CN110117621A - 一种碱基编辑器及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种碱基编辑器及其制备方法和应用，属于基因编辑技术领域，所述碱基编辑器包括pCMV‑dCpf1‑RR‑eBE重组质粒和pLbCpf1‑sgRNA重组质粒；所述应用包括以下步骤：确定靶标序列，设计单链寡核苷酸对；退火获得双链DNA片段；连接到pLbCpf1‑sgRNA重组质粒中获得靶位点sgRNA表达载体；靶位点sgRNA表达载体与pCMV‑dCpf1‑RR‑eBE重组质粒共转染细胞后培养；本发明所述碱基编辑器能够特异性的将靶位点的胞嘧啶C突变为胸腺嘧啶T，而对非靶位点的碱基没有任何影响，基因编辑效率在20％～30％之间。
Description
技术领域
本发明属于基因编辑技术领域，尤其涉及一种碱基编辑器及其制备方法和应用。
背景技术
传统的CRISPR/Cas9基因编辑技术虽然具有较高的基因敲除效率，但在执行碱基替换 (譬如对造成遗传性疾病的点突变进行矫正)时效率通常很低，这也限制了CRISPR/Cas9 基因编辑的应用。近年，利用将CRISPR/Cas9和APOBEC(胞嘧啶脱氨酶)整合而发展出的新型碱基编辑系统(Base Editor,BE)，可在单碱基水平(如胞嘧啶向胸腺嘧啶)实现高效率的基因组靶向编辑改造。这种新型碱基编辑系统理论上可对数百种引起人类疾病的基因组点突变进行定点矫正，因此拥有巨大的临床应用潜力。目前已报道的碱基编辑系统均是利用Cas9蛋白(主要是Streptococcus pyogenesCpf1,SpCpf1和StaphylococcusaureusCpf1,SaCpf1)执行与基因组的靶向性结合，而这种靶向性结合依赖于靶点旁侧的PAM(ProtospacerAdjacent Motif)序列。SpCas9和SaCas9蛋白所识别的PAM序列多含鸟嘌呤/胞嘧啶(G/C-rich)，因此利用已报导的碱基编辑系统无法在腺嘌呤/胸腺嘧啶富集 (A/T-rich)区域进行高效的碱基编辑操作。
近日，上海科技大学和中科院的科研人员构建了一系列基于CRISPR/Cpf1蛋白的新型碱基编辑器(Cpf1-BE)(见文献:Base editing with a Cpf1–cytidine deaminasefusion， Xiaosa Li,Ying Wang,Yajing Liu,Bei Yang,Xiao Wang,Jia Wei,ZongyangLu,Yuxi Zhang, Jing Wu,Xingxu Huang,Li Yang&Jia Chen.Nature Biotechnologyvolume 36,pages 324–327(2018))。由于Cpf1蛋白可识别富含腺嘌呤/胸腺嘧啶的PAM序列，这种基于Cpf1 的新型碱基编辑器实现了在腺嘌呤/胸腺嘧啶富集区域的碱基编辑操作。在拓展编辑区域的同时，基于Cpf1的新型碱基编辑器所产生的编辑副产物也较低，因此具有更高的编辑精准度。这种基于Cpf1的新型碱基编辑器与现有的基于Cpf1的碱基编辑器可实现碱基编辑的有效互补，为碱基编辑系统在基础研究及未来临床领域的全面深入应用提供了新方法、拓展了新思路。但是这种碱基编辑器仅仅识别5’-TTTV的PAM序列，这种靶点在基因组中比较稀少，从而导致它的应用范围狭窄。CRISPR/Cpf1-RR突变体(见文献:Engineered Cpf1variants with altered PAM specificities.Linyi Gao,David B TCox,Winston X Yan,John C Manteiga,Martin W Schneider,Takashi Yamano,HiroshiNishimasu,Osamu Nureki,Nicola Crosetto&Feng Zhang.Nature Biotechnology volume35,pages 789–792 (2017))将识别范围扩展到了5’-TYCV，这种靶点在基因组中相对较多，将 CRISPR/Cpf1-RR突变体改造成新型的碱基编辑器，将会显著扩展碱基编辑的靶标范围。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种能够特异性的将靶位点中靶位点的胞嘧啶C 突变为胸腺嘧啶T的碱基编辑器及其制备方法和应用。
为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：
一种碱基编辑器，包括pCMV-dCpf1-RR-eBE重组质粒和pLbCpf1-sgRNA重组质粒；
所述pCMV-dCpf1-RR-eBE重组质粒包括载体骨架pCMV-dCpf1-eBE和
dCpf1-RR-eBE表达框DNA片段；
所述pLbCpf1-sgRNA重组质粒包括载体骨架pUC57和sgRNA通用表达框的DNA 片段。
优选的，所述dCpf1-RR-eBE表达框DNA片段的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。
优选的，sgRNA通用表达框DNA片段的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。
优选的，所述pLbCpf1-sgRNA重组质粒的核苷酸序列如SEQ ED NO：3所示。
本发明提供了所述的碱基编辑器的制备方法，包括以下步骤：
将dCpf1-RR-eBE表达框DNA片段插入到载体骨架pCMV-dCpf1-eBE中构建获得pCMV-dCpf1-RR-eBE重组质粒；
将sgRNA通用表达框DNA片段插入到载体骨架pUC57中获得pLbCpf1-sgRNA重组质粒。
优选的，所述dCpf1-RR-eBE表达框DNA片段的插入位点为载体骨架 pCMV-dCpf1-eBE的Pst I酶切位点和Apa I酶切位点之间；所述sgRNA通用表达框DNA 片段的插入位点为载体骨架pUC57的EcoRV酶切位点。
本发明提供了所述的碱基编辑器在基因编辑中的应用，包括以下步骤：
1)确定待编辑基因的靶位点，并根据所述靶位点设计所述靶位点的单链寡核苷酸对；
2)将所述单链寡核苷酸对退火获得双链DNA片段；
3)将所述双链DNA片段连接到pLbCpf1-sgRNA重组质粒中获得靶位点sgRNA表达载体；
4)将所述靶位点sgRNA表达载体与所述pCMV-dCpf1-RR-eBE重组质粒共转染细胞后培养36～60h。
优选的，步骤4)中靶位点sgRNA表达载体与所述pCMV-dCpf1-RR-eBE重组质粒的总质量与转染细胞的个数的比例为0.5μg:(0.5～5)×106个。
优选的，所述靶位点sgRNA表达载体与所述pCMV-dCpf1-RR-eBE重组质粒的比例为(1～5)：(1～5)。
优选的，步骤3)中所述双链DNA片段与pLbCpf1-sgRNA重组质粒通过酶切后连接；所述酶切用酶为BbsⅠ酶。
本发明的有益效果：本发明提供的碱基编辑器，包括pCMV-dCpf1-RR-eBE重组质粒和pLbCpf1-sgRNA重组质粒；所述pCMV-dCpf1-RR-eBE重组质粒包括载体骨架 pCMV-dCpf1-eBE和dCpf1-RR-eBE表达框DNA片段；所述pLbCpf1-sgRNA重组质粒包括载体骨架pUC57和sgRNA通用表达框的DNA片段。本发明所述碱基编辑器能够特异性的将靶位点的胞嘧啶C突变为胸腺嘧啶T，而对非靶位点的碱基没有任何影响，基因编辑效率在20％～30％之间，可有效修饰哺乳动物的基因组DNA序列，是高效的基因碱基编辑器。
具体实施方式
本发明提供了一种碱基编辑器，包括pCMV-dCpf1-RR-eBE重组质粒和pLbCpf1-sgRNA重组质粒；所述pCMV-dCpf1-RR-eBE重组质粒包括载体骨架 pCMV-dCpf1-eBE和dCpf1-RR-eBE表达框DNA片段；所述pLbCpf1-sgRNA重组质粒包括载体骨架pUC57和sgRNA通用表达框的DNA片段。
在本发明中，所述pCMV-dCpf1-RR-eBE重组质粒包括载体骨架pCMV-dCpf1-eBE 和dCpf1-RR-eBE表达框DNA片段；本发明对所述载体骨架pCMV-dCpf1-eBE的来源没有特殊限定，优选的采用市售产品；在本发明具体实施过程中，所述载体骨架 pCMV-dCpf1-eBE购自addgene，货号为107688。本发明中，所述dCpf1-RR-eBE表达框 DNA片段的核苷酸序列优选的如SEQ ID NO：1所示。本发明中，所述dCpf1-RR-eBE 表达框DNA片段的插入位点优选为载体骨架pCMV-dCpf1-eBE的Pst I酶切位点和Apa I 酶切位点之间，即所述载体骨架pCMV-dCpf1-eBE的2365bp-5178bp区间。
在本发明中，所述pLbCpf1-sgRNA重组质粒包括载体骨架pUC57和sgRNA通用表达框DNA片段。在本发明中，所述载体骨架pUC57优选的来源是市售商品；所述sgRNA 通用表达框DNA片段包括顺次连接的U6启动子序列、转录起始信号、sgRNA上游序列、 spacer克隆位点、U6终止子编码序列和bGH polyA序列；所述sgRNA通用表达框DNA 片段优选的将上述序列整合后进行调整，所述sgRNA通用表达框DNA片段的核苷酸序列优选的如SEQ ID NO：2所示。在本发明中，所述sgRNA通用表达框DNA片段优选的插入载体骨架pUC57的EcoRV酶切位点。本发明中，所述pLbCpf1-sgRNA重组质粒的核苷酸序列优选的如SEQ ED NO：3所示。
本发明提供了所述的碱基编辑器的制备方法，包括以下步骤：将dCpf1-RR-eBE表达框DNA片段插入到载体骨架pCMV-dCpf1-eBE中构建获得pCMV-dCpf1-RR-eBE重组质粒；将sgRNA通用表达框DNA片段插入到载体骨架pUC57中获得pLbCpf1-sgRNA重组质粒。
在本发明中，所述dCpf1-RR-eBE表达框DNA片段的插入位点为载体骨架 pCMV-dCpf1-eBE的Pst I酶切位点和Apa I酶切位点之间，即所述载体骨架 pCMV-dCpf1-eBE的2365bp-5178bp区间；在本发明中，所述插入优选的通过将所述 dCpf1-RR-eBE表达框DNA片段和pCMV-dCpf1-eBE分别进行双酶切后进行连接；所述双酶切用酶为Pst I酶和Apa I酶。本发明中，所述酶切的体系以50μL计，优选的包括 Pst I酶1μL；Apa I酶1μL，dCpf1-RR-eBE表达框DNA片段1μg，Buffer H 5μL和余量的双蒸水。在本发明中，所述酶切体系中的试剂优选的购自宝生物工程(大连)有限公司。本发明在所述酶切后将酶切产物进行连接。在本发明中，所述连接的体系以10μL计，优选的包括T4 DNA连接酶1μL，T4 DNA连接Buffer 1μL，dCpf1-RR-eBE表达框DNA 片段的酶切产物4μL，载体骨架pCMV-dCpf1-eBE酶切产物4μL；所述连接过程中所用试剂优选的购自NEB公司，货号M0202S；所述连接的温度优选为4℃，所述连接的时间优选为10～14h。本发明在获得所述pCMV-dCpf1-RR-eBE重组质粒后优选的将所述质粒导入大肠杆菌感受态细胞中进行克隆，本发明对所述克隆的具体操作没有特殊限定，采用本领域常规的操作即可。
本发明将sgRNA通用表达框DNA片段插入到载体骨架pUC57中获得 pLbCpf1-sgRNA重组质粒。在本发明中，所述sgRNA通用表达框DNA片段的插入位点优选为载体骨架pUC57的EcoRV酶切位点；本发明对所述sgRNA通用表达框DNA片段插入到载体骨架pUC57中的方法没有特殊限定，按照本领域常规的酶切连接法插入自行制备或委托生物公司进行合成。在本发明的一个具体实施过程中，委托生工生物工程 (上海)股份有限公司制备pLbCpf1-sgRNA重组质粒。
本发明还提供了所述的碱基编辑器在基因编辑中的应用，包括以下步骤：1)确定待编辑基因的靶位点，并根据所述靶位点设计所述靶位点的单链寡核苷酸对；2)将所述单链寡核苷酸对退火获得双链DNA片段；3)将所述双链DNA片段连接到pLbCpf1-sgRNA 重组质粒中获得靶位点sgRNA表达载体；4)将所述靶位点sgRNA表达载体与所述 pCMV-dCpf1-RR-eBE重组质粒共转染细胞后培养36～60h。
在本发明中，首先确定待编辑基因的靶位点；本发明对所述待编辑基因没有特殊限定，任何哺乳动物细胞中的基因均可作为待编辑的基因；在本发明中，所述靶位点的长度优选为5～10bp，更优选为6～7bp。本发明在确定靶位点后，根据所述靶位点设计所述靶位点的单链寡核苷酸对；在本发明中，所述单链寡核苷酸对通过通过以下规则设计：在基因组序列中将靶位点序列向上下游延伸，使得该序列5’端末端紧邻TYCV序列(即 PAM序列)，总长度为20-30bp，即为靶标序列(编码sgRNA起识别并结合DNA序列作用的部分)；正向寡核苷酸序列为在靶标序列5’端加上AGAT，反向寡核苷酸为在靶标序列的反向互补序列5’端加上AAGC。
本发明在获得所述单链寡核苷酸对后，将所述单链寡核苷酸对退火获得双链DNA片段。在本发明中，所述单链寡核苷酸对优选的委托生物科技公司进行合成。在本发明中，所述退火的程序优选的如下：95℃5min，72℃，10min，0℃保持；在本发明具体实施过程中，所述“0℃保持”优选的通过将退火体系置于冰上实现。
本发明将所述双链DNA片段连接到pLbCpf1-sgRNA重组质粒中获得靶位点sgRNA表达载体；在本发明中，所述双链DNA片段与pLbCpf1-sgRNA重组质粒通过酶切后连接；所述酶切用酶为BbsⅠ酶。本发明对所述酶切和连接的具体方法和参数没有特殊限定，采用本领域常规的酶切和连接的方法和参数即可。本发明在所述连接后，优选的对所述连接的产物进行检测；所述检测优选的包括将所述连接产物转入大肠杆菌感受态细胞中进行培养，然后依次进行菌落PCR检测和测序检测；检测正确无误的靶位点sgRNA 表达载体用于后续试验。在本发明对所述转化、菌落PCR和测序检测的方法没有特殊限定，采用本领域常规的方法即可。
本发明在获得所述靶位点sgRNA表达载体，优选的还包括对所述靶位点sgRNA表达载体的特异性进行检测的过程，确定所述靶位点sgRNA表达载体是否能够特异性的识别并结合特定的靶位点。在本发明中，优选的将所述靶位点sgRNA表达载体、PY010质粒、双荧光素酶报告载体SSA-DKK2(核苷酸的序列如SEQ ID NO：4所示)以1:1:1 的质量比例共转染，48h后，使用试剂盒检测双荧光素酶报告基因活性，从而确定所述靶位点sgRNA表达载体是否能够特异性的识别并结合特定的靶位点。
本发明在获得靶位点sgRNA表达载体后，将所述靶位点sgRNA表达载体与所述pCMV-dCpf1-RR-eBE重组质粒共转染细胞后培养36～60h。在本发明中，所述靶位点 sgRNA表达载体与所述pCMV-dCpf1-RR-eBE重组质粒的质量比例优选为(1～5)：(1～5)；在本发明中，靶位点sgRNA表达载体与所述pCMV-dCpf1-RR-eBE重组质粒的总质量与转染细胞的个数的比例优选为0.5μg:(0.5～5)×106个，更优选为0.5μg:1×106个。在本发明中，所述转染试剂优选为DNA Fect Transfection Reagent DNA转染试剂盒(CWBIO， CatNo.CW0860)，本发明对所述转染的操作没有特殊限定，按照转染试剂盒的操作说明书进行即可。本发明中，所述培养的时间优选为40～56h，更优选为48h。在本发明中，所述细胞优选为哺乳动物细胞，在本发明的一个优选的具体实施例中，所述细胞为迪庆绵羊皮肤上皮细胞系DQSHS1，购自中国科学院昆明细胞库，编号：KCB 94026。
下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
碱基编辑器的构建
1.pCMV-dCpf1-RR-eBE重组质粒的构建
合成2814bp的dCpf1-RR-eBE表达框DNA片段(核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示)，通过Pst I酶和Apa I酶双酶切插入到pCMV-dCpf1-eBE载体中，获得 pCMV-dCpf1-RR-eBE载体。
pCMV-dCpf1-eBE载体购自addgene，货号107688。
Pst I酶购自宝生物工程(大连)有限公司，货号1624；ApaI酶购自宝生物工程(大连)有限公司，货号1604。
酶切体系：50μL，试剂购自宝生物工程(大连)有限公司)：Pst I酶1μL，Apa I 酶1μL，dCpf1-RR-eBE表达框DNA片段或pCMV-dCpf1-eBE骨架载体1μg，BufferH 5μL，补加双蒸水至50μL。酶切温度为37℃，酶切时间为3h。
连接的步骤和参数：
连接体系(10μL，连接试剂购自NEB公司，货号M0202S)：1μL T4 DNA连接酶， 1μLT4 DNA连接Buffer，4μL dCpf1-RR-eBE表达框DNA片段酶切片段，4μLp CMV-dCpf1-eBE骨架载体的酶切片段。
连接条件：4℃过夜。
转化的步骤和参数：
将5μL连接产物加入50μL感受态细胞(购自宝生物工程(大连)有限公司，货号9057)中，轻弹混匀，于冰上静置30min，42℃热激90S，于冰上静置2min，添加500μL 的LB培养基，置于37℃摇床中以200转/min的转速复苏1h，取100μL复苏菌液均匀涂抹于含有60mg/ml氨苄青霉素的固体LB培养基上，37℃静置培养14h。
挑菌：在上一步的固体LB培养板中挑取单菌落5～10个，置于1mL含60mg/mL氨苄青霉素的液体LB培养基中，在37℃摇床中以200转/min的转速培养2～3h，用于测序。测序验证正确的进行后续实验。
2.pLbCpf1-sgRNA重组质粒的构建
向导RNA通用表达载体pLbCpf1-sgRNA序列构成：
sgRNA表达载体(U6启动子):合成序列，见pX335序列中中1-249(U6启动子) +G(转录起始信号)+sgRNA上游序列+spacer克隆位点(两个反向的Bbs1位点，两个Bbs1位点之间插入随机序列)+U6终止子344-349+"bGHpolyA5457-5688
U6启动子序列：
gagggcctat ttcccatgat tccttcatat ttgcatatac gatacaaggc tgttagagagataattggaa ttaatttgac tgtaaacaca aagatattag tacaaaatac gtgacgtaga aagtaataatttcttgggta gtttgcagttttaaaattat gttttaaaat ggactatcat atgcttaccg taacttgaaagtatttcgat ttcttggctt tatatatctt gtggaaagga cgaaacacc(SEQ ID NO：5)
转录起始信号：G
sgRNA上游序列：taatttctactaagtgtagat(SEQ ID NO：6)
spacer克隆位点：gggtcttcg(SEQ ID NO：7)
随机序列：
ggcgagctgcacgctgccgtcctcgatgttgtggcggatcttgaagttcaccttgatgccgttcttctgcttgtcggccatgatatag acgttgtggctgttgtagttgtactccagcttgtgccccaggatgttgccgtcctccttgaagtcgatgcccttcagctcgatgcggttcacc agggtgtcgccctcgaacttcacctcggcgcgggtcttgtagttgccgtcgtccttgaagaagatggtgcgctcctggacgtagccttcgg gcatggcggacttgaagaagtcgtgctgcttcatgtggtcggggtagcggctgaagca(SEQ ID NO：8)
spacer克隆位点：agaagacctgc(SEQ ID NO：9)
U6终止子：tttttt(SEQ ID NO：10)
5457-5688("bGHpolyA)：
ctagagctcgctga tcagcctcga ctgtgccttc tagttgccag ccatctgttgtttgcccctcccccgtgcct tccttgaccc tggaaggtgc cactcccact gtcctttcctaataaaatgaggaaattgca tcgcattgtc tgagtaggtg tcattctatt ctggggggtggggtggggcaggacagcaag ggggaggatt gggaagagaatagcaggcat gctgggga(SEQ ID NO： 11)
在此基础上进行适当调整获得859bp的sgRNA通用框整理后序列如SEQ ID NO：2所示。
将上述859bp序列交由生工生物工程(上海)股份有限公司合成并克隆到pUC57载体上(克隆位置为EcoRV酶切位点，432-433bp之间)，获得pLbCpf1-sgRNA重组质粒。
pLbCpf1-sgRNA载体全序列长3569bp，核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示。
实施例2
碱基编辑器在在哺乳动物细胞系基因编辑中的应用
迪庆绵羊皮肤上皮细胞系DQSHS1，购自中国科学院昆明细胞库，编号：KCB 94026。
1、sgRNA靶点设计
在绵羊6号染色体(NCBI GI:417531944)的序列中提取绵羊DKK2基因包含第一外显子的序列(DKK2-440，如下所示)，设计Cpf1sgRNA靶标。
agactgagttcacacggtgctgggcccccaaagccaagtggggttgggggaacagagtctgcgagtcccggcgccccgagt gcagggccccgtgttggggtcctccttcccatttgtatccgtatccttgcgggctttgcgcctccccgggggacccctcgccgggagatg gccgcactgatgcggggcaaggactcctcccgctgcctgctcctactggccgcggtgctgatggtggagagctcacagttcggcagct cgcgggccaaactcaactccatcaagtcctctctgggcggggagacgcctgcccaggccgccaatcgatctgcgggcacttaccaag gactggctttcggcggcagtaagaagggcaaaaacctggggcaggtaggaaaatacccccaatacactcttcaaccagaagaggtag ggacccg(SEQID NO：12)
靶标位点TF3：atccgt(SEQ ID NO：13)
2、sgRNA表达质粒对的构建
首先根据设计的靶位点序列送公司合成单链寡核苷酸，具体序列如下：
RRF3F:agat catttgtatccgtatccttgcggg(111-134)(SEQ ID NO：14)
RRF3R:aagc cccgcaaggatacggatacaaatg(SEQ ID NO：15)
RRF3F与RRF3R退火(95℃5min，72℃10min，置冰上)获得带粘性末端的双链DNA 短片段，经BbsⅠ酶切，连入pLbCpf1-sgRNA载体中(pLbCpf1-sgRNA同时使用BbsⅠ酶切，回收酶切片段与双链DNA短片段连接)，获得TF3靶标序列sgRNA的表达载体 pLbCpf1-TF3。
用寡核苷酸的正向单链RRF3F与反向引物X2sgRNA-R配对，检测相应载体，获得120bp的PCR产物者判为阳性，用于后续测序，测序结果与RRF3F序列分别比对，阳性率为100％者确定为正确质粒。
反向引物用X2sgRNA-R:5'cagtgggagtggcacctt 3'(兼做测序引物)(SEQ ID NO：16)
将pLbCpf1-TF3与pCMV-dCpf1-RR-eBE载体按照1:1的质量比例转染迪庆绵羊皮肤上皮细胞系DQSHS1作为实验组，每组三个处理，每个处理的转染质粒总量为0.5μg，转细胞数为1×106个，转染试剂均为DNA Fect Transfection ReagentDNA转染试剂 (CWBIO，CatNo.CW0860)，每个处理中转染试剂的加入量为6μL，并按照说明书进行操作。对照组使用pLbCpf1-sgRNA空质粒与pCMV-dCpf1-RR-eBE重组质粒进行共转染(转染比例和总量同实验组)。
培养48h后，提取细胞基因组DNA，使用引物对DKK2-F、DKK2-R进行PCR扩增，对获得的440bp的PCR产物进行克隆测序。
DKK2-F：agactgagttcacacggtgc(SEQ ID NO：17)
DKK2-R：cgggtccctacctcttctgg(SEQ ID NO：18)
共挑取10个单克隆菌落测序，其中有3个单克隆的测序结果相对于原序列(即DKK2-440序列)而言在靶位点发生了C-T突变，突变后序列见DKK2-TF3，而且非靶位点均没有发生突变，碱基编辑效率为30％，此结果表明本发明构建的碱基编辑器可有效修饰哺乳动物的基因组DNA序列，是高效的染色体碱基编辑器。
DKK2-TF3的序列如下： agactgagttcacacggtgctgggcccccaaagccaagtggggttgggggaacagagtctgcgagtcccggcgccccgagtgcagg gccccgtgttggggtcctccttcccatttgtatttgtatccttgcgggctttgcgcctccccgggggacccctcgccgggagatggccgca ctgatgcggggcaaggactcctcccgctgcctgctcctactggccgcggtgctgatggtggagagctcacagttcggcagctcgcggg ccaaactcaactccatcaagtcctctctgggcggggagacgcctgcccaggccgccaatcgatctgcgggcacttaccaaggactggc tttcggcggcagtaagaagggcaaaaacctggggcaggtaggaaaatacccccaatacactcttcaaccagaagaggtagggacccg (SEQ ID NO：19)
实施例3
碱基编辑器在在哺乳动物细胞系基因编辑中的应用
1、sgRNA靶点设计
在绵羊6号染色体(NCBI GI:417531944)的序列中提取绵羊DKK2基因包含第一外显子的序列(DKK2-440，如下所示)，设计Cpf1sgRNA靶标。
agactgagttcacacggtgctgggcccccaaagccaagtggggttgggggaacagagtctgcgagtcccggcgccccgagt gcagggccccgtgttggggtcctccttcccatttgtatccgtatccttgcgggctttgcgcctccccgggggacccctcgccgggagatg gccgcactgatgcggggcaaggactcctcccgctgcctgctcctactggccgcggtgctgatggtggagagctcacagttcggcagct cgcgggccaaactcaactccatcaagtcctctctgggcggggagacgcctgcccaggccgccaatcgatctgcgggcacttaccaag gactggctttcggcggcagtaagaagggcaaaaacctggggcaggtaggaaaatacccccaatacactcttcaaccagaagaggtag ggacccg(SEQID NO：12)
靶标位点TF7：gcgggc(SEQ ID NO：20)
2、sgRNA表达质粒对的构建
首先根据设计的靶位点序列送公司合成单链寡核苷酸，具体序列如下：
RRF7F:agat gcagctcgcgggccaaactcaact(254-277)SEQ ID NO：21)
RRF7R:aagc agttgagtttggcccgcgagctgc(SEQ ID NO：22)
RRF7F与RRF7R退火(95℃5min，72℃10min，置冰上)获得带粘性末端的双链DNA 短片段，经BbsⅠ酶切，连入pLbCpf1-sgRNA载体中(pLbCpf1-sgRNA同时使用BbsⅠ酶切，回收酶切片段与双链DNA短片段连接)，获得TF7靶标序列sgRNA的表达载体 pLbCpf1-TF7。
用寡核苷酸的正向单链RRF7F与反向引物X2sgRNA-R配对，检测相应载体，获得120bp的PCR产物者判为阳性，用于后续测序，测序结果与RRF7F序列分别比对，阳性率为100％者确定为正确质粒。
反向引物用X2sgRNA-R:5'CAGTGGGAGTGGCACCTT 3'(兼做测序引物)(SEQ ID NO：16)
将pLbCpf1-TF7与pCMV-dCpf1-RR-eBE载体按照1:1的质量比例转染迪庆绵羊皮肤上皮细胞系DQSHS1作为实验组，每组三个处理，每个处理的转染质粒总量为0.5μg，转细胞数为1×106个，转染试剂均为DNA Fect Transfection ReagentDNA转染试剂 (CWBIO，CatNo.CW0860)，每个处理中转染试剂的加入量为6μL，并按照说明书进行操作。对照组使用pLbCpf1-sgRNA空质粒与pCMV-dCpf1-RR-eBE重组质粒进行共转染(转染比例和总量同实验组)。
培养48h后，提取细胞基因组DNA，使用引物对DKK2-F、DKK2-R进行PCR扩增，对获得的440bp的PCR产物进行克隆测序。
DKK2-F：agactgagttcacacggtgc(SEQ ID NO：17)
DKK2-R：cgggtccctacctcttctgg(SEQ ID NO：18)
共挑取10个单克隆菌落测序，其中有3个单克隆的测序结果相对于原序列(即DKK2-440序列)而言在靶位点发生了C-T突变，突变后序列见DKK2-TF7，而且非靶位点均没有发生突变，碱基编辑效率为30％，此结果表明本发明构建的碱基编辑器可有效修饰哺乳动物的基因组DNA序列，是高效的染色体碱基编辑器。
DKK2-TF7的序列如下： agactgagttcacacggtgctgggcccccaaagccaagtggggttgggggaacagagtctgcgagtcccggcgccccgagtgcagg gccccgtgttggggtcctccttcccatttgtatccgtatccttgcgggctttgcgcctccccgggggacccctcgccgggagatggccgc actgatgcggggcaaggactcctcccgctgcctgctcctactggccgcggtgctgatggtggagagctcacagttcggcagctcgtgggtcaaactcaactccatcaagtcctctctgggcggggagacgcctgcccaggccgccaatcgatctgcgggcacttaccaaggactgg ctttcggcggcagtaagaagggcaaaaacctggggcaggtaggaaaatacccccaatacactcttcaaccagaagaggtagggaccc g(SEQ ID NO：23)
实施例4
碱基编辑器在在哺乳动物细胞系基因编辑中的应用
1、sgRNA靶点设计
在绵羊6号染色体(NCBI GI:417531944)的序列中提取绵羊DKK2基因包含第一外显子的序列(DKK2-440，如下所示)，设计Cpf1sgRNA靶标。
agactgagttcacacggtgctgggcccccaaagccaagtggggttgggggaacagagtctgcgagtcccggcgccccgagt gcagggccccgtgttggggtcctccttcccatttgtatccgtatccttgcgggctttgcgcctccccgggggacccctcgccgggagatg gccgcactgatgcggggcaaggactcctcccgctgcctgctcctactggccgcggtgctgatggtggagagctcacagttcggcagct cgcgggccaaactcaactccatcaagtcctctctgggcggggagacgcctgcccaggccgccaatcgatctgcgggcacttaccaag gactggctttcggcggcagtaagaagggcaaaaacctggggcaggtaggaaaatacccccaatacactcttcaaccagaagaggtag ggacccg(SEQID NO：12)
靶标位点TR1：caagtg(SEQ ID NO：24)(此靶标为反向靶标)
2、sgRNA表达质粒对的构建
首先根据设计的靶位点序列送公司合成单链寡核苷酸，具体序列如下：
RRR1F:agat ccaaccccacttggctttgggggc(SEQ ID NO：25)
RRR1R:aagc gcccccaaagccaagtggggttgg(24-47)(SEQ ID NO：26)
RRR1F与RRR1R退火(95℃5min，72℃10min，置冰上)获得带粘性末端的双链DNA 短片段，经BbsⅠ酶切，连入pLbCpf1-sgRNA载体中(pLbCpf1-sgRNA同时使用BbsⅠ酶切，回收酶切片段与双链DNA短片段连接)，获得TF7靶标序列sgRNA的表达载体 pLbCpf1-TR1。
用寡核苷酸的正向单链RRR1F与反向引物X2sgRNA-R配对，检测相应载体，获得120bp的PCR产物者判为阳性，用于后续测序，测序结果与RRR1F序列分别比对，阳性率为100％者确定为正确质粒。
反向引物用X2sgRNA-R:5'CAGTGGGAGTGGCACCTT 3'(兼做测序引物)(SEQ ID NO：16)
将pLbCpf1-TR1与pCMV-dCpf1-RR-eBE载体按照1-5:1-5的比例转染迪庆绵羊皮肤上皮细胞系DQSHS1作为实验组，每组三个处理，每个处理的转染质粒总量为0.5μg，转细胞数为1×106个，转染试剂均为DNA Fect Transfection ReagentDNA转染试剂 (CWBIO，CatNo.CW0860)，每个处理中转染试剂的加入量为6μL，并按照说明书进行操作。对照组使用pLbCpf1-sgRNA空质粒与pCMV-dCpf1-RR-eBE重组质粒进行共转染(转染比例和总量同实验组)。
培养48h后，提取细胞基因组DNA，使用引物对DKK2-F、DKK2-R进行PCR扩增，对获得的440bp的PCR产物进行克隆测序。
DKK2-F：agactgagttcacacggtgc(SEQ ID NO：17)
DKK2-R：cgggtccctacctcttctgg(SEQ ID NO：18)
共挑取10个单克隆菌落测序，其中有2个单克隆的测序结果相对于原序列(即DKK2-440序列)而言在靶位点发生了C-T突变，突变后序列见DKK2-TF7，而且非靶位点均没有发生突变，碱基编辑效率为20％，此结果表明本发明构建的碱基编辑器可有效修饰哺乳动物的基因组DNA序列，是高效的染色体碱基编辑器。
DKK2-TR1的序列如下： agactgagttcacacggtgctgggcccccaaagccaaatagggttgggggaacagagtctgcgagtcccggcgccccgagtgcagg gccccgtgttggggtcctccttcccatttgtatccgtatccttgcgggctttgcgcctccccgggggacccctcgccgggagatggccgc actgatgcggggcaaggactcctcccgctgcctgctcctactggccgcggtgctgatggtggagagctcacagttcggcagctcgcgg gccaaactcaactccatcaagtcctctctgggcggggagacgcctgcccaggccgccaatcgatctgcgggcacttaccaaggactgg ctttcggcggcagtaagaagggcaaaaacctggggcaggtaggaaaatacccccaatacactcttcaaccagaagaggtagggaccc g(SEQ ID NO：27)
实施例5
针对绵羊DKK2基因第一外显子区域(序列如下)设计三个Cpf1sgRNA靶标，T1、 T2、T3。
绵羊DKK2第一外显子440bp序列:(斜体为第一外显子编码区的起始点和结束点；下划线部分为3个靶标序列，第三个靶标序列相对于本序列是反向的)
agactgagttcacacggtgctgggcccccaaagccaagtggggttgggggaacagagtctgcgagtcccggcgccccgagtgcagg gcccc gtgttggggtcctccttcccatttgtatccgtatccttgcgggctttgcgcctccccggg
ggacccctcgccgggagatggccgcactgatgcggggcaaggactcctcccgctgcctgctcctactggccgcggtgctgatggtgg agagctcacagttcggcagctcgcgggccaaactcaactccatcaagtcctctctgggcggggagacgcctgcccaggccgccaatc gatctgcgggcacttaccaaggactggctttcggcggcagtaag aagggcaaaaacctggggcagg taggaaaatacccccaatacactcttcaaccagaagaggtagggacccg(SEQID NO：12)
合成6条寡核苷酸如下:
T1F:agattatccgtatccttgcgggctttg(117-139)(SEQ ID NO：28)
T1R:aagccaaagcccgcaaggatacggata(SEQ ID NO：29)
T2F:agatggcggcagtaagaagggcaaaaa(358-380)(SEQ ID NO：30)
T2R:aagctttttgcccttcttactgccgcc(SEQ ID NO：31)
T3F:agatgcccgcgagctgccgaactgtga(SEQ ID NO：32)
T3R:aagctcacagttcggcagctcgcgggc(244-266)(SEQ ID NO：33)
T1-F与T1-R、T2-F与T2-R、T3-F与T3-R两两退火(95℃5min，72℃10min，置冰上)，获得三条双链DNA寡核苷酸(T1、T2、T3)，同时使用BbsⅠ内切酶切割pLb Cpf1-sgRNA载体并纯化，将T1、T2、T3分别与切割后的pCpf1-sgRNA载体连接并转化获得pLbCpf1-T1、pLbCpf1-T2、pLbCpf1-T3载体。
连接的步骤：
连接体系(10μL，连接试剂购自NEB公司，货号M0202S)：1μL T4 DNA连接酶，1μL T4DNA连接Buffer，4μL双链DNA寡核苷酸(T1、T2或T3)，4μL线性化的 pLbCpf1-sgRNA载体。
连接条件：4度过夜。
转化的步骤：
将5μL连接产物加入50μL感受态细胞，购自宝生物工程(大连)有限公司，货号9057中，轻弹混匀，于冰上静置30min，42℃热激90S，于冰上静置2min，添加500μL 的LB培养基，置于37℃摇床中以200转/min的转速复苏1h，取100μL复苏菌液均匀涂抹于含有60mg/mL氨苄青霉素的固体LB培养基上，37℃静置培养14h。
在所述连接和转化后，进行PCR扩增和测序鉴定。
PCR检测步骤和参数：
挑菌：在上一步的固体LB培养板中挑取单菌落5～10个，置于1mL含60mg/mL氨苄青霉素的液体LB培养基中，在37℃摇床中以200转/min的转速培养2h，用于后续PCR 检测。
PCR加样体系(25μL)：22μL PCR MIX，1μL菌液(上一步挑菌培养所得)，1μL 正向引物(T1F、T2F或T3F)，1μL反向引物X2sgRNA-R。
PCR扩增程序：95℃3min，之后循环30次(程序为95℃，30S；60℃，30S；72℃， 30S)，最后72℃延伸5min。
PCR结果判断：获得120bpPCR产物则判为阳性，用于后续测序。
测序条件及结果判断：用反向引物X2sgRNA-R作为测序引物，测序结果与相应靶标的正向寡核苷酸T1F、T2F或T3F进行对比，同源性100％判定为正确质粒。
双荧光素酶报告基因活性检测
使用pLbCpf1-T1、pLbCpf1-T2、pLbCpf1-T3载体分别与pY010质粒(购自Addgene，货号69982)、双荧光素酶报告载体SSA-DKK2以1:1:1的比例共转染，48h后使用试剂盒检测双荧光素酶报告基因活性(结果如表1)。结果说明，pLbCpf1-T1、pLbCpf1-T2、 pLbCpf1-T3载体表达的sgRNA确实具有识别并结合特定DNA靶标的活性，即证明 pLbCpf1-sgRNA通用表达载体是有效的。
表1双荧光素酶报告基因活性检测
由上述实施例可知，本发明所述碱基编辑器能够特异性的将靶位点的胞嘧啶C突变为胸腺嘧啶T，而对非靶位点的碱基没有任何影响，基因编辑效率在20％～30％之间，可有效修饰哺乳动物的基因组DNA序列，是高效的基因碱基编辑器。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 青岛农业大学
<120> 一种碱基编辑器及其制备方法和应用
<160> 33
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 2814
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ctgcaggagt acgccgacgc tgacctgtca gtcgtggaga aactcaagga gatcataatc 60
cagaaggtgg atgaaatcta caaagtgtat ggaagctctg agaaactctt cgatgcagac 120
tttgttctgg agaagagtct gaagaagaac gacgcagtgg ttgctatcat gaaggacctg 180
ctggattctg ttaagtcttt cgagaattac attaaggcat tctttggtga agggaaggag 240
acaaataggg acgagagctt ctatggcgac tttgttctgg cctacgacat cctcctcaag 300
gttgaccaca tctatgacgc tatacggaat tacgttaccc agaagcccta tagcaaagac 360
aagttcaagc tgtatttcca gaatccacag tttatgcgcg ggtgggataa agacaaagaa 420
acagattaca gggccactat cctgcggtac ggcagcaaat actatctggc tatcatggat 480
aagaagtacg ccaaatgcct ccagaagatc gacaaggacg acgtgaacgg taactacgag 540
aagatcaatt acaagctcct gccaggacct aacaagatgc tgccccgggt gttcttctcc 600
aagaaatgga tggcctacta taacccaagc gaggacattc agaagatata caagaatggg 660
acattcaaga agggcgatat gttcaacctc aacgactgcc acaagctgat tgatttcttc 720
aaggatagca tttctcgcta tcccaagtgg tctaatgcat acgatttcaa cttcagcgag 780
actgagaagt acaaagacat cgctggcttc taccgggagg tggaagagca aggctataag 840
gtgtcattcg aatccgcttc taagaaggaa gtggataagc tcgtggaaga gggtaagctg 900
tacatgttcc agatatacaa caaagacttc agcgataaga gccacggcac tccaaacctc 960
catactatgt atttcaagct gctgtttgac gagaacaacc acggacagat taggctgtca 1020
ggaggcgcag aactcttcat gcgcagagct tcactgaaga aggaggaact cgttgtccac 1080
ccagccaata gccctatagc caataagaat ccagacaatc ctaagaaaac cactactctg 1140
tcttacgatg tgtataagga taagagattc tctgaagatc agtacgaact gcacataccc 1200
attgccatta acaagtgccc taagaacatc ttcaagatta acacagaggt tagagtgctc 1260
ctgaaacacg acgataaccc ttatgttata ggcattgctc gcggagagag aaacctgctg 1320
tacatcgtcg tggtggacgg caaaggcaac atcgtggaac agtacagtct caatgaaatc 1380
attaacaatt tcaacggaat ccgcattaag accgactacc attctctcct cgacaagaag 1440
gagaaagaaa ggttcgaagc aagacagaat tggacaagta tagagaatat caaagaactg 1500
aaggctgggt acatctctca ggttgtgcac aagatatgtg agctggtgga gaagtacgac 1560
gctgttatcg ccctcgcgga cctgaatagc ggcttcaaga actccagggt gaaggtggag 1620
aagcaggtgt atcagaagtt cgagaagatg ctgatcgaca agctcaacta tatggtggac 1680
aagaaatcca atccttgcgc tactggtgga gccctgaagg gctatcaaat caccaataag 1740
ttcgaatctt tcaagtctat gagcacccag aatggcttca tcttctacat acccgcatgg 1800
ctgacatcca agattgatcc ctctaccgga tttgttaatc tgctcaagac taagtacacc 1860
tctattgctg actcaaagaa gttcatatca tcatttgacc gcatcatgta cgtgccagaa 1920
gaggacctgt tcgagtttgc cctggattac aagaatttct ctcggactga cgccgactac 1980
atcaagaagt ggaagctcta ctcttatggt aatcggattc gcatattccg caatcccaag 2040
aagaataacg tgttcgattg ggaggaagtt tgcctcacca gcgcttacaa ggagctgttc 2100
aataagtatg ggattaacta ccagcagggc gacataagag ccctgctgtg cgaacaatct 2160
gataaggcat tctattcctc tttcatggca ctgatgtcac tgatgctgca aatgcgcaat 2220
tccatcaccg gaagaacaga cgtggccttt ctgatctctc ctgtcaagaa ctcagatggc 2280
atcttctacg attcccgcaa ctatgaagca caggagaatg ctatcctgcc taagaatgcc 2340
gatgcaaatg gagcctataa catcgccaga aaggtcctct gggccatagg acaattcaag 2400
aaagctgaag atgagaagct ggacaaggtg aagatcgcca tttcaaacaa agagtggctc 2460
gaatatgctc agacctcagt gaagcatgga tcacccaaga agaaacggaa agtgtctggt 2520
ggttctacta atctgtcaga tattattgaa aaggagaccg gtaagcaact ggttatccag 2580
gaatccatcc tcatgctccc agaggaggtg gaagaagtca ttgggaacaa gccggaaagc 2640
gatatactcg tgcacaccgc ctacgacgag agcaccgacg agaatgtcat gcttctgact 2700
agcgacgccc ctgaatacaa gccttgggct ctggtcatac aggatagcaa cggtgagaac 2760
aagattaaga tgctctctgg tggttctccc aagaagaaga ggaaagtcgg gccc 2814
<210> 2
<211> 859
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gagggcctat ttcccatgat tccttcatat ttgcatatac gatacaaggc tgttagagag 60
ataattggaa ttaatttgac tgtaaacaca aagatattag tacaaaatac gtgacgtaga 120
aagtaataat ttcttgggta gtttgcagtt ttaaaattat gttttaaaat ggactatcat 180
atgcttaccg taacttgaaa gtatttcgat ttcttggctt tatatatctt gtggaaagga 240
cgaaacaccg taatttctac taagtgtaga tgggtcttcg ggcgagctgc acgctgccgt 300
cctcgatgtt gtggcggatc ttgaagttca ccttgatgcc gttcttctgc ttgtcggcca 360
tgatatagac gttgtggctg ttgtagttgt actccagctt gtgccccagg atgttgccgt 420
cctccttgaa gtcgatgccc ttcagctcga tgcggttcac cagggtgtcg ccctcgaact 480
tcacctcggc gcgggtcttg tagttgccgt cgtccttgaa gaagatggtg cgctcctgga 540
cgtagccttc gggcatggcg gacttgaaga agtcgtgctg cttcatgtgg tcggggtagc 600
ggctgaagca agaagacctg cttttttcta gagctcgctg atcagcctcg actgtgcctt 660
ctagttgcca gccatctgtt gtttgcccct cccccgtgcc ttccttgacc ctggaaggtg 720
ccactcccac tgtcctttcc taataaaatg aggaaattgc atcgcattgt ctgagtaggt 780
gtcattctat tctggggggt ggggtggggc aggacagcaa gggggaggat tgggaagaga 840
atagcaggca tgctgggga 859
<210> 3
<211> 3569
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
tcgcgcgttt cggtgatgac ggtgaaaacc tctgacacat gcagctcccg gagacggtca 60
cagcttgtct gtaagcggat gccgggagca gacaagcccg tcagggcgcg tcagcgggtg 120
ttggcgggtg tcggggctgg cttaactatg cggcatcaga gcagattgta ctgagagtgc 180
accatatgcg gtgtgaaata ccgcacagat gcgtaaggag aaaataccgc atcaggcgcc 240
attcgccatt caggctgcgc aactgttggg aagggcgatc ggtgcgggcc tcttcgctat 300
tacgccagct ggcgaaaggg ggatgtgctg caaggcgatt aagttgggta acgccagggt 360
tttcccagtc acgacgttgt aaaacgacgg ccagtgaatt cgagctcggt acctcgcgaa 420
tgcatctaga tgagggccta tttcccatga ttccttcata tttgcatata cgatacaagg 480
ctgttagaga gataattgga attaatttga ctgtaaacac aaagatatta gtacaaaata 540
cgtgacgtag aaagtaataa tttcttgggt agtttgcagt tttaaaatta tgttttaaaa 600
tggactatca tatgcttacc gtaacttgaa agtatttcga tttcttggct ttatatatct 660
tgtggaaagg acgaaacacc gtaatttcta ctaagtgtag atgggtcttc gggcgagctg 720
cacgctgccg tcctcgatgt tgtggcggat cttgaagttc accttgatgc cgttcttctg 780
cttgtcggcc atgatataga cgttgtggct gttgtagttg tactccagct tgtgccccag 840
gatgttgccg tcctccttga agtcgatgcc cttcagctcg atgcggttca ccagggtgtc 900
gccctcgaac ttcacctcgg cgcgggtctt gtagttgccg tcgtccttga agaagatggt 960
gcgctcctgg acgtagcctt cgggcatggc ggacttgaag aagtcgtgct gcttcatgtg 1020
gtcggggtag cggctgaagc aagaagacct gcttttttct agagctcgct gatcagcctc 1080
gactgtgcct tctagttgcc agccatctgt tgtttgcccc tcccccgtgc cttccttgac 1140
cctggaaggt gccactccca ctgtcctttc ctaataaaat gaggaaattg catcgcattg 1200
tctgagtagg tgtcattcta ttctgggggg tggggtgggg caggacagca agggggagga 1260
ttgggaagag aatagcaggc atgctgggga atcggatccc gggcccgtcg actgcagagg 1320
cctgcatgca agcttggcgt aatcatggtc atagctgttt cctgtgtgaa attgttatcc 1380
gctcacaatt ccacacaaca tacgagccgg aagcataaag tgtaaagcct ggggtgccta 1440
atgagtgagc taactcacat taattgcgtt gcgctcactg cccgctttcc agtcgggaaa 1500
cctgtcgtgc cagctgcatt aatgaatcgg ccaacgcgcg gggagaggcg gtttgcgtat 1560
tgggcgctct tccgcttcct cgctcactga ctcgctgcgc tcggtcgttc ggctgcggcg 1620
agcggtatca gctcactcaa aggcggtaat acggttatcc acagaatcag gggataacgc 1680
aggaaagaac atgtgagcaa aaggccagca aaaggccagg aaccgtaaaa aggccgcgtt 1740
gctggcgttt ttccataggc tccgcccccc tgacgagcat cacaaaaatc gacgctcaag 1800
tcagaggtgg cgaaacccga caggactata aagataccag gcgtttcccc ctggaagctc 1860
cctcgtgcgc tctcctgttc cgaccctgcc gcttaccgga tacctgtccg cctttctccc 1920
ttcgggaagc gtggcgcttt ctcatagctc acgctgtagg tatctcagtt cggtgtaggt 1980
cgttcgctcc aagctgggct gtgtgcacga accccccgtt cagcccgacc gctgcgcctt 2040
atccggtaac tatcgtcttg agtccaaccc ggtaagacac gacttatcgc cactggcagc 2100
agccactggt aacaggatta gcagagcgag gtatgtaggc ggtgctacag agttcttgaa 2160
gtggtggcct aactacggct acactagaag aacagtattt ggtatctgcg ctctgctgaa 2220
gccagttacc ttcggaaaaa gagttggtag ctcttgatcc ggcaaacaaa ccaccgctgg 2280
tagcggtggt ttttttgttt gcaagcagca gattacgcgc agaaaaaaag gatctcaaga 2340
agatcctttg atcttttcta cggggtctga cgctcagtgg aacgaaaact cacgttaagg 2400
gattttggtc atgagattat caaaaaggat cttcacctag atccttttaa attaaaaatg 2460
aagttttaaa tcaatctaaa gtatatatga gtaaacttgg tctgacagtt accaatgctt 2520
aatcagtgag gcacctatct cagcgatctg tctatttcgt tcatccatag ttgcctgact 2580
ccccgtcgtg tagataacta cgatacggga gggcttacca tctggcccca gtgctgcaat 2640
gataccgcga gacccacgct caccggctcc agatttatca gcaataaacc agccagccgg 2700
aagggccgag cgcagaagtg gtcctgcaac tttatccgcc tccatccagt ctattaattg 2760
ttgccgggaa gctagagtaa gtagttcgcc agttaatagt ttgcgcaacg ttgttgccat 2820
tgctacaggc atcgtggtgt cacgctcgtc gtttggtatg gcttcattca gctccggttc 2880
ccaacgatca aggcgagtta catgatcccc catgttgtgc aaaaaagcgg ttagctcctt 2940
cggtcctccg atcgttgtca gaagtaagtt ggccgcagtg ttatcactca tggttatggc 3000
agcactgcat aattctctta ctgtcatgcc atccgtaaga tgcttttctg tgactggtga 3060
gtactcaacc aagtcattct gagaatagtg tatgcggcga ccgagttgct cttgcccggc 3120
gtcaatacgg gataataccg cgccacatag cagaacttta aaagtgctca tcattggaaa 3180
acgttcttcg gggcgaaaac tctcaaggat cttaccgctg ttgagatcca gttcgatgta 3240
acccactcgt gcacccaact gatcttcagc atcttttact ttcaccagcg tttctgggtg 3300
agcaaaaaca ggaaggcaaa atgccgcaaa aaagggaata agggcgacac ggaaatgttg 3360
aatactcata ctcttccttt ttcaatatta ttgaagcatt tatcagggtt attgtctcat 3420
gagcggatac atatttgaat gtatttagaa aaataaacaa ataggggttc cgcgcacatt 3480
tccccgaaaa gtgccacctg acgtctaaga aaccattatt atcatgacat taacctataa 3540
aaataggcgt atcacgaggc cctttcgtc 3569
<210> 4
<211> 7123
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
agatctgcgc agcaccatgg cctgaaataa cctctgaaag aggaacttgg ttaggtacct 60
tctgaggcgg aaagaaccag ctgtggaatg tgtgtcagtt agggtgtgga aagtccccag 120
gctccccagc aggcagaagt atgcaaagca tgcatctcaa ttagtcagca accaggtgtg 180
gaaagtcccc aggctcccca gcaggcagaa gtatgcaaag catgcatctc aattagtcag 240
caaccatagt cccgccccta actccgccca tcccgcccct aactccgccc agttccgccc 300
attctccgcc ccatggctga ctaatttttt ttatttatgc agaggccgag gccgcctcgg 360
cctctgagct attccagaag tagtgaggag gcttttttgg aggcctaggc ttttgcaaaa 420
agcttgattc ttctgacaca acagtctcga acttaagctg cagaagttgg tcgtgaggca 480
ctgggcaggt aagtatcaag gttacaagac aggtttaagg agaccaatag aaactgggct 540
tgtcgagaca gagaagactc ttgcgtttct gataggcacc tattggtctt actgacatcc 600
actttgcctt tctctccaca ggtgtccact cccagttcaa ttacagctct taaggctaga 660
gtacttaata cgactcacta taggctagcc accatggctt ccaaggtgta cgaccccgag 720
caacgcaaac gcatgatcac tgggcctcag tggtgggctc gctgcaagca aatgaacgtg 780
ctggactcct tcatcaacta ctatgattcc gagaagcacg ccgagaacgc cgtgattttt 840
ctgcatggta acgctgcctc cagctacctg tggaggcacg tcgtgcctca catcgagccc 900
gtggctagat gcatcatccc tgatctgatc ggaatgggta agtccggcaa gagcgggaat 960
ggctcatatc gcctcctgga tcactacaag tacctcaccg cttggttcga gctgctgaac 1020
cttccaaaga aaatcatctt tgtgggccac gactgggggg cttgtctggc ctttcactac 1080
tcctacgagc accaagacaa gatcaaggcc atcgtccatg ctgagagtgt cgtggacgtg 1140
atcgagtcct gggacgagtg gcctgacatc gaggaggata tcgccctgat caagagcgaa 1200
gagggcgaga aaatggtgct tgagaataac ttcttcgtcg agaccatgct cccaagcaag 1260
atcatgcgga aactggagcc tgaggagttc gctgcctacc tggagccatt caaggagaag 1320
ggcgaggtta gacggcctac cctctcctgg cctcgcgaga tccctctcgt taagggaggc 1380
aagcccgacg tcaccggtaa aggcgcgcca gactgagttc acacggtgct gggcccccaa 1440
agccaagtgg ggttggggga acagagtctg cgagtcccgg cgccccgagt gcagggcccc 1500
gtgttggggt cctccttccc atttgtatcc gtatccttgc gggctttgcg cctccccggg 1560
ggacccctcg ccgggagatg gccgcactga tgcggggcaa ggactcctcc cgctgcctgc 1620
tcctactggc cgcggtgctg atggtggaga gctcacagtt cggcagctcg cgggccaaac 1680
tcaactccat caagtcctct ctgggcgggg agacgcctgc ccaggccgcc aatcgatctg 1740
cgggcactta ccaaggactg gctttcggcg gcagtaagaa gggcaaaaac ctggggcagg 1800
taggaaaata cccccaatac actcttcaac cagaagaggt agggacccgg tcgacaaacc 1860
tgcaggaaaa ctagtcctca ccgcttggtt cgagctgctg aaccttccaa agaaaatcat 1920
ctttgtgggc cacgactggg gggcttgtct ggcctttcac tactcctacg agcaccaaga 1980
caagatcaag gccatcgtcc atgctgagag tgtcgtggac gtgatcgagt cctgggacga 2040
gtggcctgac atcgaggagg atatcgccct gatcaagagc gaagagggcg agaaaatggt 2100
gcttgagaat aacttcttcg tcgagaccat gctcccaagc aagatcatgc ggaaactgga 2160
gcctgaggag ttcgctgcct acctggagcc attcaaggag aagggcgagg ttagacggcc 2220
taccctctcc tggcctcgcg agatccctct cgttaaggga ggcaagcccg acgtcgtcca 2280
gattgtccgc aactacaacg cctaccttcg ggccagcgac gatctgccta agatgttcat 2340
cgagtccgac cctgggttct tttccaacgc tattgtcgag ggagctaaga agttccctaa 2400
caccgagttc gtgaaggtga agggcctcca cttcagccag gaggacgctc cagatgaaat 2460
gggtaagtac atcaagagct tcgtggagcg cgtgctgaag aacgagcagt aattctaggc 2520
gatcgctcga gcccgggaat tcgtttaaac ctagagcggc cgctggccgc aataaaatat 2580
ctttattttc attacatctg tgtgttggtt ttttgtgtga ggatctaaat gagtcttcgg 2640
acctcgcggg ggccgcttaa gcggtggtta gggtttgtct gacgcggggg gagggggaag 2700
gaacgaaaca ctctcattcg gaggcggctc ggggtttggt cttggtggcc acgggcacgc 2760
agaagagcgc cgcgatcctc ttaagcaccc ccccgccctc cgtggaggcg ggggtttggt 2820
cggcgggtgg taactggcgg gccgctgact cgggcgggtc gcgcgcccca gagtgtgacc 2880
ttttcggtct gctcgcagac ccccgggcgg cgccgccgcg gcggcgacgg gctcgctggg 2940
tcctaggctc catggggacc gtatacgtgg acaggctctg gagcatccgc acgactgcgg 3000
tgatattacc ggagaccttc tgcgggacga gccgggtcac gcggctgacg cggagcgtcc 3060
gttgggcgac aaacaccagg acggggcaca ggtacactat cttgtcaccc ggaggcgcga 3120
gggactgcag gagcttcagg gagtggcgca gctgcttcat ccccgtggcc cgttgctcgc 3180
gtttgctggc ggtgtccccg gaagaaatat atttgcatgt ctttagttct atgatgacac 3240
aaaccccgcc cagcgtcttg tcattggcga attcgaacac gcagatgcag tcggggcggc 3300
gcggtcccag gtccacttcg catattaagg tgacgcgtgt ggcctcgaac accgagcgac 3360
cctgcagcga cccgcttaaa agcttggcat tccggtactg ttggtaaagc caccatggcc 3420
gatgctaaga acattaagaa gggccctgct cccttctacc ctctggagga tggcaccgct 3480
ggcgagcagc tgcacaaggc catgaagagg tatgccctgg tgcctggcac cattgccttc 3540
accgatgccc acattgaggt ggacatcacc tatgccgagt acttcgagat gtctgtgcgc 3600
ctggccgagg ccatgaagag gtacggcctg aacaccaacc accgcatcgt ggtgtgctct 3660
gagaactctc tgcagttctt catgccagtg ctgggcgccc tgttcatcgg agtggccgtg 3720
gcccctgcta acgacattta caacgagcgc gagctgctga acagcatggg catttctcag 3780
cctaccgtgg tgttcgtgtc taagaagggc ctgcagaaga tcctgaacgt gcagaagaag 3840
ctgcctatca tccagaagat catcatcatg gactctaaga ccgactacca gggcttccag 3900
agcatgtaca cattcgtgac atctcatctg cctcctggct tcaacgagta cgacttcgtg 3960
ccagagtctt tcgacaggga caaaaccatt gccctgatca tgaacagctc tgggtctacc 4020
ggcctgccta agggcgtggc cctgcctcat cgcaccgcct gtgtgcgctt ctctcacgcc 4080
cgcgacccta ttttcggcaa ccagatcatc cccgacaccg ctattctgag cgtggtgcca 4140
ttccaccacg gcttcggcat gttcaccacc ctgggctacc tgatttgcgg ctttcgggtg 4200
gtgctgatgt accgcttcga ggaggagctg ttcctgcgca gcctgcaaga ctacaaaatt 4260
cagtctgccc tgctggtgcc aaccctgttc agcttcttcg ctaagagcac cctgatcgac 4320
aagtacgacc tgtctaacct gcacgagatt gcctctggcg gcgccccact gtctaaggag 4380
gtgggcgaag ccgtggccaa gcgctttcat ctgccaggca tccgccaggg ctacggcctg 4440
accgagacaa ccagcgccat tctgattacc ccagagggcg acgacaagcc tggcgccgtg 4500
ggcaaggtgg tgccattctt cgaggccaag gtggtggacc tggacaccgg caagaccctg 4560
ggagtgaacc agcgcggcga gctgtgtgtg cgcggcccta tgattatgtc cggctacgtg 4620
aataaccctg aggccacaaa cgccctgatc gacaaggacg gctggctgca ctctggcgac 4680
attgcctact gggacgagga cgagcacttc ttcatcgtgg accgcctgaa gtctctgatc 4740
aagtacaagg gctaccaggt ggccccagcc gagctggagt ctatcctgct gcagcaccct 4800
aacattttcg acgccggagt ggccggcctg cccgacgacg atgccggcga gctgcctgcc 4860
gccgtcgtcg tgctggaaca cggcaagacc atgaccgaga aggagatcgt ggactatgtg 4920
gccagccagg tgacaaccgc caagaagctg cgcggcggag tggtgttcgt ggacgaggtg 4980
cccaagggcc tgaccggcaa gctggacgcc cgcaagatcc gcgagatcct gatcaaggct 5040
aagaaaggcg gcaagatcgc cgtgtaataa ttctagagtc ggggcggccg gccgcttcga 5100
gcagacatga taagatacat tgatgagttt ggacaaacca caactagaat gcagtgaaaa 5160
aaatgcttta tttgtgaaat ttgtgatgct attgctttat ttgtaaccat tataagctgc 5220
aataaacaag ttaacaacaa caattgcatt cattttatgt ttcaggttca gggggaggtg 5280
tgggaggttt tttaaagcaa gtaaaacctc tacaaatgtg gtaaaatcga taaggatcca 5340
ggtggcactt ttcggggaaa tgtgcgcgga acccctattt gtttattttt ctaaatacat 5400
tcaaatatgt atccgctcat gagacaataa ccctgataaa tgcttcaata atattgaaaa 5460
aggaagagta tgagtattca acatttccgt gtcgccctta ttcccttttt tgcggcattt 5520
tgccttcctg tttttgctca cccagaaacg ctggtgaaag taaaagatgc tgaagatcag 5580
ttgggtgcac gagtgggtta catcgaactg gatctcaaca gcggtaagat ccttgagagt 5640
tttcgccccg aagaacgttt tccaatgatg agcactttta aagttctgct atgtggcgcg 5700
gtattatccc gtattgacgc cgggcaagag caactcggtc gccgcataca ctattctcag 5760
aatgacttgg ttgagtactc accagtcaca gaaaagcatc ttacggatgg catgacagta 5820
agagaattat gcagtgctgc cataaccatg agtgataaca ctgcggccaa cttacttctg 5880
acaacgatcg gaggaccgaa ggagctaacc gcttttttgc acaacatggg ggatcatgta 5940
actcgccttg atcgttggga accggagctg aatgaagcca taccaaacga cgagcgtgac 6000
accacgatgc ctgtagcaat ggcaacaacg ttgcgcaaac tattaactgg cgaactactt 6060
actctagctt cccggcaaca attaatagac tggatggagg cggataaagt tgcaggacca 6120
cttctgcgct cggcccttcc ggctggctgg tttattgctg ataaatctgg agccggtgag 6180
cgtgggtctc gcggtatcat tgcagcactg gggccagatg gtaagccctc ccgtatcgta 6240
gttatctaca cgacggggag tcaggcaact atggatgaac gaaatagaca gatcgctgag 6300
ataggtgcct cactgattaa gcattggtaa ctgtcagacc aagtttactc atatatactt 6360
tagattgatt taaaacttca tttttaattt aaaaggatct aggtgaagat cctttttgat 6420
aatctcatga ccaaaatccc ttaacgtgag ttttcgttcc actgagcgtc agaccccgta 6480
gaaaagatca aaggatcttc ttgagatcct ttttttctgc gcgtaatctg ctgcttgcaa 6540
acaaaaaaac caccgctacc agcggtggtt tgtttgccgg atcaagagct accaactctt 6600
tttccgaagg taactggctt cagcagagcg cagataccaa atactgttct tctagtgtag 6660
ccgtagttag gccaccactt caagaactct gtagcaccgc ctacatacct cgctctgcta 6720
atcctgttac cagtggctgc tgccagtggc gataagtcgt gtcttaccgg gttggactca 6780
agacgatagt taccggataa ggcgcagcgg tcgggctgaa cggggggttc gtgcacacag 6840
cccagcttgg agcgaacgac ctacaccgaa ctgagatacc tacagcgtga gctatgagaa 6900
agcgccacgc ttcccgaagg gagaaaggcg gacaggtatc cggtaagcgg cagggtcgga 6960
acaggagagc gcacgaggga gcttccaggg ggaaacgcct ggtatcttta tagtcctgtc 7020
gggtttcgcc acctctgact tgagcgtcga tttttgtgat gctcgtcagg ggggcggagc 7080
ctatggaaaa acgccagcaa cgcggccttt ttacggttcc tgg 7123
<210> 5
<211> 249
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
gagggcctat ttcccatgat tccttcatat ttgcatatac gatacaaggc tgttagagag 60
ataattggaa ttaatttgac tgtaaacaca aagatattag tacaaaatac gtgacgtaga 120
aagtaataat ttcttgggta gtttgcagtt ttaaaattat gttttaaaat ggactatcat 180
atgcttaccg taacttgaaa gtatttcgat ttcttggctt tatatatctt gtggaaagga 240
cgaaacacc 249
<210> 6
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
taatttctac taagtgtaga t 21
<210> 7
<211> 9
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
gggtcttcg 9
<210> 8
<211> 330
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
ggcgagctgc acgctgccgt cctcgatgtt gtggcggatc ttgaagttca ccttgatgcc 60
gttcttctgc ttgtcggcca tgatatagac gttgtggctg ttgtagttgt actccagctt 120
gtgccccagg atgttgccgt cctccttgaa gtcgatgccc ttcagctcga tgcggttcac 180
cagggtgtcg ccctcgaact tcacctcggc gcgggtcttg tagttgccgt cgtccttgaa 240
gaagatggtg cgctcctgga cgtagccttc gggcatggcg gacttgaaga agtcgtgctg 300
cttcatgtgg tcggggtagc ggctgaagca 330
<210> 9
<211> 11
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
agaagacctg c 11
<210> 10
<211> 6
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
tttttt 6
<210> 11
<211> 232
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
ctagagctcg ctgatcagcc tcgactgtgc cttctagttg ccagccatct gttgtttgcc 60
cctcccccgt gccttccttg accctggaag gtgccactcc cactgtcctt tcctaataaa 120
atgaggaaat tgcatcgcat tgtctgagta ggtgtcattc tattctgggg ggtggggtgg 180
ggcaggacag caagggggag gattgggaag agaatagcag gcatgctggg ga 232
<210> 12
<211> 440
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
agactgagtt cacacggtgc tgggccccca aagccaagtg gggttggggg aacagagtct 60
gcgagtcccg gcgccccgag tgcagggccc cgtgttgggg tcctccttcc catttgtatc 120
cgtatccttg cgggctttgc gcctccccgg gggacccctc gccgggagat ggccgcactg 180
atgcggggca aggactcctc ccgctgcctg ctcctactgg ccgcggtgct gatggtggag 240
agctcacagt tcggcagctc gcgggccaaa ctcaactcca tcaagtcctc tctgggcggg 300
gagacgcctg cccaggccgc caatcgatct gcgggcactt accaaggact ggctttcggc 360
ggcagtaaga agggcaaaaa cctggggcag gtaggaaaat acccccaata cactcttcaa 420
ccagaagagg tagggacccg 440
<210> 13
<211> 6
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
atccgt 6
<210> 14
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
agatcatttg tatccgtatc cttgcggg 28
<210> 15
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
aagccccgca aggatacgga tacaaatg 28
<210> 16
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
cagtgggagt ggcacctt 18
<210> 17
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
agactgagtt cacacggtgc 20
<210> 18
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
cgggtcccta cctcttctgg 20
<210> 19
<211> 440
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
agactgagtt cacacggtgc tgggccccca aagccaagtg gggttggggg aacagagtct 60
gcgagtcccg gcgccccgag tgcagggccc cgtgttgggg tcctccttcc catttgtatt 120
tgtatccttg cgggctttgc gcctccccgg gggacccctc gccgggagat ggccgcactg 180
atgcggggca aggactcctc ccgctgcctg ctcctactgg ccgcggtgct gatggtggag 240
agctcacagt tcggcagctc gcgggccaaa ctcaactcca tcaagtcctc tctgggcggg 300
gagacgcctg cccaggccgc caatcgatct gcgggcactt accaaggact ggctttcggc 360
ggcagtaaga agggcaaaaa cctggggcag gtaggaaaat acccccaata cactcttcaa 420
ccagaagagg tagggacccg 440
<210> 20
<211> 6
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
gcgggc 6
<210> 21
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
agatgcagct cgcgggccaa actcaact 28
<210> 22
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
aagcagttga gtttggcccg cgagctgc 28
<210> 23
<211> 440
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
agactgagtt cacacggtgc tgggccccca aagccaagtg gggttggggg aacagagtct 60
gcgagtcccg gcgccccgag tgcagggccc cgtgttgggg tcctccttcc catttgtatc 120
cgtatccttg cgggctttgc gcctccccgg gggacccctc gccgggagat ggccgcactg 180
atgcggggca aggactcctc ccgctgcctg ctcctactgg ccgcggtgct gatggtggag 240
agctcacagt tcggcagctc gtgggtcaaa ctcaactcca tcaagtcctc tctgggcggg 300
gagacgcctg cccaggccgc caatcgatct gcgggcactt accaaggact ggctttcggc 360
ggcagtaaga agggcaaaaa cctggggcag gtaggaaaat acccccaata cactcttcaa 420
ccagaagagg tagggacccg 440
<210> 24
<211> 6
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
caagtg 6
<210> 25
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 25
agatccaacc ccacttggct ttgggggc 28
<210> 26
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 26
aagcgccccc aaagccaagt ggggttgg 28
<210> 27
<211> 440
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 27
agactgagtt cacacggtgc tgggccccca aagccaaata gggttggggg aacagagtct 60
gcgagtcccg gcgccccgag tgcagggccc cgtgttgggg tcctccttcc catttgtatc 120
cgtatccttg cgggctttgc gcctccccgg gggacccctc gccgggagat ggccgcactg 180
atgcggggca aggactcctc ccgctgcctg ctcctactgg ccgcggtgct gatggtggag 240
agctcacagt tcggcagctc gcgggccaaa ctcaactcca tcaagtcctc tctgggcggg 300
gagacgcctg cccaggccgc caatcgatct gcgggcactt accaaggact ggctttcggc 360
ggcagtaaga agggcaaaaa cctggggcag gtaggaaaat acccccaata cactcttcaa 420
ccagaagagg tagggacccg 440
<210> 28
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 28
agattatccg tatccttgcg ggctttg 27
<210> 29
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 29
aagccaaagc ccgcaaggat acggata 27
<210> 30
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 30
agatggcggc agtaagaagg gcaaaaa 27
<210> 31
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 31
aagctttttg cccttcttac tgccgcc 27
<210> 32
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 32
agatgcccgc gagctgccga actgtga 27
<210> 33
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 33
aagctcacag ttcggcagct cgcgggc 27
Claims (10)
1.一种碱基编辑器，其特征在于，包括pCMV-dCpf1-RR-eBE重组质粒和pLbCpf1-sgRNA重组质粒；
所述pCMV-dCpf1-RR-eBE重组质粒包括载体骨架pCMV-dCpf1-eBE和dCpf1-RR-eBE表达框DNA片段；
所述pLbCpf1-sgRNA重组质粒包括载体骨架pUC57和sgRNA通用表达框的DNA片段。
2.根据权利要求1所述的碱基编辑器，其特征在于，所述dCpf1-RR-eBE表达框DNA片段的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。
3.根据权利要求1或2所述的碱基编辑器，其特征在于，sgRNA通用表达框DNA片段的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。
4.根据权利要求1所述的碱基编辑器，其特征在于，所述pLbCpf1-sgRNA重组质粒的核苷酸序列如SEQ ED NO：3所示。
5.权利要求1～4任意一项所述的碱基编辑器的制备方法，包括以下步骤：
将dCpf1-RR-eBE表达框DNA片段插入到载体骨架pCMV-dCpf1-eBE中构建获得pCMV-dCpf1-RR-eBE重组质粒；
将sgRNA通用表达框DNA片段插入到载体骨架pUC57中获得pLbCpf1-sgRNA重组质粒。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述dCpf1-RR-eBE表达框DNA片段的插入位点为载体骨架pCMV-dCpf1-eBE的Pst I酶切位点和Apa I酶切位点之间；所述sgRNA通用表达框DNA片段的插入位点为载体骨架pUC57的EcoRV酶切位点。
7.权利要求1～4任意一项所述的碱基编辑器在基因编辑中的应用，包括以下步骤：
1)确定待编辑基因的靶位点，并根据所述靶位点设计所述靶位点的单链寡核苷酸对；
2)将所述单链寡核苷酸对退火获得双链DNA片段；
3)将所述双链DNA片段连接到pLbCpf1-sgRNA重组质粒中获得靶位点sgRNA表达载体；
4)将所述靶位点sgRNA表达载体与所述pCMV-dCpf1-RR-eBE重组质粒共转染细胞后培养36～60h。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，步骤4)中靶位点sgRNA表达载体与所述pCMV-dCpf1-RR-eBE重组质粒的总质量与转染细胞的个数的比例为0.5μg:(0.5～5)×106个。
9.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述靶位点sgRNA表达载体与所述pCMV-dCpf1-RR-eBE重组质粒的比例为(1～5)：(1～5)。
10.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，步骤3)中所述双链DNA片段与pLbCpf1-sgRNA重组质粒通过酶切后连接；所述酶切用酶为BbsⅠ酶。
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