KR20080003084A

KR20080003084A - 배추 무름병 방제 효과를 가지는 비병원성 균주 어위니아카로토보라 93 및 배양법

Info

Publication number: KR20080003084A
Application number: KR1020060061622A
Authority: KR
Inventors: 차재순; 신윤주; 백기엽
Original assignee: 충청북도
Priority date: 2006-06-30
Filing date: 2006-06-30
Publication date: 2008-01-07

Abstract

본 발명은 배추 무름병에 대하여 방제 효과를 가지는 비병원성 균주 및 그 배양법에 관한 것으로, 배추에서 발병하는 무름병원균을 분리하여 박테리오신의 생산을 확인한 후, 박테리오신 활성이 높은 균주를 선발하여 병원성 상실이 유도된 돌연변이를 통해 비병원화한 균주가 무름병 방제에 효과가 있음을 확인하고 배양과정에서 염의 농도를 높여 건조과정에서 생존율을 높인 배양법에 관한 것이다.

무름병, 비병원성 균주, 방제효과, 배양법

Description

배추 무름병 방제 효과를 가지는 비병원성 균주 어위니아 카로토보라 93 및 배양법 {Nonpathogenic Strain Erwinia carotovara 93 Having a Effect of Protecion of Bacterial Soft Rot Disesase of Chinese Cabbage and Method of Culture Thereof}

도 1은 분리된 균들의 박테리오신 조절 유전자에 특이적인 프라이머로 중합효소 연쇄반응 수행 후, 전기 영동한 결과를 나타내는 사진이다.

도 2는 비병원성 돌연변이체에서 무름병균자 병원성 인자인 폴리갈락트로나제, 펙테이트 리아제, 셀루라제 및 프로테아제의 효소 활성 실험 결과를 나타내는 사진이다.

도 3은 비병원성 돌연변이체의 병원성 검정 실험 결과를 나타내는 사진이다.

도 4는 본 발명의 어위니아 카로토보라 93 균주의 배추 중륵의 침 접종법에 의하여 무름병에 대한 방제효과를 나타내는 사진이다.

도 5는 본 발명의 어위니아 카로토보라 93 균주의 온실에서의 미네랄 접종법에 의 하여 무름병에 대한 방제효과를 나타내는 사진이다.

세균성 무름병은 채소재배에서 가장 문제가 되는 병으로서 신선한 저장기관을 형성하는 거의 모든 채소, 과채류, 감자, 구근등 약 50종의 식물에서 발견되고 있으며, 재배기간 중에는 물론 수확물의 수송도중 또는 저장 중에도 큰 피해를 초래하는 병이다. 배추에서는 잎, 줄기, 뿌리에 발생하는데 상처부위에서 처음 시작하여 좌우상하로 발전하며, 마지막에는 조직이 크림처럼 변하여 악취를 발산하고 배추의 일부 또는 전체가 시들어 죽게 한다. 배추 무름병은 우리나라 배추에서 매년 발생하여 큰 피해를 주고 있으며, 특히 여름철 배추 생산에 가장 큰 제한요인 중 하나이다.

배추 무름병은 피해가 매우 심하지만 방제는 매우 어렵다. 무름병을 일으키는 병원균 어위니아 카로토보라(Erwinia carotovora subsp. carotovara , Ecc)가 토양속에서 상당히 오랫동안 생존이 가능하고, 화학농약의 방제효과가 매우 낮고, 또한 배추에서 이 병에 대한 저항성 품종이 없기 때문이다. 현재 이 병의 방제를 위한 농약으로 스트렙토마이신(streptomycin: 농용신수화제)과 옥쏘리닉산(oxolinic acid: 일품)이 농약으로 등록되어 있으나, 여름철 배추 및 배추 포장에서 병원균의 밀도가 높아지게 되면 이들의 방제효과는 매우 낮아지게 된다. 또한 식물병 방제를 위해 사용하는 항생제 또는 화학물질은 농업생태계에서 항생제 저항성의 유발, 환경에 대한 오염 및 잔류독성의 문제 때문에 선진국을 중심으로 1980년대 이후 환경친화적인 미생물 농약의 개발에 몰두하게 되었다.

특히, 이러한 미생물 농약을 이용한 방제법은 환경에 대해 안전하고, 사람과 가축에 대한 독성이 거의 없으며, 일반적으로 이미 자연계에 널리 존재하는 미생물을 이용하기 때문에 농약사용에 대한 거부감 및 자연생태계의 변이 등을 최소화할 수 있는 장점이 있다.

박테리오신은 근연 관계의 세균을 특이적으로 억제하는 항균성 단백질로, 단백질 합성을 저해하며 DNA의 안정성을 파괴, 세포막을 교란시켜 그 대상 균을 용균시킨다. 어위니아 카로토보라(Ecc)가 생산하는 박테리오신은 박테리오파지와 유사한 구조를 가졌으며, 고분자 박테리오신은 넓은 생장저지환을 형성하고 저분자 박테리오 신은 좁은 생장저지환을 형성하는 두 가지 형태가 있다. 박테리오신은 세균의 동정, 생물적 방제, 식품 방부제 등에 사용되고 있는데, 아그로박테리움 라디오박터 84(Agrobacterium radiobacter strain 84)가 생산하는 agrocin 84를 이용해 많은 식물 종의 뿌리혹병의 효과적인 생물적 방제제로 사용되는 것을 그 예로 들 수 있다. 박테리오신의 대상 세균은 동종이나 근연 관계에 있기 때문에 다른 유익한 미생물을 사멸시키지 않고 병원세균만을 죽일 수 있다.

현재까지 전 세계적으로 실용화된 방제용 미생물은 50여종 이상이 되며, 이 외에도 현재 많은 미생물을 이용한 미생물 농약이 실용화 단계에 있어 이 분야의 연구 및 산업화가 급속도로 이루어지고 있다.

한편, 식물 병원세균에서 밀도감지신호(quorum sensing signal) 물질인 호모세린락톤(homoserine lactone)을 분해하는 효소(lactonase)를 미생물로부터 분리하여 감자와 담배에 형질전환시키면 밀도감지신호에 의해 병원성인자가 유도되는 병원세균이 일으키는 무름병에 저항성이 유발된다는 것이 보고되었다(한국특허출원 10-2003-7002587).

무름병에 대한 방제용 미생물에 대해서는 바실러스 속(Bacillus sp.) GENO-100 세균이 무름병을 일으키는 어위니아 카로토보라(Erwinia carotovora) 세균에 대해 항균활성을 갖는 것에 대한 특허가 출원된바 있으나(한국공개특허 2002-0064386), 실 제 작물의 방제에 적용한 예는 보고된 바가 없다.

또한 한국특허등록 제10-0580336 호에는 배추 세균성 무름병 방제효과를 가지는 신규 바실러스 속 미생물이 개시되어 있으나, 비병원성의 성질을 가지고 있지는 않다.

이에 본 발명자들은 배추의 무름병에 방제 효과가 있는 미생물을 찾기 위하여 연구하던 중, 무름병원균을 분리하여 박테리오신의 생산을 확인한 후, 박테리오신 활성이 높은 균주를 선발하여 병원성 상실이 유도된 돌연변이를 통해 비병원화한 균주가 무름병 방제에 효과가 있다는 것을 확인하고 본 발명을 완성하게 되었다.

결국, 본 발명의 주된 목적은 배추 무름병에 대하여 방제효과를 가지는 비병원성 균주를 제공하는 것이다.

또한 본 발명의 목적은 상기 비병원성 균주의 효과적인 배양법을 제공하는 것이다.

또한 본 발명의 다른 목적은 상기 균주를 이용한 배추 무름병의 방제 방법을 제공하는 것이다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 배추 무름병에 대하여 방제효과를 가지는 비병원성 균주 어위니아 카로토보라 93 (Erwinia carotovora 93)을 제공한다.

또한, 본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여, 그람 음성균의 경우 건조과정에서 생존력 확보가 매우 어려운데 배양과정에서 염의 농도를 높여 건조과정에서 생존율을 올리는 배양법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 균주를 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 배추 무름병 방제용 미생물 농약을 제공한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

재배지 토양과 병든 배추 식물체를 수집하여 병원균을 분리하여 지방산 분류에 의한 미생물 동정법(MIDI)을 이용하여 분리균을 동정하였다.

분리균의 상징액을 지시균주를 함유한 영양배지에 점적해 지시균주 세포의 용균현상을 통해 분리균의 박테리오신 생성을 확인하였다. 분리균중 Ecc로 동정된 94개 균주의 박테리오신 생성을 확인한 결과 모든 균주가 박테리오신을 생성하는 것으로 나타났다. Ecc에서 박테리오신 생성을 조절하는 유전자로 보고된 brg 유전자를 증폭하는 프라이머를 이용하여 중합효소 연쇄반응을 시행한 결과 83번 균주를 제외한 Ecc로 동정된 모든 균에서 예상했던 430 bp의 DNA가 증폭되었다. MIDI 동정 결과 Ecc가 아닌 것으로 동정된 균주도 중합효소 연쇄반응을 시행하였는데 430 bp의 DNA가 증폭되지 않았다.

비병원성 무름병균 선발 실험을 위하여, 박테리오신 활성이 좋은 6개 균주를 선장하여 이들 균주에 돌연변이원 에탄 메틸 썰포네이트(EMS)를 처리하고 펙틴 분해 효소 검정용 배지에서 펙틴 분해 효소 활성이 감소한 8개의 돌연변이체를 선발하였다. 선발한 돌연변이체를 배추의 중륵에 침 접종하여 병원성 검정을 하였고, 병원성이 감소하거나 병원성을 상실한 8개 균을 선발하였다. 선발한 비병원성 돌연변이체들의 세균 상징액을 얻어 Ecc의 병원성인자로 알려진 폴리갈락트로나제, 펙테이트 리아제, 셀루라제 및 프로테아제의 생성을 확인하였다. 이들 4개의 효소의 생성 정도를 조사하여 효소 활성이 가장 크게 감소한 Ecc 93을 최종 선발하였다. 상기 균주를 한국 농용미생물 보존센터에 2003년 12월 09일에 기탁하였다(기탁번호: KACC 91087).

본 발명의 실시예에서는 Ecc 93이 Ecc 9의 돌연변이체로써 Ecc 9-3으로 실시되어 도면 설명시 Ecc 93과 Ecc 9-3이 동일한 균주임을 말한다.

바실러스(Bacillus) 속 균은 전 세계적으로 가장 많이 사용되는 미생물 농약제의 주성분인데, 바실러스 속 균이 다른 미생물에 비해 상대적으로 쉽게 미생물 농약으로 개발될 수 있는 가장 큰 이유는 그 균의 생존력이 매우 우수하기 때문이다. 이 에 반해 그람 음성균은 생존력 확보가 어려워 극히 일부의 그람 음성균만이 미생물농약 또는 미생물제제로 개발되어 있으며, 또한 세균의 분말형태 제제를 만들기 위해서는 배양 후 건조과정에서의 높은 생존율 확보가 필수적이기 때문에, 본 연구에서는 그람 음성균인 Ecc 93의 생존력을 확보하고자 하였다. 이에, 생존율을 높이기 위한 유도물질의 사용 없이 배양배지의 염의 농도를 조절하여 세균의 건조과정에서 생존력을 높이는 원리를 적용하였다.

이하, 실시 예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 이들 실시예에 의하여 본 발명의 범위가 국한되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 기술분야 및 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시예 1. 배추 무름병균 분리

(1-1)배추 무름병원균 분리

강원도, 경상북도, 충청북도의 배추, 감자, 양배추, 무의 재배지에서 2002년 6월에서 8월까지 재배지 토양과 병든 식물체를 수집하였다. 토양 채취는 한 포장 에서 임의적으로 3지점을 정해 배추 근권의 토양을 약 300 g정도를 비닐 봉투에 담아 채취하였고, 식물체는 병이 진행되고 있는 부분을 칼로 절단해 비닐 봉투에 담고, 수집한 토양과 병든 식물체는 저온실(4℃)에 보관하여 실험에 사용하였다.

토양 5 g과 병든 식물체의 이병부와 건전부의 경계부를 각각 50 ㎖의 증류수에 넣고 30분간 상온에서 150~200 rpm으로 진탕하였다. 상기 현탁액을 농화배지(Polypectate enrichme nt medium: sodium polypectate 1.5 g, 10% (NH₄)SO₄ 10 ㎖, 10% K₂HPO₄ 10 ㎖, 5% MgSO₄·7H₂O 5 ㎖)에 100 ㎕를 넣고 28℃에서 200 rpm으로 3~5일 동안 진탕 배양한 후, 배양액을 선택배지인 CVP (Crystal violet pectate: 1 N NaOH 4.5 ㎖, 10% CaCl₂·2H₂O 3 ㎖, NaNO₃ 1 g, sodium polypectate 10 g, 10% SDS 0.5 ㎖, 0.075% crystal violet 1 ㎖, agar 1.5 g)에 48시간 배양하였다. 그 결과 CVP 배지에서 주위가 말갛고 움푹 들어간 콜로니(colony)를 확인할 수 있었으며 이러한 콜로니를 골라서 영양배지(Bacto-peptone 5 g, yeast extract 2 g, beef extract 3 g, agar 17 g) 에서 순수 분리하였다.

병원균의 병원성 검정을 하기 위하여, 배추를 70% 에탄올(ethanol)에 담구어 표면 살균을 한 후 멸균한 칼로 배추의 중륵을 약 5× 5 cm로 절단한 후 멸균한 이쑤시개에 상기 분리균을 묻혀 점 접종한 후 습실 처리를 위해 종이 타올(paper towel)을 바닥에 깔은 후 멸균수를 부어 충분히 적시었다. 28℃ 배양기에서 24시간 배양한 후 접종부위에 무름 증상이 나타난 것을 무름병균으로 분리하였다.

그 결과, 무름병균은 강원도에서 60개, 경북에서 43개, 충북에서 2개 균주로 총 105개 균주를 분리하였다. 105개 균주 중 43개 균주가 배추 재배지 토양에서 분리되었고, 62개는 병든 식물체로부터 분리되었는데 배추에서 52개, 무에서 7개, 양배추에서 1개, 감자에서 2개 균주가 각각 분리되었다.

(1-2) MIDI 법을 이용한 분리균의 동정

MIDI법에 의한 분리균의 동정은 밀러(Miller, 1982)의 방법에 따라 수행하였다. 분리된 무름병균을 트립티카제 소이 아가(Trypticase Soy Agar, TSA)배지에서 배양하여, 배양된 세균을 40 mg정도 채취한 후 지질의 비누화 반응을 위하여 시약 Ⅰ (NaOH 45 g, methanol 150 ㎖, 증류수 150 ㎖) 1 ㎖를 첨가하고 완전히 혼합하여 100℃에서 25분간 반응시켰다. 찬물에 급냉시키고 시약Ⅱ (6 N HCl 325 ㎖, methanol 275 ㎖)를 2 ㎖씩 첨가하여 혼합하고 80℃에서 10분간 반응시켜 메틸화하였다. 다시 찬물에 급냉시키고 추출용매(hexane : methyl-tert-butyether = 1 : 1, v/v)를 1.25 ㎖ 첨가하고 10분간 부드럽게 진탕하였다. 분리된 층에서 아래층 부분을 제거하고, 시약Ⅳ (NaOH 10.8 g, 3차 증류수 900 ㎖)를 3 ㎖씩 첨가하고 5분 동안 부드럽게 섞어준 후 층이 완전히 분리될 때까지 방치하였다. 층이 완전히 분리되면 아래층 액이 섞이지 않도록 상징액만을 GC 분석용 병으로 옮겼다. 지방산 분은 MIDI Library version TABA 3.90과 Libary Generation system software version 3.90을 이용하여 분석하였다.

MIDI 분석 결과, 본 연구에서 분리한 105개 균주 중 94개의 균주가 Ecc와 가장 유 사도가 가장 높아서 Ecc로 동정되었으며 또한, 8개 균주는 무름병을 일으키는 슈도모나스 종(Pseudomonas spp.)으로 동정되었다. 3개 균주는 MIDI에 의해 동정되지 않았다.

실시예 2. 박테리오신 특성 분석

(2-1)박테리오신 검정

분리균의 상징액을 지시(indicator) 균주를 함유한 영양배지에 점적해 indicator 균주 세포의 용균현상을 통해 분리균의 박테리오신 생성을 확인하였다.

영양배지에서 세균을 28℃에서 12~16시간 배양한 후, L-브로스(L-broth: Bacto-trypton 10 g, yeast extract 5 g, NaCl 10 g, pH 7.0)에 접종하여 28℃에서 12~16시간 200 rpm으로 진탕 배양했다. 세균 배양액을 M9 broth (NaH₂PO₄ 7 g, KH₂PO₄ 3 g, NH₄Cl 1 g, NaCl 0.5 g, 0.1mM Cacl₂, 1 mM MgSO₄, 3 M FeCl₃, 0.2% glucose·casein acid hydrate)에 30배 희석하여 28℃에서 5~6시간 200 rpm으로 진탕 배양하고, 최종 농도가 0.2 ㎍/㎖가 되게 마이토마이신 C (mitomycin C)를 첨가한 후 28℃에서 6시간 200 rpm 진탕 배양하였다. 세균 배양액을 4℃에서 10,000 g로 10분 동안 원심분리를 하고 상징액을 얻어 M9 buffer (NaH₂PO₄ 7 g, KH₂PO₄ 3 g, NH₄Cl 1 g, NaCl 0.5 g, 0.1 mM Cacl₂, 1 mM MgSO₄, 3 M FeCl₃ )에 2배 희석하고 4℃에 보관 하여 실험에 사용하였다.

세균배양접시(Petri dish)에 감수성 균주의 현탁액을 넣은 0.35%의 소프트 아가 배지(2× 10⁷cfu/ ㎖)를 부은 후, 상기 상징액을 10 ㎕씩 점적하고 28℃에서 8~12시간 배양한 후 생장저지환을 관찰하였다.

분리균 중 Ecc로 동정된 94개 균주의 박테리오신 생성을 확인한 결과 모든 균주가 박테리오신을 생성하는 것으로 나타났다. 실험결과를 보면 감수성이 가장 낮은 균주는 9개 균주, 가장 높은 균주는 59개 균주의 박테리오신에 대해 감수성을 보였다. 그리고 박테리오신 활성이 가장 높은 균주는 61개 균주에 활성을 보였으며, 가장 낮은 균주는 3개 균주에 대해 활성을 보였다. 각 균주의 박테리오신 생성 능력과 박테리오신의 감수성은 균주마다 다양한 결과를 보여주었다.

(2-1)박테리오신 조절 유전자 확인

모든 분리균으로부터 전체 DNA를 DNeasy kit(Qiagen)를 사용해 분리하였다.

박테리오신 조절 유전자에 특이적인 프라이머(DY-R1: TGGTGAATTGACAATACG, DY-F1: TTGTAGTGCATAGGTTGG)를 사용하여 94℃에서 1분간 변성시킨 다음, 54℃에서 1분, 그리고 72℃에서 1분간을 35회 반복하여 중합효소 연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR)을 수행하고 1.5% 아가로오스 겔을 이용해 전기 영동하여 증폭산물 을 확인하였다.

Ecc에서 박테리오신 생성을 조절하는 유전자로 보고된 brg 유전자를 증폭하는 프라이머를 이용하여 PCR을 시행한 결과 83번 균주를 제외한 Ecc로 동정된 모든 균에서 예상했던 430 bp의 DNA가 증폭되었다(도 1). MIDI 동정 결과, Ecc가 아닌 것으로 동정된 균주도 PCR을 시행하였는데 430 bp의 DNA가 증폭되지 않았다.

실시예 3. 비병원성 돌연변이체 제조

(3-1) 비병원성 돌연변이체 유도 및 선발

박테리오신 검정을 통해 선발한 균주의 비병원성 돌연변이체 유도는 Ma(1993)의 방법에 따라 수행하였다. 박테리오신 활성이 좋은 균주의 세균 배양액 2.5 ㎖를 2% 에탄 메틸 썰포네이트(Ethane Methyl Sulfonate, EMS) 0.1 ㎖를 첨가한 2.5 ㎖ L-broth와 혼합한 후 100분 동안 진탕 배양하고, 배양액의 0.5 ㎖를 10 ㎖ 페니실린 G 배지(NaNO₃ 1 g, K₂HPO₄ 4 g, MgSO₄·7H₂O 0.2 g, sodium polypectate 5 g, Penicillin G 200 g/㎖, pH7.0)에 첨가한 후 28℃에서 6시간 동안 200 rpm으로 진탕 배양하였다. 상기 배양액을 PG· PM 배지(sodium polypectate 5 g, pectin 5 g, 50 mM sodium phosphate buffer, pH 6.0)에 리플리카 플레이팅(replica plating)하여 배양한 후, 배지 위에 5 N 황산(H₂SO₄ ₎을 부어 투명환을 관찰해 투명환이 관찰되 지 않는 콜로니를 순수 배양하였다.

(3-2) 비병원성 돌연변이체의 효소 활성 검정

효소 활성 검정은 차터지(Chatterjee, 1995)의 방법에 준하였다.

비병원성 돌연변이체를 무름병균자 병원성 인자인 폴리갈락트로나제(1% sodium polypectate, 1% yeast extract, 2.5 mM EDTA, 50 mM sodium acetate, pH5.5), 펙테이트 리아제(1% sodium polypectate, 1% yeast extract, 50 M CaCl₂, 50mM Tris-HCl, pH8.5), 셀루라제(0.1% carboxy- methyl cellulose, 50mM sodium phosphate pH7.0) 및 프로테아제(3% gelatin, 1% nutrient broth) 배지에서 배양하였다. 폴리갈락트로나제와 펙테이트 리아제의 활성은 배지 위에 5 N 황산을 부어 관찰했고, 셀룰라제 활성은 배지 위에 0.1% 콩고 레드(congo red)로 염색하고 1 M 염화나트륨으로 여러 번 씻어낸 후 관찰했으며, 프로테아제 활성은 아무런 처리 없이 바로 관찰하였다.

그 결과 이들 4개의 효소의 생성 정도에서 효소 활성이 가장 크게 감소한 93을 최종 선발하였다. 모균주인 9번 균주는 4가지의 효소를 모두 생성 하였지만 돌연변이체인 93은 셀루라제와 폴리갈락트로나제는 생성하지 못하였으며, 펙테이트 리아제은 모균주에 비해 크게 감소하였다. 그러나 프로테아제의 생성은 모균주와 동일하였다(도 2).

(3-3) 비병원성 무름병균의 병원성 검정

분리한 비병원성 무름병균의 병원성을 검정하였다. 비병원성 돌연변이체의 현탁액 8 ㎖를 미네랄 오일 2 ㎖와 혼합해 10 ㎖를 온실에서 키운 6~8 엽기의 배추 중앙 기부에 관주접종 했으며, 대조구로 돌연변이체의 모균주를 동일한 방법으로 접종하였다. 각 처리 당 배추는 30 주씩 사용하였으며 접종 4일 후 결과를 관찰하였다.

그 결과, 온실에서 접종 결과 모균주인 9번 균주는 접종한 모든 배추에 병을 일으켰으나 93균주는 전혀 병을 일으키지 않았다(도 3).

상기 비병원성 균주 어위니아 카로토보라 93균주(Erwinia carotovora 93)를 한국 농용미생물 보존센터에 2003년 12월 09일에 기탁하였다(KACC 91087).

실시예 4. 비병원성 Ecc 93의 방제 효과

분리한 비병원성 Ecc 93의 무름병 억제력을 검정하기 위해 실험실, 온실, 그리고 포장에서 억제력 검정을 하였다.

(4-1) 실내 검정

시중에 판매되고 있는 배추를 이용하여 비병원성 Ecc 93균주의 배추 무름병 억제력 을 검정하기 위한 접종 실험을 수행하였다.

배추 중륵에 이쑤시개로 상처를 낸 후 비병원성 Ecc 93(10 ⁸cells/㎖) 현탁액과 병원균 Ecc 35, 33(10⁴cells/㎖) 현탁액을 50 ㎕씩 혼합 접종하였다. 병원균 단독 접종 했을 때는 배추에 병반이 형성되었지만 93 현탁액과 Ecc 33, 35번 현탁액과 혼합 접종 했을 때는 거의 병반이 형성되지 않았다(도 4).

(4-2) 온실 검정

샛노랑 배추 종자를 파종하여 발아한 유묘를 직경 15 cm의 비닐 포트에 옮겨 심어 유리 온실에서 키워 6~8엽기의 배추를 사용하여 미네랄오일 접종법에 의해 병 방제효과를 검정하였다.

93(10⁸cfu/㎖) 현탁액 4 ㎖와 35(2× 10⁴cfu/㎖) 각각의 현탁액 4 ㎖와 멸균한 미네랄 오일(heavy white oil, Sigma) 2 ㎖을 혼합하여 6-8엽기 배추의 중앙에 관주 접종하였다. 대조로는 35 현탁액(10⁴cfu/㎖) 8 ㎖와 미네랄 오일 2 ㎖를 혼합하여 접종하였다.

실험결과 Ecc 35번을 단독접종 한 배추에서는 접종 4일 후에는 전체의 61% 배추에 서 무름병이 발생하였고 6일 후에는 병 발생이 증가 하여 90% 발생하였고, 35번 균주와 93균주를 혼합접종 한 처리에서는 4일 후에는 병이 전혀 발생하지 않았으며(그림 9) 6일 후에 25%의 배추에 병이 발생하였다.

(4-3) 포장 검정

여름 배추의 주요 생산지인 강원도 배추 포장에서 CR산촌 품종을 사용하여 무름병 억제 효과 검정 시험을 실시하였으며 온실에서 30일간 육묘된 유묘를 해발 720 m의 고랭지에 위치한 포장에 정식하여 일반 관행 재배 방법으로 경작하였다.

처리구는 비병원성 Ecc 93 동결 건조물(10⁵-10⁶cfu/g), 바이오키퍼(Biokeeper), 엑소리닉 에시드(oxolinic acid)는 1,000배, 스트렙토마이신(streptomycin)은 800배 희석해 사용하였고 무처리를 대조구로 사용하였다. 처리 시기는 14일간 발병 초 7일 간격으로 3회 살포하였다. 시험구 배치는 난괴법 3회 반복으로 배치하였다.

조사 항목으로 발병도 조사하였고, 실험구에서 총 20주를 2회 조사하였다.

무름병의 단계별 발병 정도 조사 기준(발병도)은 육안 조사를 통해 0 = 무발병, 1 = 외엽의 외부가 발병, 2 = 외엽에 발병하고 결구엽의 일부가 발병, 3 = 결구엽의 대부분 발병 등 4단계로 나누어 조사한 후 백분율로 환산하였다.

[표 1] 발병율

시험약제	발병도(%)				유의차 (DMRT)	방제가 (%)
시험약제	Ⅰ 반복	Ⅱ 반복	Ⅲ 반복	평균	유의차 (DMRT)	방제가 (%)
무처리	28.3	19.22	29.2	25.6	b	-
Ecc 93	13.3	6.7	18.3	12.8	a	50.0
Biokeeper	10.0	8.33	17.5	11.9	a	53.5
스트렙토마이신	6.7	20.8	5.0	10.8	a	57.8
옥소리닉에시드	11.7	8.3	13.3	11.1	a	56.6

7일 간격으로 2회 처리 7일 후 발병도를 조사한 결과 비병원성 Ecc 93은 50.0%, 대조약제인 는 각각 53.5, 57.8, 56.6% 의 방제가를 나타냈으며 이들 모두 무처리 대조구와 통계적으로 유의성 있는 방제 효과를 나타내었다(표 1).

실시예 5. 생존율 확보 실험

Ecc 93균을 0, 0.3M, 0.5M, 0.7M 염화나트륨을 함유한 GB배지에 24시간 배양 후 원심분리를 통해 수확한 후 5%의 스킴 밀크 용액으로 현탁하고 미네랄 캐리어(mineral carrier)로 0.2 g의 벤토나이트(bentonite)를 넣어 잘 섞은 후 액체질소에서 동결시켜 동결건조기로 건조하거나 스피드 백(speed vac)에 넣고 상온에서 감압 건조시켰다. 건조 후 회수한 무게를 측정하고, 그 중 소량을 10배 희석법으로 생균수를 조사하여 건조물 내의 생균수를 측정하였다(표 2).

[표 2]

염 농도(M)	배양 후 생균수 (CFU)	동결건조 후 생균수 (CFU)	생존율 (%)	상온 감압건조 후 생균수(CFU)	생존율 (%)
0	4.4 x 10¹¹	<10⁷	<0	1.7 x 10⁹	0.39
0.3	3.6 x 10¹¹	2.4 x 10⁸	0.07	1.8 x 10⁹	0.5
0.5	2.5 x 10¹¹	1.3 x 10⁹	0.52	4.6 x 10⁹	1.84
0.7	2.7 x 10¹¹	1.5 x 10⁹	0.56	2.5 x 10⁹	0.93

동결건조에서는 염을 첨가하지 않고 배양한 세균의 생존은 매우 낮았고, 0.5 M과 0.7 M의 염농도에서 배양한 세균은 생존율이 유사하였다. 상온에서 감압에 의한 건조에서는 0.5 M의 염농도에서 배양한 세균의 생존율이 가장 높았으며, 염을 넣지 않는 배지에서 배양한 세균의 생존율은 낮았지만 상당히 높은 수준을 유지하였다. 이 결과는 높은 염농도에 의해 유도되는 생리적 변화가 동결과정에서 세균의 생존에 중요한 역할을 하는 것을 의미한다. 또한 동결건조를 하지 않고 상온건조를 통해서도 상대적으로 높은 생존율을 유지할 수 있음을 의미한다. 상온 건조의 경우 0.5 M의 염 농도에서 배양한 세균의 생존율이 염농도가 낮은 배지에서 배양한 세균보다 약 5배 높은 것으로 나타났다.

이상에서 살펴본 바와 같이, 본 발명은 배추 무름병원균을 분리하여 비병원화한 균주가 무름병 방제에 효과가 있음을 확인하고 배양과정에서 염의 농도를 높여 건조 과정에서의 생존율이 증대함을 확인하였다. 본 발명의 Ecc 93균주 및 배양법을 이용하여 경제적이고 효과적인 배추 무름병 방제를 위한 미생물 농약의 개발에 유용하게 활용될 수 있다.

Claims

배추 무름병 방제 효과가 있는 비병원성 어위니아 카로토보라 93(Erwinia carotovora 93) 균주(기탁번호:KACC 91087).
제 1항의 어위니아 카로토보라 93균주를 이용하는 것을 특징으로 하는 배추 무름병의 방제 방법.
제 1항의 어위니아 카로토보라 93균주를 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 식물 무름병 방재용 미생물 농약.
제 1항의 어위니아 카로토보라 93균주의 분말형태 제제시 염의 농도를 조절하여 건조과정에서 생존율을 증가시키는 배양방법.
제 4항의 배양방법으로 배양되어 건조과정에서 생존율이 증가된 균주로부터 제조되는 미생물 농약.