CN110055280A - 一种稳定表达mCherry-tau的细胞系及其构建方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种稳定表达mCherry‑tau的细胞系及其构建方法与应用，所述方法包括步骤：预先制备重组质粒pLVX‑mCherry‑tau；将所述重组质粒pLVX‑mCherry‑tau与psPAX2以及pMD2.G混合并转染至HEK293T细胞中，获得含有mCherry‑tau基因的慢病毒颗粒；将所述慢病毒颗粒感染HEK293细胞，采用含有嘌呤霉素的培养基对慢病毒颗粒感染的HEK293细胞进行抗性筛选，获得稳定表达mCherry‑tau的细胞系。本发明构建的细胞系可用于筛选阻断tau表达和聚集的化合物，为开发抑制tau蛋白的表达、聚集、扩散和蔓延，从而治疗AD的药物，提供了一个筛选工具和平台。
Description
技术领域
本发明细胞生物学领域，尤其涉及一种稳定表达mCherry-tau的细胞系及其构建方法与应用。
背景技术
阿尔茨海默症（Alzheimer’s disease, AD），是最常见的痴呆类型，占老年人痴呆发病率的60%~80%。65岁以上老年人中，每8人就有1人患AD 。预计到2050年AD人数将达1.5亿、经济负担将每年达到1万亿美元。中国60岁以上老人中，1.6%患有AD，预计到2050年中国60岁以上老人将达4.38亿，AD将给中国的家庭和社会带来巨大经济负担。
tau蛋白与微管结合可发挥正常生物功能，然而，当tau 蛋白出现过度磷酸化而从微管上脱落时，则容易聚集形成神经纤维缠结，从而导致多种脑疾病，如阿尔茨海默症（俗称老年痴呆症，缩写AD）。也就是说，tau蛋白的过度表达和聚集及传播，是阿尔茨海默症（AD）的主要病理特征之一。因此，通过筛选抑制tau蛋白表达、聚集和传播的化合物，可用于抗tau病变相关疾病包括AD的药物筛选和研究。
因此，现有技术亟需开发出一种能够用于筛选抑制tau蛋白表达和聚集的药物的方法。
发明内容
鉴于上述现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种稳定表达mCherry-tau的细胞系及其构建方法与应用，旨在解决现有技术缺少用于筛选抑制tau蛋白表达药物的方法的问题。
本发明的技术方案如下：
一种稳定表达mCherry-tau的细胞系的构建方法，其中，包括步骤：
对tau基因片段和pLVX-mcherry载体进行同源重组，获得重组质粒pLVX-mCherry-tau；
将所述重组质粒pLVX-mCherry-tau与psPAX2以及pMD2.G混合并转染至HEK293T细胞中，培养预定时间后，获得含有mCherry-tau基因的慢病毒颗粒；
将所述含有mCherry-tau基因的慢病毒颗粒感染HEK293细胞，之后采用含有嘌呤霉素的培养基对所述慢病毒颗粒感染的HEK293细胞进行抗性筛选，获得稳定表达mCherry-tau的细胞系。
所述稳定表达mCherry-tau的细胞系的构建方法，其中，所述tau基因片段的制备包括以下步骤：
提取人源肾细胞系HEK293细胞中的RNA，并将所述RNA反转录为cDNA，采用正向引物5‘-gacgagctgtacaagatggctgagccccgc-3’以及反向引物5‘-cggttcagtcagtcacaaaccctgcttggccagg-3’对所述cDNA进行PCR扩增，制得PCR产物；
对所述PCR产物进行电泳纯化处理，得到纯化的tau基因片段。
所述稳定表达mCherry-tau的细胞系的构建方法，其中，所述对tau基因片段和pLVX-mcherry载体进行同源重组，获得重组质粒pLVX-mCherry-tau的步骤包括：
采用非连接酶依赖型单片段快速克隆试剂盒对tau基因片段和pLVX-mcherry载体进行同源重组，制得重组产物；
将所述重组产物转化至大肠杆菌中，在含有氨苄青霉素抗性的平板上培养所述大肠杆菌，通过测序选取含有重组产物的大肠杆菌；
对所述含有重组产物的大肠杆菌进行培养并提取质粒，即获得重组质粒pLVX-mCherry-tau。
所述稳定表达mCherry-tau的细胞系的构建方法，其中，所述HEK293T细胞的融合度为70-80%。
一种稳定表达mCherry-tau的细胞系，其中，所述细胞系为转入了融合基因mCherry-tau的细胞，所述融合基因mCherry-tau的序列为SEQ ID NO.7核苷酸序列。
一种稳定表达mCherry-tau的细胞系的应用，其中，将所述稳定表达mCherry-tau的细胞系应用于筛选抗阿尔茨海默症的药物。
一种稳定表达mCherry-tau的细胞系的应用，其中，将所述稳定表达mCherry-tau的细胞系应用于筛选抑制tau蛋白表达和聚集的药物。
所述稳定表达mCherry-tau的细胞系的应用，其中，将稳定表达mCherry-tau的细胞系应用于筛选抑制tau蛋白表达和聚集的药物的步骤包括：
将待筛选药物加入到培养液中对所述稳定表达mCherry-tau的细胞系进行培养；
在培养预定时间后，通过检测培养液的荧光强度判断所述待筛选药物是否抑制tau蛋白的表达和聚集。
有益效果：本发明提供一种稳定表达mCherry-tau的细胞系的构建方法，通过将所述含有mCherry-tau基因的慢病毒颗粒感染HEK293细胞，之后采用含有嘌呤霉素的培养基对所述慢病毒颗粒感染的HEK293细胞进行抗性筛选，获得稳定表达mCherry-tau的细胞系。利用本发明构建的细胞系可用于筛选阻断tau表达和聚集的化合物，为开发抑制tau蛋白的表达、聚集、扩散和蔓延，从而治疗AD的药物，提供了一个筛选工具和平台。
附图说明
图1为本发明一种稳定表达mCherry-tau的细胞系的构建方法较佳实施例的流程图。
具体实施方式
本发明提供一种稳定表达mCherry-tau的细胞系及其构建方法与应用，为使本发明的目的、技术方案及效果更加清楚、明确，以下对本发明进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
请参阅图1，图1为本发明提供的一种稳定表达mCherry-tau的细胞系的构建方法较佳实施例的流程图，其中，如图所示，包括步骤：
S10、对tau基因片段和pLVX-mcherry载体进行同源重组，获得重组质粒pLVX-mCherry-tau；
S20、将所述重组质粒pLVX-mCherry-tau与psPAX2以及pMD2.G混合并转染至HEK293T细胞中，培养预定时间后，获得含有mCherry-tau基因的慢病毒颗粒；
S30、将所述含有mCherry-tau基因的慢病毒颗粒感染HEK293细胞，之后采用含有嘌呤霉素的培养基对所述慢病毒颗粒感染的HEK293细胞进行抗性筛选，获得稳定表达mCherry-tau的细胞系。
由于tau 蛋白出现过度磷酸化时会从微管上脱落，其容易聚集形成神经纤维缠结，从而导致多种脑疾病，如阿尔茨海默症（俗称老年痴呆症，缩写AD）。也就是说，tau蛋白的过度表达和聚集及传播，是阿尔茨海默症（AD）的主要病理特征之一。因此，通过筛选抑制tau蛋白表达、聚集和传播的化合物，可用于抗tau病变相关疾病包括AD的药物筛选和研究。
本发明构建的细胞系可同时表达荧光蛋白和tau蛋白，通过检测本发明细胞系培养液中的荧光表达状况可以筛选阻断tau表达和聚集的化合物，为开发抑制tau蛋白的表达、聚集、扩散和蔓延，从而治疗AD的药物，提供了一个筛选工具和平台。
在一些实施方式中，所述tau基因片段的制备包括以下步骤：
提取人源肾细胞系HEK293细胞中的RNA，并将所述RNA反转录为cDNA，采用正向引物5‘-gacgagctgtacaagatggctgagccccgc-3’以及反向引物5‘-cggttcagtcagtcacaaaccctgcttggccagg-3’对所述cDNA进行PCR扩增，制得PCR产物；对所述PCR产物进行电泳纯化处理，得到纯化的tau基因片段。其中，用于PCR获取tau基因片段的正向引物如SEQ ID NO.1核苷酸序列所示，用于PCR获取tau基因片段的正向引物如SEQ ID NO.2核苷酸序列所示，所述纯化的tau基因片段如SEQ ID NO.3核苷酸序列所示。
在一些实施方式中，所述pLVX-mcherry载体的制备包括以下步骤：
采用正向引物5‘- tgactgactgaaccggatctagataactgatcataatt-3’，反向引物5‘-cttgtacagctcgtccatgcc-3’对购自Clonetec的pLVX-mcherry-N1质粒进行PCR扩增，制得相应的PCR产物；对所述PCR产物进行电泳纯化处理，即可获得纯化的pLVX-mcherry载体。其中，用于PCR获取pLVX-mcherry载体的正向引物如SEQ ID NO.4核苷酸序列所示，用于PCR获取pLVX-mcherry载体的反向引物如SEQ ID NO.5核苷酸序列所示，所述纯化的pLVX-mcherry载体如SEQ ID NO.6核苷酸序列所示。
在一些实施方式中，所述对tau基因片段和pLVX-mcherry载体进行同源重组，获得重组质粒pLVX-mCherry-tau的步骤包括：
采用购自诺为赞公司的非连接酶依赖型单片段快速克隆试剂盒对tau基因片段和pLVX-mcherry载体进行同源重组，制得重组产物；将所述重组产物转化至大肠杆菌中，在含有氨苄青霉素抗性的平板上培养所述大肠杆菌，通过测序选取含有重组产物的大肠杆菌；对所述含有重组产物的大肠杆菌进行培养并提取质粒，即获得重组质粒pLVX-mCherry-tau。
在所述步骤S20中，将所述重组质粒pLVX-mCherry-tau与psPAX2以及pMD2.G混合并转染至HEK293T细胞中，培养预定时间后，获得含有mCherry-tau基因的慢病毒颗粒。具体来讲，首先以含有10%胎牛血清的高糖DMEM培养基，在10cm培养皿中培养HEK293T细胞，直到细胞融合度达到70-80%；随后将重组质粒pLVX-mCherry-tau、psPAX2、pMD2.G分别以1.64pmol、1.3pmol，0.72pmol或者10.18µg、8.57µg和2.59µg的量混合并转染HEK293T细胞，6小时后更换细胞培养基；随着所述重组质粒pLVX-mCherry-tau、psPAX2和pMD2.G三种质粒上相关基因的表达，所述HEK293T细胞会产生病毒颗粒释放到培养基上清液中；待细胞培养60小时后，收集培养基，保存在4℃，将收集的上清液进行离心处理后，弃去细胞沉淀，用0.45µm孔径的PES材质针头过滤器过滤，即可制得含有mCherry-tau基因的慢病毒颗粒。
在所述步骤S30中，将所述含有mCherry-tau基因的慢病毒颗粒感染HEK293细胞，之后采用含有嘌呤霉素的培养基对所述慢病毒颗粒感染的HEK293细胞进行抗性筛选，获得稳定表达mCherry-tau的细胞系。
具体来讲，将所述含有mCherry-tau基因的慢病毒颗粒加入到预先培养的融合度达到70-80%的HEK293细胞培养介质中，并加入浓度为5µg/ml的聚凝胺，促进所述慢病毒颗粒感染细胞HEK293细胞；使用慢病毒颗粒感染HEK293细胞48小时，在荧光显微镜下观察细胞荧光可发现阳性率未达到100%，仍然有细胞不含荧光；因此，可通过使用含有5µg/ml的嘌呤霉素的培养基对感染后的细胞进行抗性筛选，持续一周，嘌呤霉素会将没有被病毒感染的、不具有抗生素抗性的细胞杀死；将筛选后能正常增殖的细胞扩大培养，并且传代冻存即获得稳定表达mCherry-tau的HEK293细胞系。
在一些实施方式中，还提供一种稳定表达mCherry-tau的细胞系，其中，所述细胞系为转入了融合基因mCherry-tau的细胞，所述融合基因mCherry-tau的序列为SEQ IDNO.7核苷酸序列。
在一些实施方式中，还提供一种稳定表达mCherry-tau的细胞系的应用，其中，将所述稳定表达mCherry-tau的细胞系应用于筛选抗阿尔茨海默症的药物。
在一些实施方式中，还提供一种稳定表达mCherry-tau的细胞系的应用，其中，将所述稳定表达mCherry-tau的细胞系应用于筛选抑制tau蛋白表达和聚集的药物。
具体来讲，将稳定表达mCherry-tau的细胞系应用于筛选抑制tau蛋白表达和聚集的药物的步骤包括：
将待筛选药物加入到培养液中对所述稳定表达mCherry-tau的细胞系进行培养；在培养预定时间后，通过检测培养液的荧光强度判断所述待筛选药物是否抑制tau蛋白的表达和聚集。
更具体地讲，可设置对照组和实验组，所述对照组为未加入待筛选药物的培养液，所述实验组为加入待筛选药物的培养液；将所述稳定表达mCherry-tau的细胞系分别在对照组和实验组进行培养预定时间后，同时检测所述对照组和实验组中培养液的荧光强度；若实验组含有荧光且荧光强度小于对照组的荧光强度，则判定所述待筛选药物具有抑制tau蛋白的表达和聚集作用；若实验组含有荧光且荧光强度与对照组的荧光强度相等，则判定所述待筛选药物不具有抑制tau蛋白的表达和聚集作用；若实验组不含有荧光，则判定所述待筛选药物具有很强的抑制tau蛋白表达的作用。
综上所述，本发明提供一种稳定表达mCherry-tau的细胞系的构建方法，通过将所述含有mCherry-tau基因的慢病毒颗粒感染HEK293细胞，之后采用含有嘌呤霉素的培养基对所述慢病毒颗粒感染的HEK293细胞进行抗性筛选，获得稳定表达mCherry-tau的细胞系。利用本发明构建的细胞系可用以筛选阻断tau表达和聚集的化合物，为开发抑制tau蛋白的表达、聚集、扩散和蔓延，从而治疗AD的药物，提供了一个筛选工具和平台。
应当理解的是，本发明的应用不限于上述的举例，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。
序列表
<110> 深圳大学
<120> 一种稳定表达mCherry-tau的细胞系及其构建方法与应用
<160> 7
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(rengongxulie)
<400> 1
gacgagctgt acaagatggc tgagccccgc 30
<210> 2
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列(rengongxulie)
<400> 2
cggttcagtc agtcacaaac cctgcttggc cagg 34
<210> 3
<211> 1323
<212> DNA
<213> 人工序列(rengongxulie)
<400> 3
atggctgagc cccgccagga gttcgaagtg atggaagatc acgctgggac gtacgggttg 60
ggggacagga aagatcaggg gggctacacc atgcaccaag accaagaggg tgacacggac 120
gctggcctga aagaatctcc cctgcagacc cccactgagg acggatctga ggaaccgggc 180
tctgaaacct ctgatgctaa gagcactcca acagcggaag atgtgacagc acccttagtg 240
gatgagggag ctcccggcaa gcaggctgcc gcgcagcccc acacggagat cccagaagga 300
accacagctg aagaagcagg cattggagac acccccagcc tggaagacga agctgctggt 360
cacgtgaccc aagctcgcat ggtcagtaaa agcaaagacg ggactggaag cgatgacaaa 420
aaagccaagg gggctgatgg taaaacgaag atcgccacac cgcggggagc agcccctcca 480
ggccagaagg gccaggccaa cgccaccagg attccagcaa aaaccccgcc cgctccaaag 540
acaccaccca gctctggtga acctccaaaa tcaggggatc gcagcggcta cagcagcccc 600
ggctccccag gcactcccgg cagccgctcc cgcaccccgt cccttccaac cccacccacc 660
cgggagccca agaaggtggc agtggtccgt actccaccca agtcgccgtc ttccgccaag 720
agccgcctgc agacagcccc cgtgcccatg ccagacctga agaatgtcaa gtccaagatc 780
ggctccactg agaacctgaa gcaccagccg ggaggcggga aggtgcagat aattaataag 840
aagctggatc ttagcaacgt ccagtccaag tgtggctcaa aggataatat caaacacgtc 900
ccgggaggcg gcagtgtgca aatagtctac aaaccagttg acctgagcaa ggtgacctcc 960
aagtgtggct cattaggcaa catccatcat aaaccaggag gtggccaggt ggaagtaaaa 1020
tctgagaagc ttgacttcaa ggacagagtc cagtcgaaga ttgggtccct ggacaatatc 1080
acccacgtcc ctggcggagg aaataaaaag attgaaaccc acaagctgac cttccgcgag 1140
aacgccaaag ccaagacaga ccacggggcg gagatcgtgt acaagtcgcc agtggtgtct 1200
ggggacacgt ctccacggca tctcagcaat gtctcctcca ccggcagcat cgacatggta 1260
gactcgcccc agctcgccac gctagctgac gaggtgtctg cctccctggc caagcagggt 1320
ttg 1323
<210> 4
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列(rengongxulie)
<400> 4
tgactgactg aaccggatct agataactga tcataatt 38
<210> 5
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(rengongxulie)
<400> 5
cttgtacagc tcgtccatgc c 21
<210> 6
<211> 8712
<212> DNA
<213> 人工序列(rengongxulie)
<400> 6
accggatcta gataactgat cataattcta ccgggtaggg gaggcgcttt tcccaaggca 60
gtctggagca tgcgctttag cagccccgct gggcacttgg cgctacacaa gtggcctctg 120
gcctcgcaca cattccacat ccaccggtag gcgccaaccg gctccgttct ttggtggccc 180
cttcgcgcca ccttctactc ctcccctagt caggaagttc ccccccgccc cgcagctcgc 240
gtcgtgcagg acgtgacaaa tggaagtagc acgtctcact agtctcgtgc agatggacag 300
caccgctgag caatggaagc gggtaggcct ttggggcagc ggccaatagc agctttgctc 360
cttcgctttc tgggctcaga ggctgggaag gggtgggtcc gggggcgggc tcaggggcgg 420
gctcaggggc ggggcgggcg cccgaaggtc ctccggaggc ccggcattct gcacgcttca 480
aaagcgcacg tctgccgcgc tgttctcctc ttcctcatct ccgggccttt cgacctgcag 540
cccaagctta ccatgaccga gtacaagccc acggtgcgcc tcgccacccg cgacgacgtc 600
cccagggccg tacgcaccct cgccgccgcg ttcgccgact accccgccac gcgccacacc 660
gtcgatccgg accgccacat cgagcgggtc accgagctgc aagaactctt cctcacgcgc 720
gtcgggctcg acatcggcaa ggtgtgggtc gcggacgacg gcgccgcggt ggcggtctgg 780
accacgccgg agagcgtcga agcgggggcg gtgttcgccg agatcggccc gcgcatggcc 840
gagttgagcg gttcccggct ggccgcgcag caacagatgg aaggcctcct ggcgccgcac 900
cggcccaagg agcccgcgtg gttcctggcc accgtcggcg tctcgcccga ccaccagggc 960
aagggtctgg gcagcgccgt cgtgctcccc ggagtggagg cggccgagcg cgccggggtg 1020
cccgccttcc tggagacctc cgcgccccgc aacctcccct tctacgagcg gctcggcttc 1080
accgtcaccg ccgacgtcga ggtgcccgaa ggaccgcgca cctggtgcat gacccgcaag 1140
cccggtgcct gaccgcgtct ggaacaatca acctctggat tacaaaattt gtgaaagatt 1200
gactggtatt cttaactatg ttgctccttt tacgctatgt ggatacgctg ctttaatgcc 1260
tttgtatcat gctattgctt cccgtatggc tttcattttc tcctccttgt ataaatcctg 1320
gttgctgtct ctttatgagg agttgtggcc cgttgtcagg caacgtggcg tggtgtgcac 1380
tgtgtttgct gacgcaaccc ccactggttg gggcattgcc accacctgtc agctcctttc 1440
cgggactttc gctttccccc tccctattgc cacggcggaa ctcatcgccg cctgccttgc 1500
ccgctgctgg acaggggctc ggctgttggg cactgacaat tccgtggtgt tgtcggggaa 1560
gctgacgtcc tttccatggc tgctcgcctg tgttgccacc tggattctgc gcgggacgtc 1620
cttctgctac gtcccttcgg ccctcaatcc agcggacctt ccttcccgcg gcctgctgcc 1680
ggctctgcgg cctcttccgc gtcttcgcct tcgccctcag acgagtcgga tctccctttg 1740
ggccgcctcc ccgcctggaa ttaattctgc agtcgagacc tagaaaaaca tggagcaatc 1800
acaagtagca atacagcagc taccaatgct gattgtgcct ggctagaagc acaagaggag 1860
gaggaggtgg gttttccagt cacacctcag gtacctttaa gaccaatgac ttacaaggca 1920
gctgtagatc ttagccactt tttaaaagaa aagaggggac tggaagggct aattcactcc 1980
caacgaagac aagatatcct tgatctgtgg atctaccaca cacaaggcta cttccctgat 2040
tagcagaact acacaccagg gccaggggtc agatatccac tgacctttgg atggtgctac 2100
aagctagtac cagttgagcc agataaggta gaagaggcca ataaaggaga gaacaccagc 2160
ttgttacacc ctgtgagcct gcatgggatg gatgacccgg agagagaagt gttagagtgg 2220
aggtttgaca gccgcctagc atttcatcac gtggcccgag agctgcatcc ggagtacttc 2280
aagaactgct gatatcgagc ttgctacaag ggactttccg ctggggactt tccagggagg 2340
cgtggcctgg gcgggactgg ggagtggcga gccctcagat cctgcatata agcagctgct 2400
ttttgcctgt actgggtctc tctggttaga ccagatctga gcctgggagc tctctggcta 2460
actagggaac ccactgctta agcctcaata aagcttgcct tgagtgcttc aagtagtgtg 2520
tgcccgtctg ttgtgtgact ctggtaacta gagatccctc agaccctttt agtcagtgtg 2580
gaaaatctct agcagtagta gttcatgtca tcttattatt cagtatttat aacttgcaaa 2640
gaaatgaata tcagagagtg agaggccttg acattgctag cgttttaccg tcgacctcta 2700
gctagagctt ggcgtaatca tggtcatagc tgtttcctgt gtgaaattgt tatccgctca 2760
caattccaca caacatacga gccggaagca taaagtgtaa agcctggggt gcctaatgag 2820
tgagctaact cacattaatt gcgttgcgct cactgcccgc tttccagtcg ggaaacctgt 2880
cgtgccagct gcattaatga atcggccaac gcgcggggag aggcggtttg cgtattgggc 2940
gctcttccgc ttcctcgctc actgactcgc tgcgctcggt cgttcggctg cggcgagcgg 3000
tatcagctca ctcaaaggcg gtaatacggt tatccacaga atcaggggat aacgcaggaa 3060
agaacatgtg agcaaaaggc cagcaaaagg ccaggaaccg taaaaaggcc gcgttgctgg 3120
cgtttttcca taggctccgc ccccctgacg agcatcacaa aaatcgacgc tcaagtcaga 3180
ggtggcgaaa cccgacagga ctataaagat accaggcgtt tccccctgga agctccctcg 3240
tgcgctctcc tgttccgacc ctgccgctta ccggatacct gtccgccttt ctcccttcgg 3300
gaagcgtggc gctttctcat agctcacgct gtaggtatct cagttcggtg taggtcgttc 3360
gctccaagct gggctgtgtg cacgaacccc ccgttcagcc cgaccgctgc gccttatccg 3420
gtaactatcg tcttgagtcc aacccggtaa gacacgactt atcgccactg gcagcagcca 3480
ctggtaacag gattagcaga gcgaggtatg taggcggtgc tacagagttc ttgaagtggt 3540
ggcctaacta cggctacact agaagaacag tatttggtat ctgcgctctg ctgaagccag 3600
ttaccttcgg aaaaagagtt ggtagctctt gatccggcaa acaaaccacc gctggtagcg 3660
gtggtttttt tgtttgcaag cagcagatta cgcgcagaaa aaaaggatct caagaagatc 3720
ctttgatctt ttctacgggg tctgacgctc agtggaacga aaactcacgt taagggattt 3780
tggtcatgag attatcaaaa aggatcttca cctagatcct tttaaattaa aaatgaagtt 3840
ttaaatcaat ctaaagtata tatgagtaaa cttggtctga cagttaccaa tgcttaatca 3900
gtgaggcacc tatctcagcg atctgtctat ttcgttcatc catagttgcc tgactccccg 3960
tcgtgtagat aactacgata cgggagggct taccatctgg ccccagtgct gcaatgatac 4020
cgcgagaccc acgctcaccg gctccagatt tatcagcaat aaaccagcca gccggaaggg 4080
ccgagcgcag aagtggtcct gcaactttat ccgcctccat ccagtctatt aattgttgcc 4140
gggaagctag agtaagtagt tcgccagtta atagtttgcg caacgttgtt gccattgcta 4200
caggcatcgt ggtgtcacgc tcgtcgtttg gtatggcttc attcagctcc ggttcccaac 4260
gatcaaggcg agttacatga tcccccatgt tgtgcaaaaa agcggttagc tccttcggtc 4320
ctccgatcgt tgtcagaagt aagttggccg cagtgttatc actcatggtt atggcagcac 4380
tgcataattc tcttactgtc atgccatccg taagatgctt ttctgtgact ggtgagtact 4440
caaccaagtc attctgagaa tagtgtatgc ggcgaccgag ttgctcttgc ccggcgtcaa 4500
tacgggataa taccgcgcca catagcagaa ctttaaaagt gctcatcatt ggaaaacgtt 4560
cttcggggcg aaaactctca aggatcttac cgctgttgag atccagttcg atgtaaccca 4620
ctcgtgcacc caactgatct tcagcatctt ttactttcac cagcgtttct gggtgagcaa 4680
aaacaggaag gcaaaatgcc gcaaaaaagg gaataagggc gacacggaaa tgttgaatac 4740
tcatactctt cctttttcaa tattattgaa gcatttatca gggttattgt ctcatgagcg 4800
gatacatatt tgaatgtatt tagaaaaata aacaaatagg ggttccgcgc acatttcccc 4860
gaaaagtgcc acctgacgtc gacggatcgg gagatcaact tgtttattgc agcttataat 4920
ggttacaaat aaagcaatag catcacaaat ttcacaaata aagcattttt ttcactgcat 4980
tctagttgtg gtttgtccaa actcatcaat gtatcttatc atgtctggat caactggata 5040
actcaagcta accaaaatca tcccaaactt cccaccccat accctattac cactgccaat 5100
tacctgtggt ttcatttact ctaaacctgt gattcctctg aattattttc attttaaaga 5160
aattgtattt gttaaatatg tactacaaac ttagtagttg gaagggctaa ttcactccca 5220
aagaagacaa gatatccttg atctgtggat ctaccacaca caaggctact tccctgatta 5280
gcagaactac acaccagggc caggggtcag atatccactg acctttggat ggtgctacaa 5340
gctagtacca gttgagccag ataaggtaga agaggccaat aaaggagaga acaccagctt 5400
gttacaccct gtgagcctgc atgggatgga tgacccggag agagaagtgt tagagtggag 5460
gtttgacagc cgcctagcat ttcatcacgt ggcccgagag ctgcatccgg agtacttcaa 5520
gaactgctga tatcgagctt gctacaaggg actttccgct ggggactttc cagggaggcg 5580
tggcctgggc gggactgggg agtggcgagc cctcagatcc tgcatataag cagctgcttt 5640
ttgcctgtac tgggtctctc tggttagacc agatctgagc ctgggagctc tctggctaac 5700
tagggaaccc actgcttaag cctcaataaa gcttgccttg agtgcttcaa gtagtgtgtg 5760
cccgtctgtt gtgtgactct ggtaactaga gatccctcag acccttttag tcagtgtgga 5820
aaatctctag cagtggcgcc cgaacaggga cttgaaagcg aaagggaaac cagaggagct 5880
ctctcgacgc aggactcggc ttgctgaagc gcgcacggca agaggcgagg ggcggcgact 5940
ggtgagtacg ccaaaaattt tgactagcgg aggctagaag gagagagatg ggtgcgagag 6000
cgtcagtatt aagcggggga gaattagatc gcgatgggaa aaaattcggt taaggccagg 6060
gggaaagaaa aaatataaat taaaacatat agtatgggca agcagggagc tagaacgatt 6120
cgcagttaat cctggcctgt tagaaacatc agaaggctgt agacaaatac tgggacagct 6180
acaaccatcc cttcagacag gatcagaaga acttagatca ttatataata cagtagcaac 6240
cctctattgt gtgcatcaaa ggatagagat aaaagacacc aaggaagctt tagacaagat 6300
agaggaagag caaaacaaaa gtaagaccac cgcacagcaa gcggccggcc gctgatcttc 6360
agacctggag gaggagatat gagggacaat tggagaagtg aattatataa atataaagta 6420
gtaaaaattg aaccattagg agtagcaccc accaaggcaa agagaagagt ggtgcagaga 6480
gaaaaaagag cagtgggaat aggagctttg ttccttgggt tcttgggagc agcaggaagc 6540
actatgggcg cagcgtcaat gacgctgacg gtacaggcca gacaattatt gtctggtata 6600
gtgcagcagc agaacaattt gctgagggct attgaggcgc aacagcatct gttgcaactc 6660
acagtctggg gcatcaagca gctccaggca agaatcctgg ctgtggaaag atacctaaag 6720
gatcaacagc tcctggggat ttggggttgc tctggaaaac tcatttgcac cactgctgtg 6780
ccttggaatg ctagttggag taataaatct ctggaacaga tttggaatca cacgacctgg 6840
atggagtggg acagagaaat taacaattac acaagcttaa tacactcctt aattgaagaa 6900
tcgcaaaacc agcaagaaaa gaatgaacaa gaattattgg aattagataa atgggcaagt 6960
ttgtggaatt ggtttaacat aacaaattgg ctgtggtata taaaattatt cataatgata 7020
gtaggaggct tggtaggttt aagaatagtt tttgctgtac tttctatagt gaatagagtt 7080
aggcagggat attcaccatt atcgtttcag acccacctcc caaccccgag gggacccgac 7140
aggcccgaag gaatagaaga agaaggtgga gagagagaca gagacagatc cattcgatta 7200
gtgaacggat ctcgacggta tcgcctttaa aagaaaaggg gggattgggg ggtacagtgc 7260
aggggaaaga atagtagaca taatagcaac agacatacaa actaaagaat tacaaaaaca 7320
aattacaaaa attcaaaatt ttcgggttta ttacagggac agcagagatc cagtttatcg 7380
ataagcttgg gagttccgcg ttacataact tacggtaaat ggcccgcctg gctgaccgcc 7440
caacgacccc cgcccattga cgtcaataat gacgtatgtt cccatagtaa cgccaatagg 7500
gactttccat tgacgtcaat gggtggagta tttacggtaa actgcccact tggcagtaca 7560
tcaagtgtat catatgccaa gtacgccccc tattgacgtc aatgacggta aatggcccgc 7620
ctggcattat gcccagtaca tgaccttatg ggactttcct acttggcagt acatctacgt 7680
attagtcatc gctattacca tggtgatgcg gttttggcag tacatcaatg ggcgtggata 7740
gcggtttgac tcacggggat ttccaagtct ccaccccatt gacgtcaatg ggagtttgtt 7800
ttggcaccaa aatcaacggg actttccaaa atgtcgtaac aactccgccc cattgacgca 7860
aatgggcggt aggcgtgtac ggtgggaggt ctatataagc agagctcgtt tagtgaaccg 7920
tcagatcgcc tggagacgcc atccacgctg ttttgacctc catagaagac accgactcta 7980
ctagaggatc taccggtcgc caccatggtg agcaagggcg aggaggataa catggccatc 8040
atcaaggagt tcatgcgctt caaggtgcac atggagggct ccgtgaacgg ccacgagttc 8100
gagatcgagg gcgagggcga gggccgcccc tacgagggca cccagaccgc caagctgaag 8160
gtgaccaagg gtggccccct gcccttcgcc tgggacatcc tgtcccctca gttcatgtac 8220
ggctccaagg cctacgtgaa gcaccccgcc gacatccccg actacttgaa gctgtccttc 8280
cccgagggct tcaagtggga gcgcgtgatg aacttcgagg acggcggcgt ggtgaccgtg 8340
acccaggact cctccctgca ggacggcgag ttcatctaca aggtgaagct gcgcggcacc 8400
aacttcccct ccgacggccc cgtaatgcag aagaagacca tgggctggga ggcctcctcc 8460
gagcggatgt accccgagga cggcgccctg aagggcgaga tcaagcagag gctgaagctg 8520
aaggacggcg gccactacga cgctgaggtc aagaccacct acaaggccaa gaagcccgtg 8580
cagctgcccg gcgcctacaa cgtcaacatc aagttggaca tcacctccca caacgaggac 8640
tacaccatcg tggaacagta cgaacgcgcc gagggccgcc actccaccgg cggcatggac 8700
gagctgtaca ag 8712
<210> 7
<211> 2031
<212> DNA
<213> 人工序列(rengongxulie)
<400> 7
atggtgagca agggcgagga ggataacatg gccatcatca aggagttcat gcgcttcaag 60
gtgcacatgg agggctccgt gaacggccac gagttcgaga tcgagggcga gggcgagggc 120
cgcccctacg agggcaccca gaccgccaag ctgaaggtga ccaagggtgg ccccctgccc 180
ttcgcctggg acatcctgtc ccctcagttc atgtacggct ccaaggccta cgtgaagcac 240
cccgccgaca tccccgacta cttgaagctg tccttccccg agggcttcaa gtgggagcgc 300
gtgatgaact tcgaggacgg cggcgtggtg accgtgaccc aggactcctc cctgcaggac 360
ggcgagttca tctacaaggt gaagctgcgc ggcaccaact tcccctccga cggccccgta 420
atgcagaaga agaccatggg ctgggaggcc tcctccgagc ggatgtaccc cgaggacggc 480
gccctgaagg gcgagatcaa gcagaggctg aagctgaagg acggcggcca ctacgacgct 540
gaggtcaaga ccacctacaa ggccaagaag cccgtgcagc tgcccggcgc ctacaacgtc 600
aacatcaagt tggacatcac ctcccacaac gaggactaca ccatcgtgga acagtacgaa 660
cgcgccgagg gccgccactc caccggcggc atggacgagc tgtacaagat ggctgagccc 720
cgccaggagt tcgaagtgat ggaagatcac gctgggacgt acgggttggg ggacaggaaa 780
gatcaggggg gctacaccat gcaccaagac caagagggtg acacggacgc tggcctgaaa 840
gaatctcccc tgcagacccc cactgaggac ggatctgagg aaccgggctc tgaaacctct 900
gatgctaaga gcactccaac agcggaagat gtgacagcac ccttagtgga tgagggagct 960
cccggcaagc aggctgccgc gcagccccac acggagatcc cagaaggaac cacagctgaa 1020
gaagcaggca ttggagacac ccccagcctg gaagacgaag ctgctggtca cgtgacccaa 1080
gctcgcatgg tcagtaaaag caaagacggg actggaagcg atgacaaaaa agccaagggg 1140
gctgatggta aaacgaagat cgccacaccg cggggagcag cccctccagg ccagaagggc 1200
caggccaacg ccaccaggat tccagcaaaa accccgcccg ctccaaagac accacccagc 1260
tctggtgaac ctccaaaatc aggggatcgc agcggctaca gcagccccgg ctccccaggc 1320
actcccggca gccgctcccg caccccgtcc cttccaaccc cacccacccg ggagcccaag 1380
aaggtggcag tggtccgtac tccacccaag tcgccgtctt ccgccaagag ccgcctgcag 1440
acagcccccg tgcccatgcc agacctgaag aatgtcaagt ccaagatcgg ctccactgag 1500
aacctgaagc accagccggg aggcgggaag gtgcagataa ttaataagaa gctggatctt 1560
agcaacgtcc agtccaagtg tggctcaaag gataatatca aacacgtccc gggaggcggc 1620
agtgtgcaaa tagtctacaa accagttgac ctgagcaagg tgacctccaa gtgtggctca 1680
ttaggcaaca tccatcataa accaggaggt ggccaggtgg aagtaaaatc tgagaagctt 1740
gacttcaagg acagagtcca gtcgaagatt gggtccctgg acaatatcac ccacgtccct 1800
ggcggaggaa ataaaaagat tgaaacccac aagctgacct tccgcgagaa cgccaaagcc 1860
aagacagacc acggggcgga gatcgtgtac aagtcgccag tggtgtctgg ggacacgtct 1920
ccacggcatc tcagcaatgt ctcctccacc ggcagcatcg acatggtaga ctcgccccag 1980
ctcgccacgc tagctgacga ggtgtctgcc tccctggcca agcagggttt g 2031
Claims (8)
1.一种稳定表达mCherry-tau的细胞系的构建方法，其特征在于，包括步骤：
对tau基因片段和pLVX-mcherry载体进行同源重组，获得重组质粒pLVX-mCherry-tau；
将所述重组质粒pLVX-mCherry-tau与psPAX2以及pMD2.G混合并转染至HEK293T细胞中，培养预定时间后，获得含有mCherry-tau基因的慢病毒颗粒；
将所述含有mCherry-tau基因的慢病毒颗粒感染HEK293细胞，之后采用含有嘌呤霉素的培养基对所述慢病毒颗粒感染的HEK293细胞进行抗性筛选，获得稳定表达mCherry-tau的细胞系。
2.根据权利要求1所述稳定表达mCherry-tau的细胞系的构建方法，其特征在于，所述tau基因片段的制备包括以下步骤：
提取人源肾细胞系HEK293细胞中的RNA，并将所述RNA反转录为cDNA，采用正向引物5‘-gacgagctgtacaagatggctgagccccgc-3’以及反向引物5‘-cggttcagtcagtcacaaaccctgcttggccagg-3’对所述cDNA进行PCR扩增，制得PCR产物；
对所述PCR产物进行电泳纯化处理，得到纯化的tau基因片段。
3.根据权利要求1所述稳定表达mCherry-tau的细胞系的构建方法，其特征在于，所述对tau基因片段和pLVX-mcherry载体进行同源重组，获得重组质粒pLVX-mCherry-tau的步骤包括：
采用非连接酶依赖型单片段快速克隆试剂盒对tau基因片段和pLVX-mcherry载体进行同源重组，制得重组产物；
将所述重组产物转化至大肠杆菌中，在含有氨苄青霉素抗性的平板上培养所述大肠杆菌，通过测序选取含有重组产物的大肠杆菌；
对所述含有重组产物的大肠杆菌进行培养并提取质粒，即获得重组质粒pLVX-mCherry-tau。
4.根据权利要求1所述稳定表达mCherry-tau的细胞系的构建方法，其特征在于，所述HEK293T细胞的融合度为70-80%。
5.一种稳定表达mCherry-tau的细胞系，其特征在于，所述细胞系为转入了融合基因mCherry-tau的细胞，所述融合基因mCherry-tau的序列为SEQ ID NO.7核苷酸序列。
6.一种稳定表达mCherry-tau的细胞系的应用，其特征在于，将权利要求5所述稳定表达mCherry-tau的细胞系应用于筛选抗阿尔茨海默症的药物。
7.一种稳定表达mCherry-tau的细胞系的应用，其特征在于，将权利要求5所述稳定表达mCherry-tau的细胞系应用于筛选抑制tau蛋白表达和聚集的药物。
8.根据权利要求7所述稳定表达mCherry-tau的细胞系的应用，其特征在于，将稳定表达mCherry-tau的细胞系应用于筛选抑制tau蛋白表达和聚集的药物的步骤包括：
将待筛选药物加入到培养液中对所述稳定表达mCherry-tau的细胞系进行培养；
在培养预定时间后，通过检测培养液的荧光强度判断所述待筛选药物是否抑制tau蛋白的表达和聚集。
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