CN116196315A - VO-Ohpic在制备逆转胚胎腭裂相关产品中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及分子生物学技术领域，具体公开了VO‑Ohpic在制备逆转胚胎腭裂相关产品中的应用。本发明研究发现在胚胎发育时期，对母体施用VO‑Ohpic后，可逆转胚胎已形成的腭裂，进而提供了VO‑Ohpic在制备逆转胚胎腭裂相关产品中的应用。本发明提供了一种新的逆转胚胎腭裂的方法，扩展了VO‑Ohpic的应用领域，为腭裂发育和治疗机理研究提供了理论基础。

Description

VO-Ohpic在制备逆转胚胎腭裂相关产品中的应用
技术领域
本发明涉及分子生物学技术领域，具体地说，涉及VO-Ohpic在制备逆转胚胎腭裂相关产品中的应用。
背景技术
腭裂是在新生儿中较为常见的先天性颅面部发育畸形，发病率高。腭部的发生发展是一个复杂的过程，包括细胞间增殖、迁移和分化，这一过程由遗传网络指导，这些过程的任何失败都会导致腭裂。此外，腭裂也是一组在环境因素和遗传因素相互作用下发生的复杂疾病，其发病具有家族聚集性，遗传因素在唇腭裂的发生中发挥了重要作用。目前关于对腭裂发病机制的研究多集中于探究基因改变对增殖或迁移等过程的影响，由于增殖是腭部发育过程中的第一个重要环节，因此探究增殖异常引起的腭裂及发病机制尤为重要，尤其是研究基因改变在腭裂发病过程中对增殖带来的影响，不仅能为临床遗传咨询和疾病预防提供依据，而且对提升出生人口质量具有重要的意义。由于获取腭裂的产妇或胚胎样本是很困难的，且根据胚胎学和病因学研究，小鼠是一种容易获得的动物，其产仔率高，与人类的基因序列同源程度高(99％)，被公认为是大多数研究的合适动物模型。因此多选用小鼠作为腭裂体内研究的重要模型。
目前关于增殖异常导致小鼠腭裂的模型多集中于通过维甲酸(RA)灌胃诱导的腭裂，即在孕鼠怀孕的第10.5天(E10.5)，使用浓度为100mg/kg的RA对其进行灌胃，从而构建胎鼠腭裂模型。但在发育阶段已形成的腭裂是否可被挽救却仍有待研究。
发明内容
本发明的目的在于提供一种逆转胚胎腭裂的新方法，进而提出VO-Ohpic的新应用。
本发明的技术方案如下：
第一方面，本发明提供了VO-Ohpic在制备逆转胚胎腭裂相关产品中的应用。
本发明研究发现，在胚胎发育时期，对母体施用VO-Ohpic后，可逆转胚胎因增殖异常引起的腭裂，进而提出了本发明。
VO-Ohpic是一种高效的PTEN抑制剂，其在小鼠体内可实现对于Pten基因的有效抑制。本发明研究发现，VO-Ohpic可以透过孕鼠的胎盘屏障，抑制胎盘内胎鼠Pten的表达量，从而，逆转胚胎腭裂，挽救已腭裂的胎鼠。本发明为研究VO-Ohpic在胎盘屏障中的渗透作用及对胎鼠腭部组织的影响提供了理论依据；为研究增殖异常引起的腭裂的发病机制提供了新的作用机制及靶点，从正方两方面更完善深入地研究了增殖异常在腭部发育过程中的作用；为VO-Ohpic应用于临床预防或治疗腭裂患儿提供了理论依据。提出了一种治疗胚胎腭裂的新方法和孕妇接触腭裂易感因素(如药物)，感染后的阻断措施。
第二方面，本发明提供了VO-Ohpic在制备逆转胚胎腭裂药物中的应用。
本发明的应用中，所述药物的活性成分以游离形式或可药用盐的形式存在。
所述的活性成分或其可药用的盐还可以依据施用情况的需求，以水合物或其它溶剂的形式使用。
本发明的应用中，所述药物含有至少一种可药用载体。
本发明的应用中，所述药物的给药方式为口服、静脉注射或腹腔注射。
本发明的药物可以用现有常规的方法进行制备，例如通过常规的混合、制粒、包糖衣、溶解或冷冻干燥法来制备。其可包含治疗有效量的药理学活性成分或者还可以同时包含一种或多种可药用的载体。本发明药物优选的给药途径是腹腔注射。
本发明的药物的剂型可以是糖衣片、片剂或胶囊。各剂型中单个剂量所包含的活性成分的单位含量本身不一定需要构成有效量，其可以通过施用多个剂量单位来达到所必需的有效量。
在制备用于口服剂型的药物时，可以使用任何常规的药用介质，例如水、二醇类、油类或醇类；或在口服固体制剂例如粉剂、胶囊和片剂的情况中可使用载体如淀粉、糖、微晶纤维素、稀释剂、造粒剂、润滑剂、粘合剂、崩解剂等等。
本发明的应用中，所述药物在胚胎形成的腭发育早期(增殖期)时施用。
药物施用的有效剂量可以根据所用的给药方式、所治疗病症的严重程度而变化。
如，每日每千克体重VO-Ohpic施用量不超过100μg。
第三方面，本发明提供了VO-Ohpic在制备胚胎腭裂逆转动物模型中的应用。
第四方面，本发明提供了一种胚胎腭裂逆转动物模型的构建方法，其通过在妊娠第10.5天至13.5天向孕鼠施用VO-Ohpic来构建，所述孕鼠为怀有腭裂胎鼠的孕鼠。
所述胎鼠的腭裂是因增殖异常引起的。
本发明在妊娠的特定时期，对孕鼠施用VO-Ohpic，可有效完成胚胎腭裂逆转，进而成功构建动物模型，成功率高，避免了采用基因敲除模型构建方法对胎鼠及母体致死性的影响。
本发明的构建方法中，施用方法为腹腔注射，每天的注射剂量为100μg/kg。
腹腔注射的方法操作方便、实验结果说明性强，且施用本发明的注射剂量减少了胚胎的死亡率，大大提高了孕鼠及胎鼠的存活率。
本发明的构建方法中，所述胎鼠的腭裂由人工诱导形成，所用的诱导剂为维甲酸。
本发明中，也可使用其他方式诱导胎鼠的腭裂。
本发明构建的模型可以观察出生后胎鼠的表型，比较其与腭裂胎鼠和正常胎鼠的体型大小(包括头部、身体等)，或者观察是否有其他地方的畸形等，从而更好的说明抑制剂的作用。
本发明的有益效果至少在于：
本发明提供了一种新的逆转胚胎腭裂的方法，扩展了VO-Ohpic的应用领域，为腭裂发育和治疗机理研究提供了理论基础。本发明的胚胎腭裂逆转动物模型建模周期短，操作简单，费用低，孕鼠存活率高，成功率高。
附图说明
图1为空白对照组(control)、实验对照组(RA)和实验组(RA+10μg/kg vo-ohpic、RA+100μg/kg vo-ohpic、RA+1mg/kg vo-ohpic)的部分体式显微镜观察结果。
图2为空白对照组(control)、实验对照组(RA)和实验组(RA+100μg/kg vo-ohpic)的部分EdU染色观察结果。
图3为空白对照组(control)、实验对照组(RA)和实验组(RA+100μg/kg vo-ohpic)的部分体式显微镜观察结果。
图4为空白对照组(control)、实验对照组(RA)和实验组(RA+100μg/kg vo-ohpic)的部分H&E染色观察结果。
图5为空白对照组(control)、实验对照组(RA)和实验组(RA+100μg/kg vo-ohpic)IHC显示E13.5和E16.5上Pten的表达情况的部分观察结果。
图6为空白对照组(control)、实验对照组(RA)和实验组(RA+VO-Ohpic，100μg/kg)的定量结果。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的优选实施方式进行详细说明。需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
本发明具体实施方式部分中，所用部分实验材料、试剂如下：
C57BL/6小鼠，雌鼠：健康，6-8周，22-25g；雄鼠：健康，8-10周，25-28g。
使用试剂：维甲酸(RA，R2625，Sigma-Aldrich)，玉米油(C8267，Sigma-Aldrich)，VO-OHpic(MCE，HY-110067)，BeyoClickTM EdU-555细胞增殖检测试剂盒(碧云天，C0075S)。
配液方法：
RA：将RA粉末溶解于玉米油中。
VO-OHpic：按照产品说明书方法溶解。
实施例1
本实施例对VO-Ohpic在逆转胚胎腭裂中的效果进行了验证。实验流程如下：
1.选取8-10周龄的C57BL/6雄鼠和雌鼠，按照1：2的比例于当天晚上9点进行合笼，约10-12小时后，将雌鼠和雄鼠分笼，同时观察雌鼠阴栓的生成情况，将观察到阴栓的雌鼠记为怀孕的0.5天(即E0.5)并记录体重；
2.在E10.5天的上午，给小鼠称重，将体重增长超过10％的小鼠记为孕鼠(共15只)，使用RA的玉米油溶液对其中的12只进行灌胃，灌注量依据小鼠体重计算，每kg体重施用100mg RA(即RA施用量为100mg/kg)，诱导胎鼠腭裂模型作为实验对照组(RA，3只)和实验组(9只)，另设3只孕鼠灌胃等量玉米油作为空白对照组(control)。
3.在E10.5-13.5天，每天分别给实验组孕鼠(9只)腹腔注射vo-ohpic，每次注射量依据小鼠体重计算，其中3只，每kg体重施用10μg vo-ohpic(即vo-ohpic施用量10μg/kg)，其中3只，每kg体重施用100μg vo-ohpic(即vo-ohpic施用量100μg/kg)，最后3只，每kg体重施用1mg vo-ohpic(即vo-ohpic施用量1mg/kg)。
4.在E16.5以脱颈法处死孕鼠后，收集胎鼠腭部组织样本，通过体式显微镜观察腭部发育情况。
具体地，体式显微镜观察为在体式显微镜下直观观察腭部E16.5的发育情况，观察步骤如下：
在E16.5将孕鼠实施颈椎脱臼处死，收集胚胎，放入预冷PBS中。将所有胎鼠用显微外科剪取下头部，从口角处去掉下颌以及舌部，暴露腭部，置于体视显微镜下观察。部分观察照片见图1。
图1为空白对照组(control)、实验对照组(RA)和实验组(RA+10μg/kg vo-ohpic、RA+100μg/kg vo-ohpic、RA+1mg/kg vo-ohpic)的部分体式显微镜观察结果。图中“10×”代表放大倍数100倍，图中标尺代表200μm；“20×”代表放大倍数200倍，图中标尺代表100μm。箭头和虚线部分指示的是腭部组织。
从图可知，在E16.5天，空白对照组小鼠腭部已经完全融合，而维甲酸灌胃实验对照组(RA)的小鼠发生明显腭裂，此外，注射10μg/kg vo-ohpic的胎鼠仍出现腭裂，注射1mg/kg vo-ohpic的胎鼠出现明显畸形，主要表现为与空白对照组相比，1mg/kg vo-ohpic组胎鼠体型偏小，颜色发白，质地松软稀疏，说明高浓度vo-ohpic对胎鼠的发育存在一定的毒性。而RA+100μg/kg VO-OHpic组小鼠腭裂情况被逆转，说明该浓度VO-OHpic对RA引起的胎鼠腭裂存在一定的逆转作用。
最终根据上述实验，统计结果见表1。
表1
分组 孕鼠数 发生腭裂数/总胚胎数
Control 3 0/26
RA 3 22/23
RA+10μg/kg VO-OHpic 3 21/25
RA+100μg/kg VO-Ohpic 3 4/26
RA+1mg/kg VO-OHpic 3 畸形(0/19)
实施例2
根据实施例1的实验研究结果，本实施例再次构建了实验组，以进一步验证VO-Ohpic在逆转胚胎腭裂中的效果。
具体实验流程与实施例1相同，区别仅在于：
步骤2中，在E10.5天的上午，给小鼠称重，将体重增长超过10％的小鼠记为孕鼠(共27只)，使用RA的玉米油溶液对其中的18只进行灌胃，灌注量依据小鼠体重计算，每kg体重施用100mg RA，诱导胎鼠腭裂模型作为实验对照组(RA，9只)和实验组(9只)，另设9只孕鼠灌胃等量玉米油作为空白对照组(control)。
步骤3中，在E10.5-13.5天，每天分别给实验组孕鼠腹腔注射vo-ohpic，每次注射量依据小鼠体重计算，每kg体重施用100μg vo-ohpic。
步骤4中，在E13.5以脱颈法处死9只孕鼠(其中实验对照组3只，实验组3只，空白对照组3只)，并在处死前4小时对所有孕鼠腹腔注射EdU，收集胎鼠腭部组织样本，分别进行EdU和IHC检测。
之后在E16.5以脱颈法处死剩余孕鼠后，收集胎鼠腭部组织样本，分别进行体式显微镜观察和HE染色及免疫组化检测。
本实施例采用EdU法观察vo-ohpic对胎鼠腭部增殖能力的影响情况。具体如下：
使用PBS把EdU配置成10mg/mL的溶液，根据体重进行腹腔注射，每kg体重施用100mg EdU溶液，4小时后，快速处死小鼠，取出所需的组织，制作石蜡切片。随后对切片进行EdU染色处理，具体染色步骤如下：
(a)脱蜡：二甲苯中脱蜡5-10分钟。换用新鲜的二甲苯，再脱蜡5-10分钟。无水乙醇5分钟，换新的无水乙醇3分钟。95％
乙醇3分钟。85％乙醇3分钟。75％乙醇3分钟。50％乙醇3分钟。PBS 5分钟。
(b)根据说明书配置EdU反应液。
(c)每个样本滴加0.5ml Click反应液，使反应混合物可以均匀覆盖样品。
(d)室温避光孵育30分钟。
(e)去除反应液，用洗涤液洗涤3次，每次3-5分钟。
(f)使用含DAPI的封片液对细胞核进行染色并进行封片处理。
组织部位切勿残留小气泡，自然晾干，拍照。
EdU染色完成后将组织切片在光学显下观察。部分观察结果见图2。
图2为空白对照组(control)、实验对照组(RA)和实验组(RA+100μg/kg vo-ohpic)的部分EdU染色观察结果。图中“40×”代表放大倍数400倍，图中标尺代表12.5μm。
从图可知，RA+100μg/kg vo-ohpic组小鼠腭部增殖能力明显强于RA组，说明RA+100μg/kg vo-ohpic组增殖能力增强。
体式显微镜观察方法同实施例1。部分观察照片见图3。
图3为空白对照组(control)、实验对照组(RA)和实验组(RA+100μg/kg vo-ohpic)的部分体式显微镜观察结果。图中“10×”代表放大倍数100倍，图中标尺代表200μm；“20×”代表放大倍数200倍，图中标尺代表100μm。箭头指示的是腭部组织。
从中可知，在E16.5天，空白对照组小鼠腭部已经完全融合，而维甲酸灌胃实验对照组(RA)的小鼠发生明显腭裂，此外，RA+VO-OHpic组小鼠的腭裂被逆转，说明VO-OHpic对RA引起的胎鼠腭裂存在一定的逆转作用。
H&E染色为以石蜡包埋切片后，通过H&E染色在显微镜下观察E16.5腭部的发育情况，具体步骤如下：
(1)组织切片在烤箱上进行烘烤，65℃，3h；
(2)二甲苯I、II分别脱蜡10min；
(3)梯度酒精水化：100％酒精I、II各2min；95％酒精I、II各2min；80％酒精-2min、70％酒精-2min、50％酒精-2min；
(4)PBS冲洗3次，5min/次。轻柔地将切片擦净后放入苏木素染缸里进行染色，2-3min；
(5)PBS冲洗3次，5min/次。轻柔地将和切片捺净后放入伊红染缸里进行染色，30s-1min；
(6)PBS冲洗3次，5min/次。梯度酒精脱水；70％-酒精-2min，80％酒精-2min，95％酒精-2min，100％酒精I、II各2min；
(7)二甲苯I、II分别透明5min；
(8)透明完成后进行封片。用吸管将中性树胶滴至组织标本处，去除多余树胶后盖盖玻片，注意不要产生气泡。
H&E染色完成后将组织切片在光学显下观察。部分观察结果见图4。
图4为空白对照组(control)、实验对照组(RA)和实验组(RA+100μg/kg vo-ohpic)的部分H&E染色观察结果。图中“10×”代表放大倍数100倍，图中标尺代表100μm；“40×”代表放大倍数400倍，图中标尺代表12.5μm。
从图可知，RA+100μg/kg vo-ohpic组小鼠腭部在E16.5融合，与空白对照组一致，而RA组小鼠发生腭裂。
本实施例通过免疫组化法观察vo-ohpic的阻断效果及胎鼠发育情况。
免疫组化法：IHC染色：石蜡包埋切片后，通过IHC染色在显微镜下观察腭部E13.5/E16.5 Pten的染色情况，并通过image J proplus进行定量分析，使用Prism graphpad 9进行统计学分析。
IHC染色具体步骤如下：
(1)将5μm石蜡切片在65℃加热1h，脱蜡，再水化：将烤的切片放入二甲苯10min→二甲苯10min→二甲苯10min→无水乙醇(5min)→无水乙醇(5min)→95％乙醇(5min)→95％乙醇(5min)→ddH2O(1min)→ddH2O(1min)→ddH2O(1min)；
(2)自来水冲洗1min；
(3)磷酸盐缓冲液(Phosphate buffered saline，PBS)洗3次，每次5min；
(4)将切片放入95℃柠檬酸钠修复液中煮15min，之后让片子在柠檬酸钠修复液中室温冷却1h。PBS洗3次，每次3min，ddH2O洗2遍，每次洗2min，取出切片，用防水笔在标本周围画圈，在圆圈内滴入适量的内源性过氧化物酶阻断剂，室温孵育10min。然后PBS洗3次，每次洗3min；
(5)在10％山羊血清(ZLI-9021，ZSGB-BIO，中国)中孵育1h以阻断非特异性抗体结合，然后去掉血清，用2％ BSA以1:150的稀释度稀释一抗SIRT6，将一抗稀释液滴加到组织上，在4℃下孵育过夜；
(6)第二天取出湿盒，室温放置1h，恢复温度后PBS洗3次，每次洗3min；
(7)加100μL反应增强液，室温孵育20min，PBS洗3次，每次洗3min；
(8)滴加增强酶标山羊抗兔IgG聚合，在室温下孵育20min，PBS洗3次，每次洗3min；
(9)用DAB显色试剂盒，加入适量新鲜配制的DAB，记录显色时间，显微镜下观察到显色后，自来水冲洗。阳性区域被染成棕黄色；
(10)自来水冲洗，苏木素复染20s，自来水冲洗2次，ddH2O洗1次；
(11)脱水、透明：95％乙醇(3min)→95％乙醇(3min)→无水乙醇(3min)→无水乙醇(3min)→二甲苯5min→二甲苯5min→二甲苯5min；
(12)封片：中性树胶加盖玻片，组织部位切勿残留小气泡，自然晾干，拍照。部分观察结果见图5。定量结果见图6。
图5为空白对照组(control)、实验对照组(RA)和实验组(RA+100μg/kg vo-ohpic)IHC显示E13.5和E16.5上Pten的表达情况的部分观察结果。图中“10×”代表放大倍数100倍，图中标尺代表100μm；“40×”代表放大倍数400倍，图中标尺代表12.5μm。图6为空白对照组(control)、实验对照组(RA)和实验组(RA+VO-Ohpic，100μg/kg)的定量结果。图中*代表p＜0.05，ns代表差异不显著。从图5胎鼠腭部组织间充质区域的灰色深浅情况判断Pten的表达情况，定量结果可见图6。如图所示，RA+100μg/kg vo-ohpic组胎鼠腭部组织中Pten的表达量明显降低，说明该抑制剂可以有效抑制Pten在胎鼠腭部组织中的表达量，但在E16.5天RA+100μg/kg vo-ohpic组胎鼠腭部组织中Pten的表达量未见明显改变，推测是抑制剂在体内发生了代谢。
统计E16.5天的小鼠腭部发育情况，结果见表2。
表2
分组 孕鼠数 发生腭裂数/总胚胎数
Control 6 0/55
RA 6 47/49
RA+100μg/kg VO-Ohpic 6 8/51
实施例3
本实施例提供了本发明的胚胎腭裂逆转动物模型的构建方法。
1、将雌鼠：雄鼠＝2：1合笼过夜，第二天将其分开，同时观察雌鼠阴栓的生成情况，将观察到阴栓的雌鼠记为怀孕的0.5天(E0.5)，对其雌鼠称重；
2、在E10.5天，对雌鼠进行称重，将体重增长不足10％的雌鼠排除，体重增长超过10％的雌鼠，使用维甲酸的玉米油溶液(RA，100mg/kg)灌胃，记为RA组，构建胎鼠腭裂模型；
3、随后，使用VO-OHpic(100μg/kg)对RA组小鼠进行腹腔注射，E10.5-E13.5，每天一次，为RA+VO-OHpic组，构建挽救模型。
E16.5天，统计孕鼠存活率后，将孕鼠处死，取出胚胎，体式显微镜下观察胎鼠腭部发育状况，统计胚胎腭裂逆转成功率。具体胚胎腭裂逆转成功的判断标准为不存在腭裂。
具体本实施例的结果为：孕鼠存活率为100％，胚胎腭裂逆转成功率为84.4％。
此外，本发明还研究发现，当施用VO-Ohpic的浓度为10μg/kg，胚胎腭裂逆转成功率下降，当施用VO-Ohpic的浓度为1mg/kg，则出现胎鼠畸形，均无法实现模型的成功构建。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (10)

1.VO-Ohpic在制备逆转胚胎腭裂相关产品中的应用。
2.VO-Ohpic在制备逆转胚胎腭裂药物中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述药物的活性成分以游离形式或可药用盐的形式存在。
4.根据权利要求2或3所述的应用，其特征在于，所述药物含有至少一种可药用载体。
5.根据权利要求2-4任一项所述的应用，其特征在于，所述药物的给药方式为口服、静脉注射或腹腔注射。
6.根据权利要求2-5任一项所述的应用，其特征在于，所述药物在胚胎形成的腭发育早期施用。
7.VO-Ohpic在制备胚胎腭裂逆转动物模型中的应用。
8.一种胚胎腭裂逆转动物模型的构建方法，其特征在于，通过在妊娠第10.5天至13.5天向孕鼠施用VO-Ohpic来构建，所述孕鼠为怀有腭裂胎鼠的孕鼠。
9.根据权利要求8所述的构建方法，其特征在于，施用方法为腹腔注射，每天的注射剂量为100μg/kg。
10.根据权利要求8或9所述的构建方法，其特征在于，所述胎鼠的腭裂由人工诱导形成，所用的诱导剂为维甲酸。
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