KR101000254B1

KR101000254B1 - 파리 살충성 미생물 제제 및 이를 포함하는 양돈용 사료

Info

Publication number: KR101000254B1
Application number: KR1020080064712A
Authority: KR
Inventors: 구동환; 김명진; 곽민근; 최현식
Original assignee: 강원도 횡성군; 주식회사 에스씨아이
Priority date: 2008-07-04
Filing date: 2008-07-04
Publication date: 2010-12-10
Also published as: KR20100004506A

Abstract

본 발명은 축사 환경 문제를 유발하는 파리 살충성 미생물 제제 및 이를 포함하는 양돈용 사료에 관한 것이다. 본 발명에 따른 파리 살충성 미생물 제제는 바실러스 튜린지엔시스(Bacillus thuringiensis) F2(기탁번호 KCTC 11349BP) 균주를 포함하는 것을 특징으로 한다. 본 발명에 따른 파리 살충성 미생물 제제를 돼지에게 급여시 가축 분변에서 발생되는 파리를 감소시킬 수 있는 뛰어난 효과가 있다.

파리 살충, 바실러스 튜린지엔시스, 미생물 제제

Description

파리 살충성 미생물 제제 및 이를 포함하는 양돈용 사료{MICROBIAL PESTICIDES HAVING INSECTICIDAL ACTIVITY ON HOUSE FLIES AND FEED FOR HOG RAISING INCLUDONG THE SAME}

본 발명은 축사 환경 문제를 유발하는 파리 살충성 미생물 제제 및 이를 포함하는 양돈용 사료에 관한 것으로, 본 발명에 따른 파리 살충성 미생물 제제는 신규한 미생물 바실러스 튜린지엔시스(Bacillus thuringiensis) F2(기탁번호 KCTC 11349BP) 균주를 포함하는 것을 특징으로 한다.

양돈장에서 파리를 규제해야 하는 이유는 돼지와 돼지, 혹은 농장과 농장 간에 파리에 의해서 전파될 수 있는 병원체들 때문이다. 파리는 미생물을 옮길 수 있고, 미생물들을 퍼뜨리는데 중요한 역할을 한다.

전형적인 돼지 위생에서 파리가 옮기는 것은 오제스키(Aujesky)병을 일으키는 Pseudorabies, 회충(Ascarid), 유산의 증상을 보이는 브루셀라를 일으키는 Brucella suis, 괴사성 장염의 원인균인 돼지 콜레라와 Clostridium perfringens A, C형, 대장균과 돈단독균, 구제역 바이러스, 콕시듐의 원인체인 Isospora suis, 생식기 장애를 일으키는 렙토스피라증 원인균, 결핵과 관계가 있는 Micobacteria, 위축성 비염을 일으키는 Pasturella multicida와 Salmonella증, 돼지 옴의 원인인 Sarcoptic mites와 돈 적리의 원인체인 Serpulina hyodysenteria, 삼출성 표피 염의 원인균인 Staphylococcus hyicus등이 있다.

그리고 분만사에서 파리와 관계되는 문제는 포유 모돈에 감염이 심한 유방염이 있고, 자돈에서 연쇄상 구균에 의한 뇌막염이 관계가 있다. 또한 파리는 돈두(Swine pox)의 숙주로 정평이 나있으며, 자돈에서는 에페리스로주노시스(Eperithrozooonosis)를 일으키고, TGE의 숙주로 밝혀졌다.

최근 파리를 구제하기 위하여 여러 가지 방법을 이용하고 있다. 첫 번째 방법은 화학적인 방법으로 파리 구더기를 죽이기 위한 살충제의 사용과 파리 성충의 유인제 사용이다. 두 번째는 파리를 유인하기 위한 페르몬과 자외선의 사용이며, 세 번째는 파리 킬러라고 불리는 새 종류를 이용한 천적 형태이다. 그러나 세 번째 방법은 돈사의 문을 열 때 새가 도망치는 것을 주의해야 되고, 죽은 새들이 땅에 떨어지고, 새의 깃털이 병원체의 숙주가 될 수 있다는 이유로 인하여 유용하게 사용되고 있지 않다. 네 번째로는 Ophyra aenescens라는 천적을 이용하여 집파리의 구더기를 없애는 방법이 있다.

파리 구제를 위하여 화학 살충제를 기피하려는 이유는 자연의 다른 곤충과 벌레 조류 등에 해를 끼치고, 화학 물질에 오랫동안 노출되면 화학 물질에 저항성이 생기기 때문이다. 따라서 최근에는 천적이나 미생물을 이용하여 파리를 구제하는 새로운 방법의 개발이 요구되고 있다.

본 발명자들은 축산 폐수, 파리 유충 사체, 퇴비, 갯벌, 토양, 벼의 왕겨, 돼지의 분변 등에서 분리한 신규한 미생물이 파리 살충성을 갖는다는 사실을 발견 하고 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명의 목적은 양돈 축사의 전염병 매개체인 파리를 감소시킬 수 있는 신규한 미생물을 포함하는 파리 살충성 미생물 제제 및 이를 포함하는 양돈용 사료를 제공하는 것이다.

상기한 목적을 달성하기 위하여 본 발명자들은 축산 폐수, 파리 유충 사체, 퇴비, 갯벌, 토양, 벼의 왕겨, 돼지의 분변 등에서 신규한 미생물인 바실러스 튜린지엔시스(Bacillus thuringiensis) F2(기탁번호 KCTC 11349BP) 를 분리하였고, 이러한 신규 미생물을 포함하는 미생물 제제 및 이를 포함하는 양돈용 사료를 완성하였다.

본 발명에 따른 미생물 제제는 축사의 파리 유충에 대한 살충성이 높아 축사 파리 구제용 화학제제를 대체할 수 있고, 축사의 파리수를 현저히 낮출 수 있어 축사 환경을 개선시킬 수 있다. 또한 본 발명에 따른 미생물 제제는 양돈용 사료 첨가제로도 사용할 수 있는 우수한 효과가 있다.

본 발명은 돼지에게 급여함으로써 상기 돼지의 분변으로부터 파리가 발생하는 것을 억제하는 기능을 갖는, 바실러스 튜린지엔시스(Bacillus thuringiensis) F2(기탁번호 KCTC 11349BP) 균주를 포함하는 파리 살충성 미생물 제제를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 파리 살충성 미생물 제제를 포함하는 양돈용 사료를 제공한다.

상기 양돈용 사료에는 파리 살충성 미생물 제제가 사료 총중량에 대하여 0.2%로 포함되는 것이 바람직하다.

또한 상기 파리 살충성 미생물 제제는 축사 파리 구제용 살포제의 용도로서 사용될 수 있다.

또한 본 발명은 MnSO₄ 0.04 g/L, MgSO₄ 0.8g/L, KH₂PO₄ 4g/L, CaCO₃ 1 g/L, molasses 10 g/L, CSL(corn steep liquor) 30 g/L를 포함하는 전배양 배지에, 바실러스 튜린지엔시스(Bacillus thuringiensis) F2(기탁번호 KCTC 11349BP) 균주를 접종한 후 12시간 동안 전배양하는 단계; 상기 전배양된 균주를 상기 전배양 배지와 동일한 성분의 생산배지에 접종하여 9시간 동안 37℃에서 1vvm(vessel volume per minute), 250rpm으로 교반하여 통기시키면서 배양하는 1차 본배양 단계; 상기 1차 본배양된 균주를 상기 전배양 배지와 동일한 성분의 생산배지에 접종하여 포자가 형성될 때까지 37℃에서 0.5vvm, 120rpm으로 교반하여 통기시키면서 배양하는 2차 본배양 단계; 및 상기 2차 본배양 단계에서 얻어진 배양 균액을 옥수수분, 탈지강 및 밀기울 중 선택되는 하나 이상의 곡물가루와 4:5의 중량비율로 혼합한 후 수분함량 10중량%까지 45℃에서 열풍 건조하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 파리 살충성 미생물 제제의 제조방법을 제공한다.

이하, 실시예 및 실험예를 통하여 본 발명을 상세히 설명한다. 그러나 하기 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 아래에서 상술하는 실시예 및 실험예들로 인하여 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 파리 살충성 미생물의 분리 및 동정

(1) 균의 분리

1) 분리원: 축산 폐수, 파리 유충 사체, 퇴비, 갯벌, 토양, 벼의 왕겨, 돼지의 분변 시료로부터 균을 채취하였다.

2) 살충성 균의 분리: 축산폐수, 퇴비, 갯벌, 볏짚, 왕겨, 돼지의 분변 및 퇴비와 같이 부피를 측정할 수 있는 시료는 1㎖을 채취하여 T3 배지에 넣어 진탕 배양하였으며, 파리의 사체와 유충 사체와 곤충의 사체는 자외선으로 2시간동안 골고루 조사한 다음 유충 1마리를 9㎖의 T3 배지(표 1 참조)가 들어있는 시험관에 넣어 150 rpm에서 5시간동안 진탕 배양하였다. 그리고 60℃에서 10분간 열처리하고 상온에서 냉각시킨 후 내용물이 약간 가라앉을 때까지 기다린 다음 T3 agar 배지에 도말하여 30℃에서 2∼3일간 배양하였다. 각각의 생성된 균락을 T3 배지에 순수배양하여 살충성 시험균으로 선발하였다.

3) 파리 유충 치사율 조사

유충 사육 배지(송아지 사료 200g, 어분 5g, 건조효모 1g 및 증류수 200㎖가 혼합되어 있음) 7g을 시험관(지름 45mm, 높이 71mm)에 넣고 배양 배지에서 배양된 시료액(선발된 살충성 시험균) 10㎖을 첨가한 후 골고루 혼합하였다. 철망(구경 2mm)을 이용하여 분리한 2령 충 20마리씩을 용기에 넣고 윗부분을 모기망으로 막은 후, 유충이 모두 우화하여 성충이 될 때까지(10~15일) 25℃에서 60~70%의 습도를 가진 항온실에서 사육한 후 파리로 깨어나는 수를 계산하여 치사율을 구했으며, 모든 실험은 3반복하였다. 치사율 공식은 아래와 같다.

상기 파리 유충 치사율 조사를 통하여 치사율이 우수한 균주를 선발하였으며, 선발된 신규 미생물의 치사율은 표 2에 나타냈었다.

상기 선발된 신규한 미생물 바실러스 튜린지엔시스 F2의 당 이용성을 테스트한 결과는 각각 아래 표 3에 나타냈었다.

실험예 2: 미생물 제제(생균제) 제조를 위한 생산 배지 최적화 실험

분리한 균을 산업적으로 대량 배양을 하기 위하여 고가의 TSB 배지를 대체할 수 있는 저렴한 가격의 Corn Steep Liquor(CSL)을 기본으로 한 산업용 배지를 검토하기 위하여 MnSO₄ 0.004%(0.04 g/L), MgSO₄ 0.08%(0.8 g/L), KH₂PO₄ 0.4%(4 g/L), CaCO₃ 0.1%(1 g/L)를 기본으로 함유한 배지에서 CSL 농도와 당밀(Molasses) 농도를 1~4%(10~40 g/L)로 조절하여 24시간 배양하면서 농도별 균의 생육 정도를 비교하였다.

< 바실러스 튜린지엔시스 F2의 생산 배지 최적화>

선발된 바실러스 튜린지엔시스 F2를 미생물 제제(생균제)로 제조하기 위하여 질소원으로서 CSL과 당원료로서 molasses를 이용하여 생산 균수를 최적화 하였다(표 4). 생균수는 위의 결과와 마찬가지로 molasses 3%(30 g/L), CSL 4%(40 g/L)의 경우 3.87×10⁹cfu/ml으로 가장 높았고, 건조 생균수도 1.02×10⁹cfu/ml으로 가장 높았지만, 실질적인 생균수 비례 열풍 건조 처리 후의 회복 율을 살펴보았을 때 Molasses 1%(10 g/L)와 CSL 3%(30 g/L)의 경우가 27.9%(8.74×10⁸cfu/ml)로서 가장 높아 가장 합리적인 비율로서 결정되었다.

실험예 3: 파리 살충성 미생물 제제(생균제)의 제조

실험실 수준에서 선발한 산업용 배지를 사용하여 산업화를 위한 생산 시설에 적용하는 실험을 수행하였다. 먼저, 2ℓ flask에 400㎖의 생산 배지에 실시예 1에서 선발한 파리 살충성 신규 미생물(바실러스 튜린지엔시스 F2)을 접종 후 12시간 동안 배양하고 20ℓ의 배지를 함유하는 30ℓ 발효기에 접종하여 9시간 동안 37℃에서 1vvm(vessel volume per minute), 250rpm으로 교반하여 통기시키면서 배양하고 3톤의 발효기 1600ℓ배지에 접종하여 포자가 형성할 때(통상 20시간 이내)까지 37℃에서 0.5vvm, 120rpm으로 교반하여 통기시키면서 배양하였다. 배양 균액을 곡물가루(옥수수 분, 탈지강, 밀기울)에 4 : 5의 중량 비율로 혼합한 후 수분 함량이 10중량% 정도까지 케비넷 건조기에서 열풍 건조(45℃)하여 미생물 제제(생균제)를 제조한 후 20kg 단위로 포장하였다.

실험예 4: 파리 살충성 효과 조사

상기 실험예 3에서 제조한 미생물 제제를 파리 사료에 혼합한 후 파리 암수 각각 20마리씩을 파리 사육 망사에 방사한 후 하루 동안 산란을 유도하고 배양한 사료에서 최종적으로 발생한 파리 수를 3차에 걸쳐서 조사한 자료를 표 5에 나타내었다.

실험예 5. 파리 살충성 미생물 독소 분리 및 동정

(1) 실험 방법

1) Primer의 설정 및 DNA 분리

파리 살충에 효과를 나타내는 내독소(δ-endotoxin)를 포함하는 도메인(domain)은 이와 유사한 다른 단백질처럼 진화상 잘 보존(conserve)되어 왔다. 본 발명을 통하여 개발하고자 하는 물질은 기타 다른 저분자 물질이 아닌 단백질 독성을 나타내는 물질이어야 하기 때문에 다음과 같은 조건으로 PCR(Polymerase Chain Reaction)을 수행하였다. 우선 독성을 나타내는 도메인이 어느 부분인지를 확인하기 위하여 PCR을 수행하기 위한 primer를 문헌조사를 통하여 설정하였다. 문헌조사 결과 현재까지 분리된 균주로부터 단백질 내독소를 나타내는 공통 도메인을 설정하여 cry4A universal primer와 specific primer, cry11A specific primer를 주문 제작하였다. cry4A universal primer의 DNA 염기서열은 sense primer(5' - GCA TAT GAT GCG AAA CAA GCC - 3'), antisense primer(3' - GCG TGA CAT ACC CAT TTC CAG GTC C - 5')이며 이 primer에 의해 생산되는 PCR product는 439bp가 된다. cry4A specific primer의 DNA 염기서열은 sense primer(5' - GGG TAT GGC ACT CAA CCC CAC TT - 3'), antisense primer(3' - GCG TGA CAT ACC CAT TTC CAG GTC C - 3')이며 이 primer에 의해 생산되는 PCR product는 1529bp가 된다. cry11A specific primer의 DNA 염기서열은 sense primer(5' - CCC AAC CTA CTA TTG CGC CA - 3'), antisense primer(3' - CTC CCT GCT AGG ATT CCG TC - 5')이며 이 primer에 의해 생산되는 PCR product는 445bp가 된다. 각각의 신규 미생물을 50㎖ Seed culture medium(NaCl 5g, K₂HPO₄ 25g, Glucose 5g, Yeast extract 1g, Tryptose 10g, pH 7.5)에서 37℃, 170rpm의 조건으로 18시간 배양한 후 DNA purification kit(iNtRON Biotechnology Co. Korea)를 이용하여 genomic DNA를 분리하였다.

2) PCR 실험을 위한 조건

분리된 균주의 PCR 실험을 위한 조건은, 1㎕ template DNA(50ng/㎕), 각 10pMol sense primer, antisense primer, 2.5mM dNTPs, 10 x reaction buffer(100mM Tris-HCl, 400mM KCl, 15mM MgCl₂, pH 9.0), 5 units Taq DNA-polymerase(BioNEER, Korea)를 첨가하고, total volume은 20㎕로 하였고, PCR program은 denaturation 94℃, 1 min, annealing 50℃, 45 sec, extension 72℃, 50 sec, final extention 72℃ 10min 이며 총 30 cycles로 수행하였다. 단, cry4A specific primer를 이용한 PCR과정은 PCR product의 크기가 약 1,500bp정도가 예상되기 때문에 extension time을 1분 30초로 설정하였다.

3) 균주의 배양 및 배지 조건

균주를 배양하기 위한 기초배지로 Seed culture medium을 사용하였고, 내독소(δ-endotoxin) 단백질 결정체의 생성유도를 위해 Glucose Yeast Salt(GYS) 배지를 사용하였다. 10 ㎖의 Seed culture medium에 균을 접종한 후, 37℃, 170rpm의 조건으로 18시간 배양한 후, 균의 농도가 1.0×10⁹ cfu/㎖에 도달하게 되면, 250㎖의 GYS 배지에 위의 배양액 5㎖을 접균하여 완전한 autolysis(48~96시간)가 일어날 때 까지 170rpm의 조건으로 배양하였다. 사용된 균주는 Nutrient Agar에 보관 및 유지하였다.

4) 아포 및 살충성 내독소 결정체의 분리

GYS 배지에서 96 시간 배양 후 배양액을 15분간 4℃에서 15,000 x g로 원심분리한 후 침전물을 멸균 증류수로 3회 세척하였다. autolysis된 침전물을 freeze-thaw 방법으로 반복하여 세포벽을 파괴한 후 아포 및 내독소 결정체를 분리하기 위하여 65~85%의 sucrose 선상구배 밀도를 조성하고, 배양 침전액 3~5㎖을 천천히 떨어뜨린 다음 4℃에서 25,000 x g로 2시간 원심분리 하였다. 원심분리 튜브에 분리된 내독소 단백질 결정체 층을 파스퇴르 피펫으로 회수하여 멸균 증류수로 5회 이상 세척하였다.

5) 내독소 결정체의 전자현미경적 관찰

정제된 내독소 결정체 현탁액을 콜로디온 막을 씌운 전자현미경 그리드 위에 떨어뜨리고 실온에 방치하여 건조한 뒤 gold 코팅하여 주사전자현미경(Scanning Electron Micrograph:HITACHI S-3000N)으로 30Kv에서 30,000배로 관찰하였다.

6) 내독소 단백질의 용해와 단백질 분해효소에 의한 활성화

분리된 내독소 단백질 결정체들을 10mM dithiothreitol/50mM carbonate buffer(pH 10.0)에 넣고 37℃에서 각각 10분, 20분, 30분, 1시간, 1시간 30분, 2시간, 3시간에 걸쳐서 용해하였다. 녹지 않은 침전물은 원심 분리를 하여 제거시키고, 용해된 내독소 단백질을 단백질 분해효소인 trypsin(0.25mg/㎖, Sigma, U.S.A.)으로 각각 10분, 20분, 30분, 1시간, 2시간, 3시간 동안 37℃에서 반응시켰다. 단백질 분해효소인 trypsin에 의한 내독소 단백질의 활성을 차단시키기 위해서 Laem㎖i sample buffer[60mM Tris/HCl busser, 2%(w/v) SDS(Sodium dodecyl sulfate, 25%(v/v) glycerol, 14.4mM 2-mercaptoethanol, 0.1% bromophenol blue, pH6.8]를 첨가하여 SDS-PAGE sample로 사용하였다. SDS-PAGE로 분석하기 전까지 위에서 만든 시료는 -20℃에서 보관하였다.

7) SDS-PAGE

분리된 내독소 단백질 결정체를 1N NaOH로 pH가 12가 되게 조정한 후 37℃에서 30시간 처리한 다음, 다시 pH가 7.5로 되게 조정하였다. 용해된 내독소 용액 50㎕에 Laemmli sample buffer[60mM Tris/HCl busser, 2%(w/v) SDS(Sodium dodecyl sulfate, 25%(v/v) glycerol, 14.4mM 2-mercaptoethanol, 0.1% bromophenol blue, pH6.8]를 50㎕ 혼합한 후에 약 3분간 100℃에서 끓인 후, 다시 약 1분 동안 10,000 x g에서 원심분리를 하였다. 여기서 얻어진 상등액을 취하여 SDS-PAGE sample로 사용하였다. SDS-PAGE로 분석하기 전까지 위에서 만든 시료는 -20℃에서 보관하였다. SDS-PAGE는 Laemmli 방법에 의한 불연속 완충용액 시스템을 이용하였다. Gel은 10% seperating gel과 5% stacking gel을 사용하였다. 전기영동이 끝난 후 Coomassie brilliant blue R-250 염색용액(0.125% Coomassie brilliant blue R-250, 5% methanol, 7.5% glacial acetic acid)에 40~60분 동안 염색한 후, 탈색용액(12.5% methanol, 3.75% glacial acetic acid)으로 6~8시간 동안 탈색하였다. 내독소 단백질의 분자량 측정은 protein marker(MBI protein marker ＃SM0661)를 사용하였다.

(2) 실험 결과

1) PCR 실험

실험에 사용된 균주는 Bacillus thuringiensis F2이며, 이 균주를 대상으로 PCR 실험을 수행하였다. PCR 실험 결과 Bacillus thuringiensis F2는 Cry4A specific primer에 의해 예상했던 PCR product인 1529bp band를 얻을 수 있었다(도 1 참조).

DNA 염기서열을 확인하기 위하여 PCR product를 SolGent(solution for genetic technology, Korea) 회사에 의뢰하였고, 그 결과를 NCBI BLAST를 이용하여 DNA sequence를 분석해 본 결과 Bacillus thuringiensis와 관련된 sequence를 가진 것으로 나타났다.

2) 균주의 배양 및 배지의 조건

일반적으로 아포 및 내독소가 생산되기 위해서는 영양분이 고갈되어야만 된다는 점, 한 개의 세포내에 한 개의 아포와 통상 한 개 또는 두 개의 내독소를 생산하기 때문에 아포의 수는 내독소의 수와 비례한다는 점 및 carbon source가 많이 첨가된 배지에서는 생장률은 매우 높으나 내독소 생산은 매우 적고, carbon source가 적고 nitrogen source가 많이 첨가된 배지에서는 생장률은 낮으나 내독소 생산이 많다는 점을 고려하여 GYS 배지를 조제하였다. 초기배양에서는 균의 생장률이 높아야하기 때문에 carbon source가 많이 첨가된 배지를 사용해서 배양을 한 후 nitrogen source가 많이 첨가된 배지에 재접종 하였다. 이 배양과정에서 열악한 생장 환경 때문에 autolysis가 일어나게 되어 cell debris, 내독소 단백질, 아포 등에 의해 배양액의 투명도가 매우 탁하고, 점성이 있는 상태로 나타났다. 내독소 단백질의 유무를 확인하기 위해 주기적(24시간)으로 광학 현미경(Axioskop2 plus. CARL ZEISS)으로 관찰한 결과 rod type의 cell이 깨져있는 형태, 원형(아포)과 내독소 단백질의 형태(아포보다 작은 원형)를 관찰할 수 있었다.

3) 아포 및 살충성 내독소 결정체의 분리

96시간 배양한 배양액을 15분간 4℃에서 15,000 x g로 원심분리한 후 침전물을 멸균 증류수로 3회 세척하였다. 침전물에는 배양과정에서 autolysis가 이루어져 형성된 일부 cell debris, 내독소 단백질, 아포 및 autolysis가 않된 cell들이 있었다. 따라서 autolysis가 되지 않은 cell들의 세포벽을 파괴하기 위해 freeze-thaw 방법을 추가적으로 수행하였다. freeze-thaw 방법은 액체질소 가스를 침전물에 넣고 급속 냉동 후 60℃ water bath에서 2~3분 동안 녹였다. 이런 과정을 3~5회 정도 반복하였다. 아포 및 내독소 결정체를 분리하기 위하여 85%는 5㎖, 80%, 75%, 70%는 6㎖, 65%는 5㎖을 고농도순으로 각각 넣고 침전물 용액을 4~5㎖정도 접종하고, 25,000 x g로 2시간 원심분리 한 결과 내독소 결정체 밴드가 70%~75%(w/v) 사이에 형성되었고, 아포 및 cell debris는 튜브 밑에서 pellet을 형성하였다(도 2 참조).

4) 내독소 결정체의 전자현미경적 관찰

분리된 내독소 밴드를 회수하여 멸균 증류수로 5회 이상 세척한 후 주사전자현미경(SEM:HITACHI S-3000N)에 의해 외부구조를 관찰한 결과 분리된 내독소 결정체의 모양은 구형에 가까웠으며 외형에 주름이 잡혀 있었다(도 3 참조).

5) SDS-PAGE

Sucrose 농도 구배를 통해 정제한 내독소 단백질을 1N NaOH로 pH가 12가 되게 조정한 후 37℃에서 30시간 처리한 다음, 다시 pH가 7.5가 되도록 조정하였다. 그 후 10% SDS-polyacrylamide 전기영동 분석에 의해 그 순도(실질적인 molecular weight)와 하위 단위체의 크기 및 수를 검토하여 protein marker와 비교한 후 독소단백질을 확인하였다.

실험예 6: ICR 마우스를 이용한 간이 독성 검사

태어난 지 2주령 되는 ICR 마우스를 분양 받아 사육케이지 당 4마리를 넣어 1주일 동안 안정을 취하였다. 사육환경은 21℃±3℃, 상대 습도는 40~60%이었으며, 케이지내의 깔짚은 3일에 한번씩 갈아주었다. 실험 균주 접종량은 균주 배양액 1.2㎖을 펠렛 사료 60g에 분주하여 사료 대비 균 접종액의 양이 0.2중량%가 되도록 하여 20분 가량 정치한 후 사료 급여 통에 넣어두었다. 독성 검사는 간접적인 방법으로 각각 개체에 대한 일당 증체량과 사료 효율과 사료 요구율을 대조구와 비교하였으며, 직접적인 방법으로 각각 개체의 적혈구와 백혈구수를 측정하여 대조구와 비교하여 독성유무를 판단하였다. 표 6은 각각 균주의 급여에 의한 ICR 마우스의 사양 효과를 나타낸 자료이며, 표 7은 각각 균주의 급여에 의한 ICR 마우스의 혈액내의 적혈구 수와 백혈구 수를 나타낸 자료이다. 본 발명에 따른 미생물 제제를 포함하는 사료를 급여시 특이적인 사양 성적의 차이나 혈액 성분 변화를 감지 할 수 없었고 어떤 외형적, 행동적인 변화를 볼 수 없었다.

실험예 7: 미생물 제제 투여 후 돼지 분변의 파리 유인 효과

파리 살충성 미생물 제제를 0.2중량% 포함하는 사료를 먹은 돼지 분변의 파리 유인 효과를 확인하기 위하여, 돼지 분변(돈분)을 약 100g씩 채취하여 비어커에 담아 파리 사육 케이지에 넣고 파리 암.수놈을 무작위로 총 70마리를 혼합 방사하여 돈분에 앉아 있는 파리의 마리 수를 시간별로 조사하였다(표 8 참조). 파리 살충성 미생물을 제제를 급여한 실험구에서는 총 56마리가 앉아 있어 전체 파리 중 21%정도 파리 유인 효과가 있었으며, 비 급여구에서는 42%, 어느 곳에서도 앉지 못하고 배회하는 파리수가 37%정도로 나타났다. 급여구가 비 급여구의 분변에 비해 파리 유인 효과가 평균 100% 더 있었다.

실험예 8: 미생물 제제 투여 후 돼지 분변에서의 파리 발생율

파리 살충성 미생물 제제를 0.2중량% 포함하는 사료를 먹은 돼지 분변(돈분) 100g을 채취하여 비이커에 담아서 24시간 동안 파리 암수 각각 20마리와 함께 파리 망사 케이지에 넣어두어 파리의 산란을 유도하고 실험실 조건(25±2℃)에서 알이 부화하여 성충으로 발육하는 것을 3반복으로 조사하였다(표 9 참조). 급여구의 경우 총 파리 발생수가 현저히 낮아 파리 발생 억제 효과가 뛰어남을 확인할 수 있었다.

도 1은 Cry 4A-specific primer를 이용한 바실러스 튜린지엔시스 PCR product의 아가로스 젤 전기영동(1%) 결과를 보여주는 사진이다.

도 2는 65% to 85% sucrose 농도 구배에 의해 분리된 내독소 밴드(endotoxin crystal band)를 보여주는 사진이다.

도 3은 분리된 내독소 밴드를 회수하여 멸균 증류수로 5회 이상 세척한 후 주사전자현미경(SEM)에 의해 외부구조를 관찰한 결과를 보여주는 사진이다.

Claims

돼지에게 급여함으로써 상기 돼지의 분변으로부터 파리가 발생하는 것을 억제하는 기능을 갖는, 바실러스 튜린지엔시스(Bacillus thuringiensis) F2(기탁번호 KCTC 11349BP) 균주를 포함하는 파리 살충성 미생물 제제.
청구항 1 기재의 파리 살충성 미생물 제제를 포함하는 것을 특징으로 하는 양돈용 사료.
청구항 2에 있어서, 상기 파리 살충성 미생물 제제는 사료 총중량에 대하여 0.2%로 포함하는 것을 특징으로 하는 양돈용 사료.
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