KR20230070177A - 단백질을 발현하는 세포의 배양 방법 - Google Patents

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Abstract

본 출원에 의해 개시되는 기술의 일 양태에 따르면, 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열로 표시되는 폴리펩타이드 또는 이와 75% 이상 서열 상동성을 갖는 폴리펩타이드인 목적 단백질을 발현하는 세포주의 배양방법으로서, 상기 단백질을 발현하는 세포주를 배양하는 단계를 포함하고, 상기 세포주를 배양하는 단계는 배양액 내 글루코스 농도를 주기적으로 모니터링하며, 또한 배양액에 배양 첨가물을 투입하는 것을 포함하는, 배양 방법을 제공한다. 또한, 본 발명에 따른 목적 단백질을 발현하는 세포주의 배양 방법은 단백질 생산비용을 절감하면서도, 상기 단백질을 대량생산하는데 사용될 수 있다.

Description

단백질을 발현하는 세포의 배양 방법{METHOD FOR CULTURING A CELL EXPRESSING A PROTEIN}
본 발명은 목적 단백질을 대량 생산하면서도 생산 비용을 절감할 수 있는 단백질을 발현하는 세포주의 배양 방법으로서, 특히, SARS-CoV-2 (Severe Acute Respiratory Syndrome-Coronavirus-2) 감염을 예방하고/하거나 감염시 발현되는 증상을 완화하는 목적으로 사용되는 백신의 항원 단백질을 발현하는 세포주의 배양 방법에 관한 것이다.
2019년 12월 이후 팬데믹 감염이 보고된 SARS-CoV-2 바이러스는 Coronaviridae family, Betacoronavirus genus Sarbecovirus subgenus에 속하는 바이러스로서, 바이러스 표면의 삼량체 (trimer) 당단백질 (즉, 스파이크 (Spike) 단백질) 상단의 수용체 결합 도메인 (Receptor Binding Domain, RBD)이 인체 세포 표면의 ACE2 수용체 단백질에 결합함으로써 감염을 일으키는 것으로 알려져 있다. 스파이크 당단백질 단량체 (monomer)는 숙주세포 단백질 분해효소 (protease)에 의하여 S1 서브유닛 및 S2 서브유닛으로 분리된다.
상기 SARS-CoV-2 바이러스 감염의 주된 전파경로는 감염자의 비말과의 밀접접촉인 것으로 알려져 있다. 그러나, 감염자와 직접 접촉하거나 또는 감염자의 비말 등에 의하여 오염된 물품과 같은 매개체를 만진 후, 손을 씻지 않은 채 눈, 코, 입 등을 만짐으로써 바이러스 전파가 이루어질 수도 있다고 알려져 있다.
한편, 2020년 SARS-CoV-2 바이러스 감염으로 인한 사회·경제적 피해가 심화되면서 미국, 유럽 등 다양한 국가에서 SARS-CoV-2 바이러스 감염에 따른 증세를 완화하는 효과를 갖는 백신 사용에 대한 긴급승인과 함께 전세계적으로 여러 국가에서 백신 접종이 개시되었다. 그러나, 상기 백신을 접종하였더라도 백신 접종자에서의 SARS-CoV-2 바이러스 감염을 원천 차단하지는 못한다.
더욱이, 알파변이, 베타 변이, 감마 변이, 엡실론 변이, 델타변이, 카파변이, 에타변이와 같은 SARS-CoV-2 바이러스 변이가 계속 보고되고 있으며, 백신 접종자에서의 이러한 변이된 SARS-CoV-2 바이러스 감염이 계속적으로 발생하고 있다. 따라서, 체내 유효 항체 수치를 유지하기 위한 목적으로 백신 접종자를 대상으로 한 추가 백신 접종이 권고되고 있는 실정이다. 나아가, 각국 정부는 SARS-CoV-2 감염이 사회·경제에 미치는 영향을 고려하여 SARS-CoV-2 백신 접종 대상을 청소년 층까지 확대하고 있는바, SARS-CoV-2 감염 예방 백신 및 상기 백신에 사용될 수 있는 항원 단백질 생산 수요가 급증하고 있다. 식물에서 목적 단백질을 대량 생산하는 방법에 대해서는 이미 공지되어 있으나(공개특허 제10-2021-0117808호), 동물성 세포에서 목적 단백질을 대량 생산하는 방법에 대해서는 아직 연구가 부족한 실정이다. 따라서, 단기간 내 동물성 세포에서 백신 항원 단백질을 대량생산할 수 있는 제조 방법의 개발이 요구된다.
(특허문헌 1) 공개특허 제10-2021-0117808호
본 발명자들은 백신의 항원 단백질의 생산효율을 증가시키는 방법에 대한 연구를 진행하던 중, 바이오리액터에서의 목적 단백질을 발현하는 세포를 배양하는 과정에서 배양액에 투입되는 배양 첨가물(예를 들어 당 공급원, 단백질 발현 촉진제 등)의 종류를 달리하고/하거나 배양 첨가물의 투입 주기를 조절함으로써, 목적 단백질을 발현하는 세포의 활성, 세포생존률 및 세포 밀도를 높게 유지하면서도 목적 단백질의 발현량을 증가시킬 수 있다는 점을 발견하여 본 발명을 완성하였다.
본 출원에 의해 개시되는 기술의 일 양태에 따르면, 목적 단백질을 발현하는 세포주의 배양 방법으로서, 상기 단백질을 발현하는 세포주를 배양하는 단계를 포함하고, 상기 세포주를 배양하는 단계는 배양액 내 글루코스 농도를 주기적으로 모니터링하며, 또한 배양액에 배양 첨가물을 투입하는 것을 포함하는, 배양 방법을 제공한다.
본 발명에 따른 목적 단백질을 발현하는 세포주의 배양 방법은 단백질 생산비용을 절감하면서도, 상기 단백질을 대량생산하는데 사용될 수 있다.
도 1은 서열번호 1의 목적단백질을 코딩하는 염기서열을 포함하는 벡터의 구조를 나타낸 것이다.
도 2는 상표명 하이클론 셀부스트 7A/7B (Cell Boost 7A/7BTM)만을 공급하거나, 하이클론 셀부스트 7A/7B를 45 % (w/v) D-글루코스 용액과 격일로 교차하여 공급하였을 때 목적 단백질 발현량이 달라짐을 나타낸다.
도 3은 상표명 하이클론 셀부스트 7A/7B (Cell Boost 7A/7BTM)만을 공급하거나, 하이클론 셀부스트 7A/7B를 45 % (w/v) D-글루코스 용액과 교차하여 공급하였을 때 목적 단백질을 발현하는 세포주의 세포생존률 및 생존 세포 밀도(VCD)를 나타낸다.
도 4는 하이클론 셀부스트 7A/7B (Cell Boost 7A/7BTM)와 45 % (w/v) D-글루코스 용액의 투입 주기별 목적 단백질을 발현하는 세포주의 세포생존률 및 생존 세포 밀도(VCD)를 나타낸다.
도 5는 상표명 하이클론 셀부스트 7A/7B (Cell Boost 7A/7BTM)과 45 % (w/v) D-글루코스 용액의 투입 주기를 달리하였을 때 SDS-PAGE를 통해 측정한 배양 10일차, 배양 11일차, 배양 12일차, 배양 13일차, 배양 14일차 및 배양 15일차의 목적 단백질 발현량을 도시한다.
도 6은 상표명 하이클론 셀부스트 7A/7B (Cell Boost 7A/7BTM)과 45 % (w/v) D-글루코스 용액의 투입 주기를 달리하였을 때 웨스턴 블랏(WESTERN-BLOT)을 통해 측정한 배양 10일차, 배양 11일차, 배양 12일차, 배양 13일차, 배양 14일차 및 배양 15일차의 목적 단백질 발현량을 도시한다.
이하, 본 발명을 보다 구체적으로 설명한다.
본 발명의 일 측면은, 목적 단백질을 발현하는 세포주의 배양 방법으로서, 상기 단백질을 발현하는 세포주를 배양하는 단계를 포함하고, 상기 세포주를 배양하는 단계는 배양액 내 글루코스 농도를 주기적으로 모니터링하며, 또한 배양액에 배양 첨가물을 투입하는 것을 포함하는, 배양 방법을 제공한다.
상기 "목적 단백질"은 세포가 발현 가능한 모든 종류의 외래 산물 단백질이다. 대표적으로, 인슐린, 사이토카인(인터루킨, 종양괴사인자, 인터페론, 콜로니자극인자, 케모카인 등등), 에리트로포이에틴, 항원, 항체, 항체 단편, 구조 단백질, 조절단백질, 전사인자, 독소 단백질, 호르몬, 호르몬 유사체, 효소, 효소 저해제, 수송단백질, 리셉터 (예컨대, 티로신 키나아제 수용체 등), 리셉터의 단편, 생체방어 유도물질, 저장단백질, 이동단백질(movement protein), 익스플로이티브 프로틴(exploitive protein), 리포터 단백질, 성장 인자 등이 있으며, 이러한 목적 단백질은 세포주에서의 발현을 위한 벡터에 상기 목적 단백질을 코딩하는 유전자를 삽입할 수 있도록 하는 제한 효소 인지 또는 절단 부위가 도입되어 있는 핵산 서열인 "클로닝 부위" 를 포함할 수 있다.
본 발명에서 상기 목적 단백질은 국제특허공보 제2021-163438호의 청구항 1에 기재된 폴리펩타이드 중 하나이거나, 국제특허공보 제2019-169120호, 미국 특허공보 제9630994호, 국제특허공보 제WO2021-163481호, 국제특허공보 제WO2021-163438호, 또는 국제출원번호 제PCT/US2021/037341호의 명세서에 개시된 폴리펩타이드 중 하나일 수 있다. 바람직하게는, 상기 목적 단백질에서 RBD 및 링커 부분을 제외한 단백질은 국제특허공보 제2019-169120호에 개시된 서열번호 7, 29, 30, 31, 또는 39로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드이거나, 상기 국제특허공보 제2019-169120호에 개시된 폴리펩타이드의 아미노산 서열과 85% 이상 서열 상동성을 갖는 폴리펩타이드일 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 목적 단백질은 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩타이드이거나, 상기 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열과 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 91% 이상, 92% 이상, 93% 이상, 94% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상 또는 99% 이상 서열 상동성을 갖는 폴리펩타이드일 수 있다. 상기 목적 단백질은 서열번호 2로 표시되는 염기서열로 이루어진 유전자에 의해 코딩되거나, 상기 서열번호 2로 표시되는 염기서열과 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 91% 이상, 92% 이상, 93% 이상, 94% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상 또는 99% 이상 서열 상동성을 갖는 염기 서열에 의하여 코딩될 수 있다.
상기 목적 단백질을 생산하는 세포주는 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열로 표시되는 폴리펩타이드 또는 이와 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 91% 이상, 92% 이상, 93% 이상, 94% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상 또는 99% 이상 서열 상동성을 갖는 폴리펩타이드를 코딩하는 유전자를 포함하는 발현 벡터를 갖는 세포주일 수 있다. 본 발명의 일 구체예에서, 상기 발현 벡터는 플라스미드 벡터일 수 있으나, 세포에 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열로 표시되는 폴리펩타이드 또는 이와 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 91% 이상, 92% 이상, 93% 이상, 94% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상 또는 99% 이상 서열 상동성을 갖는 폴리펩타이드를 코딩하는 유전자를 형질감염하기에 적합한 벡터라면 제한없이 사용될 수 있다.
한편, 본 발명에서 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열로 표시되는 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 발현 벡터는 서열번호 3으로 표시되는 DNA 서열을 가질 수 있다.
본 발명에서 사용된 용어, "벡터"는 숙주세포에 도입되어 숙주세포 유전체 내로 재조합 및 삽입될 수 있거나, 또는 에피좀 (episome)으로 자발적으로 복제될 수 있는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 수단을 말한다. 적합한 발현 벡터는 프로모터, 개시코돈, 종결코돈, 폴리아데닐화 신호 및 인핸서 같은 발현 조절 요소 (element) 외에도 막 표적화 또는 분비를 위한 신호서열 또는 리더서열을 포함하며, 목적에 따라 다양하게 제조될 수 있다. 개시코돈 및 종결코돈을 표적 단백질을 암호화하는 유전자 작제물이 투여되었을 때 개체에서 반드시 작용을 나타내야 하며 암호화 서열과 인프레임 (in frame)에 있어야 한다.
본 발명의 일 구체예에 따른 폴리뉴클레오티드 또는 벡터는 게놈 외부의 독립적 분자, 구체적으로는 복제할 수 있는 분자로서 유전적으로 변형된 숙주세포 또는 비-인간 숙주개체 내에 존재할 수 있거나, 또는 숙주세포 또는 비-인간 숙주개체의 게놈으로 안정적으로 삽입될 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 따른 목적 단백질을 발현하는 세포주의 숙주세포는 진핵세포이다. 상기 진핵세포는 진균세포 (fungus), 식물세포 또는 동물세포를 포함한다. 진균세포의 예로는 효모, 구체적으로는 사카로마이세스 속(Saccharomyces sp.)의 효모, 더욱 구체적으로는 사카로마이세스 세레비지애 (S. cerevisiae)일 수 있다. 또한, 동물세포의 예로는 곤충세포 또는 포유동물 세포가 있고, 구체적인 동물세포의 예로는 HEK293, 293T, NSO, 중국 햄스터 난소 세포(CHO), MDCK, U2-OSHela, NIH3T3, MOLT-4, Jurkat, PC-12, PC-3, IMR, NT2N, Sk-n-sh, CaSki, C33A 등이 있다. 또한, 통상의 기술분야에 잘 알려져 있는 적당한 세포주들은 ATCC (American Type Culture Collection)와 같은 세포주 기탁기관으로부터 수득할 수 있다.
본 발명의 일 구체에에 따른 목적 단백질을 발현하는 세포주의 숙주세포는 중국 햄스터 난소 세포 (CHO)일 수 있으며, 바람직하게는 재조합 아데노-관련 바이러스 (recombinant Adeno-Associated Virus, rAAV)에 의하여 Glutamine Synthetase 유전자의 6번 엑손이 넉아웃 (Knock-out)된 HD-BIOP3 세포를 사용할 수 있다.
상기 숙주세포에 목적 단백질을 코딩하는 유전 서열을 갖는 발현 벡터를 도입하기 위해서는 핵산을 세포 내로 도입하는 어떤 방법이든 사용할 수 있고, 숙주세포에 따라 통상의 기술분야에 공지된 기술을 사용할 수 있다. 예를 들어, 열충격법 (Heat Shock), 전기천공법 (Electroporation), 인산칼슘 (CaPO4) 침전, 염화칼슘 (CaCl2) 침전, 미세주입법 (microinjection), 폴리에틸렌글리콜 (PEG)법, DEAE-덱스트란법, 양이온 리포좀법, 및 초산 리튬-DMSO법 등이 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서 사용된 용어, "배양 첨가물"은 세포 배양시 세포의 성장을 촉진하고/하거나 세포가 발현하는 물질의 생산량을 증가시키기 위한 목적으로 첨가되는 물질인 화학적 성분 또는 생체 물질로서, 예를 들면 성장 인자(예를 들면 인슐린 등), 철분 공급원(예를 들면 트랜스페린 등), 폴리아민류(예를 들면 푸트레신 등), 미네랄(예를 들면 셀렌산나트륨 등), 당 공급원(예를 들면 글루코스 등), 유기산(예를 들면 피루브산, 락트산 등), 아미노산(예를 들면 L-글루타민 등), 환원제(예를 들면 2-메르캅토에탄올 등), 비타민류(예를 들면 아스코르빈산, d-비오틴 등), 스테로이드(예를 들면 β-에스트라디올, 프로게스테론 등), 항생 물질(예를 들면 스트렙토마이신, 페니실린, 겐타마이신 등), 완충제(예를 들면 HEPES 등), 단백질 발현 촉진제 (예를 들어, 상표명 하이클론 셀부스트 1, 상표명 하이클론 셀부스트 2, 상표명 하이클론 셀부스트 3, 상표명 하이클론 셀부스트 4, 상표명 하이클론 셀부스트 5, 상표명 하이클론 셀부스트 6, 상표명 하이클론 셀 부스트 7A 및 상표명 하이클론 셀부스트 7B) 등을 들 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 배양 2일차 또는 그 이후부터 세포 배양액에 단백질 발현 촉진제 및 당 공급원을 하루 이상 간격으로 교대로 투입할 수 있다. 이때, 상기 단백질 발현 촉진제는 CHO 세포가 생산하는 단백질의 수율 증가를 촉진하는 물질일 수 있고, 상기 CHO 세포가 생산하는 단백질의 수율 증가를 촉진하는 물질은 본 발명이 속한 기술분야에서 CHO 세포가 생산하는 단백질의 수율 증가를 촉진하는 것으로 공지된 물질로서 CHO CD Efficient FeedA (Invitrogen, 인비트로겐), CHO CD Efficient FeedB (인비트로겐), CHO CD Efficient FeedC (인비트로겐), Sheff-CHO PLUS PF ACF (FM012) (케리), CHO CD Efficient Feed A+ (인비트로겐), CHO CD Efficient Feed B+ (인비트로겐), CHO CD Efficient Feed C+ (인비트로겐), FAA01A (Hyclone, 하이클론), 상표명 하이클론 셀부스트 1, 상표명 하이클론 셀부스트 2, 상표명 하이클론 셀부스트 3, 상표명 하이클론 셀부스트 4, 상표명 하이클론 셀부스트 5, 상표명 하이클론 셀부스트 6, 상표명 하이클론 셀부스트 7A, 상표명 하이클론 셀부스트 7B를 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. 바람직하게는 상기 단백질 발현 촉진제는 상표명 하이클론 셀 부스트 7A 및 상표명 하이클론 셀부스트 7B일 수 있다. 이 때, 상표명 하이클론 셀부스트 7A는 아미노산, 비타민, 염 및 글루코스등을 포함하는 중성에 가까운 pH를 갖는 조성물이며, 상표명 하이클론 셀부스트 7B는 아미노산 농축액으로서 알칼리성이다. 또한, 상기 상표명 하이클론 셀 부스트 7A를 배양액에 첨가하여 사용할 경우 그 사용 부피는 배양 개시 시점 또는 배양 과정 중의 배양액 총 부피의 20% 미만일 수 있으며, 상기 상표명 하이클론 셀 부스트 7B를 배양액에 첨가하여 사용할 경우 그 사용 부피는 배양 개시 시점 또는 배양 과정 중의 배양액 총 부피의 2% 미만일 수 있다. 나아가, 상기 CHO 세포가 생산하는 단백질의 수율 증가를 촉진하는 물질은 상표명 하이클론 셀 부스트 7A 및 상표명 하이클론 셀부스트 7B가 각각 10:1의 부피비로 혼합된 혼합물일 수 있다.
또한, 상기 당 공급원은 글루코스를 포함하되 세포의 증식을 저해하지 않는 물질이다. 한편, 상기 당 공급원으로서 D-글루코스 용액을 사용할 수 있으나 이에 제한되지는 않는다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 단백질 발현 촉진제는 세포의 성장 및/또는 목적 단백질 발현에 필요하거나 이를 돕는 성분을 공급하기 위한 목적으로 사용될 수 있다.
본 발명의 또다른 구체예에서, 배양 기간 동안 세포주 배양액에 투입될 수 있는 당 공급원의 당 농도는 1 % (w/v) 이상의 농도이거나, 1 g/L 내지 500 g/L, 100 g/L 내지 500 g/L, 200 g/L 내지 500 g/L, 300 g/L 내지 500 g/L, 또는 400 g/L 내지 500 g/L의 농도를 갖거나, 450 g/L의 농도를 가질 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 또한, 상기 당 공급원은 45 % (w/v) 농도의 글루코스 용액 또는 D-글루코스 용액일 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
본 발명의 다른 구체예에서, 배양 기간 동안 세포 배양액 내 글루코스 농도를 5.0 내지 7.0 g/L로 유지할 수 있다.
본 발명의 다른 구체예에서, 배양 2일차 또는 그 이후부터 세포 배양액에 당 공급원 및 단백질 발현 촉진제를 하루 이상 간격으로 교대로 투입할 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 배양 3일차에 당 공급원을 세포 배양액으로 투입할 수 있다.
본 발명의 다른 구체예에서, 배양 3일차부터 배양 종료시까지 격일로 당 공급원을 세포 배양액으로 투입할 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 단백질 발현 촉진제 및 당 공급원을 세포 배양액으로 교대로 투입하되, 상기 당 공급원은 배양 3일차부터 배양 종료시까지 2일 연속으로 1회 이상 세포 배양액으로 투입될 수 있다.
본 발명의 또다른 구체예에서, 단백질 발현 촉진제 및 당 공급원을 세포 배양액으로 교대로 투입하되, 상기 당 공급원은 배양 3일차부터 배양 종료시까지 3일 연속으로 1회 이상 세포 배양액으로 투입될 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 배양 기간 동안 당 공급원이 4회 이상 투입될 수 있다. 또한, 배양 기간 동안 당 공급원이 4회 내지 10회 투입될 수 있으나 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 다른 구체예에서, 배양 2일차에 단백질 발현 촉진제를 세포 배양액으로 투입할 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 배양 2일차부터 배양 종료시까지 격일로 단백질 발현 촉진제를 세포 배양액으로 투입할 수 있다.
본 발명의 다른 구체예에서, 상기 단백질 발현 촉진제는 배양 종료시까지 2일 이상 간격으로 1회 이상 세포 배양액에 투입될 수 있다.
본 발명의 또다른 구체예에서, 상기 단백질 발현 촉진제가 배양 종료시까지 2일 또는 3일 간격으로 1회 이상 세포 배양액에 투입될 수 있다.
본 발명의 또 다른 구체예에서, 배양 기간 동안 상기 단백질 발현 촉진제는 4회 이상 투입될 수 있다. 본 발명의 다른 구체예에서, 배양 기간 동안 상기 단백질 발현 촉진제가 4회 또는 5회 투입될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 다른 구체예에서, 목적 단백질을 발현하는 세포주를 본원발명이 속한 기술분야에서 세포 성장에 적합한 것으로 알려진 배지에 배양할 수 있지만, 이러한 조건으로 국한되는 것은 아니다. 상기 배지는 Dynamis 배지일 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 플라스크 또는 바이오리액터 (bioreactor)에서 목적 단백질을 발현하는 세포주를 배양할 수 있다. 바이오리액터를 이용한 배양은 플라스크와 달리 DO, 글루코스 함량, pH와 같은 배양조건을 조절 및 유지할 수 있어서 세포 배양을 유리한 조건에서 수행할 수 있고 대량 배양이 가능하다.
상기 플라스크 및 바이오리액터의 종류 및 배양 조건은 당업자가 통상적으로 조절 가능한 범위 내에서 변경할 수 있다.
예를 들어, 목적 단백질을 발현하는 세포주를 엘렌메이어 플라스크 (Elenmeyer Flask)에 접종하여 부유배양한 뒤 계대 배양하여 바이오리액터에 접종할 최소 세포수를 확보하고, 계대배양한 세포주를 일회용 세포배양백이 장착된 바이오리액터에 접종하여 유가식배양을 실시하여 목적 단백질을 생산할 수 있다.
본 발명의 또 다른 구체예에서, 배양 기간은 6일 이상일 수 있다. 바람직하게는 배양 기간이 6일, 7일, 8일, 9일, 10일, 11일, 12일, 13일, 14일, 15일, 16일, 17일, 18일, 19일 또는 20일일 수 있다. 보다 바람직하게는 배양 기간이 10일 내지 15일일 수 있다.
실시예
이하, 본 발명을 하기 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위가 이들만으로 한정되는 것은 아니다.
제조예 1. 목적 단백질을 발현하는 세포주의 제작
서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 폴리펩타이드를 발현하는 세포주를 제작하기 위하여 영국 HORIZON Discovery 사에서 분양 받은 HD-BIOP3 세포주를 숙주세포로 사용하였다. Donor plasmid (pJV145)에 SalI/NotI 제한 효소 반응을 이용해 Genscript사에서 합성한 cDNA를 삽입하여 재조합 발현 벡터 plasmid (M-2560)를 제작하였다 (도 1). 상기 M-2560 벡터는 서열번호 3으로 표시되는 DNA 서열을 갖는다.
상기 HD-BIOP3 세포주에 재조합 발현 벡터 plasmid (M-2560)를 형질주입하였다. 형질주입된 세포 중 안정적인 single cell cloning이 가능한 세포를 선별하여 충분한 장기 계대 안정성을 갖는 연구용 세포은행(Research cell bank; RCB)을 제조하였다. 상기 RCB를 SK바이오사이언스 안동공장으로 이관하여 GMP 기준에 적합하게 제조용 세포은행(Working Cell Bank; WCB)를 제조하였다.
WCB(Working Cell Bank) 1 바이알을 37 ℃ 항온수조 (water bath)에서 녹이고 CD OptiCHO 배지로 희석한 후 원심분리를 하여 펠렛 (pellet)을 CD OptiCHO 배지로 재부유시켰다. 10 L 바이오리액터에서 5 x 105 cells/mL 농도로 6 L 배양, 50 L 바이오리액터에서 5 x 105 cells/mL 농도로 30 L 배양, 200 L 바이오리액터에서 5 x 105 cells/mL 농도로 200 L 배양, 2000 L 바이오리액터에서 8 x 105 cells/mL 농도로 1600 L 배양할 수 있도록 확장 계대 배양하였다.
제조예 2. 목적 단백질을 발현하는 세포주의 2000 L 바이오리액터에서의 배양
일회용 세포 배양백을 2000 L 바이오리액터에 장착하고 가동 준비를 한 뒤, 1400 L의 Dynamis 배지를 주입하고 8.0 x 105 cells/mL의 농도로 WCB를 접종하여 배양하였다.
배양 3일차부터 배양 종료 시점까지 매일 샘플링을 하여 세포수 및 세포 생존률을 측정하고 미생물 오염 여부 및 배양액 내 glucose 농도를 확인하였다.
상표명 하이클론 셀부스트 7A 및 상표명 하이클론 셀부스트 7B 용액을 각각 10:1의 부피비로 혼합한 혼합물(즉, 상표명 하이클론 셀부스트 7A/7B의 혼합물)과 당 공급원인 45 % (w/v) D-glucose 용액을 투입하면서, 배양액 내 글루코스 농도를 5.0 ~ 7.0 g/L으로 유지하였다.
배양시 사용되는 배양 조건은 하기 표 1과 같다.
세포주의 배양 조건
배양 조건 설정 값
온도 (배양 0 ~ 5일차) 37℃
온도 (배양 5일차 이후) 31℃
배양용 배지 Dynamis
접종용 배지 CD OptiCHO
교반 속도 93 RPM
배양 부피 1600 L
초기 접종 농도 8.0 x 105 cells/mL
용존 산소량 40%
용존 산소량 조절 기체, 산소
pH 조절 8 % 탄산수소나트륨, 이산화탄소
실험예 1. 배양액에 공급되는 당 공급원과 단백질 발현 촉진제 투입 방식별 단백질 발현량 변화
상기 제조예 2에서 사용된 배양액으로 공급되는 단백질 발현 촉진제 및 당 공급원은 각각 상표명 하이클론 셀부스트 7A/7B의 혼합물 및 45% (w/v) D-글루코스 용액이다. 배양과정에서 상표명 하이클론 셀부스트 7A/7B의 혼합물 단독만 공급되는 경우와 달리, 배양액에 상표명 하이클론 셀부스트 7A/7B의 혼합물을 45% (w/v) D-글루코스 용액과 교차로 투입하면 목적 단백질 발현량이 증가되는지 여부를 확인하기 위하여 하기 표 2에 기재된 투입 조건을 제외하고는 제조예 2에 기재된 방식으로 목적 단백질 발현 세포주를 배양하고, 배양 16일차에 배양을 종결하였다.
단백질 발현 촉진제 및 당 공급원의 투입 방식
배치 번호 투입 조건
대조군 ICR322019, ICR322021 ·배양액 내 글루코스 농도를 6g/L로 유지함
·배양 2일차부터 배양 15일차까지 상표명 하이클론 셀부스트 7A/7B의 혼합물을 공급함
실험군 ICR322020, ICR322022 ·배양액 내 글루코스 농도를 6g/L로 유지함
·배양 2일차, 4일차, 6일차, 8일차, 10일차, 12일차 및 14일차에 상표명 하이클론 셀부스트 7A/7B의 혼합물을 공급하고, 3일차, 5일차, 7일차, 9일차, 11일차, 13일차 및 15일차에 45 % (w/v) D-글루코스 용액을 공급함
서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 목적 단백질에 결합하는 항체를 제조한 뒤, 해당 항체를 사용한 웨스턴 블랏 시험을 통해 상기 대조군 및 실험군에서 생산되는 목적 단백질 생산량 차이를 확인하기 위하여, 배양 9일차, 11일차, 13일차, 14일차 및 15일차에 배양액의 일부를 회수하여 웨스턴 블랏을 실시하였다, 웨스턴 블랏을 위한 배양액 회수시기와 관계없이, 실험군(배치 ICR32220 및 ICR322022, 도 2에서 20 및 22)의 목적 단백질 생산량이 대조군(배치 ICR322019 및 ICR322021, 도 2에서 19 및 21)보다 높은 것으로 나타났다(도 2 참조). 따라서, 배양액에 상표명 하이클론 셀부스트 7A/7B의 혼합물을 단독으로 사용하는 것보다 상표명 하이클론 셀부스트 7A/7B의 혼합물을 45 % (w/v) D-글루코스 용액과 교차하여 사용하면 목적 단백질의 생산량을 증가시킬 수 있음이 확인되었다.
또한, 배양 0일차, 9일차 및 15일차가 되는 시점 별로 대조군 및 실험군의 배치(즉, ICR322019 내지 ICR 322022)의 배양액을 2회씩 회수하여 배양액 내 세포생존률(Cell viability) 및 생존 세포 밀도 (Viable Cell Density, VCD)를 측정하였으며, 각 시점 별로 측정된 값의 평균을 내었다.
배양 2일차부터 하이클론 셀부스트 7A/7B의 혼합물만을 투여한 대조군의 세포생존률 및 VCD와 비교하였을 때, 실험군의 세포생존률 및 VCD가 더 높은 것으로 나타났다(도 3 참조). 따라서, 배양액에 상표명 하이클론 셀부스트 7A/7B의 혼합물만을 단독으로 사용하기보다 상표명 하이클론 셀부스트 7A/7B의 혼합물을 45 % (w/v) D-글루코스 용액과 교차하여 사용하면 단백질의 생산량을 증가시킬 수 있음이 확인되었다.
실험예 2. 배양액에 공급되는 상표명 하이클론 셀부스트 7A/7B의 혼합물및 45 % (w/v) D-글루코스 용액의 교차 투입 주기에 따른 생산량 변화
배양액에 공급되는 상표명 하이클론 셀부스트 7A/7B의 혼합물 및 45 % (w/v) D-글루코스 용액의 교차 투입 주기별 생산량 차이를 확인하기 위하여 표 3에 기재된 투입 조건을 제외하고는 제조예 2에 기재된 방식으로 목적 단백질 발현 세포주를 배양하였다.
상표명 하이클론 셀부스트 7A/7B의 혼합물 및 45 % (w/v) D-글루코스 용액의 교차 투입 주기
배치번호 배양기간 (Day)
0, 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15
ICR322035 C D C D C D C D C D C D C 회수
ICR322036 C D D C D D C D D C D D C 회수
ICR322037 C D D D C D D D C D D D C 회수
C: 상표명 하이클론 셀부스트 7A/7B의 혼합물
D: 45 % (w/v) D-글루코스 용액
한편, 배양 0일차, 10일차 및 15일차가 되는 시점에 상기 배치 ICR322035 내지 ICR 322037의 배양액의 일부를 각 시점별로 2회씩 회수하고, 단백질 생산량 증가를 확인하기 위한 지표의 하나인 배양액 내 세포 생존률 및 생존 세포 밀도를 측정하고, 각 시점별로 측정된 값의 평균을 내었다. 배양 2일차부터 상표명 하이클론 셀부스트 7A/7B의 혼합물만을 투여한 상기 실험예 1의 배치 ICR322019(대조군) 대비, 모든 실험군(즉, 배치 ICR322035 내지 ICR322037)에서 세포 생존률 및 VCD가 현저하게 높은 것으로 나타났다(도 4 참조).
또한, 배양 10일차, 11일차, 12일차, 13일차, 14일차 및 15일차에 상기 배치 ICR322035 내지 ICR 322037에서 배양액을 회수한 뒤, 각 시점별로 발현되는 목적 단백질의 생산량을 확인하기 위하여 SDS-PAGE 및 웨스턴 블랏을 실시하였다. 배양 10일차, 11일차, 12일차, 13일차, 14일차 및 15일차에 모든 실험군 (즉, 배치 ICR322035 내지 ICR322037, 도 5의 35 내지 37)에서 SDS-PAGE로 측정된 목적 단백질의 발현량이 높은 것으로 나타났으나, 격일로 상표명 하이클론 셀부스트 7A/7B의 혼합물 및 45 % (w/v) D-글루코스 용액을 투여한 ICR322035 배치에서의 목적 단백질 발현량이 가장 높은 것으로 나타났다(도 5 참조). 또한, 배양 10일차, 11일차, 12일차, 13일차, 14일차 및 15일차에 모든 실험군 (즉, 배치 ICR322035 내지 ICR322037, 도 6의 35 내지 37)에서 웨스턴 블랏으로 측정된 목적 단백질의 발현량이 높은 것으로 나타났으나, 격일로 상표명 하이클론 셀부스트 7A/7B의 혼합물 및 45 % (w/v) D-글루코스 용액을 투여한 ICR322035 배치에서의 목적 단백질 발현량이 가장 높은 것으로 나타났다(도 6 참조).
<110> SK bioscience Co., Ltd. <120> METHOD FOR CULTURING A CELL EXPRESSING A PROTEIN <130> FPD/202304-0084 <150> KR 10-2021-0137835 <151> 2021-10-15 <160> 3 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 467 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 1 Met Gly Ile Leu Pro Ser Pro Gly Met Pro Ala Leu Leu Ser Leu Val 1 5 10 15 Ser Leu Leu Ser Val Leu Leu Met Gly Cys Val Ala Glu Thr Gly Thr 20 25 30 Arg Phe Pro Asn Ile Thr Asn Leu Cys Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn 35 40 45 Ala Thr Arg Phe Ala Ser Val Tyr Ala Trp Asn Arg Lys Arg Ile Ser 50 55 60 Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser Val Leu Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser 65 70 75 80 Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val Ser Pro Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys 85 90 95 Phe Thr Asn Val Tyr Ala Asp Ser Phe Val Ile Arg Gly Asp Glu Val 100 105 110 Arg Gln Ile Ala Pro Gly Gln Thr Gly Lys Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr 115 120 125 Lys Leu Pro Asp Asp Phe Thr Gly Cys Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn 130 135 140 Asn Leu Asp Ser Lys Val Gly Gly Asn Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu 145 150 155 160 Phe Arg Lys Ser Asn Leu Lys Pro Phe Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu 165 170 175 Ile Tyr Gln Ala Gly Ser Thr Pro Cys Asn Gly Val Glu Gly Phe Asn 180 185 190 Cys Tyr Phe Pro Leu Gln Ser Tyr Gly Phe Gln Pro Thr Asn Gly Val 195 200 205 Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val Val Val Leu Ser Phe Glu Leu Leu His 210 215 220 Ala Pro Ala Thr Val Cys Gly Pro Lys Lys Ser Thr Gly Gly Ser Gly 225 230 235 240 Gly Ser Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Ser Glu Lys Ala Ala 245 250 255 Lys Ala Glu Glu Ala Ala Arg Lys Met Glu Glu Leu Phe Lys Lys His 260 265 270 Lys Ile Val Ala Val Leu Arg Ala Asn Ser Val Glu Glu Ala Ile Glu 275 280 285 Lys Ala Val Ala Val Phe Ala Gly Gly Val His Leu Ile Glu Ile Thr 290 295 300 Phe Thr Val Pro Asp Ala Asp Thr Val Ile Lys Ala Leu Ser Val Leu 305 310 315 320 Lys Glu Lys Gly Ala Ile Ile Gly Ala Gly Thr Val Thr Ser Val Glu 325 330 335 Gln Ala Arg Lys Ala Val Glu Ser Gly Ala Glu Phe Ile Val Ser Pro 340 345 350 His Leu Asp Glu Glu Ile Ser Gln Phe Ala Lys Glu Lys Gly Val Phe 355 360 365 Tyr Met Pro Gly Val Met Thr Pro Thr Glu Leu Val Lys Ala Met Lys 370 375 380 Leu Gly His Thr Ile Leu Lys Leu Phe Pro Gly Glu Val Val Gly Pro 385 390 395 400 Gln Phe Val Lys Ala Met Lys Gly Pro Phe Pro Asn Val Lys Phe Val 405 410 415 Pro Thr Gly Gly Val Asn Leu Asp Asn Val Ala Glu Trp Phe Lys Ala 420 425 430 Gly Val Leu Ala Val Gly Val Gly Ser Ala Leu Val Lys Gly Thr Pro 435 440 445 Asp Glu Val Arg Glu Lys Ala Lys Ala Phe Val Glu Lys Ile Arg Gly 450 455 460 Ala Thr Glu 465 <210> 2 <211> 1404 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 2 atgggaatcc tgccaagccc tggaatgcca gccctgctgt ccctggtgtc tctgctgagc 60 gtgctgctga tgggatgcgt ggcagagacc ggaacaaggt tccctaacat caccaacctg 120 tgcccattcg gcgaggtgtt taacgccaca cgctttgcct ccgtgtatgc ctggaaccgg 180 aagagaatct ctaattgcgt ggccgactat agcgtgctgt acaatagcgc ctccttctct 240 acctttaagt gctatggcgt gtctcccacc aagctgaacg acctgtgctt cacaaacgtg 300 tacgccgaca gctttgtgat ccggggcgat gaggtgagac agatcgcacc aggacagacc 360 ggcaagatcg cagactacaa ctataagctg cctgacgatt tcacaggctg cgtgatcgcc 420 tggaatagca acaatctgga ttccaaagtg ggcggcaact acaattatct gtacaggctg 480 ttccgcaaga gcaacctgaa gccatttgag cgggacatca gcaccgagat ctaccaggca 540 ggctccacac catgcaacgg agtggagggc ttcaattgtt attttcccct gcagagctac 600 ggcttccagc ctaccaatgg cgtgggctat cagccataca gagtggtggt gctgtccttt 660 gagctgctgc acgcaccagc aaccgtgtgc ggacctaaga agtccacagg cggctctgga 720 ggaagcggat ccggaggatc cggaggatct ggaagcgaga aggcagcaaa ggcagaggag 780 gcagcaagga agatggagga gctgttcaag aagcacaaga tcgtggccgt gctgagagcc 840 aactctgtgg aggaggccat cgagaaggca gtggccgtgt tcgcaggagg agtgcacctg 900 atcgagatca cctttacagt gcccgacgcc gataccgtga tcaaggccct gtccgtgctg 960 aaggagaagg gagcaatcat cggagcagga accgtgacat ctgtggagca ggcaaggaag 1020 gcagtggagt ccggagccga gtttatcgtg tctcctcacc tggatgagga gatctcccag 1080 ttcgccaagg agaagggcgt gttttacatg cctggcgtga tgaccccaac agagctggtg 1140 aaggccatga agctgggcca caccatcctg aagctgttcc caggagaggt ggtgggacca 1200 cagtttgtga aggccatgaa gggcccattc cccaatgtga agtttgtgcc tacaggcggc 1260 gtgaacctgg acaatgtggc agagtggttc aaggcaggcg tgctggcagt gggagtggga 1320 tctgccctgg tgaagggaac cccagatgag gtgagggaaa aggccaaggc ctttgtggag 1380 aagatcaggg gagcaacaga gtga 1404 <210> 3 <211> 10704 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 3 tcgcgcgttt cggtgatgac ggtgaaaacc tctgacacat gcagctcccg gagacggtca 60 cagcttgtct gtaagcggat gccgggagca gacaagcccg tcagggcgcg tcagcgggtg 120 ttggcgggtg tcggggctgg cttaactatg cggcatcaga gcagattgta ctgagagtgc 180 accatatgcg gtgtgaaata ccgcacagat gcgtaaggag aaaataccgc atcaggcgcc 240 attcgccatt caggctgcgc aactgttggg aagggcgatc ggtgcgggcc tcttcgctat 300 tacgccagct ggcgaaaggg ggatgtgctg caaggcgatt aagttgggta acgccagggt 360 tttcccagtc acgacgttgt aaaacgacgg ccagtgaatt ggagatcggt acttcgcgaa 420 tgcgtcgaga tgtttaaact cccgccccta actccgccca gttccgccca ttctccgccc 480 catggctgac taattttttt tatttatgca gaggccgagg ccgcctcggc ctctgagcta 540 ttccagaagt agtgaggagg cttttttgga ggcctaggct tttgcaaaaa gctagctggt 600 tctttccgcc tcagaaggta cctaaccaag ttcctctttc agaggttatt tcaggccacc 660 ttccaccatg gccacctcag caagttccca cttgaacaaa aacatcaagc aaatgtactt 720 gtgcctgccc cagggtgaga aagtccaagc catgtatatc tgggttgatg gtactggaga 780 aggactgcgc tgcaaaaccc gcaccctgga ctgtgagccc aagtgtgtag aagagttacc 840 tgagtggaat tttgatggct ctagtacctt tcagtctgag ggctccaaca gtgacatgta 900 tctcagccct gttgccatgt ttcgggaccc cttccgcaga gatcccaaca agctggtgtt 960 ctgtgaagtt ttcaagtaca accggaagcc tgcagagacc aatttaaggc actcgtgtaa 1020 acggataatg gacatggtga gcaaccagca cccctggttt ggaatggaac aggagtatac 1080 tctgatggga acagatgggc acccttttgg ttggccttcc aatggctttc ctgggcccca 1140 aggtccgtat tactgtggtg tgggcgcaga caaagcctat ggcagggata tcgtggaggc 1200 tcactaccgc gcctgcttgt atgctggggt caagattaca ggaacaaatg ctgaggtcat 1260 gcctgcccag tgggaatttc aaataggacc ctgtgaagga atccgcatgg gagatcatct 1320 ctgggtggcc cgtttcatct tgcatcgagt atgtgaagac tttggggtaa tagcaacctt 1380 tgaccccaag cccattcctg ggaactggaa tggtgcaggc tgccatacca actttagcac 1440 caaggccatg cgggaggaga atggtctgaa gcacatcgag gaggccatcg agaaactaag 1500 caagcggcac cggtaccaca ttcgagccta cgatcccaag gggggcctgg acaatgcccg 1560 tcgtctgact gggttccacg aaacgtccaa catcaacgac ttttctgctg gtgtcgccaa 1620 tcgcagtgcc agcatccgca ttccccggac tgtcggccag gagaagaaag gttactttga 1680 agaccgccgc ccctctgcca attgtgaccc ctttgcagtg acagaagcca tcgtccgcac 1740 atgccttctc aatgagactg gcgacgagcc cttccaatac aaaaactaac gcccgcccca 1800 cgacccgcag cgcccgaccg aaaggagcgc acgaccccat gcatcgcaca catcataaga 1860 tacattgatg agtttggaca aaccacaact agaatgcagt gaaaaaaatg ctttatttgt 1920 gaaatttgtg atgctattgc tttatttgta accattataa gctgcaataa acaagttaac 1980 aacaacaatt gcattcattt tatgtttcag gttcaggggg agatgtggga ggttttttaa 2040 agcaagtaaa acctctacaa atgtggtaga attctacgta gataaaagtt ttgttacttt 2100 atagaagaaa ttttgagttt ttgttttttt taataaataa ataaacataa ataaattgtt 2160 tgttgaattt attattagta tgtaagtgta aatataataa aacttaatat ctattcaaat 2220 taataaataa acctcgatat acagaccgat aaaacacatg cgtcaatttt acacatgatt 2280 atctttaacg tacgtcacaa tatgattatc tttctagggt taatctagct gcgtgttctg 2340 cagcgtgtcg agcatcttca tctgctccat cacgctgtaa aacacatttg caccgcgagt 2400 ctgcccgtcc tccacgggtt caaaaacgtg aatgaacgag gcgcgctcat atcatgatta 2460 cgccaagcgc gcccgccggg taactcacgg ggtatccatg tccatttctg cggcatccag 2520 ccaggatacc cgtcctcgct gacgtaatat cccagcgccg caccgctgtc attaatctgc 2580 acaccggcac ggcagttcca tttaaatggc tgtcgccggt attgttcggg ttgctgatgc 2640 gcttcgggct gaccatccgg aactgtgtcc ggaaaagccg cgacgaactg gtatcccagg 2700 tggcctgaac gaacagttca ccgttaaagg cgtgcatggc cacaccttcc cgaatcatca 2760 tggtaaacgt gcgttttcgc tcaacgtcaa tgcagcagca gtcatcctcg gcaaactctt 2820 tccatgccgc ttcaacctcg cgggaaaagg cacgggcttc ttcctccccg atgcccagat 2880 agcgccagct tgggcgatga ctgagccgga aaaaagaccc gacgatatga tcctgatgca 2940 gctagattaa ccctagaaag atagtctgcg taaaattgac gcatgcattc ttgaaatatt 3000 gctctctctt tctaaatagc gcgaatccgt cgctgtgcat ttaggacatc tcagtcgccg 3060 cttggagctc ccgtgaggcg tgcttgtcaa tgcggtaagt gtcactgatt ttgaactata 3120 acgaccgcgt gagtcaaaat gacgcatgat tatcttttac gtgactttta agatttaact 3180 catacgataa ttatattgtt atttcatgtt ctacttacgt gataacttat tatatatata 3240 ttttcttgtt atagatatca agcttataga tctggggaca gccccccccc aaagccccca 3300 gggatgtaat tacgtccctc ccccgctagg gggcagcagc gagccgcccg gggctccgct 3360 ccggtccggc gctccccccg catccccgag ccggcagcgt gcggggacag cccgggcacg 3420 gggaaggtgg cacgggatcg ctttcctctg aacgcttctc gctgctcttt gagcctgcag 3480 acacctgggg ggatacgggg aaaaagcttt aggctgaaag agagatttag aatgacagaa 3540 tcatagaacg gcctgggttg caaaggagca cagtgctcat ccagatccaa ccccctgcta 3600 tgtgcagggt catcaaccag cagcccaggc tgcccagagc cacatccagc ctggccttga 3660 atgcctgcag ggatggggca tccacagcct ccttgggcaa cctgttcagt gcgtcaccac 3720 cctctggggg aaaaactgcc tcctcatatc caacccaaac ctcccctgtc tcagtgtaaa 3780 gccattcccc cttgtcctat caagggggag tttgctgtga cattgttggt ctggggtgac 3840 acatgtttgc caattcagtg catcacggag aggcagattt ggggataagg aagtgcagga 3900 cagcatggac gtgggacatg caggtgttga gggctctggg acactctcca agtcacagcg 3960 ttcagaacag ccttaaggat aagaagatag gatagaagga caaagagcaa gttaaaaccc 4020 agcatggaga ggagcacaaa aaggccacag acactgctgg tccctgtgtc tgagcctgca 4080 tgtttgatgg tgtctggatg caagcagaag gggtggaaga gcttgcctgg agagatacag 4140 ctgggtcagt aggactggga caggcagctg gagaattgcc atgtagatgt tcatacaatc 4200 gtcaaatcat gaaggctgga aaagccctcc aagatcccca agaccaaccc caacccaccc 4260 accgtgccca ctggccatgt ccctcagtgc cacatcccca cagttcttca tcacctccag 4320 ggacggtgac ccccccacct ccgtgggcag ctgtgccact gcagcaccgc tctttggaga 4380 aggtaaatct tgctaaatcc agcccgaccc tcccctggca caacgtaagg ccattatctc 4440 tcatccaact ccaggacgga gtcagtgagg atggggctct agagtcaaca ggaaagttcc 4500 attggagcca agtacattga gtcaataggg actttccaat gggttttgcc cagtacataa 4560 ggtcaatggg aggtaagcca atgggttttt cccattactg gcacgtatac tgagtcatta 4620 gggactttcc aatgggtttt gcccagtaca taaggtcaat aggggtgaat caacaggaaa 4680 gtcccattgg agccaagtac actgagtcaa tagggacttt ccattgggtt ttgcccagta 4740 caaaaggtca atagggggtg agtcaatggg tttttcccat tattggcacg tacataaggt 4800 caataggggt gagtcattgg gtttttccag ccaatttaat taaaacgcca tgtactttcc 4860 caccattgac gtcaatgggc tattgaaact aatgcaacgt gacctttaaa cggtactttc 4920 ccatagctga ttaatgggaa agtaccgttc tcgagccaat acacgtcaat gggaagtgaa 4980 agggcagcca aaacgtaaca ccgccccggt tttcccctgg aaattccata ttggcacgca 5040 ttctattggc tgagctgcgt tctacgtggg tatataagca gagctctccc tatcagtgat 5100 agagatctcc ctatcagtga tagagatcga gctcagcgtc ggtaccgtac ctcttccgca 5160 tcgctgtctg cgagggccag ctgttggggt gagtggcggg tgtggcttcc gcgggccccg 5220 gagctggagc cctgctctga gcgggccggg ctgatatgcg agtgtcgtcc gcagggttta 5280 gctgtgagca ttcccacttc gagtggcggg cggtgcgggg gtgagagtgc gaggcctagc 5340 ggcaaccccg tagcctcgcc tcgtgtccgg cttgaggcct agcgtggtgt ccgccgccgc 5400 gtgccactcc ggccgcacta tgcgtttttt gtccttgctg ccctcgattg ccttccagca 5460 gcatgggcta acaaagggag ggtgtggggc tcactcttaa ggagcccatg aagcttacgt 5520 tggataggaa tggaagggca ggaggggcga ctggggcccg cccgccttcg gagcacatgt 5580 ccgacgccac ctggatgggg cgaggcctgt ggctttccga agcaatcggg cgtgagttta 5640 gcctacctgg gccatgtggc cctagcactg ggcacggtct ggcctggcgg tgccgcgttc 5700 ccttgcctcc caacaagggt gaggccgtcc cgcccggcac cagttgcttg cgcggaaaga 5760 tggccgctcc cggggccctg ttgcaaggag ctcaaaatgg aggacgcggc agcccggtgg 5820 agcgggcggg tgagtcaccc acacaaagga agagggcctt gcccctcgcc ggccgctgct 5880 tcctgtgacc ccgtggtcta tcggccgcat agtcacctcg ggcttctctt gagcaccgct 5940 cgtcgcggcg gggggagggg atctaatggc gttggagttt gttcacattt ggtgggtgga 6000 gactagtcag gccagcctgg cgctggaagt cattcttgga atttgcccct ttgagtttgg 6060 agcgaggcta attctcaagc ctcttagcgg ttcaaaggta ttttctaaac ccgtttccag 6120 ctcgcggttg aggacaaact cttcgcggtc tttccagtac tcttggatcg gaaacccgtc 6180 ggcctccgaa cggtactccg ccaccgaggg acctgagcga gtccgcatcg accggatcgg 6240 aaaacctcgt cgacgccgcc accatgggaa tcctgccaag ccctggaatg ccagccctgc 6300 tgtccctggt gtctctgctg agcgtgctgc tgatgggatg cgtggcagag accggaacaa 6360 ggttccctaa catcaccaac ctgtgcccat tcggcgaggt gtttaacgcc acacgctttg 6420 cctccgtgta tgcctggaac cggaagagaa tctctaattg cgtggccgac tatagcgtgc 6480 tgtacaatag cgcctccttc tctaccttta agtgctatgg cgtgtctccc accaagctga 6540 acgacctgtg cttcacaaac gtgtacgccg acagctttgt gatccggggc gatgaggtga 6600 gacagatcgc accaggacag accggcaaga tcgcagacta caactataag ctgcctgacg 6660 atttcacagg ctgcgtgatc gcctggaata gcaacaatct ggattccaaa gtgggcggca 6720 actacaatta tctgtacagg ctgttccgca agagcaacct gaagccattt gagcgggaca 6780 tcagcaccga gatctaccag gcaggctcca caccatgcaa cggagtggag ggcttcaatt 6840 gttattttcc cctgcagagc tacggcttcc agcctaccaa tggcgtgggc tatcagccat 6900 acagagtggt ggtgctgtcc tttgagctgc tgcacgcacc agcaaccgtg tgcggaccta 6960 agaagtccac aggcggctct ggaggaagcg gatccggagg atccggagga tctggaagcg 7020 agaaggcagc aaaggcagag gaggcagcaa ggaagatgga ggagctgttc aagaagcaca 7080 agatcgtggc cgtgctgaga gccaactctg tggaggaggc catcgagaag gcagtggccg 7140 tgttcgcagg aggagtgcac ctgatcgaga tcacctttac agtgcccgac gccgataccg 7200 tgatcaaggc cctgtccgtg ctgaaggaga agggagcaat catcggagca ggaaccgtga 7260 catctgtgga gcaggcaagg aaggcagtgg agtccggagc cgagtttatc gtgtctcctc 7320 acctggatga ggagatctcc cagttcgcca aggagaaggg cgtgttttac atgcctggcg 7380 tgatgacccc aacagagctg gtgaaggcca tgaagctggg ccacaccatc ctgaagctgt 7440 tcccaggaga ggtggtggga ccacagtttg tgaaggccat gaagggccca ttccccaatg 7500 tgaagtttgt gcctacaggc ggcgtgaacc tggacaatgt ggcagagtgg ttcaaggcag 7560 gcgtgctggc agtgggagtg ggatctgccc tggtgaaggg aaccccagat gaggtgaggg 7620 aaaaggccaa ggcctttgtg gagaagatca ggggagcaac agagtgagcg gccgccacac 7680 atcataagat acattgatga gtttggacaa accacaacta gaatgcagtg aaaaaaatgc 7740 tttatttgtg aaatttgtga tgctattgct ttatttgtaa ccattataag ctgcaataaa 7800 caagttaaca acaacaattg cattcatttt atgtttcagg ttcaggggga gatgtgggag 7860 gttttttaaa gcaagtaaaa cctctacaaa tgtggtacac aaagtgggga gctctagagg 7920 gacagccccc ccccaaagcc cccagggatg taattacgtc cctcccccgc tagggggcag 7980 cagcgagccg cccggggctc cgctccggtc cggcgctccc cccgcatccc cgagccggca 8040 gcgtgcgggg acagcccggg cacggggaag gtggcacggg atcgctttcc tctgaacgct 8100 tctcgctgct ctttgagcct gcagacacct ggggggatac ggggaaaaag gggagctcta 8160 gagggacagc ccccccccaa agcccccagg gatgtaatta cgtccctccc ccgctagggg 8220 gcagcagcga gccgcccggg gctccgctcc ggtccggcgc tccccccgca tccccgagcc 8280 ggcagcgtgc ggggacagcc cgggcacggg gaaggtggca cgggatcgct ttcctctgaa 8340 cgcttctcgc tgctctttga gcctgcagac acctgggggg atacggggaa aaaggatcca 8400 tggccggcca tctgcagatc atatgatcgg atgccgggac cgacgagtgc agaggcgtgc 8460 aagcgagctt ggcgtaatca tggtcatagc tgtttcctgt gtgaaattgt tatccgctca 8520 caattccaca caacatacga gccggaagca taaagtgtaa agcctggggt gcctaatgag 8580 tgagctaact cacattaatt gcgttgcgct cactgcccgc tttccagtcg ggaaacctgt 8640 cgtgccagct gcattaatga atcggccaac gcgcggggag aggcggtttg cgtattgggc 8700 gctcttccgc ttcctcgctc actgactcgc tgcgctcggt cgttcggctg cggcgagcgg 8760 tatcagctca ctcaaaggcg gtaatacggt tatccacaga atcaggggat aacgcaggaa 8820 agaacatgtg agcaaaaggc cagcaaaagg ccaggaaccg taaaaaggcc gcgttgctgg 8880 cgtttttcca taggctccgc ccccctgacg agcatcacaa aaatcgacgc tcaagtcaga 8940 ggtggcgaaa cccgacagga ctataaagat accaggcgtt tccccctgga agctccctcg 9000 tgcgctctcc tgttccgacc ctgccgctta ccggatacct gtccgccttt ctcccttcgg 9060 gaagcgtggc gctttctcat agctcacgct gtaggtatct cagttcggtg taggtcgttc 9120 gctccaagct gggctgtgtg cacgaacccc ccgttcagcc cgaccgctgc gccttatccg 9180 gtaactatcg tcttgagtcc aacccggtaa gacacgactt atcgccactg gcagcagcca 9240 ctggtaacag gattagcaga gcgaggtatg taggcggtgc tacagagttc ttgaagtggt 9300 ggcctaacta cggctacact agaagaacag tatttggtat ctgcgctctg ctgaagccag 9360 ttaccttcgg aaaaagagtt ggtagctctt gatccggcaa acaaaccacc gctggtagcg 9420 gtggtttttt tgtttgcaag cagcagatta cgcgcagaaa aaaaggatct caagaagatc 9480 ctttgatctt ttctacgggg tctgacgctc agtggaacga aaactcacgt taagggattt 9540 tggtcatgag attatcaaaa aggatcttca cctagatcct tttaaattaa aaatgaagtt 9600 ttaaatcaat ctaaagtata tatgagtaaa cttggtctga cagttaccaa tgcttaatca 9660 gtgaggcacc tatctcagcg atctgtctat ttcgttcatc catagttgcc tgactccccg 9720 tcgtgtagat aactacgata cgggagggct taccatctgg ccccagtgct gcaatgatac 9780 cgcgagaccc acgctcaccg gctccagatt tatcagcaat aaaccagcca gccggaaggg 9840 ccgagcgcag aagtggtcct gcaactttat ccgcctccat ccagtctatt aattgttgcc 9900 gggaagctag agtaagtagt tcgccagtta atagtttgcg caacgttgtt gccattgcta 9960 caggcatcgt ggtgtcacgc tcgtcgtttg gtatggcttc attcagctcc ggttcccaac 10020 gatcaaggcg agttacatga tcccccatgt tgtgcaaaaa agcggttagc tccttcggtc 10080 ctccgatcgt tgtcagaagt aagttggccg cagtgttatc actcatggtt atggcagcac 10140 tgcataattc tcttactgtc atgccatccg taagatgctt ttctgtgact ggtgagtact 10200 caaccaagtc attctgagaa tagtgtatgc ggcgaccgag ttgctcttgc ccggcgtcaa 10260 tacgggataa taccgcgcca catagcagaa ctttaaaagt gctcatcatt ggaaaacgtt 10320 cttcggggcg aaaactctca aggatcttac cgctgttgag atccagttcg atgtaaccca 10380 ctcgtgcacc caactgatct tcagcatctt ttactttcac cagcgtttct gggtgagcaa 10440 aaacaggaag gcaaaatgcc gcaaaaaagg gaataagggc gacacggaaa tgttgaatac 10500 tcatactctt cctttttcaa tattattgaa gcatttatca gggttattgt ctcatgagcg 10560 gatacatatt tgaatgtatt tagaaaaata aacaaatagg ggttccgcgc acatttcccc 10620 gaaaagtgcc acctgacgtc taagaaacca ttattatcat gacattaacc tataaaaata 10680 ggcgtatcac gaggcccttt cgtc 10704

Claims (14)

  1. 목적 단백질을 발현하는 세포주의 배양 방법으로서,
    상기 단백질을 발현하는 세포주를 배양하는 단계를 포함하고, 상기 세포주를 배양하는 단계는 배양액 내 글루코스 농도를 주기적으로 모니터링하며, 또한 배양액에 배양 첨가물을 투입하는 것을 포함하며,
    상기 목적 단백질은 SARS-CoV-2 스파이크 단백질의 수용체 결합 도메인(Receptor Binding Domain) 및 나노입자의 구조체인 I53-50A를 포함하는 단백질로서, 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열로 표시되는 폴리펩타이드 또는 이와 95% 이상 서열 상동성을 갖는 폴리펩타이드이고,
    상기 세포주는 중국 햄스터 난소 (Chinese Hamster Ovary, CHO) 세포에서 유래하고,
    배양 2일차 또는 그 이후부터 배양 종료시까지 상표명 하이클론 셀부스트 7A 및 하이클론 셀부스트 7B의 혼합물을 격일로 또는 2일 이상 간격으로 투입하며,
    배양액 내 글루코스 농도가 5.0 내지 7.0 g/L로 유지되는 것인,
    배양 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 배양 첨가물은 당 공급원을 포함하는 배양 방법.
  3. 제1항에 있어서, 배양액 내 글루코스 농도가 6 g/L로 유지되는, 배양 방법.
  4. 제2항에 있어서, 배양 2일차 또는 그 이후부터 세포 배양액에 당 공급원과 상표명 하이클론 셀부스트 7A 및 하이클론 셀부스트 7B의 혼합물을 하루 이상 간격으로 교대로 투입하는 배양 방법.
  5. 제2항에 있어서, 상기 당 공급원이 글루코스 용액인 배양 방법.
  6. 제1항에 있어서, 배양 기간이 10일 내지 15일인 배양 방법.
  7. 제4항에 있어서, 배양 3일차에 당 공급원을 세포 배양액으로 투입하는 배양 방법.
  8. 제4항에 있어서, 배양 3일차부터 배양 종료시까지 격일로 당 공급원을 세포 배양액으로 투입하는 배양 방법.
  9. 제4항에 있어서, 상기 당 공급원은 배양 3일차부터 배양 종료시까지 2일 연속으로 1회 이상 세포 배양액으로 투입되는 배양 방법.
  10. 제4항에 있어서, 상기 당 공급원은 배양 3일차부터 배양 종료시까지 3일 연속으로 1회 이상 세포 배양액으로 투입되는 배양 방법.
  11. 제4항에 있어서, 배양 기간 동안 당 공급원이 4회 이상 투입되는 배양 방법.
  12. 제4항에 있어서, 배양 2일차에 상표명 하이클론 셀부스트 7A 및 하이클론 셀부스트 7B의 혼합물을 세포 배양액으로 투입하는 배양 방법.
  13. 제4항에 있어서, 상기 상표명 하이클론 셀부스트 7A 및 하이클론 셀부스트 7B의 혼합물이 배양 종료시까지 2일 또는 3일 간격으로 1회 이상 세포 배양액에 투입되는 배양 방법.
  14. 제4항에 있어서, 상기 상표명 하이클론 셀부스트 7A 및 하이클론 셀부스트 7B의 혼합물이 4회 이상 세포 배양액에 투입되는 배양 방법.

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