KR102553935B1 - 단백질을 발현하는 세포의 배양 방법 - Google Patents

단백질을 발현하는 세포의 배양 방법 Download PDF

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Abstract

서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열로 표시되는 폴리펩타이드 또는 이와 75% 이상 서열 상동성을 갖는 폴리펩타이드인 목적 단백질을 발현하는 세포주의 배양 방법으로서, 상기 단백질을 발현하는 세포주를 배양하는 단계를 포함하며, 상기 세포주를 배양하는 단계는 배양액의 pH를 조절하는 것을 포함하는, 배양 방법을 제공한다. 또한, 본 발명에 따른 목적 단백질의 배양 방법은 목적 단백질 생산비용을 절감하면서도, 목적 단백질을 대량생산하는데 사용될 수 있다.

Description

단백질을 발현하는 세포의 배양 방법{METHOD FOR CULTURING A CELL EXPRESSING A PROTEIN}
본 발명은 목적 단백질을 대량 생산하면서도 생산 비용을 절감할 수 있는 단백질을 발현하는 세포주의 배양 방법으로서, 특히, SARS-CoV-2 (Severe Acute Respiratory Syndrome-Coronavirus-2) 감염을 예방하고/하거나 감염시 발현되는 증상을 완화하는 목적으로 사용되는 백신의 항원 단백질을 발현하는 세포주의 배양 방법에 관한 것이다.
2019년 12월 이후 팬데믹 감염이 보고된 SARS-CoV-2 바이러스는 Coronaviridae family, Betacoronavirus genus Sarbecovirus subgenus에 속하는 바이러스로서, 바이러스 표면의 삼량체 (trimer) 당단백질 (즉, 스파이크 (Spike) 단백질) 상단의 수용체 결합 도메인 (Receptor Binding Domain, RBD)이 인체 세포 표면의 ACE2 수용체 단백질에 결합함으로써 감염을 일으키는 것으로 알려져 있다. 스파이크 당단백질 단량체 (monomer)는 숙주세포 단백질 분해효소 (protease)에 의하여 S1 서브유닛 및 S2 서브유닛으로 분리된다.
상기 SARS-CoV-2 바이러스 감염의 주된 전파경로는 감염자의 비말과의 밀접접촉인 것으로 알려져 있다. 그러나, 감염자와 직접 접촉하거나 또는 감염자의 비말 등에 의하여 오염된 물품과 같은 매개체를 만진 후, 손을 씻지 않은 채 눈, 코, 입 등을 만짐으로써 바이러스 전파가 이루어질 수도 있다고 알려져 있다.
한편, 2020년 SARS-CoV-2 바이러스 감염으로 인한 사회·경제적 피해가 심화되면서 미국, 유럽 등 다양한 국가에서 SARS-CoV-2 바이러스 감염에 따른 증세를 완화하는 효과를 갖는 백신 사용에 대한 긴급승인과 함께 전세계적으로 여러 국가에서 백신 접종이 개시되었다. 그러나, 상기 백신을 접종하였더라도 백신 접종자에서의 SARS-CoV-2 바이러스 감염을 원천 차단하지는 못한다.
더욱이, 알파변이, 베타 변이, 감마 변이, 엡실론 변이, 델타변이, 카파변이, 에타변이와 같은 SARS-CoV-2 바이러스 변이가 계속 보고되고 있으며, 백신 접종자에서의 이러한 변이된 SARS-CoV-2 바이러스 감염이 계속적으로 발생하고 있다. 따라서, 체내 유효 항체 수치를 유지하기 위한 목적으로 백신 접종자를 대상으로 한 추가 백신 접종이 권고되고 있는 실정이다. 나아가, 각국 정부는 SARS-CoV-2 감염이 사회·경제에 미치는 영향을 고려하여 SARS-CoV-2 백신 접종 대상을 청소년 층까지 확대하고 있는바, SARS-CoV-2 감염 예방 백신 및 상기 백신에 사용될 수 있는 항원 단백질 생산 수요가 급증하고 있다. 식물에서 목적 단백질을 대량 생산하는 방법에 대해서는 이미 공지되어 있으나(공개특허 제10-2021-0117808호), 동물성 세포에서 목적 단백질을 대량 생산하는 방법에 대해서는 아직 연구가 부족한 실정이다. 따라서, 단기간 내 동물성 세포에서 백신 항원 단백질을 대량생산할 수 있는 제조 방법의 개발이 요구된다.
(특허문헌 1) 공개특허 제10-2021-0117808호
본 발명자들은 백신의 항원 단백질의 생산효율을 증가시키는 방법에 대한 연구를 진행하던 중, 바이오리액터에서 목적 단백질을 발현하는 세포주를 배양하는 과정에서 배양액의 pH를 일정 수치 이하로 조절함으로써 배양 안정성 및 세포의 단백질 발현 효율을 증가시켜 생산단가를 절감할 수 있으며, 상기 배양액으로 투입되는 기체 분사 속도를 조절하면 배양가능한 배양액 부피를 스케일업하고 배양액에서의 거품이 형성되는 것을 억제하는 게 가능하게 되므로, 목적 단백질의 생산성을 향상시킬 수 있다는 점을 발견하여 본 발명을 완성하였다.
본 출원에 의해 개시되는 기술의 일 양태에 따르면, 목적 단백질을 발현하는 세포주의 배양 방법으로서, 상기 단백질을 발현하는 세포주를 배양하는 단계를 포함하며, 상기 세포주를 배양하는 단계는 배양액의 pH를 조절하는 것을 포함하는, 배양 방법을 제공한다.
또한, 본 출원에 의해 개시되는 기술의 일 양태에 따르면, 상기 세포주를 배양하는 단계는 배양액으로 투입되는 기체 분사 속도의 조절을 통해 배양액 부피 스케일업 및 배양액에서의 거품 형성 억제를 가능케 할 수 있다.
본 발명에 따른 단백질을 발현하는 세포주의 배양 방법은 단백질의 생산 단가를 절감하면서도, 상기 단백질을 대량생산하는데 사용될 수 있다.
도 1은 서열번호 1의 단백질을 코딩하는 염기서열을 포함하는 벡터의 구조를 나타낸 것이다.
도 2는 바이오리액터 내 배양액의 pH 상단값을 pH 7.25로 한 경우의 배양액 내 용존산소량 (DO), pH, 산소 유량 및 이산화탄소 유량 변화를 나타낸다.
도 3은 바이오리액터 내 배양액의 pH 상단값을 pH 7.1로 낮춘 경우의 배양액 내 DO, pH, 산소 유량 및 이산화탄소 유량 변화와 배양 기간 중 누적 탄산수소나트륨 사용량 추이를 나타낸다.
도 4는 바이오리액터 내 배양액의 pH 상단값을 각각 6.8, 6.99, 7.0 또는 7.2로 변화시켰을 때 배양액 내 젖산 생성량의 변화를 나타낸다.
이하, 본 발명을 보다 구체적으로 설명한다.
본 발명의 일 측면은, 목적 단백질을 발현하는 세포주의 배양 방법으로서, 상기 단백질을 발현하는 세포주를 배양하는 단계를 포함하며, 상기 세포주를 배양하는 단계는 배양액의 pH를 조절하는 것을 포함하는, 배양 방법을 제공한다.
상기 "목적 단백질"은 세포가 발현 가능한 모든 종류의 외래 산물 단백질이다. 대표적으로, 인슐린, 사이토카인(인터루킨, 종양괴사인자, 인터페론, 콜로니자극인자, 케모카인 등등), 에리트로포이에틴, 항원, 항체, 항체 단편, 구조 단백질, 조절단백질, 전사인자, 독소 단백질, 호르몬, 호르몬 유사체, 효소, 효소 저해제, 수송단백질, 리셉터 (예컨대, 티로신 키나아제 수용체 등), 리셉터의 단편, 생체방어 유도물질, 저장단백질, 이동단백질(movement protein), 익스플로이티브 프로틴(exploitive protein), 리포터 단백질, 성장 인자 등이 있으며, 이러한 목적 단백질은 세포주에서의 발현을 위한 벡터에 상기 목적 단백질을 코딩하는 유전자를 삽입할 수 있도록 하는 제한 효소 인지 또는 절단 부위가 도입되어 있는 핵산 서열인 "클로닝 부위"를 포함할 수 있다.
본 발명에서 상기 목적 단백질은 국제특허공보 제2021-163438호의 청구항 1에 기재된 폴리펩타이드 중 하나이거나, 국제특허공보 제2019-169120호, 미국 특허공보 제9630994호, 국제특허공보 제2021-163481호, 국제특허공보 제2021-163438호, 또는 국제출원번호 제PCT/US2021/037341호의 명세서에 개시된 폴리펩타이드 중 하나일 수 있다. 바람직하게는, 상기 목적 단백질은 국제특허공보 제2021-163438호에 개시된 서열번호 7, 29, 30, 31, 또는 39로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드일 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 목적 단백질은 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩타이드이거나, 상기 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열과 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 91% 이상, 92% 이상, 93% 이상, 94% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상 또는 99% 이상 서열 상동성을 갖는 폴리펩타이드일 수 있다. 상기 목적 단백질은 서열번호 2로 표시되는 염기서열로 이루어진 유전자에 의해 코딩되거나, 상기 서열번호 2로 표시되는 염기서열과 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 91% 이상, 92% 이상, 93% 이상, 94% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상 또는 99% 이상 서열 상동성을 갖는 염기 서열에 의하여 코딩될 수 있다.
상기 목적 단백질을 생산하는 세포주는 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열로 표시되는 폴리펩타이드 또는 이와 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 91% 이상, 92% 이상, 93% 이상, 94% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상 또는 99% 이상 서열 상동성을 갖는 폴리펩타이드를 코딩하는 유전자를 포함하는 발현 벡터를 갖는 세포주일 수 있다. 본 발명의 일 구체예에서, 상기 발현 벡터는 플라스미드 벡터일 수 있으나, 세포에 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열로 표시되는 폴리펩타이드 또는 이와 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 91% 이상, 92% 이상, 93% 이상, 94% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상 또는 99% 이상 서열 상동성을 갖는 폴리펩타이드를 코딩하는 유전자를 형질감염하기에 적합한 벡터라면 제한없이 사용될 수 있다.
한편, 본 발명에서 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열로 표시되는 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 발현 벡터는 서열번호 3으로 표시되는 DNA 서열을 가질 수 있다.
본 발명에서 사용된 용어, "벡터"는 숙주세포에 도입되어 숙주세포 유전체 내로 재조합 및 삽입될 수 있거나, 또는 에피좀 (episome)으로 자발적으로 복제될 수 있는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 수단을 말한다. 적합한 발현 벡터는 프로모터, 개시코돈, 종결코돈, 폴리아데닐화 신호 및 인핸서 같은 발현 조절 요소 (element) 외에도 막 표적화 또는 분비를 위한 신호서열 또는 리더서열을 포함하며, 목적에 따라 다양하게 제조될 수 있다. 개시코돈 및 종결코돈을 표적 단백질을 암호화하는 유전자 작제물이 투여되었을 때 개체에서 반드시 작용을 나타내야 하며 암호화 서열과 인프레임 (in frame)에 있어야 한다.
본 발명의 일 구체예에 따른 폴리뉴클레오티드 또는 벡터는 게놈 외부의 독립적 분자, 구체적으로는 복제할 수 있는 분자로서 유전적으로 변형된 숙주세포 또는 비-인간 숙주개체 내에 존재할 수 있거나, 또는 숙주세포 또는 비-인간 숙주개체의 게놈으로 안정적으로 삽입될 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 따른 목적 단백질을 발현하는 세포주의 숙주세포는 진핵세포이다. 상기 진핵세포는 진균세포 (fungus), 식물세포 또는 동물세포를 포함한다. 진균세포의 예로는 효모, 구체적으로는 사카로마이세스 속 (Saccharomyces sp.)의 효모, 더욱 구체적으로는 사카로마이세스 세레비지애 (S. cerevisiae)일 수 있다. 또한, 동물세포의 예로는 곤충세포 또는 포유동물 세포가 있고, 구체적인 동물세포의 예로는 HEK293, 293T, NSO, 중국 햄스터 난소 세포 (CHO), MDCK, U2-OSHela, NIH3T3, MOLT-4, Jurkat, PC-12, PC-3, IMR, NT2N, Sk-n-sh, CaSki, C33A 등이 있다. 또한, 통상의 기술분야에 잘 알려져 있는 적당한 세포주들은 ATCC (American Type Culture Collection)와 같은 세포주 기탁기관으로부터 수득할 수 있다.
본 발명의 일 구체에에 따른 목적 단백질을 발현하는 세포주의 숙주세포는 중국 햄스터 난소 세포 (CHO)일 수 있으며, 바람직하게는 재조합 아데노-관련 바이러스 (recombinant Adeno-Associated Virus, rAAV)에 의하여 Glutamine Synthetase 유전자의 6번 엑손이 넉아웃 (Knock-out)된 HD-BIOP3 세포를 사용할 수 있다.
상기 숙주세포에 목적 단백질을 코딩하는 유전 서열을 갖는 발현 벡터를 도입하기 위해서는 핵산을 세포 내로 도입하는 어떤 방법이든 사용할 수 있고, 숙주세포에 따라 통상의 기술분야에 공지된 기술을 사용할 수 있다. 예를 들어, 열충격법 (Heat Shock), 전기천공법 (Electroporation), 인산칼슘 (CaPO4) 침전, 염화칼슘 (CaCl2) 침전, 미세주입법 (microinjection), 폴리에틸렌글리콜 (PEG)법, DEAE-덱스트란법, 양이온 리포좀법, 및 초산 리튬-DMSO법 등이 있으나, 이에 제한되지 않는다.
구체적으로, 상기 목적 단백질을 발현하는 세포주를 배양하는 단계는, 상기 세포주를 종배양하는 단계 및 상기 종배양한 세포주를 본배양하는 단계를 포함할 수 있다.
본 발명에서 사용된 용어, "종배양 (seed culture)"은 세포주를 대량으로 얻는 것을 목적으로 하는 배양을 의미한다. 상기 종배양은 세포수가 가장 활발하게 증가할 수 있는 온도 조건에서 배양될 수 있다. 다시 말해서, 세포주의 일정 세포수를 확보하기 위하여 종배양할 수 있다.
본 발명에서 사용된 용어 "본배양 (production culture)"은 목적 단백질을 생산하기 위하여 세포주를 대량 배양하는 것을 의미한다.
상기 종배양하는 단계는, 목적 단백질을 발현하는 세포주를 계대 배양, 부유배양 및 이의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 방법으로 배양하는 것일 수 있다. 바람직하게는, 목적 단백질을 발현하는 세포주를 부유배양 및 계대 배양 방식으로 배양할 수 있다.
본 발명에서 사용된 용어, "부유배양 (suspension culture)"은 배양액에 세포가 부유한 상태에서 하는 배양법을 의미하며, 혈액세포나 복수의 암세포와 같이 생체 내에서도 부유 상태로 증식하는 세포는 진탕이나 회전을 시키지 않더라도 부유배양할 수 있지만 대부분의 경우는 각반자를 회전시키거나 (각반배양), 배양병마다 진탕하거나 (진탕배양), 또는 배양기를 회전시켜 배양 (선회배양)할 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 부유배양은 120 RPM 내지 160 RPM의 교반속도의 조건에서 수행될 수 있지만, 이러한 조건으로 국한되는 것은 아니다. 상기 부유배양에서 접종하는 세포수는 2x105 cells/mL 내지 5x105 cells/mL, 3x105 cells/mL 내지 4x105 cells/mL, 또는 4x105 cells/mL 내지 5x105 cells/mL 일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서 사용된 용어, "계대 배양 (subculture)"은 배양 주기에 따라 동일한 또는 다른 신선한 배지로 세포주를 옮겨가며 배양하는 방법을 의미한다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 계대 배양은 목적 단백질을 발현하는 세포주를 1일 내지 7일, 2일 내지 5일, 3일 내지 4일 또는 2일 내지 3일 간격으로, 동일한 신선한 배지에 옮겨 접종하여 배양할 수 있다. 이때, 접종하는 세포 수는 2x105 cells/mL 내지 5x105 cells/mL, 3x105 cells/mL 내지 4x105 cells/mL, 또는 4.5x105 cells/mL 내지 5.5x105 cells/mL 일 수 있지만, 이러한 조건으로 국한되는 것은 아니다. 또한, 계대 배양시 CO2 농도는 4.0 % 내지 6.0 %, 4.5 % 내지 5.5 %, 또는 5.0 %일 수 있지만, 이러한 조건으로 국한되는 것은 아니다.
구체적으로, 상기 종배양하는 단계는, 상기 목적 단백질을 발현하는 세포주를 34℃ 내지 38℃의 온도에서 배양하는 것일 수 있다. 바람직하게는, 상기 세포주를 36.5℃의 온도에서 배양할 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 종배양하는 단계는, 목적 단백질을 발현하는 세포주를 본원발명이 속한 기술분야에서 세포 성장에 적합한 것으로 알려진 배지에 배양할 수 있지만, 이러한 조건으로 국한되는 것은 아니다. 상기 배지는 CD OptiCHO 배지일 수 있다.
상기 본배양하는 단계는, 상기 종배양된 세포주를 회분식 배양, 유가식 배양, 연속식 배양 및 이의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 방법으로 배양하는 것일 수 있다. 바람직하게는, 목적 단백질을 발현하는 세포주를 유가식 배양 방식으로 배양할 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 목적 단백질을 발현하는 세포주를 본배양하는 단계는, 부유배양에 의하여 생산될 수 있다. 이때, 상기 부유배양은 60 RPM 내지 100 RPM, 65 RPM 내지 95 RPM, 70 RPM 내지 95 RPM, 75 RPM 내지 95 RPM, 80 RPM 내지 95 RPM, 85 RPM 내지 95 RPM, 90 RPM 내지 95 RPM, 92 내지 94 RPM 또는 93 RPM의 교반속도 조건하에서 실시될 수 있으나, 이러한 조건으로 국한되지는 않는다.
본 발명의 다른 구체예에서, 목적 단백질을 발현하는 세포주를 배양시 접종되는 세포 수는 5x105 cells/mL 내지 10x105 cells/mL, 6x105 cells/mL 내지 10x105 cells/mL, 7x105 cells/mL 내지 10x105 cells/mL, 7x105 cells/mL 내지 9x105 cells/mL 또는 7.2x105 cells/mL 내지 8.8x105 cells/mL 일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 또 다른 구체예에서, 상기 목적 단백질을 발현하는 세포주를 배양하는 단계는, 상기 세포주 배양액의 pH를 이산화탄소, 또는 탄산수소나트륨 등의 염기 용액을 이용하여 조절할 수 있다. 바람직하게는, 배양액의 pH를 이산화탄소 및 탄산수소나트륨을 이용하여 조절할 수 있다. 더 바람직하게는, 배양액의 pH를 이산화탄소 및 8% 탄산수소나트륨을 이용하여 조절할 수 있다. 또한, 배양시 배양액의 pH를 조절하기 위하여 도입되는 염기성 용액은 배양액 내 세포에 의하여 분비되는 젖산과 적절한 비율로 배양액 내에 존재함으로써 배양액의 pH를 적정수준으로 유지한다. 이때, 배양액의 pH (오차범위인 deadband는 0.05)는 6.8 내지 7.5, 6.9 내지 7.4, 7.0 내지 7.3, 7.0 내지 7.4, 6.8 내지 7.2 또는 6.8 내지 7.1로 조절할 수 있다. 바람직하게는, 배양액의 pH를 pH 6.8 내지 7.1 (오차범위인 deadband는 0.05)로 조절할 수 있다.
이와 같이 배양액을 일정한 수치 범위 내의 pH로 유지되도록 조절함에 있어서, 이때 상기 pH 수치 범위의 상한값(이하, "pH 상단값")을 낮출수록 배양 후반부의 배양액으로의 이산화탄소 주입량 감소 및 배양액 내 버블 형성 예방효과가 나타난다. 배양이 진행됨에 따라 배양액 내 젖산 함량이 감소하는 현상이 발생하여 배양액 pH가 상승하며, 이러한 pH 상승은 바이오리액터 하단에 위치한 분사기 (sparger)를 통한 다량의 이산화탄소 주입을 야기한다. 또한, 분사기는 이산화탄소 및 산소를 배양액으로 도입하는 역할을 수행하므로 pH 상승에 따라 배양액으로 도입되는 공기 중 이산화탄소/산소 비율의 증가로 인해 배양액으로의 산소 전달력이 감소한다. 배양액으로의 산소 전달력 감소는 배양액 내 용존 산소량 (Dissolved Oxygen, DO)을 감소시킴으로써 분사기를 통한 산소 분사 빈도를 증가시킨다. 그런데, 기체의 배양액으로의 직접적인 주입은 배양액의 pH를 증가시키는 요인이 될 수 있다.
한편, 배양을 계속 진행하는 과정에서 배양액 내 젖산 감소에 따른 배양액의 pH 상승은 배양액 내 세포가 분비하는 젖산 분비 감소와 서로 영향을 주고받게 된다. 배양액에서의 pH 상승은 세포의 젖산 분비를 감소시키고 이는 다시 배양액의 pH를 증가시키는 악순환을 야기하는바, 배양액의 pH 상단값이 높을수록 배양액의 pH를 일정하게 유지하기 위하여 요구되는 이산화탄소 투입량이 증가할 수 밖에 없다. 따라서, 배양액 내 pH를 조절함에 있어 pH 상단값을 7.15 이하, 7.10 이하, 7.05 이하, 7.00 이하, 6.95 이하, 6.90 이하, 6.85 이하, 또는 6.80 이하로 낮게 설정하면 배양기간 동안 배양액으로 투입되는 이산화탄소 및 산소 사용량을 감소시킬 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 본 발명의 배양액 내 pH가 7.25인 경우와 대비하여 배양액 내 pH가 6.8 내지 7.1 (오차범위인 deadband는 0.05)이면 배양 기간 동안 배양액으로 투입되는 이산화탄소, 산소 및 탄산수소나트륨과 같은 염기성 물질의 사용량을 감소시킴에 따라 생산비용을 절감할 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 배양액 내 pH를 6.8 내지 7.1 (오차범위인 deadband는 0.05)로 유지함으로써 배양 후기 배양액으로 도입되는 탄산수소나트륨의 함량을 배양 전기 배양액으로 도입되는 탄산수소나트륨의 함량보다 감소시킬 수 있다. 이때, 배양 전기와 후기를 구분하는 기준점은 배양 4일차 또는 배양 5일차일 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 배양 기간 동안 분사기를 통해 분사되는 기체 (지구 대기를 구성하는 일반적인 공기를 의미함)의 기체 분사 속도 (Air sparging rate)를 변화시킬 수 있다.
본 발명의 다른 구체예에서, 배양 전기의 기체 분사 속도와 배양 후기의 기체 분사 속도를 다르게 할 수 있다. 바람직하게는, 배양 후기의 기체 분사 속도가 배양 전기의 기체 분사 속도의 절반 이하일 수 있다. 더 바람직하게는, 배양 4일차 또는 5일차 이후 기체 분사 속도가 배양 4일차 또는 5일차 이전의 기체 분사 속도의 절반 이하일 수 있다.
본 발명의 또다른 구체예에서, 배양 후기, 바람직하게는 배양 4일차 또는 5일차 이후, 기체 분사 속도가 0.0005 내지 0.01 vvm(volume air/volume media/minute), 0.0005 내지 0.009 vvm, 0.0005 내지 0.008 vvm, 0.0005 내지 0.007 vvm, 0.0005 내지 0.006 vvm, 0.0005 내지 0.005 vvm, 0.0005 내지 0.004 vvm, 0.0005 내지 0.003 vvm, 0.0005 내지 0.002 vvm, 0.0005 내지 0.001 vvm, 또는 0.001 vvm일 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 목적 단백질을 발현하는 세포주의 배양액 DO를 일정 수치 범위로 유지할 수 있다. 이때, 상기 세포주 배양액의 DO를 10% 내지 90%, 20% 내지 80%, 30% 내지 70%, 40% 내지 60%, 40% 내지 50% 또는 40%로 유지할 수 있으나, 이러한 조건으로 제한되지 않는다.
본 발명의 다른 구체예에서, 상기 세포주 배양액의 DO가 배양액의 바람직한 DO 수치 범위의 하단에 위치하게 될 경우 배양액으로 산소를 공급함으로써 배양액의 DO 수치를 유지할 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 배양 기간 내 바이오리액터로의 산소 유량 (flow rate)이 20 LPM 이하로 유지될 수 있다.
본 발명의 다른 구체예에서, 배양 후기, 바람직하게는 배양 4일차 또는 5일차 이후, 바이오리액터로의 이산화탄소 유량이 5 LPM 이하로 유지될 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 목적 단백질을 발현하는 세포주를 30℃ 내지 38℃의 온도에서 배양하는 것일 수 있다.
본 발명의 다른 구체예에서, 배양 후기, 바람직하게는 배양 4일차 또는 5일차 이후의 배양 온도가 배양 전기, 바람직하게는 배양 4일차 또는 5일차 이전의 배양온도보다 낮을 수 있다.
본 발명의 또다른 구체예에서, 배양 초기 일정기간 동안 목적 단백질을 발현하는 세포주를 37 ℃의 온도에서 배양한 뒤 온도를 낮춰 배양할 수 있다. 바람직하게는 세포주를 배양 4일차 또는 5일차까지 37 ℃의 온도에서 배양하고, 배양 5일차 또는 6일차 이후에 상기 온도보다 1 ℃, 2 ℃, 3 ℃, 4 ℃, 5 ℃, 6 ℃, 7 ℃, 8 ℃, 9 ℃ 또는 10 ℃ 낮은 온도에서 배양할 수 있다. 보다 바람직하게는, 세포주를 배양 4일차 내지 5일차까지 37 ℃의 온도에서 배양하고, 그 이후의 배양기간 동안 31℃의 온도에서 배양할 수 있다.
본 발명의 다른 구체예에서, 목적 단백질을 발현하는 세포주를 본원발명이 속한 기술분야에서 세포 성장에 적합한 것으로 알려진 배지에 배양할 수 있지만, 이러한 조건으로 국한되는 것은 아니다. 상기 배지는 Dynamis 배지일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구체예에서, 배양액에서 발생하는 버블을 제거하기 위한 목적으로 소포제를 처리할 수 있다. 상기 소포제는 배양액 성분을 고려하여 적합한 물질을 선택하여 사용할 수 있고, 바이오리액터 내 기체 필터 (air filter) 하단에 거품이 도달할 때 사용된다. 바람직하게는, 상기 소포제가 ADCF 소포제일 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 플라스크 또는 바이오리액터 (bioreactor)에서 목적 단백질을 발현하는 세포주를 배양할 수 있다. 바이오리액터를 이용한 배양은 플라스크와 달리 DO, 글루코스 함량, pH와 같은 배양조건을 조절 및 유지할 수 있어서 세포 배양을 유리한 조건에서 수행할 수 있고 대량 배양이 가능하다.
상기 플라스크 및 바이오리액터의 종류 및 배양 조건은 당업자가 통상적으로 조절 가능한 범위 내에서 변경할 수 있다.
예를 들어, 목적 단백질을 발현하는 세포주를 엘렌메이어 플라스크 (Elenmeyer Flask)에 접종하여 부유배양한 뒤 계대 배양하여 바이오리액터에 접종할 최소 세포수를 확보하고, 계대배양한 세포주를 일회용 세포배양백이 장착된 바이오리액터에 접종하여 유가식배양을 실시하여 목적 단백질을 생산할 수 있다.
본 발명의 또 다른 구체예에서, 배양 기간은 6일 이상일 수 있다. 바람직하게는 배양 기간이 6일, 7일, 8일, 9일, 10일, 11일, 12일, 13일, 14일, 15일, 16일, 17일, 18일, 19일 또는 20일일 수 있다. 보다 바람직하게는 배양 기간이 10일일 수 있다.
실시예
이하, 본 발명을 하기 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위가 이들만으로 한정되는 것은 아니다.
제조예 1. 목적 단백질을 발현하는 세포주의 제작
서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 폴리펩타이드를 발현하는 세포주를 제작하기 위하여 영국 HORIZON Discovery 사에서 분양 받은 HD-BIOP3 세포주를 숙주세포로 사용하였다. Donor plasmid (pJV145)에 SalI/NotI 제한 효소 반응을 이용해 Genscript사에서 합성한 cDNA를 삽입하여 재조합 발현 벡터 plasmid (M-2560)를 제작하였다 (도 1). 상기 M-2560 벡터는 서열번호 3으로 표시되는 DNA 서열을 갖는다.
상기 HD-BIOP3 세포주에 재조합 발현 벡터 plasmid (M-2560)를 형질주입하였다. 형질주입된 세포 중 안정적인 single cell cloning이 가능한 세포를 선별하여 충분한 장기 계대 안정성을 갖는 연구용 세포은행(Research cell bank; RCB)을 제조하였다. 상기 RCB를 SK바이오사이언스 안동공장으로 이관하여 GMP 기준에 적합하게 제조용 세포은행(Working Cell Bank; WCB)를 제조하였다.
WCB(Working Cell Bank) 1 바이알을 37 ℃ 항온수조 (water bath)에서 녹이고 CD OptiCHO 배지로 희석한 후 원심분리를 하여 펠렛 (pellet)을 CD OptiCHO 배지로 재부유시켰다. 10 L 바이오리액터에서 5 x 105 cells/mL 농도로 6 L 배양, 50 L 바이오리액터에서 5 x 105 cells/mL 농도로 30 L 배양, 200 L 바이오리액터에서 5 x 105 cells/mL 농도로 200 L 배양, 2000 L 바이오리액터에서 8 x 105 cells/mL 농도로 1600 L 배양할 수 있도록 확장 계대 배양 하였다.
제조예 2. 목적 단백질을 발현하는 세포주의 2000 L 바이오리액터에서의 배양
일회용 세포 배양백을 2000 L 바이오리액터에 장착하고 가동 준비를 한 뒤, 1400 L의 Dynamis 배지를 주입하고 8.0 x 105 cells/mL의 농도로 WCB를 접종하여 배양하였다. 배양 시, DO 조절은 기체 및 산소를 통해 진행하며, pH 조절은 8 % 탄산수소나트륨 및 이산화탄소 가스를 사용하여 진행하였다.
접종 직후부터 매일 샘플링을 하여 세포수를 측정하고 미생물 오염 여부 및 배양액 내 glucose 농도 등을 확인하였으며, 바이오리액터 내 거품이 condenser에 장착된 air filter의 하단까지 올라오면 ADCF 소포제를 처리하였다. 이와 같은 과정을 배양 종료까지 반복적으로 진행하였다. 배양시 사용되는 배양 조건은 하기 표 1과 같다.
세포주의 배양 조건
배양 조건 설정 값
온도 (배양 0 ~ 5일차) 37℃
온도 (배양 5일차 이후) 31℃
배양용 배지 Dynamis
접종용 배지 CD OptiCHO
교반 속도 93 RPM
배양 부피 1600 L
초기 접종 농도 8.0 x 105 cells/mL
용존 산소량 40%
용존 산소량 조절 기체, 산소
pH 조절 8 % 탄산수소나트륨, 이산화탄소
실험예 1. 바이오리액터 내 배양액 pH 변경에 따른 변화
상기 제조예 2에서는 배양 6일차에 바이오리액터 내 배양액의 pH 상단값이 7.25에 도달함으로써 pH 조절을 위하여 분사기를 통한 배양액으로의 이산화탄소 주입이 증가하고, 배양액의 DO 유지를 위한 산소 주입이 증가하는 현상이 발생하였다(도 2). 또한, 이산화탄소 및 산소 주입의 증가에 따라 버블 발생이 증가하는 문제가 발생하였다.
따라서, 바이오리액터 내 배양액의 pH 상단값을 pH 7.1 (pH 오차범위인 deadband는 0.05)로 설정함으로써 상기 문제를 해소할 수 있는지 검증하였다.
구체적으로, 바이오리액터 내 배양액의 pH 상단값이 pH 7.2 (deadband는 0.05)로 설정된 경우 (CTIA01503 배치) 및 배양액의 pH 상단값을 pH 7.1 (deadband는 0.05)로 설정한 경우 (E21R054 배치)의 배양 기간 동안의 변화를 관찰하였다. 배양 4일 내지 5일차 이후에도 E21R054 배치에서는 배양액으로의 산소 주입량 및 이산화탄소 주입량이 증가하는 현상이 발생하지 않았으며, pH가 일정 수준으로 유지됨에 따라 배양 기간 동안 누적되어 사용되는 탄산수소나트륨의 총량도 더 낮은 것으로 나타났다 (도 3).
또한, 바이오리액터 내 배양액의 pH 상단값을 pH 6.8, 6.99, 7.0 또는 7.2로 설정하였을 때, pH를 낮출수록 배양 기간 동안 젖산 발생량이 줄어드는 것으로 나타났다 (도 4). 따라서, 배양기간 동안 pH 상단값을 낮게 유지함으로써, 세포들이 pH 유지를 위해 무리하게 젖산과 같은 부산물을 생산하지 않게 되었다. 배양액 내 젖산의 농도가 증가하게 되면 배양액의 pH를 유지하기 위해 별도로 투입하게 되는 탄산수소나트륨과 같은 완충제 투입 용량이 감소하였다. 또한, 세포가 배양 과정에서 겪는 스트레스가 감소되고, 배양 안정성이 크게 개선되어 단백질 생산 효율이 증가되었다.
실험예 2. 배양 과정에서 기체 분사 속도 변경에 의한 거품 억제 효과의 확인
바이오리액터에서의 배양시 교반을 함에 따라 배양액에 거품을 형성하는 가스가 생성되며, 이는 배양액 내 박테리아 성장 및 세포의 단백질 발현에 악영향을 미칠 수 있다. 따라서, 배양액 내 발생되는 거품 형성을 저해하기 위한 목적으로 소포제 (antifoams)를 배양 배지에 첨가하나, 소포제는 세포막 투과성 변화를 야기하여 세포 성장 저해를 일으키고, 단백질 발현에도 영향을 줄 수 있는바, 바이오리액터 내 배양액으로 도입되는 기체 분사 속도를 변경함으로써 배양액에서 발생하는 거품 형성을 억제할 수 있는지 검증하였다.
상기 실험예 1에서 생산 효율을 증가시키는 것으로 확인된 배양액의 pH 상단값인 pH 7.1 (deadband는 0.05)을 고려하여, 배양액의 pH를 pH 6.8~7.1로 유지하면서, 아래 표 2와 같은 조건으로 배양을 진행하였을 때 배양액에서 발생되는 거품을 억제하는 효과를 확인하였다.
공정 조건 배양 기간 DO output§ Air sparging flow (vvm) 거품 생성 정도
(1~5)
대조예 Day 0 ~ Day 10 0% 0 5
10% 0.002
100%
실시예 1 Day 0 ~ Day 5 0% 0.002 3
10%
100%
Day 5 ~ Day 10 0% 0.0005 1
10%
100%
실시예 2 Day 0 ~ Day 5 0% 0.002 3
10%
100%
Day 5 ~ Day 10 0% 0.001 1
10%
100%
§DO output: 보충해야 하는 산소의 분량을 나타내는 지표로서, DO ouput이 0%인 경우는 용존 산소가 배양액 내에 충분하다는 것을 의미하며, 100%인 경우는 용존 산소가 배양액 내에서 모두 소모되었다는 것을 의미한다.
산소를 보충할 필요가 없을 경우에는 기체를 분사하지 않고, 그 외의 경우에는 일정한 분사 속도로 기체를 분사하는 대조예의 경우, 배양액 내 거품 생성 정도가 가장 높은 것으로 나타났다.
반면에, DO output과 관계 없이 배양 5일차 이후 기체 분사 속도를 감소시키는 실시예 1 및 2에서는, 거품 형성이 억제되는 것으로 나타났다. 또한, 실시예 1 및 2는 배양 5일차 이전 및 이후에 DO output 수치와 관계없이 각각 동일한 분사속도로 기체를 분사하기 때문에 공정 편의성이 확보되었다.
한편, 실시예 1은 배양 후반부에 pH 상단값 deadband 수준으로 미미한 pH 감소 현상이 관찰되어, 수율이 미미하게 감소하는 것으로 나타났으나. 실시예 2는 실시예 1과 달리, 배양 후반부 pH가 감소하는 현상이 발생하지 않았고, 수율도 유지되는 것으로 나타났다.
<110> SK bioscience Co., Ltd. <120> METHOD FOR CULTURING A CELL EXPRESSING A PROTEIN <130> FDP/202110-0043 <150> KR 10-2021-0137835 <151> 2021-10-15 <160> 3 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 467 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 1 Met Gly Ile Leu Pro Ser Pro Gly Met Pro Ala Leu Leu Ser Leu Val 1 5 10 15 Ser Leu Leu Ser Val Leu Leu Met Gly Cys Val Ala Glu Thr Gly Thr 20 25 30 Arg Phe Pro Asn Ile Thr Asn Leu Cys Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn 35 40 45 Ala Thr Arg Phe Ala Ser Val Tyr Ala Trp Asn Arg Lys Arg Ile Ser 50 55 60 Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser Val Leu Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser 65 70 75 80 Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val Ser Pro Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys 85 90 95 Phe Thr Asn Val Tyr Ala Asp Ser Phe Val Ile Arg Gly Asp Glu Val 100 105 110 Arg Gln Ile Ala Pro Gly Gln Thr Gly Lys Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr 115 120 125 Lys Leu Pro Asp Asp Phe Thr Gly Cys Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn 130 135 140 Asn Leu Asp Ser Lys Val Gly Gly Asn Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu 145 150 155 160 Phe Arg Lys Ser Asn Leu Lys Pro Phe Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu 165 170 175 Ile Tyr Gln Ala Gly Ser Thr Pro Cys Asn Gly Val Glu Gly Phe Asn 180 185 190 Cys Tyr Phe Pro Leu Gln Ser Tyr Gly Phe Gln Pro Thr Asn Gly Val 195 200 205 Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val Val Val Leu Ser Phe Glu Leu Leu His 210 215 220 Ala Pro Ala Thr Val Cys Gly Pro Lys Lys Ser Thr Gly Gly Ser Gly 225 230 235 240 Gly Ser Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Ser Glu Lys Ala Ala 245 250 255 Lys Ala Glu Glu Ala Ala Arg Lys Met Glu Glu Leu Phe Lys Lys His 260 265 270 Lys Ile Val Ala Val Leu Arg Ala Asn Ser Val Glu Glu Ala Ile Glu 275 280 285 Lys Ala Val Ala Val Phe Ala Gly Gly Val His Leu Ile Glu Ile Thr 290 295 300 Phe Thr Val Pro Asp Ala Asp Thr Val Ile Lys Ala Leu Ser Val Leu 305 310 315 320 Lys Glu Lys Gly Ala Ile Ile Gly Ala Gly Thr Val Thr Ser Val Glu 325 330 335 Gln Ala Arg Lys Ala Val Glu Ser Gly Ala Glu Phe Ile Val Ser Pro 340 345 350 His Leu Asp Glu Glu Ile Ser Gln Phe Ala Lys Glu Lys Gly Val Phe 355 360 365 Tyr Met Pro Gly Val Met Thr Pro Thr Glu Leu Val Lys Ala Met Lys 370 375 380 Leu Gly His Thr Ile Leu Lys Leu Phe Pro Gly Glu Val Val Gly Pro 385 390 395 400 Gln Phe Val Lys Ala Met Lys Gly Pro Phe Pro Asn Val Lys Phe Val 405 410 415 Pro Thr Gly Gly Val Asn Leu Asp Asn Val Ala Glu Trp Phe Lys Ala 420 425 430 Gly Val Leu Ala Val Gly Val Gly Ser Ala Leu Val Lys Gly Thr Pro 435 440 445 Asp Glu Val Arg Glu Lys Ala Lys Ala Phe Val Glu Lys Ile Arg Gly 450 455 460 Ala Thr Glu 465 <210> 2 <211> 1404 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 2 atgggaatcc tgccaagccc tggaatgcca gccctgctgt ccctggtgtc tctgctgagc 60 gtgctgctga tgggatgcgt ggcagagacc ggaacaaggt tccctaacat caccaacctg 120 tgcccattcg gcgaggtgtt taacgccaca cgctttgcct ccgtgtatgc ctggaaccgg 180 aagagaatct ctaattgcgt ggccgactat agcgtgctgt acaatagcgc ctccttctct 240 acctttaagt gctatggcgt gtctcccacc aagctgaacg acctgtgctt cacaaacgtg 300 tacgccgaca gctttgtgat ccggggcgat gaggtgagac agatcgcacc aggacagacc 360 ggcaagatcg cagactacaa ctataagctg cctgacgatt tcacaggctg cgtgatcgcc 420 tggaatagca acaatctgga ttccaaagtg ggcggcaact acaattatct gtacaggctg 480 ttccgcaaga gcaacctgaa gccatttgag cgggacatca gcaccgagat ctaccaggca 540 ggctccacac catgcaacgg agtggagggc ttcaattgtt attttcccct gcagagctac 600 ggcttccagc ctaccaatgg cgtgggctat cagccataca gagtggtggt gctgtccttt 660 gagctgctgc acgcaccagc aaccgtgtgc ggacctaaga agtccacagg cggctctgga 720 ggaagcggat ccggaggatc cggaggatct ggaagcgaga aggcagcaaa ggcagaggag 780 gcagcaagga agatggagga gctgttcaag aagcacaaga tcgtggccgt gctgagagcc 840 aactctgtgg aggaggccat cgagaaggca gtggccgtgt tcgcaggagg agtgcacctg 900 atcgagatca cctttacagt gcccgacgcc gataccgtga tcaaggccct gtccgtgctg 960 aaggagaagg gagcaatcat cggagcagga accgtgacat ctgtggagca ggcaaggaag 1020 gcagtggagt ccggagccga gtttatcgtg tctcctcacc tggatgagga gatctcccag 1080 ttcgccaagg agaagggcgt gttttacatg cctggcgtga tgaccccaac agagctggtg 1140 aaggccatga agctgggcca caccatcctg aagctgttcc caggagaggt ggtgggacca 1200 cagtttgtga aggccatgaa gggcccattc cccaatgtga agtttgtgcc tacaggcggc 1260 gtgaacctgg acaatgtggc agagtggttc aaggcaggcg tgctggcagt gggagtggga 1320 tctgccctgg tgaagggaac cccagatgag gtgagggaaa aggccaaggc ctttgtggag 1380 aagatcaggg gagcaacaga gtga 1404 <210> 3 <211> 10704 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 3 tcgcgcgttt cggtgatgac ggtgaaaacc tctgacacat gcagctcccg gagacggtca 60 cagcttgtct gtaagcggat gccgggagca gacaagcccg tcagggcgcg tcagcgggtg 120 ttggcgggtg tcggggctgg cttaactatg cggcatcaga gcagattgta ctgagagtgc 180 accatatgcg gtgtgaaata ccgcacagat gcgtaaggag aaaataccgc atcaggcgcc 240 attcgccatt caggctgcgc aactgttggg aagggcgatc ggtgcgggcc tcttcgctat 300 tacgccagct ggcgaaaggg ggatgtgctg caaggcgatt aagttgggta acgccagggt 360 tttcccagtc acgacgttgt aaaacgacgg ccagtgaatt ggagatcggt acttcgcgaa 420 tgcgtcgaga tgtttaaact cccgccccta actccgccca gttccgccca ttctccgccc 480 catggctgac taattttttt tatttatgca gaggccgagg ccgcctcggc ctctgagcta 540 ttccagaagt agtgaggagg cttttttgga ggcctaggct tttgcaaaaa gctagctggt 600 tctttccgcc tcagaaggta cctaaccaag ttcctctttc agaggttatt tcaggccacc 660 ttccaccatg gccacctcag caagttccca cttgaacaaa aacatcaagc aaatgtactt 720 gtgcctgccc cagggtgaga aagtccaagc catgtatatc tgggttgatg gtactggaga 780 aggactgcgc tgcaaaaccc gcaccctgga ctgtgagccc aagtgtgtag aagagttacc 840 tgagtggaat tttgatggct ctagtacctt tcagtctgag ggctccaaca gtgacatgta 900 tctcagccct gttgccatgt ttcgggaccc cttccgcaga gatcccaaca agctggtgtt 960 ctgtgaagtt ttcaagtaca accggaagcc tgcagagacc aatttaaggc actcgtgtaa 1020 acggataatg gacatggtga gcaaccagca cccctggttt ggaatggaac aggagtatac 1080 tctgatggga acagatgggc acccttttgg ttggccttcc aatggctttc ctgggcccca 1140 aggtccgtat tactgtggtg tgggcgcaga caaagcctat ggcagggata tcgtggaggc 1200 tcactaccgc gcctgcttgt atgctggggt caagattaca ggaacaaatg ctgaggtcat 1260 gcctgcccag tgggaatttc aaataggacc ctgtgaagga atccgcatgg gagatcatct 1320 ctgggtggcc cgtttcatct tgcatcgagt atgtgaagac tttggggtaa tagcaacctt 1380 tgaccccaag cccattcctg ggaactggaa tggtgcaggc tgccatacca actttagcac 1440 caaggccatg cgggaggaga atggtctgaa gcacatcgag gaggccatcg agaaactaag 1500 caagcggcac cggtaccaca ttcgagccta cgatcccaag gggggcctgg acaatgcccg 1560 tcgtctgact gggttccacg aaacgtccaa catcaacgac ttttctgctg gtgtcgccaa 1620 tcgcagtgcc agcatccgca ttccccggac tgtcggccag gagaagaaag gttactttga 1680 agaccgccgc ccctctgcca attgtgaccc ctttgcagtg acagaagcca tcgtccgcac 1740 atgccttctc aatgagactg gcgacgagcc cttccaatac aaaaactaac gcccgcccca 1800 cgacccgcag cgcccgaccg aaaggagcgc acgaccccat gcatcgcaca catcataaga 1860 tacattgatg agtttggaca aaccacaact agaatgcagt gaaaaaaatg ctttatttgt 1920 gaaatttgtg atgctattgc tttatttgta accattataa gctgcaataa acaagttaac 1980 aacaacaatt gcattcattt tatgtttcag gttcaggggg agatgtggga ggttttttaa 2040 agcaagtaaa acctctacaa atgtggtaga attctacgta gataaaagtt ttgttacttt 2100 atagaagaaa ttttgagttt ttgttttttt taataaataa ataaacataa ataaattgtt 2160 tgttgaattt attattagta tgtaagtgta aatataataa aacttaatat ctattcaaat 2220 taataaataa acctcgatat acagaccgat 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tgcggtaagt gtcactgatt ttgaactata 3120 acgaccgcgt gagtcaaaat gacgcatgat tatcttttac gtgactttta agatttaact 3180 catacgataa ttatattgtt atttcatgtt ctacttacgt gataacttat tatatatata 3240 ttttcttgtt atagatatca agcttataga tctggggaca gccccccccc aaagccccca 3300 gggatgtaat tacgtccctc ccccgctagg gggcagcagc gagccgcccg gggctccgct 3360 ccggtccggc gctccccccg catccccgag ccggcagcgt gcggggacag cccgggcacg 3420 gggaaggtgg cacgggatcg ctttcctctg aacgcttctc gctgctcttt gagcctgcag 3480 acacctgggg ggatacgggg aaaaagcttt aggctgaaag agagatttag aatgacagaa 3540 tcatagaacg gcctgggttg caaaggagca cagtgctcat ccagatccaa ccccctgcta 3600 tgtgcagggt catcaaccag cagcccaggc tgcccagagc cacatccagc ctggccttga 3660 atgcctgcag ggatggggca tccacagcct ccttgggcaa cctgttcagt gcgtcaccac 3720 cctctggggg aaaaactgcc tcctcatatc caacccaaac ctcccctgtc tcagtgtaaa 3780 gccattcccc cttgtcctat caagggggag tttgctgtga cattgttggt ctggggtgac 3840 acatgtttgc caattcagtg catcacggag aggcagattt ggggataagg aagtgcagga 3900 cagcatggac gtgggacatg caggtgttga gggctctggg acactctcca agtcacagcg 3960 ttcagaacag ccttaaggat aagaagatag gatagaagga caaagagcaa gttaaaaccc 4020 agcatggaga ggagcacaaa aaggccacag acactgctgg tccctgtgtc tgagcctgca 4080 tgtttgatgg tgtctggatg caagcagaag gggtggaaga gcttgcctgg agagatacag 4140 ctgggtcagt aggactggga caggcagctg gagaattgcc atgtagatgt tcatacaatc 4200 gtcaaatcat gaaggctgga aaagccctcc aagatcccca agaccaaccc caacccaccc 4260 accgtgccca ctggccatgt ccctcagtgc cacatcccca cagttcttca tcacctccag 4320 ggacggtgac ccccccacct ccgtgggcag ctgtgccact gcagcaccgc tctttggaga 4380 aggtaaatct tgctaaatcc agcccgaccc tcccctggca caacgtaagg ccattatctc 4440 tcatccaact ccaggacgga gtcagtgagg atggggctct agagtcaaca ggaaagttcc 4500 attggagcca agtacattga gtcaataggg actttccaat gggttttgcc cagtacataa 4560 ggtcaatggg aggtaagcca atgggttttt cccattactg gcacgtatac tgagtcatta 4620 gggactttcc aatgggtttt gcccagtaca taaggtcaat aggggtgaat caacaggaaa 4680 gtcccattgg agccaagtac actgagtcaa tagggacttt ccattgggtt ttgcccagta 4740 caaaaggtca atagggggtg agtcaatggg tttttcccat tattggcacg tacataaggt 4800 caataggggt gagtcattgg gtttttccag ccaatttaat taaaacgcca tgtactttcc 4860 caccattgac gtcaatgggc tattgaaact aatgcaacgt gacctttaaa cggtactttc 4920 ccatagctga ttaatgggaa agtaccgttc tcgagccaat acacgtcaat gggaagtgaa 4980 agggcagcca aaacgtaaca ccgccccggt tttcccctgg aaattccata ttggcacgca 5040 ttctattggc tgagctgcgt tctacgtggg tatataagca gagctctccc tatcagtgat 5100 agagatctcc ctatcagtga tagagatcga gctcagcgtc ggtaccgtac ctcttccgca 5160 tcgctgtctg cgagggccag ctgttggggt gagtggcggg tgtggcttcc gcgggccccg 5220 gagctggagc cctgctctga gcgggccggg ctgatatgcg agtgtcgtcc gcagggttta 5280 gctgtgagca ttcccacttc gagtggcggg cggtgcgggg gtgagagtgc gaggcctagc 5340 ggcaaccccg tagcctcgcc tcgtgtccgg cttgaggcct agcgtggtgt ccgccgccgc 5400 gtgccactcc ggccgcacta tgcgtttttt gtccttgctg ccctcgattg ccttccagca 5460 gcatgggcta acaaagggag ggtgtggggc tcactcttaa ggagcccatg aagcttacgt 5520 tggataggaa tggaagggca ggaggggcga ctggggcccg cccgccttcg gagcacatgt 5580 ccgacgccac ctggatgggg cgaggcctgt ggctttccga agcaatcggg cgtgagttta 5640 gcctacctgg gccatgtggc cctagcactg ggcacggtct ggcctggcgg tgccgcgttc 5700 ccttgcctcc caacaagggt gaggccgtcc cgcccggcac cagttgcttg cgcggaaaga 5760 tggccgctcc cggggccctg ttgcaaggag ctcaaaatgg aggacgcggc agcccggtgg 5820 agcgggcggg tgagtcaccc acacaaagga agagggcctt gcccctcgcc ggccgctgct 5880 tcctgtgacc ccgtggtcta tcggccgcat agtcacctcg ggcttctctt gagcaccgct 5940 cgtcgcggcg gggggagggg atctaatggc gttggagttt gttcacattt ggtgggtgga 6000 gactagtcag gccagcctgg cgctggaagt cattcttgga atttgcccct ttgagtttgg 6060 agcgaggcta attctcaagc ctcttagcgg ttcaaaggta ttttctaaac ccgtttccag 6120 ctcgcggttg aggacaaact cttcgcggtc tttccagtac tcttggatcg gaaacccgtc 6180 ggcctccgaa cggtactccg ccaccgaggg acctgagcga gtccgcatcg accggatcgg 6240 aaaacctcgt cgacgccgcc accatgggaa tcctgccaag ccctggaatg ccagccctgc 6300 tgtccctggt gtctctgctg agcgtgctgc tgatgggatg cgtggcagag accggaacaa 6360 ggttccctaa catcaccaac ctgtgcccat tcggcgaggt gtttaacgcc acacgctttg 6420 cctccgtgta tgcctggaac cggaagagaa 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ggggggatac ggggaaaaag gggagctcta 8160 gagggacagc ccccccccaa agcccccagg gatgtaatta cgtccctccc ccgctagggg 8220 gcagcagcga gccgcccggg gctccgctcc ggtccggcgc tccccccgca tccccgagcc 8280 ggcagcgtgc ggggacagcc cgggcacggg gaaggtggca cgggatcgct ttcctctgaa 8340 cgcttctcgc tgctctttga gcctgcagac acctgggggg atacggggaa aaaggatcca 8400 tggccggcca tctgcagatc atatgatcgg atgccgggac cgacgagtgc agaggcgtgc 8460 aagcgagctt ggcgtaatca tggtcatagc tgtttcctgt gtgaaattgt tatccgctca 8520 caattccaca caacatacga gccggaagca taaagtgtaa agcctggggt gcctaatgag 8580 tgagctaact cacattaatt gcgttgcgct cactgcccgc tttccagtcg ggaaacctgt 8640 cgtgccagct gcattaatga atcggccaac gcgcggggag aggcggtttg cgtattgggc 8700 gctcttccgc ttcctcgctc actgactcgc tgcgctcggt cgttcggctg cggcgagcgg 8760 tatcagctca ctcaaaggcg gtaatacggt tatccacaga atcaggggat aacgcaggaa 8820 agaacatgtg agcaaaaggc cagcaaaagg ccaggaaccg taaaaaggcc gcgttgctgg 8880 cgtttttcca taggctccgc ccccctgacg agcatcacaa aaatcgacgc tcaagtcaga 8940 ggtggcgaaa cccgacagga ctataaagat accaggcgtt tccccctgga agctccctcg 9000 tgcgctctcc tgttccgacc ctgccgctta ccggatacct gtccgccttt ctcccttcgg 9060 gaagcgtggc gctttctcat agctcacgct gtaggtatct cagttcggtg taggtcgttc 9120 gctccaagct gggctgtgtg cacgaacccc ccgttcagcc cgaccgctgc gccttatccg 9180 gtaactatcg tcttgagtcc aacccggtaa gacacgactt atcgccactg gcagcagcca 9240 ctggtaacag gattagcaga gcgaggtatg taggcggtgc tacagagttc ttgaagtggt 9300 ggcctaacta cggctacact agaagaacag tatttggtat ctgcgctctg ctgaagccag 9360 ttaccttcgg aaaaagagtt ggtagctctt gatccggcaa acaaaccacc gctggtagcg 9420 gtggtttttt tgtttgcaag cagcagatta cgcgcagaaa aaaaggatct caagaagatc 9480 ctttgatctt ttctacgggg tctgacgctc agtggaacga aaactcacgt taagggattt 9540 tggtcatgag attatcaaaa aggatcttca cctagatcct tttaaattaa aaatgaagtt 9600 ttaaatcaat ctaaagtata tatgagtaaa cttggtctga cagttaccaa tgcttaatca 9660 gtgaggcacc tatctcagcg atctgtctat ttcgttcatc catagttgcc tgactccccg 9720 tcgtgtagat aactacgata cgggagggct taccatctgg ccccagtgct gcaatgatac 9780 cgcgagaccc acgctcaccg gctccagatt 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taagaaacca ttattatcat gacattaacc tataaaaata 10680 ggcgtatcac gaggcccttt cgtc 10704

Claims (12)

  1. 목적 단백질을 발현하는 세포주의 배양방법으로서,
    상기 단백질을 발현하는 세포주를 배양하는 단계를 포함하며, 상기 세포주를 배양하는 단계는 배양액의 pH를 조절하는 것을 포함하며,
    상기 목적 단백질은 SARS-CoV-2 스파이크 단백질의 수용체 결합 도메인(Receptor Binding Domain) 및 나노입자의 구조체인 I53-50A를 포함하는 단백질로서, 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열로 표시되는 폴리펩타이드 또는 이와 95% 이상 서열 상동성을 갖는 폴리펩타이드이고,
    상기 세포주는 중국 햄스터 난소(Chinese Hamster Ovary, CHO) 세포에서 유래하고,
    전체 배양기간 동안 배양액의 pH 상단값이 6.75 내지 7.15이며,
    배양 개시일로부터 4일 또는 5일이 되는 시점 이후부터 배양 종료일까지의 기간인 배양 후기에 상기 배양액으로 도입되는 기체 분사 속도(Air sparging rate)가 배양 개시일로부터 4일 또는 5일이 되는 시점 이전까지의 기간인 배양 전기의 기체 분사 속도의 절반 이하이며, 배양 후기의 기체 분사 속도가 0.0005 내지 0.001이고, 배양 종료일은 배양 개시일을 0일로 하였을 때 배양개시일부터 8일 또는 10일인, 배양 방법.
  2. 삭제
  3. 제1항에 있어서, 이산화탄소, 탄산수소나트륨 또는 이산화탄소 및 탄산수소나트륨을 이용하여 배양액의 pH를 조절하는 배양 방법.
  4. 삭제
  5. 제1항에 있어서, 배양 후기에 배양액으로 도입되는 탄산수소나트륨의 함량이 배양 전기 배양액으로 도입되는 탄산수소나트륨의 함량보다 낮은 배양 방법.
  6. 삭제
  7. 삭제
  8. 제1항에 있어서, 배양 기간 내 배양이 이루어지는 바이오리액터로의 산소 유량(flow rate)이 20 LPM 이하로 유지되는 배양 방법.
  9. 제1항에 있어서, 배양 후기 배양이 이루어지는 바이오리액터로의 이산화탄소 유량이 5 LPM 이하로 유지되는 배양 방법.
  10. 제1항에 있어서, 배양 후기의 배양 온도가 배양 전기의 배양온도보다 낮은 배양 방법.
  11. 제10항에 있어서, 배양 후기의 배양 온도가 배양 전기의 배양온도보다 1℃ 내지 10 ℃ 낮은 배양 방법.
  12. 제1항에 있어서, 배양 기간이 11일인 배양 방법.


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