KR20230054234A - 코로나19 백신 제조방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 코로나19 백신 제조방법에 관한 것이다.

Description

코로나19 백신 제조방법{A method for preparing vaccine for COVID-19}
본 발명은 코로나19 백신 제조방법에 관한 것이다.
2019년 중국 우한에서 발생한 신종 코로나바이러스(2019-nCoV)는 2019년 후반기에 처음으로 인체 감염이 확인되었다는 의미에서 COVID-19로 명명되었으며, 사람이나 동물에게 호흡기 질환을 일으키는 바이러스로 감염되면 2~3일에서 최장 2주 정도 잠복기를 거쳤다가 다양한 증상이 나타나는 것으로 알려져 있다. 주 증상으로는 무기력감, 37.5도 이상의 고열, 기침, 인후통, 가래, 근육통, 두통, 호흡곤란 및 폐렴 등의 증상이 발생하며, 폐 손상에 의한 호흡부전 등이 있으며, 심하면 사망에 이를 수 있다. 유사 질환으로는 메르스와 사스가 있으며, 메르스나 사스보다 치사율은 낮지만, 전염력이 훨씬 높은 것으로 알려져 있다. 상기와 같은 COVID-19 예방을 위한 효율적인 백신 제조와, 백신용 항원 단백질의 생산을 위한 의료산업계의 요구가 증가되는 실정이다.
이에 본 발명자들은 코로나바이러스 백신에 사용되는 단백질의 제조 및 정제방법을 개발하여, 본 발명을 완성하였다.
US 2021-0338807 A1 KR 2021-0117808 A
본 발명의 목적은 다량체성 단백질 조립체의 제조방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 하나의 목적은 면역원성 조성물의 제조방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 하나의 목적은 다량체성 단백질 조립체를 제조하는 단계를 포함하는 COVID-19 예방을 위한 백신 조성물의 제조방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 하나의 양태는 다량체성 단백질 조립체의 제조방법이다.
하나의 구체예에서, 상기 제조방법은 (a) (i) 서열번호 4 또는 이와 75% 이상 서열 동일성을 갖는 단백질 및 서열번호 5 또는 이와 75% 이상 서열 동일성을 갖는 단백질이 링커를 통해 연결된, 융합 단백질 A를 발현하는 세포주를 배양하는 단계; (ii) 상기 (i)의 배양액으로부터 상기 융합 단백질 A를 회수하여 정제하는 단계; (b) (i) 서열번호 6 또는 이와 75% 이상 서열 동일성을 갖는, 단백질 B를 발현하는 세포주를 배양하는 단계; (ii) 상기 (i)의 배양액으로부터 상기 단백질 B를 회수하여 정제하는 단계; 및 (c) 상기 (a)에서 수득한 융합 단백질 A 및 (b)에서 수득한 단백질 B를 혼합하여, 자가조립된 다량체성 단백질 조립체를 형성하는 것을 포함한다.
앞선 구체예에 따른 제조방법으로서, 상기 (a) 및 (b)는 동시에 수행되거나, 시간적 간격을 두고 수행되거나, 순차적으로 수행되거나, 역순으로 수행된다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 제조방법으로서, 상기 제조방법은 (d) 상기 (c)의 반응물을 여과하는 단계를 더 포함한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 제조방법으로서, 상기 (a) (i)는 종배양 및 본배양을 포함한다,
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 제조방법으로서, 상기 (a) (ii)는 배양액을 원심분리하여 상층액을 회수하는 것을 포함한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 제조방법으로서, 상기 (a) (ii)는 회수된 배양액을 여과하는 것을 포함한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 제조방법으로서, 상기 (a) (ii)는 뉴클레아제를 처리하는 것을 포함한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 제조방법으로서, 상기 (a) (ii)는 1차 크로마토그래피, 2차 크로마토그래피 및 3차 크로마토그래피를 수행하는 것을 포함한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 제조방법으로서, 상기 (a) (ii)는 바이러스 여과를 포함한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 제조방법으로서, 상기 (a) (ii)는 한외여과를 포함한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 제조방법으로서, 상기 (b) (i)는 종배양 및 본배양 단계를 포함한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 제조방법으로서, 상기 (b) (ii)는 세포를 파쇄하는 것을 포함한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 제조방법으로서, 상기 (b) (ii)는 뉴클레아제를 처리하는 것을 포함한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 제조방법으로서, 상기 (b) (ii)는 1차 크로마토그래피 및 2차 크로마토그래피를 수행하는 단계를 포함한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 제조방법으로서, 상기 (d)의 여과는 한외여과 및 정용여과를 포함한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 제조방법으로서, 상 기 (a) (i) 의 세포주는 중국 햄스터 난소 (Chinese Hamster Ovary, CHO) 세포에서 유래한 것이다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 제조방법으로서, 상기 (a) (i)는 배양액의 pH를 조절하는 것을 포함한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 제조방법으로서, 상기 (a) (i)는 배양액의 pH를 6.75 내지 7.15로 유지하는 것을 포함한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 제조방법으로서, 상기 (a) (i)의 배양 후기에 배양액으로 도입되는 탄산수소나트륨의 함량은 배양 전기 배양액으로 도입되는 탄산수소나트륨의 함량보다 낮다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 제조방법으로서, 상기 (a) (i)의 배양 후기에 배양액으로 도입되는 기체 분사 속도(Air sparging rate)는 배양 전기의 기체 분사 속도의 절반 이하이다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 제조방법으로서, 상기 (a) (i)의 배양 후기의 기체 분사 속도는 0.0005 내지 0.001 vvm이다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 제조방법으로서, 상기 (a) (i)의 배양 기간 내 배양이 이루어지는 바이오리액터로의 산소 유량(flow rate)은 20 LPM 이하로 유지된다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 제조방법으로서, 상기 (a) (i)의 배양 후기 배양이 이루어지는 바이오리액터로의 이산화탄소 유량은 5 LPM 이하로 유지된다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 제조방법으로서, 상기 (a) (i)의 배양 후기의 배양 온도는 배양 전기의 배양온도보다 낮다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 제조방법으로서, 상기 (a) (i)의 배양 후기의 배양 온도는 배양 전기의 배양온도보다 1℃ 내지 10℃ 낮다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 제조방법으로서, 상기 (a) (i)의 배양 기간은 6일 내지 15일이다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 제조방법으로서, 상기 (a) (i)는 배양액에 배양 첨가물을 투입하는 것을 포함한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 제조방법으로서, 상기 (a) (i)는 배양액 내 글루코스 농도를 주기적으로 모니터링하는 것을 포함한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 제조방법으로서, 상기 (a) (i)의 배양 첨가물은 배양 첨가물은 당 공급원 및 단백질 발현 촉진제를 포함한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 제조방법으로서, 상기 (a) (i)의 배양액 내 글루코스 농도는 5.0 내지 7.0 g/L로 유지된다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 제조방법으로서, 상기 (a) (i)는 배양 2일차 또는 그 이후부터 세포 배양액에 당 공급원 및 단백질 발현 촉진제를 하루 이상 간격으로 교대로 투입하는 것을 포함한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 제조방법으로서, 상기 (a) (i)의 배양 첨가물에 포함되는 단백질 발현 촉진제는 CHO 세포가 생산하는 단백질의 수율 증가를 촉진하는 물질이다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 제조방법으로서, 상기 (a) (i)의 배양 첨가물에 포함되는 당 공급원은 글루코스 용액이다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 제조방법으로서, 상기 (a) (i)의 배양 기간은 10일 내지 15일이다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 제조방법으로서, 상기 (a) (i)는 배양 3일차에 당 공급원을 세포 배양액으로 투입하는 것을 포함한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 제조방법으로서, 상기 (a) (i)는 배양 3일차부터 배양 종료시까지 격일로 당 공급원을 세포 배양액으로 투입하는 것을 포함한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 제조방법으로서, 상기 당 공급원은 배양 3일차부터 배양 종료시까지 2일 또는 3일 연속으로 1회 이상 세포 배양액으로 투입된다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 제조방법으로서, 상기 당 공급원은 배양 기간 동안 4회 이상 투입된다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 제조방법으로서, 상기 (a) (i)는 배양 2일차에 단백질 발현 촉진제를 세포 배양액으로 투입하는 것을 포함한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 제조방법으로서, 상기 (a) (i)는 배양 2일차부터 배양 종료시까지 격일로 단백질 발현 촉진제를 세포 배양액으로 투입하는 것을 포함한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 제조방법으로서, 상기 단백질 발현 촉진제는 배양 종료시까지 2일 또는 3일 또는 그 이상 간격으로 1회 이상 세포 배양액에 투입된다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 제조방법으로서, 상기 단백질 발현 촉진제는 4회 이상 세포 배양액에 투입된다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 제조방법으로서, 상기 (a) (ii)는 i) 상기 세포 배양액을 원심분리하여 상층액을 회수하는 단계; 및 ii) 상기 i)의 회수된 배양액을 여과하는 단계를 포함한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 제조방법으로서, 상기 i) 세포 배양액을 원심분리하여 상층액을 회수하는 단계는 연속 원심분리기를 이용하여 수행된다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 제조방법으로서, 상기 i) 세포 배양액을 원심분리하여 상층액을 회수하는 단계에서, 원심분리시 공급유속(feed flow)은 200 L/h 내지 400 L/h이다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 제조방법으로서, 상기 i) 세포 배양액을 원심분리하여 상층액을 회수하는 단계에서, 원심분리시 공급유속(feed flow)은 200 L/h 내지 300 L/h이다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 제조방법으로서, 상기 i) 세포 배양액을 원심분리하여 상층액을 회수하는 단계에서, 원심분리시 공급유속(feed flow)은 약 250L/h이다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 제조방법으로서, 상기 i) 세포 배양액을 원심분리하여 상층액을 회수하는 단계에서, 원심분리시 배출간격(ejection interval)은 100 내지 250 초이다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 제조방법으로서, 상기 i) 세포 배양액을 원심분리하여 상층액을 회수하는 단계에서, 원심분리시 배출간격이 190 내지 210 초이다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 제조방법으로서, 상기 ii) i)의 회수된 배양액을 여과하는 단계는 정밀여과필터를 이용하여 수행된다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 제조방법으로서, 상기 ii)의 정밀여과필터는 심층필터(Depth filter)이다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 제조방법으로서, 상기 방법은 ii)의 여과액에 계면활성제를 추가로 처리하는 것을 포함한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 제조방법으로서, 상기 (a) (ii)는 뉴클레아제의 농도, 처리 시간 및 상기 배양액의 Mg2+ 이온의 농도로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 인자를 조절하는 것을 포함한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 제조방법으로서, 상기 (a) (ii)는 i) 세포주 배양액을 회수하는 단계; ii) 회수된 배양액을 여과하는 단계; iii) 여과된 배양액에 뉴클레아제를 처리하되, 뉴클레아제의 농도, 처리 시간 및 상기 배양액의 Mg2+ 이온의 농도로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 인자를 조절하는 단계; 및 iv) 상기 배양액을 정제하는 단계를 포함한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 제조방법으로서, 상기 뉴클레아제는 벤조네이즈(Benzonase) 이다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 제조방법으로서, 상기 iii)은 뉴클레아제의 농도를 1 unit/ml 내지 20 unit/ml로 조절하는 것을 포함한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 제조방법으로서, 상기 iii)은 뉴클레아제의 농도를 2 unit/ml 내지 14 unit/ml 로 조절하는 것을 포함한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 제조방법으로서, 상기 iii)은 뉴클레아제의 농도를 2 unit/ml 내지 4 unit/ml 로 조절하는 것을 포함한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 제조방법으로서, 상기 iii)은 뉴클레아제의 농도를 약 2 unit/ml 로 조절하는 것을 포함한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 제조방법으로서, 상기 iii)은 뉴클레아제의 처리 시간을 2 시간 내지 7 일로 조절하는 것을 포함한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 제조방법으로서, 상기 iii)은 뉴클레아제의 처리 시간을 2 시간 내지 6 시간으로 조절하는 것을 포함한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 제조방법으로서, 상기 iii)은 배양액의 Mg2+ 이온의 농도를 2 mM 이하로 조절하는 것을 포함한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 제조방법으로서, 상기 iii)은 상기 뉴클레아제의 농도를 2 unit/ml 내지 14 unit/ml, 상기 뉴클레아제의 처리 시간을 2 시간 내지 7 일, 상기 배양액의 Mg2+ 이온의 농도를 2 mM 이하로 조절하는 것을 포함한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 제조방법으로서, 상기 iii)은 상기 뉴클레아제의 농도를 2 unit/ml 내지 4 unit/ml; 상기 뉴클레아제의 처리 시간을 4시간 이상, 또는 2 시간 내지 6 시간; 및/또는 상기 배양액의 Mg2+ 이온의 농도를 2 mM 이하로 조절하는 것을 포함한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 제조방법으로서, 상기 iv)은 하나 이상의 크로마토그래피 단계를 포함한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 제조방법으로서, 상기 iv)은 1차 크로마토그래피, 2차 크로마토그래피 및 3차 크로마토그래피 단계를 포함한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 제조방법으로서, 상기 (a) (ii)의 1차 크로마토그래피 단계는 소수성 상호 작용 크로마토그래피(Hydrophobic Interaction Chromatography)이다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 제조방법으로서, 상기 (a) (ii)의 2차 크로마토그래피 단계는 혼합 모드 크로마토그래피(Mixed Mode Chromatography)이다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 제조방법으로서, 상기 (a) (ii)의 3차 크로마토그래피 단계는 음이온 교환 크로마토그래피(Anion Exchange Chromatography) 이다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 제조방법으로서, 상기 (a) (ii)는 '한외여과 및 정용여과(완충액 교환: Diafiltration)를 포함한다
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 제조방법으로서, 상기 (a) (ii)의 한외여과 단계는 30 킬로달톤 (kDa) 내지 100 kDa의 분자 컷오프 값을 갖는 한외여과막 필터를 사용한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 제조방법으로서, 상기 (a) (ii)의 한외여과 단계는 25 mSm/cm 이하의 전도도가 이용된다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 제조방법으로서, 상기 (a) (ii)의 한외여과 단계는 pH 6.0 내지 9.0의 완충용액이 사용된다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 제조방법으로서, 상기 (b) (i)의 세포주는 에스케리키아 속 미생물이다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 제조방법으로서, 상기 (b) (i)의 세포주는 대장균이다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 제조방법으로서, 상기 (b) (i)의 배양 배지는 글리세롤을 0 초과 4% (v/v) 미만의 함량으로 포함한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 제조방법으로서, 상기 (b) (i)의 미생물은 서열번호 6 또는 이와 75% 이상 동일성을 가지는 단백질을 코딩하는 핵산서열; 또는 이를 포함하는 발현 벡터를 포함한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 제조방법으로서, 상기 (b) (i)의 미생물이 포함하는 발현벡터는 lac 오페론을 포함한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 제조방법으로서, 상기 (b) (i)의 미생물이 포함하는 발현벡터는 도 13에 표시된 개열지도를 가진다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 제조방법으로서, 상기 (b) (i) 단계에서 글리세롤을 0 초과 4% (v/v) 미만의 함량으로 포함하는 배양 단계는 종배양(seed fermentation) 단계 이후 수행된다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 제조방법으로서, 상기 (b) (i) 단계에서 글리세롤 포함 배지는 대장균의 성장기(Growth phase) 배지이다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 제조방법으로서, 상기 (b) (i) 의 미생물은 대장균(Escherichia coli) BL21 균주이다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 제조방법으로서, 상기 (b) (i) 는 배양 배지에 IPTG를 첨가하는 단계를 포함한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 제조방법으로서, 상기 (b) (i) 는 배양 배지에 IPTG를 첨가하여 0 초과 2.0mM 이하의 IPTG 존재 하에 상기 세포주를 배양하는 것을 포함한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 제조방법으로서, 상기 IPTG의 첨가는 미생물의 성장이 대수기 후반에 진입했을 때 이루어진다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 제조방법으로서, 상기 (b) (i) 는 IPTG를 첨가한 후 1시간 내지 30시간 동안 배양하는 것을 포함한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 제조방법으로서, 상기 (b) (ii)는 미생물을 현탁액으로 현탁하는 단계; 및 상기 현탁액을 파쇄하는 단계를 포함한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 제조방법으로서, 상기 현탁액의 부피는 미생물 1g당 8ml 내지 14ml이다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 제조방법으로서, 상기 파쇄 압력은 14000 psi 내지 21000 psi이다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 제조방법으로서, 상기 미생물은 원심분리를 통해 펠렛화되거나 동결된 상태이다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 제조방법으로서, 상기 (b) (ii)는 뉴클레아제(nuclease)를 처리하는 단계를 포함한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 제조방법으로서, 상기 뉴클레아제(nuclease)는 벤조네이즈(benzonase)이다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 제조방법으로서, 상기 (b) (ii)의 뉴클레아제(nuclease) 처리는 함량이 10 unit/mL이 되도록 처리하는 것이다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 제조방법으로서, 상기 (b) (ii)의 뉴클레아제 처리 단계는 뉴클레아제 처리 후 300분 이하의 시간 동안 반응시키는 것이다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 제조방법으로서, 상기 (b) (ii)의 뉴클레아제 처리 단계는 pH 7 내지 9 조건에서 수행된다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 제조방법으로서, 상기 (b) (ii)는 뉴클레아제 처리 단계 이후 상등액과 봉입체를 분리하는 단계를 추가로 포함한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 제조방법으로서, 상기 (b) (ii)의 상등액과 봉입체는 원심분리 및/또는 여과를 통해 분리된다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 제조방법으로서, 상기 (b) (ii)의 파쇄된 현탁액은 단백질 B의 봉입체(inclusion body) 형태를 포함한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 제조방법으로서, 상기 (b) (ii)는 봉입체의 가용화 단계를 포함한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 제조방법으로서, 상기 (b) (ii)는 i) 1차 음이온 교환 크로마토그래피 및 ii) 2차 음이온 교환 크로마토그래피를 수행하는 단계를 포함한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 제조방법으로서, 상기 (b) (ii)의 i) 1차 및 ii) 2차 음이온 교환 크로마토그래피는 2급 또는 3급 아민을 교환기로 갖는 수지로 충진된 음이온 교환수지 컬럼에 로딩하는 단계를 포함한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 제조방법으로서, 상기 (b) (ii)의 i) 1차 및 ii) 2차 음이온 교환 크로마토그래피의 음이온 교환수지 컬럼은 PEI(Polyethyleneimine), PAB(Para-aminobenzyl), AE(amino ethyl), DEAE(diethyl aminoethyl) 또는 DMAE(dimethyl aminoethyl) 컬럼이다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 제조방법으로서, 상기 (b) (ii)의 i) 1차 음이온 교환 크로마토그래피는 네거티브 모드(negative mode)로 수행된다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 제조방법으로서, 상기 (b) (ii)의 ii) 2차 음이온 교환 크로마토그래피는 파지티브 모드(positive mode)로 수행된다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 제조방법으로서, 상기 (b) (ii)의 ii) 2차 음이온 교환 크로마토그래피의 완충액은 세제를 포함한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 제조방법으로서, 상기 (b) (ii)의 ii) 2차 음이온 교환 크로마토그래피의 완충액의 세제의 함량은 0.01 내지 5%(v/v)이다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 제조방법으로서, 상기 세제는 Triton X-100이다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 제조방법으로서, 상기 (b) (ii)의 ii) 2차 음이온 교환 크로마토그래피는 세제 및 염(salt)을 포함하는 인산 완충액을 이용하여 수지를 1차 세척하는 단계; 및 세제 및 염을 포함하는 인산 완충액을 이용하여 수지를 2차 세척하는 단계를 포함한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 제조방법으로서, 상기 2차 세척 단계의 완충액에 포함된 염은 150mM 이상 250mM 미만의 농도로 포함된다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 제조방법으로서, 상기 2차 세척 단계의 완충액에 포함된 염은 염화나트륨(NaCl)이다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 제조방법으로서, 상기 (b) (ii)의 정제는 2차 크로마토그래피로부터 회수된 용액을 여과하는 단계를 포함한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 제조방법으로서, 상기 (b) (ii)는 한외여과 및 정용여과(완충액 교환: Diafiltration)를 포함한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 제조방법으로서, 상기 여과 공정은 Tris, 염화나트륨 및 세제를 포함하는 완충액의 존재하에 수행된다. 앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 제조방법으로서, 상기 여과 공정의 완충액에 포함된 세제는 CHAPS이다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 제조방법으로서, 상기 여과 공정의 완충액에 포함된 세제의 함량은 0.01% 내지 5%(v/v)이다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 제조방법으로서, 상기 (b) (ii) 는 추가적인 크로마토그래피 공정을 수행하지 않는 것을 특징으로 한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 제조방법으로서, 상기 (c)에서 융합 단백질 A와 단백질 B의 몰 비율은 1:10 내지 2:1이다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 제조방법으로서, 상기 (c)의 혼합반응 시간은 1시간을 초과한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 제조방법으로서, 상기 (c)의 혼합 반응은 안정제를 포함하는 완충액 존재 하에 수행된다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 제조방법으로서, 상기 (c)의 완충액에 포함되는 상기 안정제는 폴리소르베이트-20, 폴리소르베이트-40, 폴리소르베이트-60, 폴리소르베이트-65, 폴리소르베이트-80, 폴리소르베이트-85, 폴록사머-188, 소르비탄 모노라우레이트, 소르비탄 모노팔미테이트, 소르비탄 모노스테아레이트, 소르비탄 모노올레에이트, 소르비탄 트리라우레이트, 소르비탄 트리스테아레이트, 소르비탄 트리올레이트(trioleate), 아르기닌, 수크로오스 또는 이들의 조합으로부터 선택된다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 제조방법으로서, 상기 (c)의 완충액에 포함되는 상기 안정제의 함량은 0 초과 0.050%(v/v) 미만이다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 제조방법으로서, 상기 (d)의 여과 단계는 0.01 μm 내지 0.5 μm 필터로 여과하는 것을 포함한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 제조방법으로서, 상기 (d)의 여과는 한외여과 수행 후 정용여과를 수행한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 제조방법으로서, 상기 (d)의 여과막은 100kDa 이상 500kDa 미만의 분획분자량(MWCO; molecular weight cut-off)을 갖는다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 제조방법으로서, 상기 (d)의 여과 단계는 접선유동여과(Tangential flow filtration) 방식을 이용한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 제조방법으로서, 상기 (d)의 한외여과는 단백질 농도가 4mg/mL 미만이 되도록 수행한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 제조방법으로서, 상기 (d)의 정용여과 시 단백질의 초기 농도는 4mg/mL 미만이다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 제조방법으로서, 상기 (d)의 여과막 면적당 단백질 부하(load)량은 300mg/0.1m2 이상 750 mg/0.1m2 이하이다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 제조방법으로서, 상기 융합 단백질 A의 링커는 Gly-Ser 링커를 포함한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 제조방법으로서, 상기 링커는 (GGGGS)n, (GSSGSS)n, (GSSSSSS)n, (SSSSSSS)n, (GSGGSGSGSGGSGSG)n, (GGSGGSGS)n 또는 (GSGGSGSG)n 링커이다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 제조방법으로서, 상기 링커는 나선 링커(helical linker) EKAAKAEEAAR 서열을 포함한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 제조방법으로서, 상기 융합 단백질 A는 서열번호 1 또는 이와 75% 이상 서열 동일성을 가진다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 제조방법으로서, 상기 다량체성 단백질 조립체는 융합 단백질 A의 삼량체, 및 단백질 B의 오량체를 포함한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 제조방법으로서, 상기 다량체성 단백질 조립체는 융합 단백질 A의 삼량체 20개와 단백질 B의 오량체 12개로 구성된다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 제조방법으로서, 상기 다량체성 단백질 조립체는 20 nm 내지 80 nm의 평균직경을 갖는다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 제조방법으로서, 상기 다량체성 단백질 조립체는 20면체 구조를 갖는다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 제조방법으로서, 상기 다량체성 단백질 조립체는 백신 조성물을 제조하기 위한 것이다.
본 발명의 다른 하나의 양태는 상기 다량체성 단백질 조립체를 제조하는 단계를 포함하는 면역원성 조성물의 제조방법이다.
본 발명의 다른 하나의 양태는 상기 제조된 다량체성 단백질 조립체를 포함하는 면역원성 조성물이다.
본 발명의 다른 하나의 양태는 상기 제조된 다량체성 단백질 조립체를 포함하는 백신 조성물이다.
하나의 구체예에서, 상기 백신 조성물은 COVID-19 예방을 위한 것이다.
이를 구체적으로 설명하면 다음과 같다. 한편, 본 발명에서 개시된 각각의 설명 및 실시형태는 각각의 다른 설명 및 실시 형태에도 적용될 수 있다. 즉, 본 발명에서 개시된 다양한 요소들의 모든 조합이 본 발명의 범주에 속한다. 또한, 하기 기술된 구체적인 서술에 의하여 본 발명의 범주가 제한된다고 볼 수 없다. 또한, 본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.
또한, 당해 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 통상의 실험만을 사용하여 본 발명에 기재된 본 발명의 특정 양태에 대한 다수의 등가물을 인지하거나 확인할 수 있다. 또한, 이러한 등가물은 본 발명에 포함되는 것으로 의도된다.
본원에서, 용어 "약(about)"은 특정 숫자 값 앞에 제시될 수 있다. 본 출원에서 사용되는 용어 "약"은 용어 뒤에 기재되는 정확한 숫자뿐만 아니라, 거의 그 숫자이거나 그 숫자에 가까운 범위까지 포함한다. 그 숫자가 제시된 문맥을 고려하여, 언급된 구체적인 숫자와 가깝거나 거의 그 숫자인지 여부를 결정할 수 있다. 일 예로, 용어 "약"은 숫자 값의 -10% 내지 +10% 범위를 지칭할 수 있다. 다른 예로, 용어 "약"은 주어진 숫자 값의 -5% 내지 +5% 범위를 지칭할 수 있다. 그러나 이에 제한되지 않는다.
본원에서, 용어 "및/또는"은 본원에 사용되는 경우에 2가지의 명시된 특색 또는 구성요소 각각을 다른 하나와 함께 또는 다른 하나 없이 구체적으로 개시하는 것으로서 이해되어야 한다. 따라서, 본원에서 "A 및/또는 B"와 같은 어구에 사용된 용어 "및/또는"은 "A 및 B", "A 또는 B", "A" (단독), 및 "B" (단독)를 포함하도록 의도된다. 마찬가지로, "A, B, 및/또는 C"와 같은 어구에 사용된 용어 "및/또는"은 하기 측면 각각을 포괄하도록 의도된다: A, B, 및 C; A, B, 또는 C; A 또는 C; A 또는 B; B 또는 C; A 및 C; A 및 B; B 및 C; A (단독); B (단독); 및 C (단독).
본원에서, 용어 "본질적으로 이루어지는(consisting essentially of)"은 본 발명에서 청구하는 대상의 특징이 불특정 성분의 존재에 실질적으로 영향을 받지 않는 경우, 상기 불특정 성분이 존재할 수 있음을 의미한다.
본원에서, 용어 "이루어지는(consisting of)"은 특정 성분(들)의 비율이 총 100%인 것을 의미한다. 용어 "이루어지는" 이하에 오는 성분 또는 특징은 필수적이거나 의무적인 것일 수 있다. 일부 구체예에서, "이루어지는" 이하에 오는 성분 또는 특징 외에, 다른 임의의 성분 또는 필수적이지 않은 성분은 배제될 수 있다.
본원에서, 용어 "포함하는(comprising)"은 상기 용어 이하에 기재되는 특징, 단계 또는 구성 요소의 존재를 의미하며, 하나 이상의 특징, 단계 또는 구성 요소의 존재 또는 추가를 배제하지 않는다. 본원에서 "포함하는" 이하에 기재되는 성분 또는 특징은 필수적이거나 의무적인 것일 수 있으나, 일부 구체예에서는 다른 임의의 혹은 필수적이지 않은 성분 또는 특징을 더 포함할 수 있다.
본원에서, 용어 "포함하는" 은, 일부 구체예에서, "본질적으로 이루어지는" 또는 "이루어지는"을 지칭하는 것으로 수정될 수 있다.
본원에서 아미노산 서열과 관련하여, 특정 서열번호로 기재된 아미노산 서열을 "포함하는" 폴리펩티드, 특정 서열번호로 기재된 아미노산 서열로 "이루어진" 폴리펩티드, 또는 특정 서열번호로 기재된 아미노산 서열을 "갖는" 폴리펩티드 또는 단백질이라고 기재되어 있더라도, 해당 서열번호의 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드와 동일 혹은 상응하는 활성을 가지는 경우라면, 일부 서열이 결실, 변형, 치환, 보존적 치환 또는 부가된 아미노산 서열을 갖는 단백질도 본 출원에서 사용될 수 있음은 자명하다. 예를 들어, 상기 아미노산 서열 N-말단 그리고/또는 C-말단에 단백질의 기능을 변경하지 않는 서열 추가, 자연적으로 발생할 수 있는 돌연변이, 이의 잠재성 돌연변이(silent mutation) 또는 보존적 치환을 가지는 경우일 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
본원에서, 용어 "제1, 제2, 제3…" "(i), (ii), (iii)…" "i), ii), iii)…" 또는 "(a), (b), (c), (d)…"와 같은 기재는 유사한 구성을 구별하기 위해 사용되었으며, 이들 용어는 연속적이거나 순서대로 수행되는 것에 한정되지 않는다. 예를 들어, 상기 용어가 방법, 용도 또는 분석의 단계(step)와 관련하여 사용되었을 경우, 이들 단계 사이에는 시간적인 간격이 없거나, 동시에 수행되거나, 수 초, 수 분, 수 시간, 수 일, 또는 수 개월 등의 시간 간격을 두고 순차적으로 혹은 역순으로 수행될 수 있다.
본 발명의 다량체성 단백질 조립체는 WO2019-169120, US 9630994 B2, WO2021-163481, WO2021-163438, PCT/US2021/037341 에 개시된 단백질 조립체일 수 있다. 또한, 본 발명의 다량체성 단백질 조립체의 구성 요소인 융합 단백질 A 및 단백질 B에 대해서도 WO2019-169120, US 9630994 B2, WO2021-163481, WO2021-163438, PCT/US2021/037341에 개시된 내용을 참조할 수 있다.
본 발명의 다량체성 단백질 조립체의 일 구성요소인 "융합 단백질 A"는 서열번호 4 또는 이와 75% 이상 서열 동일성을 갖는 단백질 및 서열번호 5 또는 이와 75% 이상 서열 동일성을 갖는 단백질이 링커를 통해 연결된 융합 단백질로서 항원 또는 항원 단편을 표시하는 다량체성 단백질 조립체를 제조하는 데 사용될 수 있다.
상기 융합 단백질에 있어서, 서열번호 4의 단백질은 SARS-CoV-2 Spike 단백질의 단편으로, 면역원성을 나타낼 수 있다. 본 발명에서 용어 "면역원성" 이란 특이적인 단백질, 또는 상기 특이적인 단백질과 높은 동일성 정도를 갖는 아미노산 서열을 포함하는 단백질에 대해 면역 반응을 유발하는 상기 특이적인 단백질 또는 이의 특이적인 영역의 능력을 지칭한다. 따라서 상기 다량체성 단백질 조립체에 포함될 수 있는 면역원성 단백질은 서열번호 4 또는 이와 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상 동일성을 갖는 서열을 가질 수 있다.
본 발명의 서열번호 5의 단백질은 면역원성 단백질과 연결되어 다량체성 단백질 조립체의 구조를 형성하고 항원을 표시한다. 상기 서열번호 5의 단백질은 다량성 단백질 조립체로의 조립을 교란시키지 않는 임의의 변형을 포함할 수 있으며, 예를 들어 아미노산의 추가, 결실, 삽입, 치환 또는 변형을 포함할 수 있다. 일 구현예로, 서열번호 5 또는 이와 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상 동일성을 갖는 서열을 가질 수 있다. 전술한 구현예 중 어느 하나의 구현예로, 면역원성 단백질과 연결되어 다량체성 단백질 조립체의 구조를 형성하고 항원을 표시하는 단백질은 서열번호 5, 17, 18, 19, 20 또는 21의 아미노산 서열을 포함하거나, 상기 서열로 본질적으로 이루어지거나(consisting essentially of) 또는 이루어진 것일 수 있다. 서열번호 5의 단백질에 상응하는 기능을 갖는 단백질의 예시로 WO2019-169120의 서열번호 7, 29, 30, 31, 39의 아미노산 서열로 표시되는 단백질을 들 수 있다.
전술한 구현예 중 어느 하나의 구현예로, 본 발명의 서열번호 5의 단백질의 범위에는 서열번호 5와 적어도 1, 2, 3, 4 또는 5개의 식별된 계면(interface) 위치에서 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 상기 단백질에 있어서, 조립되어 나노 구조를 형성하도록 하는 계면에 존재하는 것으로 식별된 계면 잔기는, 서열번호 5의 N-말단으로부터 25, 29, 33, 54 및 57일 수 있다.
상기 링커는 임의의 적합한 길이의 링커를 사용할 수 있다. 예를 들어, 상기 링커는 펩타이드 링커일 수 있고, 그 예로 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20개 이상의 아미노산으로 구성된 것일 수 있다. 일 구현예로 글리신 및/또는 세린 잔기를 포함하는 Gly-Ser링커일 수 있다. 전술한 구현예 중 어느 하나의 구현예로, 상기 링커는 (GGGGS)n, (GSSGSS)n, (GSSSSSS)n, (SSSSSSS)n, (GSGGSGSGSGGSGSG)n, (GGSGGSGS)n 또는 (GSGGSGSG)n 링커일 수 있다. 전술한 구현예 중 어느 하나의 구현예로, 링커는 나선 링커(helical linker) 서열을 포함할 수 있다. 구체적으로 상기 나선 링커는 EKAAKAEEAAR 서열로 표시될 수 있다. 링커의 구체적인 일 예시로 서열번호 1의 N-말단으로부터 237번 아미노산 내지 263번 아미노산 서열을 들 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
항원 단백질과 나노구조의 연결은, 예를 들어 서열번호 1의 융합 단백질과 같이 N-또는 C-말단에 융합된 형태의 융합 단백질로 발현됨으로써 달성될 수 있으나, 이에 제한되지 않고 번역-후 공유 부착에 의해 달성되거나, 비-공유 부착에 의해 달성될 수 있다. 또한 항원 단백질이 어떻게 부착되는지에 따라 항원 단백질은 임의의 배향으로 표시될 수 있다.
전술한 구현예 중 어느 하나의 구현예로, 상기 융합 단백질 A는 서열번호 1 또는 이와 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상 동일성을 갖는 서열을 가질 수 있다. 본원에서, 서열번호 1 의 단백질은 "Component A"로 지칭할 수 있다. 복수 개의 단리된 서열번호 1의 단백질 단량체는 상호작용을 통해 자가-조립(self-assembly)되어 삼량체(trimer)를 형성할 수 있다. 이러한 조립은 비공유성 단백질-단백질 상호작용 반응을 통해 이루어질 수 있다.
본 발명의 다량체성 단백질 조립체에 있어서 상기 "단백질 B"는 면역원성 조성물의 제조에 사용되는, 항원 또는 항원 단편을 표시하는 다량체성 단백질 조립체를 제조하는 데 사용될 수 있다. 구체적으로 서열번호 6으로 표시되는 단백질일 수 있으나, 이와 동일한 기능을 가지는 것은 제한없이 포함한다.
일 구현예로, 상기 단백질 B는 서열번호 6 또는 이와 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상 동일성을 갖는 서열을 가질 수 있다. 전술한 구현예 중 어느 하나의 구현예로, 상기 단백질 B는 서열번호 6, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 또는 16의 아미노산 서열을 포함하거나, 상기 서열로 본질적으로 이루어지거나(consisting essentially of) 또는 이루어진 것일 수 있다. 서열번호 6의 단백질에 상응하는 기능을 갖는 단백질의 예시로 WO2019-169120의 서열번호 6, 8, 10, 27, 28, 32, 33, 38의 아미노산 서열로 표시되는 단백질을 들 수 있다.
전술한 구현예 중 어느 하나의 구현예로, 상기 단백질 B는 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 또는 13개의 식별된 계면(interface) 위치에서 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 상기 단백질에 있어서, 조립되어 나노 구조를 형성하도록 하는 계면에 존재하는 것으로 식별된 계면 잔기는, 서열번호 6의 N-말단으로부터 24, 28, 36, 124, 125, 127, 128, 129, 131, 132, 133, 135, 및 139일 수 있다. 본원에서 서열번호 6의 단백질은 "Component B"로 지칭할 수 있다. 복수 개의 단리된 서열번호 6의 단백질 단량체는 상호작용을 통해 자가-조립(self-assembly)되어 오량체(pentamer)를 형성할 수 있다. 이러한 조립은 비공유성 단백질-단백질 상호작용 반응을 통해 이루어질 수 있다.
이와 같은 Component B와 Component A는 자가조립되어 면역원성 조성물을 형성할 수 있으며, 일 예로 코로나바이러스에 대한 백신의 일 구성요소일 수 있다.
본 발명의 융합 단백질 A 및 단백질 B는 다량성 단백질 조립체로의 조립을 교란시키지 않는 임의의 변형을 포함할 수 있으며, 예를 들어 아미노산의 추가, 결실, 삽입, 치환 또는 변형을 포함할 수 있다. 그 예로 보존적 서열 변형을 포함하는 경우를 들 수 있다.
본 발명에서, "보존적 서열 변형"은 목적 단백질의 구조적 특성에 유의하게 영향을 끼치거나 변화시키지 않는 아미노산 변형을 의미할 수 있다. 이러한 보존적 변형은 아미노산 치환, 부가 및 결실을 포함한다. 보존적 아미노산 치환은 아미노산 잔기가 유사 측쇄를 갖는 아미노산 잔기로 대체되는 것이다. 이러한 치환은 일반적으로 소수성도, 친수성도, 전하, 크기 등과 같은 아미노산 측쇄 치환기의 상대적 유사성에 기초한 것이다. 유사 측쇄를 갖는 아미노산 잔기의 패밀리는 당해 기술 분야에서 정의되어 있다. 이러한 패밀리는 염기성 측쇄(예를 들면, 리신, 아르기닌, 히스티딘), 산성 측쇄(예를 들면, 아스파르트 산, 글루타민 산), 비대전 극성 측쇄(예를 들면, 글리신, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌, 티로신, 시스테인, 트립토판), 비극성 측쇄(예를 들면, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌), 베타-분지 측쇄(예를 들면, 트레오닌, 발린, 이소류신) 및 방향성 측쇄(예를 들면, 티로신, 페닐알라닌, 트립토판, 히스티딘)를 갖는 아미노산을 포함한다.
본 발명의 다량체성 단백질 조립체는 융합 단백질 A의 삼량체와 단백질 B의 오량체가 자가조립하여 형성될 수 있다. Component A와 Component B가 자가조립되어 형성한 다량체성 단백질 조립체는 "Nanoparticle"혹은 "나노파티클", "나노구조(체)"로도 지칭할 수 있다.
구체적으로 본 발명의 다량체성 단백질 조립체는 상기 융합 단백질 A의 삼량체 20개와 상기 단백질 B의 오량체를 12개 포함하는 구조를 가질 수 있다. 따라서 본 발명의 다량체성 단백질 조립체는 융합 단백질 A의 60개 카피 및 단백질 B의 60개 카피를 포함한다. 한편 상기 다량체성 단백질 조립체는, 융합 단백질 A 및 단백질 B 간의 비-공유 상호작용으로 형성될 수 있다. 즉, 융합 단백질 A 및 단백질 B 간에는 공유결합을 형성하지 않는 것일 수 있다.
본 발명의 다량체성 단백질 조립체는 이십면체의 대칭구조를 가질 수 있다. 본 발명의 다량체성 단백질 조립체는 약 20 nm 내지 80 nm, 구체적으로는 30 nm 내지 약 70 nm의 직경을 가질 수 있다.
본 발명의 제조방법에 있어서, (a) 및 (b)는 동시에 수행되거나, 시간적 간격을 두고 수행되거나, 순차적으로 수행되거나, 또는 역순으로 수행될 수 있다.
본 발명의 제조방법에 있어서, (i) 및 (ii)는 동시에 수행되거나, 시간적 간격을 두고 수행되거나, 순차적으로 수행될 수 있다.
본 발명의 제조방법에 있어서, 융합 단백질 A 및 단백질 B를 발현하는 세포주는 개별적으로 제조된 후 세포은행(cell bank)에 저장될 수 있다.
본 발명의 제조방법에 있어서, 융합 단백질 A 및 단백질 B는 개별적으로 제조되어 저장된 후 (c) 단계를 수행할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서 제공하는 목적 단백질인 융합 단백질 A 또는 단백질 B를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 코돈의 축퇴성(degeneracy)으로 인하여 또는 상기 단백질을 발현시키고자 하는 생물에서 선호되는 코돈을 고려하여, 단백질의 아미노산 서열을 변화시키지 않는 범위 내에서 코딩 영역에 다양한 변형이 이루어질 수 있다.
또한, 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 공지의 유전자 서열로부터 제조될 수 있는 프로브, 예를 들면, 상기 염기 서열의 전체 또는 일부에 대한 상보 서열과 엄격한 조건 하에 하이브리드화하여, 본 발명의 목적 단백질을 코딩하는 서열이라면 제한 없이 포함될 수 있다.
상기 "엄격한 조건(stringent condition)"이란 폴리뉴클레오티드 간의 특이적 혼성화를 가능하게 하는 조건을 의미한다. 이러한 조건은 문헌(예컨대, J. Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory press, Cold Spring Harbor, New York, 1989; F.M. Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., New York)에 구체적으로 기재되어 있다.
본 발명에서 제공하는 목적 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 목적 단백질의 발현을 가능하게 하는 다양한 방식으로 조작될 수 있다. 발현 벡터에 따라, 벡터로 폴리뉴클레오티드를 삽입하기 전 폴리뉴클레오티드를 조작하는 것이 필요할 수 있다. 그와 같은 조작은 당업계에 공지된 방법을 사용할 수 있다.
본 발명의 "벡터"는 적합한 숙주 내에서 목적 단백질을 발현시킬 수 있도록 적합한 발현조절영역(또는 발현조절서열)에 작동 가능하게 연결된 상기 목적 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 염기서열을 함유하는 DNA 제조물을 의미한다. 상기 발현조절영역은 전사를 개시할 수 있는 프로모터, 그러한 전사를 조절하기 위한 임의의 오퍼레이터 서열, 적합한 mRNA 리보좀 결합부위를 코딩하는 서열, 및 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열을 포함할 수 있다. 벡터는 적당한 숙주세포 내로 형질전환된 후, 숙주 게놈과 무관하게 복제되거나 기능할 수 있으며, 게놈 그 자체에 통합될 수 있다. 본 발명에서 사용될 수 있는 벡터는 특별히 한정되지 않으며, 당업계에 알려진 임의의 벡터를 이용할 수 있다.
융합 단백질 A 발현 세포의 배양
본 발명의 일 구체예에 따른 융합 단백질 A를 발현하는 세포주의 숙주세포는 진핵세포이다. 상기 진핵세포는 진균세포 (fungus), 식물세포 또는 동물세포를 포함한다. 진균세포의 예로는 효모, 그 예로 사카로마이세스 속 (Saccharomyces sp.)을 들 수 있고, 그 예로 사카로마이세스 세레비지애 (S. cerevisiae)일 수 있다. 또한, 동물세포의 예로는 곤충세포 또는 포유동물 세포가 있고, 구체적인 동물세포의 예로는 HEK293, 293T, NSO, 중국 햄스터 난소 세포 (CHO), MDCK, U2-OSHela, NIH3T3, MOLT-4, Jurkat, PC-12, PC-3, IMR, NT2N, Sk-n-sh, CaSki, C33A 등이 있다. 또한, 통상의 기술분야에 잘 알려져 있는 적당한 세포주들은 ATCC (American Type Culture Collection)와 같은 세포주 기탁기관으로부터 수득할 수 있다.
본 발명의 제조방법에 있어서, 세포주에 목적 단백질을 코딩하는 유전 서열을 갖는 발현 벡터를 도입하기 위해서는 핵산을 세포 내로 도입하는 어떤 방법이든 사용할 수 있고, 숙주세포에 따라 통상의 기술분야에 공지된 기술을 사용할 수 있다. 예를 들어, 열충격법 (Heat Shock), 전기천공법 (Electroporation), 인산칼슘 (CaPO4) 침전, 염화칼슘(CaCl2) 침전, 미세주입법 (microinjection), 폴리에틸렌글리콜 (PEG)법, DEAE-덱스트란법, 양이온 리포좀법, 및 초산 리튬-DMSO법 등이 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 일 구체에에 따른 융합 단백질 A를 발현하는 세포주의 숙주세포는 중국 햄스터 난소 세포 (CHO)일 수 있으며, 구체적으로는 재조합 아데노-관련 바이러스 (recombinant Adeno-Associated Virus, rAAV)에 의하여 Glutamine Synthetase 유전자의 6번 엑손이 넉아웃 (Knock-out)된 HD-BIOP3 세포를 사용할 수 있다.
상기 융합 단백질 A를 발현하는 세포주를 배양하는 단계는, 상기 세포주를 종배양하는 단계 및 상기 종배양한 세포주를 본배양하는 단계를 포함할 수 있다.
본 발명에서 사용된 용어, "종배양 (seed culture)"은 세포주를 대량으로 얻는 것을 목적으로 하는 배양을 의미한다. 상기 종배양은 세포수가 가장 활발하게 증가할 수 있는 온도 조건에서 배양될 수 있다. 다시 말해서, 세포주의 일정 세포수를 확보하기 위하여 종배양할 수 있다.
본 발명에서 사용된 용어 "본배양 (production culture)"은 목적 단백질을 생산하기 위하여 세포주를 대량 배양하는 것을 의미한다.
상기 종배양하는 단계는, 상기 융합 단백질 A를 발현하는 세포주를 계대 배양, 부유배양 및 이의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 방법으로 배양하는 것일 수 있다. 구체적으로는 상기 융합 단백질 A를 발현하는 세포주를 부유배양 및 계대배양 방식으로 배양할 수 있다.
본 발명에서 사용된 용어, "부유배양 (suspension culture)"은 배양액에 세포가 부유한 상태에서 하는 배양법을 의미하며, 혈액세포나 복수의 암세포와 같이 생체 내에서도 부유 상태로 증식하는 세포는 진탕이나 회전을 시키지 않더라도 부유배양할 수 있지만 대부분의 경우는 각반자를 회전시키거나 (각반배양), 배양병마다 진탕하거나 (진탕배양), 또는 배양기를 회전시켜 배양 (선회배양)할 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 부유배양은 120 RPM 내지 160 RPM의 교반속도의 조건에서 수행될 수 있지만, 이러한 조건으로 국한되는 것은 아니다. 상기 부유배양에서 접종하는 세포수는 2x105 cells/mL 내지 5x105 cells/mL, 3x105 cells/mL 내지 4x105 cells/mL, 또는 4x105 cells/mL 내지 5x105 cells/mL 일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서 사용된 용어, "계대 배양 (subculture)"은 배양 주기에 따라 동일한 또는 다른 신선한 배지로 세포주를 옮겨가며 배양하는 방법을 의미한다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 계대 배양은 목적 단백질을 발현하는 세포주를 1일 내지 7일, 2일 내지 5일, 3일 내지 4일 또는 2일 내지 3일 간격으로, 동일한 신선한 배지에 옮겨 접종하여 배양할 수 있다. 이때, 접종하는 세포 수는 2x105 cells/mL 내지 5x105 cells/mL, 3x105 cells/mL 내지 4x105 cells/mL, 또는 4.5x105 cells/mL 내지 5.5x105 cells/mL 일 수 있지만, 이러한 조건으로 국한되는 것은 아니다. 또한, 계대 배양시 CO2 농도는 4.0 % 내지 6.0 %, 4.5 % 내지 5.5 %, 또는 5.0 %일 수 있지만, 이러한 조건으로 국한되는 것은 아니다.
구체적으로, 상기 종배양하는 단계는, 상기 융합 단백질 A를 발현하는 세포주를 34℃ 내지 38℃의 온도에서 배양하는 것일 수 있다. 보다 구체적으로는, 상기 세포주를 약 36.5℃의 온도에서 배양할 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 종배양하는 단계는, 융합 단백질 A를 발현하는 세포주를 본원발명이 속한 기술분야에서 세포 성장에 적합한 것으로 알려진 배지에 배양할 수 있지만, 이러한 조건으로 국한되는 것은 아니다. 상기 배지는 CDOptiCHO 배지일 수 있다.
상기 본배양하는 단계는, 상기 종배양된 세포주를 회분식 배양, 유가식 배양, 연속식 배양 및 이의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 방법으로 배양하는 것일 수 있다. 구체적으로 융합 단백질 A를 발현하는 세포주를 유가식 배양 방식으로 배양할 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 융합 단백질 A를 발현하는 세포주를 본배양하는 단계는, 부유배양에 의하여 생산될 수 있다. 이때, 상기 부유배양은 60 RPM 내지 100 RPM, 65 RPM 내지 95 RPM, 70 RPM 내지 95 RPM, 75 RPM 내지 95 RPM, 80 RPM 내지 95 RPM, 85 RPM 내지 95 RPM, 90 RPM 내지 95 RPM, 92 내지 94 RPM 또는 93 RPM의 교반속도 조건하에서 실시될 수 있으나, 이러한 조건으로 국한되지는 않는다.
본 발명의 다른 구체예에서, 융합 단백질 A를 발현하는 세포주를 배양시 접종되는 세포 수는 5x105 cells/mL 내지 10x105 cells/mL, 6x105 cells/mL 내지 10x105 cells/mL, 7x105 cells/mL 내지 10x105 cells/mL, 7x105 cells/mL 내지 9x105 cells/mL 또는 7.2x105 cells/mL 내지 8.8x105 cells/mL 일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 또 다른 구체예에서, 융합 단백질 A를 발현하는 세포주를 배양하는 단계는, 상기 세포주 배양액의 pH를 이산화탄소, 또는 탄산수소나트륨 등의 염기 용액을 이용하여 조절할 수 있다. 구체적으로 배양액의 pH를 이산화탄소 및 탄산수소나트륨을 이용하여 조절할 수 있다. 보다 구체적으로는, 배양액의 pH를 이산화탄소 및 8% 탄산수소나트륨을 이용하여 조절할 수 있다. 또한, 배양 시 배양액의 pH를 조절하기 위하여 도입되는 염기성 용액은 배양액 내 세포에 의하여 분비되는 젖산과 적절한 비율로 배양액 내에 존재함으로써 배양액의 pH를 적정수준으로 유지할 수 있다. 이때, 배양액의 pH (오차범위인 deadband는 0.05)는 6.8 내지 7.5, 6.9 내지 7.4, 7.0 내지 7.3, 7.0 내지 7.4, 6.8 내지 7.2 또는 6.8 내지 7.1로 조절할 수 있다. 보다 구체적으로는 배양액의 pH를 pH 6.8 내지 7.1 (오차범위인 deadband는 0.05)로 조절할 수 있다.
이와 같이 배양액을 일정한 수치 범위 내의 pH로 유지되도록 조절함에 있어서, 이때 상기 pH 수치 범위의 상한값(이하, "pH 상단값")을 낮출수록 배양 후반부의 배양액으로의 이산화탄소 주입량 감소 및 배양액 내 버블 형성 예방효과가 나타난다. 배양이 진행됨에 따라 배양액 내 젖산 함량이 감소하는 현상이 발생하여 배양액 pH가 상승하며, 이러한 pH 상승은 바이오리액터 하단에 위치한 분사기(sparger)를 통한 다량의 이산화탄소 주입을 야기한다. 또한, 분사기는 이산화탄소 및 산소를 배양액으로 도입하는 역할을 수행하므로 pH 상승에 따라 배양액으로 도입되는 공기 중 이산화탄소/산소 비율의 증가로 인해 배양액으로의 산소 전달력이 감소한다. 배양액으로의 산소 전달력 감소는 배양액 내 용존 산소량 (Dissolved Oxygen, DO)을 감소시킴으로써 분사기를 통한 산소 분사 빈도를 증가시킨다. 그런데, 기체의 배양액으로의 직접적인 주입은 배양액의 pH를 증가시키는 요인이 될 수 있다.
한편 배양 과정에서, pH가 높을 경우 세포의 젖산 생산량이 일시적으로 증가하여 pH가 감소하였다가, 생성된 젖산을 세포가 에너지원으로 사용함에 따라 다시 pH가 크게 증가하므로, 배양 후반부에 투입되는 이산화탄소 사용량 증가가 불가피한 측면이 있다. 따라서, 배양액 내 pH를 조절함에 있어 pH 상단값을 7.15 이하, 7.10 이하, 7.05 이하, 7.00 이하, 6.95 이하, 6.90 이하, 6.85 이하, 또는 6.80 이하로 낮게 설정하면 배양기간 동안 배양액으로 투입되는 이산화탄소 및 산소 사용량을 감소시킬 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 본 발명의 배양액 내 pH가 7.25인 경우와 대비하여 배양액 내 pH가 6.8 내지 7.1 (오차범위인 deadband는 0.05)이면 배양 기간 동안 배양액으로 투입되는 이산화탄소, 산소 및 탄산수소나트륨과 같은 염기성 물질의 사용량을 감소시킴에 따라 생산비용을 절감할 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 배양액 내 pH를 6.8 내지 7.1 (오차범위인 deadband는 0.05)로 유지하는 것과 더불어, 일련의 과정을 통해 배양 후기 배양액으로 도입되는 탄산수소나트륨 의 함량을 배양 전기 배양액으로 도입되는 탄산수소나트륨의 함량보다 감소시킬 수 있다. 이때, 배양 전기와 후기를 구분하는 기준점은 배양 4일차 또는 배양 5일차일 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 배양 기간 동안 분사기를 통해 분사되는 기체 (지구 대기를 구성하는 일반적인 공기를 의미함)의 기체 분사 속도 (Air sparging rate)를 변화시킬 수 있다.
본 발명의 다른 구체예에서, 배양 전기의 기체 분사 속도와 배양 후기의 기체 분사 속도를 다르게 할 수 있다. 구체적으로는, 배양 후기의 기체 분사 속도가 배양 전기의 기체 분사 속도의 절반 이하일 수 있다. 보다 구체적으로는, 배양 4일차 또는 5일차 이후 기체 분사 속도가 배양 4일차 또는 5일차 이전의 기체 분사 속도의 절반 이하일 수 있다.
본 발명의 또다른 구체예에서, 배양 후기, 예를 들어 배양 4일차 또는 5일차 이후, 기체 분사 속도가 0.0005 내지 0.01 vvm(volume air/volume media/minute), 0.0005 내지 0.009 vvm, 0.0005 내지 0.008 vvm, 0.0005 내지 0.007 vvm, 0.0005 내지 0.006 vvm, 0.0005 내지 0.005 vvm, 0.0005 내지 0.004 vvm, 0.0005 내지 0.003 vvm, 0.0005 내지 0.002 vvm, 0.0005 내지 0.001 vvm, 또는 0.001 vvm일 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 융합 단백질 A를 발현하는 세포주의 배양액 DO를 일정 수치 범위로 유지할 수 있다. 이때, 상기 세포주 배양액의 DO를 10% 내지 90%, 20% 내지 80%, 30% 내지 70%, 40% 내지 60%, 40% 내지 50% 또는 40%로 유지할 수 있으나, 이러한 조건으로 제한되지 않는다.
본 발명의 다른 구체예에서, 상기 세포주 배양액의 DO가 배양액의 바람직한 DO 수치 범위의 하단에 위치하게 될 경우 배양액으로 산소를 공급함으로써 배양액의 DO 수치를 유지할 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 배양 기간 내 바이오리액터로의 산소 유량 (flow rate)이 약 20 LPM 이하로 유지될 수 있다.
본 발명의 다른 구체예에서, 배양 후기, 예를 들어 배양 4일차 또는 5일차 이후, 바이오리액터로의 이산화탄소 유량이 약 5 LPM 이하로 유지될 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 목적 단백질을 발현하는 세포주를 30℃ 내지 38℃의 온도에서 배양하는 것일 수 있다.
본 발명의 다른 구체예에서, 배양 후기, 예를 들어 배양 4일차 또는 5일차 이후의 배양 온도가 배양 전기, 예를 들어 배양 4일차 또는 5일차 이전의 배양온도보다 낮을 수 있다.
본 발명의 또다른 구체예에서, 배양 초기 일정기간 동안 융합 단백질 A를 발현하는 세포주를 37℃의 온도에서 배양한 뒤 온도를 낮춰 배양할 수 있다. 구체적으로는 세포주를 배양 4일차 또는 5일차까지 37℃의 온도에서 배양하고, 배양 5일차 또는 6일차 이후에 상기 온도보다 1℃, 2 ℃, 3 ℃, 4℃, 5℃, 6℃, 7℃, 8℃, 9℃ 또는 10℃ 낮은 온도에서 배양할 수 있다. 보다 구체적으로는, 세포주를 배양 4일차 내지 5일차까지 37℃의 온도에서 배양하고, 그 이후의 배양기간 동안 31℃의 온도에서 배양할 수 있다.
본 발명의 다른 구체예에서, 융합 단백질 A를 발현하는 세포주를 본원발명이 속한 기술분야에서 세포 성장에 적합한 것으로 알려진 배지에 배양할 수 있지만, 이러한 조건으로 국한되는 것은 아니다. 일 예로 상기 배지는 Dynamis 배지일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구체예에서, 배양액에서 발생하는 버블을 제거하기 위한 목적으로 소포제를 처리할 수 있다. 상기 소포제는 배양액 성분을 고려하여 적합한 물질을 선택하여 사용할 수 있고, 바이오리액터 내 기체 필터 (air filter) 하단에 거품이 도달할 때 사용된다. 일 예로 상기 소포제가 ADCF 소포제일 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 플라스크 또는 바이오리액터 (bioreactor)에서 융합 단백질 A를 발현하는 세포주를 배양할 수 있다. 바이오리액터를 이용한 배양은 플라스크와 달리 DO, 글루코스 함량, pH와 같은 배양조건을 조절 및 유지할 수 있어 세포 배양을 유리한 조건에서 수행할 수 있고 대량 배양이 가능하다.
상기 플라스크 및 바이오리액터의 종류 및 배양 조건은 당업자가 통상적으로 조절 가능한 범위 내에서 변경할 수 있다.
예를 들어, 목적 단백질을 발현하는 세포주를 엘렌메이어 플라스크(Elenmeyer Flask)에 접종하여 부유배양한 뒤 계대 배양하여 바이오리액터에 접종할 최소 세포수를 확보하고, 계대배양한 세포주를 일회용 세포배양백이 장착된 바이오리액터에 접종하여 유가식배양을 실시하여 목적 단백질을 생산할 수 있다.
본 발명의 또 다른 구체예에서, 배양 기간은 6일 이상일 수 있다. 구체적으로는 배양 기간이 6일, 7일, 8일, 9일, 10일, 11일, 12일, 13일, 14일, 15일, 16일, 17일, 18일, 19일 또는 20일일 수 있다. 보다 구체적으로는 배양 기간이 약 10일 일 수 있다.
본 발명에서 사용된 용어, "배양 첨가물"은 세포 배양시 세포의 성장을 촉진 하고/하거나 세포가 발현하는 물질의 생산량을 증가시키기 위한 목적으로 첨가되는 물질인 화학적 성분 또는 생체 물질로서, 예를 들면 성장 인자(예를 들면 인슐린 등), 철분 공급원(예를 들면 트랜스페린 등), 폴리아민류(예를 들면 푸트레신 등), 미네랄(예를 들면 셀렌산나트륨 등), 당 공급원(예를 들면 글루코스 등), 유기산 (예를 들면 피루브산, 락트산 등), 아미노산(예를 들면 L-글루타민 등), 환원제(예를 들면 2-메르캅토에탄올 등), 비타민류(예를 들면 아스코르빈산, d-비오틴 등), 스테로이드(예를 들면 β-에스트라디올, 프로게스테론 등), 항생 물질(예를 들면 스트렙토마이신, 페니실린, 겐타마이신 등), 완충제(예를 들면 HEPES 등), 단백질 발현 촉진제 (예를 들어, 상표명 하이클론 셀부스트 1, 상표명 하이클론 셀부스트 2, 상표명 하이클론 셀부스트 3, 상표명 하이클론 셀부스트 4, 상표명 하이클론 셀부스트 5, 상표명 하이클론 셀부스트 6, 상표명 하이클론 셀 부스트 7A 및 상표명 하이클론 셀부스트 7B) 등을 들 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 배양 2일차 또는 그 이후부터 세포 배양액에 단백질 발현 촉진제 및 당 공급원을 하루 이상 간격으로 교대로 투입할 수 있다. 이때, 상기 단백질 발현 촉진제는 CHO 세포가 생산하는 단백질의 수율 증가를 촉진하는 물질일 수 있고, 상기 CHO 세포가 생산하는 단백질의 수율 증가를 촉진하는 물질은 본 발명이 속한 기술분야에서 CHO 세포가 생산하는 단백질의 수율 증가를 촉진하는 것으로 공지된 물질로서 CHO CD Efficient FeedA (Invitrogen, 인비트로겐), CHO CD Efficient FeedB (인비트로겐), CHO CD Efficient FeedC (인비트로겐), Sheff-CHO PLUS PF ACF (FM012) (케리), CHO CD Efficient Feed A+ (인비트로겐), CHO CD Efficient Feed B+ (인비트로겐), CHO CD Efficient Feed C+ (인비트로겐), FAA01A (Hyclone, 하이클론), 상표명 하이클론 셀부스트 1, 상표명 하이클론 셀부스트 2, 상표명 하이클론 셀부스트 3, 상표명 하이클론 셀부스트 4, 상표명 하이클론 셀부스트 5, 상표명 하이클론 셀부스트 6, 상표명 하이클론 셀부스트 7A, 상표명 하이클론 셀부스트 7B를 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. 구체적으로는 상기 단백질 발현 촉진제는 상표명 하이클론 셀 부스트 7A 및 상표명 하이클론 셀부스트 7B일 수 있다. 이 때, 상표명 하이클론 셀부스트 7A는 아미노산, 비타민, 염 및 글루코스 등을 포함하는 중성에 가까운 pH를 갖는 조성물이며, 상표명 하이클론 셀부스트 7B는 아미노산 농축액으로서 알칼리성이다. 또한, 상기 상표명 하이클론 셀부스트 7A를 배양액에 첨가하여 사용할 경우 그 사용 부피는 배양 개시 시점 또는 배양 과정 중의 배양액 총 부피의 20% 미만일 수 있으며, 상기 상표명 하이클론 셀부스트 7B를 배양액에 첨가하여 사용할 경우 그 사용 부피는 배양 개시 시점 또는 배양 과정 중의 배양액 총 부피의 2% 미만일 수 있다. 나아가, 상기 CHO 세포가 생산하는 단백질의 수율 증가를 촉진하는 물질은 상표명 하이클론 셀 부스트 7A 및 상표명 하이클론 셀부스트 7B가 각각 10:1의 부피비로 혼합된 혼합물일 수 있다. 상기 하이클론 셀부스트의 혼합물은 하이클론 셀부스트 7A 및 하이클론 셀부스트 7B를 각각 용매에 용해하여 혼합함으로써 수득된 것일 수 있다.
또한, 상기 당 공급원은 글루코스를 포함하되 세포의 증식을 저해하지 않는 물질이다. 한편, 상기 당 공급원으로서 D-글루코스 용액을 사용할 수 있으나 이에 제한되지는 않는다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 단백질 발현 촉진제는 세포의 성장 및/또는 목적 단백질 발현에 필요하거나 이를 돕는 성분을 공급하기 위한 목적으로 사용될 수 있다.
본 발명의 또다른 구체예에서, 배양 기간 동안 세포주 배양액에 투입될 수 있는 당 공급원의 당 농도는 1 % (w/v) 이상의 농도이거나, 1 g/L 내지 500 g/L, 100 g/L 내지 500 g/L, 200 g/L 내지 500 g/L, 300 g/L 내지 500 g/L, 또는 400 g/L 내지 500 g/L의 농도를 갖거나, 450 g/L의 농도를 가질 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 또한, 상기 당 공급원은 45 % (w/v) 농도의 글루코스 용액 또는 D-글루코스 용액일 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
본 발명의 다른 구체예에서, 배양 기간 동안 세포 배양액 내 글루코스 농도를 5.0 내지 7.0 g/L로 유지할 수 있다.
본 발명의 다른 구체예에서, 배양 2일차 또는 그 이후부터 세포 배양액에 당 공급원 및 단백질 발현 촉진제를 하루 이상 간격으로 교대로 투입할 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 배양 3일차에 당 공급원을 세포 배양액으로 투입할 수 있다.
본 발명의 다른 구체예에서, 배양 3일차부터 배양 종료시까지 격일로 당 공급원을 세포 배양액으로 투입할 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 단백질 발현 촉진제 및 당 공급원을 세포 배양액으로 교대로 투입하되, 상기 당 공급원은 배양 3일차부터 배양 종료시까지 2일 연속으로 1회 이상 세포 배양액으로 투입될 수 있다.
본 발명의 또다른 구체예에서, 단백질 발현 촉진제 및 당 공급원을 세포 배양액으로 교대로 투입하되, 상기 당 공급원은 배양 3일차부터 배양 종료시까지 3일 연속으로 1회 이상 세포 배양액으로 투입될 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 배양 기간 동안 당 공급원이 4회 이상 투입될 수 있다. 또한, 배양 기간 동안 당 공급원이 4회 내지 10회 투입될 수 있으나 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 다른 구체예에서, 배양 2일차에 단백질 발현 촉진제를 세포 배양액으로 투입할 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 배양 2일차부터 배양 종료시까지 격일로 단백질 발현 촉진제를 세포 배양액으로 투입할 수 있다.
본 발명의 다른 구체예에서, 상기 단백질 발현 촉진제는 배양 종료시까지 2일 이상 간격으로 1회 이상 세포 배양액에 투입될 수 있다.
본 발명의 또다른 구체예에서, 상기 단백질 발현 촉진제가 배양 종료시까지 2일 또는 3일 간격으로 1회 이상 세포 배양액에 투입될 수 있다.
본 발명의 또 다른 구체예에서, 배양 기간 동안 상기 단백질 발현 촉진제는 4회 이상 투입될 수 있다. 본 발명의 다른 구체예에서, 배양 기간 동안 상기 단백질 발현 촉진제가 4회 또는 5회 투입될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
융합 단백질 A의 회수 및 정제
본 발명의 일 구체예에서, 상기 (a) (ii)의 세포 배양액을 원심분리하여 상층액을 회수하는 단계는, 본 발명이 속한 기술분야에서 일반적으로 사용되는 원심분리기를 이용할 수 있다. 예를 들어, 고정각 앵글로터를 사용하는 원심분리기, 스윙 로터를 사용하는 원심 분리기, 연속 원심분리기 등을 사용할 수 있다. 구체적으로 상기 (a) (ii) 세포 배양액을 원심분리하여 상층액을 회수하는 단계는, 연속 원심분리기를 이용하여 수행될 수 있다.
본 발명의 다른 구체예에서, 상기 (a) (ii)의 세포 배양액을 원심분리하여 상층액을 회수하는 단계에서, 원심분리기로 배양액이 공급되는 공급속도인 공급유속 (feed flow)이 200 L/h 내지 400 L/h, 200 L/h 내지 300 L/h, 210 L/h 내지 300 L/h, 220 L/h 내지 300 L/h, 230 L/h 내지 300 L/h, 또는 240 L/h 내지 300 L/h일 수 있다. 구체적으로는, 상기 공급유속은 약 250 L/h일 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
본 발명의 또 다른 구체예에서, 상기 (a) (ii)의 세포 배양액을 원심분리하여 상층액을 회수하는 단계에서 원심분리시 배출간격 (ejection interval)이 100 내지 250 초, 120 내지 240 초, 120 내지 230초, 140 내지 230 초, 160 내지 220초, 180 내지 210 초, 또는 190 내지 210초일 수 있다. 또한, 구체적으로 상기 원심분리시 배출간격은 190 내지 210 초일 수 있고, 그 예로 약 201초일수 있으나, 이러한 수치로 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 다른 구체예에서, 상기 (a) (ii) 회수된 배양액을 여과하는 단계는 정밀여과필터를 이용하여 수행될 수 있다. 상기 정밀여과필터의 기능은 예컨대, ＜20 리터(l)/㎡의 피드 로드인 압력 한계, 또는 탁도 감소에 기초하여 평가될 수 있다. 또한, 상기 정밀여과필터의 비제한적인 예로는 정밀여과 멤브레인, 밀리포어(Millipore), COHC, A1HC, BIHC, XOHC 심층 필터, CUNO 60ZA, 및 CUNO 90ZA가 있다. 구체적으로, 상기 정밀여과필터가 심층필터일 수 있고, 보다 구체적으로는 A1HC 심층 필터일 수 있으나 이러한 필터로 제한되지는 않는다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 원심분리로 회수된 배양액 내 불순물을 제거하기 위하여 필터를 사용하여 여과할 수도 있다. 이때, 여과에 사용하는 필터의 공극 직경은 1 ㎛ 이하, 0.5 ㎛ 이하, 0.45 ㎛ 이하, 0.3 ㎛ 이하, 0.25 ㎛ 이하, 0.22 ㎛ 이하 또는 0.2 ㎛이하일 수 있으며, 다양한 공극 직경을 갖는 필터를 조합하여 사용할 수도 있다. 또한, 상기 여과시 전도도는 10 내지 20 mS/cm, 10 내지 19 mS/cm, 10 내지 18 mS/cm, 10 내지 17 mS/cm, 또는 10 내지 16 mS/cm일 수 있으나, 이러한 조건으로 제한되지 않는다.
본 발명의 또 다른 구체예에서, 상기 원심분리로 회수된 배양액에 필터를 적용하여 여과한 뒤 계면활성제를 추가로 처리하여 반응시킬 수 있다. 상기 계면활성제는 도데실황산 나트륨 (SDS), 디옥시콜산 나트륨, Triton X-100 (상표명, Rohm and Hass사 제조), Nodiet P-40 (상표명, Shell사 제조), Tween-80, Tween-20, CHAPS, Chapso, 디기토닌 (digitonin), 유레아 (urea) 및 이들의 혼합물 등에서 선택될 수 있으나, 이러한 성분으로 제한되는 것은 아니다. 구체적으로는, 상기 계면 활성제는 Triton X-100일 수 있다. 또한, 상기 계면활성제를 처리하여 반응시키는 시간은 10분 이상, 20분 이상, 또는 30분 이상일 수 있거나/있고, 40분 이하, 50 분 이하 또는 60분 이하일 수 있다. 그러나, 이러한 조건으로 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 계면활성제를 처리한 필터 여과액을 재여과할 수 있다. 상기 재여과에 사용하는 필터의 공극 직경은 1 ㎛ 이하, 0.5 ㎛ 이하, 0.45 ㎛ 이하, 0.3 ㎛ 이하, 0.25 ㎛ 이하, 0.22 ㎛ 이하 또는 0.2 ㎛이하일 수 있으며, 다양한 공극 직경을 갖는 필터를 조합하여 사용할 수도 있다. 상기 회수된 배양액을 대상으로 무균 시험, 마이코플라스마 검출 시험, 세포배양 접종법을 통한 외래성 인자 확인 시험, 미세 마우스 바이러스 (Mouse Minute virus) 검출 시험 및 결핵균 검출시험을 시행할 수 있다. 상기 회수된 배양액에는 균이 없으며, 마이코플라스마, 외래성 인자, 미세 마우스 바이러스 및 결핵균이 검출되지 않는다.
본 발명의 일 구체예에서, iii) 여과된 배양액에 뉴클레아제를 처리하되, 뉴클레아제의 농도, 처리 시간 및 상기 배양액의 Mg2+ 이온의 농도로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 인자를 조절하는 단계는, 핵산을 절단하는 효소라면 제한 없이 사용할 수 있고, 그 예로 DNA 절단 효소를 사용할 수 있다.
본 발명의 뉴클레아제는 엑소뉴클레아제 (exonuclease) 및 엔도뉴클레아제(endonuclease)를 포함한다. 엑소뉴클레아제는 폴리펩티드 사슬의 일단에서 3′, 5′- 포스포디에스테르 결합을 순차적으로 분해하여 모노뉴클레오티드를 생성하는 효소이다. 엔도뉴클레아제는 폴리뉴클레오티드 사슬 내부의 3´, 5´-포스포디에스테르 결합을 절단하여 올리고 리보뉴클레오티드를 생성하는 효소이며, 기질특이성 에 따라 디옥시리보뉴클레아제 I (DNase I)·디옥시리보뉴클레아제 II (DNase II) 등이 있다. 또한, 특정 염기서열을 가진 DNA를 절단하는 제한효소 (restriction enzyme)도 포함하고, 미크로코쿠스 (micrococcus)라고 하는 구균의 뉴클레아제와 같이, DNA 및 RNA 양쪽을 분해하는 뉴클레아제도 포함한다. 상기 뉴클레아제는 벤조네이즈 (benzonase)일 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 (a)(ii)iii) 단계는, 뉴클레아제의 농도를 1 unit/ml 내지 20 unit/ml, 2 unit/ml 내지 14 unit/ml, 2 unit/ml 내지 4 unit/ml, 또는 약 2 unit/ml로 조절할 수 있으나, 이러한 수치로 제한되지는 않는다.
본 발명의 다른 구체예에서, 상기 (a)(ii)iii) 단계는, 상기 뉴클레아제의 처리 시간을 2 시간 내지 7 일, 2 시간 내지 5 일, 2 시간 내지 3 일, 2 시간 내지 24 시간, 2 시간 내지 12 시간, 2 시간 내지 6 시간, 3 시간 내지 6 시간, 또는 4 시간 내지 6 시간으로 조절할 수 있으나, 이러한 수치로 제한되지는 않는다.
본 발명의 또다른 구체예에서, 상기 (a)(ii)iii) 단계는, 상기 배양액의 Mg2+ 이온의 농도를 3 mM 이하, 또는 2 mM 이하로 조절할 수 있으나, 이러한 수치로 제한되지는 않는다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 (a)(ii)의 배양액 정제 단계는, 일반적인 단백질 정제 방법을 이용하여 실시될 수 있다. 상기 배양액을 정제하는 단계는, 하나 이상의 크로마토그래피 단계를 포함할 수 있다. 구체적으로는, 상기 배양액을 정제하는 단계는 1차 크로마토그래피, 2차 크로마토그래피 및 3차 크로마토그래피 단계를 포함할 수 있다.
상기 (a)(ii)의 배양액을 정제하는 단계에서 이용되는 크로마토그래피 단계는 단백질 포획 단계로서 기능하며, 예를 들어 친화 크로마토그래피, 양이온 교환 크로마토그래피, 음이온 교환 크로마토그래피(Anion exchange chromatography; AEX), 혼합 모드 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피 또는 소수성 전하 유도 크로마토그래피, 멤브레인 또는 비드형 수지를 이용하는 크로마토그래피 등이 사용될 수 있으며, 정제 대상 단백질의 특성을 고려하여 선택될 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 (a)(ii)의 배양액을 정제하는 단계의 1차 크로마토그래피는 소수성 상호 작용 크로마토그래피 (Hydrophobic Interaction Chromatography; HIC)일 수 있다.
본 발명의 다른 구체예에서, 상기 (a)(ii)의 상기 배양액을 정제하는 단계의 2차 크로마토그래피는 혼합 모드 크로마토그래피일 수 있다.
상기 혼합 모드 크로마토그래피는 단백질 또는 기타 용질을 흡착하기 위하여 복수개의 화학적 메커니즘을 사용하는 수지, 모놀리쓰 또는 멤브레인 형태의 고체상 크로마토그래피 지지체들의 사용을 포함한다. 본 발명의 유용한 예에는, 하기 메커니즘들 중 둘 이상의 조합을 사용하는 크로마토그래피 지지체들이 비제한적으로 포함된다: 음이온 교환, 양이온 교환, 소수성 상호작용, 친수성 상호작용, 친황성(thiophilic) 상호작용, 수소 결합, 파이-파이 결합 및 금속 친화성.
본 발명의 일 구체예에서, 혼합-모드 크로마토그래피 공정은 (1) 음이온 교환 및 소수성 상호작용 기법; (2) 양이온 교환 및 소수성 상호작용 기법; 및/또는 (3) 정전기 및 소수성 상호작용 기법을 조합한다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 혼합-모드 크로마토그래피 단계는 하기 시스템들 중의 하나 이상을 사용함으로써 달성될 수 있다: Capto® MMC(GE 헬스케어 라이프 사이언시스로부터 입수가능함), HEA HyperCel™(팔 코포레이션(Pall Corporation)으로부터 입수가능함), PPA HyperCel™(팔 코포레이션으로부터 입수가능함), MBI HyperCel™(팔 코포레이션으로부터 입수가능함), MEP HyperCel™(팔 코포레이션으로부터 입수가능함), Blue Trisacryl M(팔 코포레이션으로부터 입수가능함), CFT™ Ceramic Fluoroapatite(바이오-래드 래보라토리스, 인크.(Bio-Rad Laboratories, Inc.)로부터 입수가능함), CHT™ Ceramic Hydroxyapatite(바이오-래드 래보라토리스, 인크.로부터 입수가능함) 및/또는 ABx(제이.티. 베이커(J.T. Baker)로부터 입수가능함). 구체적으로 상기 (a)(ii) 정제 단계의 2차 크로마토그래피는 Ceramic Hydroxyapatite 크로마토그래피일 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 (a)(ii)정제 단계는 1차 크로마토그래피 및 바이러스 불활화 수행 후 시료농축 및 완충용액 여과를 위한 목적으로 한외여과 및 정용여과를 포함할 수 있다. 상기 여과는 접선 유동여과(Tangential flow filtration) 시스템을 사용할 수 있다.
본 발명의 용어 "접선 유동 여과(Tangential Flow Filtration)" 는 "TFF"로도 지칭되며 "교차-유동 여과(cross-flow filtration)"라고도 정의되는 여과의 한 방식이다. 이러한 TFF 모드 여과는 생물학적 물질, 예를 들면 단백질 및 백신의 농축 및/또는 정제에 유용하게 사용될 수 있다. TFF 모드 여과에서 유체는 막의 표면을 따라 접선방향으로 펌핑된다. 가해진 압력은 샘플의 일부를 막을 통해 여과물(투과물; permeate) 측으로 강제적으로 이동하게 하는 역할을 한다. 막 공극을 통과하기에 너무 큰 생물학적 물질 및 미립자(보유물; retentate)는 상류(upstream) 측에 보유된다. 그러나 일반 여과 모드 (Normal Flow Filtration, NFF) 와 달리 보유된 물질은 막의 표면에 축적되지 않는다. 그 대신에 보유된 물질은 유체의 접선방향 유동에 의해 막의 면을 따라 스쳐 지나간다. 즉 TFF 모드 여과에서 피드 스트림은 막 면과 평행하고, 일부분은 막을 통과하고, 나머지는 보유되어 피드 저장소로 재순환 될 수 있다.
본 발명의 또다른 구체예에서, 상기 (a)(ii) 정제 단계의 3차 크로마토그래피는 양이온 교환 크로마토그래피 또는 음이온 교환 크로마토그래피일 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 1차 크로마토그래피는 컬럼 평형화(Equilibration; EQ)를 위하여 20mM 인산 나트륨(Sodium phosphate) 및 3M NaCl을 포함하는 완충용액 (buffer)을 사용할 수 있다. 구체적으로 상기 완충용액은 6.4 내지 6.6의 pH 및 170 내지 220 mS/cm 의 전도도를 가질 수 있으나, 이러한 수치로 제한되지 않는다.
본 발명의 다른 구체예에서, 상기 1차 크로마토그래피는 단백질을 용출(Elution)시키기 위하여 20mM 인산 나트륨 및 0.6M NaCl을 포함하는 완충용액을 사용할 수 있으며, 보다 구체적으로 상기 완충용액은 6.4 내지 6.6의 pH 및 50 내지 70 mS/cm 의 전도도를 가질 수 있으나, 이러한 수치로 제한되지 않는다.
본 발명의 또다른 구체예에서, 상기 1차 크로마토그래피는 목적 단백질을 용출시킨 후 남은 단백질을 제거하기 위하여 20mM 인산 나트륨을 포함하는 완충용액을 사용할 수 있으며, 보다 구체적으로 상기 완충용액은 6.4 내지 6.6의 pH 및 1.8 내지 2.4 mS/cm 의 전도도를 가질 수 있으나, 이러한 수치로 제한되지 않는다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 2차 크로마토그래피는 컬럼 평형화를 위하여 2mM 인산 나트륨 및 50mM NaCl을 포함하는 완충용액을 사용할 수 있으며, 보다 구체적으로 상기 완충용액은 6.7 내지 6.9의 pH 및 5 내지 7 mS/cm 의 전도도를 가질 수 있으나, 이러한 수치로 제한되지 않는다.
본 발명의 다른 구체예에서, 상기 2차 크로마토그래피는 세척(wash) 공정에서 25mM 인산 나트륨 및 50mM NaCl을 포함하는 완충용액을 사용할 수 있으며, 보다 구체적으로 상기 완충용액은 6.7 내지 6.9의 pH 및 7.5 내지 8.5 mS/cm 의 전도도를 가질 수 있으나, 이러한 수치로 제한되지 않는다.
본 발명의 또다른 구체예에서, 상기 2차 크로마토그래피는 단백질을 용출(Elution)시키기 위하여 240mM 인산 나트륨 및 50mM NaCl을 포함하는 완충용액을 사용할 수 있으며, 보다 구체적으로 상기 완충용액은 8.1 내지 8.3의 pH 및 28 내지 32 mS/cm 의 전도도를 가질 수 있으나, 이러한 수치로 제한되지 않는다.
본 발명의 또다른 구체예에서, 상기 2차 크로마토그래피는 목적 단백질을 용출시킨 후 남은 단백질을 제거하는 공정을 수행할 수 있다. 상기 공정은 스트립(strip)이라고 칭하며, 스트립 공정에서 400mM 인산 나트륨 및 50mM NaCl을 포함하는 완충용액을 사용할 수 있으며, 보다 구체적으로 상기 완충용액은 8.1 내지 8.3의 pH 및 38 내지 44 mS/cm 의 전도도를 가질 수 있으나, 이러한 수치로 제한되지 않는다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 3차 크로마토그래피는 컬럼 평형화를 위하여 2mM 인산 나트륨을 포함하는 완충용액을 사용할 수 있으며, 보다 구체적으로 상기 완충용액은 8.1 내지 8.3의 pH 및 0.3 내지 0.5 mS/cm 의 전도도를 가질 수 있으나, 이러한 수치로 제한되지 않는다.
본 발명의 다른 구체예에서, 상기 3차 크로마토그래피는 목적 단백질을 통과시킨 후 남은 단백질을 제거하기 위한 스트립 공정에서 20mM 인산 나트륨 및 3M NaCl을 포함하는 완충용액을 사용할 수 있으며, 보다 구체적으로 상기 완충용액은 6.4 내지 6.6의 pH 및 180 내지 200 mS/cm 의 전도도를 가질 수 있으나, 이러한 수치로 제한되지 않는다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 (a)(ii)의 정제 단계는 바이러스를 불활화하는 단계를 포함할 수 있다. 상기 바이러스 불활화 단계는 크로마토그래피 공정 이후의 용출액의 pH를 산성으로 조정함으로써 수행될 수 있다. 구체적으로, 용출액의 pH를 4.0 이하로 낮출 수 있으며, 보다 구체적으로는 pH 3.3 내지 3.7로 낮출 수 있으나, 이러한 수치로 제한되지 않는다. 또한, 상기 pH 조정을 위하여 HCl과 같은 산을 사용할 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 (a)(ii) 정제 단계는 하나 이상의 여과 단계를 포함할 수 있다. 구체적으로, 상기 (a)(ii) 정제 단계는 한외여과 (ultrafiltration) 단계 및 바이러스 여과 단계를 포함할 수 있다. 보다 바람직하게는, 상기 (a)(ii) 정제 단계는 1차 한외여과 단계 및 2차 한외여과 단계를 포함할 수 있다. 보다 구체적으로는, 1차 한외여과 단계가 1차 크로마토그래피 및 바이러스 불활화 단계 이후에 수행될 수 있고, 2차 한외여과 단계는 3차 크로마토그래피 및 바이러스 여과 단계 이후에 수행될 수 있다.
본 발명에서 용어 "한외여과"는 용액 또는 현탁액에서 생성물 (예를 들어, 단백질)을 다른 물질로부터 분리하기 위해 용액 또는 현탁액을 막 (예를 들어, 반투과성 막)에 적용하는 임의의 기술을 의미한다. 예를 들어 한외여과 막은 막의 기공보다 더 큰 분자를 보유하는 반면 염, 용매 및 물과 같은 더 작은 분자는 자유롭게 막을 통과한다. 막에 의해 보유된 용액은 "농축물" 또는 "잔류물"로 지칭되는 반면, 막을 통과하는 용액은 "여과액" 또는 "투과액"으로 지칭된다.
본 발명의 (a) (ii) 단계의 한외여과막 필터는 30 킬로달톤 (kDa) 내지 100 kDa의, 또는 이보다 더 큰 분자 컷오프 값을 가질 수 있다. 또한, 본 발명의 한외여과막 필터는 50 kDa, 60 kDa, 70 kDa, 80 kDa, 90 kDa, 또는 100 kDa, 또는 임의의 중간 값의 분자 컷오프 값을 가질 수 있다. 일부 실시 형태에서, 한외여과막의 분자량 컷오프는 100 kDa일 수 있으나, 이러한 수치로 제한되지 않는다.
본 발명의 (a) (ii) 단계의 한외여과시 이용되는 전도도는 25 mSm/cm 이하, 10 mSm/cm 이하, 9 mSm/cm 이하, 8 mSm/cm 이하, 7 mSm/cm 이하, 6 mSm/cm 이하, 또는 5 mSm/cm 이하일 수 있으나, 이러한 수치로 제한되지 않는다. 한외여과시 사용되는 완충용액의 pH는 pH 6.0 내지 9.0, 6.0 내지 7.0, 7.0 내지 8.0 또는 7.6 내지 8.4일 수 있으나, 이러한 수치로 제한되지 않는다.
상기 바이러스 여과 단계는, 심층 필터, 바이러스 필터 등 당업계에서 바이러스를 여과할 수 있는 것으로 공지된 필터를 사용하여 바이러스를 여과할 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 바이러스 여과 및 한외여과를 거친 여과액을 추가 여과 단계를 통해 여과할 수 있다. 상기 추가 여과 단계에서 사용되는 필터는 당업 계에서 단백질 여과에 적합한 것으로 공지된 필터로서, 공극 직경이 0.3 μm 이하일 수 있다.
단백질 B를 발현하는 세포 배양
본 발명의 단백질 B를 발현하는 세포주는 미생물일 수 있고, 그 예로 에스케리키아 속 미생물 일 수 있다. 구체적으로 상기 단백질 B를 발현하는 세포주는 대장균일 수 있다. 상기 대장균은 예를 들어 E.coli BL21, JM109, K-12, LE392, RR1, DH5α 또는 W3110 균주일 수 있다. 구체적으로, 상기 대장균은 E.coli BL21 균주일 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 대장균은 본 발명의 단백질 B를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 또는 이를 포함하는 벡터를 포함하는 것일 수 있다.
상기 벡터는 특별히 한정되지 않으며, 당업계에 알려진 임의의 벡터를 이용할 수 있다. 통상 사용되는 벡터의 예로는 천연 상태이거나 재조합된 상태의 플라스미드, 코스미드, 바이러스 및 박테리오파지를 들 수 있다. 예를 들어, 파지 벡터 또는 코스미드 벡터로서 pWE15, M13, MBL3, MBL4, IXII, ASHII, APII, t10, t11, Charon4A, 및 Charon21A 등을 사용할 수 있으며, 플라스미드 벡터로서 pBR계, pUC계, pBluescriptII계, pGEM계, pTZ계, pCL계 및 pET계 등을 사용할 수 있다. 구체적으로는 pET28, pET29, pDZ, pACYC177, pACYC184, pCL, pECCG117, pUC19, pBR322, pMW118, pCC1BAC 벡터 등을 사용할 수 있다. 일례로 세포 내 염색체 삽입용 벡터를 통해 염색체 내에 본 발명의 목적 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 염색체 내로 삽입할 수 있다. 상기 폴리뉴클레오티드의 염색체 내로의 삽입은 당업계에 알려진 임의의 방법, 예를 들면, 상동재조합(homologous recombination)에 의하여 이루어질 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다. 상기 염색체 삽입 여부를 확인하기 위한 선별 마커(selection marker)를 추가로 포함할 수 있다. 선별 마커는 벡터로 형질전환된 세포를 선별, 즉 목적 핵산 분자의 삽입 여부를 확인하기 위한 것으로, 약물 내성, 영양 요구성, 세포 독성제에 대한 내성 또는 표면 폴리펩티드의 발현과 같은 선택가능 표현형을 부여하는 마커들이 사용될 수 있다. 선택제(selective agent)가 처리된 환경에서는 선별 마커를 발현하는 세포만 생존하거나 다른 표현 형질을 나타내므로, 형질전환된 세포를 선별할 수 있다.
전술한 구체예 중 어느 하나의 구체예로, 상기 발현 벡터는 lac 오페론을 포함하는 것일 수 있다. 본 발명에서, "오페론"은 하나의 발현 조절 서열에 의해 발현이 조절되는 유전자군을 포함하는 DNA의 기능적 단위이며, lac 오페론은 락토오스(lactose) 또는 이의 유사체의 존재하에 전사가 이루어지는 오페론을 지칭한다.
전술한 구체예 중 어느 하나의 구체예로, 본 발명의 발현 벡터 내의 lac 작동유전자(operator)는 단백질 B를 코딩하는 유전자와 작동가능하게 연결될 수 있다. 본 발명에서 "작동 가능하게 연결된"이란 조절 서열이 코딩 서열의 발현을 지시하도록 조절 서열이 적절한 위치에 배치되는 구성을 의미한다. 따라서 본 발명의 발현 벡터 내의 lac 작동유전자(operator)와 단백질 B을 코딩하는 유전자가 작동가능하게 연결되어 있는 경우 락토오스 또는 이의 유사체의 존재하에 본 발명의 단백질 B의 발현이 유도될 수 있다.
일 예로, 상기 발현벡터는 항생제 저항성 유전자, Lac 오페론(Operon) 및 T7 프로모터(Promoter) 영역, 다중클로닝부위 (Multiple cloning site) 를 포함할 수 있다. 보다 구체적으로 상기 발현벡터는 도 13의 개열지도를 가질 수 있으나 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 (b)(i) 의 글리세롤 포함 배지에서 배양하는 단계는 종배양(seed fermentation) 단계 이후 수행되는 것일 수 있다.
전술한 구체예 중 어느 하나의 구체예로 상기 글리세롤 포함 배지는 대장균의 성장기(Growth phase) 배지일 수 있다. 미생물의 성장기는 대수증식기 (exponential phase, log phase)라고도 지칭한다. 글리세롤 포함 배지에서 배양하는 단계를 통해 세포 수를 증가시키며, 세포 성장이 증가할 수 있다. 이에 따라, 목적 단백질의 발현 수준을 증대시킬 수 있다.
전술한 구체예 중 어느 하나의 구체예로, 상기 글리세롤은 0 초과 4% (v/v) 미만으로 배양 배지에 포함될 수 있다. 상기 글리세롤의 함량은 예를 들어 0 초과이면서 약 4%(v/v) 미만, 3.9% (v/v) 이하, 3.9% (v/v) 미만, 3.8%(v/v) 이하, 3.8%(v/v) 미만, 3.7% (v/v)이하, 3.7%(v/v) 미만, 3.6%(v/v) 이하, 3.6%(v/v)미만, 3.5%(v/v) 이하, 3.5%(v/v) 미만, 3.4%(v/v) 이하, 3.4% (v/v) 미만, 3.3% (v/v) 이하, 3.3% (v/v) 미만, 3.2% (v/v) 이하, 3.2%(v/v) 미만, 3.1% (v/v) 이하, 3.1%(v/v) 미만, 3.0%(v/v) 이하, 3.0% (v/v) 미만, 2.9% (v/v) 이하, 2.9% (v/v) 미만, 2.8%(v/v) 이하, 2.8%(v/v) 미만, 2.7% (v/v)이하, 2.7%(v/v) 미만, 2.6%(v/v) 이하, 2.6%(v/v)미만, 2.5%(v/v) 이하, 2.5%(v/v) 미만, 2.4%(v/v) 이하, 2.4% (v/v) 미만, 2.3% (v/v) 이하, 2.3% (v/v) 미만, 2.2% (v/v) 이하, 2.2%(v/v) 미만, 2.1% (v/v) 이하, 또는 2.1%(v/v) 미만 일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 그 예로, 글리세롤이 성장기 배지에 포함된 경우, 글리세롤 미포함 배지에 비해 세포 성장이 증가하고 단백질 발현량 역시 증가하여 목적 단백질을 대량 생산할 수 있다.
전술한 구체예 중 어느 하나의 구체예로, 상기 (b)(i) 단계는 글리세롤을 포함하는 배지에서 배양하는 단계 이후 배지에 발현 유도물질을 첨가하는 단계를 더 포함할 수 있다. 상기 발현 유도물질은 이소프로필 β-D-1-티오갈락토피라노시드(IPTG)일 수 있다. IPTG는 락토오스와 유사한 구조를 가지며, lac 오페론의 유도자로 작용하여 오페론의 전사를 유발할 수 있다.
전술한 구체예 중 어느 하나의 구체예로, 상기 발현 유도물질의 첨가는 대장균의 성장이 대수기 후반에 진입했을 때 이루어질 수 있다.
전술한 구체예 중 어느 하나의 구체예로, 상기 발현 유도물질의 첨가는 균주의 배양액의 흡광도(OD600) 값이 약 20 내지 40이 되는 시점 혹은 그 전후에 이루어질 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 균주의 배양액의 흡광도(OD600) 값이 약 20 내지 40이 되는 시점에서 대장균의 성장이 대수기 후반에 진입한 것으로 판단할 수 있다.
OD600이란 600㎚ 파장에서의 광학 밀도를 말하며, 균주의 농도를 측정하는 데 사용될 수 있다. 일 예로 E. coli의 경우 OD600에서 흡광도 1.0이 약 1X109CFU/mL로 환산되므로 OD600 값을 측정하여 균주의 절대량을 확인할 수 있다.
상기 발현 유도물질은 미생물에 의해 분해되거나 사용되지 않는 것일 수 있다. 따라서 상기 발현 유도물질의 첨가량은 배지 내 함량과 동일할 수 있다. 전술한 구체예 중 어느 하나의 구체예로, 상기 발현 유도물질의 배지 내 함량은 0mM 초과이면서 약 5.0mM 이하, 구체적으로 4.5mM 이하, 4.0mM 이하, 3.9mM 이하, 3.8mM 이하, 3.7mM 이하, 3.6mM 이하, 3.5mM 이하, 3.0mM 이하, 2.9mM 이하, 2.8mM 이하, 2.7mM 이하, 2.6mM 이하, 2.5mM 이하, 2.4mM 이하, 2.3mM 이하, 2.2mM 이하, 2.1 mM 이하, 또는 2.0mM 이하일 수 있다. 그 예로, 약 1.9mM 이하, 1.8mM 이하, 1.7mM 이하, 1.6mM 이하, 1.5mM 이하, 1.4mM 이하, 1.3mM 이하, 1.2mM 이하, 1.1mM 이하, 1.0mM 이하일 수 있다.
전술한 구체예 중 어느 하나의 구체예로, 상기 발현 유도물질의 첨가 이후 미생물을 배양하는 시간은 약 1시간 내지 30시간일 수 있고, 그 예로, 약 2시간 내지 25시간, 2시간 내지 20시간, 2시간 내지 16시간, 2시간 내지 15시간, 3시간 내지 25시간, 3시간 내지 20시간, 3시간 내지 16시간, 3시간 내지 15시간, 4시간 내지 25시간, 4시간 내지 20시간, 4시간 내지 16시간, 5시간 내지 25시간, 5시간 내지 20시간, 5시간 내지 16시간, 5시간 내지 15시간, 4시간 내지 15시간, 4시간 내지 14시간, 4시간 내지 13시간, 4시간 내지 12시간, 4시간 내지 11시간 또는 4시간 내지 10시간일 수 있다. 일 예로, 약 10시간일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
단백질 B의 회수 및 정제
본 발명의 일 구체예에서, 상기 단백질 B는 세포주로부터 회수될 수 있다. 상기 세포주는 균주일 수 있다.
상기 회수 방법은 상기 균주를 파쇄하는 단계를 포함할 수 있다. 세포의 파쇄(lysis) 방법은 알칼리, 계면활성제, 유기 용매 또는 효소 (라이소자임 등)의 사용, 초음파처리(sonication) 또는 고압분쇄기(French Press)의 사용, 주기적인 고온, 압력, 냉동 또는 해동 사이클을 적용하여 수행될 수 있다.
전술한 구현예 중 어느 하나의 구현예로, 상기 균주는 불활성화 형태일 수 있다. 상기 불활성화 형태라는 용어에는 균주에 특이적인 플레이트 상에서 단일 집락을 형성할 수 없는, 불활성화된 균주가 포함된다. 일 예로, 상기 균주는 펠렛화되거나 동결된 형태일 수 있다. 상기 불활성화 균주는 당업계에 알려져 있는 조건하에 적절한 배지에 적용되었을 경우 다시 생장될 수 있다. 일 예로, 본 발명의 균주는 불활성화 형태로 용이하게 저장 및 취급되면서도 단백질 B를 포함하고 있는 형태일 수 있다. 그러나 반드시 이에 제한되는 것은 아니다.
전술한 구현예 중 어느 하나의 구현예로, 상기 (b)(ii)의 현탁은 원심분리를 통해 회수된 세포를 현탁하는 것일 수 있다.
전술한 구현예 중 어느 하나의 구현예로, 상기 파쇄 단계에 있어서, 현탁액의 부피는 균주 1g당 약 4ml 내지 18ml, 5ml 내지 15ml, 6ml 내지 15ml, 7ml 내지 14ml, 또는 8ml 내지 14ml일 수 있고, 그 예로 약 8ml 내지 13ml, 8ml 내지 12.5ml, 8ml 내지 12ml, 8ml 내지 11.5ml, 8ml 내지 11ml, 8ml 내지 10.5ml, 8.5ml 내지 13ml, 8.5ml 내지 12.5ml, 8.5ml 내지 12ml, 8.5ml 내지 11.5ml, 8.5ml 내지 11ml, 9ml 내지 13ml, 9ml 내지 12.5ml, 9ml 내지 12ml, 9ml 내지 11.5ml, 또는 약 9ml 내지 11ml 일 수 있다. 일 예로, 약 10ml일 수 있다.
전술한 구현예 중 어느 하나의 구현예로, 균주를 파쇄하는 단계에 있어서 세포의 파쇄(lysis) 방법은 알칼리, 계면활성제, 유기 용매 또는 효소 (라이소자임 등)의 사용, 초음파처리(sonication) 또는 고압분쇄기(French Press)의 사용, 주기적인 고온, 압력, 냉동 또는 해동 사이클을 적용하여 수행될 수 있다. 전술한 구현예 중 어느 하나의 구현예로, 상기 파쇄 단계는 압력에 의한 파쇄일 수 있다. 상기 압력은 약 14000 psi 내지 21000 psi, 14000 psi 내지 20000 psi, 14000 psi 내지 19000 psi, 14000 내지 18000 psi, 15000 psi 내지 21000 psi, 15000 psi 내지 20000 psi, 15000 psi 내지 19000 psi, 15000 psi 내지 18000 psi, 15500 psi 내지 18000 psi, 15000 내지 17500 psi, 16000 psi 내지 18000 psi, 16000 psi 내지 17500 psi, 16500 psi 내지 18000 psi, 또는 약 16500 psi 내지 17500 psi일 수 있다. 전술한 구현예 중 어느 하나의 구현예로, 상기 파쇄 횟수는 목적 단백질을 원하는 수율로 수득할 수 있는 수준으로 적절히 반복될 수 있다. 그 예로 1회 이상, 예를 들어 10회, 9회, 8회, 7회, 6회, 5회, 4회, 3회 또는 2회 수행될 수 있으나 이에 제한되지 않는다.
전술한 구현예 중 어느 하나의 구현예로, 상기 균주를 파쇄하는 단계 이후 불순물을 제거할 수 있다. 그 예로 뉴클레아제 등을 처리할 수 있다.
단백질의 회수 및 정제에 있어서 세포 배양물, 세포 용해물(cell lysate)등에 포함되어 있는 핵산은 불순물로 인식되므로, 뉴클레아제를 처리하여 불순물을 제거할 수 있다. 상기 뉴클레아제는 엔도뉴클레아제일 수 있고, 그 예로 벤조네이즈(Benzonasae: Serratia marcescens endonuclease), 옴니클레이브(Omnicleave) (Epicentre) 또는 DNase I를 이용할 수 있다.
전술한 구체예 중 어느 하나의 구체예로, 상기 균주를 파쇄하는 단계 이후 뉴클레아제(nuclease)를 처리할 수 있다. 상기 뉴클레아제는 엔도뉴클레아제일 수 있고, 그 예로 벤조네이즈(Benzonasae: Serratia marcescens endonuclease), 옴니클레이브(Omnicleave) (Epicentre) 또는 DNase I를 이용할 수 있다.
전술한 구현예 중 어느 하나의 구현예로, 상기 뉴클레아제는 벤조네이즈일 수 있다. 상기 벤조네이즈의 첨가에 의해, 벤조네이즈의 최종 함량은 0 초과이고 약 10 unit/mL 이하, 구체적으로 약 0.5 내지 10 unit/mL, 구체적으로 0.5 내지 9 Unit/mL, 0.5 내지 8 Unit/mL, 0.5 내지 7 Unit/mL, 0.5 내지 6 Unit/mL, 1 내지 10 Unit/mL, 1 내지 9 Unit/mL, 1 내지 8 Unit/mL, 1 내지 7 Unit/mL, 1 내지 6 Unit/mL, 2 내지 10 Unit/mL, 2 내지 9 Unit/mL, 2 내지 8 Unit/mL, 2 내지 7 Unit/mL, 2 내지 6 Unit/mL, 3 내지 10 Unit/mL, 3 내지 9 Unit/mL, 3 내지 8 Unit/mL, 3 내지 7 Unit/mL, 3 내지 6 Unit/mL, 4 내지 10 Unit/mL, 4 내지 9 Unit/mL, 4 내지 8 Unit/mL, 4 내지 7 Unit/mL, 또는 약 4 내지 6 Unit/mL일 수 있다. 일 예로, 약 5 Unit/mL일 수 있다.
전술한 구현예 중 어느 하나의 구현예로, 상기 뉴클레아제 처리 단계는 pH 약 7 내지 9의 환경에서 수행 될 수 있다.
전술한 구현예 중 어느 하나의 구현예로, 상기 뉴클레아제 처리 후 반응 시간은 약 300분 이하일 수 있고, 구체적으로 약 60분 내지 300분, 90분 내지 270분, 120분 내지 240분 일 수 있고, 일 예로 약 180분일 수 있다.
전술한 구현예 중 어느 하나의 구현예로, 상기 (b)(ii) 단계는 불순물을 제거하기 위한 공정을 추가로 더 포함할 수 있으며, 이러한 예시로 원심분리, 여과, 투석 등의 방법을 사용할 수 있다.
전술한 구현예 중 어느 하나의 구현예로, 상기 파쇄된 현탁액은 목적 단백질의 봉입체(inclusion body) 형태를 포함할 할 수 있다. 전술한 구현예 중 어느 하나의 구현예로, 상기 목적 단백질은 미생물로부터 봉입체(inclusion body) 형태로 회수될 수 있다.
단백질은 전사 후 단백질 접힘이라는 과정을 통해 3차 구조를 형성하고, 이 과정에서 단백질 고유의 특징과 기능이 나타나게 된다. 이 과정에서 단백질 접힘이 정상적으로 이루어지지 않으면 단백질들이 서로 뭉쳐진다. 봉입체란 잘못된 접힘 현상에 의해 폴리펩티드가 고밀도로 뭉쳐 있는 응집체 상태를 말한다. 봉입체 형태는 목적 단백질의 높은 순도 및 세포 파괴와 원심분리에 의한 정제가 용이하다는 이점을 가진다. 봉입체 형태의 상태를 풀고, 정상 단백질 형태로 되돌리는 것이 단백질 가용화 및 재접힘이다.
전술한 구현예 중 어느 하나의 구현예로, 상기 정제방법은 봉입체의 가용화 단계를 추가로 포함할 수 있다. 상기 봉입체 형태로 회수된 목적 단백질을 정상 단백질 형태로 되돌리기 위해 가용화 버퍼가 사용될 수 있다.
본 발명의 "가용화 버퍼(solubilization buffer)"는 봉입체 형태로 발현된 단백질에서 폴리펩티드의 응집을 해소하기 위한 버퍼이다.
일 구현예로, 상기 가용화 버퍼는 Na-P, NaCl, Urea 및 Triton X-100를 포함할 수 있고, 그 예로 20mM Na-P, 150mM NaCl, 2M Urea, 0.1% Triton X-100를 사용할 수 있다.
전술한 구현예 중 어느 하나의 구현예로, 상기 (b)(ii) 정제방법은 상기 뉴클레아제 처리 단계 이후 상등액과 봉입체를 분리하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 상기 분리 방법은 당업계에 공지된 방법을 이용할 수 있으며, 특별히 제한되지는 않으나, 일 예로 원심분리 또는 여과일 수 있다. 상기 여과는 종래의 공지된 미세여과, 한외여과, 정용여과, 정밀여과, 심층여과 등의 공정으로 진행될 수 있고, 그 예로 미세여과일 수 있다. 상기 여과는 약 0.01 ㎛ 내지 0.5 ㎛, 예를 들어 약 0.1 ㎛ 내지 0.3 ㎛, 구체적으로 약 0.2 ㎛의 공극 크기를 가지는 필터에 상기 회수액을 통과시키는 단계를 포함할 수 있다. 그러나 이에 제한되지 않는다.
전술한 구현예 중 어느 하나의 구현예로, 상기 뉴클레아제 처리 단계 이후 상등액으로부터 회수된 단백질은 응집체 형태가 아닌 액상의 가용성 형태 (soluble form)로 존재 할 수 있다. 그러나 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 (b)(ii)의 정제 단계는 1차 음이온 교환 크로마토그래피 및 2차 음이온 교환 크로마토그래피를 수행하는 것을 특징으로 한다.
본 발명에서 "음이온 교환 크로마토그래피(anion exchange chromatography: AEX)" 는 양으로 하전된 지지체에 음으로 하전된 (또는 산성) 분자를 결합시키는 것에 의해 분자들을 이들의 전하에 따라 분리할 수 있는 것으로서, 분자들의 동족체 (산성, 염기성 및 중성)는 이 기법에 의해 쉽게 분리할 수 있다.
음이온 교환 크로마토그래피에 사용되는 "음이온 교환 수지" 또는 "음이온 교환 막"은 양으로 하전되어 있으며, 따라서 그에 부착된 1개 이상의 양으로 하전된 리간드를 갖는 고체 상을 지칭한다. 음이온 교환 수지를 형성하기에 적합한, 고체 상에 부착되는 임의의 양으로 하전된 리간드가 사용될 수 있다.
상업적으로 입수가능한 음이온 교환 수지의 예시는 포로스 HQ, 포로스 XQ, Q 세파로스 패스트 플로우, DEAE 세파로스 패스트 플로우, 사토바인드(SARTOBIND)® Q, ANX 세파로스 4 패스트 플로우 (하이 서브), Q 세파로스 XL, Q 세파로스 빅 비드, DEAE 세파덱스 A-25, DEAE 세파덱스 A-50, QAE 세파덱스 A-25, QAE 세파덱스 A-50, Q 세파로스 하이 퍼포먼스, Q 세파로스 XL, 소스 15Q, 소스 30Q, 리소스 Q, 캅토 Q, 캅토 DEAE, 모노 Q, 도요펄 슈퍼 Q, 도요펄 DEAE, 도요펄 QAE, 도요펄 Q, 도요펄 기가캡 Q, TS 겔 슈퍼Q, TS 겔 DEAE, 프락토겔 EMD TMAE, 프락토겔 EMD TMAE 하이캡, 프락토겔 EMD DEAE, 프락토겔 EMD DMAE, 마크로프렙 하이 Q, 마크로-프렙-DEAE, 우노스피어 Q, 누비아 Q, PORGS PI, DEAE 세라믹 하이퍼D, Q 세라믹 하이퍼D를 포함한다. 다른 예시로는 DEAE 셀룰로스, 포로스® PI 20, PI 50, HQ 10, HQ 20, HQ 50, D 50 (어플라이드 바이오시스템즈), 사토바인드® Q (사토리우스), 모노Q, 미니Q, 소스 15Q 및 30Q, Q, DEAE 및 ANX 세파로스® 패스트 플로우, Q 세파로스® 하이 퍼포먼스, QAE 세파덱스(SEPHADEX)® 및 FAST Q 세파로스® (지이 헬스케어), WP PEI, WP DEAM, WP QUAT (제이. 티. 베이커), 히드로셀 DEAE 및 히드로셀 QA (바이오크롬 랩스 인크.), 우노스피어 Q, 마크로-프렙® DEAE 및 마크로-프렙® 하이 Q (바이오라드), 세라믹 하이퍼D Q, 세라믹 하이퍼D DEAE, 트리스아크릴® M 및 LS DEAE, 스페로덱스 LS DEAE, QMA 스페로실(SPHEROSIL)® LS, QMA 스페로실® M 및 무스탕(MUSTANG)® Q (폴 테크놀로지스), 다우엑스® 파인 메쉬 강염기 타입 I 및 타입 II 음이온 수지 및 다우엑스® 모노스피어 77 약염기 음이온 (다우 리퀴드 세퍼레이션즈), 인터셉트(INTERCEPT)® Q 멤브레인, 매트렉스 셀루파인® A200, A500, Q500 및 Q800 (밀리포어), 프락토겔® EMD TMAE, 프락토겔® EMD DEAE 및 프락토겔® EMD DMAE (EMD), 앰버라이트® 약 및 강 음이온 교환체 타입 I 및 II, 다우엑스® 약 및 강 음이온 교환체 타입 I 및 II, 다이아이온® 약 및 강 음이온 교환체 타입 I 및 II, 듀오라이트(DUOLITE)® (시그마-알드리치), TSK 겔 Q 및 DEAE 5PW 및 5PW-HR, 도요펄® 슈퍼Q-650S, 650M 및 650C, QAE-550C 및 650S, DEAE-650M 및 650C (도소), QA52, DE23, DE32, DE51, DE52, DE53, 익스프레스-이온 D 또는 익스프레스-이온 Q (와트만), 사토바인드® Q (미국 뉴욕 소재의 사토리우스 코포레이션)가 있으나, 이에 제한되지 않는다.
일 구체예로, 본 발명의 (b)(ii)의 정제 단계에서 1차 음이온 교환 크로마토그래피는 약한 음이온 교환수지(weak anion exchanger)를 사용할 수 있다.
전술한 구체예 중 어느 하나의 구체예로, 상기 약한 음이온 교환수지는 약 음이온 교환기를 가지는 것일 수 있다. 그 예로 1급, 2급 또는 3급 아민, 구체적으로 2급(secondray) 또는 3급(tertiary) 아민을 교환기로 갖는 수지로 충진된 음이온 교환수지를 사용할 수 있다. 상기 아민의 양으로 하전된 형태 또한 포함된다.
전술한 구체예 중 어느 하나의 구체예로, 상기 1차 음이온 교환 크로마토그래피는 PEI(Polyethyleneimine), PAB(Para-aminobenzyl), AE(amino ethyl), DEAE (diethyl aminoethyl) 또는 DMAE(dimethyl aminoethyl) 컬럼일 수 있고, 구체적으로 DEAE 컬럼일 수 있다. 일 예로 DEAE 세파로스 패스트 플로우(FF) 일 수 있으나 이에 제한되지는 않는다.
일 구체예로, 본 발명의 (b)(ii)의 정제 단계에서 2차 음이온 교환 크로마토그래피는 약한 음이온 교환수지(weak anion exchanger)를 사용할 수 있다.
전술한 구체예 중 어느 하나의 구체예로, 상기 약한 음이온 교환수지는 약 음이온 교환기를 가지는 것일 수 있다. 그 예로 1급, 2급 또는 3급 아민, 구체적으로 2급(secondray) 또는 3급(tertiary) 아민을 교환기로 갖는 수지로 충진된 음이온 교환수지를 사용할 수 있다. 상기 아민의 양으로 하전된 형태 또한 포함된다.
전술한 구체예 중 어느 하나의 구체예로, 상기 2차 음이온 교환 크로마토그래피는 PEI(Polyethyleneimine), PAB(Para-aminobenzyl), AE(amino ethyl), DEAE(diethyl aminoethyl) 또는 DMAE(dimethyl aminoethyl) 컬럼일 수 있고, 구체적으로 DEAE 컬럼일 수 있다. 일 예로 DEAE 세파로스 패스트 플로우(FF) 일 수 있으나 이에 제한되지는 않는다.
본 발명의 상기 (b)(ii) 정제 단계에 있어서 "로딩" 단계는 상기 목적 단백질을 포함하는 유체(피드)가 유입구를 통과해 흐르도록 하는 것에 의해 컬럼을 로딩하여, 상기 피드가 흡착제 또는 수지와 접촉하여 특정 물질이 결합되도록 하는 단계를 수반한다. 결합되지 않은 특정 물질 및 다른 분자들은 유체와 함께 배출구를 통과해 흐른다.
일 구체예로, 본 발명의 (b)(ii)의 정제 단계는 상기 로딩 단계 전후로 컬럼을 세척하는 단계, 표적 물질을 용출하는 단계, 흡착제를 재생시키는 단계, 및/또는 컬럼을 평형화하는 단계를 포함할 수 있다.
본 발명에서 "완충제"는 용액 내 그의 존재로 인해, pH에서의 단위 변화를 유발하기 위해 첨가되어야 하는 산 또는 알칼리의 양을 증가시키는 물질을 지칭한다. 완충된 용액은 산-염기 접합체 구성요소의 작용에 의해 pH에서의 변화에 저항한다. 완충된 용액은 용액의 pH가 생리학적 범위 내에 있도록 수소 이온의 일정한 농도를 유지할 수 있다. 완충제 구성요소는 유기 및 무기 염, 산 및 염기를 포함할 수 있으나 이에 제한되지는 않는다.
일 예로, 컬럼 완충액으로는 인산 완충액, 시트르산 완충액 또는 아세트산 완충액을 사용할 수 있다. 구체적으로, 상기 컬럼 완충액은 인산 완충액일 수 있고, 예를 들어 인산나트륨일 수 있으나 이에 제한되지는 않는다. 일 예로, 상기 컬럼 완충액은 염을 포함할 수 있다. 예를 들어 컬럼 완충액에는 NaCl, KCl, NaOAc, (NH4)2SO4, Na2SO4 및 CH3COONa 등의 염이 포함될 수 있으나 이에 제한되지는 않는다.
전술한 구체예 중 어느 하나의 구체예로, 상기 1차 음이온 교환 크로마토그래피는 완충액을 이용하여 컬럼을 재생하는 단계를 포함할 수 있다.
전술한 구체예 중 어느 하나의 구체예로, 상기 1차 음이온 교환 크로마토그래피의 컬럼 재생 단계에서 사용되는 완충액은 염을 포함하는 인산 완충액일 수 있다. 전술한 구체예 중 어느 하나의 구체예로, 상기 1차 음이온 교환 크로마토그래피의 컬럼 재생 단계에서 사용되는 완충액은 인산나트륨 및 염화나트륨을 포함할 수 있다. 전술한 구체예 중 어느 하나의 구체예로, 상기 인산나트륨의 농도는 약 100mM 내지 300mM일 수 있다. 전술한 구체예 중 어느 하나의 구체예로, 상기 염화나트륨의 농도는 약 400mM 내지 600mM일 수 있다. 그러나, 이에 제한되지 않는다.
전술한 구체예 중 어느 하나의 구체예로, 상기 1차 음이온 교환 크로마토그래피는 완충액을 이용하여 컬럼을 평형화하는 단계를 포함할 수 있다.
전술한 구체예 중 어느 하나의 구체예로, 상기 1차 음이온 교환 크로마토그래피의 컬럼 평형화 단계에서 사용되는 완충액은 인산 완충액일 수 있다. 전술한 구체예 중 어느 하나의 구체예로, 상기 1차 음이온 교환 크로마토그래피의 컬럼 평형화 단계에서 사용되는 완충액은 인산나트륨 및 염화나트륨을 포함할 수 있다. 전술한 구체예 중 어느 하나의 구체예로, 상기 인산나트륨의 농도는 약 1 내지 100mM일 수 있고, 구체적으로 약 2 내지 50mM, 또는 약 5 내지 35mM일 수 있으나 이에 제한되지 않는다. 전술한 구체예 중 어느 하나의 구체예로, 상기 염화나트륨의 농도는 약 100mM 내지 600mM일 수 있고, 예를 들어 약 100mM 내지 500mM, 100mM 내지 450mM, 100mM 내지 400mM, 150mM 내지 500mM, 150mM 내지 450mM, 150mM 내지 400mM, 200mM 내지 500mM, 200mM 내지 450mM, 200mM 내지 400mM, 250mM 내지 500mM, 250mM 내지 450mM, 250mM 내지 400mM, 또는 300mM 내지 400mM일 수 있다. 일 예로 약 350mM 일 수 있다. 그러나, 이에 제한되지 않는다.
상기 재생 및 평형화 단계는 로딩 단계 이전에 수행될 수 있다.
전술한 구체예 중 어느 하나의 구체예로, 상기 1차 음이온 교환 크로마토그래피는 목적 단백질을 포함하는 용액을 로딩하는 단계를 포함할 수 있다. 상기 용액의 목적 단백질은 봉입체 형태로 포함될 수 있으나 이에 제한되지는 않는다. 상기 로딩 단계의 유속은 적절히 선택할 수 있고, 예를 들어 적어도 약 50cm/hr, 60cm/hr, 70cm/hr 또는 그 이상일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 로딩하는 목적 단백질을 포함하는 용액의 양은 적절히 조절될 수 있다. 일 예로 단위 수지에 로드되는 시료의 양은 약 1 내지 20 v/v일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
전술한 구체예 중 어느 하나의 구체예로, 상기 1차 음이온 교환 크로마토그래피는 네거티브 모드(negative mode)로 수행하는 것을 포함할 수 있다.
본 발명에서 용어 "네거티브 크로마토그래피" 는 "음성 크로마토그래피" 또는 "관류 크로마토그래피" 로도 불리며, 목적 단백질은 컬럼에 부착되지 않지만 불순물은 칼럼에 부착되는 크로마토그래피법을 말한다. 상기 네거티브 모드 크로마토그래피의 수행에 의해 투과액(flow-through)에 목적 단백질이 존재하도록 하여, 불순물로부터 목적 단백질을 분리할 수 있다. "파지티브 크로마토그래피"는 이와 반대로 컬럼에 목적 단백질이 결합하고, 불순물은 결합하지 않는 형태의 크로마토그래피법을 지칭한다. 파지티브 크로마토그래피를 수행한 후 컬럼에 결합된 목적 단백질을 용출(elution)함으로써 목적 단백질을 수득할 수 있다.
상기 1차 음이온 교환 크로마토그래피를 네거티브 모드로 수행하는 단계를 포함함으로써, 불순물의 함량을 낮출 수 있다.
전술한 구체예 중 어느 하나의 구체예로, 본 발명의 목적 단백질은 상기 1차 음이온 교환 크로마토그래피의 투과액에 포함될 수 있다.
전술한 구체예 중 어느 하나의 구체예로, 본 발명의 (b)(ii)의 정제 단계는 상기 1차 음이온 교환 크로마토그래피의 투과액을 다시 1차 음이온 교환 컬럼에 로딩하여 순환(circulation)하는 단계를 더 포함할 수 있다. 상기 순환은 목적하는 수준으로 불순물 함량이 낮아질 때까지 수행할 수 있다. 그 예로 상기 순환 부피는 수지 부피의 약 2배 이상, 3배 이상, 4배 이상, 5배 이상, 일 예로 약 10배 일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
전술한 구체예 중 어느 하나의 구체예로, 본 발명의 (b)(ii)의 정제 단계는 1차 음이온 교환 크로마토그래피 단계에서 수득한 용액을 여과하는 단계를 포함할 수 있다. 상기 여과 단계는 약 0.01 ㎛ 내지 0.5 ㎛, 예를 들어 약 0.1 ㎛ 내지 0.3 ㎛, 구체적으로 약 0.2 ㎛의 공극 크기를 가지는 필터에 상기 투과액을 통과시키는 단계를 포함할 수 있다. 그러나 이에 제한되지 않는다.
전술한 구체예 중 어느 하나의 구체예로, 상기 1차 크로마토그래피를 통해 수득한 용액을 2차 음이온 교환 컬럼에 로딩할 수 있다.
전술한 구체예 중 어느 하나의 구체예로, 상기 2차 음이온 교환 크로마토그래피는 파지티브 모드(positive mode)로 수행될 수 있다.
전술한 구체예 중 어느 하나의 구체예로, 상기 2차 음이온 교환 크로마토그래피의 완충액은 세제를 포함하는 것일 수 있다. 상기 완충액은 평형화 단계, 세척 단계 및/또는 용출 단계의 완충액을 포함한다.
상기 2차 음이온 교환 크로마토그래피의 완충액에 포함되는 세제의 예시로는 Triton X-100, Tween 80, Tween 20, 나트륨 도데실 설페이트(SDS), 나트륨 테트라데실 설페이트, 나트륨 헥사데실 설페이트, 나트륨 데옥시콜레이트, 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노올레에이트, 브리즈(Brij), NP40, CHAPS, CHAPSO 또는 옥타글루코시드(octaglucoside)를 들 수 있으며, 구체적으로는 Triton X-100, Tween 80, Tween 20으로 이루어진 군으로부터 선택되는 세제를 사용할 수 있다. 일 예로, Triton X-100을 사용할 수 있다. 상기 세제의 함량은 약 0.01% 내지 1%, 또는 0.5% 내지 0.05%일 수 있고, 일 예로 약 0.1%(v/v)일 수 있다.
전술한 구체예 중 어느 하나의 구체예로, 상기 2차 음이온 교환 크로마토그래피는 완충액을 이용하여 컬럼을 재생하는 단계를 포함할 수 있다.
전술한 구체예 중 어느 하나의 구체예로, 상기 2차 음이온 교환 크로마토그래피의 컬럼 재생 단계에서 사용되는 완충액은 염을 포함하는 인산 완충액일 수 있다. 전술한 구체예 중 어느 하나의 구체예로, 상기 2차 음이온 교환 크로마토그래피의 컬럼 재생 단계에서 사용되는 완충액은 인산나트륨 및 염화나트륨을 포함할 수 있다. 전술한 구체예 중 어느 하나의 구체예로, 상기 인산나트륨의 농도는 약 100 내지 300mM일 수 있다. 전술한 구체예 중 어느 하나의 구체예로, 상기 염화나트륨의 농도는 약 400mM 내지 600mM일 수 있다. 그러나, 이에 제한되지 않는다.
전술한 구체예 중 어느 하나의 구체예로, 상기 2차 음이온 교환 크로마토그래피는 완충액을 이용하여 컬럼을 평형화하는 단계를 포함할 수 있다.
전술한 구체예 중 어느 하나의 구체예로, 상기 2차 음이온 교환 크로마토그래피의 컬럼 평형화 단계에서 사용되는 완충액은 인산 완충액일 수 있다. 전술한 구체예 중 어느 하나의 구체예로, 상기 2차 음이온 교환 크로마토그래피의 컬럼 평형화 단계에서 사용되는 완충액은 인산나트륨 및 염화나트륨을 포함할 수 있다. 전술한 구체예 중 어느 하나의 구체예로, 상기 인산나트륨의 농도는 약 1 내지 100mM일 수 있고, 구체적으로 약 2 내지 50mM, 또는 5 내지 35mM일 수 있으나 이에 제한되지 않는다. 전술한 구체예 중 어느 하나의 구체예로, 상기 염화나트륨의 농도는 약 500mM 이하일 수 있고, 예를 들어 약 400mM 이하, 약 300mM 이하 또는 약 250mM 이하일 수 있고, 일 예로, 약 50mM 내지 400mM, 약 50mM 내지 300mM, 또는 약 50mM 내지 250mM일 수 있다. 일 예로, 약 150mM일 수 있다. 그러나, 이에 제한되지 않는다.
상기 재생 및 평형화 단계는 2차 크로마토그래피 컬럼에 1차 크로마토그래피에서 수득한 목적 단백질을 포함한 용액을 로딩하기 전 수행될 수 있다.
전술한 구체예 중 어느 하나의 구체예로, 본 발명의 (b)(ii)의 정제 단계에서 상기 2차 음이온 교환 크로마토그래피는 세제 및 염(salt)을 포함하는 인산 완충액을 이용하여 수지를 1차 세척하는 단계; 및 세제 및 염을 포함하는 인산 완충액을 이용하여 수지를 2차 세척하는 단계를 포함할 수 있다.
상기 세척 단계는 1차 크로마토그래피를 통해 수득한 용액을 로딩하여 통과한 분획을 폐기한 후 수행될 수 있다.
전술한 구체예 중 어느 하나의 구체예로, 상기 1차 및 2차 세척 단계의 완충액은 인산 완충액, 구체적으로는 인산나트륨일 수 있다. 전술한 구체예 중 어느 하나의 구체예로, 상기 인산나트륨의 농도는 약 1 내지 100mM일 수 있고, 구체적으로 약 2 내지 50mM, 5 내지 35mM일 수 있으나 이에 제한되지 않는다.
전술한 구체예 중 어느 하나의 구체예로, 상기 1차 및 2차 세척 단계의 완충액은 염화나트륨을 포함할 수 있다. 전술한 구체예 중 어느 하나의 구체예로, 상기 1차 세척 단계 완충액의 염화나트륨의 농도는 약 100 mM 내지 200mM일 수 있다.
전술한 구체예 중 어느 하나의 구체예로, 상기 2차 세척 단계 완충액의 염화나트륨의 농도는 약 250mM 미만일 수 있고, 구체적으로 약 10mM 이상 250mM 미만, 25mM 이상 250mM 미만, 50mM 이상 250mM 미만, 75mM 이상 250mM 미만, 100mM 이상 250mM 미만, 또는 약 150mM 이상 250mM 미만일 수 있다.
본 발명의 2차 크로마토그래피는 세척 단계 이후 완충액을 투입하여 용출액을 회수하는 단계를 포함할 수 있다.
상기 용출 완충액은 인산 완충액, 구체적으로는 인산나트륨일 수 있다. 상기 완충액은 염화나트륨을 포함할 수 있다. 상기 인산나트륨의 농도는 약 1 내지 100mM일 수 있고, 구체적으로 약 2 내지 50mM, 또는 5 내지 35mM일 수 있으나 이에 제한되지 않는다. 상기 염화나트륨의 농도는 약 30mM 내지 500mM일 수 있다. 일 예로 500mM 미만일 수 있다.
전술한 구체예 중 어느 하나의 구체예로, 본 발명의 (b)(ii)의 정제 단계는 2차 음이온 교환 크로마토그래피의 회수액을 여과하는 단계를 포함할 수 있다. 상기 여과 단계는 약 0.01 ㎛ 내지 0.5 ㎛, 예를 들어 약 0.1 ㎛ 내지 0.3 ㎛, 구체적으로 약 0.2 ㎛의 공극 크기를 가지는 필터에 상기 회수액을 통과시키는 단계를 포함할 수 있다. 그러나 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 (b)(ii)의 정제 단계에 있어서, 전술한 크로마토그래피를 수행하는 단계에서 전도도, 유속 또는 유량은 적절히 조절될 수 있다.
일 구체예로, 본 발명의 (b)(ii)의 정제 단계는 크로마토그래피를 수행하는 단계 이후 여과 단계를 더 포함할 수 있다.
상기 여과는 종래의 공지된 미세여과, 한외여과, 정용여과, 정밀여과, 심층여과 등의 공정으로 진행될 수 있다.
전술한 구체예 중 어느 하나의 구체예로, 본 발명의 (b)(ii)의 정제 단계는 크로마토그래피 단계 이후 한외여과(Ultrafiltration) 및 정용여과(Diafiltration) 공정을 포함할 수 있다.
본 발명의 "한외여과(Ultrafiltration)"는 크기를 기준으로 용액 중 분자를 분리시키는 막-기반 분리 공정을 지칭한다. 한외여과 공정은 당업계에 알려져 있으며, 단백질 정제 공정에 일반적으로 사용된다(예를 들어, Zeman et al., Microfiltration and Ultrafiltration: Principles and Applications, Marcel Dekker, Inc., pp. 299-301 (1996)). 한외여과에 의해 용매와 작은 용질 분자는 통과하고 거대분자는 유지될 수 있으며, 이에 따라 단백질과 같은 미세 분자를 정제하고 농축하는 데 사용될 수 있다.
본 발명의 "정용여과(diafiltration)"는 수성 완충제를 여과잔류물(retentate)에 가하는 한외여과의 일 유형으로 한외여과 공정의 완충액 교환으로도 지칭될 수 있다. 상기 정용여과는 한외여과막을 사용하여 단백질, 펩티드, 핵산, 및 기타 생체분자를 함유하는 용액으로부터 염 또는 용매를 제거하거나 교체하거나 그 농도를 낮추는 방법이다.
전술한 구체예 중 어느 하나의 구체예로, 상기 여과 단계에서 사용되는 완충액은 TAPS, Bicine, Tris, Tricine, TAPSO, HEPES, TES, MOPS, PIPES, Cacodylate, MES 중에서 선택되는 염; 및 NaCl, KCl, NaOAc, (NH4)2SO4, Na2SO4 및 CH3COONa 중에서 선택되는 염; 및 Triton X-100, Tween 80, Tween 20, 나트륨 도데실 설페이트(SDS), 나트륨 테트라데실 설페이트, 나트륨 헥사데실 설페이트, 나트륨 데옥시콜레이트, 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노올레에이트, 브리즈(Brij), NP40, CHAPS, CHAPSO 및 옥타글루코시드(octaglucoside) 중에서 선택되는 세제를 포함할 수 있다. 전술한 구체예 중 어느 하나의 구체예로, 상기 완충액은 Tris, 염화나트륨을 포함할 수 있다. 전술한 구체예 중 어느 하나의 구체예로, 상기 완충액에 포함된 세제는 CHAPS일 수 있다. CHAPS는 3-cholamidopropyl dimethylammonio 1-propanesulfonate로 명명되기도 하는 세제로 비변성 양쪽성 이온(non-denaturing zwitterionic) 세제이다.
전술한 구체예 중 어느 하나의 구체예로, 상기 Tris는 약 10mM 내지 100mM, 구체적으로 약 20mM 내지 80mM, 30mM 내지 70mM, 또는 40mM 내지 60mM의 농도로 포함될 수 있고, 일 예로 약 50mM 농도로 포함될 수 있다.
전술한 구체예 중 어느 하나의 구체예로, 상기 염화나트륨은 약 100 내지 1000mM, 구체적으로 약 200mM 내지 800mM, 300mM 내지 700mM, 또는 400mM 내지 600mM의 농도로 포함될 수 있고, 일 예로 약 500mM 농도로 포함될 수 있다.
전술한 구체예 중 어느 하나의 구체예로, 상기 CHAPS는 약 0.01% 내지 5%, 구체적으로 0.01% 내지 3%, 0.01% 내지 2%, 0.01% 내지 1%, 0.01% 내지 1.5%, 0.05% 내지 3%, 0.05% 내지 2%, 0.05% 내지 1.5%, 0.05% 내지 1%, 0.1% 내지 3%, 0.1% 내지 2%, 0.1% 내지 1.5%, 0.1% 내지 1%, 0.5% 내지 3%, 0.5% 내지 2%, 0.5% 내지 1.5%, 또는 0.5% 내지 1% (v/v)농도로 포함될 수 있고, 일 예로 약 0.75% 농도로 포함될 수 있다.
융합 단백질 A 및 단백질 B의 조립(assembly) 및 정제
일 구체예로, 본 발명의 다량체성 단백질 조립체의 제조방법은 상기 융합 단백질 A와 단백질 B를 1:10 내지 2:1의 몰 비율로 혼합하는 단계를 포함할 수 있다.
그 예로, 상기 (c) 혼합 단계에서 융합 단백질 A과 단백질 B의 몰 비율은 약 1:9, 1:8, 1:7, 1:6, 1:5.5, 1:5, 1:4.5, 1:4, 1:3.5, 1:3, 1:2.5, 1:2.4, 1:2.3, 1:2.2, 1:2.1, 1:2, 1:1.9, 1:1.8, 1:1.7, 1:1.6, 1:1.5, 1:1.4, 1:1.3, 1:1.2, 1:1.1, 1:1, 1.05:1, 1.1:1, 1.15:1, 1.2:1, 1.25:1 또는 약 1.3:1일 수 있다. 다른 일 측면에서, 융합 단백질 A과 단백질 B의 몰 비율은 약 1:0.9 내지 1.1일 수 있고, 1:1.0 내지 1.1일 수 있다.
상기 혼합 반응을 수행하는 시간은 특별히 제한되지 않으나, 1시간을 초과하여 수행될 수 있다. 예를 들어 약 1시간, 1.5시간, 2시간, 2.5시간, 3시간, 3.5시간 또는 약 4시간 동안 수행될 수 있다. 일 예로, 약 0.5시간 초과 4시간 이하, 0.5시간 초과 3.5시간 이하, 약 1시간 초과 3.5시간 이하, 1.5시간 이상 3시간 이하, 1.5시간 이상 2.5시간 이하, 1.8시간 이상 2.2시간 이하, 또는 1.9시간 이상 2.1시간 이하의 시간 동안 수행될 수 있다.
전술한 구체예 중 어느 하나의 구체예로, 상기 혼합 단계는 안정제를 포함하는 완충액의 존재하에 수행될 수 있다.
상기 안정제는 폴리소르베이트-20, 폴리소르베이트-40, 폴리소르베이트-60, 폴리소르베이트-65, 폴리소르베이트-80, 폴리소르베이트-85, 폴록사머-188, 소르비탄 모노라우레이트, 소르비탄 모노팔미테이트, 소르비탄 모노스테아레이트, 소르비탄 모노올레에이트, 소르비탄 트리라우레이트, 소르비탄 트리스테아레이트, 소르비탄 트리올레이트(trioleate), 아르기닌, 수크로오스 또는 이들의 조합으로부터 선택되는 것일 수 있다. 일 예로, 폴리소르베이트-80일 수 있다.
상기 안정제의 함량은 0 초과 0.050 v/v% 미만일 수 있다. 구체적으로, 약 0.001% 이상 0.050% 미만, 0.005% 이상 0.050% 미만, 0.01% 이상 0.050% 미만, 0.001% 이상 0.045% 이하, 0.005% 이상 0.045% 이하, 0.01% 이상 0.045% 이하, 0.001% 이상 0.040% 이하, 0.005% 이상 0.040% 이하, 0.01% 이상 0.040% 이하, 0.001% 이상 0.030% 이하, 0.005% 이상 0.030% 이하, 0.01% 이상 0.030% 이하, 0.001% 이상 0.035% 이하, 0.005% 이상 0.035% 이하, 0.01% 이상 0.035% 이하, 0.01% 이상 0.025% 이하, 0.015% 이상 0.050% 미만, 0.02% 이상 0.050% 미만, 0.015% 이상 0.045% 이하, 0.02% 이상 0.045% 이하, 0.015% 이상 0.040% 이하, 0.02% 이상 0.040% 이하, 0.015% 이상 0.030% 이하, 0.02% 이상 0.030% 이하, 0.015% 이상 0.035% 이하, 0.02% 이상 0.035% 이하, 또는 약 0.02% 이상 0.03% 이하일 수 있다. 일 측면에서, 상기 안정제의 함량은 약 0.01% 이상 0.025% 이하일 수 있다.
전술한 구체예 중 어느 하나의 구체예로, 상기 (c)혼합 단계 이후 (d) 본 발명의 다량체성 단백질 조립체를 포함하는 조성물을 여과하는 단계를 더 포함할 수 있다. 상기 (d) 여과 단계는 약 0.01 μm 내지 0.5 μm, 예를 들어 약 0.1 ㎛ 내지 0.3 ㎛, 구체적으로 약 0.2 ㎛의 공극 크기를 가지는 필터에 상기 투과액을 통과시키는 단계를 포함할 수 있다. 그러나 이에 제한되지 않는다.
일 구체예로, 본 발명의 (d) 정제 단계는 한외여과 및/또는 정용여과를 수행하는 단계를 포함할 수 있다.
한외여과를 수행한 후 정용여과를 수행하는 경우, 한외여과에 의해 단백질을 특정 농도로 농축시킨 후 정용여과를 수행할 수 있다. 이 때 한외여과에 의해 농축된 단백질의 농도는 정용여과 초기 단백질의 농도와 동일할 수 있다.
전술한 구체예 중 어느 하나의 구체예로, 상기 정용여과 초기 단백질의 농도는 약 10mg/mL 미만, 예를 들어 약 9mg/mL 미만, 8mg/mL 미만, 7mg/mL 미만, 6mg/mL 미만, 5mg/mL 미만, 또는 약 4 mg/mL 미만일 수 있다.
전술한 구체예 중 어느 하나의 구체예로, 상기 여과 단계에 사용되는 여과막의 분획분자량 (MWCO; molecular weight cut-off)은 약 500kDa 미만일 수 있다. 그 예로 약 10kDa 이상 500kDa 미만, 20kDa 이상 500kDa 미만, 30kDa 이상 500kDa 미만, 40kDa 이상 500kDa 미만, 50kDa 이상 500kDa 미만, 60kDa 이상 500kDa 미만, 70kDa 이상 500kDa 미만, 80kDa 이상 500kDa 미만, 90kDa 이상 500kDa 미만, 또는 약 100kDa 이상 500kDa 미만일 수 있다. 일 예로 약 200kDa 이상 400kDa 이하일 수 있고, 예를 들어 약 300kDa일 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
전술한 구체예 중 어느 하나의 구체예로, 상기 여과는 접선 유동 여과 (Tangential flow filtration) 방식을 이용하는 것일 수 있다. 이에 대해서는 전술한 바와 같다.
전술한 구체예 중 어느 하나의 구체예로, 상기 여과 단계의 여과막 면적당 단백질 부하(load)량은 약 10mg/0.1m2 이상 1250 mg/0.1m2 이하일 수 있다. 그 예로, 약 20mg/0.1m2 이상 1200 mg/0.1m2 이하, 약 30mg/0.1m2 이상 1200 mg/0.1m2 이하, 약 40mg/0.1m2 이상 1200 mg/0.1m2 이하, 약 50mg/0.1m2 이상 1150 mg/0.1m2 이하, 약 60mg/0.1m2 이상 1150 mg/0.1m2 이하, 약 70mg/0.1m2 이상 1150 mg/0.1m2 이하, 약 80mg/0.1m2 이상 1100 mg/0.1m2 이하, 약 90mg/0.1m2 이상 1100 mg/0.1m2 이하, 약 100mg/0.1m2 이상 1100 mg/0.1m2 이하, 약 110mg/0.1m2 이상 1050 mg/0.1m2 이하, 약 120mg/0.1m2 이상 1050 mg/0.1m2 이하, 약 130mg/0.1m2 이상 1050 mg/0.1m2 이하, 약 140mg/0.1m2 이상 1000 mg/0.1m2 이하, 약 150mg/0.1m2 이상 1000 mg/0.1m2 이하, 약 160mg/0.1m2 이상 1000 mg/0.1m2 이하, 약 170mg/0.1m2 이상 950 mg/0.1m2 이하, 약 180mg/0.1m2 이상 950 mg/0.1m2 이하, 약 190mg/0.1m2 이상 950 mg/0.1m2 이하, 약 200mg/0.1m2 이상 900 mg/0.1m2 이하, 약 210mg/0.1m2 이상 900 mg/0.1m2 이하, 약 220mg/0.1m2 이상 900 mg/0.1m2 이하, 약 230mg/0.1m2 이상 900 mg/0.1m2 이하, 약 240mg/0.1m2 이상 850 mg/0.1m2 이하, 약 250mg/0.1m2 이상 850 mg/0.1m2 이하, 약 260mg/0.1m2 이상 850 mg/0.1m2 이하, 약 270mg/0.1m2 이상 800 mg/0.1m2 이하, 약 280mg/0.1m2 이상 800 mg/0.1m2 이하, 약 290mg/0.1m2 이상 800 mg/0.1m2 이하, 또는 약 300mg/0.1m2 이상 750 mg/0.1m2 이하 일 수 있다.
면역원성 조성물 및 백신 조성물
본 발명의 목적 단백질을 포함하는 다량체성 단백질 조립체는 면역원성 조성물의 성분으로 사용될 수 있다. 따라서, 본 발명의 다른 하나의 양태는 상기 다량체성 단백질 조립체를 포함하는 면역원성 조성물을 제공한다.
상기 면역원성 조성물은 포유류에서 항체를 발생시키는 데 사용될 수 있다.
본 발명의 면역원성 조성물은 면역학적 유효량의 다량체성 단백질 조립체를 포함할 수 있다. 용어 "면역학적 유효량"은 개체에게 투여된 경우, 항원에 대한 항체 반응을 유발하는 데 효과적인 양이다. 면역학적 유효량은 치료될 개체의 건강 및 신체 조건, 이들 개체의 연령, 개체의 면역계가 항체를 합성하는 역량, 필요한 보호 수준, 조성물의 제형, 의료 상황에 대한 치료 의사의 평가, 및 다른 관계된 인자에 따라 다양할 수 있다. 본 발명의 면역학적 조성물의 면역학적 유효량은 다량체성 단백질 조립체 또는 상기 조립체 내의 항원 함량으로 표현될 수 있고, 투여량(dose) 당 단백질의 질량의 측면에서 표현될 수 있다.
본 발명의 면역원성 조성물을 개체에 투여하여 개인의 감염을 예방할 수 있다. 따라서, 본 발명의 면역원성 조성물은 백신 조성물일 수 있다.
본 발명의 백신 조성물은 SARS-CoV-2 감염에 의해 발병되는 질환을 예방하는 데 사용될 수 있다. 본 발명의 용어 "예방" 이란 질환 발병을 억제 또는 지연시키는 모든 행위를 의미한다. 본 발명의 용어 "SARS-CoV-2(사스-코로나바이러스-2)"는 호흡기 질환인 코로나바이러스감염증-19(COVID-19)를 야기하는 바이러스를 의미한다.
본 발명의 방법을 통해 다량체성 단백질 조립제를 효율적으로 제조할 수 있다.
도 1은 서열번호 1의 단백질(Component A)을 코딩하는 염기서열을 포함하는 벡터의 구조를 나타낸 것이다.
도 2는 바이오리액터 내 배양액의 pH 상단값을 pH 7.25로 한 경우의 배양액 내 용존산소량 (DO), pH, 산소 유량 및 이산화탄소 유량 변화를 나타낸다.
도 3은 바이오리액터 내 배양액의 pH 상단값을 pH 7.1로 낮춘 경우의 배양액내 DO, pH, 산소 유량 및 이산화탄소 유량 변화와 배양 기간 중 누적 탄산수소나트륨 사용량 추이를 나타낸다.
도 4는 바이오리액터 내 배양액의 pH 상단값을 각각 6.8, 6.99, 7.0 또는 7.2로 변화시켰을 때 배양액 내 젖산 생성량의 변화를 나타낸다.
도 5는 상표명 하이클론 셀부스트 7A/7B (Cell Boost 7A/7BTM)만을 공급하거나, 하이클론 셀부스트 7A/7B를 45 % (w/v) D-글루코스 용액과 격일로 교차하여 공급하였을 때 목적 단백질 발현량이 달라짐을 나타낸다.
도 6은 상표명 하이클론 셀부스트 7A/7B (Cell Boost 7A/7BTM)만을 공급하거나, 하이클론 셀부스트 7A/7B를 45 % (w/v) D-글루코스 용액과 교차하여 공급하였을 때 목적 단백질을 발현하는 세포주의 세포생존률 및 생존 세포 밀도(VCD)를 나타낸다.
도 7은 하이클론 셀부스트 7A/7B (Cell Boost 7A/7BTM)와 45 % (w/v) D-글루코스 용액의 투입 주기별 목적 단백질을 발현하는 세포주의 세포생존률 및 생존 세포 밀도(VCD)를 나타낸다.
도 8은 상표명 하이클론 셀부스트 7A/7B (Cell Boost 7A/7BTM)과 45 % (w/v) D-글루코스 용액의 투입 주기를 달리하였을 때 SDS-PAGE를 통해 측정한 배양 10일차, 배양 11일차, 배양 12일차, 배양 13일차, 배양 14일차 및 배양 15일차의 목적 단백질 발현량을 도시한다.
도 9는 상표명 하이클론 셀부스트 7A/7B (Cell Boost 7A/7BTM)과 45 % (w/v) D-글루코스 용액의 투입 주기를 달리하였을 때 웨스턴 블랏(WESTERN-BLOT)을 통해 측정한 배양 10일차, 배양 11일차, 배양 12일차, 배양 13일차, 배양 14일차 및 배양 15일차의 목적 단백질 발현량을 도시한다.
도 10은 목적 단백질을 발현하는 세포 배양액 2000 L를 원심분리하는 과정에서 공급유속을 200 L/h, 300 L/h 또는 400 L/h로 하여 얻은 상층액 내 목적 단백질 함량 및 상기 상층액에 A1HC 심층필터 또는 공극직경 0.5 ㎛/0.2 ㎛인 필터의 조합을 적용하여 여과하였을 때 여과액 내 목적 단백질의 함량을 웨스턴 블랏으로 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 11은 목적 단백질을 발현하는 세포 배양액 2000 L를 200 L/h의 공급유속으로 원심분리하여 얻은 상층액 내 목적 단백질의 함량, 상기 상층액에 0.45 ㎛ 공극 직경의 필터를 적용하여 여과하였을 때 여과액 내 목적 단백질 함량 및 상기 상층액에 0.2 ㎛ 공극 직경의 필터를 적용하여 여과하였을 때 여과액 내 목적 단백질 함량을 웨스턴 블랏으로 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 12는 (1) 뉴클레아제(nuclease)인 벤조네이즈 농도(unit/ml)를 1 내지 20 unit/ml, (2) 뉴클레아제(nuclease) 처리 시간(hr)을 1 내지 6 hr, 및 (3) 배양액 내 Mg2+ 이온의 농도(mM)를 0 내지 2 mM 범위로 설정하였을 때, DoE 프로그램(JMP, Version: 14.0)으로부터 도출되는 augment design 시험설계 결과를 나타낸 것이다.
도 13은 Component B의 발현 벡터맵을 나타낸 것이다.
도 14는 배양 배지의 글리세롤 첨가량에 따른 균주 생장 수준을 확인한 것이다.
도 15는 IPTG 첨가량에 따른 발현량 차이를 확인한 것이다.
도 16은 유도기 (induction phase) 돌입 시 세포 성장 정도 (및 유도기 지속 시간에 따른 목적 단백질의 상대적 발현량을 시험계획법에 따라 측정하여 나타낸 것이다. 대수기 초반, 대수기 중반, 대수기 후반을 각각 -1, 0, 1로 표시하였다.
도 17은 세포 현탁액 부피 및 파쇄 압력에 따른 단백질 수율을 확인한 것이다.
도 18은 벤조네이즈 처리 조건 변경에 따른 단백질 수율 및 불순물 수준을 확인한 것이다.
도 19는 가용화 완충액(solubilization buffer)의 처리조건을 변경하여 단백질 수율 및 불순물 수준을 확인한 것이다.
도 20은 1차 크로마토그래피 공정의 Loading ratio, Linear velocity 및 Circulation time 을 조정하여 불순물 제거율을 확인한 것이다.
도 21은 Component A 및 B의 혼합 몰 비율에 따른 입자 크기 및 다분산 지수를 확인한 것이다.
도 22는 Component A 및 B 혼합 시 반응 시간에 따른 입자 크기 및 다분산 지수를 확인한 것이다.
도 23은 UF/DF permeate에 대해 SDS PAGE 분석을 통해 조립되지 않은 단백질이 제거된 것을 확인한 결과이다.
도 24는 정용여과(Diafiltration) 수행 시 다량체성 단백질 조립체의 농도 변화에 따른 수율, 크기 평균 및 다분산 지수를 확인한 결과이다.
도 25는 UF/DF 여과 막 MWCO 사이즈 변화에 따른 수율, 크기 평균 및 다분산 지수를 확인한 결과이다.
도 26은 UF/DF 여과막 면적(0.1m2)당 단백질 부하(Protein/membrane area load ratio)를 300, 750, 1250mg으로 변경하며 수율, 크기 평균 및 다분산 지수를 확인한 것이다.
도 27은 나노파티클(Nanoparticle)을 제조하기 위한 전체적인 공정의 모식도를 나타낸 것이다.
도 28 및 29는 나노파티클의 일 구성성분인 Component A를, 도 30은 나노파티클의 일 구성성분인 Component B를, 도 31은 나노파티클을 제조 및 정제하는 공정의 모식도이다.
이하 본 발명을 실시예 및 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예 및 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예 및 실시예에 한정되는 것은 아니다.
제조예 1. Component A 발현 세포의 제조
서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 폴리펩타이드("Component A")를 발현하는 세포주를 제작하기 위하여 영국 HORIZON Discovery 사에서 분양 받은 HD-BIOP3 세포주를 숙주세포로 사용하였다. Donor plasmid (pJV145)에 SalI/NotI 제한 효소 반응을 이용해 Genscript사에서 합성한 cDNA를 삽입하여 재조합 발현 벡터 plasmid (M-2560)를 제작하였다 (도 1). 상기 M-2560 벡터는 서열번호 3으로 표시되는 DNA 서열을 갖는다.
상기 HD-BIOP3 세포주에 재조합 발현 벡터 plasmid (M-2560)를 형질주입하였다. 형질주입된 세포 중 안정적인 single cell cloning이 가능한 세포를 선별하여 충분한 장기 계대 안정성을 갖는 연구용 세포은행(Research cell bank; RCB)을 제조하였다. 상기 RCB를 SK바이오사이언스 안동공장으로 이관하여 GMP 기준에 적합하게 제조용 세포은행(Working Cell Bank; WCB)를 제조하였다.
WCB(Working Cell Bank) 1 바이알을 37℃ 항온수조 (water bath)에서 녹이고 CD OptiCHO 배지로 희석한 후 원심분리를 하여 펠렛 (pellet)을 CD OptiCHO 배지로 재부유시켰다. 10 L 바이오리액터에서 5 x 105 cells/mL 농도로 6 L 배양, 50L 바이오리액터에서 5 x 105 cells/mL 농도로 30 L 배양, 200 L 바이오리액터에서 5 x 105 cells/mL 농도로 200 L 배양, 2000 L 바이오리액터에서 8 x 105 cells/mL 농도로 1600 L 배양할 수 있도록 확장 계대 배양하였다.
제조예 2. Component A를 발현하는 세포주의 2000 L 바이오리액터에서의 배양
일회용 세포 배양백을 2000 L 바이오리액터에 장착하고 가동 준비를 한 뒤, 1400 L의 Dynamis 배지를 주입하고 8.0 x 105 cells/mL의 농도로 WCB를 접종하여 배양하였다. 배양 시 DO 조절은 기체 및 산소를 통해 진행하며, pH 조절은 8 % 탄산수소나트륨 및 이산화탄소 가스를 사용하여 진행하였다.
접종 직후부터 매일 샘플링을 하여 세포수를 측정하고 미생물 오염 여부 및 배양액 내 glucose 농도 등을 확인하였으며, 바이오리액터 내 거품이 condenser에 장착된 air filter의 하단까지 올라오면 ADCF 소포제를 처리하였다. 이와 같은 과정을 배양 종료까지 반복적으로 진행하였다.
배양시 사용되는 배양 조건은 하기 표 1과 같다.
세포주의 배양 조건
배양 조건 설정 값
온도 (배양 0 ~ 5일차) 37℃
온도 (배양 5일차 이후) 31℃
배양용 배지 Dynamis
접종용 배지 CD OptiCHO
교반 속도 93 RPM
배양 부피 1600 L
초기 접종 농도 8.0 x 105 cells/mL
용존 산소량 40%
용존 산소량 조절 기체, 산소
pH 조절 8 % 탄산수소나트륨, 이산화탄소
제조예 2.2. 배양액 회수 및 DNA 절단효소 처리
목적 단백질을 발현하는 세포주의 배양액을 4,500 g에서 30 분간 원심분리하여 상층액을 회수한 후 A1HC 재질의 depth filter를 통과시키고, triton X-100을 처리한 후, 0.5/0.2 μm filter로 여과하였다. 여과된 배양액에 세포주 유래 DNA를 제거하기 위하여 DNA 절단효소인 벤조네이즈 (Merck, Benzonase® endonuclease)를 최종농도 2 Unit/mL로 처리하고 상온에서 4 시간 동안 반응시켰다.
제조예 3. Component A의 정제
제조예 3.1. 1차 크로마토그래피
1차 정제 공정에서는 HIC (hydrophobic interaction chromatography) 레진을 이용하여 불순 단백질을 제거하고 목적 단백질을 정제하였다. 로딩할 시료를 준비하기 위하여 벤조네이즈 처리가 완료된 본배양액에 5 M 염화나트륨을 첨가하고 전도도가 170 mS/cm 이상, 특히 약 170 내지 220 mS/cm 범위에 있도록 보정하였다. 컬럼을 염화나트륨을 포함한 평형 인산나트륨 완충용액을 이용하여 5 배 컬럼 용량 이상의 충분한 양으로 평형화 시킨 후 시료를 컬럼에 투입하였다. 이때 컬럼에 결합하지 않고 흘러나온 분획은 버리고 UV값이 평행을 이룰 때까지 평형 완충용액을 2 배 컬럼 용량 이상 흘려서 충분히 세척하였다. 이어서 목적 단백질 용출은, 염화나트륨을 포함한 용출 인산나트륨 완충용액을 사용하여 수행하였다.
제조예 3.2. 바이러스 불활화
바이러스 불활화를 위하여 목적 단백질 용출액의 pH가 3.5가 되도록 5 M HCl을 처리하고 상온에서 1 시간 동안 교반하면서 바이러스를 불활화하였다. 1 시간 반응 후 5 N NaOH를 불활화된 목적 단백질 용출액에 처리하여 불활화 공정 전 pH로 회복시키고 30 분간 상온에서 교반하면서 안정화시켰다.
제조예 3.3. 1차 한외여과
불활화된 1차 정제 용출액을 100 kDa 한외여과막 필터를 사용하여 농축하고 2차 정제공정에 사용할 염화나트륨을 포함한 평형 인산나트륨 완충용액을 이용하여 탈염 및 버퍼교환을 실시하였다. 여과액의 전도도를 확인하여 완충용액의 전도도와 동일한 수준이 될 때까지 완충용액을 이용하여 버퍼교환을 수행하여 목적 단백질을 회수하였다.
제조예 3.4. 2차 크로마토그래피
2차 정제 공정에서는 CHT™ Ceramic Hydroxyapatite 크로마토그래피 및 혼합모드 레진을 이용하여 남아있는 불순 단백질을 제거하고 목적 단백질을 정제하였다. 컬럼에 투입될 시료는 1차 한외여과 회수액으로 별도의 pH, 전도도 조정을 하지 않았다. 컬럼을 염화나트륨을 포함하는 평형 인산나트륨 완충용액을 이용하여 7배 컬럼 용량 이상의 충분한 양으로 평형화 시킨 후 시료를 컬럼에 투입하였다. 시료 투입 종료 후 평형 완충용액을 2 배 컬럼 용량으로 흘려 컬럼에 결합하지 않고 흘러나온 분획을 제거하였다. 이어서, 염화나트륨을 포함하는 세척 인산나트륨 완충용액을 사용하여 불순물을 제거하고, 염화나트륨을 포함하는 용출 인산나트륨 완충용액을 사용하여 목적 단백질을 용출하였다.
제조예 3.5. 3차 크로마토그래피
3차 정제 공정에서는 양이온 교환 레진이 충전된 컬럼을 이용한 음이온 교환 크로마토그래피(Anion Exchange Chromatography, AEX)를 통해 목적 단백질을 정제하고 불순 단백질과 핵산을 제거하였다. 양이온 교환 레진이 충전된 컬럼을 평형 인산나트륨 완충용액을 이용하여 6 배 컬럼 용량 이상의 충분한 양으로 평형화시키고, 2차 정제 용출액을 평형 인산나트륨 완충용액을 이용해 4배 희석한 후, 컬럼에 투입하였다. 시료 투입 종료 후 평형 완충용액을 3 배 컬럼 용량으로 흘려 컬럼에 결합하지 않고 흘러나온 분획을 취하고 컬럼을 세척하였다.
제조예 3.6. 바이러스 여과
3차 정제 공정의 컬럼 통과액을 이용하여 바이러스 여과 공정을 진행함으로써 바이러스를 제거하였다. 3차 정제 공정의 컬럼 통과액을 이용하므로, 본 바이러스 여과 대상인 컬럼 통과액에는 상기 평형 완충용액이 동일하게 존재한다. 바이러스 여과 공정에 사용하는 필터는 두 종류로 이루어져 있으며, 프리필터로 심층필터를 사용하고 심층필터 여과 후 바이러스 필터로 바이러스를 제거하였다.
제조예 3.7. 2차 한외여과
바이러스 필터 여과액을 30 kDa 크기의 필터를 사용하여 한외여과를 실시함으로써 농축 및 버퍼교환을 하였다. 바이러스 필터 여과액을 여과 시작 부피의 약 1/10~1/3 부피로 농축하고 농축액 8 배 이상 용량의 assembly buffer (50 mM Tris, 100 mM arginine, 150 mM NaCl, 5 w/v% sucrose buffer/ pH 7.9~8.1 / 전도도 18~22 mS/cm)로 버퍼교환을 실시하였다. 2차 한외여과가 완료된 시료는 0.22 μm filter로 여과하고 목적 단백질 원액을 -70 ℃이하에서 보관하였다.
제조예 3.8. 정제 공정에서 사용되는 완충용액(buffer)의 조성, pH 및 전도도(conductivity)
상기 제조예 3.1 내지 3.7의 공정에 사용한 완충용액의 조성, pH 및 전도도를 정리하여 하기 표 2에 나타내었다.
단계 완충용액 조성 완충용액 pH 전도도
제조예 3.1.
1차 크로마토그래피		 HIC EQ
컬럼 평형화		 20mM Sodium phosphate, 3M NaCl pH 6.4~6.6 170 내지 220 mS/cm
제조예 3.1.
1차 크로마토 그래피		 HIC Elution
용출		 20mM Sodium phosphate, 0.6M NaCl pH 6.4~6.6 50~70 mS/cm
워싱(1차 크로마토그래피 수행 후 HIC 컬럼에 남은 단백질 제거를 위한 단순 워싱 단계임) HIC Strip
잔존 단백질 제거		 20mM Sodium phosphate pH 6.4~6.6 1.8~2.4 mS/cm
제조예 3.2.
바이러스 불활화		 불활화 20mM Sodium phosphate, 0.6M NaCl pH 3.5로 조절 후, pH 회복 50~70 mS/cm
제조예 3.3.
1차 한외여과 TFF(Tangential flow filtration)		 여과 2mM Sodium phosphate, 50mM NaCl pH 6.7~6.9 5~7 mS/cm
제조예 3.4.
2차 크로마토그래피		 CHT EQ
컬럼 평형화		 2mM Sodium phosphate, 50mM NaCl pH 6.7~6.9 5~7 mS/cm
제조예 3.4.
2차 크로마토그래피		 CHT wash
세척		 25mM Sodium phosphate, 50mM NaCl pH 6.7~6.9 7.5~8.5 mS/cm
제조예 3.4.
2차 크로마토그래피		 CHT Elution
용출		 240mM Sodium phosphate, 50mM NaCl pH 8.1~8.3 28~32 mS/cm
워싱(2차 크로마토그래피 수행 후 CHT 컬럼에 남은 단백질 제거를 위한 단순 워싱 단계임) CHT Strip
잔존 단백질 제거		 400mM Sodium phosphate, 50mM NaCl pH 8.1~8.3 38~44 mS/cm
제조예 3.5.
3차 크로마토그래피		 AEX EQ
컬럼 평형화		 2mM Sodium phosphate pH 8.1~8.3 0.3~0.5 mS/cm
워싱(3차 크로마토그래피 수행 후 AEX 컬럼에 남은 단백질 제거를 위한 단순 워싱 단계임) AEX Strip
잔존 단백질 제거		 20mM Sodium phosphate, 3M NaCl pH 6.4~6.6 180~200 mS/cm
제조예 3.6.
바이러스 여과		 여과 2mM Sodium phosphate pH 8.1~8.3 0.3~0.5 mS/cm
제조예 3.7.
2차 한외여과 TFF(Tangential flow filtration)		 여과 50mM Tris
150mM NaCl
100mM Arginine
5 w/v% sucrose		 pH 7.9~8.1 18~22 mS/cm
제조예 4. Component B 발현 세포의 제조 및 배양
Thermofisher사에서 분양된 BL21 competent 세포에 Component B 단백질(서열번호 6) 발현 유전자가 도입된 벡터로 균주를 형질전환하였다. 유전자의 도입을 위한 벡터는 pET29b+를 사용하였다. 서열번호 8로 표시되는 제조된 플라스미드(도 13)를 대장균 BL21주에 형질전환하고 카나마이신(Kanamycin) 내성을 갖는 대장균 균주를 선별하고, 선별된 대장균 BL21주를 효모추출물을 포함한 대두기반 배지에 접종하여 37℃에서 200 rpm으로 흡광도가 1.8 이상이 될 때까지 진탕 배양하였다. 배양이 완료되면 멸균된 글리세롤을 최종농도가 25%가 되도록 첨가하여 연구용 세포은행을 구축하였다.
제조한 대장균(E. coli) 제조용 세포은행 1 바이알을 실온에서 녹인 후 효모추출물을 포함한 대두기반배지 500 mL이 들어있는 1 L 플라스크에 최종 농도가 30 ug/mL이 되도록 카나마이신 용액을 첨가하고 제조용 균주 0.15 mL을 접종하여 종배양액을 제조하였다. 이 때 종배양 조건은 37℃에서 200 rpm으로 진탕 배양하여 최종 흡광도가 1.5 가 초과되도록 8시간 이상 배양하였다.
효모추출물을 포함한 대두기반배지 50 L가 들어있는 75 L 발효조에 최종 농도가 30 ug/mL이 되도록 카나마이신을 첨가하고 종배양액 전량을 접종한 뒤 흡광도가 25가 될 때까지 37℃에서 200 rpm으로 배양하였다(Growth phase). 흡광도가 25가 되면 발효기 설정을 배양온도 18℃, 교반 속도 150 rpm으로 변경하고, IPTG를 최종 농도가 0.5mM이 되도록 첨가하고 10 시간 배양(Induction phase)한 후 본배양을 종료하였다.
제조예 4.2. 배양액 회수 및 DNA 절단효소 처리
제조예 4.1의 본배양액을 원심분리하여 세포를 회수하고, 완충액으로 현탁한 후 고압파쇄기로 파쇄하였다. 원심분리 조건은 원심분리속도 15,000 g, 원심분리시간 20 분으로 진행하여 배양 상등액은 폐기하고 세포를 회수하였다. 회수된 세포는 -70℃ 이하 초저온 냉동고에서 보관하였다. 세포 1 g 당 10 mL의 완충액을 이용하여 세포가 완전히 풀릴 때까지 1 ~ 2 시간 교반하였다. 세포 현탁액은 고압파쇄기를 이용하여 압력 17,000 psi 조건으로 2회 파쇄하여 세포 파쇄액을 회수하였다.
세포주 유래 DNA를 제거하기 위하여, DNA 절단효소인 벤조네이즈를 최종농도 5 Unit/ml이 되도록 세포 파쇄액에 처리하고 상온에서 3시간 반응시켰다. Benzonase 처리가 완료된 세포 파쇄액을 고속원심분리기를 이용하여 15,000 g에서 60 분간 원심분리하여 상등액은 폐기하고 봉입체를 회수하였다. 회수된 봉입체는 인산나트륨완충액을 이용하여 세척하고, 2 M 요소가 함유된 인산나트륨완충액(20mM Na-P, 150mM NaCl, 2M Urea, 0.1% Triton X-100)을 이용하여 봉입체를 용해하고, 0.2 ㎛ 여과하였다.
제조예 5. Component B의 정제
제조예 5.1 1차 크로마토그래피
다이에틸아미노에틸(Diethylaminoethyl, DEAE)수지가 충전된 컬럼을 이용하여 1차 크로마토그래피를 수행하여, 숙주 유래 불순물인 엔도톡신, 핵산을 제거하였다.
구체적으로 DEAE수지가 충진 된 컬럼(DEAE sepharose FF)을 200 mM 인산나트륨 500 mM 염화나트륨 완충액을 이용하여 재생하고, 20 mM 인산나트륨 350mM 염화나트륨 완충액을 이용하여 평형화하였다. 평형화가 완료된 크로마토그래피 컬럼에 100 cm/hr의 유속으로 실시예 3에서 회수한 봉입체를 투입하였다. 투입 후 UV280 이 0.005 AU 이상 증가 시 투과액의 수집을 시작하고, UV280 값이 다시 감소되어 평형을 이루면 수집을 중단하였다. 회수된 투과액은 0.2 μm 여과하였다.
제조예 5.2. 2차 크로마토그래피
2차 크로마토그래피는 다이에틸아미노에틸(Diethylaminoethyl, DEAE)수지가 충진 된 컬럼을 이용하여, 1차 크로마토그래피 이후 잔존되어 있는 엔도톡신, 숙주 유래 단백질을 추가적으로 제거하였다.
DEAE 수지가 충진 된 컬럼(DEAE sepharose FF)을 200 mM 인산나트륨 500 mM 염화나트륨 완충액을 이용하여 재생하고, 20 mM 인산나트륨 150 mM 염화나트륨 완충액을 이용하여 평형화하였다. 평형화가 완료된 크로마토그래피 컬럼에 100 cm/hr의 유속으로 1차 크로마토그래피 투과액을 투입하고 수지에 흡착되지 않고 통과된 분획은 폐기하였다. 다시 20 mM 인산나트륨 150 mM 염화나트륨 0.1% triton X-100을 포함하는 완충액을 이용하여 수지를 1차 세척하고, 20 mM 인산나트륨 200 mM 염화나트륨을 포함하는 완충액을 이용하여 2차 세척하였다. 이때, 세척액은 모두 폐기하였다. 세척이 완료되면, 20 mM 인산나트륨 400mM 염화나트륨을 포함하는 완충액을 투입하고 UV280 값이 0.01 AU 이상이 되면 용출액을 회수하고, UV280값이 다시 감소하여 평형을 이루면 회수를 종료하였다. 회수액은 0.2 μm 여과하였다.
제조예 5.3. UF/DF
2차 크로마토그래피 회수액을 0.7m2 면적의 100kDa MWCO(Molecular weight cut-off) 멤브레인이 장착된 접선유동여과(Tangential flow filtration)시스템을 이용하여 5 kg으로 농축(Ultrafiltration)하고, 농축액 10배 부피의 50 mM 트리스 완충액을 이용하여 완충액교환(Diafiltration)을 실시하여 회수하였다. 이 때, 막간차압(Transmembrane pressure, TMP)은 1 bar 이하로 유지하였다. 회수액을 0.2 μm 여과하였다.
제조예 6. Component A와 Component B의 조립(Assembly) 및 정제
전술한 제조예를 통해 수득한 Component A와 Component B를 조립하여 백신에 사용되는 다량체성 단백질 조립체 Nanoparticle를 제조하였다.
상온, 1시간, 80 rpm의 교반속도로 Component A 원액 및 Component B 를 혼합하는 반응을 수행하였다. Component A : Component B의 혼합 비율은 1 : 1.1 (몰농도) 로 하였다. 반응이 완료되면 반응액은 0.2 μm 필터로 여과하였다.
여과가 완료된 assemble 반응액을 0.7m2 면적의 300kDa MWCO(Molecular weight cut-off) 멤브레인이 장착된 접선유동여과(Tangential flow filtration)시스템을 이용하여 4 kg으로 농축(Ultrafiltration)하고, 농축액 10배 부피의 50 mM 트리스 완충액을 이용하여 완충액교환(Diafiltration)을 실시하여 회수하였다. 이 때, 막간차압(Transmembrane pressure, TMP)은 1 bar 이하로 유지하였다.
Component A 발현 세포 배양 조건 최적화
실시예 1. 바이오리액터 내 배양액 pH 변경에 따른 변화
제조예 2에서, 배양 6일차에 바이오리액터 내 배양액의 pH 상단값이 7.25에 도달함으로써 pH 조절을 위하여 분사기를 통한 배양액으로의 이산화탄소 주입이 증가하고, 배양액의 DO 유지를 위한 산소 주입이 증가하는 현상이 발생하였다(도 2). 또한, 이산화탄소 및 산소 주입의 증가에 따라 버블 발생이 증가하는 문제가 발생하였다.
따라서, 바이오리액터 내 배양액의 pH 상단값을 pH 7.1 (pH 오차범위인 deadband는 0.05)로 설정함으로써 상기 문제를 해소할 수 있는지 검증하였다.
구체적으로, 바이오리액터 내 배양액의 pH 상단값이 pH 7.2 (deadband는 0.05)로 설정된 경우 (CTIA01503 배치) 및 배양액의 pH 상단값을 pH 7.1 (deadband 는 0.05)로 설정한 경우 (E21R054 배치)의 배양 기간 동안의 변화를 관찰하였다. 배양 4일 내지 5일차 이후에도 E21R054 배치에서는 배양액으로의 산소 주입량 및 이산화탄소 주입량이 증가하는 현상이 발생하지 않았으며, pH가 일정 수준으로 유지됨에 따라 배양 기간 동안 누적되어 사용되는 탄산수소나트륨의 총량도 더 낮은 것으로 나타났다 (도 3).
또한, 바이오리액터 내 배양액의 pH 상단값을 pH 6.8, 6.99, 7.0 또는 7.2로 설정하였을 때, pH를 낮출수록 배양 기간 동안 젖산 발생량이 줄어드는 것으로 나타났다 (도 4). 따라서, 배양기간 동안 pH 상단값을 낮게 유지함으로써, 세포들이 pH 유지를 위해 무리하게 젖산과 같은 부산물을 생산하지 않게 되었다. 배양액 내 젖산의 농도가 증가하게 되면 배양액의 pH를 유지하기 위해 별도로 투입하게 되는 탄산수소나트륨과 같은 완충제 투입 용량이 감소하였다. 또한, 세포가 배양 과정에 서 겪는 스트레스가 감소되고, 배양 안정성이 크게 개선되어 단백질 생산 효율이 증가되었다.
실시예 2. 배양 과정에서 기체 분사 속도 변경에 의한 거품 억제 효과의 확인
바이오리액터에서의 배양시 교반을 함에 따라 배양액에 거품을 형성하는 가스가 생성되며, 이는 배양액 내 세포 성장 및 세포의 단백질 발현에 악영향을 미칠 수 있다. 따라서, 배양액 내 발생되는 거품 형성을 저해하기 위한 목적으로 소포제 (antifoams)를 배양 배지에 첨가하나, 소포제는 세포막 투과성 변화를 야기 하여 세포 성장 저해를 일으키고, 단백질 발현에도 영향을 줄 수 있는바, 바이오리 액터 내 배양액으로 도입되는 기체 분사 속도를 변경함으로써 배양액에서 발생하는 거품 형성을 억제할 수 있는지 검증하였다.
상기 실시예 1에서 생산 효율을 증가시키는 것으로 확인된 배양액의 pH 상단 값인 pH 7.1 (deadband는 0.05)을 고려하여, 배양액의 pH를 pH 6.8~7.1로 유지하면 서, 아래 표 3과 같은 조건으로 배양을 진행하였을 때 배양액에서 발생되는 거품을 억제하는 효과를 확인하였다.
공정 조건 배양 기간 DO output§ Air sparging flow (vvm) 거품 생성 정도 (1~5)
대조예 Day 0 ~ Day 10 0% 0 5
10% 0.002
100%
실험예 1 Day 0 ~ Day 5 0% 0.002 3
10%
100%
Day 5 ~ Day 10 0% 0.0005 1
10%
100%
실험예 2 Day 0 ~ Day 5 0% 0.002 3
10%
100%
Day 5 ~ Day 10 0% 0.001 1
10%
100%
§DO output: 보충해야 하는 산소의 분량을 나타내는 지표로서, DO ouput이 0%인 경우는 용존 산소가 배양액 내에 충분하다는 것을 의미하고, 0%를 초과하는 경우 배양액 내에 산소가 분사되어야 하는 상황을 의미하며, 100%인 경우는 세포가 소모하는 산소의 양이 분사 가능한 산소량의 최대치인 것을 의미한다.
산소를 보충할 필요가 없을 경우에는 기체를 분사하지 않고, 그 외의 경우에는 일정한 분사 속도로 기체를 분사하는 대조예의 경우, 배양액 내 거품 생성 정도가 가장 높은 것으로 나타났다.
반면에, DO output과 관계 없이 배양 5일차 이후 기체 분사 속도를 감소시키는 실시예 1 및 2에서는, 거품 형성이 억제되는 것으로 나타났다. 또한, 실험예 1 및 2는 배양 5일차 이전 및 이후에 DO output 수치와 관계없이 각각 동일한 분사속 도로 기체를 분사하기 때문에 공정 편의성이 확보되었다.
한편, 실험예 1은 배양 후반부에 pH 상단값 deadband 수준으로 미미한 pH 감소 현상이 관찰되어, 수율이 미미하게 감소하는 것으로 나타났으나, 실험예 2는 실험예 1과 달리, 배양 후반부 pH가 감소하는 현상이 발생하지 않았고, 수율도 유지되는 것으로 나타났다.
실시예 3. 배양액에 공급되는 당 공급원과 단백질 발현 촉진제 투입 방식별 단백질 발현량 변화
제조예 2에서 배양 3일차부터 배양 종료 시점까지 매일 샘플링을 하여 세포수 및 세포 생존률을 측정하고 미생물 오염 여부 및 배양액 내 glucose 농도를 확인하였다. 상표명 하이클론 셀부스트 7A 및 상표명 하이클론 셀부스트 7B를 각각 중성용매 및 염기성 용매에 용해하여 용액을 제조하였다. 제조된 하이클론 셀부스트 7A 및 상표명 하이클론 셀부스트 7B 용액을 10:1의 부피비로 혼합한 혼합물(즉, 상표명 하이클론 셀부스트 7A/7B의 혼합물)과 당 공급원인 45 % (w/v) D-glucose 용액을 투입하면서, 배양액 내 글루코스 농도를 5.0 ~ 7.0 g/L으로 유지하였다.
한편 배양과정에서 상표명 하이클론 셀부스트 7A/7B의 혼합물 단독만 공급되는 경우와 달리, 배양액에 상표명 하이클론 셀부스트 7A/7B의 혼합물을 45% (w/v) D-글루코스 용액과 교차로 투입하면 목적 단백질 발현량이 증가되는지 여부를 확인하기 위하여, 하기 표 4에 기재된 투입 조건으로 변경하여 목적 단백질 발현 세포주를 배양하고, 배양 16일차에 배양을 종결하였다.
　 배치 번호 투입 조건
대조군 ICR322019, ICR322021 ·배양액 내 글루코스 농도를 6g/L로 유지함
·배양 2일차부터 배양 15일 차까지 상표명 하이클론 셀부스트 7A/7B의 혼합물을 공급함
실험군 ICR322020, ICR322022 ·배양액 내 글루코스 농도를 6g/L로 유지함
·배양 2일차, 4일차, 6일차, 8일차, 10일차, 12일차 및 14 일차에 상표명 하이클론 셀부스트 7A/7B의 혼합물을 공급하고, 3일차, 5일차, 7일차, 9일차, 11일차, 13일차 및 15 일차에 45 % (w/v) D-글루코스 용액을 공급함
서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 목적 단백질에 결합하는 항체를 제조한 뒤, 해당 항체를 사용한 웨스턴 블랏 시험을 통해 상기 대조군 및 실험군에서 생산되는 목적 단백질 생산량 차이를 확인하기 위하여, 배양 9일차, 11일차, 13일차, 14일차 및 15일차에 배양액의 일부를 회수하여 웨스턴 블랏을 실시하였다, 웨스턴 블랏을 위한 배양액 회수시기와 관계없이, 실험군(배치 ICR32220 및 ICR322022, 도 5에서 20 및 22)의 목적 단백질 생산량이 대조군(배치 ICR322019 및 ICR322021, 도 5에서 19 및 21)보다 높은 것으로 나타났다(도 5 참조). 따라서, 배양액에 상표명 하이클론 셀부스트 7A/7B의 혼합물을 단독으로 사용하는 것보다 상표명 하이클론 셀부스트 7A/7B의 혼합물을 45 % (w/v) D-글루코스 용액과 교차하여 사용하면 단백질의 생산량을 증가시킬 수 있음이 확인되었다.
또한, 배양 0일차, 9일차 및 15일차가 되는 시점별로 대조군 및 실험군의 배치(즉, ICR322019 내지 ICR 322022)의 배양액을 2회씩 회수하여 배양액 내 세포 생존률(Cell viability) 및 생존 세포 밀도 (Viable Cell Density, VCD)를 측정하였으며, 각 시점 별로 측정된 값의 평균을 내었다.
배양 2일차부터 하이클론 셀부스트 7A/7B의 혼합물만을 투여한 대조군의 세포생존률 및 VCD와 비교하였을 때, 실험군의 세포생존률 및 VCD가 더 높은 것으로 나타났다(도 6 참조). 따라서, 배양액에 상표명 하이클론 셀부스트 7A/7B의 혼합물만을 단독으로 사용하기보다 상표명 하이클론 셀부스트 7A/7B의 혼합물을 45 % (w/v) D-글루코스 용액과 교차하여 사용하면 단백질의 생산량을 증가시킬 수 있음이 확인되었다.
실시예 4. 배양액에 공급되는 상표명 하이클론 셀부스트 7A/7B의 혼합물 및 45 % (w/v) D-글루코스 용액의 교차 투입 주기에 따른 생산량 변화
배양액에 공급되는 상표명 하이클론 셀부스트 7A/7B의 혼합물 및 45 % (w/v) D-글루코스 용액의 교차 투입 주기별 생산량 차이를 확인하기 위하여 표 5에 기재된 투입 조건을 제외하고는 제조예 2 및 실시예 3에 기재된 방식으로 목적 단백질 발현 세포주를 배양하였다.
상표명 하이클론 셀부스트 7A/7B의 혼합물 및 45 % (w/v) D-글루코스 용액의 교차 투입 주기
배치 번호 배양기간 (Day)
0, 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15
ICR322035 　 C D C D C D C D C D C D C 회수
ICR322036 　 C D D C D D C D D C D D C 회수
ICR322037 　 C D D D C D D D C D D D C 회수
C: 상표명 하이클론 셀부스트 7A/7B의 혼합물
D: 45 % (w/v) D-글루코스 용액
한편, 배양 0일차, 10일차 및 15일차가 되는 시점에 상기 배치 ICR322035 내지 ICR 322037의 배양액의 일부를 각 시점별로 2회씩 회수하고, 단백질 생산량 증가를 확인하기 위한 지표의 하나인 배양액 내 세포 생존률 및 생존 세포 밀도를 측정하고, 각 시점별로 측정된 값의 평균을 내었다. 배양 2일차부터 상표명 하이클론 셀부스트 7A/7B의 혼합물만을 투여한 상기 실시예 1의 배치 ICR322019(대조군) 대비, 모든 실험군(즉, 배치 ICR322035 내지 ICR322037)에서 세포 생존률 및 VCD가 현저하게 높은 것으로 나타났다(도 7 참조).
또한, 배양 10일차, 11일차, 12일차, 13일차, 14일차 및 15일차에 상기 배치 ICR322035 내지 ICR 322037에서 배양액을 회수한 뒤, 각 시점별로 발현되는 목적단백질의 생산량을 확인하기 위하여 SDS-PAGE 및 웨스턴 블랏을 실시하였다. 배양 10일차, 11일차, 12일차, 13일차, 14일차 및 15일차에 모든 실험군 (즉, 배치 ICR322035 내지 ICR322037, 도 8의 35 내지 37)에서 SDS-PAGE로 측정된 목적 단백질의 발현량이 높은 것으로 나타났으나, 격일로 상표명 하이클론 셀부스트 7A/7B의 혼합물 및 45 % (w/v) D-글루코스 용액을 투여한 ICR322035 배치에서의 목적 단백질 발현량이 가장 높은 것으로 나타났다(도 8 참조). 또한, 배양 10일차, 11일차, 12일차, 13일차, 14일차 및 15일차에 모든 실험군 (즉, 배치 ICR322035 내지 ICR322037, 도 9의 35 내지 37)에서 웨스턴 블랏으로 측정된 목적 단백질의 발현량이 높은 것으로 나타났으나, 격일로 상표명 하이클론 셀부스트 7A/7B의 혼합물 및 45 % (w/v) D-글루코스 용액을 투여한 ICR322035 배치에서의 목적 단백질 발현량이 가장 높은 것으로 나타났다(도 9 참조).
Component A의 회수 및 정제 공정 최적화
실시예 1. 원심분리 공급유속 (feed flow) 차이에 따른 목적 단백질의 회수량 및 불순물의 변화
다량의 목적 단백질을 신속하게 생산하기 위하여 대규모 바이오리액터를 사용하거나 또는 배양액 부피를 증가시킬 수 있으나, 소규모 바이오리액터 또는 적은 부피로 배양하는 경우보다 배양액을 회수하는 과정에서 배양액의 원심분리기로의 투입시간 및 원심분리기 내 대기 시간이 증가하기 때문에 생산기간이 증가하는 단점이 존재하였다.
이에, 단백질의 대규모 생산에 사용되는 바이오리액터 (2000L)에서 1400L의 배지를 채워 용존산소량 및 pH 등의 배양 조건을 칼리브레이션한 뒤 1600L의 배지로 목적 단백질을 발현하는 세포의 배양을 개시하고 목적 단백질의 생산을 위한 배양 첨가물들을 배양 과정에서 첨가함으로써 배양 10일차 배양부피가 2000 L의 배양 부피가 되도록 배양하였다. 산업용 연속 원심분리기 (2000L 분리가능)를 사용하되, 배양액이 원심분리기로 공급되는 공급 유속을 증가시킴으로써 원심분리에 소요되는 시간을 단축하면 원심분리 후 회수되는 목적 단백질의 수율에 영향을 미치지 않으면서도 불순물을 감소시킬 수 있는지 여부를 확인하기 위하여 상층액 내 목적 단백질의 농도, 수율, 상층액 내 불순물 및 상층액의 탁도를 측정하였다.
상층액 내 전체 단백질 농도는 써모피셔 사이언티픽사 (ThermoFisher Scientific)에서 제공하는 피어스 (상표명) BCA 단백질 분석 키트 (카탈로그 번호 23225)를 이용한 BCA 분석법을 통해 측정되었다. 또한, 상층액 내 목적 단백질의 농도는 HIC-HPLC를 이용하여 측정하였다.
상층액 내 불순물 함량은 상층액 내 숙주세포 단백질 및 숙주세포 유래 DNA 를 측정하여 확인하였다. 이때, 상층액 내 숙주세포 단백질 농도는 시그너스 테크놀로지사 (Cygnus Technologies)의 중국 햄스터 난소 세포 (CHO) 숙주세포 단백질(Host Cell Protein, HCP) ELISA 키트 (카탈로그 번호: F550-1)를 이용한 ELISA 분석을 통해 측정하였다. 나아가, 상층액 내 숙주세포 유래 DNA (Host Cell Derived DNA, HCD) 농도는 써모피셔 사이언티픽사의 어플라이드 바이오시스템 (상표명 Applied Biosystems) resDNASEQ 정량 CHO DNA 키트 (카탈로그 번호: 4402085)를 이용한 RT-PCR을 통해 분석하였다. 또한, 상층액의 탁도는 탁도계 (Naphelometer)를 이용하여 측정하였다.
배양액이 원심분리기로 공급되는 공급 유속 변화에 따른 상층액 내 전체 단백질 농도, 목적 단백질 농도, 목적 단백질의 수율 및 상층액 내 불순물과 상층액의 탁도 측정 결과를 표 6에 나타내었다.
공급 유속 차이에 따른 상층액 내 목적 단백질 농도, 불순물 및 탁도
공급 유속(L/h) 상층액 내 전체 단백질 농도 (μg/ml) 목적 단백질
농도 (μg/ml)		 숙주세포 단백질 (HCP) (ng/ml) 숙주 세포 유래 DNA(HCD) (ng/ml) 탁도(NTU)
200 5639.778 1585 369140 26473.4 56.6
300 5794.096 1568.1 359130 27045.6 73.8
400 6081.003 1598.6 389700 32786 154
원심분리시 공급유속이 200L/h 인 경우 2000L의 배양액의 원심분리시간이 10시간인데 반해, 공급유속이 300L/h로 증가될 경우 2000L 배양액을 원심분리하는데 약 6.7 시간이 소요되었다. 또한, 공급유속이 400L/h인 경우 2000L 배양액을 원심분리하는데 소요되는 시간이 약 5시간으로 단축되었다.
한편, 원심분리시 공급유속이 200L/h에서 300L/h 또는 400L/h로 증가하더라도 회수되는 상층액 내 목적 단백질의 함량은 크게 달라지지 않는 것으로 나타났다. 또한, 원심분리시 공급유속이 200L/h에서 300L/h로 증가하더라도 상층액 내 불순물인 숙주세포 단백질 및 숙주 세포 유래 DNA가 크게 증가하거나 감소하지 않는 것으로 나타났다. 비록, 원심분리시 공급유속이 200 L/h에서 300L/h로 증가되면, 상층액 내 탁도가 증가하였으나, 이러한 탁도 증가는 원심 분리로 얻은 상층액에 심층필터 (Depth filter)를 적용함으로써 개선되는 것으로 확인되었다.
나아가, 원심분리시 공급유속이 200L/h에서 400L/h로 증가하면 숙주세포 단백질 및 숙주세포 유래 DNA가 증가하는 경향을 보였으나, 원심 분리 이후 심층필터를 사용함으로써 숙주세포 단백질 및 숙주세포 유래 DNA가 상당수 제거되었고, 탁도가 현저하게 낮아지는 것으로 확인되었다.
한편, 원심분리시 공급유속이 200L/h보다 낮으면 원심분리시간이 10시간 이상으로 증가하여 생산기간이 지연되는 문제가 발생할 수 밖에 없다. 또한, 원심분리시 공급유속이 400L/h보다 높은 경우 공급유속이 200L/h인 경우보다 원심분리 시간이 절반 미만으로 단축될 수 있으나, 상층액 내 불순물 및 탁도가 증가함으로써 불순물 제거를 위하여 사용하여야 하는 필터의 수가 급격히 늘어나는 문제가 발생하였다.
따라서, 목적 단백질을 발현하는 세포주의 배양액을 원심분리할 때 공급유속이 200L/h 내지 400L/h이면, 상층액 내 목적 단백질 농도에 영향을 주지 않으면서도 생산기간 단축 및 생산비용 절감효과를 달성하는 것으로 확인되었다.
실시예 2. 원심분리 공급유속 (feed flow) 차이에 따른 탁도 변화
2000L 바이오 리액터에서 1600 L 배지로 목적 단백질을 발현하는 세포의 배양을 개시하고, 목적 단백질의 생산을 위한 배양 첨가물들을 배양 과정에서 첨가함으로써 배양 10일차 배양부피가 2000 L가 되도록 배양한뒤, 산업용 연속 원심분리기를 사용하여 상층액을 회수하였다. 공급 유속이 200 L/h, 250 L/h 또는 300 L/h이고 배출간격이 각각 252초, 201초 또는 168초로 원심분리하여 얻은 상층액의 탁도를 탁도계를 이용하여 측정하였고, 측정 결과를 표 7에 기재하였다.
공급 유속 차이에 따른 상층액 내 탁도 변화
공급 유속(L/h) 원심분리시 배출간격 탁도 (NTU)
200 252초 134
250 201초 135
300 168초 166
원심분리시 공급유속이 200 L/h에서 250L/h로 증가되더라도, 상층액 내 탁도는 거의 변하지 않았으며, 공급유속이 200 L/h에서 300L/h로 증가하더라도 탁도의 변화폭은 약 30 수준이어서 실시예 1에서 공급유속이 200 L/h에서 300L/h로 증가되었을 때 나타난 변화폭(약 20)과 크게 차이 나지 않는 것으로 확인되었다.
비록, 원심분리시 공급유속이 400 L/h인 경우의 탁도를 측정하지는 않았으나, 상기 200 L/h 및 300 L/h에서의 탁도를 고려할 때, 상기 실시예 1에서 측정된 것과 유사한 탁도를 보일 것으로 예상되었다. 따라서, 단백질을 발현하는 세포의 상업적 배양시 배양부피가 증가하더라도 200 L/h 내지 400 L/h의 공급유속을 사용하면 생산기간을 단축하면서도 불순물이 적어 탁도가 낮은 상층액을 얻을 수 있는 것으로 확인되었다.
실시예 3. 원심분리 상층액의 여과시 사용되는 필터의 사용에 따른 목적 단백질의 정제 및 불순물의 제거
상기 실시예 1에서 수득한 원심분리 상층액에 필터를 적용하여 여과하였을 때 여과액 내 목적 단백질의 함량 변화 및 불순물 감소 효과 여부를 확인하였다.
상기 실시예 1에서 수득한 원심분리 상층액에 A1HC 심층필터, 공극직경이 0.5 ㎛인 필터 및 0.2 ㎛인 필터의 조합, 공극직경이 0.45 ㎛인 필터 또는 공극직경이 0.45 ㎛인 필터를 이용하여 여과하였을 때, 여과액 내 목적 단백질의 함량 변화 및 불순물 제거 효과 여부를 웨스턴 블랏을 통해 측정하였다.
원심분리 상층액에 필터를 적용하였을 때 여과액 내 목적 단백질 함량은 필터를 적용하지 않은 원심분리 상층액에서의 목적 단백질 함량과 유사하여 목적 단백질 단량체 및 목적 단백질 이량체 밴드 크기가 유사함으로써 목적 단백질 함량이 유지되는 것으로 나타났다 (도 10 및 도 11 참조).
한편, 원심분리 상층액에 필터를 적용한 경우 불순물이 감소하여 목적 단백질 단량체 및 목적 단백질 이량체 밴드가 필터를 적용하지 않은 원심분리 상층액에서 관찰되는 목적 단백질 단량체 및 목적 단백질 이량체 밴드보다 뚜렷하였고, 그 외의 밴드 (즉, 목적 단백질이 아닌 다른 단백질인 불순물)의 선명도가 줄어듦으로써 상대적으로 흐릿하게 관찰되는 것으로 나타났다 (도 10 및 도 11 참조).
실시예 4. 배양액에 처리되는 뉴클레아제(nuclease) 농도, 처리 시간 및 배양액의 Mg 2+ 이온의 농도에 따른 숙주 세포 (host cell) DNA 제거율 변화 확인
상기 제조예 2의 뉴클레아제 처리 단계에서, 세포주에서 유래한 불순물인 숙주세포 DNA를 효과적으로 제거하기 위한 최적화 공정 조건을 도출하기 위하여, 하기의 실험을 수행하였다.
보다 구체적으로, 불순물인 DNA 제거에 유의미하게 영향을 미치는 인자로서 확인된 (1) 뉴클레아제 벤조네이즈 농도(unit/ml), (2) 뉴클레아제 처리 시간(hr), 및 (3) 배양액 내 Mg2+ 이온의 농도(mM) 총 3가지 인자를 변수로 설정하여, JMP14 소프트웨어를 사용한 실험계획법(Design of Experiments, DoE) 다변량(multivariate) 실험을 통해, DNA 제거율을 최대로 높일 수 있는 조건을 탐색하였다. 상기 DoE 플랫폼을 사용하면 조사자가 각 파라미터를 개별적으로 변경한 다음 전체 최적화된 결과에 대해 각각 최적화된 파라미터를 고려하는 대신, 여러 파라미터를 동시에 변경할 수 있다. 파라미터 간의 2차 효과가 결과에 영향을 미칠 수 있는 경우, 모든 후보 파라미터를 동시에 변경하는 DoE 플랫폼을 사용하면 보다 효율적이고 정확한 결과를 얻을 수 있다. DoE 플랫폼을 사용하는 실험은 또한 기존 실험 접근 방식보다 실행 횟수가 적고 경제적이다. 문헌[Kauffman et al., Optimization of Lipid Nanoparticle Formulations for mRNA Delivery in Vivo with Fractional Factorial and Definitive Screening Designs, NanoLetters 15:7300-7306 (2015)] 및 DoE 플랫폼에 대한 이론적인 논의를 위한 보충 자료를 참조한다.
(1) 뉴클레아제 (벤조네이즈) 농도(unit/ml)를 1 내지 20 unit/ml, (2) 뉴클레아제 처리 시간(hr)을 1 내지 6 hr, 및 (3) 배양액 내 Mg2+ 이온의 농도(mM)를 0 내지 2 mM 범위로 설정하였을 때, DoE 프로그램(JMP, Version: 14.0)으로부터 도출되는 augment design 시험설계 결과를 도 12에 나타내었다.
도 12에 나타낸 바와 같이, DNA 제거율을 최대로 높이는 조건은 벤조네이즈 농도 13.5 unit/mL, 벤조네이즈 반응시간 5.5 시간, 및 Mg2+ 농도 2 mM인 것으로 나타났다. 아울러, 상기 조건으로 JMP 프로그램상에서 100,000회의 monte-carlo 시뮬레이션 수행 시, 80% 이상의 DNA 제거율을 타겟 범위 (target range)로 설정할 경우, 해당 범위를 벗어날 확률은 0.007%로 매우 안정적인 결과도 확인되었다. 이로부터, DNA 제거율 측면에서는 벤조네이즈 농도 13.5 unit/mL, 벤조네이즈 반응시간 5.5시간 및 Mg2+ 농도 2 mM가 최적의 조건임을 확인하였다.
그러나, 벤조네이즈 농도는 백신 항원 생산비용 증가에 직접적인 영향을 주며, 상기 벤조네이즈를 13.5 unit/mL 농도로 사용하면 실제로 상업생산이 불가능할 정도로 큰 비용이 소요되는 문제가 있다.
실시예 5. 상업생산 적용시 발생할 비용을 감소시키는 조건 확인
상기 실시예 4에서 도출한 DNA 제거율을 최대로 높이는 조건에서 더 나아가, 생성 모델과 공정 비용 등 상업생산 적용시 발생할 비용을 추가적으로 고려하여, 상업생산 적용이 가능할 정도로 경제적이면서도 우수한 DNA 제거효율이 달성되는 조건을 도출하고자 하였다.
보다 구체적으로, DoE 실험 설계 시 벤조네이즈 반응 시간을 2 시간 또는 4시간인 그룹으로 나누되, 각 그룹별로 벤조네이즈 최종 농도를 각각 1 unit/mL, 2 unit/mL 또는 4 unit/mL로 조절하여 뉴클레아제 처리 전 배양액 대비 처리 후 배양액에서의 DNA의 감소율을 측정하였다. 이때, 벤조네이즈 처리 시간과 농도를 제외한 다른 공정 조건들, 특히 Mg2+ 농도는 2 mM로 동일하게 고정하였다.
그 결과를 하기 표 8에 나타내었다.
Sample DNA 농도(ng/mL) DNA 감소율(-%)
벤조네이즈 처리시간 벤조네이즈 농도
배양여과액 18382 　
2 시간 1 unit/mL 10641.5 42.1
2 unit/mL 9938.7 45.9
4 unit/mL 5264.6 71.4
4 시간 1 unit/mL 6462.3 64.8
2 unit/mL 3542.1 80.7
4 unit/mL 1360.9 92.6
DNA 감소율(-%)이 최소 80% 이상이 달성되어야만 상업생산 적용이 가능하며, 상기 표 8의 벤조네이즈 4시간 처리군 중에서, 벤조네이즈 2 또는 4 unit/mL 농도에서 DNA 감소율(-%) 80% 이상이 달성됨을 알 수 있다.
다음으로, 상기 DNA 감소율(-%)이 80% 이상 달성되는 벤조네이즈 2 또는 4 unit/mL 농도 조건과, 실시예 1에서 확인한 13.5 unit/mL 농도 조건으로 상업생산 적용시, 벤조네이즈 처리공정에서 발생할 비용을 비교하였다.
제조예 2에서 사용한 벤조네이즈 제품 정보는 하기 표 9와 같다.
unit unit/μL mL 제품금액 (만원) 금액 (만원/mL) 배양액 (unit/L) 처리량 (μL/L)
5,000,000 250 20 1,800 90 2,000 8
다음으로, 1800L 배양액에서 벤조네이즈 농도를 조절할 때 처리해야하는 벤조네이즈 처리량과 금액을 하기 표 10에 나타내었다.
최종 벤조네이즈 조절 농도 (unit/ml) 벤조네이즈 처리량 (ml) 총액(만원)
2 14.4 1,296
4 28.8 2,592
13.5 97.2 8,748
1800L 배양액에서 최종 벤조네이즈 농도를 2 unit/ml로 조절하기 위해서는, 250 unit/μl 벤조네이즈 제품을 14.4 ml 처리해야 하며, 벤조네이즈 ml당 90만원 인걸 고려하면, 벤조네이즈 농도 조절에 따른 금액이 약 1,296 만원이 도출된다. 동일한 과정으로 최종 벤조네이즈 농도를 4 또는 13.5 unit/ml로 조절할 경우 발생 비용도 도출 가능하다.
벤조네이즈 농도를 2 unit/mL로 조절하여 벤조네이즈 처리공정을 수행할 경우, 4 unit/mL로 조절할 경우 대비 약 1296 만원 절감된 비용으로 항원을 생산할 수 있고, 13.5 unit/mL로 조절할 경우 대비 약 7,452 만원 절감된 비용으로 항원을 생산할 수 있음을 알 수 있다.
생산하고자 하는 항원 양이 증가하면 증가할수록, 그리고 공정 사이클을 반복하면 반복할수록 비용적 격차가 매우 커질 것임을 알 수 있다.
종합하면, 벤조네이즈 농도 2 unit/mL, 벤조네이즈 반응시간 4 시간 및 Mg2+ 이온의 농도 2 mM 조건으로 벤조네이즈 처리공정을 수행할 경우, 상업생산 적용이 가능할 정도로 경제적이면서도 우수한 DNA 제거효율이 달성되었다.
Component B 발현 세포 배양 조건 최적화
실시예 1. Growth phase 배지의 글리세롤 함량 최적화
제조예 4의 Growth phase에서 배지에 글리세롤을 첨가하여 균주의 생장 및 단백질 발현에 미치는 영향을 확인하였다.
글리세롤 0% (미 첨가), 2% 및 4% (v/v) 농도로 첨가하여, 농도에 따른 세포 성장을 도 4 및 표 11에 나타냈으며, 회수 후 세포 무게를 확인하였다. 실험결과 글리세롤 추가 시 최대 세포 성장이 개선되는 것을 확인하였다.
또한, 시험 계획법 (Design of experiment, DoE)에 따라 글리세롤 농도가 단백질의 발현에 미치는 영향을 확인하였으며, 표 11에 나타내었다.
실험결과 글리세롤 2% 첨가 시 단백질 발현 량이 최대치를 보였으며, 글리세롤 미 첨가 군 대비 약 25% 발현량 증대를 확인하였다.
분류 글리세롤 농도 (%) 최대 세포 성장 (OD600)
시험 군 1 0 23
시험 군 2 2 56
시험 군 3 4 50
실시예 2. Induction phase 조건 최적화
Induction phase에서 IPTG 첨가량(0, 0.5mM, 1mM, 2mM: 도 15)을 조절하며 최적의 조건을 확인하였다.
시료 정보 Relative
Expression (%) 		Main fermentation Result
Time (h) Harvest OD
IPTG 농도 0mM 100.0 18.5 53
0.5mM 104.6 18.5 51
1mM 107.7 18.5 50
2mM 104.8 18.5 50
실험 결과 IPTG 첨가군 모두 단백질 발현이 증가하였으며, 특히 0.5mM 내지 1mM 첨가 시 최적의 발현 조건임을 확인하였다(도 15).
또한, 시험계획법에 따라 유도기 (induction phase) 돌입 시 세포 성장 정도 (대수기 초반, 대수기 중반, 대수기 후반, 도 4에서는 각 -1, 0, 1로 표기 됨) 및 유도기 지속 시간에 따른 목적 단백질의 상대적 발현 량을 도 16에 나타내었다.
시험결과, 대수기 후반 유도기에 진입하는 것이 대수기 초반 유도기 진입보다 약 25%의 목적 단백질 증가를 확인할 수 있었다. 유도기 지속시간의 경우, 10시간의 유도기가 최대의 목적 단백질 발현을 보이는 것을 확인할 수 있었다.
Component B의 회수 및 정제 공정 최적화
실시예 1. 세포 파쇄 및 단백질 분리 공정 최적화
단백질 수율을 최적화하기 위해 세포 현탁액 부피 및 파쇄 압력과 벤조네이즈 처리 시의 파라미터를 변경하였다.
JMP® 실험 설계(DOE: Design of Experiment) 플랫폼을 사용하여, 실험을 설계하였다. DOE 플랫폼을 사용하면 조사자가 각 파라미터를 개별적으로 변경한 다음 전체 최적화된 결과에 대해 각각 최적화된 파라미터를 고려하는 대신, 여러 파라미터를 동시에 변경할 수 있다. 파라미터간의 2차 효과가 결과에 영향을 미칠 수 있는 경우, 모든 후보 파라미터를 동시에 변경하는 DOE 플랫폼을 사용하면 보다 효율적이고 정확한 결과를 얻을 수 있다. DOE 플랫폼을 사용하는 실험은 또한 기존 실험 접근 방식보다 실행 횟수가 적고 경제적이다. 문헌[Kauffman et al., Optimization of Lipid Nanoparticle Formulations for mRNA Delivery in Vivo with Fractional Factorial and Definitive Screening Designs, NanoLetters 15:7300-7306 (2015)] 및 DOE 플랫폼에 대한 이론적인 논의를 위한 보충 자료를 참조한다.
세포 1g당 세포 현탁액의 부피를 5 내지 15 ml로, 파쇄 압력은 13000 내지 21000 psi 범위로 설정하여, 각 파라미터에 따른 단백질 회수를 확인하여 도 17에 나타내었다.
두 파라미터를 종합한 실험 결과, 세포 현탁액은 약 8ml 내지 14ml 범위, 구체적으로는 약 10ml 부피에서, 파쇄 압력은 약 14000 내지 21000 psi, 구체적으로는 약 17000 psi에서 단백질 수율이 가장 높은 것을 확인하였다.
또한 JMP® 실험 설계(DOE: Design of Experiment) 플랫폼을 사용하여 벤조네이즈 처리 시의 조건을 0-10Unit/ml, 배양시간을 0-300min, pH 7-9 범위에서 변경해보고 불순물인 숙주세포 DNA 제거율(host cell DNA elimination rate; HCD), 및 수율(Process yield)을 종합하여 최적 조건을 확인하였다(도 18).
실험 결과, 약 5 Unit/mL, 3hr, pH 8.0 조건이 불순물 제거율이 가장 우수한 최적의 조건임을 확인하였다.
또한 가용화 공정의 가용화 시간 및 완충액 부피 파라미터가 단백질 회수 및 불순물에 주는 영향을 파악하였으며(도 19), 가용화 완충액의 부피는 10mL 에서 최적임을 확인하였다.
실시예 2. 1차 크로마토그래피 조건 최적화
실시예 2.1. 1차 크로마토그래피 수행 여부에 따른 불순물 함량 확인
네거티브 모드 (negative mode) 로 수행하는 1차 크로마토그래피의 수행 여부에 따른 불순물 수준 변화를 확인하였다. 네거티브 모드 크로마토그래피를 수행하지 않은 경우 Group 1, 수행한 경우 Group 2로 표시하였다. 전체 정제 조건은 다음과 같다.
Group Chromatography application Product quality
Negative mode Positive mode Endotoxin content (EU/mg of protein) Host cell DNA content (ng/mg of protein) Productivity (mg/L of fluid)
Group 1 X O 11,924 2.9 62
Group 2 O O 517 1.6 89
실험 결과 단백질 수득량 및 불순물의 양은 상기 표 13에 표시한 바와 같았으며, 이로부터 네거티브 모드 (negative mode) 로 수행되는 1차 크로마토그래피 공정의 추가로 불순물인 엔도톡신, 핵산의 함량이 낮아지는 것을 확인하였다.
실시예 2.2. 1차 크로마토그래피 수행 조건의 최적화
다음으로 시험계획법 (DoE)을 수행하여 1차 크로마토그래피 수행 시 단위 수지에 로드 되는 시료의 양 Loading ratio, Linear velocity 및 시료의 순환 부피 Circulation time(CV)을 조정하여 불순물 제거율을 확인하였다(도 20). 실험 결과 수지 부피의 약 10배의 통과액을 다시 loading하는 조건인, 10CV에서 수율이 높아지는 것을 확인하였다.
실시예 3. 2차 크로마토그래피 조건 최적화
실시예 3.1. 2차 크로마토그래피 완충액의 세제 포함 여부에 따른 정제 수율 확인
2차 크로마토그래피에서 사용되는 평형, 세척 및 용출 완충액에 세제 포함 유무에 따른 정제 수율을 확인하였다. 완충액 내 다른 구성은 제조예에 기재한 바와 같다.
Group Test condition Product quality
완충액 내 Triton 농도 (%) Endotoxin content (EU/mg of protein) Host cell DNA content (ng/mg of protein) Productivity (mg/L of fluid)
Group 1 0 343 1.7 48
Group 2 0.1 662 11.7 212
실험 결과는 상기 표 14에 나타낸 바와 같다.
이를 통해 2차 크로마토그래피에서 세제를 0.1% 함량으로 사용하는 경우, 세제를 포함하지 않는 경우에 비해 단백질 생산성이 증대되는 것을 확인하였다.
실시예 3.2. 2차 크로마토그래피 세척 완충액의 염 함량 조절
2차 크로마토그래피 2차 세척 완충액(washing buffer)의 조성에서 NaCl 함량을 변경하며 불순물의 함량을 최소화하며 수율 감소를 최소화하는 조성을 확인하였다. 완충액 내 다른 구성은 제조예에 기재한 바와 같다.
실험 결과 단백질 수율 및 불순물 함량은 다음 표 15에 나타낸 바와 같다.
Group Test condition Product quality
NaCl (mM) in washing buffer Endotoxin content (EU/mg of protein) Host cell DNA content (ng/mg of protein) Productivity (mg/L of fluid)
Group 1 0 25,100 6,466 127
Group 2 200 11,924 2.9 62
Group 3 250 11,099 17.2 10
이를 통해 2차 크로마토그래피의 2차 세척 완충액(washing buffer)에서 NaCl의 최적 함량은 약 200mM 임을 확인하였다.
실시예 4. UF/DF 조건 최적화
한외여과/정용여과 공정에서의 완충액 조성을 변경하며 최적의 수율을 나타내는 buffer를 확인하고자 하였다.
실시예 4.1. 완충액의 최적 조성 확인
다음 표 16의 4가지 조성을 사용해본 결과, Group 4의 조성(50mM Tris, 500mM NaCl, 0.75% CHAPS (pH 7.5)) 가장 수율이 우수한 것을 확인하였다.
Group 정용여과 완충액 조성 공정 수율 (%) 정용여과 중 aggregation 발생여부
1 50mM Tris + 5% sucrose + 100mM Arginine + 150mM NaCl 100 O
2 50mM Tris + 100mM Arginine + 150mM NaCl 120 O
3 50mM Tris + 5% sucrose + 500mM Arginine + 150mM NaCl 136 O
4 50mM Tris + 500mM NaCl + 0.75% CHAPS 137 X
구체적으로, 상기 Group 1 내지 3의 경우 보관 시간 경과에 따라 침전물이 생성되었으나, Group 4는 침전물 없이 안정적으로 유지되는 것을 확인하였다.
실시예 4.2. 완충액에 포함되는 세제 종류에 따른 단백질 수율 확인
상기 실험을 통해 선발한 Group 4의 조성에서 세제의 종류를 PS80, Triton으로 변경하여 수율을 확인하였다.
Group Composition Protein content reduction rate (%)
1 50mM Tris, 500mM NaCl 21.6
2 50mM Tris, 500mM NaCl, 0.75% CHAPS 1.88
3 50mM Tris, 500mM NaCl, 0.05% PS80 8.81
4 50mM Tris, 500mM NaCl, 0.1% Triton 22.1
실험 결과, Group 2 즉 CHAPS를 사용하는 경우 단백질 함량 감소율이 가장 낮은 것을 확인하였다.
이를 통해 50mM Tris, 500mM NaCl, 0.75% CHAPS가 완충액의 최적 조성임을 확인하였다.
Component A 및 Component B 조립 공정 최적화
제조예 6의 조립(Asssembly) 반응을 최적화하기 위해 최적의 혼합 비율 및 완충액 조성을 변경해 보았다.
실시예 1. 최적의 혼합 비율 설정
상온, 2시간, 80 rpm의 교반속도로 Component A 원액 및 Component B 원액을 혼합하는 반응을 수행하였다. 반응이 완료되면 반응액은 0.2 μm 필터로 여과하였다.
한편 최적의 혼합 몰 비율을 확인하기 위해 Component A와 Component B의 몰 농도 비율을 변화시키며 입자 크기 및 다분산 지수를 측정하여 결과를 하기 표와 도 21에 나타내었다.
Group Reaction ratio
(A : B) 		Particle size
(d,nm) 		Polydipersity Index (PDI)
1 1:1.1 54.6 0.210
2 1:2 68.9 0.310
3 1:3 84.3 0.432
Group Reaction ratio
(A : B) 		Particle size
(d,nm) 		Polydipersity Index (PDI)
1 1.5:1 72.7 0.496
2 1.1:1 56.8 0.275
3 1:1.5 69.4 0.306
상기 표 18 및 표 19에 나타낸 바와 같이, Component A와 Component B의 몰 농도 비율을 변화시킴에 따라 입자 크기 및 다분산 지수도 변화하는 것을 알 수 있다. 이로부터 백신 항원 용도로 가장 바람직한 입자 크기와 PDI 값이 확보되는 1:1.1 몰 농도 비율이 최적의 혼합 몰 비율임을 확인하였다.
실시예 2. 최적의 혼합 시간 설정
상기 확인한 최적의 몰 농도 비율로 Component A와 Component B의 자가조립을 유도하되, 반응 시간만 다르게 설정하여 최종 제조되는 입자 크기와 수율을 평가하였고, 그 결과를 하기 표와 도 22에 나타내었다.
Group Reaction time (hr) Particle size
(nm) 		Process yield (%)
1 0.5 60.2 28
2 1 67.8 26
3 2 53.4 49
4 4 58.3 47
상기 표 20에 나타낸 바와 같이, Component A와 Component B의 자가조립 유도 반응시간을 변화시킴에 따라 입자 크기 및 수율이 변화하는 것을 알 수 있다. 이로부터 백신 항원 용도로 가장 바람직한 입자 크기가 확보되며 동시에 수율도 가장 우수한 반응 시간은 2시간임을 확인하였다.
실시예 3. 완충액 조성 최적화
Component A 및 B 원액을 혼합함에 따라, 자가조립이 유도되는 완충액은 전술한 제조예에서 완충액교환을 실시할 때 사용한 50 mM 트리스 완충액(500 mM NaCl, 0.75 w/v% CHAPS 포함)에 해당한다. 해당 완충액에 추가적인 안정제로 polysorbate-80 (PS80)를 첨가하였는데, 이때 자가조립이 유도되는 완충액 내 안정제의 최적의 농도를 도출하고자 하였다. polysorbate-80 (PS80)를 미첨가하거나 함량을 0.05 v/v% 내지 0.01 v/v%로 변경하면서 수율 및 입자 크기, 다분산 지수를 확인하여 하기 표에 나타내었다.
Test group PS80 concentration (v/v %) Process yield
(%) 		Particle size (DLS)
Z-average PDI
Group 1 0.050 67.3 82.57 0.556
Group 2 0.025 62.0 41.92 0.263
Group 3 0.010 61.1 40.24 0.270
Group 4 0.000 56.6 62.09 0.635
상기 표에 나타낸 바와 같이, PS80 미포함군인 Group 4는 수율이 비교적 낮고 PDI 값이 높으며, PS80 함량이 0.05 v/v%인 Group 1의 경우 입자 크기 평균값이 너무 커서 백신의 항원으로 사용하기에 적합하지 않음을 확인하였다. 또한, PS80을 자가조립 유도 완충액에 미포함시키거나 0.05 v/v% 농도로 포함시킨 경우 다양한 size의 intensity와 mass peak가 관찰되었다.
반면, 자가조립 유도 완충액에 PS80을 0.025 v/v% 또는 0.010 v/v% 농도만큼 포함시킨 Group 2, 3의 경우 scale-up 공정을 고려할 때 60% 이상 높은 수율을 달성함과 동시에, Z-average 및 PDI 값이 백신의 항원 용도로 사용하기에 바람직한 범위로 확보됨을 확인하였다. 상기 다분산성 지수 PDI란 중량평균 분자량(Mw)을 수평균 분자량(Mn)으로 나눈값(Mw/Mn)을 의미하며, 다분산성 지수가 높다는 것은 제조된 입자의 크기, 모양이나 질량 분포가 일정하지 않아(non-uniform) 품질이 균일하지 않으며 가공성이 저하된다는 의미이다.
이로부터, 자가조립 유도 완충액에 안정제의 바람직한 농도 범위는 0.010-0.025 v/v% 범위임을 확인하였다. 최종적으로는 공정 중 유실 가능성을 고려하여 0.025% v/v%가 자가조립 유도 완충액 내 가장 바람직한 안정제 농도인 것으로 설정하였다.
다량체성 단백질 조립체 Nanoparticle의 정제 공정 최적화
제조예 6에서 UF/DF 공정을 진행한 결과 assemble 반응이 진행되지 않은 Component A가 제거되는 것을 확인하였다(도 23). 한외여과 및 정용여과의 최적 조건을 확인하기 위해 (i) 정용여과 시 초기 단백질의 농도, (ii) 멤브레인의 분획분자량(MWCO), (iii) 여과막 면적당 단백질 부하(protein/membrane load ratio) 를 변경하여 수율 및 품질을 확인하였다.
실시예 1. UF/DF (Ultrafiltration/diafiltration) 공정
실시예 1.1. 정용여과(Diafiltration) 단백질 농도 최적화
정용여과 시 단백질의 농도를 최적화 하기 위해 1 내지 6 mg/mL의 농도로 수행하는 경우 수율과 품질을 확인하였다 (도 24).
Group Test condition Result
Target UFDF conc. (mg/mL) Yield (%) z average (d.nm) PDI
1 1 62.4 61.51 0.23
2 2 64.1 59.65 0.21
3 4 67.7 75.66 0.35
4 6 46.5 95.77 0.50
실험 결과 약 1 내지 2mg/mL 농도에서는 수율 및 품질이 적정수준으로 유지되었으나, 4mg/mL 이상의 농도에서는 z average (d, nm)이 70nm 이상으로 증가하고 다분산 지수(PDI)도 증가하여 품질의 저하가 나타나는 것을 확인하였다.이를 통해 정용여과 시 최적 단백질 농도를 4mg/mL 미만으로 설정하였다.
실시예 1.2. UF/DF 공정의 멤브레인 분획분자량(MWCO) 최적화
UF/DF 공정에서 멤브레인 분획분자량(MWCO)을 변경하여 수율을 확인하였다(도 25).
MWCO Yield (%) DLS
Z-average PDI
300 kDa 47.59 38.68 0.187
500 kDa 3.85 101.5 0.662
실험 결과 멤브레인 분획분자량이 500 kDa인 경우 수율이 크게 하락하고 품질 역시 저하가 일어나는 것을 확인하였다. 이를 통해 한외여과 및 정용여과 공정에서 멤브레인 분획분자량의 최적 범위는 약 300kDa 임을 확인하였다.
실시예 1.3. UF/DF 공정의 여과막 면적당 단백질 부하(load) 비율에 따른 수율 및 품질 변화 확인
UF/DF 공정에서 여과막 면적당 단백질 부하 비율(protein/membrane load ratio)에 따른 공정 수율 및 품질을 확인하였다(도 26).
Batch Test condition Yield (%) QA
Protein loading (mg/0.1m 2 )
Particle size
(z average, d.nm) 		PDI
NPA210720-01 300 78.2 63.65 0.27
NPA210720-02 750 86.4 67.56 0.24
NPA210720-03 1250 96.3 79.56 0.26
실험 결과 Protein/membrane area load ratio의 증가에 따라 수율이 증가하였으나 1250 mg/0.1m2 이상에서는 다량체성 단백질 조립체의 크기가 증가하는 문제가 있음을 확인하였다. 이를 통해 최적 범위를 300 내지 750 mg/0.1m2 으로 설정하였다.
이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.
<110> SK bioscience Co., Ltd. <120> A method for preparing vaccine for COVID-19 <130> KPA211656-KR-P7 <150> KR 10-2021-0137835 <151> 2021-10-15 <160> 21 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 467 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Component A <400> 1 Met Gly Ile Leu Pro Ser Pro Gly Met Pro Ala Leu Leu Ser Leu Val 1 5 10 15 Ser Leu Leu Ser Val Leu Leu Met Gly Cys Val Ala Glu Thr Gly Thr 20 25 30 Arg Phe Pro Asn Ile Thr Asn Leu Cys Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn 35 40 45 Ala Thr Arg Phe Ala Ser Val Tyr Ala Trp Asn Arg Lys Arg Ile Ser 50 55 60 Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser Val Leu Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser 65 70 75 80 Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val Ser Pro Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys 85 90 95 Phe Thr Asn Val Tyr Ala Asp Ser Phe Val Ile Arg Gly Asp Glu Val 100 105 110 Arg Gln Ile Ala Pro Gly Gln Thr Gly Lys Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr 115 120 125 Lys Leu Pro Asp Asp Phe Thr Gly Cys Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn 130 135 140 Asn Leu Asp Ser Lys Val Gly Gly Asn Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu 145 150 155 160 Phe Arg Lys Ser Asn Leu Lys Pro Phe Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu 165 170 175 Ile Tyr Gln Ala Gly Ser Thr Pro Cys Asn Gly Val Glu Gly Phe Asn 180 185 190 Cys Tyr Phe Pro Leu Gln Ser Tyr Gly Phe Gln Pro Thr Asn Gly Val 195 200 205 Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val Val Val Leu Ser Phe Glu Leu Leu His 210 215 220 Ala Pro Ala Thr Val Cys Gly Pro Lys Lys Ser Thr Gly Gly Ser Gly 225 230 235 240 Gly Ser Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Ser Glu Lys Ala Ala 245 250 255 Lys Ala Glu Glu Ala Ala Arg Lys Met Glu Glu Leu Phe Lys Lys His 260 265 270 Lys Ile Val Ala Val Leu Arg Ala Asn Ser Val Glu Glu Ala Ile Glu 275 280 285 Lys Ala Val Ala Val Phe Ala Gly Gly Val His Leu Ile Glu Ile Thr 290 295 300 Phe Thr Val Pro Asp Ala Asp Thr Val Ile Lys Ala Leu Ser Val Leu 305 310 315 320 Lys Glu Lys Gly Ala Ile Ile Gly Ala Gly Thr Val Thr Ser Val Glu 325 330 335 Gln Ala Arg Lys Ala Val Glu Ser Gly Ala Glu Phe Ile Val Ser Pro 340 345 350 His Leu Asp Glu Glu Ile Ser Gln Phe Ala Lys Glu Lys Gly Val Phe 355 360 365 Tyr Met Pro Gly Val Met Thr Pro Thr Glu Leu Val Lys Ala Met Lys 370 375 380 Leu Gly His Thr Ile Leu Lys Leu Phe Pro Gly Glu Val Val Gly Pro 385 390 395 400 Gln Phe Val Lys Ala Met Lys Gly Pro Phe Pro Asn Val Lys Phe Val 405 410 415 Pro Thr Gly Gly Val Asn Leu Asp Asn Val Ala Glu Trp Phe Lys Ala 420 425 430 Gly Val Leu Ala Val Gly Val Gly Ser Ala Leu Val Lys Gly Thr Pro 435 440 445 Asp Glu Val Arg Glu Lys Ala Lys Ala Phe Val Glu Lys Ile Arg Gly 450 455 460 Ala Thr Glu 465 <210> 2 <211> 1404 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Component A <400> 2 atgggaatcc tgccaagccc tggaatgcca gccctgctgt ccctggtgtc tctgctgagc 60 gtgctgctga tgggatgcgt ggcagagacc ggaacaaggt tccctaacat caccaacctg 120 tgcccattcg gcgaggtgtt taacgccaca cgctttgcct ccgtgtatgc ctggaaccgg 180 aagagaatct ctaattgcgt ggccgactat agcgtgctgt acaatagcgc ctccttctct 240 acctttaagt gctatggcgt gtctcccacc aagctgaacg acctgtgctt cacaaacgtg 300 tacgccgaca gctttgtgat ccggggcgat gaggtgagac agatcgcacc aggacagacc 360 ggcaagatcg cagactacaa ctataagctg cctgacgatt tcacaggctg cgtgatcgcc 420 tggaatagca acaatctgga ttccaaagtg ggcggcaact acaattatct gtacaggctg 480 ttccgcaaga gcaacctgaa gccatttgag cgggacatca gcaccgagat ctaccaggca 540 ggctccacac catgcaacgg agtggagggc ttcaattgtt attttcccct gcagagctac 600 ggcttccagc ctaccaatgg cgtgggctat cagccataca gagtggtggt gctgtccttt 660 gagctgctgc acgcaccagc aaccgtgtgc ggacctaaga agtccacagg cggctctgga 720 ggaagcggat ccggaggatc cggaggatct ggaagcgaga aggcagcaaa ggcagaggag 780 gcagcaagga agatggagga gctgttcaag aagcacaaga tcgtggccgt gctgagagcc 840 aactctgtgg aggaggccat cgagaaggca gtggccgtgt tcgcaggagg agtgcacctg 900 atcgagatca cctttacagt gcccgacgcc gataccgtga tcaaggccct gtccgtgctg 960 aaggagaagg gagcaatcat cggagcagga accgtgacat ctgtggagca ggcaaggaag 1020 gcagtggagt ccggagccga gtttatcgtg tctcctcacc tggatgagga gatctcccag 1080 ttcgccaagg agaagggcgt gttttacatg cctggcgtga tgaccccaac agagctggtg 1140 aaggccatga agctgggcca caccatcctg aagctgttcc caggagaggt ggtgggacca 1200 cagtttgtga aggccatgaa gggcccattc cccaatgtga agtttgtgcc tacaggcggc 1260 gtgaacctgg acaatgtggc agagtggttc aaggcaggcg tgctggcagt gggagtggga 1320 tctgccctgg tgaagggaac cccagatgag gtgagggaaa aggccaaggc ctttgtggag 1380 aagatcaggg gagcaacaga gtga 1404 <210> 3 <211> 10704 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Plasmid (M-2560) <400> 3 tcgcgcgttt cggtgatgac ggtgaaaacc tctgacacat gcagctcccg gagacggtca 60 cagcttgtct gtaagcggat gccgggagca gacaagcccg tcagggcgcg tcagcgggtg 120 ttggcgggtg tcggggctgg cttaactatg cggcatcaga gcagattgta ctgagagtgc 180 accatatgcg gtgtgaaata ccgcacagat gcgtaaggag aaaataccgc atcaggcgcc 240 attcgccatt caggctgcgc aactgttggg aagggcgatc ggtgcgggcc tcttcgctat 300 tacgccagct ggcgaaaggg ggatgtgctg caaggcgatt aagttgggta acgccagggt 360 tttcccagtc acgacgttgt aaaacgacgg ccagtgaatt ggagatcggt acttcgcgaa 420 tgcgtcgaga tgtttaaact cccgccccta actccgccca gttccgccca ttctccgccc 480 catggctgac taattttttt tatttatgca gaggccgagg ccgcctcggc ctctgagcta 540 ttccagaagt agtgaggagg cttttttgga ggcctaggct tttgcaaaaa gctagctggt 600 tctttccgcc tcagaaggta cctaaccaag ttcctctttc agaggttatt tcaggccacc 660 ttccaccatg gccacctcag caagttccca cttgaacaaa aacatcaagc aaatgtactt 720 gtgcctgccc cagggtgaga aagtccaagc catgtatatc tgggttgatg gtactggaga 780 aggactgcgc tgcaaaaccc gcaccctgga ctgtgagccc aagtgtgtag aagagttacc 840 tgagtggaat tttgatggct ctagtacctt tcagtctgag ggctccaaca gtgacatgta 900 tctcagccct gttgccatgt ttcgggaccc cttccgcaga gatcccaaca agctggtgtt 960 ctgtgaagtt ttcaagtaca accggaagcc tgcagagacc aatttaaggc actcgtgtaa 1020 acggataatg gacatggtga gcaaccagca cccctggttt ggaatggaac aggagtatac 1080 tctgatggga acagatgggc acccttttgg ttggccttcc aatggctttc ctgggcccca 1140 aggtccgtat tactgtggtg tgggcgcaga caaagcctat ggcagggata tcgtggaggc 1200 tcactaccgc gcctgcttgt atgctggggt caagattaca ggaacaaatg ctgaggtcat 1260 gcctgcccag tgggaatttc aaataggacc ctgtgaagga atccgcatgg gagatcatct 1320 ctgggtggcc cgtttcatct tgcatcgagt atgtgaagac tttggggtaa tagcaacctt 1380 tgaccccaag cccattcctg ggaactggaa tggtgcaggc tgccatacca actttagcac 1440 caaggccatg cgggaggaga atggtctgaa gcacatcgag gaggccatcg agaaactaag 1500 caagcggcac cggtaccaca ttcgagccta cgatcccaag gggggcctgg acaatgcccg 1560 tcgtctgact gggttccacg aaacgtccaa catcaacgac ttttctgctg gtgtcgccaa 1620 tcgcagtgcc agcatccgca ttccccggac tgtcggccag gagaagaaag gttactttga 1680 agaccgccgc ccctctgcca attgtgaccc ctttgcagtg acagaagcca tcgtccgcac 1740 atgccttctc aatgagactg gcgacgagcc cttccaatac aaaaactaac gcccgcccca 1800 cgacccgcag cgcccgaccg aaaggagcgc acgaccccat gcatcgcaca catcataaga 1860 tacattgatg agtttggaca aaccacaact agaatgcagt gaaaaaaatg ctttatttgt 1920 gaaatttgtg atgctattgc tttatttgta accattataa gctgcaataa acaagttaac 1980 aacaacaatt gcattcattt tatgtttcag gttcaggggg agatgtggga ggttttttaa 2040 agcaagtaaa acctctacaa atgtggtaga attctacgta gataaaagtt ttgttacttt 2100 atagaagaaa ttttgagttt ttgttttttt taataaataa ataaacataa ataaattgtt 2160 tgttgaattt attattagta tgtaagtgta aatataataa aacttaatat ctattcaaat 2220 taataaataa acctcgatat acagaccgat aaaacacatg cgtcaatttt acacatgatt 2280 atctttaacg tacgtcacaa tatgattatc tttctagggt taatctagct gcgtgttctg 2340 cagcgtgtcg agcatcttca tctgctccat cacgctgtaa aacacatttg caccgcgagt 2400 ctgcccgtcc tccacgggtt caaaaacgtg aatgaacgag gcgcgctcat atcatgatta 2460 cgccaagcgc gcccgccggg taactcacgg ggtatccatg tccatttctg cggcatccag 2520 ccaggatacc cgtcctcgct gacgtaatat cccagcgccg caccgctgtc attaatctgc 2580 acaccggcac ggcagttcca tttaaatggc tgtcgccggt attgttcggg ttgctgatgc 2640 gcttcgggct gaccatccgg aactgtgtcc ggaaaagccg cgacgaactg gtatcccagg 2700 tggcctgaac gaacagttca ccgttaaagg cgtgcatggc cacaccttcc cgaatcatca 2760 tggtaaacgt gcgttttcgc tcaacgtcaa tgcagcagca gtcatcctcg gcaaactctt 2820 tccatgccgc ttcaacctcg cgggaaaagg cacgggcttc ttcctccccg atgcccagat 2880 agcgccagct tgggcgatga ctgagccgga aaaaagaccc gacgatatga tcctgatgca 2940 gctagattaa ccctagaaag atagtctgcg taaaattgac gcatgcattc ttgaaatatt 3000 gctctctctt tctaaatagc gcgaatccgt cgctgtgcat ttaggacatc tcagtcgccg 3060 cttggagctc ccgtgaggcg tgcttgtcaa tgcggtaagt gtcactgatt ttgaactata 3120 acgaccgcgt gagtcaaaat gacgcatgat tatcttttac gtgactttta agatttaact 3180 catacgataa ttatattgtt atttcatgtt ctacttacgt gataacttat tatatatata 3240 ttttcttgtt atagatatca agcttataga tctggggaca gccccccccc aaagccccca 3300 gggatgtaat tacgtccctc ccccgctagg gggcagcagc gagccgcccg gggctccgct 3360 ccggtccggc gctccccccg catccccgag ccggcagcgt gcggggacag cccgggcacg 3420 gggaaggtgg cacgggatcg ctttcctctg aacgcttctc gctgctcttt gagcctgcag 3480 acacctgggg ggatacgggg aaaaagcttt aggctgaaag agagatttag aatgacagaa 3540 tcatagaacg gcctgggttg caaaggagca cagtgctcat ccagatccaa ccccctgcta 3600 tgtgcagggt catcaaccag cagcccaggc tgcccagagc cacatccagc ctggccttga 3660 atgcctgcag ggatggggca tccacagcct ccttgggcaa cctgttcagt gcgtcaccac 3720 cctctggggg aaaaactgcc tcctcatatc caacccaaac ctcccctgtc tcagtgtaaa 3780 gccattcccc cttgtcctat caagggggag tttgctgtga cattgttggt ctggggtgac 3840 acatgtttgc caattcagtg catcacggag aggcagattt ggggataagg aagtgcagga 3900 cagcatggac gtgggacatg caggtgttga gggctctggg acactctcca agtcacagcg 3960 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ggtggttttt cttttcacca gtgagacggg caacagctga ttgcccttca 3660 ccgcctggcc ctgagagagt tgcagcaagc ggtccacgct ggtttgcccc agcaggcgaa 3720 aatcctgttt gatggtggtt aacggcggga tataacatga gctgtcttcg gtatcgtcgt 3780 atcccactac cgagatgtcc gcaccaacgc gcagcccgga ctcggtaatg gcgcgcattg 3840 cgcccagcgc catctgatcg ttggcaacca gcatcgcagt gggaacgatg ccctcattca 3900 gcatttgcat ggtttgttga aaaccggaca tggcactcca gtcgccttcc cgttccgcta 3960 tcggctgaat ttgattgcga gtgagatatt tatgccagcc agccagacgc agacgcgccg 4020 agacagaact taatgggccc gctaacagcg cgatttgctg gtgacccaat gcgaccagat 4080 gctccacgcc cagtcgcgta ccgtcttcat gggagaaaat aatactgttg atgggtgtct 4140 ggtcagagac atcaagaaat aacgccggaa cattagtgca ggcagcttcc acagcaatgg 4200 catcctggtc atccagcgga tagttaatga tcagcccact gacgcgttgc gcgagaagat 4260 tgtgcaccgc cgctttacag gcttcgacgc cgcttcgttc taccatcgac accaccacgc 4320 tggcacccag ttgatcggcg cgagatttaa tcgccgcgac aatttgcgac ggcgcgtgca 4380 gggccagact ggaggtggca acgccaatca gcaacgactg tttgcccgcc agttgttgtg 4440 ccacgcggtt 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cgcggtgtta ggcaccgcct ttgtggtgaa tggtggcatt tatcgtcacg 5340 aatttgtggc gagcgcggtt attaacggca tgatgaatgt gcagctgaac acgggcgtgc 5400 cagtgttaag tgccgtgctg accccacaca actatgataa aagcaaagcc cataccctgc 5460 tgttcttagc gctgtttgcg gtgaaaggca tggaagcggc gcgtgcctgc gtggagattt 5520 tagcggcccg tgaaaagatt gcggcgtgac tcgagcacca ccaccaccac cactgagatc 5580 cggctgctaa caaagcccga aaggaagctg agttggctgc tgccaccgct gagcaataac 5640 tagcataacc ccttggggcc tctaaacggg tcttgagggg ttttttgctg aaaggaggaa 5700 ctatatccgg at 5712 <210> 9 <211> 157 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetically constructed nanostructure polypeptide <400> 9 Met Asn Gln His Ser His Lys Asp Tyr Glu Thr Val Arg Ile Ala Val 1 5 10 15 Val Arg Ala Arg Trp His Ala Asp Ile Val Asp Ala Cys Val Glu Ala 20 25 30 Phe Glu Ile Ala Met Ala Ala Ile Gly Gly Asp Arg Phe Ala Val Asp 35 40 45 Val Phe Asp Val Pro Gly Ala Tyr Glu Ile Pro Leu His Ala Arg Thr 50 55 60 Leu Ala Glu Thr Gly Arg Tyr Gly Ala Val Leu Gly Thr Ala Phe Val 65 70 75 80 Val Asn Gly Gly Ile Tyr Arg His Glu Phe Val Ala Ser Ala Val Ile 85 90 95 Asp Gly Met Met Asn Val Gln Leu Ser Thr Gly Val Pro Val Leu Ser 100 105 110 Ala Val Leu Thr Pro His Arg Tyr Arg Asp Ser Ala Glu His His Arg 115 120 125 Phe Phe Ala Ala His Phe Ala Val Lys Gly Val Glu Ala Ala Arg Ala 130 135 140 Cys Ile Glu Ile Leu Ala Ala Arg Glu Lys Ile Ala Ala 145 150 155 <210> 10 <211> 157 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetically constructed nanostructure polypeptide <400> 10 Met Asn Gln His Ser His Lys Asp Tyr Glu Thr Val Arg Ile Ala Val 1 5 10 15 Val Arg Ala Arg Trp His Ala Glu Ile Val Asp Ala Cys Val Ser Ala 20 25 30 Phe Glu Ala Ala Met Ala Asp Ile Gly Gly Asp Arg Phe Ala Val Asp 35 40 45 Val Phe Asp Val Pro Gly Ala Tyr Glu Ile Pro Leu His Ala Arg Thr 50 55 60 Leu Ala Glu Thr Gly Arg Tyr Gly Ala Val Leu Gly Thr Ala Phe Val 65 70 75 80 Val Asn Gly Gly Ile Tyr Arg His Glu Phe Val Ala Ser Ala Val Ile 85 90 95 Asp Gly Met Met Asn Val Gln Leu Ser Thr Gly Val Pro Val Leu Ser 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Sequence <220> <223> synthetically constructed nanostructure polypeptide <400> 13 Met Asn Gln His Ser His Lys Asp His Glu Thr Val Arg Ile Ala Val 1 5 10 15 Val Arg Ala Arg Trp His Ala Asp Ile Val Asp Ala Cys Val Glu Ala 20 25 30 Phe Glu Ile Ala Met Ala Ala Ile Gly Gly Asp Arg Phe Ala Val Asp 35 40 45 Val Phe Asp Val Pro Gly Ala Tyr Glu Ile Pro Leu His Ala Arg Thr 50 55 60 Leu Ala Glu Thr Gly Arg Tyr Gly Ala Val Leu Gly Thr Ala Phe Val 65 70 75 80 Val Asp Gly Gly Ile Tyr Asp His Glu Phe Val Ala Ser Ala Val Ile 85 90 95 Asp Gly Met Met Asn Val Gln Leu Asp Thr Gly Val Pro Val Leu Ser 100 105 110 Ala Val Leu Thr Pro His Glu Tyr Glu Asp Ser Asp Glu Asp His Glu 115 120 125 Phe Phe Ala Ala His Phe Ala Val Lys Gly Val Glu Ala Ala Arg Ala 130 135 140 Cys Ile Glu Ile Leu Asn Ala Arg Glu Lys Ile Ala Ala 145 150 155 <210> 14 <211> 157 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetically constructed nanostructure polypeptide <400> 14 Met Asn Gln His Ser His Lys Asp His Glu Thr Val Arg Ile 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Phe Ala Val Asp 35 40 45 Val Phe Asp Val Pro Gly Ala Tyr Glu Ile Pro Leu His Ala Arg Thr 50 55 60 Leu Ala Glu Thr Gly Arg Tyr Gly Ala Val Leu Gly Thr Ala Phe Val 65 70 75 80 Val Asp Gly Gly Ile Tyr Asp His Glu Phe Val Ala Ser Ala Val Ile 85 90 95 Asp Gly Met Met Asn Val Gln Leu Asp Thr Gly Val Pro Val Leu Ser 100 105 110 Ala Val Leu Thr Pro His Glu Tyr Glu Asp Ser Asp Ala Asp Thr Leu 115 120 125 Leu Phe Leu Ala Leu Phe Ala Val Lys Gly Met Glu Ala Ala Arg Ala 130 135 140 Cys Val Glu Ile Leu Ala Ala Arg Glu Lys Ile Ala Ala 145 150 155 <210> 16 <211> 157 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetically constructed nanostructure polypeptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (9) <223> Xaa is Tyr or His <220> <221> MISC_FEATURE <222> (82) <223> Xaa is Asn or Asp <220> <221> MISC_FEATURE <222> (87) <223> Xaa is Arg or Asp <220> <221> MISC_FEATURE <222> (105) <223> Xaa is Ser or Asp <220> <221> MISC_FEATURE <222> (119) <223> Xaa is Arg or Glu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (121) 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Val Cys Glu Trp Phe Lys Ala Gly Val Leu Ala Val Gly 165 170 175 Val Gly Asp Ala Leu Val Lys Gly Asp Pro Asp Glu Val Arg Glu Lys 180 185 190 Ala Lys Lys Phe Val Glu Lys Ile Arg Gly Cys Thr Glu 195 200 205 <210> 19 <211> 205 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetically constructed nanostructure polypeptide <400> 19 Met Lys Met Glu Glu Leu Phe Lys Lys His Lys Ile Val Ala Val Leu 1 5 10 15 Arg Ala Asn Ser Val Glu Glu Ala Ile Glu Lys Ala Val Ala Val Phe 20 25 30 Ala Gly Gly Val His Leu Ile Glu Ile Thr Phe Thr Val Pro Asp Ala 35 40 45 Asp Thr Val Ile Lys Ala Leu Ser Val Leu Lys Glu Lys Gly Ala Ile 50 55 60 Ile Gly Ala Gly Thr Val Thr Ser Val Glu Gln Cys Arg Lys Ala Val 65 70 75 80 Glu Ser Gly Ala Glu Phe Ile Val Ser Pro His Leu Asp Glu Glu Ile 85 90 95 Ser Gln Phe Cys Lys Glu Lys Gly Val Phe Tyr Met Pro Gly Val Met 100 105 110 Thr Pro Thr Glu Leu Val Lys Ala Met Lys Leu Gly His Asp Ile Leu 115 120 125 Lys Leu Phe Pro Gly Glu Val Val Gly Pro Glu Phe Val Glu Ala Met 130 135 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Claims (20)

  1. (a) (i) 서열번호 4 또는 이와 75% 이상 서열 동일성을 갖는 단백질 및 서열번호 5 또는 이와 75% 이상 서열 동일성을 갖는 단백질이 링커를 통해 연결된, 융합 단백질 A를 발현하는 세포주를 배양하는 단계; (ii) 상기 (i)의 배양액으로부터 상기 융합 단백질 A를 회수하여 정제하는 단계;
    (b) (i) 서열번호 6 또는 이와 75% 이상 서열 상동성을 갖는, 단백질 B를 발현하는 세포주를 배양하는 단계; (ii) 상기 (i)의 배양액으로부터 상기 단백질 B를 회수하여 정제하는 단계; 및
    (c) 상기 (a)에서 수득한 융합 단백질 A 및 (b)에서 수득한 단백질 B를 혼합하여, 자가조립된 다량체성 단백질 조립체를 형성하는 것을 포함하는, 다량체성 단백질 조립체의 제조방법으로,
    상기 (a) 및 (b)는 동시에 수행되거나, 시간적 간격을 두고 수행되거나, 순차적으로 수행되거나, 역순으로 수행되는 것인, 제조방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 제조방법은 (d) 상기 (c)의 조립체 형성의 반응물을 여과하는 단계를 더 포함하는, 제조방법.
  3. 제1항에 있어서 상기 (a) (i)는 종배양 및 본배양 단계를 포함하는, 제조방법.
  4. 제1항에 있어서 상기 (a) (ii)는 배양액을 원심분리하여 상층액을 회수하고, 회수된 배양액을 여과하는 것을 포함하는, 제조방법.
  5. 제1항에 있어서 상기 (a) (ii)는 배양액을 여과하여 뉴클레아제를 처리하는 것을 포함하는, 제조방법.
  6. 제1항에 있어서 상기 (a) (ii)는 1차 크로마토그래피, 2차 크로마토그래피 및 3차 크로마토그래피를 수행하는 것을 포함하는, 제조방법.
  7. 제1항에 있어서 상기 (a) (ii)는 바이러스 여과 및 한외여과를 포함하는, 제조방법.
  8. 제1항에 있어서 상기 (b) (i)는 종배양 및 본배양 단계를 포함하는, 제조방법.
  9. 제1항에 있어서 상기 (b) (ii)는 세포를 파쇄하여 뉴클레아제를 처리하는 것을 포함하는, 제조방법.
  10. 제1항에 있어서 상기 (b) (ii)는 1차 크로마토그래피 및 2차 크로마토그래피를 수행하는 단계를 포함하는, 제조방법.
  11. 제1항에 있어서 상기 (a) (i)는 배양액의 pH를 조절하는 것을 포함하는, 제조방법.
  12. 제1항에 있어서, 상기 (a) (i)는 배양액에 배양 첨가물을 투입하는 것을 포함하는, 제조방법.
  13. 제1항에 있어서 상기 (a) (ii)는 뉴클레아제의 농도, 처리 시간 및 상기 배양액의 Mg2+ 이온의 농도로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 인자를 조절하는 것을 포함하는, 제조방법.
  14. 제1항에 있어서 상기 (b) (i)의 배양 배지는 글리세롤 0 초과 4% (v/v) 미만의 함량으로 포함하는, 제조방법.
  15. 제1항에 있어서 상기 (b) (ii)는 세포주를 현탁액으로 현탁하는 단계; 및 상기 현탁액을 파쇄하는 단계를 포함하는, 제조방법.
  16. 제10항에 있어서 상기 1차 크로마토그래피는 음이온 교환 크로마토그래피, 2차 크로마토그래피는 음이온 교환 크로마토그래피인, 제조방법.
  17. 제1항에 있어서 상기 (c)의 혼합 반응은 안정제를 포함하는 완충액 존재하에 수행되는 것인, 제조방법.
  18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서 상기 다량체성 단백질 조립체는, 융합 단백질 A의 삼량체 20개 및 단백질 B의 오량체 12개로 구성되는 20면체 구조를 갖는, 제조방법.
  19. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 따라 다량체성 단백질 조립체를 제조하는 단계를 포함하는, 면역원성 조성물의 제조방법.
  20. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 따라 다량체성 단백질 조립체를 제조하는 단계를 포함하는, COVID-19 예방을 위한 백신 조성물의 제조방법.
KR1020220030768A 2021-10-15 2022-03-11 코로나19 백신 제조방법 KR102600616B1 (ko)

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