虫饲喂区域之外(Karch，S.和J.F.Charles.(1987)Ann Inst PasteurMicrobiol(巴斯德微生物研究所学报)138：485-92)和毒素因紫外线失活。

为了解决这些问题，我们已经形成一种通过以下方式控制蚊子群体的策略：通过向蚊子幼虫饲喂转基因衣藻，使蚊子存活必需的基因沉默，其中所述转基因衣藻表达靶向这些基因的双链体RNA(dsRNA)。

这种策略具有几种优点，包括1)它不涉及表达可能成为问题的外来蛋白质，2)RNAi元件是十分特异的，抑制目的基因表达，并且3)仅需要少量的靶基因的dsRNA作为触发剂以通过进化上保守的基因沉默装置启动RNAi元件(如siRNA)的产生。

另外，几项研究已经显示蚊子和衣藻拥有RNAi装置(Blandin等人，(2002)EMBO Rep(欧洲分子生物学会报告)3：852-6.，Boisson等人，(2006)FEBSLett(欧州生物化学会通讯)580：1988-92.，Osta等人，(2004)Science(科学)303：2030-2.，Schroda，M.(2006)Curr Genet(现代遗传学)49：69-84.)。支持这种生物控制策略的其他证据来自显示在产生靶向线虫必需基因的dsRNAs的植物中形成线虫抗性的研究(Huang等人，(2006)Proc Natl Acad Sci U S A(美国科学院院报)103：14302-6.，Yadav等人，(2006)Mol Biochem Parasitol(分子生物化学寄生学)148：219-22)。

选择莱茵衣藻(Chlamydomonas rienhardtii)用于控制蚊子，原因是1)可以对其遗传操作，2)它是在充当蚊子繁殖基地的静水中生长的藻类，3)单细胞藻类是蚊子幼虫的天然食物，4)它可以光合性生长并且5)具有低生产成本。

来自这些初步研究的结果显示，这个方案具有潜力以显著地影响对蚊子和以微藻和植物为食的其他昆虫的控制。令人惊讶地，来自这些研究的结果显示，与表达载体的核整合相比，沉默性RNA的叶绿体表达导致更有效地抑制昆虫生长和发育，即便存在以下事实：微藻叶绿体似乎缺少将dsRNA加工成siRNA的酶促装置。

因此，沉默性RNA在植物和微藻中的叶绿体表达似乎代表一种用于递送RNA和用于靶向控制昆虫以及其他寄生体、病原体和害虫中基因表达的的新方案。另外，数据显示，该方案可以成功地适用于消费微藻或植物或感染以微藻为食或植物的宿主生物(如鱼类和虾)的其他病原体或寄生体。

发明概述

在一个实施方案中，本发明包括一种递送siRNA至宿主生物的方法，所述方法包括步骤i)提供植物，所述植物包含在植物的叶绿体中表达的沉默性核糖核酸，和ii)将所述植物饲喂给所述宿主生物。

在另一个实施方案中，本发明包括一种调节靶基因在宿主生物中表达的方法，所述方法包括步骤i)提供植物，所述植物包含在植物的叶绿体中表达的沉默性核糖核酸，其中所述沉默性RNA是对所述宿主生物的靶基因特异的；和ii)将所述植物饲喂给所述宿主生物。

在另一个实施方案中，本发明包括一种保护宿主生物免遭寄生体或病原体影响的方法，所述方法包括步骤：i)提供植物，所述植物包含在植物的叶绿体中表达的沉默性核糖核酸，其中所述沉默性RNA是对所述寄生体或病原体的靶基因特异的；ii)将所述植物饲喂给所述宿主生物。

在另一个实施方案中，本发明包括一种用于控制采食植物的害虫的方法，其包括步骤i)提供植物，所述植物包含在植物的叶绿体中表达的沉默性核糖核酸，其中所述沉默性RNA是对所述害虫的靶基因特异的；和ii)将所述植物提供给所述害虫。

在另一个实施方案中，本发明包括一种包含沉默性核糖核酸的转基因植物，其中所述沉默性RNA在植物的叶绿体中表达，和其中所述沉默性RNA是对可以采食所述转基因植物的生物的靶基因或第二生物的病原体或寄生体的靶基因特异的。

在另一个实施方案中，本发明包括一种用于控制昆虫的方法，所述方法包括：i)提供包含沉默性核糖核酸的微藻，所述沉默性核糖核酸在摄入所述微藻后发挥作用以抑制所述昆虫的靶基因的表达，其中所述靶基因的表达是对所述昆虫的功能、生长、发育、感染性或繁殖必需的，其中所述沉默性核糖核酸包含有义RNA链和反义RNA链，其中所述有义和反义RNA链形成RNA双链体，并且其中所述有义RNA链包含与靶基因中至少约20个连续核苷酸的靶序列基本上相同的核苷酸序列；并且ii)将所述微藻导入所述昆虫的栖息地中，其中所述昆虫或其幼虫形式摄入所述微藻。

在另一个实施方案中，本发明包括一种抑制靶基因在昆虫中表达的方法，所述方法包括：i)提供包含沉默性核糖核酸的微藻，所述沉默性核糖核酸在摄入所述微藻后发挥作用以抑制寄生体或病原体的靶基因的表达，其中所述靶基因的表达是昆虫存活必需的，其中所述沉默性核糖核酸包含有义RNA链和反义RNA链，其中所述有义和反义RNA链形成RNA双链体，并且其中所述有义RNA链包含与靶基因中至少约20个连续核苷酸的靶序列基本上相同的核苷酸序列；并且ii)将所述微藻饲喂给所述昆虫或其幼虫形式。

在另一个实施方案中，本发明包括一种用于控制侵入性物种的方法，所述方法包括：i)提供包含沉默性核糖核酸的微藻，所述沉默性核糖核酸在摄入所述微藻后发挥作用以抑制所述侵入性物种的靶基因的表达，其中所述靶基因的表达是对所述侵入性物种的功能、生长、发育、感染性或繁殖必需的，其中所述沉默性核糖核酸包含有义RNA链和反义RNA链，其中所述有义和反义RNA链形成RNA双链体，并且其中所述有义RNA链包含与靶基因中至少约20个连续核苷酸的靶序列基本上相同的核苷酸序列；并且ii)将所述微藻导入所述侵入性物种的栖息地中，其中所述侵入性物种或其幼虫形式摄入所述微藻。

在另一个实施方案中，本发明包括一种抑制靶基因在侵入性物种中表达的方法，所述方法包括：i)提供包含沉默性核糖核酸的微藻，所述沉默性核糖核酸在摄入所述微藻后发挥作用以抑制所述寄生体或病原体的靶基因的表达，其中所述靶基因的表达是对所述侵入性物种的存活必需的，其中所述沉默性核糖核酸包含有义RNA链和反义RNA链，其中所述有义和反义RNA链形成RNA双链体，并且其中所述有义RNA链包含与靶基因中至少约20个连续核苷酸的靶序列基本上相同的核苷酸序列；并且ii)将所述微藻饲喂给所述侵入性物种或其幼虫形式。

在另一个实施方案中，本发明包括一种用于保护以微藻为食的宿主生物免遭寄生体和病原体感染的方法，所述方法包括：i)提供包含沉默性核糖核酸的微藻，所述沉默性核糖核酸在所述微藻由所述宿主生物、寄生体或病原体摄入后发挥作用以抑制所述寄生体或病原体的靶基因的表达，其中所述靶基因的表达是对所述寄生体或病原体的功能、生长、发育、感染性或繁殖必需的，其中所述沉默性核糖核酸包含有义RNA链和反义RNA链，其中所述有义和反义RNA链形成RNA双链体，并且其中所述有义RNA链包含与靶基因中至少约20个连续核苷酸的靶序列基本上相同的核苷酸序列；并且ii)将所述微藻饲喂给所述宿主生物。

在另一个实施方案中，本发明包括一种抑制靶基因在侵袭宿主生物的病原体或寄生体中表达的方法，所述方法包括：i)提供包含沉默性核糖核酸的微藻，所述沉默性核糖核酸在所述微藻由宿主生物、寄生体或病原体摄入后发挥作用以抑制所述寄生体或病原体的靶基因的表达，其中所述靶基因的表达是对所述寄生体或病原体的功能、生长、发育、感染性或繁殖必需的，其中所述沉默性核糖核酸包含有义RNA链和反义RNA链，其中所述有义和反义RNA链形成RNA双链体，并且其中所述有义RNA链包含与靶基因中至少约20个连续核苷酸的靶序列基本上相同的核苷酸序列；并且ii)将所述微藻饲喂给所述宿主生物。

在另一个实施方案中，本发明包括一种微藻，其包含在微藻由昆虫摄入后发挥作用以抑制昆虫媒介的靶基因表达的沉默性核糖核酸；其中所述靶基因的表达是对寄生体或病原体的功能、生长、发育、感染性或繁殖必需的，其中所述沉默性核糖核酸包含有义RNA链和反义RNA链，其中所述有义和反义RNA链形成RNA双链体，其中所述有义RNA链包含与靶基因中至少约20个连续核苷酸的靶序列基本上相同的核苷酸序列；并且其中所述沉默性RNA在微藻的叶绿体内部表达。

在另一个实施方案中，本发明包括一种分离的沉默性核糖核酸，其由昆虫摄入时发挥作用以抑制所述昆虫媒介的靶基因表达，其中所述沉默性核糖核酸包含有义RNA链和反义RNA链，其中所述有义和反义RNA链形成RNA双链体，并且

其中所述有义RNA链包含与靶基因中至少约20个连续核苷酸的靶序列基本上相同的核苷酸序列。

在另一个实施方案中，本发明包括一种分离的多核苷酸，其在微藻中表达时发挥作用以形成沉默性核糖核酸，所述沉默性核糖核酸在微藻由昆虫媒介摄入后发挥作用以抑制所述昆虫媒介的靶基因的表达，其中所述沉默性核糖核酸包含有义RNA链和反义RNA链，其中所述有义和反义RNA链形成RNA双链体，并且其中所述有义RNA链包含与靶基因中至少约20个连续核苷酸的靶序列基本上相同的核苷酸序列。

在另一个实施方案中，本发明包括一种分离的多核苷酸，其在宿主生物中表达时发挥作用以形成沉默性核糖核酸，在所述沉默性核糖核酸由所述宿主生物的寄生体或病原体摄入时，所述沉默性核糖核酸发挥作用以抑制所述寄生体或病原体的靶基因的表达，其中所述沉默性核糖核酸包含有义RNA链和反义RNA链，其中所述有义和反义RNA链形成RNA双链体，并且其中所述有义RNA链包含与靶基因中至少约20个连续核苷酸的靶序列基本上相同的核苷酸序列。

在另一个实施方案中，本发明包括一种用于宿主生物以保护所述生物免遭一种或多种寄生体或寄生体影响的饲喂添加物，其包含沉默性核糖核酸，所述沉默性核糖核酸在所述饲喂添加物由所述宿主生物摄入时发挥作用以抑制所述寄生体或病原体的靶基因的表达，其中所述靶基因的表达是对所述寄生体或病原体的功能、生长、发育、感染性或繁殖必需的，其中所述沉默性核糖核酸包含有义RNA链和反义RNA链，其中所述有义和反义RNA链形成RNA双链体，并且其中所述有义RNA链包含与靶基因中至少约20个连续核苷酸的靶序列基本上相同的核苷酸序列。

在另一个实施方案中，本发明包括一种用于选择性控制蚊子的方法，所述方法包括：i)提供包含沉默性核糖核酸的微藻，所述沉默性核糖核酸在所述微藻由蚊子幼虫摄入后发挥作用以抑制所述幼虫中3-羟基羟犬尿氨酸转氨酶的表达，其中所述沉默性核糖核酸包含有义RNA链和反义RNA链，其中所述有义和反义RNA链形成RNA双链体，并且其中所述有义RNA链包含与SEQ.ID.No1的至少约20个连续核苷酸基本上相同的核苷酸序列；和ii)将所述微藻导入所述蚊子幼虫的栖息地中，其中所述蚊子幼虫可以摄入所述微藻。

在另一个实施方案中，本发明包括一种用于防止由蚊子传播的病原体或寄生体扩散的方法，所述方法包括：i)提供包含沉默性核糖核酸的微藻，所述沉默性核糖核酸在所述微藻由蚊子幼虫摄入后发挥作用以抑制所述幼虫中3-羟基羟犬尿氨酸转氨酶的表达，其中所述沉默性核糖核酸包含有义RNA链和反义RNA链，其中所述有义和反义RNA链形成RNA双链体，并且其中所述有义RNA链包含与SEQ.ID.No1的至少约20个连续核苷酸基本上相同的核苷酸序列；和ii)将所述微藻导入所述蚊子幼虫的栖息地中，其中所述蚊子幼虫可以摄入所述微藻。

在另一个实施方案中，本发明包括一种用于产生将有效控制昆虫的沉默性RNA的方法，所述方法包括：

i)合成编码许多一种或多种目的RNA种类的多核苷酸文库；

ii)使所述多核苷酸文库与表达载体中的2个会聚启动子有效连接以产生表达文库；

iii)用所述表达文库转化多个微藻宿主细胞，从而以便形成转化的微藻群体；其中所述转化的微藻产生从所述表达载体有义RNA链和反义RNA链，并且其中有义RNA链和反义RNA链形成RNA双链体；

iv)在转化的微藻群体内部鉴定一种细胞或多种细胞，所述细胞表达能够控制昆虫媒介的功能、生长、发育、感染性或繁殖的沉默性RNA；

v)从步骤iv)中鉴定的所述细胞或多个细胞建立一个或多个细胞克隆群体。

在另一个实施方案中，本发明包括一种用于产生沉默性RNA的方法，所述沉默性RNA将有效用于保护以微藻为食的宿主生物免遭寄生体和病原体感染，所述方法包括：

i)合成编码许多一种或多种目的RNA种类的多核苷酸文库；

iv)在转化的微藻群体内部鉴定一种细胞或多种细胞，所述细胞表达能够在微藻由宿主生物摄入后控制寄生体或病原体的功能、生长、发育、感染性或繁殖的沉默性RNA；

在另一个实施方案中，本发明包括一种用于选择用于沉默性RNA中的核苷酸序列的方法，所述沉默性RNA用于在微藻中表达以便控制可能传播寄生体和病原体的昆虫媒介，所述方法包括步骤：

i)用包含所述核苷酸序列的表达载体转化微藻宿主细胞，其中所述转化的微藻产生从所述表达载体有义RNA链和反义RNA链，并且其中有义RNA链和反义RNA链形成RNA双链体；

ii)将所述转化的微藻饲喂给所述寄生体或病原体；

iii)选择抑制所述昆虫媒介的功能、生长、发育、感染性或繁殖的核苷酸序列。

在另一个实施方案中，本发明包括一种用于选择用于沉默性RNA中的核苷酸序列的方法，所述沉默性RNA用于保护以微藻为食的宿主生物免遭寄生体和病原体感染，所述方法包括步骤：

ii)将所述转化的微藻饲饲喂给所述宿主生物；

iii)选择保护宿主生物免遭寄生体或病原体影响和/或抑制所述寄生体或病原体的功能、生长、发育、感染性或繁殖的核苷酸序列。

在这些权利要求中任一项的一个方面，植物是微藻。在这些权利要求中任一项的一个方面，沉默性RNA在叶绿体内部表达。在这些权利要求中任一项的一个方面，植物是选自海产绿藻(Chlamydomas perigranulata)、淡水衣藻(Chlamydomonas moewusii)、莱茵衣藻和衣藻属的种(Chlamydomonas sp.)的微藻。

在这些权利要求中任一项的一个方面，宿主生物选自对虾科(Penaeidae)的小虾和对虾、鲤科(Cyprinidae)的鲤和源于罗非鱼(tilapine cichlid)族的非鲫属(Tilapia)。在另一个方面，宿主生物选自南美白对虾(Penaeusvannamei)、斑节对虾(Penaeus monodon)、蓝对虾(P.stylirostris)、中国对虾(P.chinensis)、日本对虾(P.japonicus)、印度对虾(P.indicus)和墨吉对虾(P.merguiensis)。在这些方法的另一个方面，病原体或寄生体选自病毒，包括Taura综合征病毒(TSV)、传染性皮下及造血组织坏死病毒(IHHNV)、线极病毒(WSSV)、若尼病毒(ronivirus)(YHV、GAV、LOV)、形成包涵体的肠杆状病毒(occluded enteric baculovirus)(BP)、形成包涵体的肠杆状病毒(MBV)、不形成包涵体的肠杆状病毒(BMN)、肠细小病毒(HPV)、细菌，包括α-变形菌门(NHP)，和原生动物，包括微孢子虫(Microsporidian)、单孢子虫(Haplosporidian)及簇虫(Gregarine)。

在这些权利要求中任一项的一个方面，宿主生物选自草鱼(Ctenopharyngodon idella)、鲤鱼(Cyprinus carpio)、鲢鱼(Hypophthalmichthysmolitrix)、大鳞鲢(Hypophthalmichthys harmandi)、鳙鱼(Hypophthalmichthysnobilis)、青鱼(Mylopharyngodon piceus)、普通金鱼(Carassius auratus)和鲫鱼(Carassius carassius)。在这些方法的另一个方面，病原体或寄生体选自多子小瓜虫(Ichthyophthirius multifilis)(Ich：)、车轮虫属(Trichodina)、口丝虫属(Costia)、斜管虫属(Chilodonella)、鲤鲺(Argulus foliaceus)、鲤锚头鳋(Lernaea cyprinacea)、鱼虱(Ergasilus sieboldi)、坏鳃指环虫(Dactylogyrusvastator)和尺蠖鱼蛭(Piscicola geometra)。

在这些权利要求中任一项的一个方面，宿主生物选自口孵非鲫属(Oreochromis spp.)、帚齿非鲫属(Sarotherodon spp)和非鲫属(Tilapia spp.)。在这些方法的另一个方面，病原体或寄生体选自链球菌属(streptococcus)、气单胞菌属(aeromonas)、车轮虫属(trichodina)、柱状菌(columnaris)和虹彩病毒(Iridovirus)。在另一个方面，病原体或寄生体选自纤毛虫、甲藻、吸虫类、甲壳类、桡足类和医蛭科(Hirudidae)。

在这些权利要求中任一项的一个方面，侵入性物种选自贻贝科(Mytilidae)的贻贝和帘蛤科(Veneridae)的蛤。在一个方面，侵入性物种是斑纹贻贝(Dreissena polymorpha)。

在另一个方面，昆虫选自按蚊属(Anopheles sps)、库蚊属(Culex)、曼蚊属(Mansonia)和埃及伊蚊(Aedes aegypti)。在这些方法的另一个方面，病原体或寄生体选自圣路易斯脑炎病毒(SLE)、西方马脑炎病毒(WEE)、委内瑞拉马脑炎病毒(VEE)、东方马脑炎病毒(EEE)、La Crosse病毒(LACV)、东方马脑炎病毒(EEEV)、委内瑞拉马脑炎病毒(VEEV)、乙型脑炎病毒(JE)、黄热病毒、裂谷热(RVF)病毒、西尼罗病毒、登革病毒(DENV1、DENV2、DENV3、或DENV4)、恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)、间日疟原虫(P.vivax)、卵形疟原虫(P.ovale)和三日疟原虫(P.malariae)。

附图简述

可以通过参考阐述说明性实施方案的以下详细描述，获得对本发明特征和优点的更好理解，在所述实施方案中使用本发明的远离，并且其附图是：

图1显示用来从衣藻核基因组中产生双链HKT特异性沉默性RNA的3HKT反向重复序列构建体的示意图。在pCVAC150表达构建体中，HKT反向重复序列构建体由衣藻肌动蛋白启动子驱动。在构建体pCVAC153中，HKT反向重复序列以衣藻肌动蛋白内含子1作为间隔序列，并且HKT反向重复序列的表达由衣藻psaD启动子驱动。构建体pCVAC145具有由衣藻psaD启动子和肌动蛋白启动子从任意末端驱动的HKT表达，导致HKT的双向转录。

图2显示CC424/pCVAC150克隆的PCR分析的结果，所述PCR分析检验HKT反向重复序列构建体在衣藻的核基因组中的整合。在pCVAC150的图示中显示用于PCR证实的4条引物的结合位点。A)采用引物1和2的PCR反应的结果。B)在所选的克隆上采用引物3和4的PCR反应的结果。野生型对照(C)、水对照(-ve)和质粒对照(+ve)。

图3显示CC424/pCVAC153克隆的PCR分析的结果，所述PCR分析检验HKT反向重复序列构建体在衣藻的核基因组中的整合。在pCVAC153的图示中显示用于PCR证实的4条引物的结合位点。A)采用引物1和2的PCR反应的结果。B)在所选的克隆上采用引物3和4的PCR反应的结果。野生型对照(C)、水对照(-ve)和质粒对照(+ve)。

图4显示CC424/pCVAC153克隆的PCR分析的结果，所述PCR分析检验HKT构建体在衣藻的核基因组中的整合。在pCVAC145的图示中显示用于PCR证实的2条引物的结合位点。野生型对照(C)、水对照(-ve)和质粒对照(+ve)。

图5显示CC4147/pCVAC108克隆的PCR分析的结果，所述PCR分析检验HKT构建体在衣藻叶绿体基因组中的整合。在pCVAC108的图示中显示用于PCR分析的2条引物的结合位点。PCR反应的结果证实HKT反向重复序列表达盒的整合。野生型对照(C)、水对照(-ve)和质粒对照(+ve)。

图6显示证实3-HKT dsRNA在衣藻叶绿体转化体中转录的RTPCR结果。在图6中，泳道1＝100bp梯；泳道2＝亲本菌株CC4147no RT，采用psbD引物的PCR；泳道3＝CC4147/pCVAC108-13no RT，采用psbD引物的PCR；泳道4＝CC4147/pCVAC108-15no RT，采用psbD引物的PCR；泳道5＝亲本菌株CC4147cDNA，采用psbD引物的PCR；泳道6＝CC4147/pCVAC108-13cDNA，采用psbD引物的PCR；泳道7＝CC4147/pCVAC108-15cDNA，采用psbD引物的PCR；泳道8＝亲本菌株CC4147no RT，采用3-HKT引物的PCR；泳道9＝CC4147/pCVAC108-13noRT，采用3-HKT引物的PCR；泳道10＝CC4147/pCVAC108-15no RT，采用3-HKT引物的PCR；泳道11＝亲本菌株CC4147cDNA，采用3-HKT引物的PCR；泳道12＝CC4147/pCVAC108-13cDNA，采用3-HKT引物的PCR；泳道13＝CC4147/pCVAC108-15cDNA，采用3-HKT引物的PCR和泳道14＝100bp梯。

图7显示在产生3HKT dsRNA的转基因藻类上饲喂后由斑须按蚊幼虫显示的不同表型。A)依赖转基因藻类培养的按斑须按蚊的死幼虫。B)在第12日比较以转基因藻类为食时显示生长抑制(红箭头)的幼虫与正常发育的幼虫(绿色箭头)。C)在具有转基因藻类的实验孔中的死蛹(红箭头)和活蛹(绿色箭头的图像。新孵化的斑须按蚊幼虫在12孔平板中依赖藻类外加1/3酵母+血清微粒(micron)(向对照幼虫饲喂的1/3量的酵母+微粒(micron)混合物)培养(在第7日转移至6孔平板中)。每日记录蚊子死亡和蜕皮直至第12日。

图8显示随表达3-HKT dsRNA的CC424/pCVAC153克隆所观察到的斑须按蚊(Anopheles stephensi)幼虫死亡率。将20条新孵化的斑须按蚊幼虫在12孔平板中依赖藻类外加1/3酵母+血清微粒(micron)(向对照幼虫饲喂的1/3量的酵母+微粒(micron)混合物)培养(在第7日转移至6孔平板中)。每日记录蚊子死亡和蜕皮直至第12日。幼虫数目/孔(N)＝10，重复数＝2。

图9显示随表达3-HKT dsRNA的CC424/pCVAC150克隆所观察到的斑须按蚊幼虫死亡率。

将20条新孵化的斑须按蚊幼虫在12孔平板中依赖藻类外加1/3酵母+血清微粒(micron)(向对照幼虫饲喂的1/3量的酵母+微粒(micron)混合物)培养(在第7日转移至6孔平板中)。每日记录蚊子死亡和蜕皮直至第12日。幼虫数目/孔(N)＝10，重复数＝2。

图10显示随表达3-HKT dsRNA的CC424/pCVAC145克隆所观察到的斑须按蚊幼虫死亡率。

图11显示随表达3-HKT dsRNA的衣藻叶绿体转化体(CC4147/pCVAC108)所观察到的斑须按蚊幼虫死亡率。

图12显示一致地发现叶绿体转化体108-13和108-15对按斑须按蚊幼虫有毒。

将20条新孵化的斑须按蚊幼虫在12孔平板中依赖藻类外加1/3酵母+血清微粒(micron)(向对照幼虫饲喂的1/3量的酵母+微粒(micron)混合物)培养(在第7日转移至6孔平板中)。每日记录蚊子死亡和蜕皮直至第12日。幼虫数目/孔(N)＝10，重复数＝2。将实验重复2次。

图13显示实时PCR分析的结果，所述实时PCR分析检验存活/死亡的斑须按蚊幼虫和依赖表达3-HKT的转基因衣藻培养的蛹之间的3-HKT转录物水平。图13A显示在依赖克隆108-13和108-15培养的存活幼虫当中所观察的3-HKT转录物水平。图13B显示在源自依赖108-13所培养的幼虫的死亡蛹当中所观察的3-HKT转录物水平。图13C显示在源自依赖108-13、108-15和153-15转基因衣藻克隆所培养的幼虫的死亡蛹当中所观察的3-HKT转录物水平。

发明详述

定义

为了可以更轻易地理解本公开，首先定义某些术语。在发明详述的通篇范围描述额外的定义。如本文中所用，单数形式“一个(a)”、“一种(an)”和“该(the)”包括复数称谓，除非上下文另外清楚地指出。因此，例如，对“一个分子”的指称包括一个或多个此类分子，对“一种试剂”的指称包括一种或多种此类不同的试剂，对“一种抗体”的指称包括一种或多种此类不同的抗体，并且对“该方法”的指称包括对本领域普通技术人员已知的同等步骤和方法的指称，所述同等步骤和方法可以被修改或替换本文所述的方法。

在提供一个值范围的情况下，应当理解，除非上下文明确说明，还具体地披露了在这个范围的上限与下限之间的每个中间值至该下限的十分之一单位。本发明中包括在所述范围内任一所述值或中间值与这个所述范围内任一其他所述值或中间值之间的每个较小范围。这些较小范围的上限和下限可以独立地被包括在该范围内或排除在外，并且在所述较小范围内包含两个界限中任一者、均不包含或均包含这二个界限的情况下，每个范围也包含于本发明中，受所述范围中任何具体排除的界限约束。在所述的范围包括所述界限之一者或两者的情况下，本发明中也包括排除所包括的这些界限的任一者或两者的范围。

术语“约”或“大约”意指处于由本领域技术人员所测定的特定值的可接受误差范围内部，这将部分地取决于怎样度量或测定该值，即，测量系统的界限值。例如，“约”可以意指处于距均值的1或2个标准偏差范围内。或者，“约”可以意指加上或减去至多到20％、优选地至多到10％、更优选地至多到5％的范围。

如本文所用，术语“细胞”、“细胞”、“细胞系”、“宿主细胞”、和“宿主细胞”互换地使用，并且包括动物细胞，并且包括植物细胞、无脊椎动物细胞、非哺乳动物性脊椎动物细胞、昆虫细胞和哺乳动物细胞。全部此类命名均包括细胞群体和子代。因而，术语“转化体”和“转染子”包括原代主题细胞和源自其中的细胞系，无论转移次数是多少。

短语“保守性氨基酸置换”或“保守性突变”指一个氨基酸由具有共同特性另一个氨基酸置换。限定各个氨基酸之间共同特性的功能性方式是分析同源生物的相应蛋白质之间氨基酸变化的归一化频率(Schulz，G.E.和R.H.Schirmer，Principles of Protein Structure(蛋白质结构原理)，Springer-Verlag(德国施普灵格))。根据此类分析，可以定义氨基酸的组，其中组内的氨基酸优先交换彼此，并且因此在它们影响总体蛋白质结构方面彼此最相似(Schulz，G.E.和R.H.Schirmer，Principles of Protein Structure(蛋白质结构原理)，Springer-Verlag)。

以这种方式定义的氨基酸组的例子包括：“由Glu、Asp、Asn；Gln、Lys、Arg和His；Gln、Lys、Arg和His组成的带电荷/极性组；由Pro、Phe、Tyr和Trp组成的“芳香族或环状组”；和由Gly、Ala、Val、Leu；Ile、Met、Ser、Thr和Cys组成“脂族组”。

在每个组内部，也可以鉴定出亚组，例如，带电荷/极性氨基酸可以进一步划分成由Lys、Arg和His组成的“带正电荷亚组”；由Glu和Asp组成的“带负电荷亚组”和由Asn和Gln组成的“极性亚组。芳香族或环状组可以进一步划成由以下亚组组成的亚组：由Pro、His和Trp组成的“氮环亚组”和由Phe和Tyr组成的“苯基亚组”。脂族组可以再划成由以下亚组组成的亚组：由Val、Leu和Ile组成的“大体积脂族非极性亚组”、由Met、Ser、Thr和Cys组成的“脂族轻微极性亚组”和由Gly和Ala组成的“小残基亚组”。

保守性突变的例子包括置换以上亚组内部的氨基酸，例如，Lys替换Arg并且反之亦然，从而可以维持正电荷；Glu替换Asp并且反之亦然，从而可以维持负电荷；Ser替换Thr，从而可以维持游离-OH；Gln替换Asn，从而可以维持游离-NH₂。

术语“控制”或“起到控制作用”在控制昆虫、害虫或侵入性物种或其他生物的语境下，指以下情况的任一种或全：i)抑制生物发挥作用的能力；ii)生物的生存力降低；iii)生物的繁殖率降低；iv)生物的感染性降低；v)抑制生物的正常发育速率；或vi)生物生长速率降低。

如本文所用，术语“抑制”或相关的术语“抑制作用”、“降低”或“降低的”指统计显著的减少。为避免怀疑，这些术语通常指所给出的参数减少至少10％，并且可以包括至少20％减少、30％减少、40％减少、50％减少、60％减少、70％减少、80％减少、90％减少、95％减少、97％减少、99％或甚至100％减少(即，测量的参数是处于零)。

术语“表位标签”指任何抗原决定簇或与目的蛋白编码区融合以使检测或纯化目的蛋白成为可能的任何生物学结构或序列。可以鉴定和纯化此类融合蛋白，例如通过使用表位标签特异性抗体。表位标签的代表性例子包括而不限于His标签(6-组氨酸)、HA标签(血凝素)、V5-标签、c-Myc标签、GST标签和DYKDDDDK。

如本文所用的术语“表达”指核苷酸序列在宿主细胞内部的转录和/或翻译。宿主细胞中所需产物的表达水平可以基于细胞中存在的相应mRNA的量或由选择的序列编码的所需多肽的量确定。例如，从选择的序列中转录的mRNA可以通过RNA印迹杂交、核糖核酸酶RNA保护法、与细胞RNA原位杂交或通过PCR定量。由选择的序列编码的蛋白质可以通过多种方法定量，所述的多种方法包括，但不限于例如针对这种蛋白质的生物学活性的ELISA、蛋白质印迹法、放射免疫测定、免疫沉淀测定，或通过蛋白质的免疫染色，随后FACS分析来定量。

如本文所用，术语“有义”RNA指与下述序列或区段相对应的RNA转录物，其中所述序列或区段由靶基因产生时处于能够由靶细胞翻译成蛋白质的mRNA形式。如本文所用，术语“反义RNA”指与靶生物的细胞中正常产生的mRNA的全部或部分互补的RNA转录物。反义RNA的互补性可以是与特定基因转录物的任何部分，即，在5′非编码序列、3′非翻译序列、内含子或编码序列。

“表达控制序列”是引起编码序列在宿主细胞中表达的DNA调节序列，如启动子、增强子、多腺苷酸化信号、终止子、内部核糖体进入位点(IRES)等。示例性表达控制序列在Goeddel，Gene Expression Technology：Methods inEnzymology(基因表达技术：酶学中的方法)185，Academic Press，San Diego，CA(加利福尼亚州圣地亚哥学术出版社)(1990)中描述。

术语“异源DNA”指已经导入细胞中的DNA，或源自另一来源或来自相同来源但处于不同(即非固有)环境下的核酸分子。

术语“同源性”描述基于数学的序列相似比较结果，其用来鉴定具有相似功能或基序的基因或蛋白质。本发明的核酸和蛋白质序列可以用作“查询序列”以针对公共数据库执行进行检索，以例如鉴定其他家族成员、相关序列或同源物。此类检索可以使用Altschul等人的NBLAST和XBLAST程序(版本2.0)(Altschul等人，(1990)J.Mol.Biol.(分子生物学杂志)215：403-10)进行。BLAST核苷酸检索可以在采用NBLAST程序，评分＝100、字长度＝12的情况下执行，以获得与本发明的核酸分子同源的核苷酸序列。可以用XBLAST程序、评分＝50、字长度＝3进行BLAST蛋白质检索以获得与本发明蛋白质的分子同源的氨基酸序列。为了出于比较目的获得空位比对结果，可以使用空位BLAST，如Altschul等人，(1997)Nucleic Acids Res.(核酸研究)25(17)：3389-3402中所述。当使用BLAST和空位BLAST程序时，可以使用相应程序(例如，XBLAST和BLAST)的默认参数。

术语“同源的”指拥有“共同进化起源的两种蛋白质之间的关系”，所述蛋白质包括相同动物物种中来自超家族的蛋白质(例如，免疫球蛋白超家族)，以及来自不同动物物种的同源蛋白(例如，肌球蛋白轻链多肽等；见Reeck等人，Cell(细胞)，50：667，1987)。此类蛋白质(和它们的编码核酸)具有序列同源性，若其序列相似性所反映，无论就同一性百分比而言或因存在特定残基或基序和保守位置。

如本文所用，术语“增加”或相关的术语“增加的”、“增强”或“增强的”指统计显著的增加。为避免怀疑，该术语通常指所给出参数的至少10％增加，并且可以包括超过对照值的至少20％增加、30％增加、40％增加、50％增加、60％增加、70％增加、80％增加、90％增加、95％增加、97％增加、99％或甚至100％增加。

当用来描述蛋白质或核酸时，术语“分离的”意指已经将所述物质鉴定并且与其天然环境的组分分离和/或从其中回收。其天然环境的杂质组分是一般将干扰该蛋白质或核酸的研究、诊断性或治疗性用途的物质，并且可以包括酶、激素和其他蛋白质溶质或非蛋白质溶质。在一些实施方案中，将所述蛋白质或核酸纯化到至少95％均匀性，如通过在非还原性或还原性条件下使用考马斯蓝或优选地银染色法的SDS-PAGE所评估。分离的蛋白质包括在重组细胞内部在原位的蛋白质，因为目的蛋白的天然环境的至少一种组分将不存在。然而，一般将通过至少一个纯化步骤制备分离的蛋白质和核酸。

如本文所用，“同一性”意指当比对两个或更多个序列以使序列匹配最大化，即计入空位和插入时，在所述序列中相应位置处的相同核苷酸或氨基酸残基的百分比。可以通过已知的方法轻易计算同一性，所述方法包括但不限于在(Computational Molecular Biology(计算分子生物学)，Lesk，A.M.编著，OxfordUniversity Press(牛津大学出版社)，New York(纽约)，1988；Biocomputing：Informatics and Genome Projects(计算机的运作：情报学和基因组计划)，Smith，D.W.编著，Academic Press(学术出版社)，New York(纽约)，1993；ComputerAnalysis of Sequence Data(序列数据的计算机分析)，第I部分，Griffin，A.M.和Griffin，H.G.编著，Humana Press(人类出版社)，New Jersey(新泽西)，1994；Sequence Analysis in Molecular Biology(分子生物学中的序列分析)，von Heinje，G.，Academic Press(学术出版社)，1987；及Sequence Analysis Primer(序列分析引物)，Gribskov，M.ereux，J.编著，M Stockton Press(斯托克顿出版社)，NewYork(纽约)，1991；以及Carillo，H.和Lipman，D.，SIAM J.Applied Math.(应用数学杂志)，48：1073(1988)中描述那些方法。将确定同一性的方法设计成在所检验序列之间产生最大匹配。另外，确定同一性的方法编纂于中公众可获得的计算机程序中。

可以通过以下方式实施用于比较的最佳序列比对，例如，通过1981年Smith和Waterman中所述的局部同源性算法、通过1970年Needleman和Wunsch中所述的同源性比对算法、通过1988年Pearson和Lipman中所述的相似性检索方法、通过这些算法的计算化实施(GCG Wisconsin软件包中的GAP、BESTFIT、PASTA和TFASTA，从美国加利福尼亚州圣迭戈Accelrys，Inc.可获得)或通过目视审查。总体上见(Altschul，S.F.等人，J.Molec.Biol.215：403-410(1990)和Altschul等人，Nuc.Acids Res.(核酸研究)25：3389-3402(1997))。

适用于确定序列同一性和序列相似性百分数的算法的一个例子是BLAST算法，所述算法在Altschul，S.等人，NCBI NLM NIH(美国国家生物技术信息中心)Bethesda，Md(美国马里兰州贝塞斯达).20894；和Altschul，S.等人，J.Mol.Biol.215：403-410(1990)中描述。用于进行BLAST分析的软件是通过国家生物技术信息中心可公开获得的。这种算法涉及首先通过查询序列中长度W的短字鉴定高评分序列对(HSP)，其中所述短字与数据库序列中具有相同长度的字比对时匹配或满足某些正值阈评分T。将T称作相邻字评分阈值。

这些初始邻居字命中充当启动检索的种子以发现含有这些种子的更长HSP。所述字命中随后在两个方向沿每个序列尽可能远地延伸，只要可以提高累积比对评分。对于核苷酸序列，使用参数M(一对匹配残基的报酬评分；总是＞0)和N(错配残基的的惩罚评分；总是＜0)计算累积评分。对于氨基酸序列，使用评分矩阵来计算累积评分。字命中在每个方向上的延伸在以下情况时停止：-27累积比对评分从其最大实现值跌落达量X，累积评分因积累一个或更多负评分残基比对比对结果而达到或低于零；或抵达两个序列二者之一的末端。BLAST算法参数W、T和X决定比对的灵敏度和速度。BLASTN程序(对于核苷酸序列)使用字长度(W)11、期望(E)10、临界值100、M＝5、N＝-4和两条链的比较作为默认。对于氨基酸序列，BLASTP程序使用字长度(W)3、期望(E)10和BLOSUM62评分矩阵作为默认。

除计算序列同一性百分数之外，BLAST算法也进行两个序列之间相似性的统计分析。由BLAST算法提供的相似性的一种度量是最小总和概率(P(N))，其提供两个核苷酸序列或氨基酸序列之间的匹配会因偶然发生的概率指示。例如，如果在测试核酸序列与参考核酸序列比较中的最小总和概率在一个实施方案中小于约0.1、在另一个实施方案小于约0.01，并且在仍另一个实施方案中小于约0.001，则将认为测试核酸序列与参考核酸序列相似。

如本文中可互换使用的术语“有效连接”和“有效连接的”指将两个或更多个核苷酸序列或序列元件以允许它们按照意图方式发挥作用的方式安置。在一些实施方案中，本发明的核酸分子包括与编码重组蛋白的核苷酸序列有效连接的能够使染色质开放和/或维持染色质处于开放状态的一个或多个DNA元件。在其他实施方案中，核酸分子可以额外地包括一个或多个核苷酸序列，其选自：(a)能够增加翻译的核苷酸序列；(b)增加重组蛋白分泌于细胞外部的核苷酸序列；和(c)能够增加mRNA稳定性的核苷酸序列，其中此类核苷酸序列与编码重组蛋白的核苷酸序列有效连接有效连接。通常但不必然地，有效连接的核苷酸序列是连续的，并且根据需要，是符合可读框的。然而，虽然有效连接的能够使染色质开放和/或维持染色质处于开放状态的DNA元件通常位于编码重组蛋白的核苷酸序列上游；但是它不需要与该核苷酸序列连续。通过本领域熟知的重组方法，例如使用PCR方法，通过在适宜的限制性位点处连接或通过复性，完成多种核苷酸序列的有效连接。如果合适的限制性位点不存在，可以根据常规惯例使用合成性寡核苷酸接头或衔接子。

术语“多核苷酸”、“核苷酸序列”和“核酸”在本文中可互换地使用，指任何长度的聚合物形式的核苷酸，无论是核糖核苷酸或是脱氧核糖核苷酸。这些术语包括但单链、双链或三链的DNA、基因组DNA、cDNA、RNA、DNA-RNA杂合体或包含嘌呤和嘧啶碱基，或其他天然的、化学的、生物化学修饰的、非天然或衍生化核苷酸碱基的聚合物。多核苷酸的骨架可以包含糖和磷酸酯基团(如一般可以在RNA或DNA中找到)或修饰或取代的糖或磷酸酯基团。此外，双链多核苷酸可以通过合成互补链并且使该链在适宜的条件下复性或通过使用DNA聚合酶以适宜的引物从头合成互补链而从化学品合成的单链多核苷酸产物获得。核酸分子可以采取许多不同的形式以下是多核苷酸的非限制性例子：基因或基因片段、一个或多个外显子、一个或多个内含子、mRNA、tRNA、rRNA、核酶、cDNA、重组多核苷酸、支化多核苷酸、质粒、载体、任意序列的分离DNA、任意序列的分离RNA、核酸探针和引物。多核苷酸可以包含修饰的核苷酸(如甲基化核苷酸)与核苷酸类似物、尿嘧啶(uracyl)、其他糖及连接基团如氟代核糖(fluororibose)与硫代酯(thioate)和核苷酸分支(nucleotidebranche)。如本文所用，多核苷酸不仅包括天然存在的碱基A、T、C和G，还包括以下情况的任一者：这些碱基的类似物或修饰形式如甲基化核苷酸、核苷酸间修饰如不带电荷的连接和硫代酯、糖类似物的使用、修饰的和/或替代性骨架结构如聚酰胺。

“启动子”是能够在细胞中结合RNA聚合酶并且启动下游(3′方向)编码序列转录的DNA调节区。如本文所用，启动子序列在其3′末端由转起始位点结合并且向上游(5′方向)延伸以包括最少数目的为了以高于背景的可检测水平启动转录所需要的碱基或元件。转录起点(通过用核酸酶S1作图便利地限定)可以存在于启动子序列以及负责结合RNA聚合酶的蛋白质结合结构域(共有序列)内部。除-10和-35共有序列之外，原核启动子还含有夏因-达尔加诺序列(Shine-Dalgarno sequence)。

本领域熟知来自多种不同来源的众多启动子，包括组成型、诱导型和阻遏型启动子。代表性来源包括例如，病毒、哺乳动物、昆虫、植物、酵母和细菌细胞类型，并且源自这些来源的合适启动子是轻易地可获得的，或可以基于在线或例如从保藏中心如ATCC以及其他商业或个人来源可公共获得的序列合成地产生。启动子可以是单向的(即，以一个方向启动转录)或双向的(即，以3′或5′方向启动转录)。在植物中有活性的启动子的非限制性例子包括例如根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)的肿瘤诱导质粒上所携带的胭脂碱合酶(nos)启动子和章鱼碱合酶(ocs)启动子和花椰菜花叶病毒属启动子如花椰菜花叶病毒(CaMV)19S或35S启动子(美国专利号5,352,605)、带有重复的增强子的CaMV35S启动子(美国专利号5,164,316；5,196,525；5,322,938；5,359,142；和5,424,200)和玄参花叶病毒(FMV)35S启动子(美国专利号5,378,619)。这些启动子和众多其他启动子已经在产生用于植物或植物细胞中转基因表达的构建体中使用。其他有用的启动子例如在美国专利号5,391,725；5,428,147；5,447,858；5,608,144；5,614,399；5,633,441；6,232,526；和5,633,435中描述，所述专利均通过引用方式并入本文。

如本文所用的术语“纯化”指已经在减少或消除无关物质即杂质存在的条件下分离的物质，所述杂质包括从其中获得所述物质的天然物质。例如，纯化的蛋白质优选地基本上不含在细胞中与该蛋白质结合的其他蛋白质或核酸。用于纯化的方法是本领域熟知的。如本文所用，术语“基本上不含”在该物质的分析性检定情况下以操作方式使用。优选地，基本上不含杂质的纯化物质是至少50％纯的；更优选地是至少75％纯的，并且仍更优选地是至少95％纯的。可以通过色谱法、凝胶电泳、疫测定法、组成分析法、生物学测定法和本领域已知的其他方法评估纯度。术语“基本上纯的”表示可以使用本领域已知的常规纯化技术实现的最高程度的纯度。

如本文所用，术语“核糖核酸”或“RNA”指包含至少一个核糖核苷酸残基的分子。“核糖核苷酸”意指在f-D-核糖呋喃糖部分的2′位置具有羟基的核苷酸。该术语包括双链RNA，单链RNA，具有双链区域和单链区域的RNA，分离的RNA如部分纯化的RNA、实质上纯的RNA、合成RNA、重组产生的RNA，以及改变的RNA，或因添加，缺失，置换和/或改变一个或多个核苷酸而与天然存在的RNA不同的RNA类似物。这类种改变可以包括添加非核苷酸物质，如向RNA的末端或在内部例如在该RNA的一个或多个核苷酸处添加。在目前公开的主题的RNA分子中的核苷酸也可以包括非标准核苷酸，如非天然存在的核苷酸或化学合成的核苷酸或脱氧核苷酸。这些改变的RNA可以称作类似物或天然存在的RNA的类似物。

如本文所用，术语“RNA转录物”指因RNA聚合酶催化的DNA序列转录产生的产物。当RNA转录物是所述DNA序列的完全互补副本时，将它称作初级转录物或它可以是源自初级转录物转录后加工的RNA序列并且称作成熟RNA。

如本文所用，短语“双链RNA”或“dsRNA”指一种RNA分子，其至少一部分处于Watson-Crick碱基配对，从而形成双链体。就这一点而论，将该术语理解为包括完全或仅部分成双链的RNA分子。示例性双链RNA包括但不限于包含至少两条不同RNA链的分子，所述tRNA链通过分子间杂交部分地或完全形成双链体。额外地，该术语意在包括可以通过分子内杂交形成双链区域(例如，发夹)的单个RNA分子。因此，如本文所用，短语“分子间杂交”和“分子内杂交”指双链分子，对所述双链分子而言，参与双链体形成的核苷酸分别在不同分子或相同分子上存在。

术语“序列相似性”指在可以或可以不共有共同进化起源的核酸或氨基酸序列之间的统一性或对应性的程度(见Reeck等人，上文)。然而，在常见用途中并且在本申请中，术语“同源的”当以副词如“高度地”修饰时，可以指序列相似性并且可以或可以不涉及共同进化起源。

在具体实施方案中，如已知的序列比较算法如BLAST、FASTA、DNAStrider、CLUSTAL等所确定，当至少约85％和更优选地至少约90％或至少约95％d核苷酸在限定长度的核酸序列范围内匹配时，两个核酸序列是“基本上同源的”或“基本上相似的。这种序列的例子是本发明特定基因的等位性或物种变体。也可以通过杂交，例如在例如相对于这个特定系统所定义的严格条件下在DNA印迹杂交实验中鉴定出基本上同源的序列。

术语“特异的”适用于这样一种情况，其中特异性结合对的一个成员将不显示与除其特异性结合配偶物之外的分子的任何明显结合。改术语是适用于这样一种情况，其中两条互补性多核苷酸链可以复性在一起，然而每条单链多核苷酸在严格杂交条件下显示与另一个多核苷酸序列少量结合或不结合。

类似地，在本发明的实施方案中，当多于90％的氨基酸残基相同时，两个氨基酸序列是“基本上同源的”或“基本上相似的。当多于约95％的氨基酸残基相似时，两个序列是功能上相同。优选地，通过使用例如GCG(GeneticsComputer Group(遗传学电脑集团)，第7版，Madison，Wis.(威斯康辛州麦迪逊市))堆积(pileup)程序或使用上述任何程序和算法比对，鉴定到相似或同源的多肽序列。所述程序可以使用Smith和Waterman局部同源性算法，采用默认值：空位产生罚分＝-(1+1/k)，k是空位延伸数目，平均匹配＝1，平均错配＝-0.333。

术语“转化”或“转染”指将一个或多个核酸分子转移至宿主细胞或生物中。将核酸分子导入宿主细胞中的方法包括例如磷酸钙转染法、DEAE-葡聚糖介导转染法、微量注射法、阳离子脂类介导转染法、电穿孔法、划痕负载法(scrapeloading)、射弹导入法或用病毒或其他感染介质感染法。

在细胞的背景下，“转化的”、“转导的”或“转基因的”指已经导入有重组或异源核酸分子(例如，一个或多个DNA构建体或RNA或siRNA对应物)的宿主细胞或生物。核酸分子可以稳定地表达(即，以有功能的形式在细胞中维持超过约三个月)或以有功能的形式在细胞中非稳定地维持不足三个月，即，瞬时表达。例如，“转化的”、“转化体”、和“转基因”细胞已经经历转化过程并且含有外来核酸分子。术语“未转化的”指未经历转化过程的细胞。

除非另外说明，否则本发明的实施将采用化学、分子生物学、微生物学和重组DNA和免疫学的常规技术，这些技术属于本领域普通技术人员的能力范围。文献中解释了此类技术。见例如，J.Sambrook，E.F.Fritsch和T.Maniatis，1989，Molecular Cloning：A Laboratory Manual(分子克隆实验手册)，第2版，1-3卷，Cold Spring Harbor Laboratory Press(冷泉港实验出版社)；Ausubel，F.M.等人.(1995年和定期增补内容；Current Protocols in Molecular Biology(现代分子生物学实验指南)，第9、13和6章，John Wiley&Sons(约翰威立国际出版公司)，New York，N.Y.(纽约))；B.Roe，J.Crabtree和A.Kahn，1996，DNAIsolation and Sequencing：Essential Techniques(DNA分离和测序：基本技术)，John Wiley&Sons；J.M.Polak和James O′D.McGee，1990，In Situ Hybridization：Principles and Practice(原位杂交：原理和实践)；Oxford University Press(牛津大学出版社)；M.J.Gait(编辑)，1984，Oligonucleotide Synthesis：A PracticalApproach(寡聚核苷酸合成：实用的途径)，Irl Press；D.M.J.Lilley和J.E.Dahlberg，1992，Methods of Enzymology：DNA Structure Part A：Synthesis andPhysical Analysis of DNA Methods in Enzymology(酶学方法：DNA结构部分A：酶学中DNA方法的合成和物理分析)，Academic Press(学术出版社)；TheChlamydomonas Sourcebook(衣藻资料读物)，第2版，2008年11月出版(版权日2009年).从Elsevier Science and Technology(Elsevier科学与技术)可获得；Transgenic Microalgae as Green Cell Factories(转基因微藻作为绿色细胞工厂).Advances in Experimental Medicine and Biology(实验药学和生物学进展)，第616卷.Rosa León，Aurora Galván和Emilio Fernández编著，2007年Landes Bioscience and Springer Science_Business Media(朗德斯生物科学和施普林格科学-商业媒介)，LLC，New York(纽约)出版；The Molecular Biologyof Chloroplasts and Mitochondria in Chlamydomonas(衣藻中叶绿体和线粒体的分子生物学)，Jean-David Rochaix编著，Michel Goldschmidt-Clermont andSabeeha Merchant，Kluwer Academic Publishers出版；及实验室参考书：AHandbook of Recipes，Reagents and Other Reference Tools for Use at the Bench(关于配方、试剂和其他参考工具的使用手册)，Jane Roskams和Linda Rodgers编著，2002，Cold Spring Harbor Laboratory(冷泉港实验室)，ISBN0-87969-630-3。这些通用教材的每一部通过引用的方式并入本文。

除非另外规定，否则本文中所用的全部术语及科学术语具有与本发明所属领域的技术人员通常理解的相同意义。尽管与本文所述的那些方法、组合物、试剂、细胞相似或等效的任意方法、组合物、试剂、细胞可以用于实施或检验本发明中，然而在此描述优选的方法和材料。

上文所讨论的公布内容仅提供用于本申请的提交日期之前它们的公开。本文中任何内容均不得解释为承认由于在先发明而不授予本发明早于这种公布的权利。

将本说明书中引用的全部出版物和参考文献，包括但不限于专利和专利申请，通过引用方式完整并入本文，如同特别地和逐一地指明，将每份单独的出版物或参考文献通过引用方式如充分所述那样并入本文。本申请要求优先权的任何专利申请也通过引用的方式以针对出版物和参考文献上述的方式完整并入本文。

方法的概述

本发明包括使用植物和微藻控制寄生体和病原体的方法。在多种实施方案中，本发明包括以下方法：

一种递送siRNA至宿主生物的方法，所述方法包括步骤i)提供植物，所述植物包含在植物的叶绿体中表达的沉默性核糖核酸，和ii)将所述植物饲喂给所述宿主生物。

一种调节靶基因在宿主生物中表达的方法，所述方法包括步骤i)提供植物，所述植物包含在植物的叶绿体中表达的沉默性核糖核酸，其中所述沉默性RNA是对所述宿主生物的靶基因特异的；和ii)将所述植物饲喂给所述宿主生物。

一种保护宿主生物免遭寄生体或病原体影响的方法，所述方法包括步骤：i)提供植物，所述植物包含在植物的叶绿体中表达的沉默性核糖核酸，其中所述沉默性RNA是对所述寄生体或病原体的靶基因特异的；ii)将所述植物饲喂给所述宿主生物。

一种用于控制采食植物的害虫的方法，其包括步骤i)提供植物，所述植物包含在植物的叶绿体中表达的沉默性核糖核酸，其中所述沉默性RNA是对所述害虫的靶基因特异的；和ii)将所述植物提供给所述害虫。

一种用于控制昆虫的方法，所述方法包括：i)提供包含沉默性核糖核酸的微藻，所述沉默性核糖核酸在摄入所述微藻后发挥作用以抑制所述昆虫的靶基因的表达，其中所述靶基因的表达是对所述昆虫的功能、生长、发育、感染性或繁殖必需的，其中所述沉默性核糖核酸包含有义RNA链和反义RNA链，其中所述有义和反义RNA链形成RNA双链体，并且其中所述有义RNA链包含与靶基因中至少约20个连续核苷酸的靶序列基本上相同的核苷酸序列；并且ii)将所述微藻导入所述昆虫的栖息地中，其中所述昆虫或其幼虫形式摄入所述微藻。

一种抑制靶基因在昆虫中表达的方法，所述方法包括：i)提供包含沉默性核糖核酸的微藻，所述沉默性核糖核酸在摄入所述微藻后发挥作用以抑制寄生体或病原体的靶基因的表达，其中所述靶基因的表达是昆虫存活必需的，其中所述沉默性核糖核酸包含有义RNA链和反义RNA链，其中所述有义和反义RNA链形成RNA双链体，并且其中所述有义RNA链包含与靶基因中至少约20个连续核苷酸的靶序列基本上相同的核苷酸序列；并且ii)将所述微藻饲喂给所述昆虫或其幼虫形式。

一种用于保护以微藻为食的宿主生物免遭寄生体和病原体感染的方法，所述方法包括：i)提供包含沉默性核糖核酸的微藻，所述沉默性核糖核酸在所述微藻由所述宿主生物、寄生体或病原体摄入后发挥作用以抑制所述寄生体或病原体的靶基因的表达，其中所述靶基因的表达是对所述寄生体或病原体的功能、生长、发育、感染性或繁殖必需的，其中所述沉默性核糖核酸包含有义RNA链和反义RNA链，其中所述有义和反义RNA链形成RNA双链体，并且其中所述有义RNA链包含与靶基因中至少约20个连续核苷酸的靶序列基本上相同的核苷酸序列；并且ii)将所述微藻饲喂给所述宿主生物。

一种抑制靶基因在侵袭宿主生物的病原体或寄生体中表达的方法，所述方法包括：i)提供包含沉默性核糖核酸的微藻，所述沉默性核糖核酸在所述微藻由宿主生物、寄生体或病原体摄入后发挥作用以抑制所述寄生体或病原体的靶基因的表达，其中所述靶基因的表达是对所述寄生体或病原体的功能、生长、发育、感染性或繁殖必需的，其中所述沉默性核糖核酸包含有义RNA链和反义RNA链，其中所述有义和反义RNA链形成RNA双链体，并且其中所述有义RNA链包含与靶基因中至少约20个连续核苷酸的靶序列基本上相同的核苷酸序列；并且ii)将所述微藻饲喂给所述宿主生物。

一种用于控制侵入性物种的方法，所述方法包括：i)提供包含沉默性核糖核酸的微藻，所述沉默性核糖核酸在摄入所述微藻后发挥作用以抑制所述侵入性物种的靶基因的表达，其中所述靶基因的表达是对所述侵入性物种的功能、生长、发育、感染性或繁殖必需的，其中所述沉默性核糖核酸包含有义RNA链和反义RNA链，其中所述有义和反义RNA链形成RNA双链体，并且其中所述有义RNA链包含与靶基因中至少约20个连续核苷酸的靶序列基本上相同的核苷酸序列；并且ii)将所述微藻导入所述侵入性物种的栖息地中，其中所述侵入性物种或其幼虫形式摄入所述微藻。

一种抑制靶基因在侵入性物种中表达的方法，所述方法包括：i)提供包含沉默性核糖核酸的微藻，所述沉默性核糖核酸在摄入所述微藻后发挥作用以抑制所述寄生体或病原体的靶基因的表达，其中所述靶基因的表达是对所述侵入性物种的存活必需的，其中所述沉默性核糖核酸包含有义RNA链和反义RNA链，其中所述有义和反义RNA链形成RNA双链体，并且其中所述有义RNA链包含与靶基因中至少约20个连续核苷酸的靶序列基本上相同的核苷酸序列；并且ii)将所述微藻饲喂给所述侵入性物种或其幼虫形式。

I.核糖核酸

本发明利用双链短RNA分子调节细胞基因表达(一种称作RNA干扰(RNAi)或转录后基因沉默(PTGS)的过程)的能力。总体上见，PCT国际公开号WO99/32619WO99/07409、WO00/44914.WO00/44895、WO00/63364WO00/01846、WO01/36646、WO01/75164、WO01/29058、WO02/055692、WO02/44321、WO2005/054439和WO2005/110068。在一个方面，本发明涉及植物包括(微藻)的用途，所述植物表达沉默性核糖核酸以抑制摄入所述植物的寄生体或病原体中的基因表达。在一个方面，沉默性RNA在植物的叶绿体中表达。

术语“沉默性RNA”或“沉默性核糖核酸”指一旦向宿主细胞中、优选地在病原体或寄生体中导入则能够直接或在细胞加工后介导RNA干扰(RNAi)或转录后基因沉默以减少病原体或寄生体中靶基因表达的任何RNA分子。

这类种沉默性RNA包括例如RNAi(抑制性RNA)、dsRNA(双链RNA)、siRNA(小干扰性RNA)和miRNA(微RNA)。这种沉默作用可以例如是所谓“反义RNA”，因而所述RNA分子包含与靶核酸的序列、优选靶基因的编码序列的互补物具有至少95％序列同一性的至少约20个连续核苷酸的序列。然而，反义RNA也可以针对靶基因的调节序列，包括启动子序列和转录终止信号和多聚腺苷化信号。沉默性RNA还包括所谓“有义RNA”，因而所述RNA分子包含与靶核酸的序列具有至少95％序列同一性的至少约20个连续核苷酸的序列。

在又一个方面，沉默性RNA包括dsRNA，所述dsRNA包括能够通过碱基配对作用在分别与靶序列互补和同源的反义RNA核苷酸序列和有义RNA核苷酸序列之间形成双链RNA的RNA。这类种双链RNA(dsRNA)也称作发夹RNA(hpRNA)。

添加dsRNA至植物或动物细胞刺激了酶DICER(一种核糖核酸酶III样酶)的活性。DICER催化dsRNA降解成称作小干扰性RNAsiRNA的短段dsRNA(Hannon和Rossi，(2004)Nature431371-378)。因DICER介导的降解产生的小干扰性RNA通常地具有约21-23个核苷酸长度并且含有约19个碱基对双链体。在降解后，siRNA掺入核酸内切酶复合体(称作RNA诱导性沉默复合体(RISC))中。RISC能够介导细胞内部存在的与siRNA双链体的反义链互补的单链RNA裂解并且介导翻译性阻遏，或者诱导染色质修饰。

因此，在要求保护的发明的一个方面，沉默性RNA包括具有一个或多个环结构和茎的核糖核苷酸，所述茎包含自身互补的有义区和反义区，其中反义区包含与靶核酸分子的区域互补的序列，并且其中所述多核苷酸可以在体内或体外经加工以产生能够介导RNAi的活性siRNA。

在要求保护的发明的另一个方面，沉默性RNA可以在后摄入表达沉默性RNA的植物或微藻，在宿主生物的细胞内部原位加工，以便产生能够抑制宿主生物的病原体或寄生体的靶基因表达的siRNA分子。可以通过使用宿主细胞或者病原体或寄生体的内源性DICER酶和/或RNA酶III细胞装置，完成这种酶促过程。

在要求保护的发明的另一个方面，沉默性RNA可以在后摄入表达沉默性RNA的植物或微藻，在病原体或寄生体的细胞内部原位加工，以便产生能够抑制所述病原体或寄生体的靶基因表达的siRNA分子。可以通过使用病原体或寄生体的内源性DICER酶和/或RNA酶III细胞装置，完成这种酶促过程。

在这些发明中的任一项中，取决于基因的长度，与靶核酸分子的区域互补的序列可以包含至少约20-100个核苷酸长度或可选地至少约100-200个核苷酸长度、至少200-400约个核苷酸长度、或至少约400-500个核苷酸长度、或至少约500-1000个碱基的核苷酸序列。一般地，可以使用约200至600个核苷酸的序列。

在这些发明中任一项的一个方面，与靶核酸分子的区域互补的序列与靶基因的一部分相同。在另一个方面，与靶核酸分子的区域互补的序列与靶基因的一部分共享至少80序列同一性百分数。在另一个方面，与靶核酸分子的区域互补的序列与靶基因的一部分共享至少85序列同一性百分数。在另一个方面，与靶核酸分子的区域互补的序列与靶基因的一部分共享至少90序列同一性百分数。在另一个方面，与靶核酸分子的区域互补的序列与靶基因的一部分共享至少95序列同一性百分数。因此在这些发明中任一项中，沉默性RNA可以不需要与靶基因完全相同，并且相对于靶基因mRNA不需要是全长的。

在这些发明的另一个实施方案中，本发明的沉默性RNA可以包含由“间隔序列”分隔的反向重复序列。在要求这种序列的情况下，间隔序列可以是包含促进每个重复序列之间形成二级结构的任何核苷酸序列的区域。在本发明的一个实施方案中，间隔序列是mRNA的有义或反义编码序列的部分。间隔序列可以可选地包含能够与核酸分子共价连接的核苷酸或其同源物的任何组合。间隔序列可以包含至少约10-100个核苷酸长度、或可选地至少约100-200个核苷酸长度、至少约200-400个核苷酸长度、或至少约400-500个核苷酸长度的核苷酸序列。在一个方面，间隔序列可以包含内含子。

沉默性RNA可以在体内或体外合成。沉默性RNA可以通过单一自身互补RNA链或从两条互补RNA链形成。细胞的内源RNA聚合酶可以介导体内转录，或克隆的RNA聚合酶可以用于体内或体外转录。RNA链可以聚腺苷酸化或可以不聚腺苷酸化；RNA链可以由细胞翻译装置翻译成多肽或不能够由其翻译成多肽。

本发明的RNA、dsRNA、siRNA或miRNA也可以由本领域技术人员通过手工反应或自动化反应化学地或酶促地产生或在另一种生物中在体内产生。也可以通过部分或完全有机合成产生RNA；可以通过体外酶合成或有机合成导入任何修饰的核糖核苷酸。RNA可以由细胞RNA聚合酶或噬菌体RNA聚合酶(例如，T3、T7、SP6)合成。表达构建体是用途和产生是本领域已知的(见例如，WO97/32016；美国专利号5,593,874、5,698,425、5,712,135、5,789,214和5,804,693)。

如果化学合成或通过体外酶促合成，则RNA可以在导入细胞之前进行纯化。例如，RNA可以通过用溶剂或树脂提取、沉淀、电泳、色谱或其组合从混合物中纯化出来。可选地，RNA可以在不纯化或最少纯化的情况下使用以避免因样品加工所致的损失。可以将RNA干燥以便储存或溶解于水溶液中。这种溶液可以含有缓冲剂或盐以促进双链体链的复性和/或稳定。

在本发明的一些方面，可以通过以下方式修饰沉默性RNA以便改善siRNA分子的稳定性或活性：修饰糖磷酸酯主链或用至少一种氮或硫杂原子置换核苷(见PCT WO00/44914和WO01/68836)或使用2′-氨基或2′-O-甲基核苷酸和含有2′-O或4′-C亚甲基桥的核苷酸(加拿大专利申请号2,359,180)。

在本发明的一些方面，通过从体内转基因或表达构建体转录产生沉默性RNA，如下文更充分地描述。

II.靶基因

用于本发明中的靶基因可以包括例如在病原体，寄生体或害虫的生存力、生长、发育、繁殖和感染性方面发挥重要作用的那些。这些靶基因可以是以下之一：持家基因、转录因子和病原体特异性基因或在病原体、寄生体或害虫的一个或多个模式生物中已知的致死性敲除突变之一。

靶基因也可以基于它们的周转速率来选择，其中预期RNAi介导的表达抑制作用将导致蛋白质水平快速下降。在其他情况下，有利的是选择其表达水平的微小降低导致有害作用的基因。如果需要靶向宽范围的物种，则选择在这些物种之间高度保守的基因。反过来，出于赋予特异性的目的，在本发明的某些实施方案中，选择这样的基因，所述基因含有在各个物种之间或在病原体和其他生物之间保守不良的区域。在某些实施方案中，需要选择在其他生物中没有已知同源物的基因。

在控制昆虫的情况下，在一个实施方案中，选择在昆虫肠道中表达的基因。靶向肠道中表达的基因避免要求dsRNA在昆虫内部扩散。在另一个实施方案中，选择实质上参与昆虫的功能、生长、发育和繁殖的基因。示例性基因包括但不限于CHD3基因、13-微管蛋白基因和3-羟基羟犬尿氨酸转氨酶基因。

实施本发明时优选使用这些DNA区段，其序列与对应于靶基因或编码序列的序列显示出从至少约80％开始的同一性或从至少90％开始的同一性或至少从95％开始的同一性，或至少从98％开始的同一性，或至少约100％同一性。用于本发明中的的DNA区段是至少约19个至约23个，或约23个至约100个核苷酸长度，但是小于约2000个核苷酸长度。通常在这些条件下，抑制作用是对靶基因特异，并且不相关基因的表达不受影响。这种特异性允许选择性靶向病害物种，对暴露本发明组合物的其他生物不产生影响。

本发明是不限于本文所述的具体基因，反而包括抑制之将对病原体、寄生体或害虫产生有害作用的任何基因。

对于作为受本发明控制的潜在靶的许多这类病原体、寄生体或害虫而言，关于大多数基因的序列或因特定基因的突变产生的表型的信息可能是有限的。因此，本发明人构思可以通过以下方式完成从病原体、寄生体或害虫选择用于本发明中的适宜基因：使用随机、半随机或理性文库筛选方案以鉴定具有抑制病原体、寄生体或其媒介的生长、发育、感染性或繁殖的能力的核苷酸序列。

因此在一个实施方案中，本发明也包括多核苷酸文库和用于在微藻中筛选这类文库以鉴定核苷酸序列的方法，所述核苷酸序列具有选择性抑制位于病原体或寄生体或所述病原体或寄生体的媒介内部的靶基因表达的能力。

因此，在另一个实施方案中，本发明包括一种用于制造将有效控制消费微藻的生物沉默性RNA的方法，所述方法包括：

i)合成编码许多一种或多种目的RNA种类的多核苷酸文库；

iv)在转化的微藻群体内部鉴定一种细胞或多种细胞，所述细胞表达能够控制消费微藻的生物的功能、生长、发育、感染性或繁殖的沉默性RNA；

在另一个实施方案中，本发明包括一种用于产生沉默性RNA的方法，所述沉默性RNA将有效用于保护以植物和/或微藻为食的宿主生物免遭寄生体和病原体感染，所述方法包括：

i)合成编码许多一种或多种目的RNA种类的多核苷酸文库；

vi)在转化的微藻群体内部鉴定一种细胞或多种细胞，所述细胞表达能够在微藻由宿主生物摄入后控制寄生体或病原体的功能、生长、发育、感染性或繁殖的沉默性RNA；

vii)从步骤iv)中鉴定的所述细胞或多个细胞建立一个或多个细胞克隆群体)。

本发明中还包括一种用于选择用于沉默性RNA中的核苷酸序列的方法，所述沉默性RNA用于在微藻和/或植物中表达以便控制昆虫，所述方法包括步骤；

ii)将所述转化的微藻饲喂给所述寄生体或病原体；

一种用于选择用于沉默性RNA中的核苷酸序列的方法，所述沉默性RNA用于保护以微藻和植物为食的宿主生物免遭寄生体和病原体感染，所述方法包括步骤：

ii)将所述转化的微藻饲饲喂给所述宿主生物；

在这些方法的任一种中，使用两个会聚启动子来驱动两条RNA链从单一随机化的核苷酸序列中表达，可以产生含有沉默性RNA的全部可能排列的全部或子集的质粒文库。用于产生和设计随机、半随机和理性设计的多核苷酸文库的众多方法是本领域已知的(见例如Theis和Buchholz F.(2010)J Vis Exp.(可视化实验杂志)12；(39).pii：2008.doi：10.3791/2008.PMID；Mei等人，(2007).Curr Opin Chem Biol.(化学生物学新见)；11(4)：388-93；Krausz E.(2007)MolBiosyst.(分子生物系统)3(4)：232-40；Lützelberger和Kjems(2006)Handb ExpPharmacol.(实验药理学手册)(173)：243-59；Chen等人，PNAS102(7)2356-2361。

在这些方法中任一方法的一个方面，将表达载体转化入微藻群体以产生能够进行高效筛选的微藻表达文库。在一个方面，将表达载体转化入微藻的叶绿体。

III.表达载体

在目前公开的主题的另一个方面，沉默性RNA分子从插入核酸载体(可选地，通常称作“重组载体”或“表达载体”)中的转录单元表达。

因此，在一个实施方案中，用于产生RNA分子的核苷酸序列可以与在植物中有功能的一个或多个启动子序列有效连接。在一个方面，将核苷酸序列置于正常情况下宿主基因组中固有的内源启动子的控制下。处于有效连接的启动子序列控制下的本发明核糖核酸还可以在旁侧分布着有利影响其转录和/或所产生转录物的稳定性的额外序列。这类序列通常位于有效连接的启动子的上游和或表达构建体3′末端的下游。

在一个方面，编码沉默性RNA的核苷酸序列可以有效连接至并且在旁侧分布有两个启动子以提供所述核苷酸序列的双向转录。

在一个方面，编码沉默性RNA的核苷酸序列可以按反向重复序列的形式存，所述反向重复序列的每个副本与不同启动子可操作地连接。在这个方案的另一个方面，两个反向重复序列可以由间隔序列分隔。在一个方面，间隔序列可以包含内含子。

在这些实施方案的任一个中，载体用来递送编码沉默性RNA的核酸分子至植物细胞中，以便使核糖核酸在植物细胞中表达成为可能。在一个方面，表达载体可以将沉默性RNA的表达导引至特定细胞器，如叶绿体或整个细胞。

在一个方面，表达载体将沉默性RNA的表达导引至微藻的叶绿体。在一个方面，表达载体整合至微藻的叶绿体基因组中。在另一个方面，表达载体将沉默性RNA的表达导引至微藻的整个细胞。在一个方面，表达载体整合至微藻的核基因组中。

重组载体可以例如是DNA质粒或病毒载体。各种表达载体是本领域已知的。可以基于几种因素作出适宜表达载体的选择，所述因素包括但不限于其中需要表达的细胞类型。例如，当寻求植物细胞中载体插入物的稳定表达时，农杆菌表达载体可以用来表达本发明公开的主题的核酸。

启动子表达盒中核苷酸序列的表达可以处于组成型启动子或处于仅在宿主细胞暴露于一些特定外部刺激时才启动转录的诱导型启动子控制下。植物中的基础启动子一般地包含与转录起始相关的规范区域，如CAAT框和TATA框。TATA框元件通常位于转录起始位点上游大约20至35个核苷酸处。CAAT框元件通常位于转录起始位点上游大约40至200个核苷酸处。这些基础启动子元件的位置导致包含翻译起始位点ATG上游的核苷酸的RNA转录物的合成。ATG上游的RNA区域常称作5′非翻译区或5′UTR。可以使用标准分子生物学技术来产生基础启动子(其为包含从CAAT框至翻译起始位点的序列的区域)与增强或否则改变启动子活性或特异性的其他上游启动子元件的组合。

可以改变启动子以含有“增强子DNA”以辅助增加基因表达。如本领域已知，某些DNA元件可以用来增强DNA的转录。这些增强子经常在真核细胞内发挥作用的启动子中转录起点的5′找到，但是可能经常插入编码序列的上游(5′)或下游(3′)。在一些情况下，这些5′增强子DNA元件是内含子。在特别可用作增强子DNA的内含子当中存在的5′内含子来自稻肌动蛋白1基因(见美国专利号5,641,876)、稻肌动蛋白2基因、玉米醇脱氢酶基因、玉米热休克蛋白70基因(美国专利号5,593,874)、玉米皱缩1基因、马铃薯光敏1基因和矮牵牛(Petunia hybrida)热休克蛋白70基因(美国专利号5,659,122)。

为了在植物中体内生产沉默性RNA，示例性组成型启动子包括源自CaMV35S基因、稻肌动蛋白基因和玉米遍在蛋白基因的那些，每种启动子在下文描述。用于微藻产生的示例性启动子包括肌动蛋白启动子、psaD启动子(US2002/0104119；Fischer和Rochaix(2001)Mol.Gen.Genet.(分子遗传学和基因组)265，888-894)、B-微管蛋白、CAB和rbcs启动子。

用于此目的的示例性诱导型启动子包括化学诱导型PR-1a启动子和伤口诱导型启动子，其也在下文描述。

选定的启动子可以指导在特定细胞类型(如叶表皮细胞、叶肉细胞、根皮层细胞)或在特定组织或器官(例如，根、叶或花)中的表达。示例性组织特异性启动子包括充分表征的根特异性、髓特异性和叶特异性启动子，每种启动子在下文描述。

在一个实施方案中，启动子可以指导在叶绿体中的表达。用于绿藻的示例性叶绿体启动子包atpB、psbA、psbD、rbcl和psa1启动子，以及来自微藻的适宜5′和3′侧翼序列。用于微藻和植物的其他叶绿体表达系统在Fletcher等人，(2007)“Optimization of recombinant protein expression in the chloroplasts ofgreen algae(绿藻叶绿体中重组蛋白表达的优化)”.Adv.Exp.Med.Biol.(高级实验药物生物学)61690-98；和Verma和Daniell(2007)“Chloroplast vectorsystems for biotechnology applications(用于生物技术应用的叶绿体载体系统)”Plant Physiology(植物生理学)1451129-1143中描述。

取决于所用的宿主细胞系统，可以使用众多合适启动子的任一种。启动子选择可以基于表达谱和表达水平。以下是可以在表达盒中使用的启动子的代表性非限制性例子。

35S启动子CaMV35S启动子可以用来驱动组成型基因表达。质粒pCGN1761的构建在公布的专利申请EP0392225中描述，所述质粒具有CaMV35S启动子和tml转录终止子，连同在启动子和终止子之间的单一EcoRI位点，并且具有pUC型主链。

肌动蛋白启动子肌动蛋白的几种同工型已知在大部分细胞类型中表达，并且因此，肌动蛋白启动子是组成型启动子的良好选项。具体而言，已经克隆并且表征来自稻Act/基因的启动子(McElroy等人，1990)。发现这种启动子的1.3kb片段本身含有在稻原生质体中表达所要求的的调节元件。另外，已经构建众多基于Act/启动子的表达载体专门用于单子叶植物中(McElroy等人，(1990)Plant Cell(植物细胞)2：163-171)。这些表达载体并入Act/-内含子1、Adbl5′侧翼序列和Adbl-内含子1(来自玉米醇脱氢酶基因)以及来自CaMV35S启动子的序列。显示最高表达的载体是35S和Act/内含子或Act/5′侧翼序列和AcV内含子的融合物。优化(GUS报道基因的)起始ATG周围的序列也增强表达。

遍在蛋白启动子遍在蛋白是已知在许多细胞类型中积累的另一种基因产物并且其启动子已经从几个物种克隆，用于转基因植物中(Christensen等人，(1989)Plant Mol.Biol.(植物分子生物学)12：619-632和Christensen等人，(1992)Plant Mol.Biol.(植物分子生物学).18：675-689)；pEMU(Last等人，(1991)Theor.Appl.Genet.(理论与应用遗传学)81：581-588)；MAS(Velten等人，(1984)EMBO J.3：2723-2730)。已经在转基因单子叶植物系统中开发了玉米遍在蛋白启动子并且在通过引用方式并入本文的专利公布EP0342926中公开了其序列和经构建用于单子叶植物转化的载体。Taylor等人1993年描述了包含玉米遍在蛋白启动子和第一内含子的载体(pAHC25)和通过微抛射体轰击法导入时其在众多单子叶植物的细胞悬液中的高度活性。遍在蛋白启动子适用于转基因植物、尤其单子叶植物中的基因表达。合适的载体是pAHC25或本申请中所述的任何转化载体的衍生物，所述载体通过导入适宜的遍在蛋白启动子和/或内含子序列进行修饰。其他组成型启动子包括例如在美国专利号5,608,149；5,608,144；5,604,121；5,569,597；5,466,785；5,399,680；5,268,463；和5,608,142中公开的那些。

组织特异性表达：组织特异性启动子包括在Yamamoto等人，(1997)PlantJ.(植物杂志)12(2)：255-265；Kawamata等人，(1997)Plant Cell Physiol.(植物细胞生理学)38(7)：792-803；Hansen等人，(1997)Mol.Gen.Genet.(分子遗传学和基因组)254(3)：337-343；Russell等人，(1997)Transgenic Res.(转基因研究)6(2)：157-168；Rinehart等人，(1996)Plant Physiol.(植物生理学)112(3)：1331-1341；Van Camp等人，(1996)Plant Physiol.112(2)：525-535；Canevascini等人，(1996)Plant Physiol.(植物生理学)112(2)：513-524；Yamamoto等人，(1994)Plant Cell Physiol.(植物细胞生理学)35(5)：773-778；Lam(1994)Results Probl.Cell Differ.(细胞分化的结果和问题)20：181-196；Orozco等人，(1993)Plant Mol.Biol.(植物分子生物学)23(6)：1129-1138；Matsuoka等人，(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.(美国科学院院报)90(20)：9586-9590和Guevara-Garcia等人，(1993)Plant J.(植物杂志)4(3)：495-505中描述的那些。根特异性启动子包括例如在Hire等人，(1992)Plant Mol.Biology(植物分子生物学)，20(2)：207-218；Keller和Baumgartner，(1991)The Plant Cell(植物细胞)，3(10)：1051-1061；Sanger等人，(1990)Plant Mol.Biology(植物分子生物学)，14(3)：433-443；Miao等人，(1991)The Plant Cell(植物细胞)，3(1)：11-22；Bogusz等人，(1990)The Plant Cell(植物细胞)，2(7)：633-641中公开的那些。种子优选的启动子包括种子特异性启动子(在种子发育期间有活性的那些启动子)以及种子萌发启动子(在种子萌发期间有活性的那些启动子)。这类启动子包括β伴球蛋白，(Fujiwara和Beachy(1994)Plant.Mol.Biol.(植物分子生物学)24261-272)；Cim1(细胞分裂素诱导的信使)；cZ19B1(玉米19KDa玉米醇溶蛋白)；milps(myo-肌醇-1-磷酸合酶)；celA(纤维素合酶)；end1(大麦mRNA克隆END1)；和imp3(myo-肌醇单磷酸-3)。对于双子叶植物，具体的启动子包括菜豆蛋白、油菜籽蛋白、β-伴球蛋白、大豆凝集素等基因启动子。对于单子叶植物，具体的启动子包括玉米15Kd玉米醇溶蛋白、22KD玉米醇溶蛋白、27kD玉米醇溶蛋白、蜡质、皱缩1、皱缩2、球蛋白1等基因启动子。在某些实施方案中，DNA构建体、转基因植物和方法使用油质蛋白启动子和/或油菜籽蛋白启动子。

诱导型表达：化学诱导型启动子化学引起的启动子元件可以用来替代前述启动子的任一种或与之组合，以便使遍及生物或在特定组织内部的化学诱导型表达成为可能。例如，与GAL4DNA结合结构域和VP16激活结构域可操作连接的反式因子(包括蜕皮素受体)的表达可以用来以配体依赖性方式调节与最小启动子和GAL4(5X UAS序列)可操作连接的第二基因的表达。众多有用的EcR是本领域已知的，并且已经用来开发配体调节的基因开关。基于EcR的基因开关的具体例子包括例如在美国专利号US6723531、US5514578、US6245531、US6504082、US7151168、US7205455、US7238859、US7456315、US7563928、US7091038、US7531326、US7776587、US7807417、US7601508、US7829676、US7919269、US7563879、US7297781、US7312322、US6379945、US6610828、US7183061和US7935510中公开的那些。此外，其他化学调节物也可以用来在根据本发明公开的主题转化的生物中诱导选择的编码序列表达，包括苯并噻二唑、异烟酸、水杨酸，例如，如通过引用方式并入本文的美国专利号5,523,311、5,614,395和5,880,333中公开。

可以将选择的靶基因编码序列插入这种载体中，并且融合产物(即，启动子-基因-终止子)可以随后转移至任何选择的转化载体，包括下文描述的那些。各种化学调节物可以用来在根据本发明公开的主题转化的植物中诱导选择的编码序列表达，包括在通过引用方式并入本文的美国专利号5,523,311和5,614,395中公开的苯并噻二唑、异烟酸和水杨酸化合物。

转录终止子多种转录终止子可用于表达盒中。它们负责终止超出转基因之外的转录及转基因的正确多聚腺苷化。

适宜的转录终止子是已知在相关微藻或植物系统中发挥作用的那些。代表性植物转录终止子包括CaMV35S终止子、tml终止子、胭脂碱合酶终止子和豌豆rbcS E9终止子。就RNA聚合酶III终止子而言，这些终止子一般包含5个或更多个连续胸苷残基的-52run。在一个实施方案中，RNA聚合酶III终止子包含序列TTTTTTT。这些可以在单子叶植物和双子叶植物中使用。

对于藻类用途，可以使用来自上文所列基因的内源5′和3′元件，即来自atpB、psbA、psbD、rbcl、肌动蛋白、psaD、B-微管蛋白、CAB、rbcs和psal基因的适宜5′和3′侧翼序列。

用于增强或调节表达的序列已经发现众多序列增强有效连接的核酸序列的表达，并且这些序列可以与本发明公开的主题的核酸联合使用，以增加它们在转基因植物中的表达。

各种内含子序列已经显示增强表达，尤其在单子叶植物细胞中增强表达。例如，已经发现当导入玉米细胞时，玉米Adbl基因的内含子明显增强处于其同族启动子下的野生型基因的表达。发现内含子1是特别有效并且增强带有氯霉素乙酰转移酶基因的融合构建体中的表达(Callis等人，1987)。在相同的实验性的系统中，来自玉米青铜色基因的内含子具有增强表达的相似作用。已经将内含子序列常规地并入植物转化载体中，一般并入非翻译前导序列内部。

衍生自病毒的众多非翻译前导序列也已知增强表达，并且这些序列在双子叶植物细胞中特别有效。尤其，已经显示来自烟草花叶病毒(TMV，“W-序列”)、玉米褪绿斑驳病毒(MCMV)和苜蓿花叶病毒(AMY)的前导序列有效增强表达(例如Gallie等人，1987；Skuzeski等人，1990)。

农杆菌转化载体许多载体可用于使用根癌农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)的转化并且可以用于植物转化。用于利用根癌农杆菌介导的植物转化法表达的示例性载体包括例如pBin19(CLONETECH)，Frisch等人，PlantMol.Biol.，27：405-409，1995；pCAMBIA1200和pCAMBIA1201(Center for theApplication of Molecular Biology to International Agriculture(国际农业分子生物学应用中心)，Canberra(堪培拉)，澳大利亚)；pGA482，An等人，EMBO J.，4：277-284，1985；pCGN1547，(CALGENE Inc.)McBride等人，Plant Mol.Biol.(植物分子生物学)，14：269-276，1990等载体，如本文所述。

其他植物转化载体：不使用根癌农杆菌的转化法避免在选择的转化载体中需要T-DNA序列，并且因此，除了含有T-DNA序列的载体(如上文描述的那些)，还可以使用缺少这些序列的载体。不依赖于农杆菌的转化技术包括借助粒子轰击、原生质体摄取(例如PEG和电穿孔)、与玻璃珠涡旋混合和微量注射的转化法。载体的选择可以取决于经选择用于待转化的物种的技术。具体而言，对于微藻，优选粒子轰击方法和使用玻璃珠。用于原生质体或植物组织中表达的示例性表达载体包括pUC18/19或pUC118/119(GIBCO BRL，Inc.，MD)；pBluescript SK(+/-)和pBluescript KS(+/-)(STRATAGENE，La Jolla，Calif.)；pT7Blue T载体(NOVAGEN，Inc.，WI)；pGEM-3Z/4Z(PROMEGA Inc.，Madison，Wis.)等载体，如本文所述。

选择标记：对于某些靶物种，不同的抗生素标记或除草剂选择标记可能是优选的。转化中常规使用的选择标记包括nptII基因，其赋予针对卡那霉素和相关抗生素的抗性(Messing和Vierra，1982；Bevan等人，1983)；Bar基因，其赋予针对除草剂膦丝菌素的抗性(White等人，1990；Spencer等人，1990)；hph基因，其赋予针对抗生素潮霉素的抗性(Blochlinger和Diggelmann，1984)；dhfr基因，其赋予针对甲氨蝶呤的抗性(Bourouis和Jarry，1983)，和EPSP合酶基因，其赋予针对草甘膦的抗性(美国专利号4,940,935和5,188,642)。

IV.植物

本发明可以用任何植物或微藻实施。随本发明使用的微藻可以包括任何天然存在的物种或任何基因修饰的微藻。随本发明使用的微藻包括任何市售株系、特定区域固有的任何株系或任何专利株系。额外地，微藻可以属于任何门、纲、目、科、属或种，或其任何子部分。在一个方面，拥有叶绿体的微藻是优选的。

在某些实施方案中，随本发明方法使用的微藻是以下门之一的成员：绿藻门(Chlorophyta)，蓝藻门(Cyanophyta)(蓝细菌(Cyanobacteria))和异鞭藻门(Heterokontophyta)。在某些实施方案中，随本发明方法使用的微藻是以下纲之一的成员：绿藻纲(Chlorophyceae)、硅藻纲(Bacillariophyceae)、真眼点藻纲(Eustigmatophyceae)和金藻纲(Chrysophyceae)。在某些实施方案中，随本发明方法使用的微藻是以下属之一的成员：衣藻属(Chlamydomonas)、微拟球藻属(Nannochloropsis)、小球藻属(Chlorella)、杜氏藻属(Dunaliella)、栅藻属(Scenedesmus)、月牙藻属(Selenastrum)、颤藻属(Oscillatoria)、席藻属(Phormidium)、螺旋藻属(Spirulina)、双眉藻属(Amphora)和棕鞭藻属(Ochromonas)。在一个方面，优选衣藻属微藻。

可以随本发明方法使用的微藻物种的非限制性例子包括例如东方曲壳藻(Achnanthes orientalis)、阿格门氏藻物种(Agmenellum spp.)、透明茧形藻(Amphiprora hyaline)、咖啡形双眉藻(Amphora coffeiformis)、咖啡形双眉藻线性变种(Amphora coffeiformis var.linea)、咖啡形双眉藻凹陷变种(Amphoracoffeiformis var.punctata)、咖啡形双眉藻塔伊乐瑞变种(Amphora coffeiformisvar.taylori)、咖啡形双眉藻小型变种(Amphora coffeiformis var.tenuis)、优美双眉藻(Amphora delicatissima)、优美双眉藻总状变种(Amphora delicatissimavar.capitata)、双眉藻属物种(Amphora sp.)、鱼腥藻(Anabaena)、纤维藻属(Ankistrodesmus)、镰形纤维藻(Ankistrodesmus falcatus)、金黄褐藻(Boekeloviahooglandii)、波洛迪尼拉属的种(Borodinella sp.)、布朗葡萄藻(Botryococcusbraunii)、葡萄藻(Botryococcus sudeticus)、小苞球藻(Bracteaococcus minor)、Bracteococcus medionucleatus)、四鞭藻属(Carteria)、纤细角毛藻(Chaetocerosgracilis)、牟氏角毛藻(Chaetoceros muelleri)、牟氏角毛藻角毛藻subsalsum变种(Chaetoceros muelleri var.subsalsum)、角毛藻属物种(Chaetoceros sp.)、海产绿藻(Chlamydomas perigranulata)、无硝小球藻(Chlorella anitrata)、南极小球藻(Chlorella antarctica)、黄绿小球藻(Chlorella aureoviridis)、假丝酵母小球藻(Chlorella Candida)、荚膜小球藻(Chlorella capsulate)、干燥小球藻(Chlorella desiccate)、椭圆小球藻(Chlorella ellipsoidea)、浮水小球藻(Chlorella emersonii)、福斯卡小球藻(Chlorella fusca)、福斯卡小球藻空泡变种(Chlorella fusca var.vacuolata)、葡萄糖小球藻(Chlorella glucotropha)、水溪小球藻(Chlorella infusionum)、水溪小球藻海栖变种(Chlorella infusionumvar.actophila)、水溪小球藻深海变种(Chlorella infusionum var.auxenophila)、裂小球藻(Chlorella kessleri)、褐小球藻(Chlorella lobophora)、小球藻(Chlorella luteoviridis)、小球藻(Chlorella luteoviridis var.aureoviridis)、小球藻(Chlorella luteoviridis var.lutescens)、微小球藻(Chlorella miniata)、极微小球藻(Chlorella minutissima)、变形小球藻(Chlorella mutabilis)、夜小球藻(Chlorella nocturna)、卵形小球藻(Chlorella ovalis)、巴夫小球藻(Chlorellaparva)、喜光小球藻(Chlorella photophila)、勃氏小球藻(Chlorellapringsheimii)、原始小球藻(Chlorella protothecoides)、原始小球藻酸变种(Chlorella protothecoides var.acidicola)、规则小球藻(Chlorella regularis)、规则小球藻微变种(Chlorella regularis var.minima)、规则小球藻伞形变种(Chlorella regularis var.umbricata)、小球藻(Chlorella reisiglii)、嗜多糖小球藻(Chlorella saccharophila)、嗜多糖小球藻椭圆变种(Chlorella saccharophilavar.ellipsoidea)、海水小球藻(Chlorella salina)、简单小球藻(Chlorellasimplex)、小球藻(Chlorella sorokiniana)、小球藻属物种(Chlorella sp.)、球形小球藻(Chlorella sphaerica)、斑小球藻(Chlorella stigmatophora)、万尼氏小球藻(Chlorella vanniellii)、普通小球藻(Chlorella vulgaris)、普通小球藻(Chlorella vulgaris fo.tertia)、普通小球藻自养变种(Chlorella vulgaris var.autotrophica)、盐生规则小球藻(Chlorella vulgaris var.viridis)、规则小球藻规则变种(Chlorella vulgaris var.vulgaris)、规则小球藻规则变种(Chlorellavulgaris var.vulgaris fo.tertia)、盐生规则小球藻规则变种(Chlorella vulgaris var.vulgaris fo.viridis)、黄色小球藻(Chlorella xanthella)、小球藻(Chlorellazofingiensis)、共球小球藻(Chlorella trebouxioides)、普通小球藻(Chlorellavulgaris)、水溪绿球藻(Chlorococcum infusionum)、绿球藻属物种(Chlorococcum sp.)、绿梭藻属(Chlorogonium)、蓝隐藻属物种(Chroomonassp.)、金球藻属物种(Chrysosphaera sp.)、球钙板藻属(Cricosphaera sp.)、寇氏隐甲藻(Crypthecodinium cohnii)、隐藻属物种(Cryptomonas sp.)、隐秘小环藻(Cyclotella cryptica)、梅尼小环藻(Cyclotella meneghiniana)、小环藻属物种(Cyclotella sp.)、淡水衣藻(Chlamydomonas moewusii)、莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)、衣藻属物种(Chlamydomonas sp.)、杜氏藻属物种(Dunaliella sp.)、巴氏杜氏藻(Dunaliella bardawil)、双纹杜氏藻(Dunaliellabioculata)、颗粒杜氏藻(Dunaliella granulate)、海生杜氏藻(Dunaliellamaritime)、微小杜氏藻(Dunaliella minuta)、巴夫杜氏藻(Dunaliella parva)、杜氏盐藻(Dunaliella peircei)、普氏杜氏藻(Dunaliella primolecta)、盐生杜氏藻(Dunaliella salina)、土生杜氏藻(Dunaliella terricola)、杜氏藻(Dunaliellatertiolecta)、绿色杜氏藻(Dunaliella viridis)、杜氏藻(Dunaliella tertiolecta)、绿色独球藻(Eremosphaera viridis)、独球藻属物种(Eremosphaera sp.)、后棘藻属物种(Ellipsoidion sp.)、裸藻属某些物种(Euglena spp.)、被刺藻属物种(Franceia sp.)、克罗脆杆藻(Fragilaria crotonensis)、脆杆藻属物种(Fragilariasp.)、粘球藻属物种(Gleocapsa sp.)、粘球枝藻属物种(Gloeothamnion sp.)、雨生红球藻(Haematococcus pluvialis)、膜胞藻属物种(Hymenomonas sp.)、大溪等鞭金藻(lsochrysis aff.galbana)、等鞭金藻(lsochrysis galbana)、鳞孔藻属(Lepocinclis)、微芒藻属(Micractinium)、微芒藻属(Micractinium)、细小单针藻(Monoraphidium minutum)、单针藻属物种(Monoraphidium sp.)、微绿球藻属物种(Nannochloris sp.)、盐生微拟球藻(Nannochloropsis salina)、微拟球藻属物种(Nannochloropsis sp.)、适意舟形藻(Navicula acceptata)、前叶舟形藻(Navicula biskanterae)、假卵泡舟形藻(Navicula pseudotenelloides)、菌膜舟形藻(Navicula pelliculosa)、腐生舟形藻(Navicula saprophila)、舟形藻属物种(Navicula sp.)、肾鞭藻属物种(Nephrochloris sp.)、肾藻属物种(Nephroselmis sp.)、普通菱形藻(Nitschia communis)、亚历山大菱形藻(Nitzschia alexandrina)、新月菱形藻(Nitzschia closterium)、普通菱形藻(Nitzschia communis)、分散菱形藻(Nitzschia dissipata)、碎片菱形藻(Nitzschiafrustulum)、汉氏菱形藻(Nitzschia hantzschiana)、平庸菱形藻(Nitzschiainconspicua)、中等菱形藻(Nitzschia intermedia)、小头菱形藻(Nitzschiamicrocephala)、微小菱形藻(Nitzschia pusilla)、微小菱形藻椭圆变种(Nitzschiapusilla elliptica)、微小菱形单剑突变种(Nitzschia pusilla monoensis)、微小菱形四边形突变种(Nitzschia quadrangular)、菱形藻属物种(Nitzschia sp.)、棕鞭藻属物种(Ochromonas sp.)、小卵囊藻(Oocystis parva)、细小卵囊藻(Oocystispusilla)、卵囊藻属物种(Oocystis sp.)、沼泽颤藻(Oscillatoria limnetica)、颤藻属物种(Oscillatoria sp.)、亚短颤藻(Oscillatoria subbrevis)、凯氏拟小球藻(Parachlorella kessleri)、嗜酸拟小球菌(Pascheria acidophila)、巴夫藻属物种(Pavlova sp.)、三角褐指藻(Phaeodactylum tricomutum)、噬菌体属(Phagus)、席藻属(Phormidium)、扁藻属物种(Platymonas sp.)、前沟颗石藻(Pleurochrysiscarterae)、齿状颗石藻(Pleurochrysis dentate)、颗石藻属物种(Pleurochrysissp.)、魏氏无绿藻(Prototheca wickerhamii)、雍滞无绿藻(Prototheca stagnora)、原外壁多孔菌(Prototheca portoricensis)、原外壁桑葚藻(Protothecamoriformis)、祖菲无绿藻(Prototheca zopfii)、水生假小球藻(Pseudochlorellaaquatica)、塔胞藻属物种(Pyramimonas sp.)、桑椹藻属(Pyrobotrys)、混浊红球菌(Rhodococcus opacus)、萨辛诺伊德金藻(Sarcinoid chrysophyte)、被甲栅藻(Scenedesmus armatus)、裂殖壶菌属(Schizochytrium)、水棉属(Spirogyra)、钝顶螺旋藻属(Spirulina platensis)、裂丝藻属物种(Stichococcussp.)、聚球藻属物种(Synechococcus sp.)、集胞藻属(Synechocystis)、万寿菊(Tagetes erecta)、法国万寿菊(Tagetes patula)、四角藻属(Tetraedron)、四爿藻属(Tetraselmis sp.)、四鞭片藻(Tetraselmis suecica)、威氏海链藻(Thalassiosira weissflogii)和耐酸性小球藻微藻(Viridiella fridericiana)。

在要求保护的方法中任一方法的一个方面，优选以下微藻物种：海产绿藻(Chlamydomas perigranulata)、淡水衣藻(Chlamydomonas moewusii)、莱茵衣藻和衣藻属物种。

V.宿主生物和病原体、寄生体和侵入性物种

如本文所用，术语“病原体”或“寄生体”指可能袭扰宿主生物的昆虫、蛛形动物、甲壳类、真菌、细菌、病毒、原虫、线虫、扁虫、圆虫、蛲虫、钩虫、带虫、锥虫、裂体吸虫、马蝇、蚤、蜱、螨、和虱等。术语“侵入性物种”指在经济、环境和/或生态上不利地影响其侵入的栖息地和生物区域的非本地物种、植物或动物。在本发明的一个方面，宿主生物可以是选自双翅目(Diptera)、长角亚目(Nematocera)、蚊下目(culicomorpha)、蚊总科(culicoidea)的昆虫。在本发明的一个方面，宿主生物选自蚊科(culicidae)、大蚊科(Tipulidae)和摇蚊科(Chironomidae)。在一个方面，昆虫属于蚊科(culicidae)。

在一个方面，病原体或寄生体是存在以微藻为食的至少一种生活周期形式的昆虫。

因此，在一个实施方案中，本发明包括一种用于控制昆虫的方法，所述方法包括：

i)提供包含沉默性核糖核酸的微藻，所述沉默性核糖核酸在摄入所述微藻后发挥作用以抑制所述昆虫的靶基因的表达，

其中所述靶基因的表达是对所述昆虫的功能、生长、发育、感染性或繁殖必需的，

其中所述沉默性核糖核酸包含有义RNA链和反义RNA链，其中所述有义和反义RNA链形成RNA双链体，并且

其中所述有义RNA链包含与靶基因中至少约20个连续核苷酸的靶序列基本上相同的核苷酸序列；

ii)将所述微藻导入所述昆虫的栖息地中，其中所述昆虫或其幼虫形式摄入所述微藻。

在另一个实施方案中本发明包括一种抑制靶基因在昆虫中表达的方法，所述方法包括：

其中所述靶基因的表达是对所述昆虫的生长、发育或繁殖必需的，

其中所述有义RNA链包含与靶基因中至少约20个连续核苷酸的靶序列基本上相同的核苷酸序列；并且

ii)将所述微藻饲喂给所述昆虫或其幼虫形式。

在一些情况下，病原体或寄生体可以在宿主生物(如辅助所述病原体或寄生体传播和扩散至中间宿主(secondary host)的昆虫媒介)中传播或孵育。在一个方面，病原体或寄生体由存在以微藻为食的至少一种生活周期形式的昆虫传播。

例如、疟疾和其他疾病，例如包括脑炎、丝虫病、黄热病、登革热、裂谷热(RVF)和西尼罗病毒感染，由包括蚊子(按蚊属(Anopheles sps)、库蚊属(Culex)、曼蚊属(Mansonia)和埃及伊蚊(Aedesa egypti)在内的昆虫媒介扩散。

因而，本发明也包括抑制病原体或寄生体由昆虫媒介传播的方法，所述方法包括步骤：

i)提供包含沉默性核糖核酸的微藻，所述沉默性核糖核酸在摄入所述微藻后发挥作用以抑制所述昆虫媒介的靶基因的表达，

其中所述靶基因的表达是对所述昆虫的功能、生长、发育或繁殖必需的，

ii)将所述微藻导入所述昆虫媒介的栖息地中，其中所述昆虫或其幼虫形式摄入所述微藻。

在一个方面，昆虫选自按蚊属、库蚊属、曼蚊属和埃及伊蚊。因此，在另一个方面中，病原体或寄生体选自圣路易斯脑炎病毒(SLE)、西方马脑炎病毒(WEE)、委内瑞拉马脑炎病毒(VEE)、东方马脑炎病毒(EEE)、La Crosse病毒(LACV)、东方马脑炎病毒(EEEV)、委内瑞拉马脑炎病毒(VEEV)、乙型脑炎病毒(JE)、黄热病毒、裂谷热(RVF)病毒、西尼罗病毒、登革病毒(DENV1、DENV2、DENV3、或DENV4)、恶性疟原虫、间日疟原虫、卵形疟原虫和三日疟原虫。

在另一个方面，病原体或寄生体可以直接攻击宿主生物。在一个方面，宿主生物以植物或微藻为食。

因此，在另一个方面，本发明包括一种用于保护以植物或微藻为食的宿主生物免遭寄生体和病原体感染的方法，所述方法包括：

i)提供包含沉默性核糖核酸的植物或微藻，所述沉默性核糖核酸在所述植物或微藻由所述宿主生物、寄生体或病原体摄入后发挥作用以抑制所述寄生体或病原体的靶基因的表达，

其中所述靶基因的表达是对所述寄生体或病原体的生长、发育或繁殖必需的，

ii)将所述植物或微藻饲喂给所述宿主生物。

在又一个方面，本发明也包括一种抑制靶基因在侵袭宿主生物的病原体或寄生体中表达的方法，所述方法包括：

i)提供包含沉默性核糖核酸的微藻，所述沉默性核糖核酸在所述微藻由所述宿主生物、寄生体或病原体摄入后发挥作用以抑制所述寄生体或病原体的靶基因的表达，

ii)将所述微藻饲喂给所述宿主生物。

在一个方面，宿主生物以微藻为食。因此，在这些方法中任一种方法的另一个方面，宿主生物选自对虾科(Penaeidae)的小虾和对虾和在其内部的对虾属(Penaeus)，鲤形目(Cypriniformes)及鲤科(Cyprinidae)的鲤鱼与淡水鱼类和丽鲷科(Tilapia)，包括自罗非鱼族的丽鱼类。

在另一个方面，宿主生物选自南美白对虾、斑节对虾、蓝对虾、中国对虾、日本对虾、印度对虾和墨吉对虾。

因此，在另一个方面中，病原体或寄生体是小虾和对虾的病原体或寄生体。在一个方面，这种病原体或寄生体选自病毒，包括Taura综合征病毒(TSV)、传染性皮下及造血组织坏死病毒(IHHNV)、线极病毒(WSSV)、若尼病毒(ronivirus)(YHV、GAV、LOV)、形成包涵体的肠杆状病毒(occluded entericbaculovirus)(BP)、形成包涵体的肠杆状病毒(MBV)、不形成包涵体的肠杆状病毒(BMN)、肠细小病毒(HPV)、细菌，包括α-变形菌门(NHP)，和原生动物，包括微孢子虫(Microsporidian)、单孢子虫(Haplosporidian)及簇虫(Gregarine)。

在另一个方面，宿主生物选自亚洲鲤鱼和印度鲤鱼。在另一个方面，宿主生物选自草鱼、鲤鱼、鲢鱼、大鳞鲢、鳙鱼、青鱼、普通金鱼和鲫鱼。

因此，在另一个方面中，病原体或寄生体是鲤鱼的病原体或寄生体。在一个方面，这种病原体或寄生体选自多子小瓜虫(Ich：)、车轮虫属、口丝虫属、斜管虫属、鲤鲺、鲤锚头鳋、Ergasilus sieboldi、坏鳃指环虫和尺蠖鱼蛭。

在另一个方面，宿主生物选自口孵非鲫属、帚齿非鲫属和非鲫属。因此，在另一个方面中，病原体或寄生体是非鲫属的病原体或寄生体。在一个方面，这种病原体或寄生体选自链球菌属、气单胞菌属、车轮虫属、columnaris和虹彩病毒。在另一个方面，病原体或寄生体选自纤毛虫、甲藻、吸虫类、甲壳类、桡足类和医蛭科(Hirudidae)。

在另一个方面，宿主生物不天然地采食微藻。然而在这种情况下，可以向该宿主生物以包含微藻的食物添加物的形式提供微藻。

因此，在另一个实施方案中，本发明包括饲喂添加物，所述喂添加物包含表达沉默性核糖核酸的微藻，其中所述沉默性核糖核酸在所述饲喂添加物由所述宿主生物摄入时发挥作用以抑制所述寄生体或病原体的靶基因的表达，

在这些方法中任一方法的一个方面，侵入性物种在其生活周期的至少一个阶段消耗微藻。在这些权利要求中任一项的一个方面，侵入性物种选自贻贝科的贻贝和帘蛤科的蛤。在一个方面，侵入性物种是斑纹贻贝(Dreissenapolymorpha)。

实施例

材料与方法

藻株系和培养条件：衣藻株系CC424(cw15，arg2，sr-u-2-60mt^-)和CC4147(FUD7mt+)从美国杜克大学处的衣藻培养物保藏中心获得。除非另外声明，否则将藻株系以混合营养方式在液体TAP培养基中或固体TAP培养基上(Harris等人，(1989)Genetics(遗传学)123：281-92)在23℃于连续白色光(40μEm^-2s^-1)下培育。当需要时，培养基补充有100μg/mL的精氨酸。通过使用固体TAP培养基或补充有100μg/mL精氨酸和50μg/mL巴龙霉素或25μg/mL潮霉素的TAP培养基，进行核转化体的选择。使用株系CC741(ac-u-(beta)mt+)，用高盐(HS)培养基进行叶绿体转化体的选择。

载体构建：为了产生3-羟基羟犬尿氨酸转氨酶(3HKT)反向重复序列(IR)构建体，将冈比亚按蚊(Anopheles gambiae)3HKT编码序列(GenBank登录号AM042695.1)(SEQ.ID.No.1)的代表3HKT基因从925至1253bp区域的长328bp的片段：ATGAACCAAAACGTTATCACCATACTGTCGCATCGAACTTAATATTTGCTCTGCGGGAAGCATTGGCTCAAATTGCGGAAGAAGGACTGGAAAATCAGATCAAACGCCGCATCGAATGTGCCCAAATCTTGTACGAAGGGCTTGGTAAGATGGGACTCGATATTTTCGTGAAAGACCCCAGACATCGCCTGCCCACCGTTACTGGTATTATGATTCCGAAAGGTGTTGACTGGTGGAAAGTTTCACAATACGCCATGAACAATTTTTCGTTAGAAGTACAAGGAGGACTTGGACCTACGTTTGGAAAAGCATGGCGTGTGGGTATTAT(SEQ.ID.No.2)用引物HKTFwd2(5′-ATGCTAAGCTTGCATGCATGAACCAAAACGTTATCACCATAC-3′)(SEQ.ID.No.3)和HKTRev2(5′-AAGATGGATCCGCTAGCATAATACCCACACGCCATGC-3′)(SEQ.ID.No.4)扩增并且克隆至载体pBSKS的HindIII/BamHI位点中，产生质粒pCVAC88。为产生3HKT反向重复序列构建体，将3HKT编码序列的167bp片段用引物HKTFwd3(5′-AGTCAGAGCTCCCATGGATGAACCAAAACGTTATCACCATAC-3′)(SEQ.ID.No.5)和HKTRev2(上文)扩增并且克隆至载体pCVAC88的SacI/XbaI位点中，产生质粒pCVAC99。将源自pCVAC99的HKT反向重复序列作为NcoI/SphI片段切下并克隆至载体pGatpA的相同位点中，产生质粒pCVAC101。最后，将源自pCVAC101的3HKT反向重复序列作为XhoI/SphI片段切下并克隆至载体pBA155的XhoI/SphI位点中，产生质粒pCVAC108。

为构建携带3HKT IR的衣藻核转化载体，将328bp长的HKT片段用引物HKTFwd4(5′-ATTTAGCGGCCGCCATATGAACCAAAACGTTATCACCATAC-3′)(SEQ.ID.No.6)和HKTRev3(5′-AATAAACTAGTCTGCAGATAATACCCACACGCCATGC-3′)(SEQ.ID.No.7)扩增且克隆至载体pCVAC135的NdeI/PstI位点中，产生质粒pCVAC146。以引物HKTFwd4和HKTRev3扩增的3HKT用NotI/SpeI限制性酶消化并克隆至pCVAC146的相同位点中，产生p3HKT IR。新载体命名为pCVAC150。为产生在重复序列区之间还包含内含子间隔区的3HKT反向重复序列，将3HKT用引物HKTFwd4(上文)和HKTRev3(上文)扩增并且克隆至载体pCVAC131的NdeI/PstI位点中，产生质粒pCVAC147。将肌动蛋白内含子用引物ActinIntron1 Fwd2(5′-ATTATATGCATGTGAAGGTGAGCAGGTGTTCAGGGCGC-3′)(SEQ.ID.No.8)和ActinIntron1Rev1(5′-TAAGATACTAGTAGCCTGCGGACACGGCGACAC-3′)(SEQ.ID.No.9)扩增，并且将产物用NsiI/SpeI消化并克隆至pCVAC147的PstI/SpeI位点中，产生质粒pCVAC148。将如上文所述的用引物HKTFwd4和HKTRev3扩增的3HKT片段随后克隆至载体pCVAC148的NotI/SpeI位点中以产生3HKT反向重复序列。新质粒命名为pCVAC153。为驱动3HKT的双向转录t，在载体pSL18的NdeI/pstI位点的D启动子的下游克隆采用引物HKTFwd4扩增的3HKT，产生质粒pCVAC143。将衣藻肌动蛋白启动子用引物ActinFwd4(5′-ATCTATCTAGAAGGTGCATGCGCTCCACGCATTAG-3′)(SEQ.ID.No.10)和ActinRev3(5′-AAGATCTGCAGCATATGTTTGAATCCTGCGTGTCACGTCCGC-3′)(SEQ.ID.No.11)扩增并且随后克隆至载体pCVAC143的PstI/XbaI位点中，产生质粒pCVAC145。

莱茵衣藻的核转化：使用玻璃珠方法进行莱茵衣藻核转化(Kindle，K.L.(1990)Proc Natl Acad Sci U S A(美国科学院院报)87：1228-32)。简而言之，在100mL补充有精氨酸的TAP液体培养基中培育衣藻CC424株。在对数期(OD₇₅₀＝0.8至1.0)通过以4000rpm离心收获细胞并且将细胞重悬于4mL无菌TAP+40μM蔗糖中。将重悬的细胞(300μL)转移至含有300mg无菌玻璃珠(0.425-0.6mm，Sigma，USA)的无菌微量离心管，将100μL无菌20％PEG6000(Sigma，USA)连同1.5μg质粒DNA一起添加至细胞。在转化之前，将全部构建体限制性消化以使构建体线性化或以便从质粒主链切下同时携带选择标记和目的基因的两个表达盒。在添加质粒DNA后，将细胞涡旋混合20秒并涂布到含有50μg/mL巴龙霉素和100μg/mL精氨酸或10μg/mL潮霉素和100μg/mL精氨酸的TAP琼脂平板上。

对于缺少任何选择标记的质粒(pSSCR7主链)，进行共转化。为共转化，在添加线性化的靶质粒(3μgDNA)和携带Arg7基因p389(1μg DNA)的质粒后，使用玻璃珠法转化CC424株。将细胞涂布于不含精氨酸的TAP琼脂平板上。

衣藻叶绿体转化：遵循Ishikura等人(Ishikura等人，(1999)J Biosci Bioeng(生物科学与生物工程期刊)87：307-14)描述的方案，进行衣藻叶绿体转化。简而言之，在100mL的TAP液体培养基中培育衣藻的psbA缺失株(CC741或CC4147)。在对数期(OD₇₅₀＝0.8至1.0)通过以4000rpm离心收获细胞并且将细胞重悬于2mL无菌HS培养基中。将约300μL细胞铺展在HS琼脂平板的中心。使用Bio-Rad PDS1000He生物射弹枪在真空下以1100psi将质粒DNA涂覆的金粒子(1μm)(InBio Gold，Eltham，Victoria，Australia)射向琼脂平板上的衣藻细胞。在射击后，将细胞涂布到HS琼脂平板上以便选择。

使用在Newman等人，(1990)Genetics(遗传学)126(4)：875-88中所述的改良黄嘌呤微量准备方法，从选择培养基上生长的推定性转化体中提取基因组DNA。将一半接种环(loop)的藻细胞重悬于300μL黄原酸盐缓冲液(12.5mM乙基黄原酸钾，100mM Tris-HCl pH7.5，80mM EDTA pH8.5，700mM NaCl)中并且在65℃水温育1.0小时。在温育后，将细胞悬液(14,000转/分钟)离心10分钟以收集上清液。将上清液转移至一个新微量离心管并添加2.5体积冷的95％乙醇(750μL)。通过翻转离心管几次充分混合该溶液，从而引起DNA沉淀。随后将样品(14,000转/分钟)离心5分钟以沉淀DNA。将DNA沉淀物用700μL冷的70％乙醇洗涤并离心3.0分钟。通过滗析移除乙醇并且使用除去任何残余乙醇的真空离心浓缩法干燥DNA沉淀。随后将DNA沉淀重悬于100μL无菌双蒸水中并且使用2-5μLDNA样品作为建立PCR的模板。

实时PCR：使用Nucleospin RNAII试剂盒(Clonetech，Mountain view，CA，USA)根据制造商的说明书，从1.0x10⁷个细胞提取细胞总RNA。通过用DNA酶I(Promega，Madison，WI USA)遵循制造商的说明书处理RNA样品除去污染性基因组DNA。使用Nanodrop(Thermo-scientific，Wilmington，DE，USA)测量RNA质量和浓度。用非变性琼脂糖凝胶和溴化乙啶染色检验RNA的结构完整性。使用Quantas cDNA合成混合物(Quantas，USA)遵循制造商的说明书，将总RNA(2.0ug)用来建立cDNA合成。使用ABI-Step One Plus(Applied Biosystems，Foster City，CA，USA)，使用以商标PERFECTATM

GREEN FASTMIX^TM(ROX染料)出售的试剂(Quanta Biosciences，Gaithersburg，MD，USA)根据制造商的说明书，实施实时定量RT-PCR。

使用按蚊肌动蛋白基因(ASActinRTFwd1(5′-GGTCGTAACCACCGGTATTG-3′)(SEQ.ID.No.12)和ASActinRTRev2(5′-GGTGGTGGTGAACGAGTAGC-3′)(SEQ.ID.No.13)作为参比基因/内对照，并且与靶3HKT基因(ASHKTRealFwd(5′-TTTAGCCTGGAAACGCTGAC-3′)(SEQ.ID.No.14)和ASHKTRealRev(5′-TCGATTTCCCATTTGTCCAT-3′)(SEQ.ID.No.15)平行地扩增，从而允许基因表达归一化并提供定量。用10ng的cDNA实施反应。使用Primer Express软件按照制造商的指南设计全部引物。对于每份样品，一式四份建立反应并且进行两个生物实验以确保结果的重现性。使用对比C_T(阈值循环)法进行转录物相对水平的定量(Livak，K.J.和T.D.Schmittgen(2001)Methods(方法)25：402-8)。

对蚊子幼虫进行的生物测定法：在Brenda Beerntsen博士的实验室(密苏里大学哥伦比亚分校，MO，USA)中，采用携带HKT反向重复序列的转基因衣藻，实施生物测定法。对于生物测定法，使用新出现(小于24小时)的按斑须按蚊幼虫。使用在TAP培养基中生长的转基因衣藻克隆的活跃生长对数期培养物(OD₇₅₀＝0.7至1.2)作为生物测定法的接种物。在每个孔中含有2.0mL的10％TAP培养基的12孔板中开始生物测定法。每个孔用转基因衣藻克隆的对数期培养物的10％接种物接种并且将10只新出现的幼虫转移至每个孔。一式两份实施实验。每日记录幼虫生长、行为和死亡(如果有的话)的观察结果。在实验过程期间，将衣藻的新鲜接种物每隔三日添加至各孔。将三龄幼虫转移至6孔平板，每个孔含有5.0mL的10％TAP。用简要列出的有前景的克隆，一式三份重复生物测定法。

实施例1：用于蚊子3HKT基因特异的沉默性RNA的衣藻表达载体的构建

3-羟基羟犬尿氨酸转氨酶(3HKT)是仅在蚊子中找到的独特蛋白质。这种蛋白质已经在蚊中进化以弥补在人和哺乳动物中存在的KAT的不存在。3HKT催化在色氨酸代谢途径中反应性3HK向更稳定的XA的转氨基作用(Han等人，(2007)J Insect Physiol(昆虫生理学)53：254-63)。因此，敲减3HKT的表达可能导致3HK的积累，这可以对蚊子是致死性的。另外，由于3HKT在蚊子主动采食阶段期间表达(Rossi等人，(2005)FEBS J272：5653-62)，所以我们探索通过饲喂表达3HKT dsRNA的转基因衣藻而敲减3HKT的可能性。

选择冈比亚按蚊3HKT基因的328bp区域用于产生3HKT反向重复序列构建体，其中所述328bp区域与NCBI数据库中来自其他生物的任何序列不显示超过11个连续碱基的比对结果。如上文所述，产生3个反向重复序列构建体用于衣藻核转化(图1)。构建体pCVAC150具有在衣藻肌动蛋白启动子控制下的3HKT反向重复序列转录。在构建体pCVAC153中，衣藻肌动蛋白内含子在HKT反向重复序列区域之间形成间隔区并且所述反向重复序列的转录由psaD启动子调节。构建体pCVAC145具有从任意末端在侧翼分布有psaD启动子和肌动蛋白启动子的3HKT的328bp区域，导致3HKT片段的双向转录。在证实正确克隆后，在衣藻中测试每种表达载体，如下文更充分地描述。

实施例2：3HKT反向重复序列表达载体的核转化和初步表征

为了证实构建体成功地稳定整合至衣藻基因组中，将衣藻CC424株用上文提到的3种构建体转化并且选择稳定的转化体。转基因集落经历PCR分析以证实3HKT反向重复序列整合于衣藻的核基因组中。如图2、3和4中所示的结果显示成功产生PCR阳性克隆，所述阳性克隆随后用来在蚊子幼虫上实施生物测定法，如下文更充分地描述。

实施例3：3HKT反向重复序列表达载体的叶绿体转化和初步表征

就我们目前所知，衣藻叶绿体缺少将双链RNA(dsRNA)加工成siRNA的装置。因此，我们期望衣藻叶绿体转化体产生的dsRNA将可用于被蚊子幼虫中存在的RNAi装置加工。为直接检验相对于由叶绿体转化体产生的dsRNA，由核转化体产生的3HKT siRNA对蚊子幼虫影响的差异，我们因此产生叶绿体特异性表达盒。通过在载体pBA155中的atpA启动子下游克隆3HKT反向重复序列完成这一点，从而产生质粒pCVAC108。使用如上文所述的基因枪，用构建体pCVAC108进行衣藻是CC4147株的叶绿体转化。通过PCR证实3HKT反向重复序列整合至叶绿体基因组中(图5)。也在生物测定法中对蚊子幼虫测试这些PCR阳性克隆，如下文更充分地描述。

通过以下方式获得3-HKT dsRNA在衣藻叶绿体转化体中转录的直接证实：使用psbD叶绿体基因作为对照，通过RT-PCR测试CC4147叶绿体转化体13和15的3-HKT dsRNA表达。在图6中显示结果。

在图6中，对照PCR实验中不存在psbD(泳道2至4)和3-HKT(泳道9和10)的任何条带，这表示全部RNA样品未受DNA污染。psbD在泳道5至7中的扩增表示cDNA合成过程已经发挥作用并且CC4147对照(泳道11)中不存在3-HKT条带是真实的，因为它缺少3-HKT。3-HKT条带在CC4147/pCVAC108克隆13和15中的存在证实，这些克隆是转基因的并且它们转录出3-HKT dsRNA。

实施例4：产生HKT dsRNA的衣藻克隆在蚊子幼虫上的生物测定法

携带HKT反向重复序列的转基因衣藻用来实施对斑须按蚊幼虫的生物测定法。这种生物测定法在幼虫出现的首日开始。将转基因衣藻克隆在TAP培养基中培育至对数期(OD₇₅₀＝0.7至1.2)，以便用作生物测定法的接种物。在每个孔中含有2.0mL的10％TAP培养基的12孔板中实施测定法。每个孔用转基因衣藻克隆的对数期培养物的10％接种物接种并且将10只新出现(小于24小时)的幼虫转移至每个孔。每个实验一式两份实施。每日记录幼虫生长、行为和死亡(如果有的话)。每隔三日，添加新鲜的衣藻接种物(OD₇₅₀＝0.8至1.0)。将三龄幼虫转移至6孔平板，每个孔含有5.0mL的10％TAP。尽管4种衣藻叶绿体转化体(CC741/pCVAC108)显示抑制幼虫生长，然而分别来自核转化体CC424/pCVAC150、CC424/pCVAC153和CC424/pCVAC145的两个克隆也抑制幼虫的生长，这表明由衣藻(叶绿体或核基因组)表达的3HKT反向重复序列有效敲减蚊子幼虫中的3HKT表达。

与对照和相同构建体的其他克隆相比时，以这些克隆为食的幼虫的发育较缓慢2-3日。随CC4147/pCVAC108克隆观察到最严重的表型，其中约60％以选定克隆为食的幼虫不发育成蛹。(表型分析，见图7)采用核转化体(CC424/pCVAC153、CC424/pCVAC150和CC424/pCVAC145克隆)，约50％的幼虫不进展至蛹期。(见图8、9、10、11)。最重要的，以来自全部4种构建体的选定克隆为食后，没有成体从能够成蛹的幼虫羽化。

这些结果显示，饲喂从叶绿体或核基因组表达3HKT反向重复序列的转基因衣藻有效抑制蚊子幼虫生长并最终造成它们死亡。随叶绿体转化体(CC4147/pCVAC108)观察到最有效幼虫生长抑制作用，因为多于60％幼虫未能成蛹(图13)。在核转化体当中，CC424/pCVAC153克隆(图8)有效抑制幼虫生长。这种是预期的，因为pCVAC153中3HKT反向重复序列的表达受psaD启动子驱动，所述psaD启动子是衣藻中用于转基因表达的最有效启动子之一。在IR构建体中纳入功能性内含子作为间隔区元件已知增强基因沉默的效率(Lee，Y.S.和R.W.Carthew(2003)Methods(方法)30：322-9；Smith等人，(2000)Nature(自然)407：319-20)。由于pCVAC153构建体额外地具有衣藻肌动蛋白内含子1作为3HKTIR之间的间隔区元件，所以它可能增强3HKT dsRNA的表达和稳定性，有助于高效的3HKT沉默。

令人惊讶地，与假定能够产生siRNA的核转化体相比时，产生3HKTdsRNA叶绿体转化体在抑制蚊子幼虫方面更有效。不限于任何具体操作理论，以下情况是可能的：与核表达的dsRNA相比，由叶绿体转化体产生的3HKTdsRNA在摄入时被蚊子的RNAi装置更有效地递送和/或加工。具体而言，以下情况是可能的：与以产生siRNA的衣藻核转化体为食时所摄入的siRNA相比，由蚊子RNAi装置从叶绿体dsRNA产生的siRNA被蚊子中RNA诱导的沉默复合体(RISC)更高效地利用。此外，与核表达的dRNA相比，在质体中包装沉默性RNA可以保护叶绿体表达的dsRNA免于在摄入期间降解。

实施例5：3HKT mRNA分析

为证实以表达3-HKT dsRNA的转基因衣藻为食的幼虫实际上确实显示出降低的3-HKT mRNA水平，从其生活周期的不同阶段(第4虫龄和蛹)期间以这些选定克隆为食的幼虫提取总RNA并且完成实时PCR分析以确定3HKTmRNA水平。

图13显示实时PCR分析的结果，所述实时PCR分析检验存活/死亡的斑须按蚊幼虫和依赖表达3-HKT dsRNA的转基因衣藻培养的蛹之间的3-HKT转录物水平。

图13A显示在依赖衣藻克隆108-13和108-15培养的存活幼虫当中所观察的3-HKT转录物水平。来自3个实验的平均ΔΔCT值接受单因素ANOVA分析。尽管表F值是3.12，但是计算的F值在3.06×10^-7显著性水平是42.08，这表明3-HKT表达水平在幼虫间显著地差异。计算的临界差异(CD)值是0.88。除了与对照相比差异不显著(3-HKT转录物水平降低小于0.88倍)的幼虫108-15C1，与对照相比，来自全部其他处理的幼虫均显示3-HKT转录物水平显著降低。

图13B显示在源自依赖108-13所培养的幼虫的死亡蛹当中所观察的3-HKT转录物水平。来自3个实验的平均ΔΔCT值接受单因素ANOVA分析。尽管表F值是5.14，但是计算的F值5.55×10^-5显著性水平是75.66，这表明与对照相比，3-HKT表达水平在死蛹间显著地差异。计算的CD值是0.41，这表明与对照相比，来自处理的死蛹具有显著较低的3-HKT转录物水平。图13C显示在源自依赖108-13、108-15和153-15转基因衣藻克隆所培养的幼虫的死亡蛹当中所观察的3-HKT转录物水平。来自3个实验的平均ΔΔCT值接受单因素ANOVA分析。尽管表F值是4.07，但是计算的F值1.86×10^-7显著性水平是157.97，这表明与对照相比，3-HKT表达水平在死蛹间显著地差异。计算的临界CD值是0.38，这表明与对照相比，来自处理的死蛹具有显著较低的3-HKT转录物水平。全部实验重复3次(N＝3)，每次5个重复。在全部实验中，将3-HKT转录物水平相对于斑须按蚊肌动蛋白转录物水平归一化。

总之，我们已经证实，衣藻中产生的靶向蚊子必需基因的的dsRNA可以作为有效策略用来选择性地调节基因表达和控制蚊子群体。

SEQ ID Nos.

SEQ.ID.NO.1

1TGTTACGGTA GCGGTACCTG TTTGCCGAAG TGTTGTCAGCTTGGTGTTCT AGAGTGAGGG

61TATAACTAAC GCTGCCCTAA AGTTGGAAGA AGGGGAATAACGTAAACGAC ACACCTCAGT

121GACATTGTGC GAATTGTCCC GTATTGTATT AACTTACTGAAAGTGCTGAT ACAATGAAGT

181TCACGCCGCC CCCTGCATCG CTACGCAATC CTTTAATCATTCCGGAAAAG ATAATGATGG

241GCCCTGGACC GTCCAACTGC TCAAAGCGGG TGCTGACTGCCATGACTAAC ACCGTGCTGA

301GCAACTTCCA CGCTGAATTG TTCCGAACGA TGGACGAGGTCAAGGATGGC TTGCGGTACA

361TTTTTCAGAC AGAAAACCGG GCCACTATGT GCGTAAGCGGTTCCGCACAC GCGGGAATGG

421AAGCTATGCT GAGCAATCTG CTTGAAGAGG GCGATCGAGTGCTGATCGCG GTTAACGGAA

481TTTGGGCAGA GCGTGCCGTC GAAATGTCTG AGCGATACGGTGCCGATGTT CGAACGATTG

541AGGGCCCTCC GGACCGCCCG TTCAGTTTGG AAACATTGGCCAGAGCCATC GAACTGCATC

601AACCCAAGTG TCTGTTCCTG ACGCACGGTG ACTCATCAAGTGGTCTGCTG CAGCCGCTGG

661AAGGTGTAGG CCAGATTTGT CACCAGCACG ACTGTTTGCTCATCGTTGAT GCCGTGGCTT

721CGCTGTGCGG TGTGCCATTT TATATGGATA AATGGGAGATTGATGCCGTC TATACTGGAG

781CGCAAAAGGT GCTAGGTGCG CCTCCTGGTA TCACTCCCATTTCTATAAGC CCGAAAGCAC

841TGGATGTTAT TCGAAATCGT CGTACAAAAT CGAAAGTATTTTACTGGGAT TTACTGCTGC

901TTGGCAATTA TTGGGGCTGT TATGATGAAC CAAAACGTTATCACCATACT GTCGCATCGA

961ACTTAATATT TGCTCTGCGG GAAGCATTGG CTCAAATTGCGGAAGAAGGA CTGGAAAATC

1021AGATCAAACG CCGCATCGAA TGTGCCCAAA TCTTGTACGAAGGGCTTGGT AAGATGGGAC

1081TCGATATTTT CGTGAAAGAC CCCAGACATC GCCTGCCCACCGTAACTGGT ATTATGATTC

1141CGAAAGGTGT TGACTGGTGG AAAGTTTCAC AATACGCCATGAACAATTTT TCGTTAGAAG

1201TACAAGGAGG ACTTGGACCT ACGTTTGGAA AAGCATGGCGTGTGGGTATT ATGGGCGAAT

1261GCTCAACGGT ACAAAAAATA CAATTCTATC TATATGGCTTTAAGGAATCA CTCAAAGCCA

1321CGCATCCCGA CTATATTTTC GAGGAAAGTA ATGGATTTCACTAGACGAAA CTTAAACAAT

1381GCATCAATGT ATTATTGCCG

SEQ.ID.NO.2ATGAACCAAAACGTTATCACCATACTGTCGCATCGAACTTAATATTTGCTCTGCGGGAAGCATTGGCTCAAATTGCGGAAGAAGGACTGGAAAATCAGATCAAACGCCGCATCGAATGTGCCCAAATCTTGTACGAAGGGCTTGGTAAGATGGGACTCGATATTTTCGTGAAAGACCCCAGACATCGCCTGCCCACCGTTACTGGTATTATGATTCCGAAAGGTGTTGACTGGTGGAAAGTTTCACAATACGCCATGAACAATTTTTCGTTAGAAGTACAAGGAGGACTTGGACCTACGTTTGGAAAAGCATGGCGTGTGGGTATTAT

SEQ.ID.NO.3

(5′ATGCTAAGCTTGCATGCATGAACCAAAACGTTATCACCATAC-3′)

SEQ.ID.NO.4

(5′-AAGATGGATCCGCTAGCATAATACCCACACGCCATGC-3′)

SEQ.ID.NO.5

(5′-AGTCAGAGCTCCCATGGATGAACCAAAACGTTATCACCATAC-3′)

SEQ.ID.NO.6

(5′-ATTTAGCGGCCGCCATATGAACCAAAACGTTATCACCATAC-3′)

SEQ.ID.NO.7

(5′-AATAAACTAGTCTGCAGATAATACCCACACGCCATGC-3′)

SEQ.ID.NO.8

ATTATATGCATGTGAAGGTGAGCAGGTGTTCAGGGCGC-3′)

SEQ.ID.NO.9

(5′-TAAGATACTAGTAGCCTGCGGACACGGCGACAC-3′)

SEQ.ID.NO.10

(5′-ATCTATCTAGAAGGTGCATGCGCTCCACGCATTAG-3′)

SEQ.ID.NO.11

(5′-AAGATCTGCAGCATATGTTTGAATCCTGCGTGTCACGTCCGC-3′)

SEQ.ID.NO.12

(5′-GGTCGTAACCACCGGTATTG-3′)

SEQ.ID.NO.13

(5′-GGTGGTGGTGAACGAGTAGC-3′)

SEQ.ID.NO.14

(5′-TTTAGCCTGGAAACGCTGAC-3′)

SEQ.ID.NO.15

(5′-TCGATTTCCCATTTGTCCAT-3′)

Claims

1.一种递送小干扰RNA至宿主生物的方法，所述方法包括步骤

i)提供植物，所述植物包含在植物的叶绿体中表达的沉默性核糖核酸，

ii)将所述植物饲喂给所述宿主生物。

2.一种调节靶基因在宿主生物中表达的方法，所述方法包括步骤：

i)提供植物，所述植物包含在植物的叶绿体中表达的沉默性核糖核酸，其中所述沉默性RNA是对所述宿主生物的靶基因特异的；

ii)将所述植物饲喂给所述宿主生物。

3.一种保护宿主生物免遭寄生体或病原体影响的方法，所述方法包括步骤

i)提供植物，所述植物包含在植物的叶绿体中表达的沉默性核糖核酸，其中所述沉默性RNA是对所述寄生体或病原体的靶基因特异的；

ii)将所述植物饲喂给所述宿主生物。

4.一种用于控制采食植物的害虫的方法，其包括步骤

i)提供植物，所述植物包含在植物的叶绿体中表达的沉默性核糖核酸，其中所述沉默性RNA是对所述害虫的靶基因特异的；

ii)将所述植物提供给所述害虫。

5.一种转基因植物，其包含沉默性核糖核酸，

其中所述沉默性RNA在植物的叶绿体中表达，和

其中沉默性RNA是对能采食所述转基因植物的生物的靶基因或第二生物的病原体或寄生体的靶基因特异的。

6.一种用于控制昆虫的方法，所述方法包括：

其中所述有义RNA链包含与所述靶基因中至少约20个连续核苷酸的靶序列基本上相同的核苷酸序列；

7.一种抑制靶基因在昆虫中表达的方法，所述方法包括：

i)提供包含沉默性核糖核酸的微藻，所述沉默性核糖核酸在摄入所述微藻后发挥作用以抑制所述寄生体或病原体的靶基因的表达，

ii)将所述微藻饲喂给所述昆虫或其幼虫形式。

8.一种用于保护以微藻为食的宿主生物免遭寄生体和病原体感染的方法，其包括：

其中所述靶基因的表达是对所述寄生体或病原体的功能、生长、发育、感染性或繁殖必需的，

ii)将所述微藻饲喂给所述宿主生物。

9.一种抑制靶基因在侵袭宿主生物的病原体或寄生体中表达的方法，所述方法包括：

ii)将所述微藻饲喂给所述宿主生物。

10.一种微藻，其包含在微藻由昆虫摄入后发挥作用以抑制所述昆虫媒介的靶基因表达的沉默性核糖核酸；

其中所述沉默性核糖核酸包含有义RNA链和反义RNA链，其中所述有义和反义RNA链形成RNA双链体，

其中所述有义RNA链包含与所述靶基因中至少约20个连续核苷酸的靶序列基本上相同的核苷酸序列，并且

其中所述沉默性RNA在微藻的叶绿体内部表达。

11.一种分离的沉默性核糖核酸，其由昆虫摄入时发挥作用以抑制所述昆虫媒介的靶基因表达；

其中所述有义RNA链包含与所述靶基因中至少约20个连续核苷酸的靶序列基本上相同的核苷酸序列。

12.一种分离的多核苷酸，其在微藻中表达时发挥作用以形成沉默性核糖核酸，所述沉默性核糖核酸在微藻由昆虫媒介摄入后发挥作用以抑制所述昆虫媒介的靶基因的表达，

13.一种分离的多核苷酸，其在宿主生物中表达时发挥作用以形成沉默性核糖核酸，在所述沉默性核糖核酸由所述宿主生物的寄生体或病原体摄入时，所述沉默性核糖核酸发挥作用以抑制所述寄生体或病原体的靶基因的表达，

14.一种用于宿主生物以保护所述生物免遭一种或多种寄生体或寄生体影响的饲喂添加物，其包含沉默性核糖核酸，所述沉默性核糖核酸在所述饲喂添加物由所述宿主生物摄入时发挥作用以抑制所述寄生体或病原体的靶基因的表达，

15.一种用于选择性控制蚊子的方法，所述方法包括：

i)提供包含沉默性核糖核酸的微藻，所述沉默性核糖核酸在所述微藻由蚊子幼虫摄入后发挥作用以抑制所述幼虫中3-羟基羟犬尿氨酸转氨酶的表达，

其中所述有义RNA链包含与SEQ.ID.No.1的至少约20个连续核苷酸基本上相同的核苷酸序列；

ii)将所述微藻导入所述蚊子幼虫的栖息地中，其中所述蚊子幼虫可以摄入所述微藻。

16.一种用于防止由蚊子传播的病原体或寄生体扩散的方法，所述方法包括：

其中所述有义RNA链包含与SEQ.ID.No1的至少约20个连续核苷酸基本上相同的核苷酸序列；

17.一种用于产生将有效控制昆虫的沉默性RNA的方法，所述方法包括：

i)合成编码许多一种或多种目的RNA种类的多核苷酸文库；

iv)从步骤iv)中鉴定的所述细胞或多个细胞建立一个或多个细胞克隆群体。

18.一种用于产生沉默性RNA的方法，所述沉默性RNA将有效用于保护以微藻为食的宿主生物免遭寄生体和病原体感染，所述方法包括：

i)合成编码许多一种或多种目的RNA种类的多核苷酸文库；

19.一种用于选择用于沉默性RNA中的核苷酸序列的方法，所述沉默性RNA用于在微藻中表达以便控制可能传播寄生体和病原体的昆虫媒介，所述方法包括步骤；

ii)将所述转化的微藻饲喂给所述寄生体或病原体；

20.一种用于选择用于沉默性RNA中的核苷酸序列的方法，所述沉默性RNA用于保护以微藻为食的宿主生物免遭寄生体和病原体感染，所述方法包括步骤；

ii)将所述转化的微藻饲饲喂给所述宿主生物；

21.一种用于控制侵入性物种的方法，所述方法包括：

i)提供包含沉默性核糖核酸的微藻，所述沉默性核糖核酸在摄入所述微藻后发挥作用以抑制所述侵入性物种的靶基因的表达，

其中所述靶基因的表达是对所述侵入性物种的功能、生长、发育、感染性或繁殖必需的，

其中所述有义RNA链包含与所述靶基因中至少约20个连续核苷酸的靶序列基本上相同的核苷酸序列；并且

ii)将所述微藻导入所述侵入性物种的栖息地中，其中所述侵入性物种或其幼虫形式摄入所述微藻。

22.一种抑制靶基因在侵入性物种中表达的方法，所述方法包括：

其中所述靶基因的表达是对所述侵入性物种的存活必需的，其中所述沉默性核糖核酸包含有义RNA链和反义RNA链，

其中所述有义和反义RNA链形成RNA双链体，并且

ii)将所述微藻饲喂给所述侵入性物种或其幼虫形式。

23.根据权利要求21或22所述的方法，其中所述侵入性物种在其生活周期的至少一个阶段消耗微藻。

24.根据权利要求21、22或23所述的方法，其中所述侵入性物种选自贻贝科(Mytilidae)的贻贝和帘蛤科(Veneridae)的蛤。

25.根据权利要求21、22或23所述的方法，其中所述侵入性物种是斑纹贻贝(Dreissena polymorpha)。

26.根据权利要求1-5中任一项所述的方法，其中所述植物是微藻。

27.根据权利要求8或9所述的方法，其中所述宿主生物选自对虾科(Penaeidae)的小虾和对虾、鲤科(Cyprinidae)的鲤和源于罗非鱼(tilapinecichlid)族的非鲫属(Tilapia)。

28.根据权利要求27所述的方法，其中所述宿主生物选自南美白对虾(Penaeus vannamei)、斑节对虾(Penaeus monodon)、蓝对虾(P.stylirostris)、中国对虾(P.chinensis)、日本对虾(P.japonicus)、印度对虾(P.indicus)和墨吉对虾(P.merguiensis)。

29.根据权利要求28所述的方法，其中所述病原体或寄生体选自病毒，包括Taura综合征病毒(TSV)、传染性皮下及造血组织坏死病毒(IHHNV)、线极病毒(WSSV)、若尼病毒(ronivirus)(YHV、GAV、LOV)、形成包涵体的肠杆状病毒(occluded enteric baculovirus)(BP)、形成包涵体的肠杆状病毒(MBV)、不形成包涵体的肠杆状病毒(BMN)、肠细小病毒(HPV)、细菌，包括α-变形菌门(NHP)，和原生动物，包括微孢子虫(Microsporidian)、单孢子虫(Haplosporidian)及簇虫(Gregarine)。

30.根据权利要求28所述的方法，其中所述宿主生物选自草鱼(Ctenopharyngodon idella)、鲤鱼(Cyprinus carpio)、鲢鱼(Hypophthalmichthysmolitrix)、大鳞鲢(Hypophthalmichthys harmandi)、鳙鱼(Hypophthalmichthysnobilis)、青鱼(Mylopharyngodon piceus)、普通金鱼(Carassius auratus)和鲫鱼(Carassius carassius)。

31.根据权利要求31所述的方法，其中所述病原体或寄生体选自多子小瓜虫(Ichthyophthirius multifilis)(Ich：)、车轮虫属(Trichodina)、口丝虫属(Costia)、斜管虫属(Chilodonella)、鲤鲺(Argulus foliaceus)、鲤锚头鳋(Lernaeacyprinacea)、鱼虱(Ergasilus sieboldi)、坏鳃指环虫(Dactylogyrus vastator)和尺蠖鱼蛭(Piscicola geometra)。

32.根据权利要求28所述的方法，其中所述宿主生物选自口孵非鲫属(Oreochromis spp.)、帚齿非鲫属(Sarotherodon spp)和非鲫属(Tilapia spp.)。

33.根据权利要求32所述的方法，其中所述病原体或寄生体选自链球菌属(streptococcus)、气单胞菌属(aeromonas)、车轮虫属(trichodina)、柱状溶胞菌columnaris和虹彩病毒(Iridovirus)。在另一个方面，病原体或寄生体选自纤毛虫、甲藻、吸虫类、甲壳类、桡足类和医蛭科(Hirudidae)。

34.根据权利要求6或7所述的方法，其中所述昆虫选自按蚊属(Anopheles sps)、库蚊属(Culex)、曼蚊属(Mansonia)和埃及伊蚊(Aedesaegypti)。

35.根据权利要求17所述的方法，其中所述病原体或寄生体选自圣路易斯脑炎病毒(SLE)、西方马脑炎病毒(WEE)、委内瑞拉马脑炎病毒(VEE)、东方马脑炎病毒(EEE)、La Crosse病毒(LACV)、东方马脑炎病毒(EEEV)、委内瑞拉马脑炎病毒(VEEV)、乙型脑炎病毒(JE)、黄热病毒、裂谷热(RVF)病毒、西尼罗病毒、登革病毒(DENV1、DENV2、DENV3、或DENV4)、恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)、间日疟原虫(P.vivax)、卵形疟原虫(P.ovale)和三日疟原虫(P.malariae)。

36.根据权利要求6-9和15至35中任一项所述的方法，其中所述沉默性RNA在叶绿体内部表达。

37.根据权利要求6-9和15至36中任一项所述的方法，其中所述微藻选自海产绿藻(Chlamydomas perigranulata)、淡水衣藻(Chlamydomonasmoewusii)、莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)和衣藻属的种(Chlamydomonas sp.)。