CN107849515A

CN107849515A - 转基因微藻及其作为用于递送干扰rna分子的饲料的用途

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Publication number: CN107849515A
Application number: CN201680041093.XA
Authority: CN
Inventors: 奥芙拉·陈
Original assignee: Co Ltd Of Te Langsage Israel
Current assignee: Co Ltd Of Te Langsage Israel; TransAlgae Ltd
Priority date: 2015-07-14
Filing date: 2016-07-14
Publication date: 2018-03-27
Also published as: JP2018520656A; JP7402479B2; US10781447B2; BR112017027260A2; EP3322798A1; IL256387B2; US11939576B2; WO2017009838A1; EP3322798A4; US20210032625A1; IL256387B; IL256387A; AU2016291813B2; AU2016291813A1; CA2986880A1; US20180195065A1

Abstract

本发明提供了表达至少一种异源RNAi分子的非繁殖转基因微藻。表达RNAi的非繁殖转基因微藻用于将RNAi分子以其完整和功能形式口服递送至靶生物体。微藻内存在的异源RNAi分子的特征在于为生物活性的、对摄取微藻的生物体或所述生物体的病原体施加至少一种特定的作用。特别地，非繁殖转基因微藻用作动物和植物害虫的生物防治剂。

Description

转基因微藻及其作为用于递送干扰RNA分子的饲料的用途

发明领域

本发明涉及包含异源RNA干扰(RNAi)分子的非繁殖转基因微藻(non-propagatingtransgenic microalgae)及其用于将RNAi分子递送至摄取转基因微藻的靶生物体或经由被喂食或暴露于表达RNAi分子的微藻的居间(intervening)生物体摄取转基因微藻的靶生物体，特别地用于动物害虫或植物害虫的生物防治的用途。

发明背景

RNA干扰(RNAi)为与靶基因的特定区域同源的包含有义RNA和反义RNA的双链RNA(dsRNA)影响靶基因转录物的裂解，导致其功能的抑制的现象。它被发现于线虫(nematode)秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans)中(Guo,S.和Kemphues,K.J.1995.Cell 81:611-620)，并且之后被证明存在于布氏锥虫(Trypanosoma brucei)、果蝇属(Drosophila)、脉孢菌属(Neurospora)、植物细胞和哺乳动物细胞中(Wianny,F.和Zernicka-Goetz,M.2000.Nat Cell Biol 2:70-75；Cogoni C.2000.Curr Opin Genet Dev 10(6):638-43；Kennerdell.2000.Nat Biotechnol Aug；18(8):896-8)。

RNAi由RNA诱导沉默复合物(RISC)控制，并由细胞的细胞质中的dsRNA分子启动。dsRNA分子的来源可以是外源的或内源的。切酶(Dicer enzyme)将dsRNA分子裂解为～20个核苷酸的短双链片段，其被称为小干扰RNA(siRNA)。这些短聚合物诱导互补mRNA的裂解。

RNAi已被证明为在数个研究领域中非常有前景的工具，例如在基因组学中用于真核生物中的基因功能确定和基因敲低(gene knockdown)。在生物技术方面，RNAi因为其高特异性显示出大的潜能，使其能够在医学中使用用于特异性控制癌症和病毒疾病以及在农业和水产养殖的害虫防治中使用。

微藻(microalgae)(单细胞藻类(alga)或浮游植物)代表了地球上最大、但最未被了解的微生物界。就像植物对于陆生动物一样，微藻代表水生食物链中的天然营养基础和所有植物营养物质的主要来源。藻类可以用作产生生物活性分子，包括遗传工程化的酶、疫苗或其他蛋白的有效平台。产生的分子可以从微藻中提取，或者可以在微藻内口服递送至靶生物体。已经报道了藻类中重组蛋白的表达，并且多种方法可用于在藻类细胞内产生外源蛋白，包括在细胞质体内的表达。

美国申请公布第2008/0107652号公开了转基因微藻用于预防、改善或治疗水生动物中的疾病的用途。转基因藻类被直接地或间接地喂食至水生动物。该系统被提议用于递送免疫原性肽、单链抗体片段和DNA疫苗。

核酸分子已经作为多功能工具出现，具有在多种生物化学、诊断和治疗应用中的有前景的效用。然而，由于缺乏有效的递送系统，这些分子的使用仍然稀少。通过喂食的核酸递送系统的成功开发受到多种屏障的挑战，其中最重要的障碍之一为肠粘膜。肠粘膜用作物理屏障和生物化学屏障两者，将外部环境与身体的内部环境分开。

美国专利第8,633,028号公开了dsRNA在甲壳动物(crustaceans)和其他无脊椎动物中诱导的特异性和非特异性免疫。所提供的系统和方法包括用靶向感染虾的病毒的dsRNA处理虾。在一个说明的实施方案中，被注射至海产虾凡纳滨对虾(Litopenaeusvannamei)中的dsRNA阻断了病毒感染。

然而，通过注射肠胃外施用核酸是不方便的，因为涉及风险并且还因为接受者的疼痛和恐惧。已经提出了用于肠胃外施用核酸的多种其他方法。例如，美国专利第8,524,679号公开了经由细胞间转移将核酸，包括dsRNA体内递送至哺乳动物靶细胞的方法。核酸的递送为通过直接转染动物细胞。美国专利第8,445,456号公开了介导RNA干扰的核酸分子用于治疗或降低疼痛的用途。然而，此发明公开了核酸分子通过注射被施用至患者。当靶生物体为水生动物或大量陆生动物时，肠胃外施用实际上为不可能的。

已经测试了RNAi剂的另外的应用模式。例如，美国专利第8,404,832号公开了口服施用siRNA，其中siRNA链为化学修饰的。

用于口服递送的另一个实例在携带被设计为靶向寄生线虫(南方根结线虫(Meloidogyne incognita))中的特定基因的dsRNA的转基因植物中被证明。在侵入到转基因植物细胞后，线虫摄取其细胞质并且由于dsRNA的RNAi活性死亡。因此转基因植物高度耐受线虫(Yadav等，Mol Biochem Parasitol.2006.148(2):219-22，Klink等Planta.2009.230(1):53-71)。

已经证明了使用RNAi用于保护作物植物免受昆虫食草动物的可行性(Price D R和Gatehouse J A.2008.Trends in Biotechnology 26(7):393-400；Katoch R.等，2013.Appl Biochem Biotechnol 171:847–873)。该方法依赖于将双链RNA(dsRNA)注入到昆虫血腔中(这在田间条件下不实用)，或者依赖于在饮食中直接喂食dsRNA，造成dsRNA不稳定性的问题。因此，开发在昆虫中稳健的dsRNA喂食方法为利用这种技术的先决条件。

美国申请公布第2013/0315883号公开了在转基因植物包括微藻中表达沉默RNA用于遗传防治寄生虫和病原体。此发明利用植物以有效摄取的形式在叶绿体内表达沉默RNA的能力，在摄入之后所述沉默RNA能够在叶绿体内起作用以抑制病原体或寄生虫内靶基因的表达。

转基因植物领域中的主要缺点之一为需要具有用于产生每一种转基因作物类型的特定手段(means)，但是一种类型的转基因藻类可以用于保护任何期望的作物。另外，关于遗传修饰的植物和藻类对环境的影响存在越来越多的公众关注。植物和藻类的可再生性质可能导致它们扩散到自然环境中，用外来基因污染野生型物种。

昼夜节律时钟控制生物体中的许多代谢和行为过程。在昆虫中，这些时钟及其分子机制已经被发现以许多不同的方式影响生殖。生殖行为，包括求偶、交尾和产卵(eggdeposition)，受到日节律的强烈影响(Tobback J.等，2011.Insect Biochemistry andMolecular Biology 41(5):313-321)。在哺乳动物和昆虫的昼夜节律调节网络中的核心基因之一被命名为“clock”(clk)。与其他昆虫相比，靶向以使clk基因沉默的双链RNA(dsRNA)的注射以剂量依赖性方式对沙漠蝗(desert locust，Schistocerca gregaria)的成虫和五龄若虫为致死的。clk-敲低的五龄若虫能够经历它们的成虫蜕皮，但取决于dsRNA的量，这花费它们比对照更长的时间达到成年期。作为成虫，clk-敲低的动物不像对照动物那样发育其脂肪体和卵巢(Tobback J等2012.Insect Molecular Biology 21(3):369–381)。

通过喂食施用介导RNAi的核酸分子为用于基因沉默的最期望的方法之一；然而这种递送方法的实用性仍然是一个挑战，主要是由于RNAi分子的不稳定性和由于安全问题。因此，对具有易于生产和使用、维持RNAi分子的生物活性并且促进生物活性分子系统地吸收而对环境没有负面影响的口服递送系统存在极大需求，并且这将是高度有利的。

发明概述

本发明提供了非繁殖微藻的制品(preparations)，用于将介导RNAi的核酸分子口服递送至生物体，提供由生物体对RNAi分子的系统性吸收。特别地，本发明提供了干燥的转基因微藻的制品，所述干燥的转基因微藻的制品除了微藻以外，包含靶向在靶生物体的细胞中存在的多核苷酸的至少一种异源RNAi分子。生物体可以是水生动物或陆生动物，包括昆虫害虫(insect pests)。当转基因微藻被水生动物或陆生动物摄取时，RNAi分子使靶多核苷酸沉默。另外地，微藻可以经由被喂食或暴露于表达RNAi分子的微藻的居间(intervening)生物体被提供至水生动物或陆生动物。在特定的示例性实施方案中，在植物害虫特别地昆虫的情况下，植物可以用包含靶向以使害虫基因沉默的RNAi分子的非繁殖转基因微藻至少部分地包被。

在其他可选的实施方案中，RNAi分子可以靶向以抑制对靶动物具有有害作用的基因的表达。如果它抑制对靶动物具有有害作用的基因，则它改进该动物的存活和福利。

本发明的微藻RNAi递送制品比迄今已知的表达RNAi的微藻有利，因为该微藻细胞是非存活的并且不能繁殖，并且因此不会造成在环境中扩散遗传工程化生物体的任何风险。

根据一些实施方案，包含RNAi分子的非繁殖微藻被用作适用于喂食动物的动物食物或食物添加剂或作为害虫天然食物的一部分。

异源RNAi分子的特征在于在被异种靶生物体摄取后，为生物活性的、稳定的和高度特异性的，抑制所述靶生物体内靶基因的表达。

本发明部分地基于以下意料不到的发现：在干燥的微藻中表达的dsRNA分子可以以完整和活性形式被转移至摄取该微藻的昆虫中。在本文下文例示的某些实施方案中，靶基因为昆虫发育的必需基因，使得所述基因的沉默导致昆虫发育的抑制和/或负面改变。

不希望被任何理论或者作用机制所束缚，RNAi分子的保存活性可以归因于本文提供的dsRNA稳定结构和干燥工艺。另外，微藻细胞壁，特别地藻类三角褐指藻(Phaeodactylum tricornutum)的细胞壁用作保护RNAi分子免于在靶水生动物或陆生动物的消化道中被降解的天然包封材料，因此使RNAi分子能够被吸收至靶动物的血液或血淋巴中。然后RNAi分子抑制所述动物的细胞内的靶基因的表达。在通过脊椎动物或昆虫的发达的消化系统之后保持完整的RNAi分子是非常意料不到的。

根据一个方面，本发明提供了一种非繁殖转基因微藻，所述非繁殖转基因微藻包含至少一种异源RNAi分子，其中所述RNAi分子靶向异种生物体内存在的多核苷酸，并且其中当所述微藻被所述异种生物体或被所述异种生物体的宿主摄取时，所述RNAi分子使所述异种生物体内存在的所述多核苷酸的表达沉默。

根据某些实施方案，非繁殖转基因微藻呈干燥的形式。根据某些示例性实施方案，转基因微藻使用冷冻干燥或微波真空干燥方法进行干燥。

根据某些实施方案，非繁殖转基因微藻包含多个拷贝的RNAi分子。

根据某些示例性实施方案，RNAi分子在微藻的细胞核内被转录。

根据某些实施方案，RNAi分子包含有义链和反义链，所述有义链和所述反义链一起形成双链体，所述有义链包含与异种生物体内存在的靶多核苷酸具有至少95％同一性的至少19个连续核酸。根据另外的实施方案，当与异种生物体内存在的靶多核苷酸相比时，至少19个连续核酸包含1个、2个、3个或4个取代。每一种可能性代表本发明的单独的实施方案。

根据某些实施方案，有义链和反义链各自包含从约20个至约1500个核苷酸长度。可选地，有义链和反义链各自包含从约50个至约1000个核苷酸长度，另外可选地每一条链包含从约100个至约800个核苷酸，又另外可选地每一条链包含从约150个至约500个核苷酸长度。

根据某些实施方案，有义链和反义链被接头序列分开。根据某些示例性实施方案，接头序列为内含子序列。根据一些实施方案，内含子来自微藻三角褐指藻，具有SEQ ID NO:6中列出的核酸序列。根据另外的某些示例性实施方案，RNAi分子的总长度为从约1,000bp至约1,500bp。根据当前某些示例性实施方案，RNAi分子的总长度为约1200bp。不希望被任何特定的理论或作用机制所束缚，内含子的存在和RNAi分子的总长度有助于在微藻的加工期间、特别地在干燥期间、以及在其被靶生物体摄取期间RNAi分子的意料不到的稳定性，使得其可以针对靶生物体的基因或其中存在的外源基因施加其沉默活性。

根据本发明的教导可以使用多种微藻物种，只要微藻在转化之后维持或再生它们的细胞壁结构。根据某些示例性实施方案，微藻为真核的。根据某些实施方案，微藻为海洋微藻。根据某些实施方案，海洋微藻选自但不限于由以下组成的组：三角褐指藻；杜氏藻属物种(Dunaliella spp.)；微拟球藻属物种(Nannochloropsis spp.)，包括眼点微拟球藻(Nannochloropsis oculata)、Nannochloropsis salina、富油微拟球藻(Nannochloropsisgaditana)；微绿球藻属物种(Nannochloris spp.)，四爿藻属物种(Tetraselmis spp.)，包括肩突四爿藻(Tetraselmis suecica)、朱氏四爿藻(Tetraselmis chuii)；球等鞭金藻(Isochrysis galbana)；巴夫藻属物种(Pavlova spp.)；透明茧形藻(Amphiprorahyaline)；牟氏角毛藻(Chaetoceros muelleri)；和富油新绿藻(Neochlorisoleoabundans)。每一种可能性代表本发明的单独的实施方案。

根据某些示例性实施方案，微藻选自由以下组成的组：三角褐指藻、微绿球藻属物种、微拟球藻属物种和杜氏藻属物种。

根据某些当前示例性实施方案，微藻为三角褐指藻。不希望被任何特定的理论或作用机制所束缚，三角褐指藻(P.tricornutum)的硅化壁可以充当一种形式的包封，其在整个藻类生物质的生长、收获和加工中保护在藻类细胞内表达的RNAi分子免于外部恶劣环境的影响以及进一步免于摄取藻类的动物的胃肠道环境的影响。

根据某些实施方案，异种生物体内存在的靶多核苷酸为所述生物体的内源基因。

根据某些实施方案，异种生物体为害虫。根据这些实施方案，RNAi分子使对害虫生长和/或再发育必需的基因的表达沉默，其中所述沉默对所述害虫具有有害作用。根据某些示例性实施方案，害虫为植物害虫。根据某些示例性实施方案，植物害虫为攻击作物植物、森林植物(特别地树木)、观赏植物或其任何组合的昆虫。

根据一些实施方案，昆虫属于直翅目(Orthoptera)。根据其他实施方案，昆虫为沙漠蝗(Schistocerca gregaria)。根据其他实施方案，昆虫为飞蝗(migratory locust，locusta migratoria)。根据一些实施方案，昆虫属于鳞翅目(Lepidoptera)。根据某些示例性实施方案，鳞翅目为斜纹夜蛾属(prodenia)。根据其他示例性实施方案，斜纹夜蛾属为棉树叶虫(leafworm)灰翅夜蛾(Spodoptera littoralis)。根据其他实施方案，昆虫属于鞘翅目(Coleoptera)。根据示例性实施方案，鞘翅目为甲虫。根据某些示例性实施方案，甲虫为粉虫甲虫黄粉虫(Tenebrio molitor)。

根据其他实施方案，害虫为动物害虫。根据一些实施方案，动物为水产养殖动物。根据某些示例性实施方案，水产养殖动物选自鱼类和甲壳动物。

根据另外的实施方案，动物为陆生动物。根据某些示例性实施方案，陆生动物选自农场动物和宠物。

根据其他实施方案，异种生物体中靶内源基因的沉默对植物，特别地作物植物或对被所述异种生物体损害的动物具有有益作用。根据这些实施方案，生物体中靶内源基因的沉默对摄取微藻的生物体的生长、发育、存活、健康和福利中的至少一个具有有害作用，使得微藻或包含所述微藻的组合物可以被称为杀虫剂。每一种可能性代表本发明的单独的实施方案。

根据某些实施方案，异种生物体为昆虫飞蝗(locusta migratoria)。根据某些实施方案，异种生物体为昆虫沙漠蝗(Schistocerca gregaria)。根据某些示例性实施方案，RNAi分子靶向沙漠蝗(Schistocerca gregaria)clk基因，导致蝗虫的扰乱的发育和/或死亡。根据某些实施方案，RNAi分子靶向沙漠蝗的clk基因，所述clk基因包含SEQ ID NO:1中列出的核酸序列。根据某些示例性实施方案，RNAi分子包含有义链和反义链，所述有义链包含SEQ ID NO:2中列出的核酸序列或其片段，所述反义链与所述SEQ ID NO:2或其片段基本上互补。根据某些示例性实施方案，RNAi分子包含有义链、接头序列和反义链，所述有义链包含SEQ ID NO:2中列出的核酸序列；所述接头序列包含SEQ ID NO:6中列出的核酸序列；所述反义链包含SEQ ID NO:3中列出的核酸序列。

根据某些示例性实施方案，本发明提供了一种非繁殖转基因微藻，所述非繁殖转基因微藻包含靶向沙漠蝗的clk基因的RNAi分子，其中所述clk基因包含SEQ ID NO:1中列出的核酸序列。根据另外的示例性实施方案，本发明提供了一种非繁殖转基因微藻，所述非繁殖转基因微藻包含RNAi分子，所述RNAi分子包含有义链、接头序列和反义链，所述有义链包含SEQ ID NO:2中列出的核酸序列；所述接头序列包含SEQ ID NO:6中列出的核酸序列；所述反义链包含SEQ ID NO:3中列出的核酸序列。

根据其他实施方案，异种生物体内存在的多核苷酸为所述生物体的异源基因。根据某些示例性实施方案，异源多核苷酸属于感染异种生物体的病毒，并且RNAi分子靶向以使病毒基因沉默。

根据某些示例性实施方案，异种生物体为甲壳动物，并且异源多核苷酸属于白斑综合征病毒(WSSV)。

又根据另外的实施方案，异种生物体为病原体，并且非繁殖转基因微藻被病原体的宿主摄取。根据这些实施方案，RNAi分子靶向病原体的多核苷酸以使其表达沉默。

根据示例性实施方案，使病原体多核苷酸沉默对病原体的生长和/或增殖和/或发育具有有害作用，因此对被所述病原体感染的宿主生物体的生长、发育、存活、福利和健康中的至少一个具有积极作用。

根据某些实施方案，病原体选自由以下组成的组：寄生虫和细菌。

根据某些示例性实施方案，感染的宿主为水产养殖生物体。根据某些实施方案，水产养殖生物体选自鱼类和甲壳动物。根据某些示例性实施方案，靶病原体为管口目(Siphonostomatoida)的桡足类。根据其他实施方案，桡足类属于纲鱼虱科(Caligidae)。又根据另外的实施方案，桡足类为鲑疮痂鱼虱(Lepeophtheirus salmonis)，以宿主海洋鱼类的粘液、表皮组织和血液为食的海洋外寄生物(marine ectoparasites)，宿主海洋鱼类中有鲑科(Salmonidae)的鱼类。

又根据其他实施方案，感染的宿主选自由以下组成的组：家养农场动物和宠物。每一种可能性代表本发明的单独的实施方案。

根据一些实施方案，农场动物为家禽，并且寄生虫属于短角鸟虱科(Menoponidae)。根据某些示例性实施方案，家禽寄生虫选自由以下组成的组：大鸡虱(Menacanthus stramineus)和鸡羽虱(Menopon gallinae)。

根据某些实施方案，当与未摄取转基因微藻的生物体中的相同靶基因或多核苷酸的表达相比时，靶基因或多核苷酸的表达被抑制至少10％、30％、50％、70％、90％、99％或更多。

又根据另外的实施方案，RNAi分子为siRNA。根据一些实施方案，表达siRNA的异源多核苷酸包含约20-25个核酸长度的有义序列和与所述20-25个核酸互补的反义序列。

又根据其他实施方案，将本发明的RNAi分子掺入到使其能够在微藻中表达的DNA构建体中。根据一个实施方案，DNA构建体包含选自由以下组成的组的至少一个表达调节元件：启动子、增强子、复制起点、转录终止序列等。

根据一些实施方案，DNA构建体包含启动子。如本领域已知的，启动子可以是组成型或诱导型的。根据通常的实施方案，启动子为在微藻中可操作的组成型启动子。根据其他实施方案，DNA构建体还包含转录终止序列信号。根据某些实施方案，编码RNAi分子的多核苷酸被可操作地连接至位于有义链和反义链两者上游的单一启动子。根据某些实施方案，RNAi分子的每一条链由具有其自身启动子的多核苷酸编码。根据一些实施方案，每一个启动子被可操作地连接并且位于编码有义链和反义链的每一个的多核苷酸的上游。根据某些实施方案，每一条链从不同的DNA构建体转录。

根据某些实施方案，本发明的微藻可以本身被施用和摄取，或者可以被配制为还包含可食用的稀释剂、赋形剂或载体的可食用的组合物。术语“可食用的”在本文中以其最宽的范围使用，并且包括可以被水生动物和被植物和动物害虫(包括昆虫)摄取的组合物。微藻或包含所述微藻的组合物还可以被用作食品添加剂。

根据某些实施方案，基于藻类的可食用的制剂为动物食物组合物，包括用于水产养殖的食物组合物。

根据一些实施方案，基于藻类的可食用的组合物被配制为至少部分地覆盖异种生物体的食物来源。根据某些示例性实施方案，生物体为植物昆虫或植物寄生虫，并且基于藻类的可食用的组合物至少部分地覆盖所述植物。

根据某些实施方案，异种生物体属于直翅目。又根据其他实施方案，生物体属于鳞翅目。又根据另外的实施方案，生物体属于鞘翅目。

又根据另外的实施方案，生物体属于线虫门(Nematoda)。

又根据其他实施方案，基于藻类的可食用的制剂用作用于动物病原体(包括动物寄生虫)的宿主的食物来源，其中RNAi分子靶向动物病原体的多核苷酸。根据一些实施方案，动物病原体为海虱寄生虫，并且宿主为鲑鱼(salmon fish)。根据其他实施方案，宿主为水产养殖动物或陆生动物，并且动物病原体为病毒或细菌。

根据某些实施方案，微藻被配制为喷雾悬浮液的形式。根据一些实施方案，喷雾悬浮液被喷洒在作物植物上。根据一些实施方案，喷雾悬浮液被喷洒在植物叶片上。根据某些实施方案，悬浮液被喷洒在可食用的植物部分诸如水果上。根据其他实施方案，微藻悬浮液被喷洒在小麦幼苗上。

根据另外的方面，本发明提供了一种用于将RNAi分子口服递送至生物体的方法，所述方法包括将包含表达RNAi分子的多核苷酸的非繁殖转基因微藻口服施用至生物体，其中所述RNAi分子使生物体内存在的基因或其一部分的表达沉默。

生物体为如上文描述的任何生物体。

根据某些示例性实施方案，本发明提供了一种用于使沙漠蝗的clk基因沉默的方法，所述方法包括将包含靶向clk基因的RNAi分子的非繁殖转基因微藻口服递送至沙漠蝗，所述clk基因包含SEQ ID NO:1中列出的核酸序列。根据另外的示例性实施方案，本发明提供了一种用于使沙漠蝗的clk基因沉默的方法，所述方法包括将包含RNAi分子的非繁殖转基因微藻口服递送至沙漠蝗，所述RNAi分子包含有义链、接头序列和反义链，所述有义链包含SEQ ID NO:2中列出的核酸序列；所述接头序列包含SEQ ID NO:6中列出的核酸序列；所述反义链包含SEQ ID NO:3中列出的核酸序列。

微藻为如上文描述的任何微藻。根据某些实施方案，非繁殖转基因微藻呈干燥的形式。

根据一些实施方案，非繁殖转基因微藻通过覆盖生物体食物来施用。组合物被配制用于喂食如上文描述的任何生物体。

应当明确地理解，本发明的范围涵盖具有如本领域已知的一个或更多个核酸取代、以及核酸衍生物、非天然核酸和合成核酸的同源物、类似物、变体和衍生物，包括较短和较长的多核苷酸，以及RNA和多核苷酸类似物，条件是，根据本发明的教导，这些变体及修饰必须在转基因藻类摄取后保存RNAi活性。

本发明的其他目的、特征和优点从以下描述和附图将变得清楚。

附图简述

图1示出了包含clk的有义和反义核酸序列片段(dsRNA-Clk)的pPhaT表达载体的方案。

图2示出了包含GFP的有义和反义核酸序列片段(dsRNA-GFP)的pPhaT表达载体的方案。

图3示出了包含mCherry的有义和反义核酸序列片段(dsRNA-mCherry)的pPhaT表达载体的方案。

图4示出了在喂食表达靶向mCherry的dsRNA(dsRNA-mCherry)的转基因藻类的粉虫甲虫，黄粉虫的血淋巴中dsRNA-mCherry的相对定量(RQ)。总RNA样品从被喂食用转基因藻类(dsmCherry)喷洒或用野生型藻类(WT)喷洒或者根本未用藻类(模拟(Mock))喷洒的卷心菜叶片的黄粉虫的血淋巴中提取。用dsRNA-mCherry特异性引物通过qRT-PCR分析对样品进行相对定量。合成的RNA(Primer Design)用作参考。使用ΔΔCt方法进行分析。

图5示出了在灰翅夜蛾的血淋巴中存在的dsRNA-GFP(dsGFP)和TATA盒结合蛋白(TBP)RNA水平的相对定量(RQ)。检查喂食用表达dsRNA-GFP的转基因藻类喷洒的蓖麻油(蓖麻(Ricinus communis))叶片的灰翅夜蛾的血淋巴中dsRNA-GFP和TBP的存在。野生型(WT)藻类用作对照。

图6分别示出了生殖腺和脑中的沙漠蝗内源clock和period RNA水平的相对定量(RQ)。图6A示出了年轻蝗虫生殖腺中的clock mRNA水平。在第一次蜕皮之后，从年轻成虫的生殖腺中提取RNA。与喂食WT藻类的蝗虫相比，在喂食表达dsRNA-clock(dsClock)的藻类的蝗虫中检测到clock mRNA水平降低36％(p值＝0.027)。图6B示出了成年蝗虫的脑中的period mRNA水平。RNA从蝗虫的脑中提取。与喂食WT藻类的蝗虫相比，在喂食表达dsRNA-clock的藻类的蝗虫中检测到period mRNA水平降低27％。用特异性引物通过qRT-PCR分析对样品进行相对定量。GAPDH用作持家基因。

图7示出了，使clk基因沉默导致每卵荚(egg pod)的孵化幼虫数目降低。图7A示出了与喂食WT藻类的蝗虫相比，在喂食表达dsRNA-clock(dsClock)的转基因微藻的蝗虫中的孵化卵降低多于2倍。图7B呈现了另外的实验结果，其显示了在整个实验中与由喂食用表达dsGFP(对照dsRNA)的藻类擦拭的叶片的蝗虫的卵孵化的幼虫的数目相比，由喂食用表达dsRNA-clock(特异性dsRNA)的转基因藻类擦拭的叶片的蝗虫的卵孵化的幼虫的数目降低。

图8示出了喂食表达dsRNA-clock(dsClock)的藻类的沙漠蝗与喂食WT藻类的沙漠蝗之间，在喂食期间的运动的变化。在2小时喂食时间期间对蝗虫进行监测，并且将每一只笼子中的运动变化的％取平均值。每一只笼子里的动物的数目为40。图8A、图8B和图8C中的每一个代表独立的重复。

图9示出了，表达特异性地靶向clk基因的dsRNA的藻类的口服递送影响沙漠蝗中的雄性/雌性分布。用表达dsclock的藻类或用表达dsGFP的藻类擦拭的小麦芽喂食沙漠蝗27天。计数4个独立重复的成年雄性和雌性，并且计算雄性/雌性动物的平均比率(p-值＝0.01)。

图10示出了在喂食表达dsRNA-GFP(dsGFP)的藻类的甲壳动物的血淋巴中dsRNA-GFP的检测。红螯螯虾(Cherax quadricarinatus)甲壳动物被喂食包含表达dsRNA-GFP的藻类或WT藻类的饲料小粒(pellets)。将从红螯螯虾的血淋巴中提取的RNA装载到膜上并且与DIG标记的GFP RNA探针杂交。在喂食表达dsRNA-GFP(dsGFP)的藻类的动物的样品中检测到信号，但在阴性对照样品(WT藻类)中未检测到信号。每一个斑点代表整个动物的1％的血淋巴。阳性对照-从表达dsRNA-GFP的藻类中提取的RNA。数字指示每一个斑点中的总RNA量(ng)。

图11显示了在冷冻干燥后藻类细胞无生存力。图11A：将1克冷冻干燥的三角褐指藻藻类粉末(包含3.42*10¹⁰个细胞)与9ml ASW(人工海水)混合。将400μl的混合物铺板在ASW琼脂板上或悬浮在ASW中并维持10天。图11B：将包含与冷冻干燥的藻类等同的细胞数目的新鲜三角褐指藻藻类液体培养物在类似的条件下铺板。在10天之后监测细胞生长。

发明详述

本发明提供了将RNAi分子以有效、稳定和环境安全的方式口服递送至靶生物体的组合物和方法。特别地，本发明提供了包含介导RNAi的多核苷酸分子的非繁殖转基因微藻和包含所述非繁殖转基因微藻的可食用的组合物。

本发明公开了，RNAi分子在摄取转基因微藻的生物体的细胞或组织中施加其生物活性。RNAi分子包含与摄取非繁殖转基因微藻的生物体中存在的靶基因或其一部分互补的序列。另外地或可选地，靶基因存在于所述生物体的病原体中。结果，靶基因表达被抑制。RNAi可以用于对生物体施加有害作用，例如当生物体为害虫时，或者当生物体为侵入宿主生物体并在其细胞内存活的病原体时。另外，RNAi可以通过改变摄取生物体(consumingorganism)的内源基因表达而对其生长、发育或福利具有有益的作用。

本发明部分地基于以下意料不到的发现：在整个转基因微藻加工过程中RNAi分子保持完整，并且直至由昆虫摄取藻类。不希望被任何特定的理论或作用机制所束缚，用作天然包封材料的微藻细胞与相对稳定的dsRNA结构一起保护RNAi分子在加工期间，特别地在干燥期间以及进一步在生物体的消化系统内免于被降解。

意料不到地，本发明的藻类可以被干燥和储存，同时在干燥的藻类被生物体摄取后保存RNAi活性。本发明的基于藻类的RNAi递送系统的显著优点为，本发明的干燥的藻类即使再水合也不能繁殖，如图11中例示的，使得遗传修饰的微藻向自然环境中的意外扩散不能发生。

本发明的技术的另外的优点在于，该技术为通用的，在这个意义上微藻可以直接地或经由靶生物体天然食物间接地应用于宽范围的靶生物体。在遗传工程化工艺中不要求对靶生物体的特异性(除了靶向基因以外)。相比之下，在产生转基因植物(例如表达苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis))时，需要具有如何单独转化每一种作物的知识。

本发明的另外的优点为，藻类也可以被提供至不摄取藻类作为其饮食的一部分的那些动物，例如通过将藻类喷洒到所述动物的常规食物上(例如，将转基因微藻喷洒到被昆虫摄取的植物上)。本发明的非繁殖转基因微藻制剂的另外的优势为货架期长。根据某些实施方案，干燥的转基因微藻可以在4℃储存6-12个月。

通常，RNA干扰(RNAi)指由小干扰RNA(siRNA)介导的序列特异性转录后基因沉默的过程。细胞中的长双链RNA(dsRNA)通常刺激被称为切酶的核糖核酸酶III酶的活性。切酶参与将长dsRNA加工为短片段的siRNA。源自切酶活性的siRNA通常长约21-23个核苷酸，并且包括约19个碱基对的双链体。

RNAi响应还以包含siRNA的内切核酸酶复合物为特征，所述复合物通常被称为RNA诱导沉默复合物(RISC)，其介导具有与siRNA双链体的反义链互补的序列的单链RNA的裂解。靶RNA的裂解在与siRNA双链体的反义链互补的区域中部发生。不限于任何加工或作用机制，本发明涉及作为下调基因表达的工具的RNAi(无论是否加工)。

定义

术语“微藻(microalga)”或“微藻(microalgae)”在本文中以其最宽的范围使用，并且指通常在淡水系统和海洋系统中发现的单细胞微观真核藻类。取决于物种，微藻的尺寸范围可以从几微米(μm)至几百微米。根据某些当前特定实施方案，该术语指海洋真核微藻(microalga or microalgae)。

如本文使用的，当关于本发明的转基因微藻使用时，术语“干燥的(dry)”或“干燥的(dried)”指包含不多于转基因微藻总质量的20％的水，通常不多于转基因微藻总质量的15％的水的微藻制品。

如本文使用的，当关于本发明的转基因微藻使用时，术语“非繁殖”指不存活的微藻，在这个意义上，微藻不能分裂和产生后代。

术语“RNAi分子”和“RNA干扰分子”在本文中可互换使用。这些术语涵盖具有有义链和反义链的双链RNA(dsRNA)序列，其中反义序列与靶基因具有高互补性。该术语还涵盖表达dsRNA的多核苷酸。有义和反义可以具有部分或完整的双链特征。双链RNA可以被切酶蛋白裂解为～20个核苷酸，或者表达的dsRNA可以具有约～20个核苷酸的长度，其之后诱导其互补mRNA的裂解。结果，靶基因的表达被降低。

当提及被RNAi分子靶向的基因时，术语“下调的”、“抑制的”、“降低的”和“沉默的”(以任何时态使用)指，当与在此类双链RNA或DNA构建体不存在下的水平相比时，在一个或更多个双链RNA或表达其的DNA构建体的存在下的基因的表达水平降低(diminishment)。术语“下调的”、“抑制的”、“降低的”和“沉默的”在本文中用于指示靶基因表达被降低1％-100％。例如，表达可以被降低约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％或更多。

双链RNA的序列可以对应于全长靶基因或其子序列。双链RNA“靶向”基因，因为双链RNA的双链体部分的核苷酸序列与靶基因的核苷酸序列基本上互补。本发明的双链RNA可以具有不同的长度。双链RNA的每一条链的长度优选地为从约20个至约1500个核苷酸长度。可选地，有义链和反义链各自包含从约50个至约1000个核苷酸长度，另外可选地每一条链包含从约100个至约800个核苷酸，又另外可选地每一条链包含从约150个至约500个核苷酸长度。然而，约12个至约20个核苷酸的RNA链也被涵盖在本发明中。

术语“异种生物体”、“靶生物体”和“异种靶生物体”在本文中可互换使用，并且指除了转基因微藻以外的生物体。根据本发明的某些实施方案，异种生物体为摄取转基因微藻的生物体。RNAi分子可以靶向靶生物体的多核苷酸或异种生物体，特别地病毒内的异源多核苷酸。根据本发明的其他实施方案，靶生物体为摄取转基因微藻的宿主生物体的病原体，并且然后RNAi分子靶向病原体的多核苷酸。根据某些实施方案，病原体为寄生虫或细菌。

术语“基因”以其最宽的意义指一个离散的基因组区域，其转录受一个或更多个启动子和远端调节元件调节，并且包含合成功能蛋白或非编码RNA的信息，因为在最终产物(蛋白或RNA)水平共有一部分遗传信息而联系起来。如本文使用的，术语“基因”指包含产生RNA或蛋白所必需的编码序列的核酸(例如，DNA或RNA)序列。RNA或蛋白可以由全长编码序列或由其任何部分编码。当关于基因使用时，术语“其部分”指该基因的片段。片段的尺寸范围可以从几个核苷酸至整个基因序列减去一个核苷酸。

术语“基因”还涵盖结构基因的编码区域，并且包括邻近所述编码区域在5'末端和3'末端两者上定位使每一末端上的距离为约1kb的序列，以使得所述基因对应于全长mRNA的长度。位于编码区域的5'并存在于mRNA上的序列被称为5'非翻译序列。位于编码区域的3'或下游并存在于mRNA上的序列被称为3'非翻译序列。术语"基因"涵盖基因的cDNA和基因组形式两者，其中基因的基因组形式或克隆包含被称为"内含子"或"间插区域(intervening region)”或"间插序列(intervening sequence)"的非编码序列中断的编码区域。内含子被从细胞核或初级转录物去除或“剪接掉”；并且因此内含子不存在于信使RNA(mRNA)转录物中。

如本文提及的，术语“多核苷酸分子”、“多核苷酸”、“核酸”和“核苷酸”序列在本文可以可互换地使用。这些术语涉及脱氧核糖核苷酸(DNA)、核糖核苷酸(RNA)及其修饰的形式的聚合物，所述聚合物呈单独的片段，或作为更大的构建体的组分、线性或支链、单链(ss)、双链(ds)、三链(ts)或其杂合体的形式。该术语还涵盖RNA/DNA杂合体。多核苷酸可以是，例如，DNA或RNA的有义和反义寡核苷酸或多核苷酸序列。DNA或RNA分子可以是，例如，但不限于：互补的DNA(cDNA)、基因组DNA、合成的DNA、重组DNA、或其杂合体，或者RNA分子，诸如，例如，mRNA、shRNA、siRNA、miRNA等。因此，如本文使用的，术语“多核苷酸分子”、“寡核苷酸”、“多核苷酸”、“核酸”和“核苷酸”序列意指DNA和RNA分子两者。这些术语还包括包含天然存在的碱基、糖和共价的核苷间键的寡核苷酸，以及具有非天然存在的部分的寡核苷酸，所述非天然存在的部分的功能类似于相应的天然存在的部分。

如本文提及的，术语“互补的”指核酸链之间的碱基配对。如本领域已知的，核酸的每一条链可以与另一条链互补，因为链之间的碱基对经由两个或三个氢键非共价连接。在通过氢键连接的相对的互补核酸链上的两个核苷酸被称为碱基对。根据沃森-克里克(Watson-Crick)DNA碱基配对，腺嘌呤(A)与胸腺嘧啶(T)且鸟嘌呤(G)与胞嘧啶(C)形成碱基对。在RNA中，胸腺嘧啶被尿嘧啶(U)取代。根据在链之间形成碱基对的核苷酸的数目(或百分比)，核酸的两条链之间的互补程度可以变化。例如，“100％互补性”指示每一条链中的所有核苷酸与互补链形成碱基对。例如，“95％互补性”指示每一条链中95％的核苷酸与互补链形成碱基对。术语足够的互补性可以包括从约30％至约100％的任何互补性百分比。

如本文在序列长度的上下文中使用的术语“约”指在负10％或正10％的范围内。

如本文使用的，术语“构建体”指人工组装或分离的核酸分子，其可以包括一个或更多个核酸序列，其中所述核酸序列可以是编码序列(即，编码终产物的序列)、调节序列、非编码序列或其任何组合。术语构建体包括，例如，载体，但不应被视为限于此。

术语“表达载体”指，具有将异源核酸片段(诸如DNA)掺入到外来细胞中并使其在外来细胞中表达的能力的载体。换言之，表达载体包含能够被转录的核酸序列/片段(诸如DNA、mRNA、tRNA、rRNA)。许多病毒、原核和真核表达载体是已知的和/或商购可得的。选择适当的表达载体在本领域技术人员的知识范围内。

如本文使用的，术语“启动子元件”、“启动子”或“启动子序列”指，通常位于编码序列的5'末端(即，在前面，位于上游)并用作开关活化编码序列的表达的核苷酸序列。如果编码序列被活化，其被表述为被转录。转录通常涉及由编码序列合成RNA分子(诸如，例如，mRNA)。启动子可完全源自天然来源，或包括源自自然界中发现的不同启动子的不同元件，或甚至包括合成的核苷酸区段。本领域技术人员应当理解，不同的启动子可以指导基因在不同发育阶段或响应不同的环境条件，或以多种表达水平表达。引起基因在大多数细胞类型中在大多数时间表达的启动子通常被称为“组成型启动子”。

术语“可操作地连接”意指选择的核酸序列与启动子接近以允许启动子调节所选择的核酸序列的表达。通常，启动子就转录方向而言位于所选择的核酸序列的上游。

如本文使用的，当关于核酸序列使用时，术语“同源性”指至少两个核苷酸序列之间的相似性或同一性的程度。可以存在部分同源性或完全同源性(即同一性)。“序列同一性”指两个或更多个核苷酸序列之间的相关性的度量，表示为相对于总对比长度的百分比。同一性计算考虑了在其各自序列中相同的且在相同相对位置上的那些核苷酸残基。空位，即比对中一个残基存在于一个序列中而不存在于另一序列中的位置被认为是不具有相同残基的位置。用于进行序列比对的广泛使用和接受的计算机程序为CLUSTALW v1.6(Thompson,等Nucl.Acids Res.,22:4673-4680,1994)。

当关于藻类使用时术语“转基因”(即，“转基因藻类”)指包含至少一个异源多核苷酸的藻类。

术语“反义寡核苷酸”指通过RNA-RNA或RNA-DNA或RNA-PNA(蛋白核酸)相互作用与靶RNA结合并改变靶RNA的活性的寡核苷酸(对于综述，参见Stein和Cheng,1993Science261,1004-1012)。通常，反义分子与靶序列沿着反义分子的单个连续序列互补。然而，在某些实施方案中，反义寡核苷酸可以与两个(或甚至更多个)非连续的靶序列互补。

如本文使用的，术语“表达”指，期望的终产物分子在靶细胞中的产生。终产物分子可以是，例如，RNA分子。

如本文使用的，术语“转化”指将分子诸如，例如，核酸、多核苷酸分子、载体等转移到靶细胞中，并且更具体地转移到靶细胞的膜包围的空间内部。分子可以通过本领域技术人员已知的任何手段“转化”到靶细胞中。将分子“转化”细胞的手段包括，例如，但不限于：热激、磷酸钙转染、PEI转染、电穿孔、脂质体转染、基因轰击(gene bombardment)、转染试剂、病毒介导的转移等或其组合。

如本文使用的，当提及RNAi分子时，术语“异源的”指被引入至靶细胞和/或在靶细胞内表达的重组DNA或RNA分子。异源RNA分子可以是完整的(即，全长分子)，或者可以在一个或更多个裂解位点处在细胞内被裂解。

如本文使用的，术语“靶核酸”指前体mRNA和mRNA(或其部分)。

如本文使用的，术语“异源的”指源自关注的生物体以外的基因或多核苷酸。

如本文使用的，术语“可食用的”指适用于作为食物食用的化合物或组合物。在本发明的上下文中，该术语涵盖可以被昆虫和其他植物害虫和/或动物害虫食用的化合物/组合物。

根据一个方面，本发明提供一种非繁殖转基因微藻，所述非繁殖转基因微藻包含表达RNAi分子的至少一种异源多核苷酸，其中所述RNAi分子靶向异种生物体内存在的多核苷酸。

根据某些实施方案，当微藻被所述生物体摄取时，RNAi分子使异种生物体内存在的多核苷酸的表达沉默。根据某些实施方案，异种生物体内存在的多核苷酸为所述生物体的内源基因。根据其他实施方案，RNAi分子靶向异种生物体的寄生虫或病原体的基因或其部分。

根据某些实施方案，RNAi分子使异种生物体内存在的多核苷酸的表达沉默，其中所述异种生物体为摄取微藻的宿主生物体的病原体。

根据另外的实施方案，RNAi分子使异种生物体内存在的多核苷酸的表达沉默，其中所述异种生物体以用微藻至少部分地覆盖的植物，特别地作物植物为食。

根据某些实施方案，RNAi分子使异种生物体内存在的多核苷酸的表达沉默，其中所述异种生物体以摄取微藻的居间生物体为食。

根据某些实施方案，异种生物体为植物害虫或寄生虫。根据某些示例性实施方案，植物害虫选自表1中呈现的组。

表1：植物害虫

根据某些实施方案，异种生物体为动物害虫或寄生虫。根据某些示例性实施方案，动物为鱼类，并且害虫或寄生虫选自表2中呈现的组。

表2：鱼类害虫

根据某些另外的示例性实施方案，动物为家养动物，并且异种生物体为选自表3中呈现的组的害虫或寄生虫。

表3：家养动物的害虫

根据某些实施方案，RNAi分子包含有义链和反义链，所述有义链和所述反义链一起形成双链体，所述有义链包含与异种靶生物体内存在的靶多核苷酸具有至少90％的同一性的至少19个连续核酸。

根据某些实施方案，RNAi分子靶向昆虫的多核苷酸。根据某些示例性实施方案，RNAi分子靶向clk基因。根据一些实施方案，clk基因包含SEQ ID NO:1中列出的核酸序列(GenBank:HQ428033.2)。

根据这些实施方案，RNAi分子包含有义链和反义链，所述有义链包含与SEQ IDNO:1中列出的核酸序列或其片段具有至少90％同源性，通常至少95％同源性，更通常至少99％同源性的多核苷酸序列，所述反义链包含与与SEQ ID NO:1或其片段互补的核酸序列具有至少90％同源性，通常至少95％同源性，更通常至少99％同源性的多核苷酸序列。

根据某些示例性实施方案，RNAi分子包含有义链和反义链，所述有义链包含SEQID NO:2中列出的多核苷酸序列，所述反义链包含SEQ ID NO:3中列出的多核苷酸序列。

SEQ ID NO:1编码沙漠蝗的clock基因(clk)。显示，用靶向clk的双链RNA处理在沙漠蝗的成虫和五龄若虫中是致死的(Tobbacka等2011.Insect Biochemistry andMolecular Biology 41:313-321)。本发明提供了一种用由微藻产生的RNAi分子来喂食沙漠蝗或飞蝗(locusta migratoria)的方法。将本发明的非繁殖微藻施加到之后被蝗虫摄取的小麦芽、幼苗或成熟植物上。根据某些示例性实施方案，将不存活的微藻或包含不存活的微藻的组合物喷洒在被蝗虫摄取的植物上。

根据某些实施方案，RNAi分子靶向桡足类的多核苷酸。根据某些示例性实施方案，桡足类为鲑疮痂鱼虱，并且RNAi分子靶向鲑疮痂鱼虱的COPB2基因。根据这些实施方案，RNAi分子包含有义链和反义链，所述有义链包含与SEQ ID NO:35中列出的核酸序列或其片段具有至少90％同源性，通常至少95％同源性，更通常至少99％同源性的多核苷酸序列，所述反义链包含与SEQ ID NO:36中列出的核酸序列或其片段具有至少90％同源性，通常至少95％同源性，更通常至少99％同源性的多核苷酸序列。

根据其他实施方案，RNAi对摄取动物的生长、发育和存活中的至少一个具有有益效果。每一种可能性代表本发明的单独的实施方案。

根据其他实施方案，RNAi对摄取转基因微藻的动物具有治疗作用。根据某些实施方案，RNAi提供对陆生害虫的抗性。根据某些实施方案，RNAi提供对水生害虫的抗性。根据某些实施方案，RNAi提供对病毒的抗性。

根据某些实施方案，生物体为鱼类。鱼类可以任选地生长用于食物或用于非食物目的(后者包括但不限于观赏等)。

根据某些实施方案，生物体为甲壳动物。甲壳动物可以任选地生长用于食物或用于非食物目的(后者包括但不限于观赏等)。

根据另一个实施方案，生物体为家禽动物。家禽通常以大量生长，因此为其提供生物活性剂的有利手段为通过口服递送。

根据某些实施方案，本发明的非繁殖转基因微藻可以本身施用，或者可以被配制为还包含可食用的稀释剂、赋形剂或载体的可食用的组合物。根据某些示例性实施方案，当单独地施用时以及当在组合物内施用时，非增殖转基因微藻为干燥的。

干燥本发明的转基因微藻要求使用适用于在微藻被异种生物体摄取后保存RNAi活性功能的干燥技术。通常，整个干燥工艺在低于50℃的温度进行。

根据某些示例性实施方案，转基因微藻被冷冻干燥。根据其他实施方案，转基因微藻使用微波真空干燥技术进行干燥。这两种方法均被设计用于固体、液体、颗粒或包封材料的高体积、低温脱水。

根据某些示例性实施方案，将干燥的转基因微藻与至少一种可食用的稀释剂、赋形剂或载体混合。

根据某些示例性实施方案，干燥的转基因微藻与明胶混合。根据另外的示例性实施方案，干燥的转基因微藻与鱼油混合。根据一些实施方案，明胶或鱼油以0.1％-10％，通常0.5％-5％w/w的量添加。

微藻或包含所述微藻的组合物还可以被用作食品添加剂。根据某些实施方案，基于藻类的可食用的组合物为动物食物组合物。

又根据其他实施方案，基于藻类的可食用的组合物单独地或与昆虫的天然食物组合用作昆虫的食物来源。根据某些示例性实施方案，可食用的组合物用作选自但不限于由以下组成的组的目的昆虫的食物来源：鳞翅目、鞘翅目和直翅目。根据其他示例性实施方案，基于藻类的可食用的组合物为沙漠蝗(Schistocerca gregaria)的食物来源。又根据其他实施方案，基于藻类的可食用的组合物为飞蝗(locusta migratoria)的食物来源。又根据其他实施方案，基于藻类的可食用的组合物为灰翅夜蛾的食物来源。又根据其他实施方案，基于藻类的可食用的组合物为线虫的食物来源。又根据其他实施方案，基于藻类的可食用的制剂为海虱宿主的食物来源。又根据其他实施方案，基于藻类的可食用的组合物用于喂食鱼类。又根据其他实施方案，基于藻类的可食用的制剂为甲壳动物的食物来源。根据某些示例性实施方案，鱼类和/或甲壳动物被病毒感染。根据这些实施方案，转基因分子内的RNAi分子靶向以使病毒基因沉默。又根据其他实施方案，基于藻类的可食用的组合物用于喂食家禽。根据某些实施方案，可食用的组合物还可以包含另外的活性治疗剂和/或营养剂。

本发明的基于藻类的可食用的组合物还可以与其他分子或化合物的混合物或引诱物，如例如用于辅助摄取、分布和/或吸收的脂质体、信息素混合、包封或缔合。

用于口服施用的组合物和制剂包括粉末、颗粒、微粒、水或非水性介质中的悬浮液或溶液、胶囊、凝胶胶囊、小袋剂(sachet)、片剂或微片剂。

适用于将基于藻类的可食用的组合物施加在植物和/或动物上的组合物和制剂包括粉末、颗粒、微粒、水或非水性介质诸如明胶或油中的悬浮液或溶液。

根据本发明的教导可以使用多种微藻物种，只要微藻在转化之后维持或再生它们的细胞壁结构。根据某些实施方案，根据本发明的教导使用的微藻为海洋微藻。根据某些实施方案，微藻选自但不限于由以下组成的组：三角褐指藻；杜氏藻属物种；微拟球藻属物种，包括眼点微拟球藻、Nannochloropsis salina、富油微拟球藻；微绿球藻属物种，四爿藻属物种，包括肩突四爿藻、朱氏四爿藻；球等鞭金藻；巴夫藻属物种；透明茧形藻；牟氏角毛藻；和富油新绿藻。每一种可能性代表本发明的单独的实施方案。

根据某些特定实施方案，微藻选自由以下组成的组：三角褐指藻、微绿球藻属物种、微拟球藻属物种和杜氏藻属物种。每一种可能性代表本发明的单独的实施方案。

根据其他特定实施方案，微藻为三角褐指藻。

根据某些实施方案，当与在生物体不摄取所述转基因微藻后的相同靶基因相比时，靶基因表达被抑制至少10％、30％、50％、70％、90％、通常99％。

根据另外的方面，本发明提供了一种用于将RNAi分子口服递送至生物体的方法，所述方法包括将包含至少一种异源RNAi分子的非繁殖转基因微藻口服施用至生物体，其中所述RNAi分子靶向所述生物体内存在的多核苷酸从而抑制其表达。

根据一些实施方案，非繁殖转基因真核微藻在动物食物组合物内施用。组合物通过如上文描述的任何手段来配制。组合物被配制用于喂食如上文描述的任何生物体。

又根据另外的实施方案，非繁殖转基因真核微藻与生物体的天然食物一起施用。根据这些实施方案，微藻至少部分地包被生物体的天然食物。如本领域已知的和如上文描述的，可以配制微藻以包被生物体的天然食物。

如本领域已知的用于转化微藻的任何方法可以根据本发明的教导被使用。转化方法包括颗粒轰击、电穿孔、微孔化(microporation)、在异源DNA存在下涡旋细胞，酸洗珠和聚乙二醇介导的转化。用于转化真核藻类的方法和工具可以见于例如国际(PCT)申请公布第WO 1997/039106号中。

通常，为了制备用于制备转基因藻类的载体，首先将转录RNAi的多核苷酸克隆到可以被整合到藻类基因组中的表达载体，质粒中。在此类表达载体中，编码异源RNAi的DNA序列被可操作地连接至指导RNA合成的表达控制序列，即启动子。启动子可以是内源启动子，即，指导通常存在于藻类中的基因转录的启动子。根据某些实施方案，载体还包含编码抗性基因的多核苷酸，以能够选择转化的藻类。根据某些当前示例性实施方案，载体包含编码赋予对zeocine和腐草霉素抗性的蛋白的多核苷酸。

转化的藻类的培养条件取决于所使用的藻类物种，如本领域技术人员已知的和如本文下文所例示的。通常，藻类在能够进行光合作用的条件下生长。由于光合作用要求阳光和CO₂，并且微藻还需要淡水、含盐或海洋的水与适当的肥料混合以生长，微藻可以在例如开放的池塘和湖泊中培养。然而，开放的系统比封闭的系统更易受到污染，并且此外，在开放的水性贮库(aqueous reservoir)中生长的遗传修饰的微藻可能被认为对环境有害。另外，在开放的系统中，对水温、CO₂浓度和光照条件的控制较少。生长季节很大程度上取决于地理位置，并且除了热带地区外，仅限于一年中较暖的月份。然而，开放的系统比封闭的系统更便宜地设置和/或维持。

因此，另一种生长微藻的方法为使用半封闭的系统，诸如用一种结构(例如“温室型”结构)覆盖池塘或池(pool)。虽然这可能导致较小的系统，但它解决了许多与开放的系统相关的问题。半封闭的系统的优点为，通过允许感兴趣的微藻超越入侵生物以获得其生长所要求的营养物质，半封闭的系统可以允许期望的微藻相比于入侵生物占优势，并且半封闭的系统可以延长生长季节。例如，如果系统被加热或冷却，微藻可以全年生长。

可选地，微藻可以在封闭的结构诸如光生物反应器中生长，其中环境在比开放的系统或半封闭的系统更严格的控制下。光生物反应器为一种生物反应器，其并入了一些类型的光源以提供光子能量输入到反应器中。术语光生物反应器可以指对环境是封闭的并且不与环境直接交换气体和污染物的系统。光生物反应器可以被描述为被设计用于光养液体细胞悬浮培养物的受控制生物质产生的封闭的、照明的培养容器。光生物反应器的实例包括，例如，玻璃容器、塑料/玻璃管、槽、塑料套管和袋。可以用于提供维持光合作用所要求的能量的光源的实例包括，例如，荧光灯泡、LED和天然阳光。因为这些系统为封闭的，生物体生长需要的所有物质(例如，二氧化碳、营养物质、水和光照)必须被引入到生物反应器中。光生物反应器，尽管设置和维持它们需要成本，但与开放的系统相比有几个优点，例如，它们可以预防或最小化污染，提供对培养条件(例如，pH、光照、二氧化碳和温度)的更好的控制，防止水蒸发，降低由于脱气造成的二氧化碳损失，并允许更高的细胞浓度。在另一方面，光生物反应器的某些要求，诸如冷却、混合、控制氧气积累和生物积垢，使得构建和操作这些系统比开放的系统或半封闭的系统更昂贵。光生物反应器可以被设置以连续收获(如以大多数大体积培养系统)，或者一次收获一个批次(例如，如以聚乙烯袋培养)。例如，用营养物质、微藻和水设置一个批次光生物反应器，并且允许微藻生长直至收获批次。连续的光生物反应器可以例如连续地、每天或以固定的时间间隔进行收获。

可以将CO₂递送至本文描述的任何系统，例如，通过从包含微藻的液体表面下面鼓入CO₂。此外，喷洒可以用于将CO₂注入到液体中。喷洒器例如为也被称为鼓泡器(Bubblers)、碳酸化器、充气器、多孔石(Porous Stones)和扩散器的多孔盘或管组件。

可以用于本文描述的系统的营养物质包括，例如，氮(以NO₃ ^-或NH₄的形式)、磷和微量金属(Fe、Mg、K、Ca、Co、Cu、Mn、Mo、Zn、V、和B)。营养物质可以，例如，以固体形式或以液体形式出现。如果营养物质呈固体形式，则可以在被递送至包含微藻的液体之前，或在被递送至光生物反应器之前，将它们与例如淡水或盐水混合。

微藻可以在大规模培养物中生长，其中大规模培养物指培养物生长体积大于约5升、或大于约10升、或大于约90升。大规模生长也可以是体积为300升或更多、1000升或更多、或5000升或更多的培养物的生长。

最佳的生长温度通常为约18℃至约25℃，然而其取决于物种。根据某些实施方案，微藻细胞在收获之前达到10⁵/ml至10⁸/ml的密度。

一些种类的收获后加工可以用于制备用于口服摄取的材料或作为食物组合物。常规工艺通常包括将藻类生物质与藻类生长于其中的液体培养物至少部分地分离。任选地，取决于靶受试者和应用模式，藻类生物质可以被均质化和/或干燥以形成多种尺寸的小粒。其他制备方式包括喷雾干燥、流化床干燥，或者甚至提供作为液体悬浮液的材料。

以下实施例被呈现以更充分地说明本发明的一些实施方案。然而，其绝不应以任何方式被解释为限制本发明的宽的范围。本领域技术人员可以容易地设想本文公开的原理的许多变化和修改，而不偏离本发明的范围。

实施例

材料和方法

藻类培养和收获

如本发明的申请人的美国专利申请公布第2011/0081706号中描述的进行藻类培养和收获。简言之，将藻类(三角褐指藻)在富含用于使硅藻(diatoms)生长的F/2营养物质的过滤海水中培养(从以下修改：Andersen R等2005.Recipes for freshwater andseawater media.In:Algal Culturing Techniques(R.A.Andersen,编著),第429-538页.Elsevier,Amsterdam).将F/2以1:1000的剂量每72h添加至最终培养物体积中。恒定温度状况(regime)被维持在21℃。光照：黑暗以100μmol光子/m²s¹的光强度以16:8小时来设置。将CO₂与空气混合，并且经由通气系统以受控制的比例递送至培养物。将藻类在其最大培养密度附近收获用于实验。为了帮助藻类的絮凝，将氢氧化钙作为包含0.15g/ml Ca(OH)₂的在水中的细颗粒悬浮液添加至培养物中，并且然后将培养物过滤或离心。将所得的藻类沉淀物冻干以形成藻类粉末。将藻类粉末在2-8℃的温度保持在真空袋中。

藻类转化

I.通过颗粒轰击转化

如以上描述的，将新鲜藻类培养物在人工海水(ASW)F/2培养基中生长至指数期中期(2-5x10⁶个细胞/ml)。在轰击之前24小时，将细胞收获，用新鲜ASW+F/2洗涤两次并且以1/10的原始细胞体积悬浮于在ASW+F/2中。将0.5ml的细胞悬液点到包含固化的ASW+F/2培养基的55mm培养皿的中心。将板在正常生长条件下静置至干燥。根据制造商的说明使用PDS1000/He基因枪转化系统(biolistic transformation system)(BioRad LaboratoriesInc.,Hercules,CA USA)进行轰击，对于直径大于2微米的细胞，使用M17钨粉(BioRadLaboratories Inc.)，并且对于较小的细胞使用包含小于0.6微米的颗粒的钨粉(FW06,Canada Fujian Jinxin Powder Metallurgy Co.,Markham,ON,Canada)。将钨用线性DNA包被。使用1100psi或1350 psi的破裂盘。所有的一次性用品均购自BioRad LaboratoriesInc.。在轰击之后，将板在正常生长条件下孵育24小时，在这之后将细胞铺板到选择性固体培养基上并且在正常生长条件下孵育直至出现单克隆。

II.通过微孔化转化

如以上描述的，将新鲜藻类培养物在ASW+F/2培养基中生长至指数期中期。将10ml培养物样品收获，用Dulbecco氏磷酸盐缓冲盐水(DPBS,Gibco,Invitrogen,Carslbad,CA,USA)洗涤两次并且重悬于250μl的缓冲液R(由Digital Bio,NanoEnTek Inc.,Seoul,Korea，微孔化装置和试剂盒的生产商提供)中。在将8μg线性DNA添加至每100μl细胞中之后，将细胞脉冲。取决于细胞的类型，通常需要多次脉冲，范围为从700伏特至1700伏特，10-40毫秒脉冲长度；每一个样品被脉冲1-5次。在脉冲之后立即将细胞转移至200μl新鲜培养培养基(非选择性的)中。在弱光在25℃孵育24小时之后，将细胞铺板到选择性固体培养基上并且在正常培养条件下孵育直至出现单克隆。

血淋巴收集

在水中洗涤(下文描述的物种的)动物，并且将一组8-10只动物的血淋巴收集到eppendorf管中。将样品在4℃以14000g离心5分钟，并且转移到包含Trizol(Ambion lifetechnologies；Cat#15596026)的新的Eppendorf管中。将样品放入到液氮中并保持冷冻直至使用。

RNA纯化

根据制造商的说明使用Master Pure植物RNA试剂盒(Epicentre；目录号MPR09100)从藻类进行RNA提取。将样品重悬于无RNA酶的水中，并且根据制造商的说明与TURBO无DNA的试剂盒(Ambion目录号AM1907)孵育。

根据制造商的说明，使用Trizol(Ambion life technologies；Cat#15596026)或通过miRNeasy Serum/Plasma试剂盒(QIAGEN目录号217184)从昆虫血淋巴进行RNA提取。

使用Trizol(Ambion life technologies；目录号15596026)从昆虫的器官进行RNA提取。根据制造商的说明，将RNA与TURBO无DNA的试剂盒(Ambion目录号AM1907)孵育。

cDNA合成

根据制造商的说明，使用补充有随机六聚体引物(Fermentas；目录号S0142)的SuperScriptII逆转录酶(Invitrogen；目录号100004925)或使用iScript^TM cDNA合成试剂盒(Bio-Rad；cat#170-8890)，将1μg总RNA用作模板用于cDNA合成。

qRT-PCR分析

根据制造商的说明，使用Biorad CFX96与Platinum SYBR green(Invitrogen；目录号11744500)通过qRT-PCR相对定量进行cDNA分析。靶向绿色荧光蛋白(GFP)编码mRNA的dsRNA使用ds-GFP Q2 For junc和ds-GFP Q2Rev接头引物(表1)进行扩增。TBP(编码TATA盒结合蛋白)用作参考基因并且用Q-TBP-fw和Q-TBP-rv(表1)扩增。靶向红色荧光蛋白mCherry的dsRNA使用ds-mCherry Q1For 5’和ds-mCherry Q1Rev junc(表1)扩增。内部对照(Primerdesign,UK；目录号INT-RNA-FAM)用作参考。数据分析根据ΔΔCt方法进行(Livak等，2001.Methods 25:402-408)。

clock(clk)基因的表达水平的分析使用被设计为扩增沙漠蝗clock mRNA序列的Sg_clk_F和Sg_clk_R引物来进行。引物dsCLOCK Q4fw和dsCLOCK rev(表4)被设计为特异性扩增在藻类中转化和表达的clock dsRNA序列。timeless和period基因的定量分别使用Sg_tim_F与Sg_tim_R及Sg_per_F与Sg_per_R(表4)进行。β肌动蛋白或GAPDH用作参考基因并且分别用Sg_b_actin_F与Sg_b_actin_R及Sg_GAPDH_F与Sg_GAPDH_R(表4)扩增。数据分析根据ΔΔCt方法进行，并且在琼脂糖5凝胶上分开qRT-PCR产物。

表4：引物列表

引物名称	引物序列	SEQ ID NO.
			Q-TBP-fw	ACCGGAGTCAAGAGCACACAC	7
Q-TBP-rv	CGGAATGCGCGTATACCAGT	8
			ds-GFP Q2For junc	GCAGCTCGCCGGTACCTA	9
ds-GFP Q2Rev接头	TTGTTTCCGACGGCACACT	10
			ds-mCherry Q1For 5'	CCGTCATGCAGAAAAAGACCAT	11
ds-mCherry Q1Rev junc	CTGCGTAGGTACCCTGCTTGA	12
			dsCLOCK Q4fw	GGACATTCTCCCTCACAAAACAA	13
dsCLOCK Q4rev	CAAATGCGATACCAACCTCAAC	14
			Sg_GAPDH_F	GTCTGATGACAACAGTGCAT	15
Sg_GAPDH_R	GTCCATCACGCCACAACTTTC	16
			Sg_b_actin_F	AATTACCATTGGTAACGAGCGATT	17
Sg_b_actin_R	TGCTTCCATACCCAGGAATGA	18
			Sg_tim_F	TTGGAATTGGAGTTGGAACATGT	19
Sg_tim_R	AGTCTACCAATGGATGGTTTGACA	20
			Sg_per_F	ACCAGATCGGAGCCAGCTT	21
Sg_per_R	CTTCTGGATGTTGTCGTTGTAGTT	22
			Sg_clk_F	CCATGAAGCTTTGATGCAGAAG	23
Sg_clk_R	CTGGCTTTGAGTTCCATTGATG	24

实施例1：clk、GFP和mCherry dsRNA在藻类中的表达

靶向沙漠蝗的clk mRNA的dsRNA的构建

clk基因的有义(SEQ ID NO:2)片段和反义(SEQ ID NO:3)片段由Biomatik USA合成。有义片段通过BamHI、SacII克隆，并且反义片段通过SacI、KpnI克隆。将clk片段以有义方向和反义反向克隆到包含内含子的pPhaT-盒中(图1，该pPhat盒具有SEQ ID NO:37中列出的核酸序列)。

靶向GFP和mCherry mRNA的dsRNA的构建：

GFP有义链(SEQ ID NO:4)用以下寡核苷酸通过PCR扩增：BamHI有义GFP F 5'-GGGATCCATGGTGAGCAAGGGC GAGG-3′(SEQ ID NO:25)。SacII有义GFP R 5'-GCCGCGGGGCGAGCTGCACGCTGCC-3'(SEQ ID NO:26)。GFP反义链(SEQ ID NO:5)用以下寡核苷酸通过PCR扩增：SacI反义GFP F 5'-GGAGCTCATGGTGA GCAAGGGCGAGG-3'(SEQ ID NO:27)。KpnI反义GFP R 5'-GGGTACCG GCGAGCTGCACGCTGCC-3'(SEQ ID NO:28)。

mCherry有义链(SEQ ID NO:29)用以下寡核苷酸通过PCR扩增：BamHI有义mCherryF 5'-GGGATCCATGGTAAGTAAGGGGGAGG-3'(SEQ ID NO:30)和SacII有义mCherry R:5'-GCCGCGGCTGCTTGATTTCGCCCTTG-3'(SEQ ID NO:31)。对于扩增mCherry反义链(SEQ ID NO:32)，使用以下引物：SacI反义mCherry F:5'-GGAGCTCATGGTAAGTAAGGGGGAGG-3'(SEQ IDNO:33)。KpnI反义mCherry R 5'-GGGTACCCTGCTTGATTTCGCCCTTG-3'(SEQ ID NO:34).

Clk、和mCherry dsRNA的构建体在fcpA组成型启动子下在pPhaT中制备，并且GFP的构建体在诱导型启动子ptCAI下在pPhaT中制备(分别为图2和图3)。将构建体通过如上文描述的颗粒轰击转化到藻类(三角褐指藻(P.tricornutum))中。在转化之后，将藻类转移到包含博来霉素(Invivogen；目录号ant-zn-1；100μg/ml)的选择板上。表达靶向clk的dsRNA(dsRNA-clock或dsclock)、靶向GFP的dsRNA(dsRNA-GFP或dsGFP)和靶向mCherry的dsRNA(dsRNA-mCherry或dsmCherry)的藻类的阳性克隆被培养并且使藻类生长用于动物喂食实验。

实施例2：通过喂食将完整dsRNA递送至粉虫甲虫血淋巴中

将粉虫甲虫，黄粉虫的幼虫置于培养室内，在24℃的恒定温度和50％的相对湿度，12h/12h光照/黑暗照明方案。将卷心菜的叶片用表达靶向mCherry的dsRNA(dsRNA-mCherry或dsmCherry)的转基因藻类的粉末或用野生型藻类的粉末擦拭，使得所有叶片均被藻类粉末均匀覆盖。为了能够将藻类粉末良好施加到植物材料上，将(野生型以及转化的藻类的)藻类粉末与用双蒸水(DDW)1:3稀释的在人工海水(ASW)中的5％明胶混合。黄粉虫幼虫被剥夺食物16小时。在实验当天，将幼虫用藻类擦拭的卷心菜叶片或用仅用明胶覆盖的叶片(模拟)喂食3-5小时。此后收集血淋巴并将样品速冻并储存于-80℃直至RNA提取。

使从血淋巴样品中提取的RNA用对dsmCherry特异性的引物通过qRT-PCR分析进行相对定量。合成RNA(Primer Design)用作参考。使用ΔΔCt方法进行分析。与喂食WT藻类的动物相比，在从喂食表达dsmCherry的藻类的动物获得的5个样品中的3个中表现出dsmCherry RNA水平增加超过20倍。每一个样品包含来自5只动物的血淋巴的池(图4)。

本文呈现的结果首次显示了通过用表达dsRNA的藻类喂食幼虫将dsRNA分子递送至粉虫甲虫的血淋巴的能力。

实施例3：通过喂食将完整dsRNA递送至灰翅夜蛾血淋巴中

将灰翅夜蛾(Prodenia littoralis)在第5龄期的幼虫置于培养室内，在24℃的恒定温度和50％的相对湿度，12h/12h光照/黑暗照明方案。将蓖麻(蓖麻子(castorbean))的叶片用表达靶向GFP的dsRNA(dsRNA-GFP)的转基因藻类的粉末或用野生型藻类的粉末擦拭，使得所有叶片均被藻类粉末均匀覆盖(如以上描述与明胶混合)。将灰翅夜蛾喂食藻类粉末擦拭的叶片。对于每一个处理，各自使用10只幼虫的5个独立的重复。从五龄若虫中收集血淋巴并且对其进行RNA制备，随后使用dsRNA-GFP(SEQ ID NO.9-10)和TATA盒结合蛋白(TBP)mRNA(SEQ ID NO 7-8)(作为上样对照)的特异性引物(表4)进行qRT-PCR分析。将RT-PCR产物上样在琼脂糖凝胶上。在所有8个血淋巴样品(从喂食用野生型以及转基因藻类的粉末覆盖的叶片的幼虫获得)中检测到TBP区段的175bp的全长尺寸扩增产物。仅在喂食表达dsRNA-GFP的藻类的动物的4个血淋巴样品中检测到83bp的dsRNA-GFP的全长尺寸扩增子产物，而在喂食WT藻类的动物的血淋巴中未检测到(图5)。在该实施例中，这些结果进一步证明了通过喂食将在藻类中表达的dsRNA分子递送至灰翅夜蛾的幼虫的能力。

实施例4：通过用表达dsRNA-clock的藻类喂食若虫来降低蝗虫中clk和period mRNA水平的表达

沙漠蝗的timeless和period基因为它们的表达被clock蛋白直接地调节的两个基因。这些基因的表达水平通常用于证明clock表达和活性的下调(Tobback等，2011，同上)。

将新出现的沙漠蝗五龄若虫以40只动物的密度置于在37℃的恒定温度具有14h/10h光照/黑暗照明方案的30x30x35cm受控制室中。对于每一个处理，各自使用40只蝗虫的3个独立的重复。将在盆中生长的小麦芽用表达靶向clk的dsRNA(dsRNA-clock)的转基因藻类的粉末或用野生型(WT)藻类的粉末(如以上描述与明胶混合的藻类粉末)擦拭直至所有叶片被藻类粉末均匀地覆盖。然后在4周期间将蝗虫喂食藻类擦拭的小麦芽。每天用藻类粉末擦拭小麦芽，以确保连续处理。

在实验的第8-11天和第28-30天，分别从每一次处理从第一次蜕皮之后的年轻成虫和从成年蝗虫收获生殖腺和脑。在喂食3小时之后收集器官。提取RNA，并且然后进行逆转录，随后进行qRT-PCR分析。用特异性引物检测蝗虫的持家基因GAPDH、β-肌动蛋白的表达以及clock和period基因的表达。蝗虫的生殖腺和脑中的clock和period转录物的相对定量使用ΔCt方法进行。与喂食用WT藻类擦拭的叶片的蝗虫相比，发现喂食用表达dsRNA-clock的藻类擦拭的叶片的蝗虫中的clock基因的相对表达水平下调36％。与喂食用WT藻类擦拭的叶片的蝗虫相比，发现喂食用表达dsRNA-clock的藻类擦拭的叶片的蝗虫中的period基因的相对表达水平下调27％。GAPDH用作持家基因(图6)。结果证明，藻类既可以用作表达工具又可以用作口服递送工具来表达将下调喂食转基因藻类的靶生物体中的特定基因的dsRNA分子。

实施例5：用表达靶向clock基因的dsRNA的藻类喂食蝗虫降低了蝗虫卵的生育力

将蝗虫沙漠蝗的龄期幼虫(4-5龄期)连续喂食如以上描述的用表达dsRNA-clock的藻类的粉末或用WT藻类擦拭的小麦芽。在第17天，当动物性成熟时，在每一个笼子中置入填充沙子的盆，以允许雌性产卵。每隔48小时收集盆，并且将其在37℃孵育10天以允许幼虫孵化。对于每一个处理，计数卵荚和孵化的幼虫，并且计算孵化幼虫与卵荚数目的比率。喂食表达dsRNA-clock的转基因藻类的蝗虫雌性产31个卵荚，其中的128个卵被孵化，而喂食WT藻类的蝗虫的雌性产28个卵荚，其中262个被孵化。与喂食WT藻类的蝗虫相比，在喂食表达dsRNA-clock的藻类的蝗虫中孵化的幼虫与卵荚的数目的比率(所有重复的平均值)低2.3倍(图7A)。

在另外的实验中，将沙漠蝗三龄若虫以100只动物的密度置于在30℃-37℃的温度范围具有14h/10h光照/黑暗照明方案的45x45x50cm受控制室中。对于每一个处理，各自使用100只蝗虫的4个独立的重复。将在盆中生长的小麦芽用表达靶向clk的dsRNA(dsRNA-clock)或dsGFP的转基因藻类的粉末擦拭直至所有叶片被藻类粉末均匀地覆盖。然后在4周期间将蝗虫喂食藻类擦拭的小麦芽，每天用新藻类擦拭的小麦芽以确保连续处理。然后计数动物，并且将10只雄性蝗虫和10只雌性蝗虫(n＝20)以对于每一个处理4个独立重复置于在30℃-37℃的温度梯度具有14h/10h光照/黑暗照明方案的45x45x50cm受控制室中。允许动物交配并在填充沙子的塑料圆筒中产卵36天。每隔3天，将圆筒替换为新鲜的圆筒。收集使用过的圆筒，并且将其置于在30℃-42℃的温度梯度具有14h/10h光照/黑暗照明方案的受控制室中。在孵化10-15天后，观察到孵化的幼虫并计数。在整个实验中与由喂食用表达dsGFP的藻类擦拭的叶片的蝗虫的卵孵化的幼虫的数目相比，由喂食用表达dsRNA-clock的藻类擦拭的叶片的蝗虫的卵孵化的幼虫的数目降低(图7B)。计算幼虫的总数目显示，与由喂食对照叶片(用表达dsGFP的藻类擦拭的)的蝗虫的卵孵化的幼虫的数目相比，由喂食用表达dsRNA-clock的藻类擦拭的叶片的蝗虫的卵孵化的幼虫的数目降低30％(t-检验＝0.026)(图7A)。

这些结果支持先前的发现，表明昼夜节律时钟控制生物体中的许多代谢和行为过程。在昆虫中，这些时钟及其分子机制已经被发现以许多不同的方式影响生殖。生殖行为包括求偶、交尾和产卵被发现受到日节律的强烈影响(Tobback J.等，2011,同上)。

实施例6：表达特异性靶向clk基因的dsRNA的藻类的口服递送降低蝗虫运动

将蝗虫沙漠蝗连续喂食用表达dsRNA-clock的藻类的粉末或用WT藻类的粉末(如以上描述的与明胶混合的藻类粉末)擦拭的小麦芽。将来自每一个处理的一个笼子用LifeCam HD-3000照相机连续监测并且用ActiveWebCam程序记录。在喂食3天期间测量蝗虫的运动表明，与喂食WT藻类的蝗虫相比，喂食表达dsRNA-clock的藻类的蝗虫的总运动降低约1.7-2.5倍(图8；A-C)。与喂食WT藻类的对照蝗虫相比，口服喂食表达dsRNA-clock的藻类降低蝗虫的活性。

实施例7：通过喂食转基因藻类将完整dsRNA递送至甲壳动物

将红螯螯虾动物(30±10g)置于专用于每一个处理的笼中。将动物持续28天每天喂食包含表达dsRNA-GFP的藻类或WT藻类的饲料小粒(7.5gr藻类/gr动物)。在第0天和第28天，喂食72小时后，从每一只动物采样100μl血淋巴。对于表达dsRNA-GFP的藻类，使用6个独立的重复，并且对于WT藻类使用3个独立的重复。对收集的血淋巴进行RNA制备，并且将样品通过RNA斑点印迹杂交进行分析。根据生产商说明，进行斑点印迹杂交程序(Roche AppliedScience,目录号11 603 558 001、目录号11 585 762 001、目录号11 093 274 910、目录号11 685 627 001)。根据制造商的说明(Roche Applied Science,目录号11175025910)，用地高辛-11-dUTP标记的dsRNA-GFP的单链RNA探针由线性化的模板DNA合成。

如图10中显示的，在喂食包含表达dsRNA-GFP的藻类的饲料小粒的红螯螯虾的六个血淋巴样品中的四个中检测到dsRNA-GFP的阳性信号，而在喂食包含对照藻类的饲料小粒的红螯螯虾的三个血淋巴样品中的三个中未检测到信号。该结果首次证明，在藻类中表达的dsRNA分子可以被转移至喂食转基因藻类的甲壳动物的血淋巴中。

实施例8：表达特异性地靶向clk基因的dsRNA的藻类的口服递送影响沙漠蝗中的雄性/雌性分布

将沙漠蝗三龄若虫以100只动物的密度置于在30℃-37℃的温度梯度具有14h/10h光照/黑暗照明方案的45x45x50cm受控制室中。对于每一个处理，各自使用100只蝗虫的4个独立的重复。将在盆中生长的小麦芽用表达靶向clk的dsRNA(dsRNA-clock)或靶向GFP的dsRNA(dsGFP)的转基因藻类的粉末擦拭直至所有叶片被藻类粉末均匀地覆盖(如以上描述的与明胶混合的藻类粉末)。然后在4周期间将蝗虫喂食藻类擦拭的小麦芽，每天用新藻类擦拭的小麦芽以确保连续处理。然后对于每一个处理，计数动物，并且计算雄性与雌性的比率。与喂食用表达dsGFP的藻类擦拭的叶片的蝗虫相比，喂食用表达dsRNA-clock的藻类擦拭的叶片的蝗虫中的比率显著降低(p-值＝0.01)(48％降低，图9)。这些结果证明，表达靶向clock基因的dsRNA的藻类在沙漠蝗蝗虫中的口服递送导致蝗虫群体内的性别分化改变。先前已经提出了昼夜节律时钟与性别发育和行为之间的联系。例如，takeout基因被鉴定为稳健的昼夜节律调节基因。Dauwalder等提出，果蝇中takeout基因家族编码具有性别特异性功能的多个因子，并且提出了其在整合有关生物体的性别、营养状态及昼夜节律周期的信息以影响成年雄性行为方面发挥作用(Dauwalder等2002.Genes&Development 16:2879–2892)。在对沙漠蝗喂食用表达靶向clock基因的dsRNA的藻类覆盖的叶片后在雌性数目中观察到的增加表明clock基因被dsRNA下调。

总之，本发明清楚地证明，对蝗虫喂食表达靶向蝗虫特定基因的dsRNA的转基因藻类下调该靶基因的表达和/或活性。

实施例9：冷冻干燥的藻类粉末为不存活的

藻类液体培养物使用GEA Westfalia分离器(型号SSD18-06-007，以9790rpm旋转)或Alfa Laval分离器型号IFB 303X-73以7500rpm来收获。将藻类糊状物置于1cmx14cmx14cm托盘中或于2cmx25cmx52cm板中并且在-80℃储存24小时。第二天，将托盘在-50℃和2*10^-1Torr使用VirTis冻干机(item number 270389)冷冻干燥24-48小时。藻类粉末用于生存力测定。

将1克冷冻干燥的三角褐指藻藻类粉末(3.42*10¹⁰个细胞)与9ml ASW x1混合。将400μl的混合物铺板在ASW琼脂板上或在ASWx1的悬浮液中并维持10天(图11A)。将在液体培养基中的等同数目的新鲜三角褐指藻藻类细胞在类似条件下铺板。在10天之后监测细胞生长(图11B)。在冷冻干燥的藻类粉末培养物中未检测到细胞生长，而液体藻类培养物生长良好。结果表明，冷冻干燥程序消除了藻类细胞的生存力。

实施例10：藻类中COPB2 dsRNA的构建

鲑疮痂鱼虱COPB2基因的有义(SEQ ID NO:35)片段和反义(SEQ ID NO:36)片段由Biomatik USA合成。有义片段通过BamHI、SacII克隆，并且反义片段通过EcoRI、KpnI克隆。将COPB2的片段以有义和反义方向克隆到包含内含子的pPhaT-盒中。

实施例11：表达特异性靶向COPB2基因的dsRNA的藻类的口服递送增加鲑疮痂鱼虱的死亡率

将具有80克的平均体重的大西洋鲑鱼(安大略鲑(Salmo salar))置于0.75m³的塑料水槽中并且维持在10℃温度的海水中(盐度34.5ppt)。将鱼以其身体重量的1％每天两次喂食用15％的表达COPB2dsRNA的藻类粉末(w/w相对于鱼食的总重)均匀包被的商业鱼食或用15％(w/w)的表达GFP dsRNA的藻类粉末均匀包被的商业鱼食。对于每一个处理，使用25只鱼的3个独立的重复。

在喂食14天之后，对于每一个水槽，用鱼虱(fish louse)(鲑疮痂鱼虱)的120个寄生桡足类攻击鱼。在添加桡足类10和24天之后，将每一组5只鱼麻醉、处死并在显微镜下计数虱子。

以上具体实施方案的描述将如此完全地揭示本发明的一般性质，使得其他人可以通过应用现有的知识，容易地为各种应用修改和/或调整此类具体实施方案而不需要过度实验且不背离一般概念，且因此，此类调整和修改应当并且预期被包含在本公开的实施方案的等效方式的含义和范围内。应理解的是，本文采用的措辞或术语是为了描述而非限制的目的。用于进行各种本公开的功能的工具、材料和步骤可采取多种替代形式而不背离本发明。

序列表

<110> 特郎萨格以色列有限公司

<120> 转基因微藻及其作为用于递送干扰RNA分子的饲料的用途

<130> TRAG/007 PCT

<150> 62/192082

<151> 2015-07-14

<160> 37

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 820

<212> DNA

<213> 沙漠蝗(Schistocerca gregaria)

<220>

<221> misc_feature

<222> (781)..(781)

<223> n为a、c、g、t或u

<400> 1

ctatgattat taccatgtgg atgatcttga gaaagttgtc acgtgccatg aagctttgat 60

gcagaaggga gaaggtactt cttgccatta tcgttttctg accaaagggc agcagtggat 120

atggttacaa actaggttct acataactta ccatcaatgg aactcaaagc cagagttcat 180

tgtatgcaca cacagagttg tcagttacat ggatgtaatg aagcaaatga gaaaggaccc 240

tgaagaaggt gaacgaagcc aagacagtga gatgggtgca tgggagtctt ctgataaaca 300

agtgggtact acatcacaag gtagcatctc ttctagtgcc tggacgtctc ggtcctcagg 360

aaaagtatct agagcagaga caaaatcgcc agtgacacag aagcagcatc agtctggatg 420

tactacgaac acagttcctt ctgcagctac tactccaggt tctgctacac ctagtcctgg 480

atctgcatgt gattctgctg tgggtgttgc agcaaccagc tcctctgcac aggcaacatc 540

atcaaggaat tcacaactta gcacgcgacg gtcgaagtca gtcagcagca aattacagat 600

gcctgtaact ccaccagctc aacagcagcg gcaacagcag cagcagcagc agcagcagca 660

acaacaacca caacaacagc aacagcagca gcaacaagaa cagtcatcat caaatgcgat 720

accaacctca acgtcccaag tttcactacc agtggcagct ccattcttag aagcccagca 780

ncaatatgtt acagccatac ctgtccagcc agtattggct 820

<210> 2

<211> 464

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成的多核苷酸

<400> 2

ggatccaagg gcagcagtgg atatggttac aaactaggtt ctacataact taccatcaat 60

ggaactcaaa gccagagttc attgtatgca cacacagagt tgtcagttac atggatgtaa 120

tgaagcaaat gagaaaggac cctgaagaag gtgaacgaag ccaagacagt gagatgggtg 180

catgggagtc ttctgataaa caagtgggta ctacatcaca aggtagcatc tcttctagtg 240

cctggacgtc tcggtcctca ggaaaagtat ctagagcaga gacaaaatcg ccagtgacac 300

agaagcagca tcagtctgga tgtactacga acacagttcc ttctgcagct actactccag 360

gttctgctac acctagtcct ggatctgcat gtgattctgc tgtgggtgtt gcagcaacca 420

gctcctctgc acaggcaaca tcatcaagga attcacaacc gcgg 464

<210> 3

<211> 464

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成的多核苷酸

<400> 3

ggtaccttgt gaattccttg atgatgttgc ctgtgcagag gagctggttg ctgcaacacc 60

cacagcagaa tcacatgcag atccaggact aggtgtagca gaacctggag tagtagctgc 120

agaaggaact gtgttcgtag tacatccaga ctgatgctgc ttctgtgtca ctggcgattt 180

tgtctctgct ctagatactt ttcctgagga ccgagacgtc caggcactag aagagatgct 240

accttgtgat gtagtaccca cttgtttatc agaagactcc catgcaccca tctcactgtc 300

ttggcttcgt tcaccttctt cagggtcctt tctcatttgc ttcattacat ccatgtaact 360

gacaactctg tgtgtgcata caatgaactc tggctttgag ttccattgat ggtaagttat 420

gtagaaccta gtttgtaacc atatccactg ctgcccttga gctc 464

<210> 4

<211> 552

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成的多核苷酸

<400> 4

ggatccatgg tgagcaaggg cgaggagctg ttcaccgggg tggtgcccat cctggtcgag 60

ctggacggcg acgtaaacgg ccacaagttc agcgtgtccg gcgagggcga gggcgatgcc 120

acctacggca agctgaccct gaagttcatc tgcaccaccg gcaagctgcc cgtgccctgg 180

cccaccctcg tgaccaccct gacctacggc gtgcagtgct tcagccgcta ccccgaccac 240

atgaagcagc acgacttctt caagtccgcc atgcccgaag gctacgtcca ggagcgcacc 300

atcttcttca aggacgacgg caactacaag acccgcgccg aggtgaagtt cgagggcgac 360

accctggtga accgcatcga gctgaagggc atcgacttca aggaggacgg caacatcctg 420

gggcacaagc tggagtacaa ctacaacagc cacaacgtct atatcatggc cgacaagcag 480

aagaacggca tcaaggtgaa cttcaagatc cgccacaaca tcgaggacgg cagcgtgcag 540

ctcgccccgc gg 552

<210> 5

<211> 552

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成的多核苷酸

<400> 5

ggtaccggcg agctgcacgc tgccgtcctc gatgttgtgg cggatcttga agttcacctt 60

gatgccgttc ttctgcttgt cggccatgat atagacgttg tggctgttgt agttgtactc 120

cagcttgtgc cccaggatgt tgccgtcctc cttgaagtcg atgcccttca gctcgatgcg 180

gttcaccagg gtgtcgccct cgaacttcac ctcggcgcgg gtcttgtagt tgccgtcgtc 240

cttgaagaag atggtgcgct cctggacgta gccttcgggc atggcggact tgaagaagtc 300

gtgctgcttc atgtggtcgg ggtagcggct gaagcactgc acgccgtagg tcagggtggt 360

cacgagggtg ggccagggca cgggcagctt gccggtggtg cagatgaact tcagggtcag 420

cttgccgtag gtggcatcgc cctcgccctc gccggacacg ctgaacttgt ggccgtttac 480

gtcgccgtcc agctcgacca ggatgggcac caccccggtg aacagctcct cgcccttgct 540

caccatgagc tc 552

<210> 6

<211> 205

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成的多核苷酸

<400> 6

ccgcgggggt acgtattgca ctttagccgc aacgtacctt gtgtgatcgt tttatgccgg 60

cattctgaca catgttttct tctatacgta gggtaagaat ggttccttac aattttaaaa 120

acatgttcat tttgtttccg acggcacact cgtggacatt ctccctcaca aaacaagaat 180

ctttttgtgc tctgcgtagg gtacc 205

<210> 7

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成的多核苷酸(引物)

<400> 7

accggagtca agagcacaca c 21

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成的多核苷酸(引物)

<400> 8

cggaatgcgc gtataccagt 20

<210> 9

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成的多核苷酸(引物)

<400> 9

gcagctcgcc ggtaccta 18

<210> 10

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成的多核苷酸(引物)

<400> 10

ttgtttccga cggcacact 19

<210> 11

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成的多核苷酸(引物)

<400> 11

ccgtcatgca gaaaaagacc at 22

<210> 12

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成的多核苷酸(引物)

<400> 12

ctgcgtaggt accctgcttg a 21

<210> 13

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成的多核苷酸(引物)

<400> 13

ggacattctc cctcacaaaa caa 23

<210> 14

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成的多核苷酸(引物)

<400> 14

caaatgcgat accaacctca ac 22

<210> 15

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成的多核苷酸(引物)

<400> 15

gtctgatgac aacagtgcat 20

<210> 16

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成的多核苷酸(引物)

<400> 16

gtccatcacg ccacaacttt c 21

<210> 17

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成的多核苷酸(引物)

<400> 17

aattaccatt ggtaacgagc gatt 24

<210> 18

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成的多核苷酸(引物)

<400> 18

tgcttccata cccaggaatg a 21

<210> 19

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成的多核苷酸(引物)

<400> 19

ttggaattgg agttggaaca tgt 23

<210> 20

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成的多核苷酸(引物)

<400> 20

agtctaccaa tggatggttt gaca 24

<210> 21

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成的多核苷酸(引物)

<400> 21

accagatcgg agccagctt 19

<210> 22

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成的多核苷酸(引物)

<400> 22

cttctggatg ttgtcgttgt agtt 24

<210> 23

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成的多核苷酸(引物)

<400> 23

ccatgaagct ttgatgcaga ag 22

<210> 24

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成的多核苷酸(引物)

<400> 24

ctggctttga gttccattga tg 22

<210> 25

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成的多核苷酸(引物)

<400> 25

gggatccatg gtgagcaagg gcgagg 26

<210> 26

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成的多核苷酸(引物)

<400> 26

gccgcggggc gagctgcacg ctgcc 25

<210> 27

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成的多核苷酸(引物)

<400> 27

ggagctcatg gtgagcaagg gcgagg 26

<210> 28

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成的多核苷酸(引物)

<400> 28

gggtaccggc gagctgcacg ctgcc 25

<210> 29

<211> 516

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成的多核苷酸

<400> 29

ggatccatgg taagtaaggg ggaggaggac aacatggcga taatcaagga gttcatgcgc 60

ttcaaggttc acatggaggg gtctgtcaac ggccacgagt ttgagatcga gggcgaaggg 120

gagggaagac cttacgaggg aacccagacc gcaaagctaa aggtgacaaa aggtggccct 180

ttgcccttcg cctgggatat actgtcccct cagttcatgt acgggtcgaa ggcctacgta 240

aagcacccag ctgacatccc ggactacttg aagctgtcct ttcccgaggg cttcaagtgg 300

gaacgcgtga tgaacttcga ggacggtggc gtggtgacag tcacacagga ttccagtctg 360

caggacggcg agttcatcta caaggtgaag ttgcggggca caaactttcc ctccgacgga 420

cccgtcatgc agaaaaagac catgggctgg gaggcctctt ccgagagaat gtatcccgaa 480

gacggcgccc tcaagggcga aatcaagcag ccgcgg 516

<210> 30

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成的多核苷酸(引物)

<400> 30

gggatccatg gtaagtaagg gggagg 26

<210> 31

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成的多核苷酸(引物)

<400> 31

gccgcggctg cttgatttcg cccttg 26

<210> 32

<211> 516

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成的多核苷酸

<400> 32

ggtaccctgc ttgatttcgc ccttgagggc gccgtcttcg ggatacattc tctcggaaga 60

ggcctcccag cccatggtct ttttctgcat gacgggtccg tcggagggaa agtttgtgcc 120

ccgcaacttc accttgtaga tgaactcgcc gtcctgcaga ctggaatcct gtgtgactgt 180

caccacgcca ccgtcctcga agttcatcac gcgttcccac ttgaagccct cgggaaagga 240

cagcttcaag tagtccggga tgtcagctgg gtgctttacg taggccttcg acccgtacat 300

gaactgaggg gacagtatat cccaggcgaa gggcaaaggg ccaccttttg tcacctttag 360

ctttgcggtc tgggttccct cgtaaggtct tccctcccct tcgccctcga tctcaaactc 420

gtggccgttg acagacccct ccatgtgaac cttgaagcgc atgaactcct tgattatcgc 480

catgttgtcc tcctccccct tacttaccat gagctc 516

<210> 33

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成的多核苷酸(引物)

<400> 33

ggagctcatg gtaagtaagg gggagg 26

<210> 34

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成的多核苷酸(引物)

<400> 34

gggtaccctg cttgatttcg cccttg 26

<210> 35

<211> 531

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成的多核苷酸

<400> 35

ggatccctgg agcgtgtgtc ttgcctggag gcgcactctg actatctgcg gtccctggcc 60

gtccacccga gtgagcccct ggtcctctcc tcctcggacg acatgctcat taagctctgg 120

aactgggaca aggcctgggc ctgtgaacag gtcttcgagg gacacacgca ctacataatg 180

caagtggtca tcaaccccaa ggacaacaac acttttgcct ccgcctcttt ggaccgcacc 240

atcaaggtct ggcacttggg cgcatcttgc cccaacttca ctctggaggg acatgacaag 300

ggcgtcaact gtctggacta ctaccacgcc ggggacaagc cctacctcat ctcgggggca 360

gacgatcgct ccgtcaagat ttgggattat cagaataaga attgcgtgca aaccctggaa 420

ggacacgccc aaaacatagc gtctgtgtgt ttccatccag agctccccat aatcttgact 480

gggtctgagg atggaacggt acggatctgg catgcaagta catatccgcg g 531

<210> 36

<211> 664

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成的多核苷酸

<400> 36

gaattcggaa acaaaatgaa catgttttta aaattgtaag gaaccattct taccctacgt 60

atagaagaaa acatgtgtca gaatgccggc ataaaacgat cacacaaggt acgttgcggc 120

taaagtgcaa tacgtaccca tatgtacttg catgccagat ccgtaccgtt ccatcctcag 180

acccagtcaa gattatgggg agctctggat ggaaacacac agacgctatg ttttgggcgt 240

gtccttccag ggtttgcacg caattcttat tctgataatc ccaaatcttg acggagcgat 300

cgtctgcccc cgagatgagg tagggcttgt ccccggcgtg gtagtagtcc agacagttga 360

cgcccttgtc atgtccctcc agagtgaagt tggggcaaga tgcgcccaag tgccagacct 420

tgatggtgcg gtccaaagag gcggaggcaa aagtgttgtt gtccttgggg ttgatgacca 480

cttgcattat gtagtgcgtg tgtccctcga agacctgttc acaggcccag gccttgtccc 540

agttccagag cttaatgagc atgtcgtccg aggaggagag gaccaggggc tcactcgggt 600

ggacggccag ggaccgcaga tagtcagagt gcgcctccag gcaagacaca cgctccaggg 660

tacc 664

<210> 37

<211> 4095

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成的多核苷酸

<400> 37

gggctgcagg acgcaatgga ggattatcac cgcaaaaatg aacttcgaaa aaaactttcg 60

agcgaccatg gaaaaggagg atcagattca gattacaaca gtggattgct ctggtagcaa 120

atatcttctg ctagattggc tcatggtcgg ttttggacgt tcgaagctca ccgtcaaaag 180

aaacaaaaga gaagaatgac gtcttcgtga cgtagaatct acgactgtac tcggatctgg 240

gaaatgaatt gactcacggt cttcttcgag tcctgttaca ggcccttggt ccgaaccccc 300

acacgatttt tgcaccaaag atttgcttca atttgctgga tgttttgact gcaagatcag 360

ctggcctagc aagagtgctc gtgttgcttc gtcgggaatc cctacgaatt tcagttctgc 420

acaaatttgt ctgccgtttc gagaattcga tatcatcgac taattcgagc tcggtacccg 480

gggatcctct agagtcgacc tgcaggcatg caagcttcag aagcgtgcta tcgaactcaa 540

ccagggacgt gcggcacaaa tgggcatcct tgctctcatg gtgcacgaac agttgggagt 600

ctctatcctt ccttaaaaat ttaattttca ttagttgcag tcactccgct ttggtttcac 660

agtcaggaat aacactagct cgtcttcacc atggatgcca atctcgccta ttcatggtgt 720

ataaaagttc aacatccaaa gctagaactt ttggaaagag aaagaatatc cgaatagggc 780

acggcgtgcc gtattgttgg agtggactag cagaaagtga ggaaggcaca ggatgagttt 840

tctcgagaca taccttcagc gtcgtcttca ctgtcacagt caactgacag taatcgttga 900

tccggagaga ttcaaaattc aatctgtttg gacctggata agacacaaga gcgacatcct 960

gacatgaacg ccgtaaacag caaatcctgg ttgaacacgt atccttttgg gggcctccgc 1020

tacgacgctc gctccagctg gggcttcctt actatacaca gcgcgcatat ttcacggttg 1080

ccagatgtca agatggccaa gttgaccagt gccgttccgg tgctcaccgc gcgcgacgtc 1140

gccggagcgg tcgagttctg gaccgaccgg ctcgggttct cccgggactt cgtggaggac 1200

gacttcgccg gtgtggtccg ggacgacgtg accctgttca tcagcgcggt ccaggaccag 1260

gtggtgccgg acaacaccct ggcctgggtg tgggtgcgcg gcctggacga gctgtacgcc 1320

gagtggtcgg aggtcgtgtc cacgaacttc cgggacgcct ccgggccggc catgaccgag 1380

atcggcgagc agccgtgggg gcgggagttc gccctgcgcg acccggccgg caactgcgtg 1440

cacttcgtgg ccgaggagca ggactgaacc ttccttaaaa atttaatttt cattagttgc 1500

agtcactccg ctttggtttc acagtcagga ataacactag ctcgtcttca ccatggatgc 1560

caatctcgcc tattcatggt gtataaaagt tcaacatcca aagctagaac ttttggaaag 1620

agaaagaata tccgaatagg gcacggcgtg ccgtattgtt ggagtggact agcagaaagt 1680

gaggaaggca caggatgagt tttctcgagg ccggtctccc tatagtgagt cgtattaatt 1740

tcgataagcc aggttaacct gcattaatga atcggccaac gcgcggggag aggcggtttg 1800

cgtattgggc gctcttccgc ttcctcgctc actgactcgc tgcgctcggt cgttcggctg 1860

cggcgagcgg tatcagctca ctcaaaggcg gtaatacggt tatccacaga atcaggggat 1920

aacgcaggaa agaacatgtg agcaaaaggc cagcaaaagg ccaggaaccg taaaaaggcc 1980

gcgttgctgg cgtttttcca taggctccgc ccccctgacg agcatcacaa aaatcgacgc 2040

tcaagtcaga ggtggcgaaa cccgacagga ctataaagat accaggcgtt tccccctgga 2100

agctccctcg tgcgctctcc tgttccgacc ctgccgctta ccggatacct gtccgccttt 2160

ctcccttcgg gaagcgtggc gctttctcaa tgctcacgct gtaggtatct cagttcggtg 2220

taggtcgttc gctccaagct gggctgtgtg cacgaacccc ccgttcagcc cgaccgctgc 2280

gccttatccg gtaactatcg tcttgagtcc aacccggtaa gacacgactt atcgccactg 2340

gcagcagcca ctggtaacag gattagcaga gcgaggtatg taggcggtgc tacagagttc 2400

ttgaagtggt ggcctaacta cggctacact agaaggacag tatttggtat ctgcgctctg 2460

ctgaagccag ttaccttcgg aaaaagagtt ggtagctctt gatccggcaa acaaaccacc 2520

gctggtagcg gtggtttttt tgtttgcaag cagcagatta cgcgcagaaa aaaaggatct 2580

caagaagatc ctttgatctt ttctacgggg tctgacgctc agtggaacga aaactcacgt 2640

taagggattt tggtcatgag attatcaaaa aggatcttca cctagatcct tttaaattaa 2700

aaatgaagtt ttaaatcaat ctaaagtata tatgagtaaa cttggtctga cagttaccaa 2760

tgcttaatca gtgaggcacc tatctcagcg atctgtctat ttcgttcatc catagttgcc 2820

tgactccccg tcgtgtagat aactacgata cgggagggct taccatctgg ccccagtgct 2880

gcaatgatac cgcgagaccc acgctcaccg gctccagatt tatcagcaat aaaccagcca 2940

gccggaaggg ccgagcgcag aagtggtcct gcaactttat ccgcctccat ccagtctatt 3000

aattgttgcc gggaagctag agtaagtagt tcgccagtta atagtttgcg caacgttgtt 3060

gccattgcta caggcatcgt ggtgtcacgc tcgtcgtttg gtatggcttc attcagctcc 3120

ggttcccaac gatcaaggcg agttacatga tcccccatgt tgtgcaaaaa agcggttagc 3180

tccttcggtc ctccgatcgt tgtcagaagt aagttggccg cagtgttatc actcatggtt 3240

atggcagcac tgcataattc tcttactgtc atgccatccg taagatgctt ttctgtgact 3300

ggtgagtact caaccaagtc attctgagaa tagtgtatgc ggcgaccgag ttgctcttgc 3360

ccggcgtcaa tacgggataa taccgcgcca catagcagaa ctttaaaagt gctcatcatt 3420

ggaaaacgtt cttcggggcg aaaactctca aggatcttac cgctgttgag atccagttcg 3480

atgtaaccca ctcgtgcacc caactgatct tcagcatctt ttactttcac cagcgtttct 3540

gggtgagcaa aaacaggaag gcaaaatgcc gcaaaaaagg gaataagggc gacacggaaa 3600

tgttgaatac tcatactctt cctttttcaa tattattgaa gcatttatca gggttattgt 3660

ctcatgagcg gatacatatt tgaatgtatt tagaaaaata aacaaatagg ggttccgcgc 3720

acatttcccc gaaaagtgcc acctgacgtc taagaaacca ttattatcat gacattaacc 3780

tataaaaata ggcgtatcac gaggcccttt cgtctcgcgc gtttcggtga tgacggtgaa 3840

aacctctgac acatgcagct cccggagacg gtcacagctt gtctgtaagc ggatgccggg 3900

agcagacaag cccgtcaggg cgcgtcagcg ggtgttggcg ggtgtcgggg ctggcttaac 3960

tatgcggcat cagagcagat tgtactgaga gtgcaccata tggacatatt gtcgttagaa 4020

cgcggctaca attaatacat aaccttatgt atcatacaca tacgatttag gtgacactat 4080

agaaccagat ccccc 4095

Claims

1.一种非繁殖转基因微藻，所述非繁殖转基因微藻包含至少一种异源RNAi分子，其中所述RNAi分子靶向异种生物体内存在的多核苷酸，并且其中当所述微藻被所述异种生物体或被所述异种生物体的宿主摄取时，所述RNAi分子使所述异种生物体内存在的所述多核苷酸的表达沉默。

2.根据权利要求1所述的非繁殖转基因微藻，其中所述非繁殖转基因微藻呈干燥的形式。

3.根据权利要求1-2中任一项所述的非繁殖转基因微藻，其中所述非繁殖转基因微藻包含多个拷贝的所述RNAi分子。

4.根据权利要求1-3中任一项所述的非繁殖转基因微藻，其中所述RNAi分子在所述非繁殖转基因微藻的细胞核内被转录。

5.根据权利要求1-4中任一项所述的非繁殖转基因微藻，其中所述RNAi分子靶向选自由以下组成的组的多核苷酸：对所述异种生物体内源的多核苷酸和对所述异种生物异源的多核苷酸。

6.根据权利要求1-5中任一项所述的非繁殖转基因微藻，其中所述RNAi分子包含有义链和反义链，所述有义链和所述反义链一起形成双链体，所述有义链包含与所述异种生物体内存在的所述多核苷酸具有至少95％同一性的至少19个连续核酸。

7.根据权利要求5-6中任一项所述的非繁殖转基因微藻，其中所述RNAi分子靶向对所述异种生物体内源的多核苷酸，并且其中所述异种生物体为害虫。

8.根据权利要求7所述的非繁殖转基因微藻，其中所述害虫为植物害虫。

9.根据权利要求8所述的非繁殖转基因微藻，其中所述植物害虫属于选自由以下组成的组的目：直翅目(Orthoptera)、鳞翅目(Lepidoptera)和鞘翅目(Coleoptera)。

10.根据权利要求9所述的非繁殖转基因微藻，其中所述植物害虫为选自由以下组成的组的蝗虫：沙漠蝗(Schistocerca gregaria)和飞蝗(locusta migratoria)。

11.根据权利要求10所述的非繁殖转基因微藻，其中所述植物害虫为沙漠蝗，并且其中所述RNAi分子靶向clk基因，所述clk基因包含在SEQ ID NO:1中列出的核酸序列。

12.根据权利要求11所述的非繁殖转基因微藻，其中所述RNAi分子包含有义链和反义链，所述有义链包含SEQ ID NO:2中列出的核酸序列或其片段，所述反义链与所述SEQ IDNO:2或其片段互补。

13.根据权利要求12所述的非繁殖转基因微藻，其中所述RNAi分子包含有义链、接头序列和反义链，所述有义链包含SEQ ID NO:2中列出的核酸序列；所述接头序列包含SEQ IDNO:6中列出的核酸序列；所述反义链包含SEQ ID NO:3中列出的核酸序列。

14.根据权利要求7所述的非繁殖转基因微藻，其中所述害虫为动物害虫。

15.根据权利要求14所述的非繁殖转基因微藻，其中所述动物选自由以下组成的组：水生动物和陆生动物。

16.根据权利要求5-6中任一项所述的非繁殖转基因微藻，其中所述RNAi分子靶向对所述异种生物体内源的多核苷酸，所述异种生物体为摄取所述非繁殖转基因微藻的宿主动物的病原体。

17.根据权利要求16所述的非繁殖转基因微藻，其中所述宿主动物选自由以下组成的组：鱼类、甲壳动物、家养农场动物和宠物。

18.根据权利要求17所述的非繁殖转基因微藻，其中所述宿主动物为鱼类或甲壳动物，并且所述病原体为管口目(Siphonostomatoida)的桡足类(copepod)。

19.根据权利要求18所述的非繁殖转基因微藻，其中所述桡足类属于纲鱼虱科(Caligidae)。

20.根据权利要求19所述的非繁殖转基因微藻，其中所述宿主动物为鲑科(Salmonidae)鱼类，并且所述病原体为海虱(鲑疮痂鱼虱(Lepeophtheirus salmonis))。

21.根据权利要求17所述的非繁殖转基因微藻，其中所述宿主动物为家禽，并且所述病原体为短角鸟虱科(Menoponidae)的家禽寄生虫。

22.根据权利要求21所述的非繁殖转基因微藻，其中所述家禽寄生虫选自由以下组成的组：大鸡虱(Menacanthus stramineus)和鸡羽虱(Menopon gallinae)。

23.根据权利要求5-6中任一项所述的非繁殖转基因微藻，其中所述RNAi分子靶向对所述异种生物体异源的多核苷酸，并且其中所靶向的多核苷酸属于感染所述异种生物体的病毒。

24.根据权利要求23所述的非繁殖转基因微藻，其中所述异种生物体选自由以下组成的组：鱼类、甲壳动物、家养农场动物和宠物。

25.根据权利要求24所述的非繁殖转基因微藻，其中所述异种生物体为甲壳动物，并且所述病毒为白斑综合征病毒(WSSV)。

26.根据权利要求1-25中任一项所述的非繁殖转基因微藻，其中当与未摄取所述转基因微藻的生物体内的所述多核苷酸的表达相比时，所述多核苷酸的表达被抑制至少10％。

27.根据权利要求1-26中任一项所述的非繁殖转基因微藻，其中所述转基因微藻被配制为可食用的组合物。

28.根据权利要求27所述的非繁殖转基因微藻，其中所述可食用的组合物还包含选自由以下组成的组的物质：可食用的稀释剂、赋形剂或载体。

29.根据权利要求28所述的非繁殖转基因微藻，其中所述可食用的组合物选自由以下组成的组：陆生动物食物组合物和水生动物食物组合物。

30.根据权利要求1-26中任一项所述的非繁殖转基因微藻，其中所述非繁殖转基因微藻被配制为施加到植物、动物或其一部分上。

31.根据权利要求30所述的非繁殖转基因微藻，其中所述制剂还包含选自由以下组成的组的物质：可食用的稀释剂、赋形剂或载体。

32.根据权利要求30-31中任一项所述的非繁殖转基因微藻，其中所述转基因微藻被配制为选自由以下组成的组的形式：喷雾悬浮液和涂布物。

33.根据权利要求1-32中任一项所述的非繁殖转基因藻类，其中所述转基因微藻为海洋藻类。

34.根据权利要求33所述的非繁殖转基因微藻，其中所述海洋藻类选自由以下组成的组：三角褐指藻(Phaeodactylum tricornutum)、微绿球藻属物种(Nannochloris spp.)、微拟球藻属物种(Nannochloropsis spp.)和杜氏藻属物种(Dunaliella spp.)。

35.根据权利要求34所述的非繁殖转基因微藻，其中所述微藻为三角褐指藻。

36.一种用于抑制生物体内多核苷酸的表达的方法，所述方法包括向所述生物体提供可食用的非繁殖转基因微藻，所述可食用的非繁殖转基因微藻包含靶向所述生物体内存在的所述多核苷酸的RNAi分子。

37.根据权利要求36所述的方法，其中所述RNAi分子使所述生物体内存在的所述多核苷酸的表达沉默。

38.根据权利要求36-37中任一项所述的方法，其中所述生物体内存在的所述多核苷酸为所述生物体的内源基因。

39.根据权利要求36-38中任一项所述的方法，其中所述生物体为选自由以下组成的组的害虫：植物害虫和动物害虫。

40.根据权利要求39所述的方法，其中所述害虫为选自由以下组成的组的目的植物害虫：直翅目、鳞翅目和鞘翅目。

41.根据权利要求40所述的方法，其中所述植物害虫为选自由以下组成的组的蝗虫：沙漠蝗(Schistocerca gregaria)和飞蝗(locusta migratoria)。

42.根据权利要求41所述的方法，其中所述RNAi分子靶向clk基因，所述clk基因包含SEQ ID NO:1中列出的核酸序列。

43.根据权利要求42所述的方法，其中所述RNAi分子包含有义链和反义链，所述有义链包含SEQ ID NO:2中列出的核酸序列或其片段，所述反义链与所述SEQ ID NO:2或其片段互补。

44.根据权利要求39所述的方法，其中所述害虫为动物害虫。

45.根据权利要求44所述的方法，其中所述动物选自由以下组成的组：水生动物和陆生动物。

46.根据权利要求36-37中任一项所述的方法，其中所述生物体内存在的所述多核苷酸对所述生物体为异源的。

47.根据权利要求46所述的方法，其中所述RNAi分子靶向感染所述生物体的病毒。

48.根据权利要求46-47中任一项所述的方法，其中所述生物体选自由以下组成的组：鱼类、甲壳动物、家养农场动物和宠物。

49.根据权利要求46所述的方法，其中所述生物体为甲壳动物，并且所述病毒为白斑综合征病毒(WSSV)。

50.一种用于抑制生物体内多核苷酸的表达的方法，所述方法包括向所述生物体的宿主提供可食用的非繁殖转基因微藻，所述可食用的非繁殖转基因微藻包含靶向所述生物体内存在的所述多核苷酸的RNAi分子。

51.根据权利要求50所述的方法，其中所述宿主选自由以下组成的组：鱼类、甲壳动物、家养农场动物和宠物，并且其中所述生物体为所述宿主的病原体。

52.根据权利要求51所述的方法，其中所述宿主为鱼类或甲壳动物，并且所述病原体为管口目的桡足类。

53.根据权利要求52所述的方法，其中所述桡足类属于纲鱼虱科。

54.根据权利要求53所述的方法，其中所述宿主为鲑科鱼类，并且所述病原体为海虱(鲑疮痂鱼虱)。

55.根据权利要求36-53中任一项所述的方法，其中所述微藻在可食用的组合物内施用。

56.根据权利要求55所述的方法，其中所述可食用的组合物还包含选自由以下组成的组的物质：可食用的稀释剂、赋形剂或载体。

57.根据权利要求36-56中任一项所述的方法，其中所述非繁殖转基因微藻被配制为施加到植物、动物或其一部分上。