KR101891298B1

KR101891298B1 - 펙토박테리움 카로토보룸에 대해 새로운 숙주수용기를 인식하여 숙주감수성을 나타내는 펙토박테리움 파지 pop72

Info

Publication number: KR101891298B1
Application number: KR1020160129781A
Authority: KR
Inventors: 유상렬; 김형순; 배재우; 김민식
Original assignee: 서울대학교 산학협력단
Priority date: 2016-10-07
Filing date: 2016-10-07
Publication date: 2018-08-23
Also published as: KR20180038751A

Abstract

본 발명은 펙토박테리움균에 대해 숙주감수성을 나타내는 펙토박테리움 파지 (Pectobacterium phage) POP72 및 이를 함유하는 조성물에 관한 것으로, 포도비리대 과의 박테리오파지이다. 본 발명의 박테리오파지는 기존에 밝혀져 있는 다양한 종류의 수용체를 인식하는 것이 아니라, 새로운 세포 외부 다당류를 인식하여 펙토박테리움의 증식을 억제 또는 사멸한다. 본 발명의 펙토박테리움 파지 (Pectobacterium phage) POP72는 신선채소의 무름병 방제에 효과를 보이므로, 농약, 항생제를 대체하는 유용한 생물학적 조절제로써 활용될 수 있다.

Description

펙토박테리움 카로토보룸에 대해 새로운 숙주수용기를 인식하여 숙주감수성을 나타내는 펙토박테리움 파지 POP72 {Pectobacterium phage POP72 recognizing a novel host receptor against Pectobacterium carotovorum}

본 발명은 펙토박테리움 카로토보룸에 대해 새로운 숙주수용기를 인식하여 숙주감수성을 나타내는 펙토박테리움 파지 (Pectobacterium phage) POP72 및 이를 함유하는 채소 무름병 방제용 조성물에 관한 것이다.

펙토박테리움균 (Pectobacterium carotovorum subsp. carotovorum)은 그람 음성의 간균이며, 포자를 형성하지 않는 편성호기성균으로, 야채, 과일, 화훼를 키우는 토양에서 주로 발견된다. 식물체에 감염하여 무름병을 일으켜 상품성을 떨어뜨린다. 펙토박테리움의 최적 성장환경은 습도가 높고 온도는 26~28℃이나, 36℃ 정도에서도 잘 자라 여름철 배추생산에 큰 영향을 준다.

무름병은 연부병이라고도 하며 식물세포벽이 흐물흐물해져서 썩는 병해를 지칭한다. 무름병에 걸리면 세포벽 중간층의 펙틴질 및 셀룰로오스 층이 녹아 점차 물러져 썩고 흐물흐물해지며 독특한 악취를 낸다.

웰빙이라는 단어는 이미 소비자들이 물건을 구매할 때 기본적으로 고려하는 사항이 되었다. 식 문화 또한 영향을 받았고, 채소를 오랫동안 신선하게 유지하며 섭취하고자 하는 수요도 증가하고 있다. 판매하는 채소를 신선하게 유지하기 위하여 수분을 계속 공급해주는데, 이때 무름병균이 전파된다. 무름병균은 토양 및 식물체에서 오랫동안 생존 가능하며, 농약에 의한 방제 효과도 일반적으로 낮은 것으로 알려져 새로운 방제기술의 개발이 필요하다.

현재까지 작물의 병 방제는 저항성 품종을 개발하거나, 농약과 같은 화학적 약제를 사용하는 것이 대부분이었다. 품종 개발은 시간, 비용이 많이 든다는 단점이 있고, 농약의 경우는 항생제 저항성 균과 유사하게 농약에 저항성을 나타내어 병을 일으킨다. 이에 대한 대책으로 생물학적 방제 기술이 부각되고 있는데, 세균을 특이적으로 공격하여 용균 시키는 박테리오파지를 이용한 방법이 많이 연구되고 있다.

박테리오파지는 용균성, 용원성 파지로 분류되며 용균성 생활사를 가지는 용균(virulent) 파지가 생물학적 방제제로 각광받고 있고, 용원성(temperate) 파지는 숙주와의 상호관계를 연구하는데 많이 이용되고 있다. 파지의 특성은 나열하면 다음과 같다.

첫째, 파지는 숙주가 있는 경우에만 복제가 가능하며, 그 속도는 세균 감염 후 30분경에 100~200개의 새로운 파지를 만드는 정도로 빠르다. 둘째, 파지는 자연환경에 존재하며 세균과 함께 진화해 왔기 때문에 균이 있는 곳에 함께 존재한다. 셋째, 파지는 진핵 세포에 영향을 주지 않는다. 이와 같은 특징으로 사람과 동물에게 안전하며 환경 구성요소에 영향을 주지 않는다.

박테리오파지는 그람 음성균의 외막 구성요소를 인식하여 부착 및 파지의 DNA를 주입하는데, 외막 구성요소들 중 하나를 인식하지 못하면 숙주특이성이 사라지게 된다. 현재까지 밝혀진 그람 음성균의 숙주 수용체는 매우 다양하다. 리포다당류의 O-항원, 캡슐 형태의 외막 다당류 K-항원과 Vi-항원, 편모, 섬모 등을 파지의 꼬리 단백질 부분이 인식하여 (D.V. RAKHUBA, G.I. NOVIK, Polish Journal of Microbiology, 2010, Jul: Vol. 59, No 3, 145-155) 숙주에 부착하고 DNA를 주입한다.

새로운 숙주 수용체를 찾으려는 시도가 계속 이루어졌지만 위의 숙주 수용체 외의 새로운 종류는 발견되지 않는 상황이다.

대한민국 특허출원 제10-2013-0012010호 (출원일자 2013.02.01)에는, "박테리오파지 T10-1, MY-1 및 이를 포함하는 채소 무름병 방제용 조성물"이 기재되어 있다.

D.V. RAKHUBA, G.I. NOVIK, Polish Journal of Microbiology, 2010, Jul: Vol. 59, No 3, 145-155.

본 발명은 무름병 세균의 사멸을 유도할 수 있는 새로운 박테리오파지를 분리하고, 이를 함유하는 식물 무름병균 증식 억제용 또는 사멸용 조성물을 제공하고자 한다.

본 발명은 펙토박테리움 카로토보룸 (Pectobacterium carotovorum)에 대해 숙주감수성을 나타내는 펙토박테리움 파지 (Pectobacterium phage) POP72 (KACC 97028P)를 제공한다.

한편, 본 발명은 펙토박테리움 파지 (Pectobacterium phage) POP72 (KACC 97028P)을 포함하는 것을 특징으로 하는 식물 무름병 방제용 조성물을 제공한다. 상기 식물 무름병 방제용 조성물은, 일 예로 농약일 수 있는데, 본 발명 펙토박테리움 파지 (Pectobacterium phage) POP72 (KACC 97028P)의 식물 잎 또는 줄기에 대한 부착능을 증진시키는 등의 목적을 위해 당업계에 널리 알려진 보조제 성분 (일 예로 전분 등)을 포함할 수 있다.

본 발명의 식물 무름병 방제용 조성물에 있어서, 상기 식물 무름병은, 펙토박테리움 카로토보룸 (Pectobacterium carotovorum)균으로 말미암은 것일 수 있다.

한편, 본 발명은 펙토박테리움 파지 (Pectobacterium phage) POP72 (KACC 97028P)을 포함하는 것을 특징으로 하는 펙토박테리움 카로토보룸 (Pectobacterium carotovorum) 증식억제용 또는 사멸용 조성물을 제공한다. 본 발명의 펙토박테리움 카로토보룸 (Pectobacterium carotovorum) 증식억제용 또는 사멸용 조성물은 펙토박테리움 카로토보룸 (Pectobacterium carotovorum)의 증식억제 또는 사멸을 위한 조성물로써, 항균제, 항생제 등의 형태를 지칭한다. 본 발명의 펙토박테리움 카로토보룸 (Pectobacterium carotovorum) 증식억제용 또는 사멸용 조성물에는 펙토박테리움 카로토보룸 (Pectobacterium carotovorum)의 증식 또는 사멸능을 증진시키기 위한 여러 공지의 물질 (일 예로, 항생제 등)을 포함할 수 있으며, 기타 박테리오파지의 장기 보존을 위한 보존제 등 당업계에 널리 알려진 보조 성분을 포함할 수 있다.

한편, 본 발명은 펙토박테리움 파지 (Pectobacterium phage) POP72 (KACC 97028P)가 처리된 식물을 제공한다. 이때, 상기 식물은, 펙토박테리움 파지 (Pectobacterium phage) POP72 (KACC 97028P)가 바람직하게 식물의 잎 또는 줄기에 뿌려진 것을 특징으로 하는 식물일 수 있다. 또한, 상기 식물은 일 예로 채소, 과일 및 화훼 중 선택되는 어느 하나인 것일 수 있고, 상기 채소, 과일 및 화훼 중 선택되는 어느 하나의 식물은, 수확 후, 유통 중인 것일 수 있다.

상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명에서 새롭게 분리한 펙토박테리움 파지 (Pectobacterium phage) POP72 (KACC 97028P)는 신선채소의 무름병에 방제 효과가 있어, 수확 후 농산물의 유통 및 저장 중 부패에 의한 손실을 막을 수 있고, 농작물의 무름병 방제를 위한 미생물 농약으로도 활용될 수 있다.

또한, 본 발명의 박테리오파지는 세균 생육 억제 또는 사멸능이 있어, 항생제 대신 사용될 수 있으므로, 항생제 사용 절감을 통해 항생제 내성균 출현 가능성을 감소시키고, 환경 안전성을 높일 수 있다.

도 1은 본 발명 펙토박테리움 파지 (Pectobacterium phage) POP72의 형태학적 특성을 보여준다.
도 2는 본 발명 펙토박테리움 파지 (Pectobacterium phage) POP72의 용균 활성능을 보여주는 그래프이다.
도 3은 본 발명 펙토박테리움 파지 (Pectobacterium phage) POP72의 숙주 수용기를 확인시켜주는 실험결과이다.

본 발명에서는 심각한 질병을 유발하는 식물 병원성 세균인 펙토박테리움균을 제어하기 위하여 펙토박테리움 파지 (Pectobacterium phage) POP72 (KACC 97028P)를 새롭게 발견하여 제공한다.

본 발명자들은 농촌진흥청으로부터 무름병균 제어 가능성이 있는 박테리오파지 용액을 받아 용균 효과, 숙주 특이성 등을 평가하여 우수한 능력을 가진 박테리오파지를 선별하였고 이를 POP72로 명명하였다. 본 발명의 펙토박테리움 파지 (Pectobacterium phage) POP72는 무름병균에 대한 감염 능력이 있어 이를 사멸할 수 있었다.

본 발명의 박테리오파지 POP72는, 투과전자현미경으로 관찰한 결과, 도 1에 나타나는 바와 같이, 약 44 nm의 머리와 아주 짧은 꼬리를 가진 포도비리데(Podoviridae)의 형태학적 특성을 보임을 알 수 있었다. 이를 KACC(농업생명공학연구원)에 2016년 7월 29일 자로 기탁하여 기탁번호 KACC 97028P를 부여받았다.

한편, 본 발명의 펙토박테리움 파지 (Pectobacterium phage) POP72의 전장 유전체는 이중나선 DNA이며, 그 크기는 44,760 bp이었다. 전체 핵산서열은 서열번호 1에 기재한 것과 같았다. 염기서열 상동성을 BlastN, BlastP 프로그램을 이용하여 조사한 결과, 파지 POP72는 phD2B, SP6, PM85, BP12B와 상동성을 나타내었으나, 그 일치도는 높지 않았다. NCBI에 염기서열정보가 등록된 기존의 펙토박테리움 카로토보룸 아종 카로토보룸(Pectobacterium carotovorum subsp. carotovorum) 파지인 PP1과 상동성이 매우 높은 것을 확인하였다. 기타 파지인 PPP1 (KACC97005P), MY-1 (KACC97009P), T10-1 (KACC97008P)과는 염기서열의 유사성이 없었다.

본 발명의 박테리오파지는 채소 무름병균을 숙주로 하여 수행한 실험에서 플라크를 형성하여 무름병균을 용해시킴(lysis)을 확인할 수 있었다. 특히, 본 발명의 박테리오파지는 펙토박테리움 카로토보룸 종(Pectobacterium carotovorum species), 보다 정확하게는 펙토박테리움 카로토보룸 아종 카로토보룸(Pectobacterium carotovorum subsp. carotovorum) 또는 펙토박테리움 카로토보룸 아종 브라질리언스(Pectobacterium carotovorum subsp. brasiliense)을 특이적으로 용균 시킬 수 있는 사실을 확인할 수 있었다.

따라서, 본 발명의 펙토박테리움 파지 (Pectobacterium phage) POP72는, 펙토박테리움균의 감염으로 인한 질병의 치료에 사용할 수 있고, 식품, 농약에 함께 첨가되어 무름병균을 제어할 수 있는 생물학적 조절제로 사용할 수 있다.

한편, 본 발명의 채소 무름병 방제용 조성물과 펙토박테리움 종(Pectobacterium carotovorum species) 증식 억제 또는 사멸용 조성물 중 선택되는 어느 하나는, 실제 포장에서 사용하기 적합한 안정적인 제제화를 목적으로 생화학 농약으로 사용 가능한 계면활성제 또는 증량제 등을 사용하여 수화제, 입상수화제, 액상수화제, 액제, 수용제, 수용성입제 또는 캡슐화제의 형태로 제조될 수 있다.

한편, 본 발명의 펙토박테리움 파지 (Pectobacterium phage) POP72의 숙주수용체를 확인하기 위하여 트랜스포존을 이용하여 POP72에 저항성을 보이는 세균을 분리하였다. 트랜스포존은 숙주의 게놈 내에서 위치를 임의적으로 이동할 수 있는 유전자로 삽입된 유전자의 기능을 변이시키는 역할을 한다.

트랜스포존의 서열을 이용하여 프라이머를 구성하여 숙주 게놈의 어느 부분에 트랜스포존이 삽입되었는지 게놈 시퀀싱을 통하여 확인하였다. 그 결과, 본 발명의 펙토박테리움 파지 (Pectobacterium phage) POP72가 숙주세포를 감염시킬 때 새로운 숙주 수용기 M-항원을 수용기로 사용하는 사실을 알 수 있었다.

[ 실시예 1 : 펙토박테리움균에 특이적인 박테리오파지의 분리]

배추 무름병이 발생한 식물이 재배되고 있는 토양으로부터 배추 무름병 균에 대한 박테리오파지를 분리하고자 하였다.

펙토박테리움균을 선택적으로 사멸시킬 수 있는 박테리오파지를 분리하기 위하여 태백에 위치한 밭 토양 5 g과 10 ml TSB(Tryptic Soy Broth) 배지, 10 mM MgSO₄ (1M MgSO₄ 1 ml)를 넣은 혼합물을 28℃ 24시간 배양한 후, 13,000rpm 5분 동안 원심분리하고, 0.22 μm 막필터를 통해 여과시켜 잔여물을 제거한 용액을 만들었다.

세균 배양용 TSB배지(Tryptic Soy Broth)에 0.1 ml의 펙토박테리움균(Pectobacterium carotovorum subsp. carotovorum) Pcc3를 배양액에 첨가한 후, 4시간 동안 28℃에서 진탕 배양하였다. 이후, 토양에서 배양한 용액을 0.1 ml 넣어주고, 상기의 배양액을 2시간 동안 28℃에서 진탕 배양하였다. 그 다음 13,000 rpm의 속도로 1분 동안 4℃에서 원심 분리하여 상등액을 취한 후, 이를 0.22 μm 막필터로 여과하였다. 이렇게 얻어진 여과액을 이용한 용균반 분석을 통해 펙토박테리움균에 특이적인 박테리오파지를 검출하였다.

자세히 설명하면 0.1 ml의 여과액과 8시간 이상 배양한 세균 0.1 ml의 현탁액 그리고 1 M 황산마그네슘 0.1 ml(10 mM)를 섞어 주었다. 이 혼합액을 TSB에 낮은 농도의 아가를 섞은 소프트 아가 배지(0.4% TSB soft agar)와 함께 섞어서 1.5% TSA 배지를 포함하는 플레이트에 부었다. 이후, 상기 플레이트를 28℃에서 12시간 동안 배양하였다.

일정 시간 경과 후, 목적하는 박테리오파지가 플레이트 상에 나타난 경우에 독립되고 투명한 용균반이 관찰되었다. 이 용균반 영역을 백금 루프를 이용하여 분리해 낸 다음, 새로운 세균 배양액에 넣어 28℃에서 배양하였는데, 배양액이 뿌옇게 보였지만 세균만 넣은 대조군과 비교해보았을 때 더 맑아짐을 확인하였다. 이후 배양액을 원심분리하고, 상등액을 취해 0.22 μm 막필터를 통해 여과시켜 용해물에 남아있는 모든 세균을 제거하고, 여과액만을 취하였다. 이때, 상기 여과액은 박테리오파지만을 포함한다.

상기의 과정을 통해 얻은 박테리오파지 용액을 가지고, 아가 배지 상에서 다르게 희석하고 주입하여 용균반의 재분리를 3회 수행하였고, 이와 같은 일련의 과정을 통해 순수한 박테리오파지 POP72를 얻을 수 있었다.

본 발명자들은 위와 같은 방법으로 얻어진 박테리오파지 POP72를 미생물기탁기관인 농촌진흥청 국립농업과학원 농업유전자정보센터(KACC)에 2016년 7월 29일자로 기탁하여 수탁번호 KACC97028P을 부여받았다.

[실시예 2 : 펙토박테리움 파지 (Pectobacterium phage) POP72의 형태 관찰 및 분류]

펙토박테리움 파지 (Pectobacterium phage) POP72의 형태를 관찰하기 위해 염화세슘(CsCl) 밀도 구배법(밀도: 0.39g/㎖, 0.6 g/㎖, 0.67 g/㎖ 및 0.95 g/㎖)을 이용한 원심분리(25,000 rpm, 2시간, 4℃)를 통하여 박테리오파지를 정제한 다음, 투과전자현미경을 사용하여 박테리오파지의 형태를 관찰하였다.

이를 상세히 설명하면, 정제된 박테리오파지를 구리 격자(cupper grid)에 올리고, 2% 액상 우라닐 아세테이트(Uranyl acetate)로 음성 염색(negative staining)을 하고 건조하였다. 염색된 시료를 80kV의 전압으로 에너지 여과 투과 전자현미경(LIBRA 120, CarlZeiss)을 이용하여 관찰하였고, 그 결과를 도 1에 나타내었다.

도 1에 관찰된 박테리오파지를 모양으로 분류하는 기준으로 보았을 때, 펙토박테리움 파지 (Pectobacterium phage) POP72는 44nm의 육각형 머리를 가지고 수축성이 없는 짧은 꼬리(a short non-contractile tail)를 갖고, 시스(sheath)가 없으므로, 복합형의 포도비리데(Podoviridae)에 속하는 것으로 분류하였다. 도 1은 본 발명 펙토박테리움 파지 (Pectobacterium phage) POP72의 형태학적 특성을 보여준다.

[실시예 3 : 펙토박테리움 파지 (Pectobacterium phage) POP72의 숙주별 감수성(susceptibility) 확인]

숙주별 감수성은 연속 희석 적하법(serial dilution dropping method)을 사용하여 확인하였다(Adams, M.H. 1959. Bacteriophage, pp27-34. Interscience Publishers Inc., New York). 12시간 배양한 세균 배양액과 0.4%의 소프트 아가 배지를 섞은 후, TSA 아가 플레이트 상에 부어서 28℃에서 30분간 건조하였고, 그 위에 희석 배수별로 희석된 펙토박테리움 파지 (Pectobacterium phage) POP72를 떨어뜨리고, 상온에서 말린 후 28℃에서 10시간 정치 배양하였다.

균주가 파지에 대해 감수성을 갖는 경우 플레이트 상에 용균반이 보이게 되며, 이는 세균 세포가 완전하게 용해되어 사멸된 결과를 나타낸다. 만약 감수성이 약한 경우, 뿌옇게 영역이 생길 수 있다.

하기 표 1에서는 펙토박테리움 파지 (Pectobacterium phage) POP72를 사용하여 펙토박테리움에 감수성이 있는 균과 없는 균의 수성을 실험한 결과를 나타내었다. 본 발명의 펙토박테리움 파지 (Pectobacterium phage) POP72가 펙토박테리움 카로토보룸 아종 카로토보룸(Pectobacterium carotovorum subsp. carotovorum) 또는 펙토박테리움 카로토보룸 아종 브라질리언스(Pectobacterium carotovorum subsp. brasiliense)에 대해 높은 용균 활성을 보임을 확인하였다

숙주	박테리오파지	숙주	박테리오파지
Pectobacterium carotovorum subsp. carotovorum	POP72	Pectobacterium carotovorum subsp. brasiliensis	POP72
Pcc3	C	Pcc21	I
Pcc4	C	Pcc25	-
Pcc8	C	Pcc26	C
Pcc9	C	Pcc49	C
Pcc10	C	Pcc87	C
Pcc11	C	Pcc88	C
Pcc12	C	Pcc99	C
Pcc13	C	E10	C
Pcc14	C	E12	C
Pcc15	C	E3	C
Pcc17	C	Pcc0001	C
Pcc22	C	Pcc0031	C
Pcc27	C	E6	C
Pcc29	C
Pcc96	-
Pcc97	C
Pcc101	C
Pcc102	C
E13	-
E17	C
Pcc38	C
E35	C
Pcc kiwi KSG2	C
주) C는 Clear plaque (투명한 용균반)을 형성하였다는 의미이고, I는 Inhibition zone (억제 영역)을 형성하는 것을 의미함. 억제영역은 박테리오파지에 의한 독립된 하나의 용균반이 형성되지는 않지만 어떠한 물질에 의해 세균의 증식이 억제됨을 의미함.

[실시예 4: 펙토박테리움 파지 (Pectobacterium phage) POP72의 용균 활성능]

펙토박테리움균 균주에 대한 펙토박테리움 파지 (Pectobacterium phage) POP72의 용균 활성능을 알아보고자 하였다. 펙토박테리움 파지 (Pectobacterium phage) POP72의 용균 활성 확인을 위해 두 개의 시험군으로 나누어 실험을 실시하였다. 대조군(●)에는 숙주 균주인 펙토박테리움균 Pcc27을 액체배지에서 배양하며 실험하였고, 실험군(■,▲,▼)에는 숙주 균주인 펙토박테리움균(Pcc27)을 액체배지에서 3시간 배양 후, 10 mM의 MgSO₄와 함께 펙토박테리움 파지 (Pectobacterium phage) POP72를 감염시켰다.

감염 직후부터 시작하여 일정 시간 간격으로 대조군과 실험군 각각의 흡광도(OD₆₀₀)를 측정하며 세포의 생장 및 사멸 정도를 파악하였다. 실험 결과, 도 2에서 보는 바와 같이, 본 발명의 박테리오파지는 숙주에 감염 후 1시간 이후부터 용균 활성이 빠르게 진행되어 2시간 후 대부분의 균을 사멸하는 것으로 확인하였다. 단시간에 용균 활성이 빠르게 일어나는 특징을 이용하면 효과적인 생물학적 조절제로 활용 가능할 것으로 판단되었다. 도 2는 펙토박테리움 파지 (Pectobacterium phage) POP72의 용균 활성능을 보여주는 그래프이다.

[실시예 5 : 펙토박테리움 파지 (Pectobacterium phage) POP72의 숙주 수용기]

펙토박테리움균에 감염하는 펙토박테리움 파지 (Pectobacterium phage) POP72의 작용 경로를 알아보기 위해 숙주 수용기 탐색을 목표로 실험을 수행하였다. 펙토박테리움 파지 (Pectobacterium phage) POP72가 감염할 수 있는 균주 Pcc27을 사용하여 확인하였다. 야생 균주와 접합이 가능하며 트랜스포존을 전달할 수 있는 영양 요구 변이 E.coli 균주를 각각 12시간씩 배양한 후 접합하여 24시간 동안 TSA 아가 플레이트에 디아미노피멜산을 첨가하여 배양하였다.

영양 요구 변이 균주를 제거하면서, POP72에 저항성을 가지는 균주를 분리하기 위하여, 접합한 균주에 고농도의 POP72 (10⁹pfu/ml)를 첨가하여 상온에서 15분간 정치 배양하였다. 이 균주를 연속 희석 (serial dilution)하여 카나마이신 (50μg/ml)이 포함된 TSA 아가 플레이트에 24시간 배양하여 POP72에 저항성을 나타내는 단일 집락을 얻었다.

단일 집락의 게놈 디엔에이를 추출하여 트랜스포존 염기서열을 자르지 않는 제한효소로 게놈디엔에이를 자른 후 T4 리가아제를 이용하여 원형의 형태로 만들었다. 트랜스포존 서열의 프라이머를 이용하여 원형의 DNA를 시퀀싱 하여 어느 유전자에 트랜스포존이 삽입되었는지 확인하였다.

트랜스포존은 외막다당류의 종류 중 하나인 M-항원(colanic acid)을 합성하는 유전자(cpsG) 군집에 삽입된 것을 확인하였다. M-항원 합성 유전자가 망가진 돌연변이 균주에 대한 감수성을 연속 희석 적하법(serial dilution dropping method)을 사용하여 확인하였다.

세균 배양액과 0.4%의 소프트 아가 배지를 각각 섞어 TSA 아가 플레이트 상에 부어서 상온에서 30분 동안 건조하였고, 그 위에 희석배수 별로 희석된 펙토박테리움 파지 (Pectobacterium phage) POP72를 떨어뜨리고 상온에서 말린 후 28℃에서 10시간 정치 배양하였다.

실험결과, 도 3에서 보듯이 야생균주는 파지에 대해 감수성을 가지므로 플레이트 상에 독립된 투명한 영역인 용균반이 보인 반면, M-항원 합성 유전자가 제거된 돌연변이 균주에 대해서는 용균반을 형성하지 못하는 것으로 관찰되었다. 또한, M-항원 합성 유전자를 회복시킨 균주를 숙주세균으로 하여 실험을 수행하였을 때, 펙토박테리움 파지 (Pectobacterium phage) POP72가 세포를 완전하게 사멸시킨 것으로 확인하였다.

이와 같은 결과로부터 본 발명의 펙토박테리움 파지 (Pectobacterium phage) POP72가 숙주세포를 감염시킬 때 새로운 숙주 수용기 M-항원을 수용기로 사용하는 사실을 알 수 있었다. 도 3은 펙토박테리움 파지 (Pectobacterium phage) POP72의 숙주 수용기를 확인시켜주는 실험결과이다.

본 발명의 박테리오파지를 포함한 세균 사멸용 조성물 및 세균 사멸용 제제는 펙토박테리움균의 감염에 의한 질환 치료용으로 사용할 수 있고, 항생제 및 농약에 내성을 갖는 펙토박테리움균으로 인한 수확 전, 후 농작물의 상품성 유지에 이용될 수 있으며, 새로운 개념의 항생제 내성균 제어방안 개발을 통해 야채, 과일류의 안전성을 향상시킬 수 있다.

또한, 펙토박테리움에 특이성을 가지며 다른 숙주 수용체를 가지는 파지를 찾아 본 발명의 박테리오파지와 함께 섞어 생물학적 방제제로 사용할 수 있다.

<110> Seoul National University R&DB Foundation <120> Bacteriophage POP72 recognizing a novel host receptor against Pectobacterium carotovorum <130> YP-16-199 <160> 1 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 44760 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Bacteriophage POP72 (KACC 97028P) <400> 1 tcagtgccaa tgcaccactt tgtgattgca cgggacacca atggcgacct gcttgatatt 60 atcttgctgc aagagaaaag cctgcgcacc tttgacccag ccacccgtgc tgccatcgag 120 caagccaagg gtgggcagaa gtgcaaggat gatgatgaag tcaagttgta tactcacgcc 180 aagctggata aagatggcat gtgggtagta cgccaatctg ctgatgatat ccctgtgggt 240 gaagaatccc gtgtgctgtt cgagcgtcta ccatttatcg tggtgacttg gaagcgtgca 300 tacggcgagg catacggacg acctctgtgc gaggactacg ctggcgactt gttcgtcgtg 360 caattcttgt ctgaggccat cgcccgtggt gcggcactca tggcagatat aaaatacctg 420 attcgaccgg gcgcacagac tgacatcgac cactttgtgc ggtcgggaac tggtgaggtt 480 atcactggtg ttgctgatga tgtgcatatt gtacagctag gcaagtacgc agacctgaca 540 cctatcgatg cagtgctgga gaagtacaca cgccgtctgg gtattgtctt catgatggag 600 tcacttgttc 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gaataaataa tgccgactat tgaatcacga 38940 ctgcgtgtaa ctaccgacac acaacagtgt atatctacga tgaacgacat cactaaggtg 39000 agcatttacc ttgatggtga gttgtatcac gtggagtatt ttgaacacga ctggcatgat 39060 cattacgacc cgtcgccata ctctgtgggc tgtgcggcag ttggacgctt cttgaaggag 39120 tggaaaacat gtccagagtt aacttcactt ttggagccga agtatcggaa gataataacc 39180 tcatcctgtg gccaactgac ggtgacagaa tcgctctagt tgatggcgat atgttgccat 39240 acatcatcgg ctataccatc aatgagatga gtgctgtccg tgctgccacc cgtgtgaagt 39300 ctgggcaagt tgagcggatt gaggatacac ctgagtgcaa ggatgcatgt gaccgactga 39360 atgcactctt gaatagctgg gtgtacagtg cgggtgcaga tgcggcacga acgttcatga 39420 cctcatcggc ggataacttc cgtctacgct tggcattctc gaagccatac aaggggacac 39480 gtaaggcaga gaagccgcca ttcttctatg agatgcgtga ccacctcatt aacgtacatg 39540 gtgcaatact ggcacaaggc gatgaggcgg acgacttgat gagcatcgag cagtggaatt 39600 cacacaatct tttcttgaat gaaacaggtg gagagttccg catcggtggc cctgagcacc 39660 gcgcattctc aaacactatc atcgtgtctg ccgataaaga cttgatgatt gtaccgggct 39720 ggcaccttat accgggtaat gatcctgtgt gggtagacat catggggcac cttgagcttc 39780 gacttaaacc taatgggcaa gttaaagacc tcaaaggttc cggcctcaag ttcttctatg 39840 ctcaaatgat tgtaggagac actgtcgata actactcagg cattcccggc cgtggtgcca 39900 agtttgcctt tgacctgctg gatggttgca aggaagagaa ggaattatac atggctgttc 39960 tcggtgcgta tcgtgccaag ttcggcagtg gcgacgtgtt gttgaagaac caccgtggca 40020 ctcataaagt gggtaaggca tttgacctta tgctggagag tgggcgactg gcgcacatgg 40080 cacaattctc tggtgacatc tggcgtgaag gtaagaacca tgtaacgtgg ggagatgatg 40140 acacatggca atcaaactga aagctaaaga agttccagca tacaagctgg agttgatgga 40200 ggcgcagaag aaccgctgcc ctctgtgtgg tggtagcctt aaggcgatca cacctgcaaa 40260 ccgagtgtta gaccacgacc acagtaatgg cttttgccgt gctgttgttt gccgtggctg 40320 caacggggca gaaggtaaag tcctttccgt catctcaggg tacggcaagg ctggcaacag 40380 taagcacaat caaattgagt ggctcaagaa cctgctgaac tattgggtat tgcatcagac 40440 tccacagtca gatcgcatct accatctaca taagtcagca gcagagctgc gggaggcgag 40500 aaatagaaag gctcgcttgg cacacgcacg taaaaaggag gtcaaaggtg ggtaaattac 40560 gaagccttta taaagattca gaagtattag aggcaatcac cctatctacc gacgacaaag 40620 gtaatgttaa ctttaacgag atggctaaaa ccctttcggc tcatgcggtc ggtaagaaga 40680 tcacacgaca gcttgcacgt tattgggctt cgcagtttga ctacgttaag aagaatggtg 40740 agcattatca atctcttctg gtgtcaaacc gcaaggctaa ggaagaacgc aagctccgtg 40800 ctcctaaccg ctatgaggat ctggctactg taccattgcc taagtcgtct aatcatagca 40860 ttctggtaat ccctgacact catgcacctt atgagcatca agatgcgctg gagttcttgg 40920 ctgctgttgc tgctaagttt cgtccagaca ccgtggtgca tcttggcgat gaagcagata 40980 agcacgccat gagcttccat aactccgacc ctaacttgga ttcggctggg atggagcttg 41040 agaaggcacg catctttatg ggcaagttgc acaagatgtt ccctgtcatg cgcctgtgtc 41100 actctaacca cggctcgatg gctttccgta aggctaacgc acatggcatc cctgtccagt 41160 acctgcgcac ctatcgtgaa gtcttcttcc ccggtggtgg cggtgagcgt tgggagtggt 41220 tgcacacaat catccttgac ctacctaacg gtcaacaggt ggcgttcaaa caccaaccag 41280 ctggcggtgt gctgggggat gcagcccatg agcggatgaa tgttgtagca ggtcaccttc 41340 acggaaagat gtctatcgag ttcgcagcta acagcaccga acagtattgg ggtgcgcagg 41400 gcgggtgctt gattgacaac gactcattgg ccttcgccta tgggaaagaa tccaagttca 41460 aacctgcgct tggttgcatg gtgattgtag agggtgtacc tcagattata cctatgcaaa 41520 ctaatcagga tgggcgttgg gtgggttacg tctaagggcg gactatagaa caaaggtcat 41580 cttcgggtgg ccttgattgt atagttaatt actaaggagc gtattatgca taaaagttct 41640 tgtagctaca tgacatccaa ctgtgtagat aagtgtgact gcaaccaagg caacccagat 41700 atcaatgtag gggatattgt ccgtcgcgta cacaatttag gttgcccggt gtgggcggag 41760 ttcttgtata aagaccagcc gaaggtgttc aaggtaacat ccaaaagtga aggcggtcgg 41820 tacgtctcca tcaatgggta tagccaaggt ttcaaccgag agcctttcga gattaacttc 41880 ttcgaaaagt ttgaagtgga gccagttcca ccgtgccaag catgtttgga aaaggatgat 41940 cggtttgggc acacatgtgt acagccgtcc aacacgttgg acaagaagcc agaatacact 42000 ggaggctctg tgaactacta tggcgtgttc gtaagcaagc ccaccagtgg gggtgaacct 42060 taccttgcag agtgtaacga tatcattgaa tcgcttggta tgaactttgc agagggcaac 42120 gccttaaaag cgatttggcg tcgtgctgca catcgcacac taggaaagaa gaaagcaggt 42180 gccagcgatg atggattata cgatgcggag aaggttgtgt ttttcggtca gcgtcttgta 42240 gaacaaagca aggtgaagta atgaatatct tcgagttctt tggtctagat gaagaccacc 42300 gcaaccaccc ggttcaactg gtgaagcacc gtgatgaagt cccagaaagc aagctgactt 42360 tccctgtgta cgcacagatt aagcgcgatg gtatcttcgc tgctgtatgt gtcacgcacg 42420 acacaggcgt caaaggtctg gatggctcca cgactgttgg tatcttcggt cgtactggta 42480 agaaactgat gaatgtggaa gtactagagg aagcattctc caccttccct gttggtgtct 42540 acttcggtga actgcaatct atgacgctgg acatctcact tgagatgtta tctggtgtgg 42600 ttaaccctaa tcgcaccgag ccactaagcg acatagggca gcagttgaag gatggactgt 42660 acatcgactt cttcgacatg atgacagttc aaggcttcat tgagggctat acctctgtga 42720 ccttcactaa gcgacacgct gcacttgagc gccgactcaa aggccacctt catggtttca 42780 attctgtgct tcgaatccac cagtgcaata gcgaaaacga agtacaatcc tttgccgacg 42840 agcaaatcaa gctgggtcgt gaaggtgcgg tgttcaagca ggaagtggat tgggaggcag 42900 gccataaagg ttaccgccag accaagatcg tccgcatgac ctcattcgac cttcgctgca 42960 tcggctggga agagggcaaa ggtaaataca agggtaaggt agccaacctt atcttcaaat 43020 ggaaaggtgg caagaccgta aaggctatgc ttggtaaagg atggacgcat gatgatgcgg 43080 ctaaaatgtt taacgatatc acaatgggtg gctcattgaa cgtcattggt aaaatcttct 43140 gtgtgaaagc actgcaagaa tcttctaagg gcgttttacg actgcccaaa gttggcgagc 43200 ttcgacatga taaggagttc gctgacgtag aataggagac taactatgtc aatcaatgcg 43260 caacatgcgg cacgagccgt agagacagca ggtgctatct ttgagtacct gtcttgtggt 43320 atggacgttc cagtaaactt actggcagat gccgaagagt atggccttag tgttgaggcc 43380 atcaaagaac gtgtggagga actttacggt gacgaagacg aagcctacta ttaaccaagc 43440 agggatggac atgctggaga atatgattct caagccagca cctgcaaagc agggaaaggg 43500 gcatgatgag ctggtgtggg atgaagcaaa gcgttacatc ctagcttgca tctaccagca 43560 atttcaggtg caacaatgat tctgcgtgag gccacatact tcgatgtgcc tgagctgcta 43620 cgctctatgt cagactacat ggattcagag gttaagccac aaggccacca ctgtgacgag 43680 tggagtcctg agctggcagc acacaacctg atgtgctcca tcaaaaaccc aacagaaacc 43740 gtcacattgg cgattgagga tgggagactg gtagggtaca tatgggctgc tgcacaccaa 43800 cttgggccgt ggtcgcacac acttgtttca tctgactatc tcttctatgt acaccctgac 43860 tatcgtggct ctcttgctgc gtatcgtcta atgaaggcat acaaactgtg ggctgtagag 43920 ttggggtgta aagaagtacg gttgtctgta gcatcaggca tccacccaga gcgtacaggt 43980 aaactctatg aacgcatggg ctttaccttg ttcgccttaa cttacaacta cgtcaacagg 44040 agtgaacatg ggagcaatta aaaaggtagt taagaaggca actggtgccg ttagtggtgt 44100 tgtcaaaggt gtgactggta tgcttggcct tggtggtcag gacatcaaca tgcctgagat 44160 taagacacca gcacagcagc ttgcccgtga gtcagaggtc ggcgcagaag atattcagtc 44220 tggcgttgat gatgaatctg ggattgccgc taaaggcaaa cgcgcacttc ttcgccctgc 44280 atctacatct agcttaggtg ggatgcgatg aagataccgg ggcgtaaccg ttcaaagatt 44340 cccaaactct gggagaagct gagccgggaa cgtaacgagt tcttagaccg agccaagcgc 44400 tatgctatgc tgacactgcc ttaccttgtc gcggacaagg gagaacagaa cggctcgcag 44460 aatggatggc aaggtgtagg tgcacaatct gtgaaccact tggctaacaa gctggcgcag 44520 gtaatgttcc cccctcaacg ttcgttcttt cgtattgacc ttactacgaa aggtgaagct 44580 gccataatgg aggctggtta caagaagact gagctggctt ccttgtttgc agtggtagaa 44640 gctcaggcca tgaaagcact tgatgcacgc cagttccgcc cttctatggt ggaggcgttc 44700 aagcacctgc tggttgcagg gactacaatg ctgttcaagc ctaagactgg ctccattcag 44760 44760

Claims

펙토박테리움 카로토보룸 아종 카로토보룸 (Pectobacterium carotovorum subsp. carotovorum) Pcc4, 펙토박테리움 카로토보룸 아종 카로토보룸 (Pectobacterium carotovorum subsp. carotovorum) Pcc13, 펙토박테리움 카로토보룸 아종 카로토보룸 (Pectobacterium carotovorum subsp. carotovorum) Pcc14, 펙토박테리움 카로토보룸 아종 카로토보룸 (Pectobacterium carotovorum subsp. carotovorum) Pcc15를 포함하는 펙토박테리움 카로토보룸 아종 카로토보룸 (Pectobacterium carotovorum subsp. carotovorum)과 펙토박테리움 카로토보룸 아종 브라질리언시스 (Pectobacterium carotovorum subsp. brasiliensis)에 대해 숙주감수성을 나타내는 펙토박테리움 파지 (Pectobacterium phage) POP72 (KACC 97028P).
펙토박테리움 파지 (Pectobacterium phage) POP72 (KACC 97028P)을 포함하며,
펙토박테리움 카로토보룸 아종 카로토보룸 (Pectobacterium carotovorum subsp. carotovorum) Pcc4, 펙토박테리움 카로토보룸 아종 카로토보룸 (Pectobacterium carotovorum subsp. carotovorum) Pcc13, 펙토박테리움 카로토보룸 아종 카로토보룸 (Pectobacterium carotovorum subsp. carotovorum) Pcc14, 펙토박테리움 카로토보룸 아종 카로토보룸 (Pectobacterium carotovorum subsp. carotovorum) Pcc15를 포함하는 펙토박테리움 카로토보룸 아종 카로토보룸 (Pectobacterium carotovorum subsp. carotovorum)과 펙토박테리움 카로토보룸 아종 브라질리언시스 (Pectobacterium carotovorum subsp. brasiliensis)에 의해 유발되는 식물 무름병을 방제하기 위한 식물 무름병 방제용 조성물.
삭제
제2항에 있어서,
상기 방제용 조성물은,
농약인 것을 특징으로 하는 식물 무름병 방제용 조성물.
펙토박테리움 파지 (Pectobacterium phage) POP72 (KACC 97028P)을 포함하는 것을 특징으로 하는 펙토박테리움 카로토보룸 아종 카로토보룸 (Pectobacterium carotovorum subsp. carotovorum) Pcc4, 펙토박테리움 카로토보룸 아종 카로토보룸 (Pectobacterium carotovorum subsp. carotovorum) Pcc13, 펙토박테리움 카로토보룸 아종 카로토보룸 (Pectobacterium carotovorum subsp. carotovorum) Pcc14, 펙토박테리움 카로토보룸 아종 카로토보룸 (Pectobacterium carotovorum subsp. carotovorum) Pcc15를 포함하는 펙토박테리움 카로토보룸 아종 카로토보룸 (Pectobacterium carotovorum subsp. carotovorum)과 펙토박테리움 카로토보룸 아종 브라질리언시스 (Pectobacterium carotovorum subsp. brasiliensis) 증식억제용 또는 사멸용 조성물.
펙토박테리움 카로토보룸 아종 카로토보룸 (Pectobacterium carotovorum subsp. carotovorum) Pcc4, 펙토박테리움 카로토보룸 아종 카로토보룸 (Pectobacterium carotovorum subsp. carotovorum) Pcc13, 펙토박테리움 카로토보룸 아종 카로토보룸 (Pectobacterium carotovorum subsp. carotovorum) Pcc14, 펙토박테리움 카로토보룸 아종 카로토보룸 (Pectobacterium carotovorum subsp. carotovorum) Pcc15를 포함하는 펙토박테리움 카로토보룸 아종 카로토보룸 (Pectobacterium carotovorum subsp. carotovorum)과 펙토박테리움 카로토보룸 아종 브라질리언시스 (Pectobacterium carotovorum subsp. brasiliensis)에 대해 숙주감수성을 나타내는 펙토박테리움 파지 (Pectobacterium phage) POP72 (KACC 97028P)가 처리된 식물.
제6항에 있어서,
상기 식물은,
펙토박테리움 파지 (Pectobacterium phage) POP72 (KACC 97028P)가 식물의 잎 또는 줄기에 뿌려진 것을 특징으로 하는 식물.
제6항에 있어서,
상기 식물은,
채소, 과일 및 화훼 중 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 식물.
제7항에 있어서,
상기 식물은,
수확 후, 유통 중인 것을 특징으로 하는 식물.