CN102228690A - 抗叶酸药物在制备构建神经管畸形小鼠模型中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及抗叶酸药物在制备构建神经管畸形小鼠模型中的应用，具体而言，是采用抗叶酸代谢药物干预孕鼠，造成叶酸代谢障碍，引起鼠胚胎发育异常，从而建立起神经管畸形小鼠模型；本发明所采用的方法操作简单，重复性好，致畸率高，效果稳定，通过阻碍叶酸正常代谢，模拟出了与人NTDs发病机制相近的动物模型，为进一步研究出生缺陷，特别是NTDs提供了便利。

Description

抗叶酸药物在制备构建神经管畸形小鼠模型中的应用

技术领域：

本发明属于应用基础医学研究领域，涉及抗叶酸药物在制备构建神经管畸形小鼠模型中的应用。

背景技术：

神经管畸形(neural tube defects，NTDs)是由于叶酸缺乏导致的一类常见的、严重的出生缺陷疾病，在世界范围内，其发病率平均占到0.05％～0.2％。而在中国，NTDs的发病率远高于上述比例，为0.2％～0.4％，是世界上已知的神经管畸形高发国家。NTDs是胎儿、新生儿和婴儿死亡的主要原因，又是导致儿童智力发育障碍、终身残疾的主要因素，不仅给国家经济造成很大负担，也给家庭生活带来痛苦不幸。

建立合适的动物模型有助于了解人类NTDs的病因、发病机制和病理特点，对预防和筛选治疗药物具有重大意义。叶酸缺乏与NTDs关系的研究一直是该领域的研究焦点和热点，目前已证明，孕妇体内的叶酸缺乏是造成NTDs形成的重要危险因素，补充0.4～4.0mg/d的叶酸能够预防大约50％～70％NTDs的发生。但是，由于食物中的叶酸及动物营养状况较难控制，短时间的叶酸不足可以通过机体的代偿作用，提高叶酸利用率来满足机体的需要；母体还可以通过自身组织消融供给胎儿，所以通过食物建立叶酸直接缺乏的NTDs动物模型尚未见有成功报道。现有NTDs动物模型主要有以下几种构建方法：1)物理因素诱发，通过妊娠期高温、高糖构建NTDs动物模型；2)化学因素诱发，通过环磷酰胺、维甲酸、丙戊酸等注射孕鼠，诱导胚胎神经管发育畸形；3)基因敲除技术，利用基因敲除Cbs、Mthfdl、Mthfr、NOG等诱发NTDs。上述方法所采用的动物模型通常选用ICR、SWISS、C57BL/6J、kunming、SELH/BC、Wistar等品系的小鼠和大鼠。然而，这些动物模型的构建均未能从影响叶酸及叶酸代谢角度思考，有的方法构建的动物模型具有破环基因组结构的倾向，是否能够很好地模拟出人类NTDs的发病机制尚待商榷。

叶酸缺乏对细胞和机体的影响，是通过叶酸的代谢及不同的代谢产物如四氢叶酸，一碳单位，单核苷酸，甲基化作用等实现的。叶酸在体内经过二氢叶酸还原酶作用后转化为四氢叶酸，四氢叶酸是叶酸的活性形式，是一碳单位的运载体。一碳单位一方面通过S-腺苷甲硫氨酸提供甲基，进行体内广泛的甲基化反应，包括DNA和组蛋白等甲基化，另一方面作为合成嘌呤和嘧啶的原料，影响单核苷酸的生物合成。单核苷酸除了作为DNA和RNA合成原料以外，还参与体内广泛的生物学过程，涉及到几乎所有的代谢和代谢调控。迄今为止，通过叶酸代谢障碍构建神经管畸形的动物模型，国内外尚未见有相关报道。因此，迫切需要设计和建立新的思路来制备叶酸缺乏及代谢障碍的神经管畸形小鼠模型，以便顺利开展疾病机制及防治方法的研究。通过对叶酸代谢途径中关键酶二氢叶酸还原酶的特异抑制，可以模拟出叶酸缺乏和叶酸代谢障碍的生物效应状态。

从化学结构看，二氢叶酸还原酶抑制剂可分为经典和非经典两大类。

经典的二氢叶酸还原酶抑制剂均含有谷氨酸残基结构，需要经过细胞膜上还原叶酸载体蛋白的载运进入细胞，然后在叶酸多聚谷氨酸合成酶的催化下多聚谷氨酸化，多聚谷氨酸形式增加了药物分子在细胞内的滞留时间，使细胞对药物接触时间延长和细胞内药物浓度增加，同时加强与二氢叶酸还原酶的结合，从而加大其对二氢叶酸还原酶的抑制。

最早作为二氢叶酸还原酶抑制剂使用的药物氨基蝶呤(AMT)和氨甲喋呤(MTX)，其化学结构与叶酸相似，通过竞争性抑制二氢叶酸还原酶，阻断二氢叶酸还原成四氢叶酸，从而使N⁵，N¹⁰-甲烯四氢叶酸减少，最终影响DNA、RNA、蛋白的生物合成；对AMT和MTX结构进一步进行修饰、设计筛选而来的伊打曲沙(EDX)作为蝶呤类似物，可以在细胞内进行更广泛的多谷氨酸化，对二氢叶酸还原酶有强效的抑制作用，对胸苷合成酶亦有抑制作用；PDX是EDX的延续，较EDX更易被还原叶酸载体蛋白转运；TNP-351作为一种新结构类型的二氢叶酸还原酶抑制剂，利用2，4-二氨基吡咯并嘧啶代替蝶啶结构，并在5-位引入可塑性大的三亚甲基桥，以提供最有利的构象，满足抑制剂与二氢叶酸还原酶活性部位最大限度的氢键和疏水键相互作用；AAG120-292-3及其类似物是含呋喃的二氢叶酸还原酶抑制剂；培美曲塞二钠(LY231514)是一种新型多点位抗叶酸代谢药，通过细胞还原型载体和胞膜表面叶酸盐结合蛋白转运体系进入细胞内，转化为多聚谷氨酸盐，抑制细胞体内与胸腺嘧啶核苷酸和嘌呤核苷酸合成有关的多种酶系，包括胸甘酸合成酶、二氢叶酸还原酶、甘氨酰胺核苷酸转甲酰基酶。

非经典二氢叶酸还原酶抑制剂不含谷氨酸残基，脂溶性好，可被动扩散进入细胞，进入细胞不需要谷氨酸化。三甲氧苯氨喹唑啉(TMQ，三甲曲沙)为氨甲喋呤的衍生物，是一种非经典抗叶酸代谢药，其作用机理与MTX相似，也是作用于二氢叶酸还原酶。叶酸需要通过还原型叶酸载体进入细胞内，经叶酸多谷氨酸化合成酶催化形成谷氨酸化物参与代谢。TMQ不依赖叶酸正常的载体转运，侧链缺少谷氨酸，亦不会多谷氨酸化，避免由于转运机制不良引起的耐药。

其他非经典的二氢叶酸还原酶抑制剂还包括派利特林(PTX)、PT-523、Mobiltrex、甲氧苄氨嘧啶(TMP)及其类似物、乙胺嘧啶等。PTX是无谷氨酸的化合物，苯环上有2个甲氧基，作用机理和TMQ相似。TMP抗菌谱与磺胺药相近，有抑制二氢叶酸还原酶的作用。乙胺嘧啶是含氯的非经典二氢叶酸还原酶抑制剂，使二氢叶酸不能还原成四氢叶酸。

本项研究的宗旨是，通过抑制母体二氢叶酸还原酶阻碍叶酸代谢通路，产生叶酸代谢障碍的神经管畸形小鼠，影响胚胎基因组稳定性，并且利用叶酸和或四氢叶酸干预母体以减少、抑制叶酸代谢障碍引起的胚胎神经管发育畸形的发生。

叶酸代谢障碍包括影响叶酸及有关代谢生化指标，涉及叶酸、四氢叶酸、5-甲基四氢叶酸、5-甲酰四氢叶酸、蛋氨酸、同型半胱氨酸、半胱氨酸、丝氨酸、组氨酸、S-腺苷蛋氨酸、S-腺苷同型半胱氨酸、胱硫醚、还原性谷胱甘肽或腺苷等。

叶酸代谢障碍的神经管畸形小鼠胚胎基因组稳定性受到影响，表现为彗星电泳实验中细胞发生严重拖尾现象(DNA受损)；比较基因组杂交芯片分析存在基因组拷贝数严重变化；测序结果表明，染色体片段部分丢失和或扩增等。

如上所述，目前神经管畸形(NTDs)动物模型主要采用物理因素诱发、化学因素诱发或基因敲除诱发。本发明所述抗叶酸药物用于制备构建神经管畸形小鼠模型，迄今尚未见有相关报道。本发明的目的是，提供一种抗叶酸药物在制备构建神经管畸形小鼠模型中的应用。

发明内容：

本发明所提供抗叶酸药物制备构建神经管畸形小鼠模型技术方案是：

选用年龄、体重符合要求的小鼠，雌雄鼠合笼后，将孕鼠随机分为实验组和对照组，实验组采用抗叶酸代谢药物进行干预，对照组采用等体积生理盐水处理，处理后，在孕至规定天数时，对鼠胚胎发育影响进行逐项研究，包括身长、体重测量；形态学观察，是否发生神经系统发育异常，神经管闭合出现障碍，表现为无脑、露脑、脑膨出、脊柱裂、颅脊柱裂、脊髓脊膜膨出等畸形表型；同时对孕鼠和胚胎进行叶酸及相关生化代谢指标、基因组稳定性检测。

本发明与现有技术相比，具有如下优点和有益效果：

本发明中，选择的是C57BL/6J小鼠，此品系的小鼠属近交系，生殖周期仅19～21天，因而用其进行致畸实验周期短，见效快。成熟的7～8周小鼠体重为19～20克，容易操作，且其对致畸因子敏感性较高，非常适合用于致畸实验。模型建立之后的后续研究将有广泛的适用范围。本发明所述模型，是在国内外首次建立的叶酸代谢障碍神经管畸形小鼠模型，为NTDs的发病机制研究奠定了良好的基础，提供了广阔的前景。

本发明所采用的方法操作简单，重复性好，致畸效果稳定，致畸率高，致死率低。通过阻碍叶酸正常代谢，模拟出了与人NTDs发病机制相近的动物模型，为进一步研究出生缺陷，特别是NTDs提供了便利。处于发育分化中的器官对致畸因子最敏感，受到作用后最易出现畸形。因此，致畸因子的投放时间决定了是否出现或出现何种畸形。小鼠胚胎神经发育过程是从妊娠E6.0d开始，大约在E10.0d后神经孔最后封闭，在此期间进行抗叶酸药物的干预，均可以导致神经管发育畸形的出现。此外，通过选取不同抗叶酸代谢药物的剂量和干预方式，可以控制胚胎发育的影响程度，不会造成细胞与组织的全部死亡。

本发明涉及的动物模型用于NTDs发病机制的研究，叶酸缺乏与NTDs关系的研究一直是目前该领域的研究焦点和热点，通过食物建立叶酸直接缺乏的动物模型至今尚未见有成功报道，因此叶酸与NTDs的直接关系及其机制尚未阐明。本发明可在模型中开展时间动力学多项指标的取材、示踪以及相关因素协同影响胚胎发育尤其是神经系统发育的研究。

本发明的动物模型还可用于筛选感兴趣的化合物进行NTDs的防治，例如，认为能够预防NTDs发生的叶酸、肌醇及其类似物等；可以给予孕鼠上述药物，与正常对照组相比，降低致畸率或延迟神经系统疾病，均被视为一种保护性指标。

附图说明：

图1-神经管畸形小鼠胚胎与正常小鼠胚胎形态学观察

其中：A-正常胚胎；B-露脑(后脑)畸形；C-露脑(全脑)畸形；D-颅脊柱裂畸形。

图2-神经管畸形小鼠胚胎、孕鼠的叶酸代谢指标的变化

其中：A-甲氨蝶呤注射以后小鼠胚胎二氢叶酸还原酶活性；B、C-甲氨蝶呤注射以后孕鼠血浆同型半胱氨酸、叶酸浓度。

图3-神经管畸形小鼠胚胎与正常小鼠胚胎后脑HE染色

其中：A、B-正常胚胎、后脑畸形胚胎的脑组织切片病理改变，50×；C、D-正常胚胎、后脑畸形胚胎的脑组织切片病理改变，200×。

图4-神经管畸形小鼠胚胎与正常小鼠胚胎前脑HE染色

其中：A、B-正常胚胎、前脑畸形胚胎的脑组织切片病理改变，50×；C、D图为正常胚胎、前脑畸形胚胎的脑组织切片病理改变，200×。

图5-神经管畸形小鼠胚胎与正常小鼠胚胎比较基因组杂交芯片结果分析

其中：A-正常胚胎；B-NTDs胚胎(横坐标为染色体上的所有探针，纵坐标为log₂ ratio)。

具体实施方式：

以下实施例仅为本领域技术人员更好地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。

《实施例》神经管畸形小鼠模型的构建

1.实验动物与材料

SPF级成年C57BL/6J小鼠，雌雄各半，7～8周龄，体重19～20g。购自北京维通利华实验动物技术有限公司，许可证编号：SCXK(京)2006-0009。实验动物的使用遵循中华人民共和国卫生部令(第55号)-医学实验动物管理实施细则，遵循首都儿科研究所医学实验动物管理委员会章程。鼠繁殖饲料喂养(购自北京华阜康生物科技股份有限公司)，常规饮水。

MTX购自Merck公司，贮存液浓度为25mg/ml。Cell Lytic MT^TM Cell LysisReagent、Dihydrofolate Reductase Assay Kit、苏木精、伊红、BSA(bovine serumalbumin)、多聚赖氨酸均购自Sigma公司。叶酸、同型半胱氨酸检测试剂盒(北京九强生物技术有限公司)。

2.实验仪器

连续变倍体视显微镜、眼科镊、手术剪、眼科手术剪、电子天平、医用超净工作台、超低温冰箱、分光光度计、pH计、离心机、LeicaRM2255全自动切片机、Leica HI1210摊片机、Leica HI1220烘片机、Leica BOND-Max全自动免疫组化染色机、LEICA EG1150石蜡包埋机、Leica ASP 200S智能化组织脱水机、Leica DM3000智能型生物显微镜、Leica Qwin V3图像分析系统、Leica AUTSTainer XL染色机、高压锅、移液器、无菌注射器、培养皿、玻璃比色皿、光学显微镜。

3.模型制备

购入的C57BL/6J小鼠适应性喂养2天后，随机分组，每组15只。分组后的雌鼠与同一批雄鼠合笼过夜。第二天早晨发现阴道栓被定为孕0.5天。胚胎神经发育E6.0d时，实验组孕鼠给予3mg/kg的MTX水溶液腹腔注射；正常对照组孕鼠给予等体积的生理盐水。

怀孕11.5天时，对孕鼠进行摘眼球采血。在滴血的过程中可以轻轻按摩小鼠的心脏，有助于加速滴血，增加采血量。操作正常时采血量一般在0.5ml～1ml。取血至离心管后，离心取上清，贮存于-70℃冰箱，备用。采血后的小鼠断颈处死，75％酒精消毒。沿腹中线剖腹取出妊娠子宫，将子宫成串取下置于盛有磷酸盐缓冲液(PBS，pH7.4)的培养皿中，体视显微镜下小心取出胚胎，并仔细观察每窝胚胎，记录活胎数、死胎数、吸收胎数、畸形胎数，观察体视显微镜下可见的畸形情况，计算畸形率。测量胚胎的体长和体重，并对胚胎进行形态学检查，结果如图1所示。A图是正常胚胎；B图是露脑(后脑)畸形；C图是露脑(全脑)畸形；D图是颅脊柱裂畸形。

4.二氢叶酸还原酶活性测定及叶酸代谢生化指标检测

4.1组织总蛋白的提取与蛋白浓度的测定

按照试剂(CelLytic MT^TM Cell Lysis Reagent)使用说明提取胚胎组织中的总蛋白。首先称量胚胎组织的重量，加入适量的CelLytic MT试剂，转移至提前预冷的微量匀浆器中，研磨组织，将研磨好的组织转移至EP管，离心10分钟，取上清。用Bradford法测定胚胎总蛋白浓度。

制作蛋白浓度标准曲线：按下表配制标准溶液及操作(双管平行法)。

每管分别加Bradford(考马斯亮蓝)工作液2.5ml，混匀，放置5min后，用Blank管调零，595nm测得A值。将各点的OD595nm均值对蛋白量作图，绘出标准曲线。

样品中蛋白质浓度的测定：将待测蛋白溶液100μl转移至离心管中，加入2.5ml Bradford工作液震荡混匀；以Blank调零，在5min后测OD595nm值，利用标准曲线的回归方程计算蛋白质的浓度。

4.2二氢叶酸还原酶活性检测

实验过程中，所有的试剂均放在冰上，Assay Buffer x1放在室温。

将仪器调在340nm，22℃，动态程序(每15秒读取1次，共读取10次)。

加98.5μl Assay Buffer x1至96孔板中。

加入样品1.5μl，混合均匀。

将96孔板放入板架上。

加入0.6μl NADPH溶液，混匀

测试前加入0.5μl Dihydrofolic acid，混匀。

立即开始动态程序，340nm的吸光度值会逐渐下降。

利用下面的公式计算活力单位

ΔOD/min.blank：Blank每分钟OD值的改变；

ΔOD/min.sample：Sample每分钟OD值的改变；

12.3：DHFR在340nm的消光系数；

V：样本的体积；

d：样本的稀释因子；

mg P/ml：样本稀释前的浓度；

Units/mg P：酶活性

如图2A所示，二氢叶酸还原酶活性在注射MTX 4小时时降到最低点。

4.3血液生化指标检查

部分指标结果如图2B、C所示，为孕鼠血浆叶酸和同型半胱氨酸在注射MTX后不同时间点的变化水平。与对照组相比具有显著性差异。

5.病理形态学检查

5.1石蜡包埋及切片

取出固定于10％中性甲醛溶液中的胚胎脑组织，进行：

脱水：70％酒精1.5h→80％酒精1.5h→90％酒精1.5h→95％酒精1.5h→100％酒精1h→100％酒精1h；

透明：二甲苯I 30min，二甲苯II(纯二甲苯)30min，注意观察标本，至标本完全透明；

浸蜡：石蜡在58℃烤箱中熔化并用滤纸过滤，将透明的组织浸入石蜡I 2h，石蜡II(纯石蜡)2h；

包埋：将浸蜡的胚胎组织放入包埋盒中，加入已经熔化的纯石蜡，使石蜡迅速凝固；

切片：用组织切片机对包埋好的石蜡块进行连续切片，用于做HE染色。

5.2HE染色

脱蜡至水：二甲苯I 10min→二甲苯II(纯二甲苯)10min→100％酒精I 5min→100％酒精II(纯酒精)5min→95％酒精5min→90％酒精5min→80％酒精5min→70％酒精5min→蒸馏水中3min。

苏木素染色：切片放入配好的Harris苏木素中10min，取出，用自来水流水冲洗。

分化：将切片放入1％盐酸水溶液约5～10s，见切片变红，颜色较浅即可。

返蓝：自来水流水冲洗，返蓝15～30min。镜下观察切片上细胞核的颜色。

脱水：50％酒精5min →70％酒精5min →80％酒精5min。

伊红染色：将切片放入配制好的伊红溶液30～60s。

脱水：95％酒精I 5min→95％酒精II 5min(新酒精)→100％酒精I 5min→100％酒精II(纯酒精)。

透明：二甲苯I 5min→二甲苯II(纯二甲苯)3min。

封片：中性树胶封片。

镜下观察。如图3、4所示胚胎前脑、后脑的形态学改变。

6.比较基因组杂交芯片分析

提取NTDs小鼠胚胎和正常小鼠胚胎组织DNA，进行比较基因组杂交芯片分析，发现与正常组相比，其基因组存在拷贝数变异，尤其是在X染色体，如图5所示，并选取覆盖于拷贝数变异区域的基因，在选择的基因上设计引物，通过real-time PCR方法验证出基因组确实存在不稳定性，NTDs小鼠胚胎组织DNA发生严重基因拷贝数变异。

综上所述，本发明采用的抗叶酸药物制备神经管畸形小鼠模型损伤易控制，机制明了，NTDs表型症状明确，模型稳定可重复，是一种理想的能够模拟人类叶酸缺乏引起NTDs发病机制的动物模型，与其它动物模型相比，方法简便、饲养繁殖简便，因此可以为证明叶酸与NTDs的关系、进一步研究NTDs发病机制及其防治药物的开发提供实验基础和平台。

Claims (8)

1.抗叶酸药物在制备构建神经管畸形小鼠模型中的应用，其特征在于，所述应用是采用抗叶酸代谢药物干预孕鼠，造成叶酸代谢障碍，引起鼠胚胎发育异常，从而建立神经管畸形小鼠模型。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述抗叶酸代谢药物为二氢叶酸还原酶抑制剂，以其干预孕鼠，阻断叶酸在体内的活性形式四氢叶酸的形成。

3.如权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述二氢叶酸还原酶抑制剂选自经典和非经典两大类抑制剂氨基蝶呤、氨甲喋呤、伊打曲沙、TNP-351、培美曲塞二钠、三甲曲沙、派利特林、甲氧苄氨嘧啶TMP及其类似物或乙胺嘧啶。

4.如权利要求1所述的应用，其特征是，所述神经管畸形小鼠模型表型包括无脑、露脑、脑膨出、脊柱裂、颅脊柱裂、脊髓脊膜膨出。

5.如权利要求1所述的应用，其特征是，抗叶酸药物的干预方式包括口服、灌胃、皮下注射、肌肉注射、腹腔注射、静脉注射、局部涂抹。

6.如权利要求1所述的应用，其特征是，抗叶酸代谢药物的剂量范围在0.01mg/kg-5000mg/kg。

7.如权利要求1所述的应用，其特征是，所述叶酸代谢障碍包括叶酸及其相关代谢生化指标的改变，涉及叶酸、四氢叶酸、5-甲基四氢叶酸、5-甲酰四氢叶酸、蛋氨酸、同型半胱氨酸、半胱氨酸、丝氨酸、组氨酸、S-腺苷蛋氨酸、S-腺苷同型半胱氨酸、胱硫醚、还原性谷胱甘肽或腺苷。

8.如权利要求1所述的应用，其特征是，叶酸代谢障碍的神经管畸形小鼠胚胎发育异常，表现为基因组稳定性发生改变，出现基因拷贝数变异。

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