KR102354855B1 - 클로렐라 불가리스의 형질전환용 벡터 및 이를 이용한 형질전환 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 클로렐라 불가리스의 형질전환용 벡터 및 이를 이용한 형질전환 방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 질산염 환원 효소 발현용 벡터 및 이를 이용하여 클로렐라 불가리스를 형질전환 하는 방법에 관한 것이다. 본 발명자들은 클로렐라 불가리스를 대상으로 이에 적용 가능한 유전자 편집 기술을 확립하고, 이를 이용해 암모니아 요구성 변이주 및 이를 모계종으로 하는 DNA 형질전환 방법을 개발하였다. 본 발명에 따른 형질전환 방법은 유전자 변형 균주의 개발을 위한 플랫폼으로써 이를 이용하면 항생물질 사용에 따른 환경오염의 문제 없이 효율적으로 형질전환체의 선별이 가능하므로 클로렐라 불가리스의 유전체 연구 및 종 개량 등에 유용하게 활용될 수 있을 것이다.

Description

클로렐라 불가리스의 형질전환용 벡터 및 이를 이용한 형질전환 방법{Vector for transformation of Chlorella vulgaris and transformation method using the same}

본 발명은 클로렐라 불가리스의 형질전환용 벡터 및 이를 이용한 형질전환 방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 질산염 환원 효소 발현용 벡터 및 이를 이용하여 클로렐라 불가리스를 형질전환 하는 방법에 관한 것이다.

미세 조류(Microalgae)는 광독립 영양성 진핵 생물로서 바이오 연료 및 바이오 소재 생산을 위한 유망한 균주이며, 이의 이용은 CO₂ 배출량을 감소시킴으로써 환경친화적이다. 미세 조류 중 산업 분야에서 가장 많이 사용되는 클로렐라 속(Chlorella genus)은 치료 단백질의 발현 또는 고부가가치 화합물 생산에 적합한 숙주로 간주되고 있으며, 성장속도가 빠르며 실내외에서 배양 및 스케일업이 쉽다는 장점을 갖는다.

클로렐라의 이러한 장점에도 불구하고, 단백질 발현의 불안정성과 고부가가치 화합물의 상대적으로 낮은 생산 수율은 클로렐라의 산업적 이용 범위를 제한한다. 이에 따라 클로렐라의 산업적 가치를 높이기 위해 많은 연구자들이 적절한 프로모터, 인핸서, 마커 유전자 및 코돈 최적화를 통해 개선된 벡터를 구축하여 클로렐라의 형질전환 시스템을 최적화하기 위한 유전공학적 연구를 수행하고 있다.

일반적으로 클로렐라의 형질전환을 위해서는 무작위 돌연변이법 또는 DNA 벡터 삽입을 통한 방법이 이용된다. 무작위 돌연변이는 유전적 변이를 특정할 수 없는 어려움이 있기 때문에 유전체 연구에서 활용도가 낮다. DNA 벡터를 이용한 형질전환 방법은 외부 유전자의 도입을 통해 원하는 표현형을 유도할 수 있기 때문에 효과적으로 사용되지만 선별 마커로 주로 하이그로마이신 (hygromycin) 및 제오신 (zeocin)과 같은 항생제 또는 제초제가 사용되기 때문에 환경적 문제를 야기할 수 있다는 단점이 존재한다. 따라서 일부 산업종에 대해서 영양요구성 특징이 유도된 변이주를 이용하는 방법이 연구개발되고 있다.

한편, 최근에는 DNA 벡터 시스템을 이용한 전통적인 형질전환 방법 대신 보다 정확한 유전자 변형을 위한 방법론이 보고되고 있다. 예컨대, ZFN (zinc-finger nuclease), TALEN (transcription activator-like effector nuclease) 또는 CRISPR-Cas9 (clustered regularly interspaced short palindromic repeats-associated protein 9)을 이용하는 유전자 편집 기술을 미세 조류에 적용하는 방법이 연구되고 있다. 특히, 이 중에서 ZFN과 TALEN은 실험 설계의 복잡성과 어려움으로 인해 CRISPR-Cas9이 미세 조류에서 가장 활발하게 개발되고 있다. 미세 조류에서 CRISPR-Cas9 시스템은 DNA 벡터를 시작으로 2014년부터 적용되었으며 최근에는 리보핵단백질 (Ribonucleoprotein; RNP) 시스템이 이용되고 있다.

본 발명에서는 종래의 형질전환 균주의 선별에 이용되는 항생물질 사용에 따른 문제를 극복하기 위해, 유전자 편집 기술을 적용하여 질산염 환원 효소를 표적함으로써 항생물질 대신 질산염을 선별 마커로 사용하는 형질전환 방법을 개발하였다.

본 발명은 종래 미세 조류의 형질전환 방법에서 형질전환된 균주의 선별에 이용되는 항생물질의 사용에 따른 문제점을 해결하기 위해 안출된 것으로서, 본 발명자들은 유전자 편집기술을 이용해 질산염 환원 효소가 결핍된 암모니아 요구성 변이주를 개발하였고, 이를 모계종으로 하여 질산염 환원 효소를 발현하는 신규한 DNA 재조합 벡터를 도입함으로써 항생물질 대신 질산염을 선별 마커로 사용하는 형질전환 방법을 개발하였으며, 이로써 본 발명을 완성하였다.

이에, 본 발명은 신규한 질산염 환원 효소 발현용 재조합 벡터를 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명은 질산염 환원 효소가 녹아웃된 균주를 모계종으로 하여 질산염 환원 효소를 발현시키는 단계를 포함하는 클로렐라 불가리스 (Chlorella vulgaris)의 형질전환 방법을 제공하는 것을 다른 목적으로 한다.

그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 프로모터; 및 상기 프로모터와 작동 가능하게 연결된 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 질산염 환원 효소를 암호화하는 유전자를 포함하는, 재조합 벡터를 제공한다.

본 발명의 일구현예로, 상기 벡터는 서열번호 3의 염기서열로 이루어진 종결인자(Terminator)를 더 포함할 수 있다.

본 발명의 다른 구현예로, 상기 프로모터는 클로렐라 불가리스 유래 chloroplast photosystem Ⅱ psbR 유전자의 프로모터인 것일 수 있다.

또한, 본 발명은 하기의 단계를 포함하는 클로렐라 불가리스(Chlorella vulgaris)의 형질전환 방법을 제공한다.

(a) 질산염 환원 효소(nitrate reductase) 유전자가 녹아웃된 균주를 제작하는 단계;

(b) 상기 녹아웃 균주에 상기 재조합 벡터를 도입하는 단계; 및

(c) 질산염을 유일한 질소원으로 함유하는 배지에서 상기 벡터가 도입된 균주를 배양하는 단계.

본 발명의 일구현예로, 상기 단계 (a)에서, 상기 유전자의 녹아웃은 CRISPR/Cas9을 이용하여 이루어질 수 있다.

본 발명의 다른 구현예로, 상기 CRISPR/Cas9은 Cas9 단백질과 단일가닥 가이드 RNA(sgRNA)를 발현하는 DNA 벡터, 또는 외부에서 결합된 Cas9 단백질 및 단일가닥 가이드 RNA(sgRNA)의 복합체 형태로 도입되는 것일 수 있다.

본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 sgRNA는 서열번호 5 내지 7의 염기서열로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나인 것일 수 있다.

본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 녹아웃 균주는 암모니아 영양 요구성을 나타내는 클로렐라 불가리스 Cv-nr2 균주 (기탁번호 KCTC 14293BP)일 수 있다.

본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 단계 (a) 및 (b)에서, 도입은 전기천공법을 통해 이루어지는 것일 수 있다.

본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 단계 (c) 이후에, 배양하여 증식된 균주만을 선별하는 단계를 더 포함하는 것일 수 있다.

본 발명자들은 클로렐라 불가리스를 대상으로 이에 적용 가능한 유전자 편집 기술을 확립하고, 이를 이용해 암모니아 요구성 변이주 및 이를 모계종으로 하는 DNA 형질전환 방법을 개발하였다. 본 발명에 따른 형질전환 방법은 유전자 변형 균주의 개발을 위한 플랫폼으로써 이를 이용하면 항생물질 사용에 따른 환경오염의 문제 없이 효율적으로 형질전환체의 선별이 가능하므로 클로렐라 불가리스의 유전체 연구 및 종 개량 등에 유용하게 활용될 수 있을 것이다.

도 1은 질산염 환원 효소(nitrate reductase)의 유전자 편집용 sgRNA 서열의 설계 전략을 그림으로 도시한 것이다.
도 2는 CRISPR/Cas9 매개 유전자 편집을 위한 sgRNA 및 Cas9 단백질 복합체 다이어그램을 나타낸 것이다.
도 3은 C. vulgaris UTEX395의 유전자 편집 및 확인 과정을 그림으로 간략히 나타낸 것이다.
도 4는 생어 염기서열 분석(Sanger sequencing)을 통해 질산염 환원 효소가 녹아웃된 돌연변이체 (nr1, nr2, nr3)의 서열을 분석한 결과이다.
도 5는 질산염 환원 효소가 녹아웃된 돌연변이체 (nr1, nr2, nr3)에서 질산염 환원 효소 (NR)의 단백질 발현을 분석한 웨스턴 블롯 결과 (도 5a), 및 각각 암모늄이온 (NH₄ ⁺) 및 질산염 (NO₃ ^-) 공급 배지에서 야생형 및 상기 돌연변이체 균주를 배양한 결과 (도 5b)를 나타낸 것이다.
도 6은 질산염 환원 효소의 발현 벡터 구축에 관한 것으로, 도 6a는 전사체 분석의 개략도를 도시한 것이고, 도 6b는 특정 프라이머를 사용하여 지수기 및 정지기에서 신규한 프로모터 후보군 유전자의 발현수준을 비교한 결과이며, 도 6c는 높은 발현 수준에서 100개 유전자의 번역 시작 부위(ATG) 주변의 컨센서스 서열을 분석한 결과이고. 도 6d는 질산염 환원 효소를 발현하는 플라스미드 DNA의 벡터지도를 도시한 것이다.
도 7은 질산염 환원 효소 발현 벡터를 도입한 균주에서 DNA의 통합여부를 확인한 결과로서, 도 7a는 pCvpsabR::NR이 통합된 게놈을 PCR로 분석한 결과이고, 도 7b는 통합된 DNA를 서던 블롯으로 분석한 결과이며, 도 7c는 정량적 실시간 PCR을 통해 카피 수 변이(CNV)를 분석한 결과이다.
도 8은 질산염 환원 효소가 녹아웃된 모균주 (nr2)에 질산염 환원 효소 발현 벡터를 도입하여 형질전환된 균주 (C1, C2, C3)에서 질산염 환원 효소의 기능을 확인한 결과로서, 도 8a는 상기 균주들에서 질산염 환원 효소의 mRNA 발현을 측정한 결과이고, 도 8b는 모균주 (nr2) 및 질산염 환원 효소 발현 균주 (C1)에서 질산염 환원 효소 단백질 발현을 분석한 결과이며, 도 8c는 각각 암모늄이온 (NH₄ ⁺) 및 질산염 (NO₃ ^-) 공급 배지에서 모균주 (nr2) 및 질산염 환원 효소 발현 균주 (C1-C3)를 배양한 결과를 나타낸 것이다.

본 발명은 항생물질 사용에 따른 환경오염의 문제 없이 효율적으로 형질전환체의 선별이 가능한 클로렐라 불가리스 균주의 형질전환 방법에 관한 것이다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 프로모터; 및 상기 프로모터와 작동 가능하게 연결된 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 질산염 환원 효소를 암호화하는 유전자를 포함하는, 재조합 벡터를 제공한다.

상기 벡터는 서열번호 3의 염기서열로 이루어진 종결인자 (Terminator)를 더 포함할 수 있다.

본 발명에서 사용되는 용어, “벡터 (vector)”는 적합한 숙주 내에서 목적 유전자를 발현시킬 수 있도록 유전 물질을 보유하는 인위적 DNA 분자로서, 상기 프로모터 또는 적합한 유전자 발현 조절 서열; 및 이에 작동 가능하게 연결된 목적 단백질을 코딩하는 유전자의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 DNA 제조물을 의미한다. 본 발명에 따른 상기 재조합 벡터는 바람직하게 서열번호 5의 염기서열로 구성된 것일 수 있다.

본 발명에서 사용되는 용어, “프로모터”는 유전자의 전사를 조절하는 DNA의 특정 부위를 말하는 것으로, 일반적으로 유전자의 전사 개시 영역 주변에 위치하며 유전자의 앞쪽 수백~수천개 염기쌍 상류에 위치한다. 본 발명에 있어서, 상기 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 프로모터는 클로렐라 불가리스 유래 chloroplast photosystem Ⅱ psbR 유전자의 번역 개시 부위로부터 1,000bp 상류에 위치하는 것일 수 있다.

본 발명에서 사용되는 용어, “작동 가능하게 연결된”은 본 발명의 프로모터 활성을 갖는 폴리뉴클레오티드 서열이 목적 유전자의 전사를 개시 및 매개하도록 상기 유전자 서열과 기능적으로 연결되어 있는 것을 의미한다. 작동 가능한 연결은 당업계의 공지된 유전자 재조합 기술을 이용하여 제조할 수 있으며, 부위-특이적 DNA 절단 및 연결은 당업계의 절단 및 연결 효소 등을 사용하여 제작할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명에서 사용되는 용어, “종결인자”는 유전자의 끝을 알리는 부위로, RNA 중합효소가 종결인자 DNA 서열에 도달하면 RNA 전사물이 중합효소에서 분리되면서 전사가 종결된다. 본 발명에 있어서, 상기 서열번호 3의 염기서열로 이루어진 종결인자는 상기 재조합 벡터에서 발현된 mRNA의 3’ UTR 영역에 위치한다.

본 발명의 다른 양태로서, 본 발명은 하기의 단계를 포함하는, 클로렐라 불가리스 (Chlorella vulgaris)의 형질전환 방법을 제공한다.

(a) 질산염 환원 효소 (nitrate reductase) 유전자가 녹아웃된 균주를 제작하는 단계;

(b) 상기 녹아웃 균주에 상기 재조합 벡터를 도입하는 단계; 및

(c) 질산염을 유일한 질소원으로 함유하는 배지에서 상기 벡터가 도입된 균주를 배양하는 단계.

본 발명에서 사용되는 용어, “형질전환 (Transformation)”은 원래의 세포가 가지고 있던 것과 다른 종류의 유전자가 포함된 DNA사슬 조각 또는 플라스미드가 세포들 사이에 침투되어 원래 세포에 존재하던 DNA와 결합, 세포의 유전형질이 변화되는 분자생물학적 현상을 의미한다. 형질전환은 세균 (Bacteria)에서 흔히 관찰되며 인공적인 유전자 조작을 통해 이루어질 수도 있다. 형질전환을 선별하는 방법에는 여러가지가 있는데, 예컨대 항생물질에 대한 저항성이나 영양요구를 사용하는 방법이 있다. 그리고 복제기술에서 선별할 때에는 베타-갈락토시다아제 (β-galactosidase)를 암호화하는 lacZ 유전자를 사용하는 blue white screen의 방법이 사용되며, 이외에 녹색형광단백질 (GFP)을 사용하는 방법도 이용된다. 본 발명에 있어서, 형질전환은 미세 조류인 클로렐라 불가리스 균주를 대상으로 한다.

본 발명의 형질전환 방법은 상기 (a) 내지 (c) 단계로 구성되며, 각 단계에 대한 구체적인 내용은 하기와 같다.

본 발명에서, 상기 단계 (a)는 야생형 클로렐라 불가리스 균주를 대상으로 하여 질산염 환원 효소 유전자가 결핍된 녹아웃 균주를 제작하기 위한 단계이다.

상기 질산염 환원 효소 (Nitrate reductase)는 질산염을 아질산염으로 전환을 촉매하는 효소이다. 미세 조류는 질소원이 질산염 (NO₃ ^-)인 경우 이를 체내로 흡수한 후 질산염 환원 효소에 의해 NO₂ ^-으로 환원시키고 이어서 NO₂ ^-를 아질산 환원 효소에 의해 NH₄ ⁺로 환원시킨 다음 글루타민 합성효소 (glutamine synthetase) 및 글루타메이트 합성효소 (glutamate synthetase)를 이용해 최종적으로 아미노산으로 축적시킨다. 따라서 미세 조류는 NO₃ ^-를 NH₄ ⁺로 환원시키는데 요구되는 에너지를 절약할 수 있어 NH₄ ⁺와 NO₃ ^-, NO₂ ^- 등의 다양한 질소원을 이용할 수 있지만, 타 질소원에 비해 NH₄ ⁺를 선호하며, 따라서 대부분의 미세조류는 NHNH₄ ⁺가 고갈되었을 경우에만 NO₃ ^-를 흡수하기 시작한다고 보고되고 있다. 그러나 NO₃ ^-와 NH₄ ⁺를 각각 단독으로 주입한 경우에는 각 질소원에 따른 총 질소 제거결과에 유의한 차이가 나타나지 않는 것을 통해 질소원으로 NO₃ ^-만 존재할 경우에는 NH₄ ⁺와 비교하여 유사한 소비속도로 NO₃ ^-를 소비하는 것으로 보고되어 있다.

상기 질산염 환원 효소 유전자의 녹아웃은 해당 기술분야에서 특정 유전자를 녹아웃시키기 위해 이용되는 방법을 제한 없이 사용할 수 있으나, 바람직하게는 유전자 편집 기술, 더욱 바람직하게는 CRISPR/Cas9을 이용하여 수행될 수 있다.

상기 CRISPR/Cas9은 상기 CRISPR/Cas9은 Cas9 단백질과 단일가닥 가이드 RNA(sgRNA)를 발현하는 DNA 벡터, 또는 외부에서 결합된 Cas9 단백질 및 단일가닥 가이드 RNA(sgRNA)의 복합체 형태로 도입되는 것일 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 “Cas9”이란 “CRISPR-Cas9”을 지칭하며, 3세대 유전자가위로써 이용하고자 하는 특정 염기서열을 인식하여 절단하고 편집하며, 게놈의 목적 장소에 특정 유전자를 삽입하거나 특정 유전자의 활동을 정지시키는 조작을 간단하고 신속하고 효율성 있게 실시하는데 유용하다. Cas9 단백질 또는 유전자 정보는 NCBI(National Center for Biotechnology Information)의 GenBank와 같은 공지의 데이터 베이스에서 얻을 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, Cas9 단백질은 그 목적에 따라 당업자가 추가적인 도메인을 적절하게 연결할 수 있다.

본 발명에 있어서, Cas9 단백질은 야생형 Cas9 뿐만아니라, 유전자 편집을 위한 핵산분해효소의 기능을 갖는 것이라면 Cas9의 변이체를 모두 포함할 수 있다.

또한, 본 발명에서 Cas9 단백질은 스트렙토코커스 피요제네스 (Streptococcus pyogenes), 프란시셀라 노비시다 (Francisella novicida), 스트렙토코커스 써모필러스 (Streptococcus thermophilus), 레지오넬라 뉴모필라 (Legionella pneumophila), 리스테리아 이노큐아 (Listeria innocua), 또는 스트렙토코커스 뮤탄스 (Streptococcus mutans) 유래일 수 있고, 바람직하게는 스트렙토코커스 피요제네스 유래일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니며 당업자가 적절히 선택하여 이용할 수 있다.

본 발명에서 사용되는 용어, “가이드 RNA (guide RNA; gRNA)”란 표적하는 특정 DNA의 위치를 찾아내어 Cas 단백질을 표적 DNA로 인도하는 역할을 하는 단일 가닥의 RNA로서, 상기 가이드 RNA는 PAM (protospacer adjacent motif) 자리와 인접하며, 편집하려는 DNA의 10~25bp의 염기 서열과 상보적인 서열을 포함하는 것일 수 있다. 상기 가이드 RNA는 표적 DNA 서열의 상보적 사슬과 염기쌍을 형성할 수 있는 서열의 5’ 부위 앞에 1 내지 3개의 추가적인 뉴클레오티드, 보다 구체적으로 2개 또는 3개의 뉴클레오티드를 가질 수 있다. 또한 가이드 RNA는 표적 DNA 내 서열과 상보적인 서열을 가지는 부분 (이를 Spacer region, Target DNA recognition sequence, base pairing region 등으로도 명명함) 및 Cas 단백질 결합을 위한 hairpin 구조를 포함할 수 있다. 보다 구체적으로, 표적 DNA 내 서열과 상보적인 서열을 가지는 부분, Cas 단백질 결합을 위한 hairpin 구조 및 Terminator 서열을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에 있어서, 가이드 RNA는 클로렐라 불가리스의 질산염 환원 효소를 암호화하는 유전자를 표적으로 하며, 보다 바람직하게는 상기 유전자의 exon 1의 특정 영역을 표적으로 한다. 본 발명의 상기 가이드 RNA는 서열번호 5 내지 7의 염기서열로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나일 수 있다.

본 발명은 구체적인 실시예에서 상기 기재된 방법을 통해 질산염 환원 효소가 결핍된 3종의 변이주를 제조하였으며, 생어 서열분석을 통해 상기 변이주에서 NR 서열을 확인해 야생형 균주와 비교하여 구체적인 돌연변이 양상을 확인하였다 (실시예 2 참조).

또한, 상기 각 변이주와 야생형 균주의 분자적 및 표현형적 특성을 비교하였다. 상기 변이주들은 질산염 환원 효소 단백질이 검출되지 않았으며, 질산염을 질소원으로 하는 배지에서는 야생형 균주와는 달리 성장이 억제되었고, 암모늄이온 (NH₄ ⁺)이 포함된 배지에서만 성장 가능한 것을 확인하였다 (실시예 3 참조).

따라서 본 발명의 상기 단계 (a)를 통해 제조된 녹아웃 균주는 질산염 환원 효소가 결핍되어 질산염을 질소원으로 이용할 수 없는바, 암모니아 영양 요구성을 나타내는 특성을 가지며, 본 발명자들은 상기 녹아웃 균주인 클로렐라 불가리스 (Chlorella vulgaris) nr2 (Cv-nr2)를 한국생명공학연구원의 KCTC 생물자원센터에 2020년 09월 02일자로 기탁하였으며, 기탁번호 KCTC 14293BP를 부여받았다.

이에, 본 발명은 질산염 환원 효소가 결핍된, 암모니아 영양 요구성 클로렐라 불가리스 Cv-nr2 균주(기탁번호 KCTC 14293BP)를 제공한다.

본 발명에서, 상기 단계 (b)는 상기 질산염 환원 효소 유전자가 결핍된 녹아웃 균주에 질산염 환원 효소를 발현하는 본 발명에 따른 재조합 벡터를 도입하여 상기 녹아웃 균주에서 질산염 환원 효소를 발현시키기 위한 단계이다.

본 발명에 있어서, 상기 단계 (a) 및 단계 (b)에서 상기 CRISPR/Cas9 RNP 복합체 및 질산염 환원 효소 발현용 재조합 벡터는 각각 야생형 균주 및 녹아웃 균주에 전기천공법을 통해 도입할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니며 당업자가 상기 복합체 및 벡터를 상기 균주 세포 내로 효율적으로 전달할 수 있는 방법이라면 적절한 방법을 적용할 수 있다.

본 발명에서, 상기 단계 (c)는 상기 질산염 환원 효소를 발현하는 재조합 벡터가 도입된 균주를 질산염을 유일한 질소원으로 함유하는 배지에서 배양함으로써 형질전환된 균주를 선별하기 위한 단계이다.

본 발명자들은 구체적인 실시예를 통해 상기 질산염 환원 효소를 발현하는 신규한 DNA 벡터를 구축하였다(실시예 4 참조).

이어서 질산염 환원 효소가 결핍된 상기 3 종류의 녹아웃 균주 중 상기 기탁번호 KCTC 14293BP로 기탁된 균주를 모계종으로 이용하여 본 발명에 따른 질산염 환원 효소 발현용 DNA 재조합 벡터를 도입하여 보완 계통의 균주를 제작하였다. 상기 벡터를 도입한 후 생성된 콜로니를 배양하여 얻은 균주에 대하여 게놈 PCR 및 서던 블롯을 통해 도입된 질산염 환원 효소 유전자가 상기 균주의 게놈에 통합된 것을 확인하였다. 또한, 질산염 환원 효소의 발현여부를 분석한 결과, DNA 벡터를 도입하여 모계종으로 이용한 녹아웃 균주와는 달리 형질전환된 균주에서만 상기 효소 단백질이 발현되었으며, 질산염이 함유된 배지에서 성장하는 것을 확인하였다. 이러한 결과를 통해 질산염 환원 효소를 발현하는 신규한 DNA 벡터의 도입을 통해 상기 녹아웃 균주에서 질산염 환원 효소의 기능적 발현이 회복되었음을 확인하였으며, 항생물질의 이용 없이 질산염 함유 배지에서의 성장 여부를 통해 형질전환된 균주를 효과적으로 선별할 수 있음을 알 수 있었다(실시예 5 참조).

이에, 본 발명은 상기 방법에 의해 형질전환된, 클로렐라 불가리스 균주를 제공한다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.

[실시예]

실시예 1. 실험재료 및 실험방법

1-1. 균주 및 이의 배양

미국 텍사스 대학교에서 제공받은 클로렐라 불가리스(Chlorella vulgaris) UTEX395 균주를 TAP (Tris-Acetate-Phosphate) 배지에서 혼합영양적으로 배양하였다. 야생형 (Wild type; WT) 및 질산염 환원 효소 결핍 돌연변이체 (nr mutants)는 필터-캡 플라스크 (filter-capped flask)에서 80-100 μmol 광자 m^-2s^-1 (연속 광) 하에 25℃에서 100rpm으로 진탕 배양하였다. 대조적으로, 질산염 환원 효소 보완 돌연변이체 (nitrate reductase complemented mutants)의 경우에는 NH₄ ⁺이 동일한 몰농도의 NO₃ ^-로 대체된 TAP 배지에서 배양되었다. 상기 각 균주의 성장률은 20 mM의 NH₄ ⁺ 또는 NO₃ ^-이 각각 첨가된 배지에서 750 nm 흡광도로 측정하여 평가하였다.

1-2. 질산염 환원 효소 (NR)의 DNA 서열 확인 및 sgRNA 설계

C. vulgaris의 질산염 환원 효소 (Nitrate Reductase; 이하, NR)의 염기서열은 미국 국립생물공학정보센터 (National Center for Biotechnology Information) (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)의 뉴클레오티드 데이터베이스 (Accession: U39930)에서 확인하였다. 또한 C. vulgaris UTEX395의 NR 서열을 확인하기 위해 공개된 NR 서열을 C. vulgaris UTEX395의 전체 게놈 서열 (Accession: PRJNA186385)과 정렬시켰다. 다음으로, 게놈 DNA 및 cDNA 서열 분석을 통해 C. vulgaris UTEX395의 NR 서열을 결정하였다. 나아가 Cas-Designer (http://www.rgenome.net/cas-designer/)를 이용하여 CRISPR/Cas9 구현을 위한 sgRNA 서열을 설계하였다. 보다 구체적으로, 도 1에서 볼 수 있는 바와 같이 첫 번째 엑손 (exon 1)의 위치에서 3가지 다른 sgRNA 서열이 결정되었다. 오프 타겟 효과를 방지하기 위해 Cas-OFFinder (http://www.rgenome.net/cas-offinder/)를 비특이적 결합 서열을 예측하였다. 상기 방법으로 설계된 3가지 sgRNA 서열은 다음과 같다.

-sgRNA 1: 5’- AGCCAATGGCTACAGCACAG-3’(서열번호 5)

-sgRNA 2: 5’- CACTCGGCGGCGGGTGCTTG-3’(서열번호 6)

-sgRNA 3: 5’- AGTGCGGCAAGGCGCCGGTG-3’(서열번호 7)

1-3. CRISPR-Cas9 시스템 구현을 위한 벡터 구축

DNA 벡터는 전통적인 클로닝 프로토콜에 따라 제한 효소와 T4 DNA 리가아제 (ligase)를 사용하여 스트렙토코커스 피오게네스 (Streptococcus pyogenes)의 코돈 최적화된 Cas9 (본 발명에서 합성, Bioneer, Daejeon, Korea)을 클로닝하였으며, 도 2에 보다 구체적인 벡터 구조를 도시하였다. Cas9 서열은 XbaI 및 BamHI 제한 부위에서 빈 벡터의 콜리플라워 모자이크 바이러스 (CaMV) 35S 프로모터의 하류로 클로닝하였다. 이후, BsaI 제한 효소를 이용해 골든 게이트 클로닝을 이용하여 sgRNA를 애기장대(At) U6 프로모터의 하류에 클로닝하였다. tRNA 서열은 단일 벡터에서 여러 sgRNA를 생성하는데 이용되었다. 본 실험에서 이용된 클로닝 프라이머 서열은 하기 표 1에 나타내었다.

명칭	서열 (5' -> 3')	서열번호
sgRNA NR-F1	ATATATGGTCTCGattgAGCCAATGGCTACAGCACAGGTTTTAGAGCTAGAAATAGC	8
sgRNA NR-R1	ATTATTGGTCTCGCACTCGGCGGCGGGTGCTTGTGCACCAGCCGGGAATC	9
sgRNA NR-F2	ATATATGGTCTCGagtgGTTTTAGAGCTAGAAATAGC	10
sgRNA NR-R2	ATTATTGGTCTCGaaacAGTGCGGCAAGGCGCCGGTGTGCACCAGCCGGGAATC	11

1-4. 녹아웃 돌연변이체(knockout mutants) 제작

DNA 벡터와 RNP 복합체 (complex)를 사용하여 질산염 환원 효소의 녹아웃 돌연변이를 제작하였다. RNP 복합체는 종래 보고된 방법에 따라 미리 제조하였고, 뉴클레아제가 없는 물 (nuclease-free water)에 용해시킨 동결건조된 Cas9 단백질 (ToolGen, Seoul, South Korea) 100μg 및 70μg의 in-vitro 전사된 sgRNA (GeneArt™ Precision gRNA Synthesis Kit, Invitrogen, CA, USA)를 혼합하고 실온에서 10분 동안 배양하여 RNP 복합체를 형성시켰다.

C. vulgaris UTEX395를 25℃에서 연속광 하에 100rpm에서 진탕하면서 6g L^-1 글루코오스가 함유된 BG11 배지에서 3일 동안 적응시켰다. 대수기 (2.0-2.5 × 10⁷ 세포 mL^-1)에서 세포를 회수하고 실온에서 5분 동안 2000×g에서 원심분리하였고, 세포 펠렛 (2 × 10⁸ 세포)을 과삼투 완충액 (0.2M 소르비톨 및 0.2M 만니톨)으로 세척하고 얼음에서 1시간 동안 20 mL의 차가운 과삼투 완충액에서 배양하였다. 이후, 전처리된 세포를 회수하여 4℃에서 5분 동안 2000 × g에서 원심분리하고, 200μL의 전기천공 완충액 (0.2M 소르비톨, 0.2M 만니톨, 0.08M KCl, 0.005M CaCl₂ 및 0.01M HEPES)으로 재현탁하였다. DNA 벡터 또는 RNP 복합체를 세포 내로 도입하기 위해 25μg의 sperm DNA (또는 RNP 복합체)와 혼합된 5μg의 DNA를 100μL의 세포와 혼합하였다. 이어서 상기 혼합물을 2mm 갭 전기천공 큐벳으로 옮기고 10분 동안 얼음 위에 두었다. Gene-Pulser 장치 (Bio-Rad, CA, USA)를 사용하여 3.3kV cm^-1, 25-50μF 및 200 저항에서 전기천공을 진행하였다. 전기천공 후, 세포 현탁액은 33℃에서 밤새도록 암조건 하에 6gL^-1 글루코오스가 함유된 BG11 배지에서 회복시켰다. 상기 회복된 세포를 20mM NaNO₂ 및 100-150mM KClO₃이 첨가된 BG11 한천 플레이트 배지에 도말하여 돌연변이 체를 선별하였다. 콜로니가 형성된 후 모든 콜로니를 2차 스크리닝을 위해 액체 배지로 옮겼다. 마지막으로 영양요구성 특성을 갖는 것으로 보이는 세포에 대하여 서열분석을 실시하였다. 상기 과정은 도 3에 그림으로 도시하였다.

1-5. 웨스턴 블롯(Western blot) 분석

배양된 세포 (1 × 10⁶)를 SDS-PAGE 로딩 완충액 하에 끓이고 8% SDS-폴리 아크릴아미드 겔 (polyacrylamide gels)에서 전기영동한 다음, Xcell II 블롯 모듈 (Thermo Fisher, MA, USA)을 이용하여 PVDF 막 (membrane)으로 옮겼다. 이후 질산염 환원 효소 특이적 항체 (Agrisera, Vannas, Sweden)를 사용하여 질산염 환원 효소 유전자의 발현 여부를 확인하였다. 또한 ATP 합성 효소 (ATP-β) 항체의 베타-서브유닛 (Agrisera, Vannas, Sweden)을 단백질 양 보정을 위해 사용했으며, HRP-접합 염소 항-토끼 IgG (H+L) 항체 (Life Technologies, CA, USA)를 2차 항체로 사용했다. 이후 EPD Western Reagent (ELPIS-BIOTECH, 대전, 대한민국)를 사용하여 화학발광을 통해 X-선 필름에 NR 및 ATP-β 단백질 발현을 시각화하였다.

1-6. psbR 프로모터 발굴 및 NR 유전자 보완을 위한 벡터 구축

NR의 보완 벡터를 구축하기 위해, 전사체 분석을 기반으로 C. vulgaris UTEX395에서 새로운 프로모터 서열을 분리하였다. 구체적으로 정량적 실시간 PCR (real-time PCR)을 통해 엽록체 광계 II psbR 유전자 (chloroplast photosystem II psbR; CvpsbR)의 발현을 확인하고 검증하였다. 대수기 및 정지기에서 세포를 회수하고 mRNA 발현 수준을 비교하였다. CvpsbR의 프로모터 서열은 CvpsabR의 번역 개시 부위 (ATG)로부터 1,000bp 상류에 위치하는 서열을 선택하였고, 종결인자 (terminator) 서열은 발현된 mRNA에 대한 3’ UTR을 결정하였다. C. vulgaris UTEX395의 NR DNA 서열을 CvpsbR 프로모터와 종결인자 사이에 클로닝하였다. 모든 클로닝 과정은 제한효소 및 T4 리가아제를 기반으로 한 전통적인 방법에 따라 수행하였다. SpeI과 NcoI은 프로모터 서열의 클로닝에 사용되었고, EcoRI과 XbaI은 종결인자 서열의 융합에 사용되었으며, NcoI와 XbaI 사이에 NR 유전자를 클로닝하였다. 정량 분석 및 벡터 구축에 사용된 모든 프라이머는 하기 표 2에 나타내었다.

Name	Sequence (5’ -> 3’)	서열번호
18s-F	TATGGGTGGTGGTGCATGGC	12
18s-R	TGCCTCATGCTTCCATTGGCT	13
psbR-F	GGGGCTCAACTCCATTGGCA	14
psbR-R	ACCAGGTGTCGGGGGTGTAA	15
Ribo L29e-F	CCGTCACAATGGCCAAGAGC	16
Ribo L29e-R	CTTCTTGGCAAAGCGCTGGT	17
rbcS1-F	TGTGAACAACGGCTGGACCC	18
rbcS1-R	TCTGTGCAGCCGAACATGGG	19
psaD-F	GTTCCCCAACGGAGAGGTGC	20
psaD-R	GGGGCTGCTGCTCAGAACTC	21
psbR-pro-F	GGACTAGTGCCGAGCAGTGAGCATGGGGTGGCCGTG	22
psbR-pro-R	CATGCCATGGTGGCGACGGTGTGGCGGCAAGGAG	23
psbR-ter-F	CTAGTCTAGAGGTGGTGCCCACCTTGTGCGCCGGCC	24
psbR-ter-R	CGGAATTCCAGTTGGACTCAGTTCGACTGTTATTAC	25
NR-F	CATGCCATGACAGTGCTCCTGGCAGGCGAG	26
NR-R	CGGGATCCTCAAAATTGAATGCACTGCTCCGGCTTG	27

1-7. NR 보완을 위한 형질전환

보완 연구를 위해 nr2 모균주에 플라스미드 DNA, pCvpsbR::NR을 도입하여 형질전환시켰다. 구체적으로, 대수기의 세포를 회수하고 실온에서 2000 × g로 5분 동안 원심분리한 후 상기 실시예 1-4의 방법에 따라 형질전환을 실시하였다. 먼저, 제한 효소 (SalI 및 SpeI)로 절단하여 선형화된 DNA (2-8μg)와 250μL 세포 (1 × 10⁸ 세포 mL^-1)를 혼합하고 혼합물을 2mm 갭 전기천공 큐벳으로 옮겼다. 큐벳은 6.0kVcm^-1, 50μF 및 800 저항에서 전기천공된 것보다 15분 동안 얼음에 두었으며, 전기 천공 후, 세포 현탁액을 25℃에서 밤새 20mM KNO₃이 포함된 TAP 배지에서 회복시켰다. 이후 보완된 세포를 20mM KNO₃를 유일한 질소 공급원으로 포함하는 TAP 한천 플레이트에서 선별한 다음, 특정 프라이머를 이용해 PCR을 실시하여 유전자의 삽입 및 발현을 검증하였다. 상기 PCR 분석에서 이용된 프라이머 서열은 하기 표 3에 나타내었다.

Name	Sequence (5’ -> 3’)	서열번호
psbR-pro-conf-F	CTCACGGTGAACTGCCTGAGTTC	28
NR-conf-R	CCACTCGTCCTTGGTGCCCTTGTC	29
NR-mRNA-F	GCGGTGCTGAAGGACCCCAAAGACACAACC	30
NR-mRNA-R	GAATGCACTGCTCCGGCTTGTAGCCCAGCTTC	31
APT-mRNA-F	CCGTCCACATCCAGTCAACA	32
APT-mRNA-R	TGAGCTCGGGCAACTCAATT	33
NR-CNV-F	GCACCCAGACCTTGTGCGGCTCACAG	34
NR-CNV-R	GCTAGACACGCTACCTGGCTATGAGCTAGC	35
LCYE-CNV-F	CAGCAGCGCTTGGCATGTTGGCACTG	36
LCYE-CNV-R	GCAACTGGAAGTTTACAAATGCACGCAAAC	37

1-8. 서던 블롯 (Southern blot) 분석

서던 블롯을 이용해 DNA 삽입을 확인하였다. 보다 상세하게, CTAB 방법을 통해 세포로부터 게놈 DNA를 추출하였다. 추출된 게놈 DNA를 PvuII 제한 효소로 분해하고, 분해된 DNA는 0.8% 아가로오스 겔에서 분리한 다음 모세관 이동을 통해 나일론 막으로 옮겼다. 본 연구에서는 Gene Images AlkPhos Direct Labeling and Detection System (Amersham, Little Chalfont, Bucks, UK)을 사용하여 제조한 NR을 표적으로하는 유전자 특이적 프로브와의 혼성화를 통해 막 부착 DNA를 개발했다. 이후에는 제조사의 프로토콜에 따라 실험을 진행하였다.

1-9. 정량적 실시간 PCR을 통한 복제 후 변이 분석

NR의 복제 수 변이 (copy number variation; CNV)를 검증하기 위해 정량적 실시간 PCR (quantitative real-time PCR)을 수행하였다. 게놈에서 NR의 카피 수는 NR에 특이적인 프라이머를 이용해 TaKaRa PCR Thermal Cycler Dice (Takara, Shiga, Japan)를 사용하여 결정하였다. 상기 실시예 1-8에서와 동일한 방법으로 Genomic DNA를 준비하고, CNV를 평가하기 위한 PCR 주형으로 0.1㎍의 DNA를 사용하였으며, 라이코펜 엡실론 사이클라제 (Lycopene epsilon cyclase; LCYE)를 단일 카피 참조로 사용하였다. 로우 데이터는 제조사에서 제공한 소프트웨어를 이용하여 ΔΔCt 방법으로 분석하였다.

실시예 2. NR 녹아웃 돌연변이체의 제조

질산염 환원 효소 (nitrate reductase; NR)는 질산염 (nitrate)에서 아질산염 (nitrite)으로의 전환을 매개하고 일반적으로 고등 식물 및 미세 조류에서 질소 동화의 속도 제한 단계를 매개하는 것으로 알려져 있으며, 본 발명에서는 C. vulgaris의 성공적인 유전자 편집 기술을 입증하기 위해 선택하였다. C. vulgaris에서 상기 유전자를 표적하면 돌연변이 표현형을 쉽게 검증할 수 있는데, 상기 유전자가 결핍되면 질산염을 유일한 질소 공급원으로 포함하는 배지에서 성장이 억제되기 때문이다. 더욱이, NR이 결핍된 돌연변이 (영양 요구성 돌연변이)는 미세 조류의 유전적 변형을 위한 귀중한 자원이다. NR 유전자를 사용하는 형질전환 균주는 항생제 내성 유전자와 같은 외래 선별 마커를 사용할 필요가 없어 환경오염에 영향을 미치지 않으면서 형질전환 계통의 개발을 가속화하는데 이용될 수 있다.

C. vulgaris UTEX395의 NR의 DNA 서열은 게놈 DNA 및 cDNA 서열 분석을 통해 결정하였다. NR 게놈 DNA의 서열은 7039bp 길이로 19개의 엑손을 가지고 있다. 종래 보고된 바에 따르면 유전자 편집 표적은 프레임쉬프트 돌연변이에 의해 조기 번역 종결 코돈을 유도하도록 초기 CDS 영역에 위치하였다. 이러한 전략을 기반으로, 본원발명에서는 exon 1의 위치에서 NR의 유전자 편집을 위한 3개의 다른 표적 영역을 결정하였으며, Cas-OFFinder (불일치 범위: 2bp)를 통해 3가지 서열 모두에 대해 오프 타겟 서열을 예측한 결과 발견되지 않았다. 따라서 본 발명자들은 본 실시예에서 오프 타겟 효과의 가능성을 배제하였다.

NR 녹아웃 돌연변이체는 DNA 벡터 시스템 및 RNP 복합체를 사용하여 상기 실시예 1-4의 방법에 따라 제작되었다. 원형 Cas9-sgRNA 발현 벡터 및 RNP 복합체를 각각 C. vulgaris UTEX395로 형질전환시켰다. 형질전환된 C. vulgaris를 선별 마커로써 KClO₃이 함유된 고체 한천 플레이트에서 스크리닝 하였다. 이후 콜로니가 형성된 KClO₃ 내성 세포를 추가 스크리닝하기 위해 액체 배지에서 배양하였다. 마지막으로, 24번의 시험과 수천개 후보에 대한 서열 분석을 통해 3개의 다른 녹아웃 돌연변이체를 얻었다. 본 발명에서 유전자 편집 효율은 녹아웃 돌연변이가 발생한 실험에서 1차 선별된 콜로니 수를 기준으로 0.5~1.8%였으며, 벡터 시스템 (돌연변이 번호 1 및 2)과 RNP 복합체 (돌연변이 번호 3)에 의해 각각 생성되었다.

녹아웃 돌연변이체 (nr)에서 NR의 서열을 확인하기 위해 생어 서열분석 (sanger sequencing)을 수행하고 야생형의 서열과 비교하였다. 그 결과, 도 4에 나타낸 바와 같이 nr1은 표적 3 (T3)의 protospacer 영역에서 2bp가 삽입된 것으로 나타났으며, 상기 DNA 삽입에 의한 프레임쉬프트 변이 때문에 exon 3에 대한 번역이 조기 종결되었다. nr2의 경우에는 표적 1 (T1)에 돌연변이가 유발되었는데, 구체적으로 절단 부위에서 678bp의 삽입과 5bp의 결실이 일어났다. 이러한 돌연변이 때문에 exon 1에서 단백질 발현이 억제되었다. nr3에서는 표적 3 (T3)의 영역에서 9bp의 삽입이 발견되었으며, 또한 exon 1의 프레임쉬프트 돌연변이에 의해 NR의 발현이 조기 종결되었다. nr1과 nr3는 절단 부위 외부에서 예상치 못한 변이가 발생하였으며, 이러한 돌연변이는 미세 조류 및 고등 식물에서 유전자 편집의 결과로 발생할 수 있으나, 현재까지 이러한 현상의 원인은 명확하게 밝혀지지 않았다. 이는 이중 가닥 DNA가 절단된 후 오류가 발생하기 쉬운 비상동말단연결에 의한 DNA 복구 과정에서 발생하는 돌연변이로 생각된다.

실시예 3. NR 녹아웃의 분자적 및 표현형적 분석

3개의 nr 돌연변이체를 WT와 비교하여 NR의 유전자 발현 여부를 평가하였다. 먼저, 단백질의 발현 감소 수준을 확인하기 위해 NR 특이 항체를 이용한 면역 블롯 분석을 실시해 NR의 단백질 발현을 검출하였다. 그 결과, 도 5a에 나타낸 바와 같이 항체는 95-kDa 크기 (약 110-kDa) 위쪽에 결합되었으며, WT에서 예상되는 NR 유전자의 크기에 해당하였다. 그러나 모든 돌연변이에서 검출되지 않았으며, 이러한 결과를 통해 NR이 유전자 편집에 의해 nr 돌연변이체에서 녹아웃 되었음을 알 수 있었다.

전술한 바와 같이, NR 유전자가 기능하지 않으면 세포는 질산염을 질소원으로 사용하지 못해 질산염 공급 배지에서 성장이 억제된다. 따라서 NR의 녹아웃을 평가하기 위해 질산염 공급 배지에서 야생형 (WT) 및 nr 돌연변이체 (nr1, nr2, nr3)를 각각 배양하고 세포 성장을 비교하였다. 그 결과, 도 5b에서 볼 수 있는 바와 같이 질소 공급원으로 암모늄이온 (NH₄ ⁺)이 포함된 배지에서는 야생형 및 nr 돌연변이체의 성장을 비교했을 때 유의한 차이가 관찰되지 않았다. 그러나, 질산염 (NO₃ ^-)이 함유된 배지에서는 야생형은 정상적으로 성장하는데 반해 nr 돌연변이체의 세포 성장은 완전히 억제된 것을 확인하였다. 이러한 결과는 NR 유전자가 nr 돌연변이체에서 녹아웃 되었음을 명확히 입증하는 것이다.

실시예 4. NR 보완용 벡터 구축

항생제 유전자를 선별 마커로 사용하지 않는 새로운 벡터 시스템을 개발하기 위해, nr 돌연변이와 관련된 선별 마커로써 질산염을 이용하는 새로운 벡터 시스템을 개발하고자 하였다. 이를 위해, 새로운 프로모터 서열을 이용하여 NR 유전자를 발현 할 수 있는 DNA 벡터를 구축하였다. 이때 새로운 프로모터 서열을 발굴하기 위해 도 6a에 도시한 바와 같이 전사체 분석에서 1) 지수 및 정지 성장기에서 고도로 발현되는 유전자, 2) 정확한 주석이 달린 유전자, 3) 핵에서 발현되는 유전자의 기준에 따라 22,000개 contig 중 3개 유전자를 선정 하였다. 선정된 3가지 유전자 즉, photosystem II subunit R (psbR, contig 8008), ribosomal L29e protein family (Ribo L29e, contig 21050) 및 rubisco small subunit1 (rbcS1, contig 7464) 유전자에 대하여 mRNA 발현 수준을 지수기 및 정지기에서 정량적 실시간 PCR을 통해 모두 검증하였다. 또한 이전에 보고된 psaD 유전자 (contig 5690)의 mRNA 발현 수준도 비교하였다.

상기 4개 유전자의 발현 수준을 비교한 결과, 도 6b에 나타낸 바와 같이 psbR과 rbcS1의 발현 수준이 다른 유전자 보다 높게 나타났다. 특히, psbR은 rbcS1보다 일정한 수준의 발현을 나타냈기 때문에 발현 벡터의 구축에 있어서 더욱 신뢰할 수 있는 후보였다. 이에 더하여, ATG 근처의 컨센서스 서열이 유전자 발현 수준과 함께 단백질 발현 수준에 영향을 미치기 때문에, 상위 0.5% 수준의 높은 발현률을 보이는 유전자 군의 ATG 근처 서열 분석도 수행하였다. 추가 염기서열 분석 결과, 도 6c에 나타낸 바와 같이 발현수준이 높은 유전자의 ATG (번역 시작 부위) 주변의 컨센서스 염기 서열은 psbR과 동일한 CACC-ATG-G 패턴을 가지고 있음을 확인하였다. 이에, 항생제 대신 질산염을 선별 마커로 사용하기 위해 도 6d에 나타낸 바와 같이 psbR 프로모터를 사용하여 NR을 발현하는 DNA 벡터를 구축하였다. 본 실험에서 확인된 psbR 유전자의 프로모터 및 종결인자 서열을 먼저 모의 벡터에 클로닝하고 psbR 프로모터의 하류에 NR 유전자의 전체 서열을 융합하였다.

실시예 5. NR 보완 연구

pCvpsabR::NR 벡터를 사용하여 질산염 환원 효소의 보완 시스템을 확인하기 위해, nr2를 모균주로 이용하여 C. vulgaris로의 유전적 형질전환을 유도하였다. 상기 벡터를 세포에 도입하기 위한 방법으로는 전기천공법을 이용하였다. 형질전환 2~3주 내에 pCvpsabR::NR 벡터를 보유한 세포를 유일한 질소 공급원으로 질산염을 포함하는 한천 플레이트에서 배양하였다. 결과적으로 두 번의 시험에서 3가지 다른 콜로니가 생성되었다. 이후 생성된 각 콜로니를 액체 배지로 옮겨 DNA 삽입을 확인하였다. 구체적으로, 도 7a 및 7b에 나타낸 바와 같이 게놈 PCR 및 서던 블롯 분석을 통해 NR 보완 계통인 형질전환체에서 pCvpsabR::NR 벡터의 통합을 확인하였다. 또한, 도 7b에서 볼 수 있는 바와 같이 CNV 분석을 통해 NR의 카피 수는 상기 형질전환체에서 2개 이상인 것으로 확인되었으며, 이러한 결과들을 통해 도입유전자가 통합된 것을 명확하게 알 수 있었다.

나아가 본 발명자들은 상기 보완된 계통에서 NR의 유전자 발현을 조사하기 위해 3가지의 보완 계통 (C1-C3)에서 mRNA를 분리하고, 암모늄이온 함유 배지 (비-유도 조건)에서 배양된 모균주 계통 (nr2)과 NR 유전자의 발현수준을 cDNA PCR을 통해 비교하였다. 그 결과, 도 8a에 나타낸 바와 같이 상기 보완 계통에서 NR 유전자가 발현되었으나, nr2에서는 전혀 발현되지 않은 것으로 나타났다. 또한, 도 8b의 웨스턴 블롯 분석을 통해서도 NR 유전자의 보완 계통 (C1)의 경우 약 110 kDa 위치에서 NR 단백질이 발현되는 것을 확인하였다. 더욱이, 질산염 공급 조건에서 각 균주의 성장 여부를 분석한 결과 도 8c에 나타낸 바와 같이 보완 계통 균주 (C1, C2, C3)는 nr2 균주와는 달리 질산염 함유 배지에서 잘 성장하였으며, 이러한 결과는 psbR 프로모터에 의해 조절되는 NR 유전자의 발현에 의해 NR의 기능적 발현이 회복되었음을 의미하는 것이다. 다시 말해, 상기 결과들은 pCvpsabR::NR 벡터가 게놈 DNA에 삽입되었고 새로운 벡터의 발현 시스템이 기능적 수준에서 작동함을 입증하는 것이다.

전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.

<110> IUCF-HYU (Industry-University Cooperation Foundation Hanyang University) <120> Vector for transformation of Chlorella vulgaris and transformation method using the same <130> PD20-256 <160> 37 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 1003 <212> DNA <213> psbR promoter <400> 1 gccgagcagt gagcatgggg tggccgtggt ggtctggtgc tgcattgcaa tgcacgcaag 60 ctcagcaaca gcatcggaca atgtcttctg ctgatgcctg atcggttgtg cctacagcgt 120 cacaacaaag atgcggggtg caagttatac agcaagtcag gctgcaccat gcgccgtccc 180 gtgccttgtc acaacctgct ctctgaccta tattcccctc gagagtcctt catggttgct 240 ccgttttctt tcttggccgc aggttatggc cgggtatatg cgtgaggctg acctggctgc 300 ctcgcgcatt gcgccgtctg aagagtttgc gctgacgggt gggcgcttgg ccgcctggcc 360 ttcgctcatg atgtcccagt ttttggtgcc tggcgcaagc ttagtgggcc acttgtgtgg 420 cttggcggcc ggcgtgttgc acgtgtatgc tggagcctta ttgggcaggc tgcgaaggcg 480 gcgccgcagc ggcggcggtg ggcggcggct gcgggatggt cgcctggtgc ctgcattggg 540 gccacaagac ctgggcacag gcaggcatcc tggcctgggc tggttggacg tcggcagcca 600 cgtagtgctg ggggtggccg 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gctgcagctg gcttgcttct 6420 gtggcgtggg cgtgagtgtt gcggttgtgc tcgtggtgcc ttggcaggct cggatttgaa 6480 tgcatagctg gtatcccact tacctgcacc tattggcacg ccagcgttcc acctaccatc 6540 actccaccaa cccatgtggc tccccctgcc tgtgtgtgca ggcaagatga gccagtacct 6600 tgagggaatg gccatcgggg actacatgga ggtgaagggt ccgctggggc acgttcacta 6660 cactgggcga ggcaggtgag aagtagttta gggttgattg tgtgttgggg tggggcctcg 6720 aaaggaggca gcagggatat gcagcaggag gggtgccatc atgcacgcag tggccttgct 6780 tgccttgcct gcctgccctg cctgctgacc tactgccccg cactccctca cagccctgcc 6840 tcaacctttc ttcctgccat gcgtgccgct ttgtgttgca gctacacgct ggatggcacg 6900 ccgcacagcg ccagccgcat cagcatgatt gctggcggca caggcatcac ccccatgctc 6960 caggtgaacc cttgaattgc tcgctgctga cgccgctggt ttgcaccgcg ccatgtgcgc 7020 cagcggcttc ctccagggct tgcctgtggc ccaggcccac gcacatgcac cacaatctcc 7080 actgctgcag ctgccgcagc ctgcttattg tgctcagttg tccctgttcc atgtacccgg 7140 cccctctgcc catcctgctg ctttcctcct tcctcctttc tttcttcccg ccaggtcatt 7200 aaagcggtgc tgaaggaccc caaagacaca accgagctct ccctgctcta tgccaatgtg 7260 tcaccggatg acatcctgct gcgagaagag ctggacgcac tggcagccaa gcacgacaac 7320 ttcagcgtgt ggtacacagg tgcgctgtgc tgcgacagta gcatcagctg gcagctggtg 7380 ggctgggcca ggcggcaagg gctggctgga tgcagtgcgt gcagggttgc tagatgggag 7440 gcagggagac ttgggatgct gggacgtgca agggactgtc agggaaaatc gctgtgcccc 7500 tgcacaaacg cactgtggcg tgtggcgccg cttctctctg ctctcgtccc cttctcgcca 7560 tgctcccaca cccctgcctt ggtttgtggt gcagttgaca aggcggatga ggggtggccg 7620 ttcagcaccg ggttcatcaa tgaggacatg gtgaaggagc gcctgtttcc gggtgagtac 7680 atattgtggt ggcagcaagg caccaccctg tgcggcagca gtgttgtgtg cagcggcggc 7740 ctggatgtct gtgtctgcgt tgcgaataaa caaaaaaact gattttggtg aagacggttg 7800 ggtgaagaca tgtggtattg gagggagacg agggctgcta gtctggctgc tcaatgtgca 7860 agcttgctgc tcctcttgtt tgcttcttga cactcactct tcttctgccc tgcttgtccc 7920 tgccctctct tgctgcagcc ggcgacgaca ccatctgctg cctgtgcggc cctcccccca 7980 tgatcaagtt tgcctgcctg cccaacctcg agaagctggg ctacaagccg gagcagtgca 8040 ttcaattttg atctagaggt ggtgcccacc ttgtgcgccg gcctttatcg gccagccgca 8100 gcagttttgg caccgcagca gcagcagccc cgcagttctt tgcagcagta gtagcaagag 8160 cagcgtaatc atccccaccc agagaagacc tttcatcgtc ccctttgctt ccgtttcctg 8220 ttcttttagt tggcgtgtgt gacgcaagat cggccgctgt atcctcggtc gctgcttgcc 8280 ccctagcgga gactgacgtg gagtgcacca gcccacgtcg gtggcggatt gtgccgcaaa 8340 cttgctgtaa taacagtcga actgagtcca actggaattc aagcttatcg ataagtcgac 8400 gtatatatga gtaaacttgg tctgacagtt accaatgctt aatcagtgag gcacctatct 8460 cagcgatctg tctatttcgt tcatccatag ttgcctgact ccccgtcgtg tagataacta 8520 cgatacggga gggcttacca tctggcccca gtgctgcaat gataccgcga gacccacgct 8580 caccggctcc agatttatca gcaataaacc agccagccgg aagggccgag cgcagaagtg 8640 gtcctgcaac tttatccgcc tccatccagt ctattaattg ttgccgggaa gctagagtaa 8700 gtagttcgcc agttaatagt ttgcgcaacg ttgttgccat tgctacaggc atcgtggtgt 8760 cacgctcgtc gtttggtatg gcttcattca gctccggttc ccaacgatca aggcgagtta 8820 catgatcccc catgttgtgc aaaaaagcgg ttagctcctt cggtcctccg atcgttgtca 8880 gaagtaagtt ggccgcagtg ttatcactca tggttatggc agcactgcat aattctctta 8940 ctgtcatgcc atccgtaaga tgcttttctg tgactggtga gtactcaacc aagtcattct 9000 gagaatagtg tatgcggcga ccgagttgct cttgcccggc gtcaatacgg gataataccg 9060 cgccacatag cagaacttta aaagtgctca tcattggaaa acgttcttcg gggcgaaaac 9120 tctcaaggat cttaccgctg ttgagatcca gttcgatgta acccactcgt gcacccaact 9180 gatcttcagc atcttttact ttcaccagcg tttctgggtg agcaaaaaca ggaaggcaaa 9240 atgccgcaaa aaagggaata agggcgacac ggaaatgttg aatactcata ctcttccttt 9300 ttcaatatta ttgaagcatt tatcagggtt attgtctcat gaccaaaatc ccttaacgtg 9360 agttttcgtt ccactgagcg tcagaccccg tagaaaagat caaaggatct tcttgagatc 9420 ctttttttct gcgcgtaatc tgctgcttgc aaacaaaaaa accaccgcta ccagcggtgg 9480 tttgtttgcc ggatcaagag ctaccaactc tttttccgaa ggtaactggc ttcagcagag 9540 cgcagatacc aaatactgtt cttctagtgt agccgtagtt aggccaccac ttcaagaact 9600 ctgtagcacc gcctacatac ctcgctctgc taatcctgtt accagtggct gttgccagtg 9660 gcgataagtc gtgtcttacc gggttggact caagacgata gttaccggat aaggcgcagc 9720 ggtcgggctg aacggggggt tcgtgcacac agcccagctt ggagcgaacg acctacaccg 9780 aactgagata cctacagcgt gagctatgag aaagcgccac gcttcccgaa gggagaaagg 9840 cggacaggta tccggtaagc ggcagggtcg gaacaggaga gcgcacgagg gagcttccag 9900 ggggaaacgc ctggtatctt tatagtcctg tcgggtttcg ccacctctga cttgagcgtc 9960 gatttttgtg atgctcgtca ggggggcgga gcctatggaa aaacgccagc aacgcggcct 10020 ttttacggtt cctggccttt tgctggcctt ttgctc 10056 <210> 5 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sgRNA 1 <400> 5 agccaatggc tacagcacag 20 <210> 6 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sgRNA 2 <400> 6 cactcggcgg cgggtgcttg 20 <210> 7 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sgRNA 3 <400> 7 agtgcggcaa ggcgccggtg 20 <210> 8 <211> 57 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sgRNA NR-F1 <400> 8 atatatggtc tcgattgagc caatggctac agcacaggtt ttagagctag aaatagc 57 <210> 9 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sgRNA NR-R1 <400> 9 attattggtc tcgcactcgg cggcgggtgc ttgtgcacca gccgggaatc 50 <210> 10 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sgRNA NR-F2 <400> 10 atatatggtc tcgagtggtt ttagagctag aaatagc 37 <210> 11 <211> 54 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sgRNA NR-R2 <400> 11 attattggtc tcgaaacagt gcggcaaggc gccggtgtgc accagccggg aatc 54 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 18s-F <400> 12 tatgggtggt ggtgcatggc 20 <210> 13 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 18s-R <400> 13 tgcctcatgc ttccattggc t 21 <210> 14 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> psbR-F <400> 14 ggggctcaac tccattggca 20 <210> 15 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> psbR-R <400> 15 accaggtgtc gggggtgtaa 20 <210> 16 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Ribo L29e-F <400> 16 ccgtcacaat ggccaagagc 20 <210> 17 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Ribo L29e-R <400> 17 cttcttggca aagcgctggt 20 <210> 18 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> rbcS1-F <400> 18 tgtgaacaac ggctggaccc 20 <210> 19 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> rbcS1-R <400> 19 tctgtgcagc cgaacatggg 20 <210> 20 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> psaD-F <400> 20 gttccccaac ggagaggtgc 20 <210> 21 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> psaD-R <400> 21 ggggctgctg ctcagaactc 20 <210> 22 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> psbR-pro-F <400> 22 ggactagtgc cgagcagtga gcatggggtg gccgtg 36 <210> 23 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> psbR-pro-R <400> 23 catgccatgg tggcgacggt gtggcggcaa ggag 34 <210> 24 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> psbR-ter-F <400> 24 ctagtctaga ggtggtgccc accttgtgcg ccggcc 36 <210> 25 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> psbR-ter-R <400> 25 cggaattcca gttggactca gttcgactgt tattac 36 <210> 26 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NR-F <400> 26 catgccatga cagtgctcct ggcaggcgag 30 <210> 27 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NR-R <400> 27 cgggatcctc aaaattgaat gcactgctcc ggcttg 36 <210> 28 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> psbR-pro-conf-F <400> 28 ctcacggtga actgcctgag ttc 23 <210> 29 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NR-conf-R <400> 29 ccactcgtcc ttggtgccct tgtc 24 <210> 30 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NR-mRNA-F <400> 30 gcggtgctga aggaccccaa agacacaacc 30 <210> 31 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NR-mRNA-R <400> 31 gaatgcactg ctccggcttg tagcccagct tc 32 <210> 32 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> APT-mRNA-F <400> 32 ccgtccacat ccagtcaaca 20 <210> 33 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> APT-mRNA-R <400> 33 tgagctcggg caactcaatt 20 <210> 34 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NR-CNV-F <400> 34 gcacccagac cttgtgcggc tcacag 26 <210> 35 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NR-CNV-R <400> 35 gctagacacg ctacctggct atgagctagc 30 <210> 36 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LCYE-CNV-F <400> 36 cagcagcgct tggcatgttg gcactg 26 <210> 37 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LCYE-CNV-R <400> 37 gcaactggaa gtttacaaat gcacgcaaac 30

Claims (10)

1. 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 프로모터; 및
   상기 프로모터와 작동 가능하게 연결된 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 질산염 환원 효소를 암호화하는 유전자를 포함하는, 재조합 벡터.
   
2. 제1항에 있어서,
   상기 벡터는 서열번호 3의 염기서열로 이루어진 종결인자 (Terminator)를 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 재조합 벡터.
   
3. 제1항에 있어서,
   상기 프로모터는 클로렐라 불가리스 유래 chloroplast photosystem Ⅱ psbR 유전자의 프로모터인 것을 특징으로 하는, 재조합 벡터.
   
4. 하기의 단계를 포함하는, 클로렐라 불가리스 (Chlorella vulgaris)의 형질전환 방법:
   (a) 질산염 환원 효소 (nitrate reductase) 유전자가 녹아웃된 균주를 제작하는 단계;
   (b) 상기 녹아웃 균주에 제1항의 재조합 벡터를 도입하는 단계; 및
   (c) 질산염을 유일한 질소원으로 함유하는 배지에서 상기 벡터가 도입된 균주를 배양하는 단계.
   
5. 제4항에 있어서,
   상기 단계 (a)에서, 상기 유전자의 녹아웃은 CRISPR/Cas9을 이용하여 이루어지는 것을 특징으로 하는, 형질전환 방법.
   
6. 제5항에 있어서,
   상기 CRISPR/Cas9은 Cas9 단백질과 단일가닥 가이드 RNA(sgRNA)를 발현하는 DNA 벡터, 또는 외부에서 결합된 Cas9 단백질 및 단일가닥 가이드 RNA(sgRNA)의 복합체 형태로 도입되는 것을 특징으로 하는, 형질전환 방법.
   
7. 제6항에 있어서,
   상기 sgRNA는 서열번호 5 내지 7의 염기서열로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는, 형질전환 방법.
   
8. 제4항에 있어서,
   상기 녹아웃 균주는 암모니아 영양 요구성을 나타내는 클로렐라 불가리스 Cv-nr2 균주 (기탁번호 KCTC 14293BP)인 것을 특징으로 하는, 형질전환 방법.
   
9. 제4항에 있어서,
   상기 단계 (a) 및 (b)에서, 도입은 전기천공법을 통해 이루어지는 것을 특징으로 하는, 형질전환 방법.
   
10. 제4항에 있어서,
    상기 단계 (c) 이후에, 배양하여 증식된 균주만을 선별하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 형질전환 방법.
    
    

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