CN112980799B - 一种构建klf12高表达小鼠的方法及在构建非叶酸依赖的神经管缺陷小鼠模型的应用 - Google Patents

一种构建klf12高表达小鼠的方法及在构建非叶酸依赖的神经管缺陷小鼠模型的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种构建KLF12高表达小鼠的方法及在构建非叶酸依赖的神经管缺陷(neural tube defects,NTDs)小鼠模型的应用，其包括根据Klf12基因序列，利用Cre‑loxP基因重组技术，构建Rosa26Klf12/Klf12小鼠；将所述Rosa26Klf12/Klf12小鼠与SoxCre雌鼠交配，获得的KLF12高表达胚胎即为非叶酸依赖的神经管缺陷小鼠模型，该小鼠模型可以应用在筛选治疗候选药物、保健品的制备或研发中。本发明首次构建高水平KLF12所致非叶酸依赖的NTDs动物模型，该模型与人类非叶酸依赖的NTDs患者类似，具有很好的临床症状模拟性，稳定性高，十分利于进行机理研究和药物筛选。

Description

一种构建KLF12高表达小鼠的方法及在构建非叶酸依赖的神 经管缺陷小鼠模型的应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及一种构建Krüppel-like factor 12(KLF12)高表达小鼠的方法及在构建非叶酸依赖的神经管缺陷小鼠模型的应用。
背景技术
神经管缺陷(neural tube defects,NTDs)是一种常见的胎儿严重畸形，因妊娠前四周神经管未能完全闭合所致。根据解剖学特点，NTDs主要分为无脑儿、脊膨出、脑膨出和脊柱裂等类型。人们已经证实，叶酸能够参与DNA修复、核苷酸合成和甲基化反应等生物学过程，其缺乏是造成NTDs的主要原因之一。得益于叶酸服用的普及，我国 NTDs发生率由1996年的13.6/万，下降至2011年的4.5/万。虽然成效显著，但由于我国人口基数大，每年新增NTDs总例数仍然庞大，这些补充叶酸仍不能避免发生的NTDs 病例给家庭和社会造成了严重负担，是全面实现“健康中国”亟待解决的问题之一，有待进一步研究。因此，为了针对非叶酸依赖的NTDs实施有效的诊断及治疗，开发用于非叶酸依赖的NTDs的机理研究与治疗方法研究的生物样本，也就需要合适的动物模型。
Cre-LoxP系统是由一个单一的Cre重组酶和被称为LoxP序列的靶向基因敲除序列组成。Cre重组酶有70％的重组效率，不借助任何辅助因子，可作用于多种结构的DNA 底物，如线形、环状甚至超螺旋DNA。它是一种位点特异性重组酶，能介导两个LoxP 位点(序列)之间的特异性重组，使LoxP位点间的基因序列被删除或重组。Cre-LoxP重组系统可用于分析转基因动物模型的表型和基因型之间的关系，Cre重组酶可以识别LoxP序列，通过DNA重组的原理，可以将两个LoxP序列之间的片段 去除。如果没有Cre，LoxP只是在特定的基因片段两侧，不影响基因片段的活性。一旦Cre酶有活性，就可以把LoxP中间所夹的序列去除，即条件性基因敲除。Cre重组酶介导两个LoxP位点间的重组是一个动态、可逆的过程，可以分成三种情况：
1、如果两个LoxP位点位于一条DNA链上，且方向相同，Cre重组酶能有效切除两个LoxP位点间的序列；
2、如果两个LoxP位点位于一条DNA链上，但方向相反，Cre重组酶能导致两个 LoxP位点间的序列倒位；
3、如果两个LoxP位点分别位于两条不同的DNA链或染色体上，Cre酶能介导两条DNA链的交换或染色体易位。
但目前现有技术中对于非叶酸依赖的NTDs动物模型的开发和选择还比较少，且效果不够稳定，因此开发一种具有较高临床症状模拟性且较为稳定的非叶酸依赖的NTDs 动物模型对筛选候选药物具有重要的意义。
发明内容
发明目的：目前利用高温、高糖或维甲酸等诱导NTDs小鼠模型的方法成功率均不够稳定，为了克服现有技术中存在的不足，本发明提供一种建立非叶酸依赖的神经管缺陷小鼠模型的方法及应用，目的在于对于KLF12高表达的胚胎，该胚胎能够100％出现非叶酸依赖的NTDs表型，可为进一步进行机理研究和药物筛选提供稳定的模型。
技术方案：为实现上述目的，本发明提供一种构建Klf12基因高表达小鼠的方法，其为根据Klf12基因序列，利用Cre-loxP基因重组技术，构建Rosa26Klf12/Klf12小鼠，包括如下步骤，(1)根据Klf12基因，构建打靶载体，所述打靶载体的序列如SEQ ID NO.1 所示；(2)ES细胞筛选：复苏MEFs，制作Feeder，复苏ES并传代，用所述打靶载体进行电转，加抗生素筛选后培养，筛选3’和5’端均阳性的克隆细胞；(3)囊胚注射：体外培养2.5d的胚胎，囊胚注射步骤(2)中筛选的3’和5’端均阳性的克隆细胞至胚胎内，体外培养后移植到假孕雌鼠体内，至嵌合鼠诞生作为Funder鼠配种繁殖，通过基因型鉴定可得Rosa26Klf12/Klf12小鼠。
优选的，使用的序列还包括如SEQ ID NO.9～SEQ ID NO.21所示序列中的一种或几种。
优选的，所述构建打靶载体，其步骤为，根据Klf12基因，获得线性化套取载体，电转BAC到EL350中，用所述线性化套取载体进行套取；插入1st LoxP site，进行PCR 和酶切鉴定，获得第一纯化质粒；利用Cre/LoxP删除neo；插入2nd LoxP site，进行PCR 和酶切鉴定，获得第二纯化质粒，继续进行PCR和酶切鉴定，线性化后得到打靶载体。
本发明还提供一种非叶酸依赖的神经管缺陷小鼠模型的构建序列，其包括如SEQID NO.1、SEQ ID NO.9～SEQ ID NO.21所示序列中的一种或几种。
本发明还提供一种非叶酸依赖的神经管缺陷小鼠模型的构建序列的试剂盒。
本发明还提供一种非叶酸依赖的神经管缺陷小鼠模型的构建方法，其包括如下步骤，将Rosa26Klf12/Klf12小鼠与Sox2Cre雌鼠交配，获得的KLF12高表达胚胎即为非叶酸依赖的神经管缺陷小鼠模型。
优选的，所述雌鼠为Sox2Cre。
本发明还提供一种非叶酸依赖的神经管缺陷小鼠模型的应用，其为在筛选治疗候选药物、保健品中的应用。
有益效果：
本发明利用Cre/LoxP系统首次构建了Rosa26Klf12/Klf12小鼠，并利用该小鼠构建高水平KLF12所致非叶酸依赖的NTDs动物模型，该模型与人类非叶酸依赖的NTDs患者类似，具有很好的临床症状模拟性，利于进行机理研究和药物筛选。
附图说明
图1小鼠构件策略图，其中图(1)为Rosa26Klf12/Klf12小鼠构建策略，图(2)为获得全身性KLF12高表达小鼠配种繁殖策略。
图2为高水平KLF12导致NTDs表型。其中图A-B为免疫荧光检测野生型(wild type，WT)与KLF12高表达囊胚KLF12蛋白水平，比例尺：20μm；图C为3.5dpc KLF12 高表达囊胚计数；图D-E为4.5dpc Blue Dye反应显示WT与KLF12高表达胚胎种植位点，图中“▲”所示为种植位点，比例尺：1cm；图F-G为4.5dpc WT与KLF12高表达胚胎种植位点HE染色，“*”所示为胚胎，比例尺：100μm；图H-I为7.5dpc WT与KLF12 高表达胚胎种植位点，比例尺：1cm；图J-K为7.5dpc WT与KLF12高表达胚胎种植位点HE染色，“*”所示为胚胎，比例尺：500μm；图L-M为8.5dpc WT与KLF12高表达小鼠胚胎，比例尺：1mm；图N-O为9.0dpc WT与KLF12高表达小鼠胚胎，比例尺： 1mm；图P-Q为9.5dpc WT与KLF12高表达小鼠胚胎，比例尺：1mm。
图3为高水平KLF12致神经管发育标志分子表达异常，其中图A为9.5dpc WT与KLF12高表达小鼠胚胎HE染色，比例尺：500μm；图B为免疫荧光染色检测9.5dpc WT 与KLF12高表达胎鼠神经上皮细胞ARL13B和NKX2.2表达，比例尺：50μm；图C为免疫荧光染色检测9.5dpc WT与KLF12高表达胎鼠神经上皮细胞FOXA2和NKX6.1 表达，比例尺：50μm；图D为免疫荧光染色检测9.5dpc WT与KLF12高表达胎鼠神经上皮细胞KI67表达，比例尺：50μm；图E为TUNEL法检测9.5dpc WT与KLF12高表达胎鼠神经上皮细胞凋亡状态，比例尺：100μm。
图4为叶酸相关药物不能挽救高水平KLF12所致NTDs表型结果图，可见叶酸和甲酸钙对高水平KLF12所致神经管缺陷表型的改善无明显效果，比例尺：1mm。
图5为3’端筛选检测结果图。
图6为5’端筛选检测结果图。
图7为Southern鉴定分析结果。
图8为基因鉴定结果图。
图9为终载体图谱。
图10为酶切鉴定结果图。
图11为实施例2中KLF12高表达胎鼠基因型鉴定的凝胶成像图。
具体实施方式
下面结合附图对本发明作更进一步的说明。
本发明涉及的材料和试剂来源：
1)实验动物：Rosa26Klf12/Klf12小鼠由南京大学生物医药研究所协助构建；Sox2Cre工具鼠购买于南京大学-生物医药研究所；C57BL/6小鼠购买于南京医科大学。小鼠饲养条件：黑暗19:00-07:00，光照07:00-19:00，温度：22-24℃，湿度40％-70％。
2)抗体与试剂：KLF12抗体购买于Santa Cruz公司，货号sc84347；ARL13B抗体购买于Proteintech公司，货号17711-1-AP；FOXA2抗体购买于Seven Hills Bioreagents公司，货号WRAB-FOXA2；NKX2.2抗体购买于Developmental Studies Hybridoma Bank公司，货号74.5A5；NKX6.1抗体购买于Developmental Studies Hybridoma Bank公司，货号 F55A10；反转录试剂盒购买于TAKARA公司，货号RR047A；叶酸购买于Sigma-Aldrich 公司，货号F8758；甲酸钙购买于Sigma-Aldrich公司，货号21134。
实施例1：构建Rosa26Klf12/Klf12小鼠
从Ensembl数据库中(http://www.ensembl.org/index.html)获得KLF12基因组序列，利用Cre-loxP基因重组技术，构建Rosa26Klf12/Klf12小鼠，包括如下步骤，
1、根据Klf12基因，构建打靶载体，所述打靶载体的序列如SEQ ID NO.1所示；具体为，根据Klf12基因，设计引物构建线性化套取载体，电转(245V，500μF)BAC 到EL350中，用线性化套取载体进行套取；插入1st LoxP site，进行PCR和酶切鉴定，获得第一纯化质粒；利用Cre/LoxP删除neo；插入2nd LoxP site，进行PCR和酶切鉴定，获得第二纯化质粒，继续进行PCR和酶切鉴定，线性化后得到打靶载体。图9为最终载体图谱。
(1)终载体PCR结果：引物为FUS-TF:TCCAAACTCATCAATGTATC，SEQ ID NO.2；KLF12-CDS-R:TCCTCCCATCCTCCAGGAGC，SEQ ID NO.3；产物:765bp。
(2)终载体酶切结果和线性化结果：
Apa1:11871bp/3426bp/1532bp
ApaL1:12941bp/2642bp/1246bp
EcoRV:11975bp/4378bp/476bp
DL2000:2000bp,1000bp,750bp,500bp,250bp,100bp
M(Mark T14):19329bp，7743bp，6223bp，4254bp，3472bp，2690bp，1882bp，1489bp，925bp，421bp，74bp。
(3)终载体EL350 pop out tested
EL350pop out鉴定引物：KLF12-EGFP-TF:TTCGGCTTCTGGCGTGTGAC，SEQ ID NO.4，KLF12-CDS-R:TCCTCCCATCCTCCAGGAGC，SEQ ID NO.5。
产物Product:858bp
终载体:4084bp
酶切鉴定：
Apa1:8645bp/3426bp/1532bp
ApaL1:9715bp/2642bp/1246bp
EcoR1:7403bp/4378bp/1822
DL2000:2000bp,1000bp,750bp,500bp,250bp,100bp
M(Mark T14):19329bp，7743bp，6223bp，4254bp，3472bp，2690bp，1882bp，1489bp，925bp，421bp，74bp。上述鉴定结果见图10。
(4)终载体测序
再对EGFP、CDS进行测序，其中EGFP测序引物KLF12-EGFP-TF:TTCGGCTTCTGGCGTGTGAC,SEQ ID NO.6；CDS测序引物KLF12-SQ-F: CCTGTGGTGGTACAGTCAGT，SEQ ID NO.7，测序引物KLF12-CDS-R: TCCTCCCATCCTCCAGGAGC，SEQ ID NO.8。
2、ES细胞筛选：复苏MEFs，制作Feeder，复苏ES并传代，用所述打靶载体进行电转，加抗生素筛选后培养，筛选3’和5’端均阳性的克隆细胞；
1)用96孔板，进行3’端筛选：引物为KLF12-ES-SF1:caaagtcgctctgagttgtt，SEQID NO.9， Rosa26-CAG-ES-R:CCTATTGGCGTTACTATGGG，SEQ ID NO.10；产物长度:509bp。
PCR体系 PCR程序
Volume(μl)
ddH2O 16.75 95℃ 5min
10XPCRbuffer 2.5 95℃ 30s
Mg++(25mM) 2 58℃ 30s
dNTPs(10mM) 0.5 72℃ 30sec
KLF12-ES-SF1(10μM) 1 72℃ 10min
Rosa26-CAG-ES-R(10μM) 1 共40个循环
Taq(5U/μl) 0.25
Template(ESDNA) 1
经检测，如图5为3’端筛选检测结果图，显示为阳性结果的孔编号有：
1A.1B.1C.1D.1H.3A.3B.3C.3E.3G.4A.4B.4C.4D.4E.4G.5A.5B.5C.5E.5F.5H.6A.6C.6D.
6G.6H.7A-7H.8A-8D.8F.8G.8H.9A.9B.9C.9E.9H.10A-10F.10H.
11A-11C.11F.11G.12A-12D.
12F-12H.
2)用96孔板，进行5’端筛选：引物为KLF12-SQ-F：cctgtggtggtacagtcagt，SEQNO：ID 11， Rosa26-CAG-ES-R:CCCTATTGGCGTTACTATGGG，SEQ NO：ID 10；产物长度:5.8Kb。
Figure RE-GDA0003049898480000051
Figure RE-GDA0003049898480000061
经检测，图6为5’端筛选检测结果图，其中阳性的孔编号为：1C.1D.2C-2F.3B-3G.4A.4B.4D.4E.4F.5A-5F.5H.6A.6C-6H.7A-7H.9A-9C.9E.10A-10H.11A-11C.11F.11G.12D。综上，两端都为阳性孔编号的有：1C.1D.3B.3C.3E.3G.4A.4B.4D.5A.5B.5C.5E.5F.5H.6C.6D.6G.6H.7A-7H.9A.9B.9C.9E.10A -10F.10H.11A.11B.11C.11F.11G.12D。筛选两端都为阳性的3E/4B/4D/6C/6D/11A克隆做southern分析，以B6为对照。
3)southern分析：Southern鉴定分析方案如下表，结果见图7 Southern鉴定分析结果，可见所选克隆均为阳性。
鉴定方案
Figure RE-GDA0003049898480000062
(3)囊胚注射：体外培养2.5d的胚胎，囊胚注射步骤(2)中筛选的3’和5’端均阳性的克隆细胞至胚胎内，获得40只小鼠，其中嵌合鼠13只。
注射信息如下：
移植数(枚) 移植受体数量 妊娠数量 出生小崽数量(只) 存活数量(只)
118 7 5 36 31
66 4 4 9 9
选择高嵌合率的小鼠与野生型小鼠交配进行繁育，对获得的F1代Rosa26-LoxP.GFP.Stop.LoxP-Klf12进行基因鉴定。
Figure RE-GDA0003049898480000063
Figure RE-GDA0003049898480000071
Figure RE-GDA0003049898480000072
ID 性别 鉴定结果 出生日期 代数 F/M
#139 ♂ KI/wt 2014-7-30 F1 ♂#5
#150 ♂ KI/wt 2014-8-13 F1 ♂#37
#58 ♀ KI/wt 2014-6-11 F1 ♂#9
#59 ♀ KI/wt 2014-6-11 F1 ♂#9
#67 ♀ KI/wt 2014-6-18 F1 ♂#5
#75 ♀ KI/wt 2014-6-21 F1 ♂#5
#96 ♀ KI/wt 2014-7-2 F1 ♂#9
从上表和检测结果图8中可以看出，基因型为KI/wt，阳性。
实施例2：
利用Rosa26Klf12/Klf12条件性KLF12高表达小鼠，与SoxCre雌鼠交配后获得KLF12高表达胚胎。对胎鼠基因型进行鉴定：
(1)取9.5 dpc胎鼠卵黄囊至洁净EP管。
(2)加入1X基因组提取碱性裂解液70μL，并将组织简单离心至液体中。
(3)金属浴100℃煮30min。
(4)加入基因组提取酸性裂解液140μL。
(5)15000rpm室温离心1min，上清即为待检测的模版DNA。
(6)配置PCR反应体系(14μL)：
Figure RE-GDA0003049898480000081
注：WT、MUT选用的正向引物为CAAAGTCGCTCTGAGTTGTT，SEQ ID NO.22； WT选用的反向向引物为CCAGATGACTACCTATCCTC，SEQ ID NO.23；MUT选用的反向向引物为CCCTATTGGCGTTACTATGGG，SEQ ID NO.24。
(7)设置PCR程序：a、95℃3min、b、95℃30s、c、58℃30s、d、72℃1min、 e、b-d35cycles、f、72℃2min、g、End。将样品上机，运行程序。
(8)根据产物片段大小配置琼脂糖凝胶：
基因型鉴定PCR产物片段一般在500bp-1kb，可使用1.5％琼脂糖凝胶进行电泳：称取1.5g琼脂糖粉，置于100mL TAE溶液中，微波炉反复煮沸至溶液澄清；待冷却至室温后，加入Goldview染料并混匀，倒入成胶模具中，成胶30min。
(9)将样品加至上样孔，电压150V跑胶20min。凝胶成像仪采集图像，结果见图11。
本申请还设计了多种交配组合：
Rosa26Klf12/Klf12小鼠与PRCre工具鼠交配，获得子宫特异性高表达KLF12小鼠模型，发现高水平KLF12并未影响子宫发育和其孕育胎儿的能力；
Rosa26Klf12/Klf12小鼠与Elf5Cre工具鼠交配，获得胎盘特异性高表达KLF12小鼠模型，发现高水平KLF12并未影响胎盘发育，相应小鼠能够正常发育至出生。
从各交配组合的胚胎发育结果看出，只有Rosa26Klf12/Klf12小鼠与SoxCre雌鼠交配后获得KLF12高表达胚胎能够模拟NTDs的疾病状态。
实施例3：囊胚收集：
(1)打开3.5-day-post-coitus(dpc，阴栓阳性计0.5dpc)孕鼠腹腔，用剪刀在宫颈部位剪开，向上拉伸子宫牵引系膜，用剪刀将宫角壁上的系膜剥离，然后在输卵管和卵巢之间剪开，保证输卵管和子宫之间的连接完整。
(2)将子宫放置于35mm培养皿。
(3)冲洗子宫：在靠近宫颈的位置剪断宫角；在靠近子宫输卵管连接处的子宫上端插入注射器针头，用0.2mLM2培养液向宫颈方向冲洗子宫。
(4)用移卵管收集胚胎并在几滴新鲜的培养液中洗涤，以去除杂质，进行后续胚胎免疫荧光染色。
检测所得数据均使用Prism 7.0软件进行分析。数据定量以均数±标准误(x±s)表示，两组之间数据比较采用t检验，以P<0.05为具有显著性差异，有统计学意义。结果如下：
1、本申请构建了
转录因子KLF12的条件性KLF12高表达小鼠Rosa26Klf12/Klf12(图1(1))，与Sox2Cre雌鼠交配即可获得全身性KLF12高表达小鼠(图1(2))，用于下一步观察和检测高水平KLF12对神经管发育的影响。
2、高水平KLF12导致NTDs表型
为了明确高水平KLF12对小鼠发育的影响，我们取小鼠妊娠不同时间点的胚胎进行观察。3.5dpc收集囊胚，计数囊胚数目并进行KLF12染色，结果表明Rosa26Klf12/Klf12雄鼠与Sox2Cre雌鼠交配所获KLF12高表达囊胚数目正常，形态与野生型WildType(WT) 囊胚相似(图2A-C)。4.5dpc Blue Dye反应显示KLF12高表达胚胎植入子宫的数目正常，且胚胎沿系膜-对系膜轴植入子宫(图2D-G)。7.5dpc，KLF12高表达胚胎发育出了典型的三腔结构(羊膜腔、胚外体腔和外胎盘锥腔)(图2H-K)。8.5dpc，KLF12高表达胎鼠与WT胎鼠发育到了类似的阶段(图2L-M)。0.5天之后，WT胎鼠完成胚胎旋转，由“U”形胚胎转变为“C”形胚胎，而同一子宫中KLF12高表达胎鼠尚未完成胚胎旋转，发育迟缓(图2N-O)。9.5dpc，KLF12高表达胎鼠虽然能够完成胚胎旋转，但发育明显异常，主要表现为神经管缺陷(图2P-Q)，随后发生孕中期流产。
3、高水平KLF12致神经管发育标志分子表达异常
HE染色显示，KLF12高表达胎鼠未能形成良好的背外侧铰链点(图3A)；对神经管发育相关标志分子进行免疫荧光染色，可见KLF12高表达胚胎中标志神经上皮纤毛结构的ARL13B表达减少，标志V3祖细胞的NKX2.2水平下降(图3B)，标志神经管腹侧区的FOXA2和NKX6.1表达范围变小，FOXA2信号强度增加(图3C)；KI67和 TUNEL染色结果表明，与WT胚胎相比，KLF12高表达胚胎神经上皮增殖信号减弱，而凋亡信号增多(图3D-E)。
Figure RE-GDA0003049898480000101
目前临床上主要通过服用叶酸来预防胎儿神经管发育异常，所以我们尝试分别给予其亲代叶酸(3mg/kg/d，0.5dpc-9.5dpc灌胃)和叶酸代谢产物也即甲酸根供体甲酸钙(0.1M 甲酸钙溶液，自由饮水)对该表型进行挽救，结果发现叶酸和甲酸钙对KLF12高表达胎鼠的神经管缺陷表型无明显改善效果，表明高水平KLF12所致的NTDs为非叶酸依赖的NTDs(图4)。
本申请其他工艺参照《小鼠胚胎实验操作手册》2005年版进行。以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出：对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 南京鼓楼医院
<120> 一种构建Klf12高表达小鼠的方法及在构建非叶酸依赖的神经管缺陷小鼠模型的应用
<141> 2021-02-07
<160> 14
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 16829
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 1
ccccgcggca ggccctccga gcgtggtgga gccgttctgt gagacagccg ggtacgagtc 60
gtgacgctgg aaggggcaag cgggtggtgg gcaggaatgc ggtccgccct gcagcaaccg 120
gagggggagg gagaagggag cggaaaagtc tccaccggac gcggccatgg ctcggggggg 180
ggggggcagc ggaggacgct tccggccgac gtctcgtcgc tgattggctt ttttcctccc 240
gccgtgtgtg aaaacacaaa tggcgtgttt tggttggcgt aaggcgcctg tcagttaacg 300
gcagccggag tgcgcagccg ccggcagcct cgctctgccc actgggtggg gcgggaggta 360
ggtggggtga ggcgagctga cgtgcgggcg cggtcggcct ctggcggggc gggggagggg 420
agggagggtc agcgaaagta gctcgcgcgc gagcggccgc ccaccctccc cttcctctgg 480
gggagtcgtt ttacccgccg ccggccgggc ctcgtcgtct gattggctct cggggcccag 540
aaaactggcc cttgccattg gctcgtgttc gtgcaagttg agtccatccg ccggccagcg 600
ggggcggcga ggaggcgctc ccaggttccg gccctcccct cggccccgcg ccgcagagtc 660
tggccgcgcg cccctgcgca acgtggcagg aagcgcgcgc tgggggcggg gacgggcagt 720
agggctgagc ggctgcgggg cgggtgcaag cacgtttccg acttgagttg cctcaagagg 780
ggcgtgctga gccagacctc catcgcgcac tccggggagt ggagggaagg agcgagggct 840
cagttgggct gttttggagg caggaagcac ttgctctccc aaagtcgctc tgagttgtta 900
tcagtaaggg agctgcagtg gagtaggcgg ggagaaggcc gcacccttct ccggaggggg 960
gaggggagtg ttgcaatacc tttctgggag ttctctgctg cctcctggct tctgaggacc 1020
gccctgggcc tgggagaatc ccttgccccc tcttcccctc gtgatctgca actccagtct 1080
ttctagcatc tgtagggcgc agtagtccag ggtttccttg atgatgtcat acttatcctg 1140
tccctttttt ttccacagct cgcggttgag gacaaactct tcgcggtctt tccagtggtt 1200
aattaagtcg acattgatta ttgactagtt attaatagta atcaattacg gggtcattag 1260
ttcatagccc atatatggag ttccgcgtta cataacttac ggtaaatggc ccgcctggct 1320
gaccgcccaa cgacccccgc ccattgacgt caataatgac gtatgttccc atagtaacgc 1380
caatagggac tttccattga cgtcaatggg tggagtattt acggtaaact gcccacttgg 1440
cagtacatca agtgtatcat atgccaagta cgccccctat tgacgtcaat gacggtaaat 1500
ggcccgcctg gcattatgcc cagtacatga ccttatggga ctttcctact tggcagtaca 1560
tctacgtatt agtcatcgct attaccatgg tcgaggtgag ccccacgttc tgcttcactc 1620
tccccatctc ccccccctcc ccacccccaa ttttgtattt atttattttt taattatttt 1680
gtgcagcgat gggggcgggg ggggggggcg cgcgccaggc ggggcggggc ggggcgaggg 1740
gcggggcggg gcgaggcgga gaggtgcggc ggcagccaat cagagcggcg cgctccgaaa 1800
gtttcctttt atggcgaggc ggcggcggcg gcggccctat aaaaagcgaa gcgcgcggcg 1860
ggcgggagtc gctgcgcgct gccttcgccc cgtgccccgc tccgccgccg cctcgcgccg 1920
cccgccccgg ctctgactga ccgcgttact cccacaggtg agcgggcggg acggcccttc 1980
tcctccgggc tgtaattagc gcttggttta atgacggctt gtttcttttc tgtggctgcg 2040
tgaaagcctt gaggggctcc gggagggccc tttgtgcggg gggagcggct cggggggtgc 2100
gtgcgtgtgt gtgtgcgtgg ggagcgccgc gtgcggctcc gcgctgcccg gcggctgtga 2160
gcgctgcggg cgcggcgcgg ggctttgtgc gctccgcagt gtgcgcgagg ggagcgcggc 2220
cgggggcggt gccccgcggt gcgggggggg ctgcgagggg aacaaaggct gcgtgcgggg 2280
tgtgtgcgtg ggggggtgag cagggggtgt gggcgcgtcg gtcgggctgc aaccccccct 2340
gcacccccct ccccgagttg ctgagcacgg cccggcttcg ggtgcggggc tccgtacggg 2400
gcgtggcgcg gggctcgccg tgccgggcgg ggggtggcgg caggtggggg tgccgggcgg 2460
ggcggggccg cctcgggccg gggagggctc gggggagggg cgcggcggcc cccggagcgc 2520
cggcggctgt cgaggcgcgg cgagccgcag ccattgcctt ttatggtaat cgtgcgagag 2580
ggcgcaggga cttcctttgt cccaaatctg tgcggagccg aaatctggga ggcgccgccg 2640
caccccctct agcgggcgcg gggcgaagcg gtgcggcgcc ggcaggaagg aaatgggcgg 2700
ggagggcctt cgtgcgtcgc cgcgccgccg tccccttctc cctctccagc ctcggggctg 2760
tccgcggggg gacggctgcc ttcggggggg acggggcagg gcggggttcg gcttctggcg 2820
tgtgaccggc ggctctagag cctctgctaa ccatgttcat gccttcttct ttttcctaca 2880
gctcctgggc aacgtgctgg ttattgtgct gtctcatcat tttggcaaag aattcctcga 2940
gggcctagtc ggccataact tcgtatagca tacattatac gaagttatat ggtgagcaag 3000
ggcgaggagc tgttcaccgg ggtggtgccc atcctggtcg agctggacgg cgacgtaaac 3060
ggccacaagt tcagcgtgtc cggcgagggc gagggcgatg ccacctacgg caagctgacc 3120
ctgaagttca tctgcaccac cggcaagctg cccgtgccct ggcccaccct cgtgaccacc 3180
ctgacctacg gcgtgcagtg cttcagccgc taccccgacc acatgaagca gcacgacttc 3240
ttcaagtccg ccatgcccga aggctacgtc caggagcgca ccatcttctt caaggacgac 3300
ggcaactaca agacccgcgc cgaggtgaag ttcgagggcg acaccctggt gaaccgcatc 3360
gagctgaagg gcatcgactt caaggaggac ggcaacatcc tggggcacaa gctggagtac 3420
aactacaaca gccacaacgt ctatatcatg gccgacaagc agaagaacgg catcaaggtg 3480
aacttcaaga tccgccacaa catcgaggac ggcagcgtgc agctcgccga ccactaccag 3540
cagaacaccc ccatcggcga cggccccgtg ctgctgcccg acaaccacta cctgagcacc 3600
cagtccgccc tgagcaaaga ccccaacgag aagcgcgatc acatggtcct gctggagttc 3660
gtgaccgccg ccgggatcac tctcggcatg gacgagctgt acaagtaagg atccgaacaa 3720
acgacccaac acccgtgcgt tttattctgt ctttttattg ccgatcccct cagaagaact 3780
cgtcaagaag gcgatagaag gcgatgcgct gcgaatcggg agcggcgata ccgtaaagca 3840
cgaggaagcg gtcagcccat tcgccgccaa gctcttcagc aatatcacgg gtagccaacg 3900
ctatgtcctg atagcggtcc gccacaccca gccggccaca gtcgatgaat ccagaaaagc 3960
ggccattttc caccatgata ttcggcaagc aggcatcgcc atgggtcacg acgagatcct 4020
cgccgtcggg catgcgcgcc ttgagcctgg cgaacagttc ggctggcgcg agcccctgat 4080
gctcttcgtc cagatcatcc tgatcgacaa gaccggcttc catccgagta cgtgctcgct 4140
cgatgcgatg tttcgcttgg tggtcgaatg ggcaggtagc cggatcaagc gtatgcagcc 4200
gccgcattgc atcagccatg atggatactt tctcggcagg agcaaggtga gatgacagga 4260
gatcctgccc cggcacttcg cccaatagca gccagtccct tcccgcttca gtgacaacgt 4320
cgagcacagc tgcgcaagga acgcccgtcg tggccagcca cgatagccgc gctgcctcgt 4380
cctgcagttc attcagggca ccggacaggt cggtcttgac aaaaagaacc gggcgcccct 4440
gcgctgacag ccggaacacg gcggcatcag agcagccgat tgtctgttgt gcccagtcat 4500
agccgaatag cctctccacc caagcggccg gagaacctgc gtgcaatcca tcttgttcaa 4560
tggccgatcc catattggct gcagggtcgc tcggtgttcg aggccacacg cgtcacctta 4620
atatgcgaag tggacctggg accgcgccgc cccgactgca tctgcgtgtt cgaattcgcc 4680
aatgacaaga cgctgggcgg ggtttgctcg acattgggtg gaaacattcc aggcctgggt 4740
ggagaggctt tttgcttcct cttgcaaaac cacactgctc gacattgggt ggaaacattc 4800
caggcctggg tggagaggct ttttgcttcc tcttgcaaaa ccacactgct cgactagtga 4860
ttaaagtcga ctcggggaca ccaaatatgg cgatctcggc cttttcgttt cttggagctg 4920
ggacatgttt gccatcgatc catctaccac cagaacggcc gttagatctg ctgccaccgt 4980
tgtttccacc gaagaaacca ccgttgccgt aaccaccacg acggttgttg ctaaagaagc 5040
tgccaccgcc acggccaccg ttgtagccgc cgttgttgtt attgtagttg ctcatgttat 5100
ttctggcact tcttggtttt cctcttaagt gaggaggaac ataaccattc tcgttgttgt 5160
cgttgatgct taaattttgc acttgttcgc tcagttcagc cataatatga aatgcttttc 5220
ttgttgttct tacggaatac cacttgccac ctatcaccac aactaacttt ttcccgttcc 5280
tccatctctt ttatattttt tttctcgagg gatctttgtg aaggaacctt acttctgtgg 5340
tgtgacataa ttggacaaac tacctacaga gatttaaagc tctaaggtaa atataaaatt 5400
tttaagtgta taatgtgtta aactactgat tctaattgtt tgtgtatttt agattccaac 5460
ctatggaact gatgaatggg agcagtggtg gaatgccttt aatgaggaaa acctgttttg 5520
ctcagaagaa atgccatcta gtgatgatga ggctactgct gactctcaac attctactcc 5580
tccaaaaaag aagagaaagg tagaagaccc caaggacttt ccttcagaat tgctaagttt 5640
tttgagtcat gctgtgttta gtaatagaac tcttgcttgc tttgctattt acaccacaaa 5700
ggaaaaagct gcactgctat acaagaaaat tatggaaaaa tattctgtaa cctttataag 5760
taggcataac agttataatc ataacatact gttttttctt actccacaca ggcatagagt 5820
gtctgctatt aataactatg ctcaaaaatt gtgtaccttt agctttttaa tttgtaaagg 5880
ggttaataag gaatatttga tgtatagtgc cttgactaga gatcataatc agccatacca 5940
catttgtaga ggttttactt gctttaaaaa acctcccaca cctccccctg aacctgaaac 6000
ataaaatgaa tgcaattgtt gttgttaact tgtttattgc agcttataat ggttacaaat 6060
aaagcaatag catcacaaat ttcacaaata aagcattttt ttcactgcat tctagttgtg 6120
gtttgtccaa actcatcaat gtatcttatc atgtctggat ctgacatggt aagtaagctt 6180
ataacttcgt atagcataca ttatacgaag ttatgggcgc gccgccgcca ccatgaatat 6240
ccatatgaag aggaaaacca taaagaatct cagcgccctt gagaacagaa tgctaatgct 6300
tgatggaatg ccggcagtca gagtcaaaac cgagcttgtg gaatctgaac aagggtctcc 6360
aaacgtccac aactaccccg atatggaagc tgtccccctc ttgctaaata atgtgaaagg 6420
ggagccccca gaggactcac tgcctgtaga tcactttcag acacaaactg agccagtgga 6480
cttgtcaatc aacaaagcca ggacctcccc tactgcagcg tcatcctccc ctgtctccat 6540
gacagcgtcc gcctcctcac cttcttcaac ttcaacctct tcatcctctt ctagtcgtcc 6600
agcctcatcc cccactgtta taacatcagt atcttcagca tcgtcttcgt caacagtgtt 6660
atctccagga ccccttgttg cctctgcatc tggcgtgggc ggccagcagt tcttgcacat 6720
catccatccg gtcccacctt ccagtcccat gaacttacag tctaacaaac tcagtcatgt 6780
tcatcgaatc cctgtggtgg tacagtcagt gccggttgtc tacacagctg tacggtcacc 6840
tggaaatgtg aacaacacta ttgttgtacc gctcctggag gatgggagga gccatggcaa 6900
agcacaaatg gagccccgag gcctatctcc cagacagagt aaaagtgaca gtgacgatga 6960
tgacctgcca aatgtgacct tagatagcgt taatgaaact ggatccacgg ccctttccat 7020
agccagagca gtacaagagg tacatccatc cccggtatcc agggtccgag gaaatcgaat 7080
gaataaccag aagtttgctt gttcaatctc accatttagc attgagagca caagacgcca 7140
gagacgatca gaatccccag actccaggaa acggcgcatc cacagatgtg acttcgaagg 7200
gtgcaacaaa gtctatacaa aaagttctca cctgaaggca caccggagaa cacacacagg 7260
agagaagccc tacaaatgca cgtgggaagg ctgcacctgg aagtttgccc gttcagatga 7320
actgaccaga cactaccgca aacacacggg agtgaagcca ttcaagtgcg cggactgtga 7380
ccgcagcttc tcgaggtcag accacctggc actgcaccgt aggaggcaca tgctggtgac 7440
gcgtacgcgg ccgctcgagc agaaactcat ctcagaagag gatctggcag caaatgatat 7500
cctggattac aaggatgacg acgataaggt ttaaggcgcg ccgcggccgc gatcaattcg 7560
gtaccgaagt tcctattccg aagttcctat tctctagaaa gtataggaac ttcctcgagg 7620
ttggatgcag cccgggggat ccactagttc tagagcggcc gatcagcctc gactgtgcct 7680
tctagttgcc agccatctgt tgtttgcccc tcccccgtgc cttccttgac cctggaaggt 7740
gccactccca ctgtcctttc ctaataaaat gaggaaattg catcgcattg tctgagtagg 7800
tgtcattcta ttctgggggg tggggtgggg caggacagca agggggagga ttgggaagac 7860
aatagcaggc atgctgggga tgcggtgggc tctatggctt ctgaggcgga aagaaccagc 7920
tggggctcga gatccactag ttctagcctc gaggctagag cggccgccgc ggatatcgaa 7980
ttcgctagaa gatgggcggg agtcttctgg gcaggcttaa aggctaacct ggtgtgtggg 8040
cgttgtcctg caggggaatt gaacaggtgt aaaattggag ggacaagact tcccacagat 8100
tttcggtttt gtcgggaagt tttttaatag gggcaaataa ggaaaatggg aggataggta 8160
gtcatctggg gttttatgca gcaaaactac aggttattat tgcttgtgat ccgcctcgga 8220
gtattttcca tcgaggtaga ttaaagacat gctcacccga gttttatact ctcctgcttg 8280
agatccttac tacagtatga aattacagtg tcgcgagtta gactatgtaa gcagaatttt 8340
aatcattttt aaagagccca gtacttcata tccatttctc ccgctccttc tgcagcctta 8400
tcaaaaggta ttttagaaca ctcattttag ccccattttc atttattata ctggcttatc 8460
caacccctag acagagcatt ggcattttcc ctttcctgat cttagaagtc tgatgactca 8520
tgaaaccaga cagattagtt acatacacca caaatcgagg ctgtagctgg ggcctcaaca 8580
ctgcagttct tttataactc cttagtacac tttttgttga tcctttgcct tgatccttaa 8640
ttttcagtgt ctatcacctc tcccgtcagg tggtgttcca catttgggcc tattctcagt 8700
ccagggagtt ttacaacaat agatgtattg agaatccaac ctaaagctta actttccact 8760
cccatgaatg cctctctcct ttttctccat ttataaactg agctattaac cattaatggt 8820
ttccaggtgg atgtctcctc ccccaatatt acctgatgta tcttacatat tgccaggctg 8880
atattttaag acattaaaag gtatatttca ttattgagcc acatggtatt gattactgct 8940
tactaaaatt ttgtcattgt acacatctgt aaaaggtggt tccttttgga atgcaaagtt 9000
caggtgtttg ttgtctttcc tgacctaagg tcttgtgagc ttgtattttt tctatttaag 9060
cagtgctttc tcttggactg gcttgactca tggcattcta cacgttattg ctggtctaaa 9120
tgtgattttg ccaagcttct tcaggaccta taattttgct tgacttgtag ccaaacacaa 9180
gtaaaatgat taagcaacaa atgtatttgt gaagcttggt ttttaggttg ttgtgttgtg 9240
tgtgcttgtg ctctataata atactatcca ggggctggag aggtggctcg gagttcaaga 9300
gcacagactg ctcttccaga agtcctgagt tcaattccca gcaaccacat ggtggctcac 9360
aaccatctgt aatgggatct gatgccctct tctggtgtgt ctgaagacca caagtgtatt 9420
cacattaaat aaataaatcc tccttcttct tctttttttt ttttttaaag agaatactgt 9480
ctccagtaga atttactgaa gtaatgaaat actttgtgtt tgttccaata tggtagccaa 9540
taatcaaatt actctttaag cactggaaat gttaccaagg aactaatttt tatttgaagt 9600
gtaactgtgg acagaggagc cataactgca gacttgtggg atacagaaga ccaatgcaga 9660
ctttaatgtc ttttctctta cactaagcaa taaagaaata aaaattgaac ttctagtatc 9720
ctatttgttt aaactgctag ctttacttaa cttttgtgct tcatctatac aaagctgaaa 9780
gctaagtctg cagccattac taaacatgaa agcaagtaat gataattttg gatttcaaaa 9840
atgtagggcc agagtttagc cagccagtgg tggtgcttgc ctttatgcct ttaatcccag 9900
cactctggag gcagagacag gcagatctct gagtttgagc ccagcctggt ctacacatca 9960
agttctatct aggatagcca ggaatacaca cagaaaccct gttggggagg ggggctctga 10020
gatttcataa aattataatt gaagcattcc ctaatgagcc actatggatg tggctaaatc 10080
cgtctacctt tctgatgaga tttgggtatt attttttctg tctctgctgt tggttgggtc 10140
ttttgacact gtgggctttc tttaaagcct ccttcctgcc atgtggtctc ttgtttgcta 10200
ctaacttccc atggcttaaa tggcatggct ttttgccttc taagggcagc tgctgagatt 10260
tgcagcctga tttccagggt ggggttggga aatctttcaa acactaaaat tgtcctttaa 10320
tttttttttt aaaaaatggg ttatataata aacctcataa aatagttatg aggagtgagg 10380
tggactaata ttaaatgagt ccctccccta taaaagagct attaaggctt tttgtcttat 10440
acttaacttt ttttttaaat gtggtatctt tagaaccaag ggtcttagag ttttagtata 10500
cagaaactgt tgcatcgctt aatcagattt tctagtttca aatccagaga atccaaattc 10560
ttcacagcca aagtcaaatt aagaatttct gacttttaat gttaatttgc ttactgtgaa 10620
tataaaaatg atagcttttc ctgaggcagg gtctcactat gtatctctgc ctgatctgca 10680
acaagatatg tagactaaag ttctgcctgc ttttgtctcc tgaatactaa ggttaaaatg 10740
tagtaatact tttggaactt gcaggtcaga ttcttttata ggggacacac taagggagct 10800
tgggtgatag ttggtaaaat gtgtttcaag tgatgaaaac ttgaattatt atcaccgcaa 10860
cctacttttt aaaaaaaaaa gccaggcctg ttagagcatg cttaagggat ccctaggact 10920
tgctgagcac acaagagtag ttacttggca ggctcctggt gagagcatat ttcaaaaaac 10980
aaggcagaca accaagaaac tacagttaag gttacctgtc tttaaaccat ctgcatatac 11040
acagggatat taaaatattc caaataatat ttcattcaag ttttccccca tcaaattggg 11100
acatggattt ctccggtgaa taggcagagt tggaaactaa acaaatgttg gttttgtgat 11160
ttgtgaaatt gttttcaagt gatagttaaa gcccatgaga tacagaacaa agctgctatt 11220
tcgaggtctc ttggtttata ctcagaagca cttctttggg tttccctgca ctatcctgat 11280
catgtgctag gcctacctta ggctgattgt tgttcaaata aacttaagtt tcctgtcagg 11340
tgatgtcata tgatttcata tatcaaggca aaacatgtta tatatgttaa acatttgtac 11400
ttaatgtgaa agttaggtct ttgtgggttt gatttttaat tttcaaaacc tgagctaaat 11460
aagtcatttt tacatgtctt acatttggtg gaattgtata attgtggttt gcaggcaaga 11520
ctctctgacc tagtaaccct acctatagag cactttgctg ggtcacaagt ctaggagtca 11580
agcatttcac cttgaagttg agacgttttg ttagtgtata ctagtttata tgttggagga 11640
catgtttatc cagaagatat tcaggactat ttttgactgg gctaaggaat tgattctgat 11700
tagcactgtt agtgagcatt gagtggcctt taggcttgaa ttggagtcac ttgtatatct 11760
caaataatgc tggccttttt taaaaagccc ttgttcttta tcaccctgtt ttctacataa 11820
tttttgttca aagaaatact tgtttggatc tccttttgac aacaatagca tgttttcaag 11880
ccatattttt tttccttttt tttttttttt ttggtttttc gagacagggt ttctctgtat 11940
agccctggct gtcctggaac tcactttgta gaccaggctg gcctcgaact cagaaatccg 12000
cctgcctctg cctcctgagt gccgggatta aaggcgtgca ccaccacgcc tggctaagtt 12060
ggatattttg tatataacta taaccaatac taactccact gggtggattt ttaattcagt 12120
cagtagtctt aagtggtctt tattggccct tattaaaatc tactgttcac tctaacagag 12180
gctgttggac tagtggacta agcaacttcc tacggatata ctagcagata agggtcaggg 12240
atagaaacta gtctagcgtt ttgtatacct accagcttat actaccttgt tctgatagaa 12300
atatttagga catctagctt atcgatccgt cgacggtatc gataagcttg atatcgaatt 12360
ctaccgggta ggggaggcgc ttttccaagg cagtctgagc atgcgcttag cagccccgct 12420
ggcacttggc gctacacaag tggccttggc ctcgcacaca ttccacatcc accggtaggc 12480
gccaaccggc tccgttcttt ggtggcccct tcgcgccacc ttctctcctc ccctagtcag 12540
gaagttcccc cccgccccgc agctcgcgtc gtaggacgtg acaaatggaa gtagcacgtc 12600
tcactagtct cgtcagatgg acagcaccgc tgagcaatgg aagcgggtag gcctttgggg 12660
cagcggccaa tagcagcttt gctccttcgc tttctgggct cagaggctgg gaaggggtgg 12720
gtccgggggc gggctcaggg gcgggctcag gggcggggcg ggcgcccgaa ggtcctccgg 12780
aggcccggca ttctgcacgc ttcaaaagcg cacgtctgcc gcgctgttct cctcttcctc 12840
atctccgggc ctttcgacct gcaggtcctc gccatggatc ctgatgatgt tgttattctt 12900
ctaatctttt gtatggaaaa cttttcttcg taccacggga ctaaacctgg ttatgtagat 12960
tccattcaaa aaggtataca aaagccaaaa tctggtacac aaggaaatta tgacgatgat 13020
tggaaagggt tttatagtac cgacaataaa tacgacgctg cgggatactc tgtagataat 13080
gaaaacccgc tctctggaaa agctggaggc gtggtcaaag tgacgtatcc aggactgacg 13140
aaggttctcg cactaaaagt ggataatgcc gaaactatta agaaagagtt aggtttaagt 13200
ctcactgaac cgttgatgga gcaagtcgga acggaagagt ttatcaaaag gttcggtgat 13260
ggtgcttcgc gtgtagtgct cagccttccc ttcgctgagg ggagttctag cgttgaatat 13320
attaataact gggaacaggc gaaagcgtta agcgtagaac ttgagattaa ttttgaaacc 13380
cgtggaaaac gtggccaaga tgcgatgtat gagtatatgg ctcaagcctg tgcaggaaat 13440
cgtgtcaggc gatctctttg tgaaggaacc ttacttctgt ggtgtgacat aattggacaa 13500
actacctaca gagatttaaa gctctaaggt aaatataaaa tttttaagtg tataatgtgt 13560
taaactactg attctaattg tttgtgtatt ttagattcca acctatggaa ctgatgaatg 13620
ggagcagtgg tggaatgcag atcctagagc tcgctgatca gcctcgactg tgccttctag 13680
ttgccagcca tctgttgttt gcccctcccc cgtgccttcc ttgaccctgg aaggtgccac 13740
tcccactgtc ctttcctaat aaaatgagga aattgcatcg cattgtctga gtaggtgtca 13800
ttctattctg gggggtgggg tggggcagga cagcaagggg gaggattggg aagacaatag 13860
caggcatgct ggggatgcgg tgggctctat ggcttctgag gcggaaagaa ccagctgggg 13920
ctcgacctcg agggggggcc cgcggccgcc ctgcagggcg atcgctacgt acagcttttg 13980
ttccctttag tgagggttaa ttgcgcgctt ggcgtaatca tggtcatagc tgtttcctgt 14040
gtgaaattgt tatccgctca caattccaca caacatacga gccggaagca taaagtgtaa 14100
agcctggggt gcctaatgag tgagctaact cacattaatt gcgttgcgct cactgcccgc 14160
tttccagtcg ggaaacctgt cgtgccagct gcattaatga atcggccaac gcgcggggag 14220
aggcggtttg cgtattgggc gctcttccgc ttcctcgctc actgactcgc tgcgctcggt 14280
cgttcggctg cggcgagcgg tatcagctca ctcaaaggcg gtaatacggt tatccacaga 14340
atcaggggat aacgcaggaa agaacatgtg agcaaaaggc cagcaaaagg ccaggaaccg 14400
taaaaaggcc gcgttgctgg cgtttttcca taggctccgc ccccctgacg agcatcacaa 14460
aaatcgacgc tcaagtcaga ggtggcgaaa cccgacagga ctataaagat accaggcgtt 14520
tccccctgga agctccctcg tgcgctctcc tgttccgacc ctgccgctta ccggatacct 14580
gtccgccttt ctcccttcgg gaagcgtggc gctttctcat agctcacgct gtaggtatct 14640
cagttcggtg taggtcgttc gctccaagct gggctgtgtg cacgaacccc ccgttcagcc 14700
cgaccgctgc gccttatccg gtaactatcg tcttgagtcc aacccggtaa gacacgactt 14760
atcgccactg gcagcagcca ctggtaacag gattagcaga gcgaggtatg taggcggtgc 14820
tacagagttc ttgaagtggt ggcctaacta cggctacact agaaggacag tatttggtat 14880
ctgcgctctg ctgaagccag ttaccttcgg aaaaagagtt ggtagctctt gatccggcaa 14940
acaaaccacc gctggtagcg gtggtttttt tgtttgcaag cagcagatta cgcgcagaaa 15000
aaaaggatct caagaagatc ctttgatctt ttctacgggg tctgacgctc agtggaacga 15060
aaactcacgt taagggattt tggtcatgag attatcaaaa aggatcttca cctagatcct 15120
tttaaattaa aaatgaagtt ttaaatcaat ctaaagtata tatgagtaaa cttggtctga 15180
cagttaccaa tgcttaatca gtgaggcacc tatctcagcg atctgtctat ttcgttcatc 15240
catagttgcc tgactccccg tcgtgtagat aactacgata cgggagggct taccatctgg 15300
ccccagtgct gcaatgatac cgcgagaccc acgctcaccg gctccagatt tatcagcaat 15360
aaaccagcca gccggaaggg ccgagcgcag aagtggtcct gcaactttat ccgcctccat 15420
ccagtctatt aattgttgcc gggaagctag agtaagtagt tcgccagtta atagtttgcg 15480
caacgttgtt gccattgcta caggcatcgt ggtgtcacgc tcgtcgtttg gtatggcttc 15540
attcagctcc ggttcccaac gatcaaggcg agttacatga tcccccatgt tgtgcaaaaa 15600
agcggttagc tccttcggtc ctccgatcgt tgtcagaagt aagttggccg cagtgttatc 15660
actcatggtt atggcagcac tgcataattc tcttactgtc atgccatccg taagatgctt 15720
ttctgtgact ggtgagtact caaccaagtc attctgagaa tagtgtatgc ggcgaccgag 15780
ttgctcttgc ccggcgtcaa tacgggataa taccgcgcca catagcagaa ctttaaaagt 15840
gctcatcatt ggaaaacgtt cttcggggcg aaaactctca aggatcttac cgctgttgag 15900
atccagttcg atgtaaccca ctcgtgcacc caactgatct tcagcatctt ttactttcac 15960
cagcgtttct gggtgagcaa aaacaggaag gcaaaatgcc gcaaaaaagg gaataagggc 16020
gacacggaaa tgttgaatac tcatactctt cctttttcaa tattattgaa gcatttatca 16080
gggttattgt ctcatgagcg gatacatatt tgaatgtatt tagaaaaata aacaaatagg 16140
ggttccgcgc acatttcccc gaaaagtgcc acctaaattg taagcgttaa tattttgtta 16200
aaattcgcgt taaatttttg ttaaatcagc tcatttttta accaataggc cgaaatcggc 16260
aaaatccctt ataaatcaaa agaatagacc gagatagggt tgagtgttgt tccagtttgg 16320
aacaagagtc cactattaaa gaacgtggac tccaacgtca aagggcgaaa aaccgtctat 16380
cagggcgatg gcccactacg tgaaccatca ccctaatcaa gttttttggg gtcgaggtgc 16440
cgtaaagcac taaatcggaa ccctaaaggg agcccccgat ttagagcttg acggggaaag 16500
ccggcgaacg tggcgagaaa ggaagggaag aaagcgaaag gagcgggcgc tagggcgctg 16560
gcaagtgtag cggtcacgct gcgcgtaacc accacacccg ccgcgcttaa tgcgccgcta 16620
cagggcgcgt cccattcgcc attcaggctg cgcaactgtt gggaagggcg atcggtgcgg 16680
gcctcttcgc tattacgcca gctggcgaaa gggggatgtg ctgcaaggcg attaagttgg 16740
gtaacgccag ggttttccca gtcacgacgt tgtaaaacga cggccagtga gcgcgcgtaa 16800
tacgactcac tatagggcga attggagct 16829
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 9
caaagtcgct ctgagttgtt 20
<210> 10
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 10
ccctattggc gttactatgg g 21
<210> 11
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 11
cctgtggtgg tacagtcagt 20
<210> 12
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 12
gcctcctggc ttctgaggac 20
<210> 13
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 13
ccctattggc gttactatgg g 21
<210> 14
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 14
gcggactgtg accgcagctt 20
<210> 15
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 15
taagcctgcc cagaagactc 20
<210> 16
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 16
taggaggcac atgctggtga 20
<210> 17
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 17
ccagatgact acctatcctc 20
<210> 18
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 18
caaagtcgct ctgagttgtt 20
<210> 19
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 19
ccagatgact acctatcctc 20
<210> 20
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 20
caaagtcgct ctgagttgtt 20
<210> 21
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 21
taagcctgcc cagaagactc 20

Claims (4)

1.一种非叶酸依赖的神经管缺陷小鼠模型的构建方法，其特征在于：包括如下步骤，
将Rosa26 Klf12/Klf12 小鼠与Sox Cre 雌鼠交配，获得的KLF12高表达胚胎即为非叶酸依赖的神经管缺陷小鼠模型；
所述Rosa26 Klf12/Klf12 小鼠为根据Klf12基因序列，利用Cre-loxP基因重组技术构建；具体构建步骤如下：
（1）根据Klf12基因，构建打靶载体，所述打靶载体的序列如SEQ ID NO.1所示；
（2）ES细胞筛选：复苏MEFs，制作Feeder，复苏ES并传代，用所述打靶载体进行电转，加抗生素筛选后培养，筛选3’和5’端均阳性的克隆细胞；所述筛选3’和5’端均阳性的克隆细胞时，采用的引物序列分别如SEQ ID NO.9~ SEQ ID NO.10和SEQ ID NO.10~ SEQ IDNO.11所示；
（3）囊胚注射：体外培养2.5d的胚胎，囊胚注射步骤（2）中筛选的3’和5’端均阳性的克隆细胞至胚胎内，体外培养后移植到假孕雌鼠体内，至嵌合鼠诞生作为Founder鼠配种繁殖，通过基因型鉴定可得Rosa26 Klf12/Klf12 小鼠。
2.如权利要求1所述的非叶酸依赖的神经管缺陷小鼠模型的构建方法，其特征在于：所述雌鼠为Sox2 Cre 。
3.如权利要求1所述的构建KLF12条件性高表达小鼠的方法，其特征在于：所述打靶载体构建过程中使用的序列包括如SEQ ID NO.9~ SEQ ID NO.21所示序列。
4.权利要求1或2所述的非叶酸依赖的神经管缺陷小鼠模型的应用：其特征在于：在筛选治疗性候选药物、保健品中的应用。
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